DE102014108044A1

DE102014108044A1 - Light microscope with a rotatable disc and method of microscopy with this

Info

Publication number: DE102014108044A1
Application number: DE102014108044.0A
Authority: DE
Inventors: Manfred Loth; Gunter Möhler
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2015-12-17
Anticipated expiration: 2034-06-07
Also published as: DE102014108044B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere die Gewinnung konfokaler Aufnahmen gemäß der Aperture Correlation Microscopy ermöglicht. Die Erfindung betrifft im Weiteren ein Lichtmikroskop mit einer rotierbaren Scheibe (04) und mit Lichtquellen (14, 16, 17), welche die Aufnahme eines Übersichtsbildes ermöglichen. Gemäß dem Verfahren wird eine in einem Beleuchtungsstrahlengang (03) angeordnete Scheibe (04) rotiert. Die Scheibe (04) umfasst einen strukturierten Kreisausschnitt (08) zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht und einen unstrukturierten Kreisausschnitt (07) zur Aufnahme des Übersichtsbildes. Es erfolgt abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet. Weiterhin erfolgt ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.The present invention relates to a method for microscopy of a sample with a light microscope, which in particular enables the acquisition of confocal images according to Aperture Correlation Microscopy. The invention further relates to a light microscope with a rotatable disc (04) and light sources (14, 16, 17), which allow the recording of an overview image. According to the method, a disc (04) arranged in an illumination beam path (03) is rotated. The disk (04) comprises a structured circular cutout (08) for producing structured illumination light and an unstructured circular cutout (07) for recording the overview image. Alternate illumination of the sample occurs at least with light in a first wavelength range and with light in a second wavelength range different from the first wavelength range when the unstructured circular cutout (07) of the disk (04) is located in the illumination beam path (03). Furthermore, the sample is illuminated alternately at least with light in the first wavelength range and with light in the second wavelength range, in each case at a frequency above a flicker fusion frequency, when the structured circular cutout (08) of the disc (04) is located in the illumination beam path (03).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere eine rotierende Scheibe (Spinning Disk) mit einem strukturierten Kreisausschnitt umfasst, zur Durchführung einer sogenannten Aperture Correlation Microscopy. Die Erfindung betrifft im Weiteren ein Lichtmikroskop mit einer rotierbaren Scheibe (Spinning Disk) und mit Lichtquellen, welche die Aufnahme eines Übersichtsbildes ermöglichen. The present invention initially relates to a method for microscopying a sample with a light microscope, which in particular comprises a rotating disk (spinning disk) with a structured circular cutout, for carrying out a so-called aperture correlation microscopy. The invention further relates to a light microscope with a rotatable disc (spinning disk) and with light sources, which enable the recording of an overview image.

Die DE 10 2012 007 045 A1 zeigt eine Vorrichtung zur konfokalen Mikroskopie, bei welcher zusätzlich zur konfokalen Information eine Weitfeldinformation aufgenommen wird. Im Beleuchtungsstrahlengang befindet sich eine Anregungsmaske, die bevorzugt ein- oder zweidimensionale Strukturierungen aufweist. Die Anregungsmaske ist für ein Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent, während sie einem Licht mit einer zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Struktur aufprägt. Die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften können durch unterschiedliche Wellenlängenbereiche gebildet sein. Das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft ist zur Gewinnung der konfokalen Information vorgesehen, während das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft die Gewinnung der Weitfeldinformation ermöglichen soll. The DE 10 2012 007 045 A1 shows a device for confocal microscopy, in which in addition to the confocal information a wide-field information is recorded. In the illumination beam path there is an excitation mask, which preferably has one-dimensional or two-dimensional structuring. The excitation mask is transparent to a light having a first physical property, while imparting a spatial structure to a light having a second physical property. The different physical properties can be formed by different wavelength ranges. The light having the second physical property is for obtaining the confocal information, while the light having the first physical property is for enabling the extraction of the far-field information.

Die DE 10 2012 009 836 A1 zeigt ein konfokales Lichtmikroskop mit einer polychromatischen Lichtquelle. Im Beleuchtungsstrahlengang befindet sich ein strukturiertes Element zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht. Das Lichtmikroskop umfasst weiterhin Fokussiermittel zum Erzeugen einer Tiefenauflösung. Die Fokussiermittel weisen eine chromatische Längsaberration auf. The DE 10 2012 009 836 A1 shows a confocal light microscope with a polychromatic light source. In the illumination beam path is a structured element for generating structured illumination light. The light microscope further comprises focusing means for generating a depth resolution. The focusing means have a longitudinal chromatic aberration.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Darstellung eines farbigen Übersichtsbildes einer zu mikroskopierenden Probe für die Einrichtung eines Objektivs eines konfokalen Lichtmikroskops zu verbessern und auch ein unmittelbares Betrachten der im Lichtmikroskop befindlichen Probe zu erleichtern. The object of the present invention is to improve the representation of a colored overview image of a sample to be microscoped for the setup of a lens of a confocal light microscope and also to facilitate a direct viewing of the sample in the optical microscope.

Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch ein Lichtmikroskop gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 6. Said object is achieved by a method according to the appended claim 1 and by a light microscope according to the attached independent claim 6.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere die Gewinnung konfokaler Aufnahmen gemäß der Aperture Correlation Microscopy ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zum einen die Aufnahme eines farbigen Übersichtbildes, welches zusätzlich zu den konfokalen Aufnahmen gewonnen wird und die verbesserte Einrichtung eines Objektivs erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zum anderen das flimmerfreie unmittelbare Betrachten der Probe durch einen Benutzer. The method according to the invention is used to microscopy a sample with a light microscope, which in particular makes it possible to obtain confocal images according to Aperture Correlation Microscopy. On the one hand, the method according to the invention makes it possible to record a colored overview image, which is obtained in addition to the confocal recordings and permits the improved setting up of a lens. On the other hand, the method according to the invention makes possible the flicker-free direct viewing of the sample by a user.

Gemäß dem Verfahren wird eine in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Scheibe rotiert. Derartige Scheiben werden auch als Messscheibe oder als Spinning Disk bezeichnet. Die Scheibe umfasst einen strukturierten Kreisausschnitt zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht, insbesondere zur Durchführung der Aperture Correlation Microscopy. Die Scheibe umfasst weiterhin einen unstrukturierten Kreisausschnitt, welcher die Aufnahme eines Übersichtsbildes erlaubt. Der unstrukturierte Kreisausschnitt ist transparent und bevorzugt durch einen freien Durchgang, d. h. durch eine Öffnung in der Scheibe gebildet, oder er umfasst zumindest einen solchen freien Durchgang. Jedenfalls ist der unstrukturierte Kreisausschnitt bzw. der freie Durchgang der Scheibe dazu geeignet, dass durch diesen hindurch das Übersichtsbild der Probe aufgenommen werden kann. Die Scheibe kann weitere Kreisausschnitte, beispielweise opake Kreisausschnitte umfassen. Die rotierende Scheibe führt zu periodischen Phasen, in denen die Probe mit dem strukturierten Licht beleuchtet wird, und zu periodischen Phasen, in denen die Aufnahme des Übersichtsbildes ermöglicht ist. Die Scheibe befindet sich gleichfalls in einem Bildaufnahmestrahlengang. Bei den beiden Kreisausschnitten handelt es sich insbesondere um Kreissektoren. According to the method, a disc arranged in an illumination beam path is rotated. Such disks are also referred to as a measuring disk or spinning disk. The disk comprises a structured circular cutout for producing structured illumination light, in particular for carrying out the aperture correlation microscopy. The disc further comprises an unstructured circular section, which allows the recording of an overview image. The unstructured circular cutout is transparent and preferred by a free passage, i. H. formed by an opening in the disc, or it comprises at least one such free passage. In any case, the unstructured circular cutout or the free passage of the disc is suitable for being able to receive the overview image of the sample through it. The disc may comprise further circular cutouts, for example opaque circular cutouts. The rotating disk leads to periodic phases, in which the sample is illuminated with the structured light, and to periodic phases, in which the recording of the overview image is possible. The disc is also located in an imaging beam path. The two circular sections are in particular circular sectors.

Gemäß dem Verfahren erfolgt ein Beleuchten der Probe, wenn sich der unstrukturierte transparente Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, um in dieser Zeit das Übersichtsbild aufzunehmen. Um ein farbiges Übersichtsbild mit einer monochromatischen Detektionseinheit aufnehmen zu können, erfolgt ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich in den zeitlichen Abschnitten, in denen sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Dies bedeutet nicht, dass bereits innerhalb eines einzigen dieser zeitlichen Abschnitte, d. h. innerhalb eines einzigen Durchlaufes des unstrukturierten Kreisausschnittes der Scheibe durch den Beleuchtungsstrahlengang der Wellenlängenbereich gewechselt werden muss. Im einfachsten Fall werden die mindestens zwei Wellenlängenbereiche aufeinanderfolgend für je eine Umdrehung der rotierenden Scheibe aktiviert. Das farbige Übersichtbild wird bevorzugt aus den spektralen Anteilen der mindestens zwei Wellenlängenbereiche additiv zusammengesetzt. Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, stellt einen ersten Modus des Beleuchtens dar. According to the method, the sample is illuminated when the unstructured transparent circular cutout of the slice is in the illumination beam path in order to record the overview image during this time. In order to be able to record a color overview image with a monochromatic detection unit, the sample is alternately illuminated at least with light in a first wavelength range and with light in a second wavelength range different from the first wavelength range in the temporal portions in which the unstructured circular cutout of the slice in the Illumination beam path is located. This does not mean that within a single one of these temporal sections, ie within a single pass of the unstructured circular section of the pane through the illumination beam path, the wavelength range must be changed. In the simplest case, the at least two wavelength ranges are activated in succession for one revolution of the rotating disk. The colored overview image is preferably composed additively of the spectral components of the at least two wavelength ranges. The alternating illumination of the sample at least with light in the first wavelength range and with light in the second Wavelength range, when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path, represents a first mode of lighting.

Gemäß dem Verfahren erfolgt außerdem ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgt das aufeinander folgende Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz und das aufeinander folgende Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich erfolgt ebenfalls mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wobei sich das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich abwechseln. In addition, according to the method, the sample is illuminated alternately at least with light in the first wavelength range and with light in the second wavelength range, each with a frequency above the flicker fusion frequency, when the structured circular cutout of the slice is in the illumination beam path. Thus, the successive illumination of the sample with light in the first wavelength range at a frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz and the successive illumination of the sample with light in the second wavelength range is also at a frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz, wherein the illumination of the sample with light in the first Wavelength range and illuminating the sample with light in the second wavelength range alternate.

Bei der Flimmerverschmelzungsfrequenz handelt es sich um die Frequenz, bei der eine Folge von Lichtblitzen vom menschlichen Sehsinn als ein kontinuierliches Licht wahrgenommen wird. Unterhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz tritt ein Flimmern auf. Die Flimmerverschmelzungsfrequenz hängt von der Stärke der Reize, dem Adaptationszustand der Netzhaut sowie vom allgemeinen Aktivationsniveau des menschlichen Betrachters ab. Flicker fusion frequency is the frequency at which a train of flashes of light is perceived by the human visual sense as a continuous light. Below the flicker-fuse frequency, flicker occurs. The flicker fusion frequency depends on the strength of the stimuli, the state of adaptation of the retina and the general level of activation of the human observer.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Flimmerverschmelzungsfrequenz bevorzugt mehr als 30 Hz; weiter bevorzugt mehr als 50 Hz und besonders bevorzugt mehr als 100 Hz. In carrying out the method according to the invention, the flicker fusion frequency is preferably more than 30 Hz; more preferably more than 50 Hz and more preferably more than 100 Hz.

Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit der Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, dient dazu, dass die Probe derart beleuchtet wird, dass sie durch den Benutzer unmittelbar und ohne störendes Flimmern betrachtet werden kann. Der Benutzer kann die in einem Messraum des Lichtmikroskops befindliche Probe beobachten, ohne dass die Probe bzw. der Messraum für den Benutzer flimmert. Alternately illuminating the sample at least with light in the first wavelength range and with light in the second wavelength range at the frequency above the flicker fusion frequency, when the patterned circular section of the slice is in the illumination beam path, serves to illuminate the sample so that it passes through the sample User can be viewed directly and without annoying flicker. The user can observe the sample located in a measuring space of the light microscope without flickering the sample or the measuring space for the user.

Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit der Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, stellt einen zweiten Modus des Beleuchtens dar. The alternating illumination of the sample at least with light in the first wavelength range and with light in the second wavelength range in each case with the frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz when the structured circular section of the disc is in the illumination beam path, represents a second mode of lighting.

Der erste Modus des Beleuchtens und der zweite Modus des Beleuchtens alternieren während des Rotierens der Scheibe. Bevorzugt wechseln sich der erste Modus des Beleuchtens und der zweite Modus des Beleuchtens während einer Umdrehung der Scheibe genau ein Mal ab. Bevorzugt ist dabei permanent eine Beleuchtung gegeben, entweder im ersten Modus des Beleuchtens oder im zweiten Modus des Beleuchtens, sodass die Probe ständig durch das sich abwechselnde Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, beleuchtet wird. Zwar wird die Probe im ersten Modus mit einer Frequenz ggf. unterhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz beleuchtet, jedoch führen die kurzen zeitlichen Abschnitte des ersten Modus nicht dazu, dass die Probe für den Betrachter flimmernd erscheint, da das flimmerfreie Beleuchten im zweiten Modus für den visuellen Sinneseindruck überwiegt. Die Scheibe liegt im Bildaufnahmestrahlengang sowohl der konfokalen Aufnahmen als auch des Übersichtsbildes. The first mode of lighting and the second mode of lighting alternate during rotation of the disk. Preferably, the first mode of lighting and the second mode of lighting alternate exactly once during one revolution of the disk. In this case, illumination is preferably given permanently, either in the first mode of illumination or in the second mode of illumination, so that the sample is constantly illuminated by the alternating light, which lies at least in the first wavelength range and in the second wavelength range. Although in the first mode the sample is illuminated at a frequency that may be below the fibrillation frequency, the short temporal portions of the first mode do not cause the sample to flicker for the viewer because the flicker-free illumination in the second mode outweighs the visual sensory impression , The disc lies in the image recording beam path of both the confocal images and the overview image.

Da ein abwechselndes Beleuchten der Probe mit dem Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, sowohl dann erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, als auch dann, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, kann ein quasi kontinuierliches Beleuchten der Probe gewährleistet werden. Das abwechselnde Beleuchten in denjenigen Zeitabschnitten, in denen sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, erfolgt für jeden der Wellenlängenbereiche jeweils mit der Einzelfrequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz. Besonders bevorzugt führt diese Beleuchtung dazu, dass die Probe sowohl im strukturierten als auch im unstrukturierten Modus im Wesentlichen zeitlich durchgehend beleuchtet wird. Wahrnehmbare Helligkeitsschwankungen treten damit nicht mehr auf. Damit wird die Probe in Bezug auf den menschlichen Sehsinn flimmerfrei beleuchtet. Somit ist das beim Benutzer entstehende Bild beim unmittelbaren Betrachten der Probe flimmerfrei. Since alternating illumination of the sample with the light, which is at least in the first wavelength range and in the second wavelength range, takes place both when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path and when the structured circular section of the disc is in the illumination beam path , a quasi-continuous illumination of the sample can be ensured. The alternating illumination in the time periods in which the structured circular section of the disc is in the illumination beam path, takes place for each of the wavelength ranges each with the single frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz. Particularly preferably, this illumination results in the sample being illuminated substantially in time, both in the structured and in the unstructured mode. Perceptible fluctuations in brightness no longer occur. Thus, the sample is illuminated flicker-free with respect to the human visual sense. Thus, the image produced by the user is flicker-free when viewed directly from the sample.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass lediglich durch eine veränderte Ansteuerung bereits vorhandener Komponenten ein flimmerfreies unmittelbares Betrachten der Probe durch den Benutzer möglich ist, ohne dass es hierfür zusätzlicher Komponenten bedarf. A particular advantage of the method according to the invention is that a flicker-free direct viewing of the sample by the user is possible only by changing the control of already existing components, without requiring additional components for this purpose.

Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Bei diesen Ausführungsformen erfolgt das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgen das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz und das Beleuchten der Probe mit Licht im dritten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wobei sich das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und das Beleuchten der Probe mit Licht im dritten Wellenlängenbereich abwechseln. Bei diesen Ausführungsformen kann das farbige Übersichtbild aus den spektralen Anteilen der drei Wellenlängenbereiche additiv zusammengesetzt werden, sodass zumindest ein sehr großer Teil der durch den Menschen wahrnehmbaren Farben im Übersichtsbild wiedergegeben werden kann. In particularly preferred embodiments of the method according to the invention, the alternating illumination of the sample is carried out with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and with light in one of the first wavelength range and the second Wavelength range of different third wavelength range, when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path. In these embodiments, alternately illuminating the sample with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range, and with light in the third wavelength range, each at a frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz when the structured circular section of the disc is in the illumination beam path. Thus, illuminating the sample with light in the first wavelength range at a frequency above the flicker fusion frequency, illuminating the sample with light in the second wavelength range at a frequency above the flicker fusion frequency and illuminating the sample with light in the third wavelength range at a frequency above the flicker fusion frequency, wherein the illumination of the sample with light in the first wavelength range, the illumination of the sample with light in the second wavelength range and the illumination of the sample with light in the third wavelength range alternate. In these embodiments, the color overview image can be additively composed of the spectral portions of the three wavelength ranges, so that at least a very large portion of the human-perceivable colors can be reproduced in the overview image.

Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, liegen der erste Wellenlängenbereich im roten Spektralbereich des sichtbaren Lichtes, der zweite Wellenlängenbereich im grünen Spektralbereich des sichtbaren Lichtes und der dritte Wellenlängenbereich im blauen Spektralbereich des sichtbaren Lichtes. Insoweit ist ein RGB-System ausgebildet, welches als Farbsystem weit verbreitet ist und aufwandsarm zur Generierung des farbigen Übersichtsbildes genutzt werden kann. In particularly preferred embodiments of the method according to the invention, the first wavelength range lies in the red spectral range of the visible light, the second wavelength range in the green spectral range of the visible light and the third wavelength range in the blue spectral range of the visible light. In that regard, an RGB system is formed, which is widely used as a color system and can be used with little effort to generate the colored overview image.

Während des Beleuchtens der Probe mit dem strukturierten Beleuchtungslicht, d. h. während der periodisch auftretenden zeitlichen Phasen, in denen sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, werden bevorzugt die konfokalen Aufnahmen gewonnen. Das zu strukturierende Beleuchtungslicht wird bevorzugt mit einer Hauptlichtquelle erzeugt und ist unabhängig von dem Licht im ersten Wellenlängenbereich, dem Licht im zweiten Wellenlängenbereich und den Licht im dritten Wellenlängenbereich. While illuminating the sample with the patterned illumination light, i. H. during the periodically occurring phases in which the structured circular section of the disk is located in the illumination beam path, the confocal recordings are preferably obtained. The illuminating light to be structured is preferably produced with a main light source and is independent of the light in the first wavelength range, the light in the second wavelength range and the light in the third wavelength range.

Während des Beleuchtens der Probe mit dem sich abwechselnden Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, in den periodisch auftretenden zeitlichen Phasen, in denen sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, wird bevorzugt das Übersichtsbild gewonnen. During illumination of the sample with the alternating light, which lies at least in the first wavelength range and in the second wavelength range, in the periodically occurring time phases in which the unstructured circular section of the slice is located in the illumination beam path, the overview image is preferably obtained.

Die konfokalen Aufnahmen und das Übersichtsbild werden bevorzugt jeweils durch monochrome Bildwandlungen erzeugt, wobei zur Erzeugung des farbigen Übersichtsbildes mindestens zwei monochrome Bildwandlungen erfolgen. Die monochromen Bildwandlungen für die konfokalen Aufnahmen und für das Übersichtsbild erfolgen bevorzugt mit einer einzigen monochromen Detektionseinrichtung. Bei der monochromen Bildwandlung wird Licht, welches zumindest den ersten Wellenlängenbereich, den zweiten Wellenlängenbereich und ggf. auch den dritten Wellenlängenbereich umfassen kann, aber bevorzugt dem gesamten visuellen Spektrum entstammen kann, in ein elektrisches Signal gewandelt. The confocal images and the overview image are preferably generated in each case by monochrome image conversions, with at least two monochrome image transformations taking place to produce the colored overview image. The monochrome image transformations for the confocal images and for the overview image preferably take place with a single monochrome detection device. In monochrome image conversion, light which may comprise at least the first wavelength range, the second wavelength range and optionally also the third wavelength range, but preferably originates from the entire visual spectrum, is converted into an electrical signal.

Der erste Wellenlängenbereich, der zweite Wellenlängenbereich und ggf. der dritte Wellenlängenbereich sind bevorzugt jeweils durch ein Linienspektrum gebildet, sodass zur Erzeugung des Lichtes im ersten Wellenlängenbereich, im zweiten Wellenlängenbereich und im dritten Wellenlängenbereich monochromatische Lichtquellen, wie z. B. LEDs verwendbar sind. The first wavelength range, the second wavelength range and possibly the third wavelength range are preferably each formed by a line spectrum, so that for generating the light in the first wavelength range, in the second wavelength range and in the third wavelength range monochromatic light sources such. B. LEDs are used.

Die Einzelfrequenz, mit welcher die Probe jeweils mit Licht im ersten Wellenlängenbereich bzw. mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich bzw. mit Licht im dritten Wellenlängenbereich beleuchtet wird, beträgt bevorzugt mindestens 40 Hz; besonders bevorzugt mindestens 100 Hz. Folglich beträgt eine Globalfrequenz, mit welcher die Probe abwechselnd mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich beleuchtet wird, das Dreifache der genannten Einzelfrequenz, nämlich bevorzugt mindestens 120 Hz und weiter bevorzugt mindestens 300 Hz. Diese Globalfrequenz beträgt besonders bevorzugt mindestens 500 Hz. Bei den genannten Frequenzen ist eine flimmerfreie Beobachtung gewährleistet. The individual frequency with which the sample is illuminated in each case with light in the first wavelength range or with light in the second wavelength range or with light in the third wavelength range is preferably at least 40 Hz; particularly preferably at least 100 Hz. Consequently, a global frequency at which the sample is illuminated alternately with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and with light in the third wavelength range is three times the said single frequency, namely preferably at least 120 Hz and more preferred at least 300 Hz. This global frequency is particularly preferably at least 500 Hz. At the frequencies mentioned a flicker-free observation is ensured.

Die Scheibe wird mit einer Rotationsgeschwindigkeit rotiert, die bevorzugt zwischen 1.000 Umdrehungen/min und 10.000 Umdrehungen/min liegt. Besonders bevorzugt beträgt die Rotationsgeschwindigkeit 3.000 Umdrehungen/min. Entsprechend der Rotationsgeschwindigkeit ergibt sich eine Rotationsfrequenz in Hz, welche ein Sechzigstel der Rotationsgeschwindigkeit in Umdrehungen/min beträgt. The disk is rotated at a rotational speed which is preferably between 1,000 rpm and 10,000 rpm. Particularly preferably, the rotational speed is 3,000 revolutions / min. Corresponding to the rotational speed results in a rotation frequency in Hz, which is one-sixtieth of the rotational speed in revolutions / min.

Das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und ggf. mit Licht im dritten Wellenlängenbereich erfolgt besonders bevorzugt mit einer der Rotationsfrequenz der Scheibe gleichenden Frequenz, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgt während genau einer Umdrehung der Scheibe ein Beleuchten entweder mit Licht im ersten Wellenlängenbereich oder mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich oder mit Licht im dritten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, wobei bei der nächsten Umdrehung der Scheibe ein Beleuchten mit Licht in einem anderen der mindestens zwei bzw. drei Wellenlängenbereiche erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. The alternating illumination of the sample with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and optionally with light in the third wavelength range is particularly preferably carried out with one of the rotational frequency of the disc equal frequency, when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path. Thus, during exactly one revolution of the disc, illumination takes place either with light in the first wavelength range or with light in the second wavelength range or with light in the third wavelength range when the unstructured circular cutout of the disc is in the illumination beam path, with illumination being lit on the next revolution of the disc Light in another of the at least two or three wavelength ranges, if the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path.

Während einer Umdrehung der Scheibe befindet sich bevorzugt entweder der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe oder der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang. During one revolution of the disk, either the unstructured circular section of the disk or the structured circular section of the disk is preferably located in the illumination beam path.

Während der Dauer einer Umdrehung der Scheibe befindet sich der unstrukturierte Kreisausschnitt bevorzugt weniger als die Hälfte der Dauer der Umdrehung im Beleuchtungsstrahlengang. Besonders bevorzugt befindet sich während der Dauer einer Umdrehung der Scheibe der unstrukturierte Kreisausschnitt weniger als 20 % der Dauer der Umdrehung im Beleuchtungsstrahlengang, d.h. der unstrukturierte Kreisausschnitt nimmt ein Kreissegment von weniger als 20 % ein. During the duration of one revolution of the disk, the unstructured circular section is preferably less than half the duration of the rotation in the illumination beam path. More preferably, during the period of one revolution of the disk, the unstructured sector is less than 20% of the duration of the revolution in the illumination beam path, i. the unstructured circular section occupies a circle segment of less than 20%.

Das Licht zum Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, im zweiten Wellenlängenbereich und ggf. im dritten Wellenlängenbereich, welches insbesondere zur Aufnahme des Übersichtbildes und zum unmittelbaren Betrachten der Probe dient, fällt bevorzugt nicht durch die Scheibe. The light for illuminating the specimen with light in the first wavelength range, in the second wavelength range and optionally in the third wavelength range, which is used in particular for capturing the overview image and for directly viewing the specimen, preferably does not fall through the disc.

Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop dient insbesondere der Aperture Correlation Microscopy unter Nutzung einer Spinning Disk. Es umfasst bevorzugt eine Hauptlichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht. Das Lichtmikroskop umfasst weiterhin eine Detektionseinrichtung zum Nachweis des von einer Probe zurückgestrahlten Lichts. Eine weitere Komponente des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops bildet eine Mikroskopoptik zum Leiten des Beleuchtungslichtes auf die Probe und zum Leiten des von der Probe zurückgestrahlten Lichts in Richtung der Detektionseinheit. The light microscope according to the invention is used in particular for aperture correlation microscopy using a spinning disk. It preferably comprises a main light source for providing illumination light. The light microscope further comprises a detection device for detecting the light reflected back from a sample. Another component of the light microscope according to the invention forms a microscope optics for guiding the illumination light to the sample and for guiding the light reflected back from the sample in the direction of the detection unit.

In einem Beleuchtungsstrahlengang ist eine rotierbare Scheibe angeordnet, welche die Spinning Disk darstellt. Die Scheibe weist einen strukturierten Kreisausschnitt zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht aus dem von der Hauptlichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslicht auf. Weiterhin besitzt die Scheibe einen unstrukturierten Kreisausschnitt zur Aufnahme eines Übersichtsbildes. In an illumination beam path, a rotatable disc is arranged, which represents the spinning disk. The disk has a structured circular cutout for producing structured illumination light from the illumination light provided by the main light source. Furthermore, the disc has an unstructured circular section for recording an overview image.

Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst zudem mindestens eine erste Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und eine zweite Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich, um das farbige Übersichtsbild aus mehreren monochromatischen Bildern aufnehmen zu können. The light microscope according to the invention additionally comprises at least one first light source for emitting light in a first wavelength range and a second light source for emitting light in a second wavelength range different from the first wavelength range in order to be able to record the color overview image from a plurality of monochromatic images.

Eine weitere Komponente des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops bildet eine Ansteuereinheit zum Ansteuern zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle. Die Ansteuereinheit ist dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Die Ansteuereinheit ist zudem dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Another component of the light microscope according to the invention forms a drive unit for driving at least the first light source and the second light source. The drive unit is configured to alternately turn on the first light source and the second light source when the unstructured sector of the disk is in the illumination beam path. The drive unit is additionally configured to switch on the first light source and the second light source alternately and in each case at a frequency above a flicker fusion frequency if the structured circular cutout of the pane is located in the illumination beam path.

Die Ansteuereinheit kann als eine Einheit aus zwei Automaten aufgefasst werden. Der erste Automat steuert zumindest die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit dient der erste Automat zum Betreiben zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle im oben beschriebenen ersten Modus. Der zweite Automat steuert zumindest die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit dient der zweite Automat zum Betreiben zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle im oben beschriebenen zweiten Modus. Bevorzugt sind beide Automaten für einen durchlaufenen Betrieb ausgebildet, wobei der erste Automat eine höhere Priorität als der zweite Automat besitzt. The drive unit can be understood as a unit of two machines. The first automaton controls at least the first light source and the second light source when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path. Thus, the first automaton is for operating at least the first light source and the second light source in the first mode described above. The second automaton controls at least the first light source and the second light source when the structured circular cutout of the disc is located in the illumination beam path. Thus, the second machine is for operating at least the first light source and the second light source in the second mode described above. Preferably, both machines are designed for a continuous operation, wherein the first machine has a higher priority than the second machine.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops umfassen weiterhin eine dritte Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich. Bei diesen Ausführungsformen ist die Ansteuereinheit auch zum Ansteuern der dritten Lichtquelle ausgebildet. Die Ansteuereinheit ist dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und die dritte Lichtquelle abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Die Ansteuereinheit ist weiterhin dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und die dritte Lichtquelle abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Particularly preferred embodiments of the light microscope according to the invention further comprise a third light source for emitting light in a third wavelength range different from the first wavelength range and from the second wavelength range. In these embodiments, the drive unit is also designed to drive the third light source. The drive unit is configured to use the first light source, the alternately turn on the second light source and the third light source when the unstructured circular section of the disc is in the illumination beam path. The drive unit is further configured to turn on the first light source, the second light source, and the third light source alternately and each at a frequency above the flicker merge frequency when the patterned slice of the slice is in the illumination beam path.

Die Detektionseinheit ist bevorzugt zur Aufnahme eines konfokalen Mikroskopbildes der mit dem strukturierten Beleuchtungslicht beleuchteten Probe und auch zur Aufnahme des Übersichtbildes ausgebildet. Somit umfasst das erfindungsgemäße Lichtmikroskop bevorzugt nur eine einzige monochrome Detektionseinheit. The detection unit is preferably designed for receiving a confocal microscope image of the sample illuminated with the structured illumination light and also for recording the overview image. Thus, the light microscope according to the invention preferably comprises only a single monochrome detection unit.

Die Detektionseinheit ist bevorzugt zur Aufnahme monochromatischer Bilder ausgebildet. Dabei ist Detektionseinheit bevorzugt zur Wandlung von Licht aus dem gesamten visuellen Spektrum in ein elektrisches Signal ausgebildet. The detection unit is preferably designed to receive monochromatic images. In this case, detection unit is preferably designed for converting light from the entire visual spectrum into an electrical signal.

Die Detektionseinheit weist bevorzugt ein zweidimensionales Feld aus Detektorelementen auf. Insbesondere ist die Detektionseinheit bevorzugt durch eine elektronische Messkamera gebildet. The detection unit preferably has a two-dimensional array of detector elements. In particular, the detection unit is preferably formed by an electronic measuring camera.

Die rotierbare Scheibe ist bevorzugt kreisrund. Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst bevorzugt weiterhin einen Elektromotor zum Antrieb der Scheibe. The rotatable disc is preferably circular. The light microscope according to the invention preferably further comprises an electric motor for driving the disc.

Der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe ist bevorzugt durch eine willkürliche Anordnung von Lochblenden gebildet, die auch als Pinholes bezeichnet werden. Eine solche Struktur ermöglicht eine Aperture Correlation Microscopy. The structured circular cutout of the disk is preferably formed by an arbitrary arrangement of pinholes, which are also referred to as pinholes. Such a structure allows for Aperture Correlation Microscopy.

Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen ist der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe durch mindestens ein Rastergitter gebildet. In alternative preferred embodiments, the structured circular section of the disc is formed by at least one raster grid.

Bevorzugt umfasst der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe zwei sich unterscheidende strukturierte Teilkreisausschnitte, beispielsweise zwei unterschiedliche Rastergitter. The structured circular cutout of the pane preferably comprises two differing structured partial cutouts, for example two different grid lattices.

Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst bevorzugt weiterhin einen Positionssensor zur Bestimmung des Drehwinkels der Scheibe, der elektrisch mit der Ansteuereinheit verbunden ist. Entsprechend eines vom Positionssensor ausgegebenen Signals kann die Ansteuereinheit entweder in den ersten Modus oder in den zweiten Modus schalten. The light microscope according to the invention preferably further comprises a position sensor for determining the angle of rotation of the disc, which is electrically connected to the drive unit. In accordance with a signal output from the position sensor, the drive unit may switch to either the first mode or the second mode.

Die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und ggf. auch die dritte Lichtquelle sind bevorzugt jeweils durch eine LED gebildet. Die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und ggf. auch die dritte Lichtquelle sind bevorzugt zwischen der Scheibe und der Probe angeordnet. The first light source, the second light source and possibly also the third light source are preferably each formed by an LED. The first light source, the second light source and possibly also the third light source are preferably arranged between the pane and the sample.

Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop weist bevorzugt auch solche Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dessen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben sind. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Lichtmikroskop und dessen bevorzugten Ausführungsformen angewendet. The light microscope according to the invention preferably also has such features which are described in connection with the method according to the invention and its preferred embodiments. The method according to the invention is preferably used in the light microscope according to the invention and its preferred embodiments.

Weitere Vorteile, Einzelheiten und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen: Further advantages, details and developments of the invention will become apparent from the following description of preferred embodiments of the invention, with reference to the drawing. Show it:

1: eine Prinzipdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops; 1 : a schematic representation of a preferred embodiment of a light microscope according to the invention;

2: eine Prinzipdarstellung einer LED-Ansteuerung des in 1 gezeigten Lichtmikroskops; 2 : a schematic diagram of an LED control of the in 1 shown light microscope;

3: eine abgewandelte Ausführungsform einer in 1 gezeigten Messscheibe; und 3 a modified embodiment of an in 1 shown measuring disk; and

4: ein zeitliches Diagramm zweier Modi des in 1 gezeigten Lichtmikroskops. 4 : a temporal diagram of two modes of in 1 shown light microscope.

1 zeigt eine Prinzipdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops. Das Lichtmikroskop umfasst ein Objektiv 01, welches auf eine zu mikroskopierende Probe (nicht gezeigt) zu richten ist. Die Bildaufnahme erfolgt mit einer monochromen Messkamera 02. Zwischen dem Objektiv 01 und der Messkamera 02 ist ein Strahlengang 03 ausgebildet, in welchem sich u. a. eine rotierbare kreisförmige Messscheibe 04 befindet, welche durch einen Motor 05 antreibbar ist, der wiederum durch eine Motorsteuerung 06 angesteuert wird. Die Messscheibe 04 rotiert bevorzugt mit 3.000 Umdrehungen/min. Die Messscheibe 04 ist in einen ersten Kreisausschnitt 07 und einen zweiten Kreisausschnitt 08 aufgeteilt, wobei der zweite Kreisausschnitt 08 wiederum in einen ersten Teilkreisausschnitt 09 und in einen zweiten Teilkreisausschnitt 11 aufgeteilt ist. Die beiden Kreisausschnitte 07, 08 und auch die beiden Teilkreisausschnitte 09, 11 sind jeweils durch einen Kreissektor gebildet. Der erste Kreisausschnitt 07 und die beiden Teilkreisausschnitte 09, 11 weisen jeweils einen Mittelpunktswinkel von 120° auf. Der erste Kreisausschnitt 07 weist einen freien Durchgang 12 auf, durch welchen Licht ungehindert hindurchtreten kann. Der zweite Kreisausschnitt 08 weist Strukturen (nicht dargestellt) auf, durch welche durch den zweiten Kreisausschnitt 08 hindurchtretendes Licht strukturiert wird, um eine Aperture Correlation Microscopy zu ermöglichen, bei welcher konfokale Aufnahmen mit der monochromen Messkamera 02 durchgeführt werden. Die Strukturen in den beiden Teilkreisausschnitten 09, 11 unterscheiden sich. 1 shows a schematic diagram of a preferred embodiment of a light microscope according to the invention. The light microscope includes a lens 01 which is to be directed to a sample to be microscoped (not shown). The image is taken with a monochrome measuring camera 02 , Between the lens 01 and the measuring camera 02 is a ray path 03 formed, in which, inter alia, a rotatable circular measuring disk 04 which is by a motor 05 is drivable, in turn, by a motor control 06 is controlled. The measuring disk 04 rotates preferably with 3,000 revolutions / min. The measuring disk 04 is in a first circle section 07 and a second circle cutout 08 split, with the second circular section 08 again in a first partial circle cutout 09 and in a second partial circle cutout 11 is divided. The two circular cutouts 07 . 08 and also the two partial circle sections 09 . 11 are each formed by a circular sector. The first circle cutout 07 and the two partial cuttings 09 . 11 each have a center angle of 120 °. The first circle cutout 07 has a free passage 12 on, through which light can pass unhindered. The second circle section 08 has structures (not shown) through which through the second circular cutout 08 transmitted light is patterned to allow Aperture Correlation Microscopy, in which confocal images with the monochrome measuring camera 02 be performed. The Structures in the two partial cutouts 09 . 11 differ.

Zwischen der Messscheibe 04 und dem Objektiv 01 ist ein LED-Halter 13 angeordnet, der eine erste LED 14, eine zweite LED 16 und eine dritte LED 17 trägt. Die erste LED 14 emittiert bei Bestromung rotes Licht, die zweite LED 16 grünes Licht und die dritte LED 17 blaues Licht. Die drei LEDs 14, 16, 17 dienen insbesondere zur Beleuchtung der Probe, wenn mit der monochromen Messkamera 02 ein Übersichtsbild aufgenommen wird und auch zur ständigen Beleuchtung der Probe, damit diese durch den Benutzer unmittelbar betrachtet werden kann. Das Übersichtsbild wird in zeitlichen Abschnitten aufgenommen, in welchen sich der im ersten Kreisausschnitt 07 angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Die drei LEDs 14, 16, 17 leuchten mit jeder Umdrehung der Messscheibe 04 abwechselnd, um die Probe abwechselnd mit rotem Licht, mit grünem Licht und mit blauem Licht zu beleuchten, sodass aus den Aufnahmen der monochromen Messkamera 02 ein farbiges Übersichtsbild generiert werden kann. Between the measuring disc 04 and the lens 01 is an LED holder 13 arranged, the first LED 14 , a second LED 16 and a third LED 17 wearing. The first LED 14 emits red light when energized, the second LED 16 green light and the third LED 17 blue light. The three LEDs 14 . 16 . 17 especially for illuminating the sample when using the monochrome measuring camera 02 an overview image is taken and also for the constant illumination of the sample so that it can be viewed directly by the user. The overview picture is taken in temporal sections, in which the one in the first circle section 07 arranged free passage 12 in the beam path 03 located. The three LEDs 14 . 16 . 17 light up with each revolution of the measuring disk 04 alternately to illuminate the sample alternately with red light, with green light and with blue light, so from the photographs of the monochrome measuring camera 02 a colored overview picture can be generated.

2 zeigt eine Prinzipdarstellung einer LED-Ansteuerung des in 1 gezeigten Lichtmikroskops. Die Ansteuerung der drei LEDs 14, 16, 17 erfolgt mithilfe eines FPGA 18, wofür der FPGA 18 über entsprechende Treiber 19 verfügt. Der FPGA 18 ist elektrisch mit einem Positionssensor 21 verbunden, mit welchem die Winkelposition der rotierenden Messscheibe 04 messbar ist. Der FPGA 18 ist dazu ausgebildet, die drei LEDs 14, 16, 17 abwechselnd in einem ersten Modus 22 und in einem zweiten Modus 23 zu betreiben. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden im ersten Modus 22 betrieben, wenn sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet, d. h. wenn das Übersichtsbild aufgenommen wird. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden im zweiten Modus 23 betrieben, wenn sich der zweite Kreisausschnitt 08 (gezeigt in 1) im Strahlengang 03 befindet. 2 shows a schematic diagram of an LED control of in 1 shown light microscope. The control of the three LEDs 14 . 16 . 17 is done using an FPGA 18 What the FPGA is for 18 via appropriate drivers 19 features. The FPGA 18 is electric with a position sensor 21 connected, with which the angular position of the rotating measuring disc 04 is measurable. The FPGA 18 is designed to the three LEDs 14 . 16 . 17 alternately in a first mode 22 and in a second mode 23 to operate. The three LEDs 14 . 16 . 17 be in the first mode 22 operated when in the first circle 07 (shown in 1 ) arranged free passage 12 in the beam path 03 is, ie when the overview picture is taken. The three LEDs 14 . 16 . 17 be in the second mode 23 operated when the second circle cutout 08 (shown in 1 ) in the beam path 03 located.

Im ersten Modus 22 wird jeweils eine der drei LEDs 14, 16, 17 betrieben, solang sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Bei der nächsten Umdrehung der Messscheibe 04 wird eine andere der drei LEDs 14, 16, 17 betrieben, solang sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden mit den Umdrehungen der Messscheibe 04 zyklisch durchgeschaltet, sodass die Probe abwechselnd mit rotem Licht, mit grünem Licht und mit blauem Licht beleuchtet wird. In the first mode 22 each one of the three LEDs 14 . 16 . 17 operated, as long as in the first circle 07 (shown in 1 ) arranged free passage 12 in the beam path 03 located. At the next revolution of the measuring disc 04 becomes another of the three LEDs 14 . 16 . 17 operated, as long as in the first circle 07 (shown in 1 ) arranged free passage 12 in the beam path 03 located. The three LEDs 14 . 16 . 17 be with the revolutions of the measuring disk 04 cyclically switched so that the sample is illuminated alternately with red light, with green light and with blue light.

Im zweiten Modus 23 werden die drei LEDs 14, 16, 17 zyklisch nacheinander betrieben, solang sich der zweite Kreisausschnitt 08 (gezeigt in 1) im Strahlengang 03 befindet. Die Wechselfrequenz bezogen auf alle drei LEDs 14, 16, 17 beträgt bevorzugt 500 Hz, sodass jede der drei LEDs 14, 16, 17 mit einer Frequenz von 166 ²/₃ Hz betrieben wird. Erfindungsgemäß wird jede der drei LEDs 14, 16, 17 mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz betrieben, wobei die Flimmerverschmelzungsfrequenz typischerweise zwischen 40 Hz und 60 Hz liegt. Der zweite Modus 23 erlaubt ein flimmerfreies unmittelbares Betrachten der Probe durch den Benutzer. In the second mode 23 become the three LEDs 14 . 16 . 17 operated cyclically one after another, as long as the second circular section 08 (shown in 1 ) in the beam path 03 located. The change frequency based on all three LEDs 14 . 16 . 17 is preferably 500 Hz, so each of the three LEDs 14 . 16 . 17 is operated at a frequency of 166 ^_2/3 Hz. According to the invention, each of the three LEDs 14 . 16 . 17 operated at a frequency above a Flimmerverschmelzungsfrequenz, wherein the Flimmerverschmelzungsfrequenz is typically between 40 Hz and 60 Hz. The second mode 23 allows a flicker-free immediate viewing of the sample by the user.

3 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform der in 1 gezeigten Messscheibe 04. Bei dieser abgewandelten Ausführungsform weist der erste Kreisausschnitt 07 einen Mittelpunktswinkel von nur etwa 40° auf, während der zweite Kreisausschnitt 08 einen Mittelpunktswinkel von etwa 320° aufweist. Bei dieser Ausführungsform können die konfokalen Aufnahmen präziser angefertigt werden. Der erste Kreisausschnitt 07 führt zum ersten Modus 22 (gezeigt in 2), während der zweite Kreisausschnitt 08 zum zweiten Modus 23 (gezeigt in 2) führt. 3 shows a modified embodiment of the in 1 shown measuring disk 04 , In this modified embodiment, the first circle cutout 07 a midpoint angle of only about 40 °, while the second circular section 08 has a midpoint angle of about 320 °. In this embodiment, the confocal recordings can be made more precisely. The first circle cutout 07 leads to the first mode 22 (shown in 2 ) while the second circle cutout 08 to the second mode 23 (shown in 2 ) leads.

4 zeigt die zeitlichen Verläufe des ersten Modus 22 und des zweiten Modus 23 in einem Diagramm. Im zweiten Modus 23 werden die drei LEDs 14, 16, 17 (gezeigt in 1) ständig abwechselnd betrieben, was durch Diagrammverläufe R, G, B veranschaulicht ist. Der erste Modus 22 ist nur dann aktiv, wenn sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. In diesen zeitlichen Abschnitten leuchtet jeweils nur einer der drei LEDs 14, 16, 17 (gezeigt in 1), was wiederum durch Diagrammverläufe R, G, B veranschaulicht ist. Diese zeitlichen Abschnitte sind bei der gezeigten Ausführungsform etwa 2 ms lang und treten bei jeweils einer Umdrehung der Messscheibe 04 (gezeigt in 2) auf. 4 shows the timings of the first mode 22 and the second mode 23 in a diagram. In the second mode 23 become the three LEDs 14 . 16 . 17 (shown in 1 ) constantly operated alternately, which is illustrated by diagram curves R, G, B. The first mode 22 is only active when the first circle 07 (shown in 1 ) arranged free passage 12 in the beam path 03 located. Only one of the three LEDs will light in these time intervals 14 . 16 . 17 (shown in 1 ), which in turn is illustrated by diagrams R, G, B. In the embodiment shown, these time intervals are about 2 ms long and occur in each case one revolution of the measuring disk 04 (shown in 2 ) on.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

01 01: Objektiv lens
02 02: Messkamera measuring camera
03 03: Strahlengang beam path
04 04: Messscheibe measuring disk
05 05: Motor engine
06 06: Motorsteuerung motor control
07 07: erster Kreisausschnitt first circle cutout
08 08: zweiter Kreisausschnitt second circle section
09 09: erster Teilkreisausschnitt first part of the circle
10 10
11 11: zweiter Teilkreisausschnitt second partial cutout
12 12: freier Durchgang free passage
13 13: LED-Halter LED holders
14 14: erste LED first LED
15 15
16 16: zweite LED second LED
17 17: dritte LED third LED
18 18: FPGA FPGA
19 19: Treiber driver
20 20
21 21: Positionssensor position sensor
22 22: erster Modus first mode
23 23: zweiter Modus second mode

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 102012007045 A1 [0002]
DE 102012009836 A1 [0003]

Claims

A method of microscopically probing a sample with a light microscope, comprising the steps of: - rotating one in an illumination beam path ( 03 ) arranged disc ( 04 ), which have a structured circular section ( 08 ) for producing structured illumination light and an unstructured circular cutout ( 07 ) for recording an overview image; Alternately illuminating the sample at least with light in a first wavelength range and with light in a second wavelength range different from the first wavelength range, when the unstructured circular cutout ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located; and alternately illuminating the sample at least with light in the first wavelength range and with light in the second wavelength range when the structured circular cutout (FIG. 08 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ), wherein the illumination with light of each of the at least two wavelength ranges is at a frequency above a flicker fusion frequency.

Method according to claim 1, characterized in that - the alternating illumination of the sample with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and with light in a third wavelength range different from the first wavelength range and from the second wavelength range occurs when the unstructured sector ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located; and that - alternately illuminating the sample with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and with light in the third wavelength range, each with a frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz when the structured circular section ( 08 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located.

A method according to claim 2, characterized in that the first wavelength range is in the red spectral range, that the second wavelength range in the green spectral range and that the third wavelength range is in the blue spectral range.

A method according to claim 2 or 3, characterized in that the alternating illumination of the sample with light in the first wavelength range, with light in the second wavelength range and with light in the third wavelength range with one of the rotational frequency of the disc ( 04 ) frequency occurs when the unstructured sector ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the lighting when the structured circular section ( 08 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) and illuminating when the unstructured circle ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ), result in substantially the same light intensity.

Light microscope, comprising the following components: - a detection device ( 02 ) for detecting the light reflected back from a sample; - a microscope optics ( 01 ) for directing the illumination light onto the sample and for guiding the light reflected back from the sample in the direction of the detection unit ( 02 ); - one in an illumination beam path ( 03 ) arranged rotatable disc ( 04 ) with a structured circular section ( 08 ) for producing structured illumination light and with an unstructured circular cutout ( 07 ) for recording an overview image; A first light source ( 14 ) for emitting light in a first wavelength range and a second light source ( 16 ) for emitting light in a second wavelength range different from the first wavelength range; and - a drive unit ( 18 ) for driving the first light source ( 14 ) and the second light source ( 16 ), which is configured to use the first light source ( 14 ) and the second light source ( 16 ) alternately turn on when the unstructured circle ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ), and which is further configured to receive the first light source ( 14 ) and the second light source ( 16 ) alternately and in each case with a frequency above a Flimmerverschmelzungsfrequenz when the structured Circle cutout ( 08 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located.

Light microscope according to claim 5, characterized in that it further comprises a third light source ( 17 ) for emitting light in a third wavelength range different from the first wavelength range and the second wavelength range, wherein the drive unit ( 18 ) also for driving the third light source ( 17 ) is configured and configured to the first light source ( 14 ), the second light source ( 16 ) and the third light source ( 17 ) alternately turn on when the unstructured circle ( 07 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ), and which is configured to receive the first light source ( 14 ), the second light source ( 16 ) and the third light source ( 17 ) alternately and in each case with a frequency above the Flimmerverschmelzungsfrequenz turn on when the structured circular section ( 08 ) of the disc ( 04 ) in the illumination beam path ( 03 ) is located.

Optical microscope according to claim 6, characterized in that the first light source, the second light source and the third light source are each by an LED ( 14 . 16 . 17 ) are formed.

Light microscope according to one of claims 5 to 7, characterized in that the detection unit ( 02 ) for receiving a microscope image of the lighted with the structured illumination light sample and recording the overview image is formed.

Light microscope according to one of claims 5 to 8, characterized in that the detection unit ( 02 ) is designed to receive monochromatic images.