DE4414940C2 - Lumineszenz-Rastermikroskop mit zwei Photonen Anregung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Lumineszenz-Rastermikroskop gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruches.

Ein derartiges Rastermikroskop mit einer Laser-, einer Filter- und einer Detektoranordnung ist aus der US 5034613 bekannt. Die Laseranordnung regt die Lumineszenz einer zu untersuchen­ den Probe an. Die Filteranordnung separiert das Lumineszenz­ licht der Probe vom Laserlicht und die Detektoranordnung registriert das Lumineszenzlicht.

Die DE 40 35 799 A1 beschreibt ein Rastermikroskop, bei dem meh­ rere Rasterpunkte gleichzeitig angeregt und mit einem Detek­ torarray konfokal registriert werden. Dieses Mikroskop arbeitet ohne zwei Photonen Anregung.

Aus der DE 35 05 728 C2 ist ferner ein Verfahren zur gezielten Zerstörung unerwünschter Nukleinsäuren in der unmittelbaren Nachbarschaft von Proteinen bekannt, bei dem die Probe einer zwei Photonen Anregung unterworfen wird. Dabei wird das zu un­ tersuchende Material zerstört.

Die Druckschrift "Proceedings Spie: Three Dimensional Micros­ copy: Image Acquisition and Processing, vol. 2184, 7 February 1994, San Jose USA; pages 66-71, Hänninen and Hell" beschreibt eine Vorgehensweise bei der die Spitzenleistung erniedrigt und zugleich die Pulsdauer vergrößert wird, so daß sie < 1 ps ist. Dadurch sollen komplexe und teure fs Laser umgangen werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Lumineszenz- Rastermikroskop mit zwei Photonen Anregung anzugeben, das ko­ stengünstig herstellbar ist und schnell und probenschonend ar­ beitet.

Diese Aufgabe wird durch ein Lumineszenz-Rastermikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Dabei erzeugt eine Laseranordnung als Array von Halbleitern Lichtimpulse größer als 1 Picosekunde und die Detektoranordnung ist als Array von Halbleiterdetektoren ausgebildet. Durch die Anregung mit Laserimpulsen, deren Dauer größer ist als eine Pikosekunde oder durch die Anregung mit kontinuierlichem Licht sind die Leistungsspitzen im Anregungslicht soweit reduziert, daß eine Zerstörung des Objektes nicht auftritt. Da die verwendeten Laserimpulse eine niedrigere Leistung aufweisen, als die Leistung im Sub-Picosekundenbereich, sind längere Meßzeiten in der Regel angebracht, wobei die Empfindlichkeit des verwendeten Detektors den Meßbedingungen angepaßt wird. Es hat sich herausgestellt, daß wenn als Auswertungsverfahren das Verfahren des Photonenzählens eingesetzt wird, dieses zu sehr guten Messergebnissen führt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn Halbleiterlaserarray und das Detek­ torhalbleiterarray bezüglich des Objektivs des Rastermikroskops in zueinander konjugierten Positionen angeordnet sind. Sogar mit kontinuierlichem Laserlicht mittlerer Leistung ist die Aufnahme und Auswertung der Meßergebnisse möglich.

Es ist vorteilhaft, wenn ein Detektorhalbleiterarray mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis eingesetzt wird. Von besonderer Bedeutung ist dabei, daß der eingesetzte Detektor eine entsprechend hohe Empfindlichkeit und ein kleines Eigenrauschen aufweist. Durch die arrayförmige Anordnung der Laser und Detektoren und die dadurch gegebene Bestrahlung und Messung von mehreren Rasterpunkten, ist die Möglichkeit gege­ ben, die Dauer des Verfahrens zu verkürzen.

Bei dem erfindungsgemäßen Luminesenz-Rastermikroskop sind weiterhin Filter vorgesehen zum Separieren des von der Probe emitierten Lichtes von dem Laserlicht. Anstatt eines Filters kann auch ein Detektor eingesetzt werden, der die entsprechende Wellenlänge herausfiltert.

Das Detektorhalbleiterarray kann auch als Photonenzähler aus­ gebildet sein.

Eine schematische Darstellung eines Lumineszenz-Rastermikro­ skopes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der einzigen Figur wiedergegeben.

Das Lumineszenz-Rastermikroskop weist einen Laser 1 zur Erzeugung des Laserlichtes, einen Fotodedektor 2 zur Auswertung der Meßergebnisse und ein Objektiv 3 zur Fokussierung des von der Laserlichtquelle 1 ausgesandten Laserstrahles 4 auf das zu untersuchende Objekt 5 auf. Der Laserstrahl 4 wird mit einer Strahlrastereinrichtung 6 zum Abrastern des Objektes 5 gesteuert. Ferner weist das Lumineszenz-Rastermikroskop Filter 7 und 8 zum Separieren des Laserlichtes 4 vom Lumineszlicht auf. Gemäß der Erfindung ist die Laserlichtquelle 1 als ein herkömmlicher Laser mit kontinuierlicher oder gepulster Strahlung ausgebildet. Die Laserlichtquelle 1 kann auch durch eine arrayförmige Anordnung von Lasern gebildet sein. Das gleiche trifft für den Fotodedektor 2 zu. Dieser kann entweder punkt- oder arrayförmig ausgebildet sein. Im Falle einer arrayförmigen Anordnung der Laser 1 und Detektoren 2 sind diese sowie der abzubildende Probenbereich in jeweils zueinan­ der optisch konjugierten Ebenen zur gleichzeitigen Aufnahme von mehreren Rasterpunkten angeordnet.

Claims (6)

1. Lumineszenz-Rastermikroskop mit Zwei-Photonen-Anregung,

• - mit einer Laseranordnung (1) zur Zwei-Photonen-Anregung von dreidimensional in einem zu beobachtenden Objekt (5) verteilten, lumineszierenden Molekülen,
• - mit einer das zu beobachtende Objekt (5) abtastenden Rastereinrichtung (6),
• - und mit einem Strahlteiler (7) zwischen dem Objekt (5) und einer Detektoranordnung (2), der das Lumineszenzlicht der Lumineszenzmoleküle zu der Detektoranordnung (2) auskoppelt,
  dadurch gekennzeichnet,
• - daß die Laseranordnung (1) die Zwei-Photonen-Anregung mit Lichtpulsen von einer Dauer größer als 1 Pikosekunde erzeugt,
• - und daß die Laseranordnung (1) als Array von Halbleiterlasern und die Detektoranordnung (2) als Array von Halbleiterdetektoren ausgebildet ist,
• - wobei diese beiden Arrays das Objekt abtasten.

2. Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Halbleiterlaserarray und das Detektorhalbleiterarray bezüglich des Objektivs (3) des Rastermikroskops in zueinander konjugierten Positionen angeordnet sind.

3. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektorhalbleiterarray eine hohe Empfindlichkeit bei kleinem Eigenrauschen besitzt.

4. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Halbleiterlaserarray kontinuierliches Laserlicht abgibt.

5. Luminesenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß dem Detektorhalbleiterarray ein für die Lumineszenzwellenlänge der Lumineszenzmoleküle durchlässiger Filter (8) vorgeschaltet ist.

6. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektorhalbleiterarray als Photonenzähler ausgebildet ist.