DE3326150C2

DE3326150C2 -

Info

Publication number: DE3326150C2
Application number: DE3326150A
Authority: DE
Inventors: Nobutaka Hachioji Tokio/Tokyo Jp Kaneko
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1988-09-15
Also published as: JPS5917142A; US4575808A; DE3326150A1; JPH0522180B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vermessen und Darstellen eines elektrophoretisch gewonnenen Densitogrammes gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1, wie es beispielsweise in dem Lehrbuch von L. P. Ribeiro, E. Mitidieri, O. R. Affonso, "Paper Electorphoresis", Amsterdam, London, New York, Princeton: Elsevier Publishing Company, 1961, S. 65 bis 68 beschrieben ist.

Auch aus der DD-PS 72 387 und der US-PS 37 43 429 sind Verfahren zum Darstellen von elektrophoretisch gewonnenen Densitogrammen bekannt.

Beispielsweise wird in einem Elektrophoresegerät für den Nachweis verschiedener Proteine in einer Serumprobe ein Densitogramm erstellt, das Fraktionskurven von Albumin (Alb), α₁-Globulin ( α₁), α₂-Globulin ( α₂), β-Globulin ( β ) und γ-Globulin ( γ ), prozentuale Fraktionsanteile dieser Proteine und ein Albumin-Gesamtprotein-Verhältnis (A/G) darstellt. Anhand dieser Daten ist es möglich, eine relative Dichteänderung der Proteine zu ermitteln. Neben dieser relativen Dichteänderung ist in jüngerer Zeit der absoluten Dichteänderung der Stoffe Bedeutung zugemessen worden. Zur Erfüllung dieser Forderung werden absolute Dichtewerte für die Stoffe dadurch gewonnen, daß Produkte aus den jeweiligen prozentualen Fraktionsanteilen und einer getrennt nach dem bekannten Refraktometrie- oder dem bekannten Kolorimetrie-Verfahren gemessenen Gesamtdichte des Gesamtproteins abgeleitet werden.

Es ändere sich beispielsweise der Proteingehalt bei einem Patienten von der in Fig. 1 dargestellten Zusammensetzung aus irgendwelchen Gründen in die Zusammensetzung gemäß Fig. 2. Ein Vergleich der Fig. 1 und 2 zeigt, daß der prozentuale Fraktionsanteil von Albumin um etwa das 0,75fache abgenommen hat und die prozentualen Fraktionsanteile der a₁-, α₂-, β-, und γ-Globuline um das 1,5fache zugenommen haben. Die Änderung des Proteingehaltes kann dann aus den absoluten Proteindichtewerten genau ermittelt werden, die durch Multiplizieren der jeweiligen prozentualen Fraktionsanteile mit der Gesamtproteindichte gewonnen werden.

Jedoch wird beim Aufzeichnen des Densitogramms eine automatische Differenzsteuerung angewendet, derart, daß ein Spitzenwert der Albumin-Fraktion, welche gewöhnlich die größte Dichte aufweist, auf ein bestimmtes konstantes Niveau gebracht wird und die Globulin-Fraktionen im Verhältnis zur Albumin-Fraktion aufgezeichnet werden. Bei den in Fig. 1 und 2 dargestellten Proteingehalten entstehen dann die durch die Kurven I und II in Fig. 3 dargestellten Densitogramme. Nach diesen Kurven I und II scheinen die Fraktionen der α₁-, a₂-, β- und γ-Globuline größer geworden zu sein, obwohl sich die Dichten dieser Globuline überhaupt nicht geändert haben, dagegen die Dichte des Albumins um den Faktor 2 abgenommen hat.

Es ist auch bekannt, ein Densitogramm ohne automatische Differenzsteuerung aufzuzeichnen. In diesem Falle kann das Densitogramm die Dichteänderung der Proteine korrekt darstellen, wenn die Serumproben mengenmäßig gleich sind. In der Praxis ist es jedoch sehr schwierig, eine bestimmte konstante Probenmenge auf bei der Elektrophorese benutzte Probenträgerfilme gleichmäßig aufzutragen. Wenn die auf die Trägerfilme aufgetragenen Proben mengenmäßig voneinander verschieden sind, kann die Dichteänderung der Proteine nicht genau aus den Densitogrammen ermittelt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Vermessen und Darstellen eines elektrophoretisch gewonnenen Densitogrammes einer Proteinprobe zu schaffen, mit dem bei einer elektrophoretischen Analyse die relativen Änderungen der einzelnen Komponenten auch bei einer Änderung der für die Analyse benutzten Probenmenge in einfacher Weise direkt erkennbar sind.

Ein diese Aufgabe erfindungsgemäß lösendes Verfahren ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet.

Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Erfindungsgemäß wird also gesondert zur Elektrophorese eine Gesamtdichte der Probe mittels Kolorimetrie gemessen und abgespeichert. Es werden also zwei verschiedene Meßverfahren angewandt: Zum einen die Elektrophorese und ergänzend dazu die Kolorimetrie.

Das so erzeugte Densitogramm ermöglicht eine einfache visuelle Bestimmung von relativen Dichteänderungen der einzelnen Komponenten des analysierten Stoffes.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 4 ein Blockschaltbild für eine Ausführungsform eines Elektrophoresegerätes zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung und

Fig. 5 nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erstellte Densitogramme.

Gemäß Fig. 4 werden von einer Lichtquelle 1 ausgesendete Lichtstrahlen durch ein Objektiv 2 parallel gemacht und fallen nach Durchgang durch ein nicht dargestelltes Interferenzfilter und eine Schlitzblende 3 auf einen Trägerfilm 4 auf, der ein Fraktionsbild von Proteinen eines Serums trägt. Das vom Trägerfilm 4 durchgelassene Licht wird von einem fotoelektrischen Wandler bzw. Meßgrößenumformer 5 empfangen. Die Lichtquelle 1, das Objektiv 2, die Schlitzblende 3 und der Meßgrößenumformer 5 werden in bezug auf den Trägerfilm 4 in der Richtung bewegt, in der die Elektrophorese der Proteinstoffe in einer Serumprobe stattgefunden hat, und tasten das Fraktionsbild bzw. -muster ab. Der Meßgrößenumformer 5 erzeugt ein Ausgangssignal, das in einer bestimmten Abtastzeit abgetastet wird, und die abgetasteten Werte werden von einem Dichtewertewandler 6 nacheinander in Dichtesignale X _n (O. D. = optische Dichte) umgewandelt, die dann in einem Dichtewertespeicher 7 gespeichert werden. Zur gleichen Zeit werden die Dichtesignale X _n in einem Dichtewerte-Akkumulator 8 akkumuliert, um einen akkumulierten Dichtewert Σ X _n zu bilden. Es sei darauf hingewiesen, daß die Dichtesignale X _n dem Dichtewerte-Akkumulator 8 direkt zugeleitet werden können. Außerdem kann zur Ableitung eines genaueren akkumulierten Dichtewertes die Simpsonsche Regel angewendet werden.

Nach dem Kolorimetrie- oder Refraktometrie-Verfahren wird eine Gesamtproteindichte T (g/dl) getrennt gemessen und über eine zugehörige Eingabeeinheit 9 in einen Gesamtproteindichte-Speicher 10 eingetragen. Die Eingabeeinheit 9 kann eine Tastatur oder eine Schnittstelle sein, die an einen Rechner anschließbar ist, welcher mit dem Analysiergerät verbunden ist und entweder direkt oder indirekt verarbeitet. Die Gesamtproteindichte T und der akkumulierte Dichtewert Σ X _n werden einer Recheneinheit 11 zugeführt, die aus ihnen ein nachstehend näher erläutertes Verhältnis R errechnet. Die im Speicher 7 gespeicherten Dichtesignale X _n werden nacheinander ausgelesen und einer Dichteausgangssignal-Korrektureinheit 12 zugeführt, in welcher die Amplituden der Dichtesignale entsprechend dem errechneten Wert R korrigiert werden. Die korrigierten Ausgangssignale werden dann einem Aufzeichnungsgerät 13 zugeleitet, in dem ein Densitogramm auf einen Aufzeichnungsträger 14, z. B. in Form eines Papierstreifens, aufgezeichnet wird.

Es sei K (cm²/(g/dl)) ein eine Fläche je Dichteeinheit auf dem Aufzeichnungsträger 14 darstellender Koeffizient, R (Volt/O. D) ein Verhältnis der Ausgangssignalamplitude je Dichteeinheit an der Dichteausgangssignal-Korrektureinheit 12, Y (cm/Volt) eine Verstärkung des Aufzeichnungsgerätes 13 und P (cm) eine Aufzeichnungsteilung im vom Aufzeichnungsgerät 13 erstellten Densitogramm. Eine von einer Kurve des Densitogramms und einer Grundlinie eingeschlossene Fläche S (cm²) läßt sich dann durch die nachstehende Gleichung darstellen:

S = Σ X _n · R · Y · P (1)

Damit die erfindungsgemäß notwendige Bedingung S = KT erfüllt wird, muß die nachstehende Gleichung erfüllt sein:

Beim gezeigten Beispiel sind in der Recheneinheit 11 im voraus die Werte K, Y und P als gegebene Konstanten gesetzt worden. Das Dichte-Ausgangs-Verhältnis R wird dann entsprechend der vorstehenden Gleichung (2) berechnet und der Korrektureinheit 12 für die Amplitudenkorrektur der Dichteausgangssignale zugeführt, in welcher Produkte aus den Dichtesignalen X _n und dem Verhältnis R als berichtigte oder korrigierte Dichtesignale R · X _n errechnet werden. Die so korrigierten Dichtewerte R · X _n werden dem Aufzeichnungsgerät 13 zugeleitet, in dem zur Erstellung des Densitogramms der Aufzeichnungsträger 14 mit einer Geschwindigkeit transportiert wird, die der Aufzeichnungsteilung P entspricht, und ein Schreibstift rechtwinklig zur Vorschubrichtung des Aufzeichnungsträgers 14 um Beträge bewegt wird, die den korrigierten Dichtewerten R · X _n entsprechen.

Weil nach dem Verfahren gemäß der Erfindung die von der Kurve und der Grundlinie eingeschlossene Fläche des Densitogramms proportional der Gesamtproteindichte gemacht wird, entspricht die jeweilige Fläche jeder Fraktion dem zugehörigen Dichtewert, wie in Fig. 5 durch die Kurven I′ und II′ dargestellt. Die mengenmäßige Änderung der Proteinstoffe kann daher bequem und genau visuell beurteilt werden.

Das beschriebene Verfahren ist gleichermaßen auf die Elektrophorese von Isozymen und Lipoproteinen anwendbar.

Claims

1. Verfahren zum Vermessen und Darstellen eines elektrophoretisch gewonnenen Densitogrammes (I, II) einer Proteinprobe, deren Bestandteile (Alb, α₁, a₂, β, γ ) auf einem Trägerfilm (4) in einzelne Fraktionen getrennt sind und deren relative Dichten in dem Densitogramm (I, II) von einer Grundlinie aus auf einem Aufzeichnungsträger (14) dargestellt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß

a) gesondert zur Elektrophorese die Gesamt-Protein-Dichte (T) der Probe mittels Kolorimetrie gemessen und gespeichert wird,
b) ein Parameter (K) welcher eine vorgegebene Signalfläche auf dem Aufzeichnungsträger (14) pro Proben-Dichte-Einheit bestimmt, abgespeichert wird, und
c) die gemessenen relativen Dichten (X _n ) der Fraktionen (Alb, α₁, α₂, β, γ ) derart verarbeitet werden, daß auf dem Aufzeichnungsträger (14) die Fläche zwischen der Densitogramm-Kurve (I, II) und der Grundlinie gleich ist dem Produkt K × T.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- die gemessenen relativen Dichten (X _n ) in einem Speicher (7) gespeichert werden,
- die aufeinanderfolgenden gemessenen relativen Dichten (X _n ) zu einer Summe ( Σ X _n ) aufsummiert werden,
- Werte für den Parameter (K), eine Verstärkung (Y) des Aufzeichnungsgerätes (13) und den Aufzeichnungsmaßstab (P) des Aufzeichnungsgerätes (13) vorgegeben werden,
- ein Ausgangssignal/Dichte-Quotienten (R) nach der Gleichung berechnet wird,
- und die gemessenen relativen Dichten (X _n ) mit dem Ausgangssignal/Dichte-Quotienten (R) multipliziert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamt-Protein-Dichte (T) der Probe in einem Speicher (10) gespeichert wird und die Berechnung des Ausgangssignal/Dichte-Quotienten (R) durch Auslesen der Dichte (D) aus dem Speicher (10) durchgeführt wird.