DE19921374C2 - Vorrichtung zur dreidimensionalen optischen Untersuchung eines Objektes mit Beleuchtung durch eine Lochplatte - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopvorrichtung zur dreidimensionalen Untersuchung eines Objektes nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.

In der confocalen Mikroskopie wird das Objekt in an sich bekannter Weise durch eine Lochblende beleuchtet und der beleuchtete Punkt wird mit einem Strahlungsempfänger beobachtet, dessen lichtempfindliche Fläche ebenso klein ist wie der beleuchtete Punkt (Minsky, M., US Patent 3 013 467 und Minsky, M., Memoir on inventing the confocal scanning microscope, Scanning 10, p. 128-138). Confocale Mikroskopie hat gegenüber konventioneller den Vorteil, daß sie Tiefenauflösung (Messung in z- Koordinate) liefert und daß wenig Streulicht bei der Bildaufnahme entsteht. Nur die im Focus befindliche Ebene des Objektes wird hell beleuchtet. Objektebenen oberhalb und unterhalb der Focusebene erhalten deutlich weniger Licht. Das Bild wird durch einen Scannvorgang aufgebaut. Es können einer oder mehrere Punkte gleichzeitig beleuchtet und beobachtet werden.

Drei Methoden für den Scannvorgang sind bekannt: Spiegelscannen, Nipkowscheibe und electronisches Scannen mit Matrixempfänger. Weitere Einzelheiten zum Stand der Technik beim Scannen mit Spiegel und mit Nipkowscheibe finden sich im Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press, New York, London (Hrsg. James B. Pawley).

Ein confocales Bildaufnahmesystem mit confocaler Beleuchtung durch eine Lochplatte und electronischem Scannen durch Matrixempfänger wurde erstmals in DE 40 35 799 A1 vorgeschlagen. Dabei kommt ein Matrixempfänger zum Einsatz, dessen Pixel nur auf einem Teil (z. B. 30%) der dem Pixel zugeordneten Fläche lichtempfindlich sind und auf der Beleuchtungsseite wird typischerweise eine Lochplatte eingesetzt, die ebenso viele Löcher hat wie der Bildsensor lichtempfindliche Pixel. Die Tiefeninformation ergibt sich durch Aufnahme mehrerer Bilder aus verschiedenen Focusebenen und Auswertung des Helligkeitsmaximums individuell für die verschiedenen Pixel im Computer.

In der Druckschrift DE 196 48 316 C1 wird eine Anordnung geschildert, bei der typischerweise zugeordnet zu je vier Empfängerpixeln ein Beleuchtungsloch auf der Lochplatte und unmittelbar vor dem Matrixempfänger ein Prismenarray vorgesehen ist. Das Prismenarray wirkt als strahlformendes Element, mit dem das Licht eines jeden Beleuchtungspunktes so aufgespalten wird, daß sich außerhalb des Focus zwei halbmondförmige Bilder ergeben. In der Druckschrift DE 196 51 667 A1 ist eine Anordnung beschrieben, bei der ebenfalls typischerweise je vier Empfängerpixeln ein Beleuchtungsloch auf der Lochplatte zugeordnet ist und die unmittelbar vor dem Empfängerarray ein Array anamorphotischer Linsen enthält. Jedem Beleuchtungsloch ist eine Linse zugeordnet. Die anamorphotischen Linsen wirken hier ebenfalls als strahlformende Elemente, so daß sich im Focus ein kreisförmiges und außerhalb ein ovales Bild des Beleuchtungspunktes ergibt. Bei den beiden letztgenannten Anordnungen wird die Tiefeninformation durch Auswertung der Differenz der Lichtsignale benachbarter Pixel gewonnen.

Die Anordnungen nach DE 40 35 799 A1, DE 196 48 316 C1, und DE 196 51 667 A1 haben unter anderem den Vorteil, daß sehr viele Tiefenmeßpunkte gleichzeitig aufgenommen werden können und sie haben den Nachteil, daß zwischen den Beleuchtungspunkten kleine Teilflächen (Lücken) der Probe nicht ohne weiteres erfaßt werden können. In DE 40 35 799 A1 ist deshalb vorgeschlagen worden, mit optischen Mitteln das Beleuchtungspunktraster auf der Probe um kleine Wege zu verschieben oder die Probe um kleine Wege zu verschieben. Beide Vorgehensweisen haben den Nachteil, daß sie aufwendig und justierempfindlich sind.

Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung zu schaffen, um computergesteuert das Meßpunktraster auf der Probe so zu verschieben, daß auch die Lücken zwischen den Beleuchtungspixeln erfaßt werden können.

Erfindungsgemäß geschieht das, indem Lochplatte, Strahlungsteiler, Empfängerarray und - soweit vorhanden - auch das strahlformende Element in einer kompakten Baugruppe zusammengefaßt werden, die durch feinmechanische Stellelemente verschoben wird. Das hat auch den Vorteil, daß unabhängig von dem gewählten Vergrößerungsmaßstab der Abbildungsoptik immer die gleichen Scannwege zur Abtastung der Lücken zurückzulegen sind.

Mit DE 196 40 421 A1 ist bereits ein monolithisch ausgebildeter Strahlteilerwürfel mit genau einem Sensor- und einem Empfängerelement sowie einem strahlformenden Element bekannt geworden, die jedoch der bidirektionalen optischen Datenübertragung dient. Sie bringt für die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe keine Lösung, da Mittel zur Bildgebung fehlen.

Mit DE 197 40 678 A1 ist bereits eine Anordnung mit einer als Piezoaktuator ausgebildeten Verschiebemechanik für eine Kollimatorlinse bekannt geworden, die der optischen Vermessung eines Objektes dient. Da nur jeweils ein einziger Meßpunkt erfaßt wird und da die Anordnung interferometrisch arbeitet, ist die Messung mit dieser Anordnung zeitaufwendig. Die Vorteile, die sich bei Anwendung eines Beleuchtungsrasters ergeben, fehlen hier.

Die vorliegende Erfindung bringt gegenüber dem Stande der Technik den Fortschritt, in kurzer Zeit mit einem CCD-Empfänger und einem an sich bekannten Beleuchtungsraster auch die Bereiche der Probe messen zu können, die in den Lücken zwischen den Beleuchtungspunkten liegen.

Die Figuren zeigen als Beispiel mögliche praktische Ausführungen nach der Erfindung.

Fig. 1 zeigt eine Gesamtanordnung einer Bildaufnahmeeinrichtung nach der Erfindung

Fig. 2a und 2b zeigen eine kompakte Baugruppe mit Lochplatte, Strahlteilerwürfel, strahlformendem Element und Matrix-Strahlungsempfänger.

Fig. 3a und Fig. 3b zeigen das Beleuchtungspunktraster und verschiedene Möglichkeiten des Scanweges, der von der kompakten Baugruppe ausgeführt wird.

Fig. 4a zeigt den zeitlichen Ablauf der Microscanbewegung für rasches Abscannen der Lücken ohne örtliche Auflösung

Fig. 4b zeigt den zeitlichen Ablauf der Microscannbewegeung für Abscannen der Lücken mit örtlicher Auflösung.

In Fig. 1 ist mit (11) eine Lichtquelle, z. B. eine Halogenlampe, bezeichnet, die mit Hilfe des Kondensors (11k), evtl. über ein Filter (11f) (zur Aussonderung eines ausreichend schmalen Spektralbereiches), ein Beleuchtungsraster beleuchtet, das sich in der Beleuchtungsebene (11b) befindet. Es besteht aus einer lichtundurchlässigen Schicht mit kleinen Löchern. Eine derartige Schicht kann in bekannter Weise z. B. aus Chrom auf einer hergestellt werden. Die Löcher sind in der Schicht ebenso rasterförmig angeordnet wie die lichtempfindlichen Bereiche des Empfängerarrays (17). Die Löcher sind erheblich kleiner als ihr Abstand. Der Abstand der Löcher bzw. Bereiche von Mitte zu Mitte wird als Rastermaß bezeichnet.

Das Beleuchtungsraster wird durch die Linsen (13o, 13u) in die Focusebene (13f) abgebildet, so daß das Objekt (14) mit rasterförmig angeordneten Lichtpunkten beleuchtet wird. Bei nicht transparenten Objekten kann nur die Oberfläche (140) beleuchtet werden, während bei transparenten Objekten auch Schichten (14 s) im Inneren mit den Lichtpunkten beleuchtet werden können. Die vom Objekt in der Focusebene (13f) reflektierten Lichtstrahlen werden von den Linsen (13u, 13o) über einen Strahlteiler (16) zum Beispiel in der Empfängerebene (17b) focussiert. Zwischen den Linsen (13o, 13u) ist üblicherweise eine sog. Telezentrie-Blende (13t) angeordnet, welche dafür sorgt, daß der Mittenstrahl (13m) parallel zur optischen Achse (10) auf das Objekt (14) trifft, so daß die Lage der Lichtpunkte auf dem Objekt sich nicht ändert, wenn das Objekt (14) in Richtung der optischen Achse (10) bewegt wird.

Erfindungsgemäß ist die weiter unten ausführlicher erläuterte kompakte Baugruppe über ein Stellglied (24a) mit dem Tragarm (21) verbunden. Eine Steuerleitung (18w) ermöglicht die Ansteuerung der Microscannbewegung durch den Computer (18).

Der vorerwähnte Strahlteiler (16) ist für Auflichtanwendungen als halbdurchlässiger Spiegel ausgeführt. Für Fluoreszenzanwendungen wird vorzugsweise in an sich bekannter Weise ein dichroitischer Spiegel eingesetzt.

Das Objekt (14) kann durch eine Verstellvorrichtung (15) in allen 3 Raumrichtungen bewegt werden, so daß verschiedene Schichten (14s) und verschiedene Bereiche des Objektes (14) abgescannt werden können.

Die Signale des Empfängerarrays (17) werden über die Verbindungsleitung (17v) in einen Computer (18) übertragen, der in bekannter Weise die Auswertung übernimmt und auf einem Bildschirm (18b) die Ergebnisse der Auswertung z. B. in Form von graphischen Darstellungen oder Bildern wiedergibt. Der Computer (18) kann auch über die Verbindungsleitung (18v) die Verschiebung der Focusebene (13f) im Objekt und das Scannen in x- und y- Richtung steuern. Diese Steuerung kann im Computer als festes Programm vorliegen oder abhängig von den Ergebnissen der Auswertung erfolgen.

In Fig. 2a und 2b ist die kompakte Baugruppe aus Beleuchtungsraster (12l, 12s), strahlformendem Element(70), Teilerspiegel (16) und Empfängerarray (17) in einem größeren Maßstab und in zwei verschiedenen Ansichten dargestellt. Der Strahlteilerwürfel (20) ist auf einer Seite mit dem Beleuchtungsraster (12l, 12s) versehen. Auf der anderen trägt er in diesem Beispiel strahlformende Elemente (70) und den Strahlungsempfänger (17). Als strahlformende Elemente können, wie in DE 196 48 316 C1 vorgesehen, Prismenpaare oder, wie in DE 196 51 667 A1 vorgesehen, anamorphotische Linsen Verwendung finden.

Mit (16) ist die Strahlteilerschicht bezeichnet. Erfindungsgemäß ist die kompakte Baugruppe über ein Stellglied (24a), den Tragarm (21) und das Stellglied (24b) mit dem Widerlager (= feststehende Fläche) (25) verbunden. Wie bei Erläuterung von Fig. 1 schon erwähnt, werden die Stellglieder vom Rechner angesteuert, um erfindungsgemäß die Microscannbewegung auszuführen.

Das strahlformende Element muß nicht in jedem Falle vorhanden sein. Zum Beispiel ist in DE 40 35 799 A1 ist eine Anordnung geschildert, die keiner strahlformenden Elemente bedarf. Dort wird die Tiefenauflösung durch Einsatz eines Matrixempfängers erreicht, dessen Pixel nur auf einem Teil ihrer Fläche lichtempfindlich sind.

Fig. 3a zeigt die Beleuchtungspunkte (121) in der Probenebene und als Beispiel einen mäanderförmigen Weg (23a), den sie in der Probenebene in einer x-y-Scannbewegung zurücklegen. Erfindungsgemäß werden auf diese Weise die Lücken, die sich zwischen den Beleuchtungspunkten befinden, ebenfalls in Bildinformation umgesetzt, die vom Computer (18) ausgewertet werden kann.

Fig. 3b gibt eine spiralförmige Bewegung wieder. Mit (23b) ist eine Bewegung gekennzeichnet, die kontinuierlich erfolgt. Der gleiche Scanweg kann, wie in (23c) wiedergegeben, als Aufeinanderfolge von Bewegungsschritten zurückgelegt werden, so daß die Beleuchtungspunkte nacheinander schrittweise die Positionen 0, 1, 2, . . ., 23, 24, 0 und so fort annehmen.

Fig. 4a zeigt den zeitlichen Ablauf von Bildaufnahme, Bewegung der kompakten Baugruppe und Auslesen des Bildes aus dem Matrixsensor für den Fall, daß zur integralen Aufnahme der den Beleuchtungspunkten zugeordneten Probenteilflächen die Microscanbewegung während der Aufnahme eines Bildes (TV-Frame) erfolgt. Mit 1 sind die Zeitphasen der Bildaufnahme gekennzeichnet, in denen auf dem Strahlungsempfänger eingestrahltes Licht in Ladungsträger umgesetzt wird. In den Pausen zwischen den Bildaufnahmen findet das Auslesen 2 der Ladungen der einzelnen Pixel aus dem Strahlungsempfängerarray statt. Erfindungsgemäß wird während der Bildaufnahme in diesem Falle die kompakte Baugruppe in einer Mäander- oder in einer Spiralbewegung so geführt, daß die im Raster bestehenden Lücken auf der Probenoberfläche abgetastet werden. Dies ist in 3 wiedergegeben. So wird ein integrales Signal über die entsprechenden Teilflächen der Probe gewonnen. Sofort nach Aufnahme eines Bildes kann der nächste Schritt in z-Richtung mit dem Antrieb 15 (Fig. 1) durchgeführt werden.

Fig. 4b zeigt den zeitlichen Ablauf von Bildaufnahme, Bewegung der kompakten Baugruppe und Auslesen des Bildes aus dem Matrixsensor für den Fall, daß zur ortsaufgelösten Aufnahme der den Beleuchtungspunkten zugeordneten Probenteilflächen die Microscanbewegung zwischen zwei aufeinanderfolgenden TV- Frames nur einen Schritt vollführt. Mit 1 sind die Zeitphasen der Bildaufnahme gekennzeichnet, in denen auf den Strahlungsempfänger eingestrahltes Licht in Ladungsträger umgesetzt wird. In den Pausen zwischen den Bildaufnahmen findet das Auslesen 2 der Ladungen der einzelnen Pixel aus dem Strahlungsempfängerarray statt. Während der Bildaufnahme steht in diesem Falle die kompakte Baugruppe still, so daß in diesem Falle je ausgelesenem Bild nur ein kleiner Teil der Probenoberfläche aufgenommen wird. Nach der Aufnahme eines Bildes wird die kompakte Baugruppe um einen Schritt bewegt, z. B. von 0 nach 1. Nach der Aufnahme des nächsten Bildes dann von 1 nach 2 und so fort, bis - wenn erwünscht - alle Positionen von 0 bis 24 (siehe 23c in Fig. 3b) eingenommen worden sind. Dies ist in 3 wiedergegeben. Erst nach 25 Bildern wird bei diesem Beispiel hochauflösender 3D-Bilderfassung der nächste Schritt in z-Richtung mit dem Antrieb (15) erfolgen.

Claims (5)

1. Mikroskopvorrichtung zur dreidimensionalen Untersuchung eines Objektes,

• - mit einem in einer Beleuchtungsebene (11b) angebrachten Beleuchtungsraster (12l, 12s) mit einem vorgegebenen Rastermaß, das über ein oder mehrere optische Elemente (13o, 13u) in die Focusebene am Ort des zu vermessenden Objektes (14) abgebildet wird und dort eine Vielzahl von Leuchtpunkten erzeugt
• - und mit einem Empfängerarray (17) mit voneinander getrennten lichtempfindlichen Bereichen in der Beobachtungsebene, welches das am oder im Objekt (14) reflektierte oder durch Fluoreszenz erzeugte und von den optischen Elementen (13o, 13u) übertragene Licht in Form von diskreten Bildern registriert,

dadurch gekennzeichnet,

• - daß das Beleuchtungsraster (12l, 12s), das Empfängerarray (17) und ein zugehöriger Strahlteilerspiegel (16) als eine kompakte, monolithische Baugruppe ausgeführt ist, die vorzugsweise auch ein strahlformendes Element (70) aufweist
• - und daß diese Baugruppe vermittels Stellgliedern (24a, 24b) um Bruchteile des Abstandes zweier benachbarter Leuchtpunkte verschiebbar ist und dabei eine Mikroscanbewegung der Leuchtpunkte gewährleistet.

2. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stellglieder (24a, 24b) als Piezoaktuatoren ausgebildet sind.

3. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroscanbewegung der Leuchtpunkte während der Registrierung ein und desselben Bildes erfolgt, wobei Probenbereiche integral erfaßt werden.

4. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroscanbewegung der Leuchtpunkte außerhalb der Registrierung eines Bildes zwischen der Aufnahme zweier aufeinanderfolgender Bilder erfolgt, wobei Probenbereiche ortsaufgelöst erfaßt werden.

5. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die maximale durch die Stellglieder (24a, 24b) erzeugbare Verstellbewegung mindestens so groß ist wie der Abstand der Leuchtpunkte.