DE4414940A1

DE4414940A1 - Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie und ein Lumineszenz-Rastermikroskop

Info

Publication number: DE4414940A1
Application number: DE4414940A
Authority: DE
Inventors: Pekka Haenninen; Stefan Dr Hell
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2014-04-29
Also published as: DE4414940C2; EP0706671A1; US5777732A; WO1995030166A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lumineszenz-Raster mikroskopie gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruches und ein Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung dieses Verfahrens.

Ein derartiges Verfahren ist aus der US PS 5034613 bekannt. Bei dem beschriebenen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren mit Zwei-Photonenanregung. Ein zu untersuchendes Objekt, vorzugsweise ein biologisches Objekt wird mit einem lumineszierenden, insbesondere fluoreszierenden Farbstoff versehen. Der im Objekt befindliche Farbstoff wird durch die gemeinsame Wirkung von zwei Photonen angeregt und das vom Farbstoff emittierte Licht mittels eines Detektors registriert und ausgewertet. Um die gesamte Probe zu erfassen, wird der Laserstrahl über das Objekt gerastert. Die Werte von allen Punkten des Objektes werden registriert, wodurch eine dreidimensionale Darstellung der Auswerteergebnisse möglich ist. Die Zwei-Photonenanregung in Verbindung mit dem Rastern führt zu einer direkten dreidimensionalen Abbildung des Objektes. Um die Wahrscheinlichkeit der Zwei-Photonenanregung zu erhöhen, werden Laserimpulse verwendet, deren Dauer im Sub- Piko Sekundenbereich liegt. Laser, die solche extrem kurzen Impulse erzeugen, sind sehr teuer. Darüber hinaus werden bio logische Objekte durch die Impulse hoher Leistung oft zerstört. Eine Anregung des Objektes mit Laserimpulsen im Sub- Pico-Sekundenbereich führt oft dazu, daß das Lumineszenzsignal "zusammenbricht". Dieses "Zusammenbrechen" kann anschaulich als eine "Mikro-Explosion" dargestellt werden, die das Objektmaterial zerstört.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren so weiterzubilden, daß die oben genannten Nachteile nicht auftre ten.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen 1-3 angegebe nen Merkmale gelöst. Es wurde überraschend gefunden, daß eine Messung von Zwei-Photonen Lumineszenz mit Laserimpulsen von längerer Dauer oder sogar mit kontinuierlichem Licht möglich ist und zu guten Meßergebnissen führt. Durch die Anregung mit Laserimpulsen, deren Dauer größer ist als 10^-12 Sekunden oder durch die Anregung mit kontinuierlichem Licht sind die Leistungsspitzen im Anregungslicht soweit reduziert, daß eine Zerstörung des Objektes nicht auftritt. Ein sehr vorteilhafter Bereich der Impulsdauer liegt im Picosekunden-Bereich. Da die verwendeten Laserimpulse eine niedrigere Leistung aufweisen, als die Leistung im Sub-Picosekundenbereich, sind längere Meßzeiten in der Regel angebracht, wobei die Empfindlichkeit des verwendeten Detektors den Meßbedingungen angepaßt wird. Es hat sich herausgestellt, daß wenn als Auswertungsverfahren das Verfahren des Photonenzählens (Photon Counting) eingesetzt wird, dieses zu sehr guten Meßergebnissen führt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn als Detektor eine Avalanche-Photo diode eingesetzt wird. Sogar mit kontinuierlichem Laserlicht mittlerer Leistung ist die Aufnahme und Auswertung der Meßergebnisse möglich. Bei einer entsprechend verlängerten Zeitdauer der Messung und der Wahl eines Detektors mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis sind die Ergebnisse mit denen des Verfahrens unter Verwendung von Laserimpulsen im Sub-Piko sekundenbereich vergleichbar.

Von besonderem Vorteil ist es, daß zur Durchführung des erfindungsgemäßen Meßverfahrens als Lichtquelle handelsübliche Laser mit kontinuierlicher oder gepulster Strahlung eingesetzt werden können. Diese sind nicht teuer. Es können übliche Halb leiter- oder Gaslaser eingesetzt werden. Als Gaslaser eignen sich insbesondere HeNe-Laser und Krypton-Ion Laser. Die Laseranordnung kann auch arrayförmig ausgebildet sein. Die Be nutzung von zwei oder drei Lasern zur Bestrahlung des gleichen Objektpunktes hat sich als besonders vorteilhaft herausge stellt.

Wie oben bereits ausgeführt, ist es wesentlich, daß zur Aufnahme und Auswertung des lumineszierenden Lichtes ein Detektor mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis eingesetzt wird. Von besonderer Bedeutung ist dabei, daß der eingesetzte Detektor eine entsprechend hohe Empfindlichkeit und ein kleines Eigenrauschen aufweist. Durch die arrayförmige Anord nung der Laser und Detektoren und die dadurch gegebene Be strahlung und Messung von mehreren Rasterpunkten, ist die Möglichkeit gegeben, die Dauer des Verfahrens zu verkürzen.

Vorteilhaft ist, wenn dem Objekt eine Strahlrastereinrichtung vorgeordnet ist, wobei der Strahl über das Objekt gerastert wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Luminesenz-Rastermikroskop sind weiterhin Filter vorgesehen zum Separieren des von der Probe emmitierten Lichtes von dem Laserlicht. Anstatt eines Filters kann auch ein Detektor eingesetzt werden, der die entsprechende Wellenlänge herausfiltert.

Eine schematische Darstellung eines Lumineszenz-Rastermikro skopes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 1 wiedergegeben.

Das Lumineszenz-Rastermikroskop weist einen Laser 1 zur Erzeugung des Laserlichtes, einen Fotodedektor 2 zur Auswertung der Meßergebnisse und ein Objektiv 3 zur Fokussierung des von der Laserlichtquelle 1 ausgesandten Laserstrahles 4 auf das zu untersuchende Objekt 5 auf. Der Laserstrahl 4 wird mit einer Strahlrastereinrichtung 6 zum Abrastern des Objektes 5 gesteuert. Ferner weist das Lumineszenz-Rastermikroskop Filter 7 und 8 zum Separieren des Laserlichtes 4 vom Lumineszenzlicht auf. Gemäß der Erfindung ist die Laserlichtquelle 1 als ein herkömmlicher Laser mit kontinuierlicher oder gepulster Strahlung ausgebildet. Die Laserlichtquelle 1 kann auch durch eine arrayförmige Anordnung von Lasern gebildet sein. Das gleiche trifft für den Fotodedektor 2 zu. Dieser kann entweder punkt- oder arrayförmig ausgebildet sein. Im Falle einer arrayförmigen Anordnung der Laser 1 und Detektoren 2 sind diese sowie der abzubildende Probenbereich in jeweils zueinan der optisch konjugierten Ebenen zur gleichzeitigen Aufnahme von mehreren Rasterpunkten angeordnet.

Claims

1. Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho tonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei ein Laserimpuls lumineszie rende, insbesondere fluoreszierende Moleküle angeregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt (5) vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch Laserimpulse erfolgt, deren Dauer größer ist als 10^-12 Sekunden.

2. Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho tonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei ein Laserimpuls lumineszie rende, insbesondere fluoreszierende Moleküle anregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt (5) vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch Laserimpulse erfolgt, deren Dauer 10^-12 Se kunden ist.

3. Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho tonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei Laserlicht lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Moleküle anregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausge wertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch kontinuierliches Laserlicht erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch ge kennzeichnet, daß das Auswerten des vom Objekt (5) ausgesandten Lumineszenzlichtes im Verfahren des Photonenzählens erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch ge kennzeichnet, daß mehrere Rasterpunkte des Objektes (5) gleichzeitig angeregt werden und das von diesen Raster punkten ausgesandte Lumineszenzlicht gleichzeitig gemes sen wird.

6. Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung des Verfah rens nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 mit minde stens einer Laserlichtquelle, mindestens einem Detektor, mindestens einem Filter zum Separieren des von der Probe emittierten Lichts von dem Laserlicht, dadurch gekenn zeichnet, daß als Laserlichtquelle ein Laser (1) mit ge pulster Strahlung dient.

7. Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung des Verfah rens nach einem der Ansprüche 3 bis 5 mit mindestens ei ner Laserlichtquelle, mindestens einem Detektor, mindestens einem Filter zum Separieren des von der Probe emittierten Lichts von dem Laserlicht, dadurch gekenn zeichnet, daß als Laserlichtquelle ein Laser (1) mit kon tinuierlicher Strahlung dient.

8. Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 6 oder 7 da durch gekennzeichnet, daß der Laser ein Halbleiterlaser ist.

9. Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 6 oder 7 da durch gekennzeichnet, daß der Laser ein Gas-Laser ist.

10. Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 9 dadurch ge kennzeichnet, daß der Laser ein HeNe-Laser oder ein Kryp ton-Ion-Laser ist.

11. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 10 dadurch gekennzeichnet daß ein Detektor (2) mit einem hohen Signal-Rauschverhältnis eingesetzt wird.

12. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß eine Strahlrastereinrichtung (6) zum gesteuerten Abrastern des Objektes (5) vorgesehen ist.

13. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß ein Array aus Laser (1) als Lichtquelle dient und ein Array aus Detektoren (2), die in einer optisch konjugierten Ebene zur Fokal ebene des Objektes (5) angeordnet sind, verwendet wird.

14. Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (2) eine Avalanche-Photodiode ist.