DE102012009836A1

DE102012009836A1 - Lichtmikroskop und Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop

Info

Publication number: DE102012009836A1
Application number: DE201210009836
Authority: DE
Inventors: Helmut Lippert; Ralf Netz; Tiemo Anhut; Nils Langholz; Matthias Langhorst
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-11-21
Also published as: CN104303089A; GB2514520B; CN104303089B; JP2015519604A; CN108254909A; JP6448532B2; GB201417062D0; WO2013171309A1; CN108254909B; GB2514520A; US20150054937A1; US10261300B2

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Lichtmikroskop mit einer polychromatischen Lichtquelle zum Aussenden von Beleuchtungslicht in Richtung einer Probe, Fokussiermitteln zum Fokussieren von Beleuchtungslicht auf die Probe, wobei die Fokussiermittel zum Erzeugen einer Tiefenauflösung eine chromatische Längsaberration aufweisen, und einer Detektionseinrichtung, die ein zwei-dimensionales Array von Detektorelementen umfasst, zum Nachweisen von Probenlicht, welches von der Probe kommt. Das Lichtmikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweisen von sowohl konfokalen Anteilen als auch nicht-konfokalen Anteilen des Probenlichts ein Strahlengang von der Probe zur Detektionseinrichtung frei von Elementen zum vollständigen Ausblenden von nicht-konfokalen Anteilen ist. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop.

Description

Die Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt ein Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 16.
Für die Charakterisierung von technischen Oberflächen und insbesondere für die Ableitung von Rauhigkeitsmesswerten und Topographien wird heute als Standardverfahren die konfokale Mikroskopie eingesetzt. Dieses Verfahren ist beispielsweise beschrieben in: M. Rahlwes, J. Seewig: „Optisches Messen technischer Oberflächen", Beuth Verlag, Berlin, 2009.
Bei vielen konfokalen Systemen findet dabei ein Abtasten der Probe in allen drei Raumrichtungen statt, das heißt es handelt sich zum einen um punktscannende Systeme, bei denen ein optischer Strahl in x/y-Richtung über die Probe geführt wird. Zur Ableitung der Höheninformation wird zum anderen eine Bewegung der Probe relativ zur Detektoreinheit, also in z-Richtung benötigt. Aus dem Intensitätsmaximum in Abhängigkeit von der z-Position kann für jeden x-y-Ort die Höheninformation und damit die Topographie abgeleitet werden. Nachteilig bei diesem Verfahren ist einerseits die lange Zeit, die durch den Rasterscan für eine 3D-Topographie benötigt wird. Andererseits hängt die Präzision, also die Genauigkeit der Höhenmessung, stark von der Einstellgenauigkeit der Probenoberfläche relativ zur Detektoreinheit ab und ist damit immer begrenzt. Mit anderen Worten: Eine hohe Präzision erfordert hochgenaue und teure mechanische Stellelemente, beispielsweise auf Piezobasis.
Um den Nachteil des x-y-Rasterscans zu umgehen, existieren schon seit langem konfokale Weitfeldsysteme, bei denen in der Regel Flächenkameras zum Einsatz kommen und die somit einen hohen Grad an Parallelisierung aufweisen. Ein Beispiel hierfür ist das Spinning-Disc-Verfahren mit Nipkow-Scheibe, welches ebenfalls bei Rahlwes und Seewig beschrieben ist. Hier werden mehrere Punkte gleichzeitig nach dem konfokalen Prinzip detektiert. Statt einer Nipkow-Scheibe kann prinzipiell auch ein schnellschaltbares Mikrodisplay zum Einsatz kommen. Außerdem kann ein Multilinienscan mit digital-konfokaler Detektion durchgeführt werden. Sämtliche dieser Systeme arbeiten echt konfokal, das heißt, dass im Wesentlichen nur Licht aus dem Anregungsfokus nachgewiesen wird. Hieraus ergibt sich ein gewisser Grad an Komplexität der eingesetzten Vorrichtungen und Verfahren. Außerdem sind die Technologien aufgrund der verwendeten feststehenden Elemente, insbesondere also ein Mikrodisplay mit gegebener Pixelgröße oder eine Nipkow-Scheibe mit gegebener Lochgröße, wenig flexibel mit Hinblick auf unterschiedliche Bildfeldgrößen und im Zusammenhang damit verschiedene z-Empfindlichkeiten. Außerdem ist, wie bei den punktscannenden Systemen, auch hier ein Rastern der Probe in z-Richtung notwendig.
Mit Hinblick auf Komplexität und Flexibilität bieten die auf strukturierter Beleuchtung basierenden konfokalen Weitfeldsysteme demgegenüber Vorteile. Hier wird für jeden z-Wert ein konfokales Schnittbild errechnet aus Bildern, die mit einer beispielsweise durch ein Gitter gegebenen strukturierten Beleuchtung aufgenommen wurden. In der Regel kann dabei auch das Weitfeldbild erhalten werden. Es wird keine Lochblendenanordnung in der Detektion benötigt. Beispielsweise kann ein Beleuchtungsgitter mit unterschiedlichen Phasenlagen auf die Probe abgebildet werden. Weil Intensitätsmodulationen in Abhängigkeit von der Phasenlage nur für fokale Bildanteile vorliegen, kann hieraus ein optisches Schnittbild errechnet werden. Für die Vermessung von technischen Oberflächen wurde dieses Verfahren beispielsweise untersucht in: Vogel et al. Pwroc. DGaO 2011, P36. Ein ähnlicher Ansatz, der beispielsweise beschrieben ist in DE 10 2007 018 048 A1 , verwendet nur zwei Gitterphasen bei der Beleuchtung. Bei einem ebenfalls verwandten Verfahren wird eine sich kontinuierlich ändernde strukturierte Beleuchtung verwendet und das optische Schnittbild wird aus zwei parallel aufgenommenen Bildern errechnet, bei denen eines außerfokale und fokale und das andere nur außerfokale Anteile enthält. Ein Vorteil dieser auf strukturierter Beleuchtung basierenden Verfahren ist, dass parallel zum konfokalen Bild auch ein Weitfeldbild erhalten werden kann. Es bleibt aber bei dem Problem, dass die Probe in z-Richtung relativ zum Detektor gerastert werden muss.
Eine besondere Ausführung der konfokalen Schnittbilderzeugung mit strukturierter Beleuchtung ist beschrieben in Mitic et al., Optical Letters 28, 698 (2003). Hier kommt außer einem beweglichen Gitter ein sogenanntes Smart Pixel Detector Array zum Einsatz, welches es erlaubt, die zeitmodulierten Signalanteile und damit die fokalen Signalanteile direkt auf der Detektorebene in Echtzeit zu extrahieren.
Weitere besondere Ausführungen der strukturierten Beleuchtung sind beschrieben in Wicker et al., Journal of Optics 12, 084010 (2010) und Krzewina et al., Optical Letters 31, 477 (2006).
Hier werden die unterschiedlichen Gitterphasen mithilfe einer Polarisationskodierung beziehungsweise einer Farbkodierung quasi parallel auf die Probe aufgebracht, was vor allem Geschwindigkeitsvorteile mit sich bringt.
Es existieren noch weitere Weitfeld-Methoden, mit denen optische Schnitte erzeugt werden können. Hier ist einerseits die sogenannte Fokus-Variation zu nennen, bei der die Bildschärfe in Abhängigkeit der z-Koordinate ausgewertet wird, um hieraus ähnlich dem konfokalen Fall ein Maximum zu errechnen. Es werden damit auch räumliche Informationen herangezogen. Ähnlich einzuordnen ist das in Mertz et al., Journal of Biometrical Optics 15, 016027 (2010) beschriebene Verfahren, bei dem Weitfeldbilder mit und ohne Strukturierung aufgenommen werden, um hieraus durch den geschickten Einsatz von räumlichen Bandpass-Filtern ein optisches Schnittbild zu erhalten. Die Strukturierung kann dabei auch auf einem sogenannten Speckle-Muster basieren.
Um das Rastern in z-Richtung zu vermeiden, hat sich andererseits auch das sogenannte chromatisch konfokale Prinzip bewährt. Hier wird in der Regel eine polychromatische Lichtquelle eingesetzt, die die interessierende Probe über ein chromatisch wirkendes brechendes oder beugendes Element beleuchtet, wodurch die z-Information spektral kodiert wird. Wird nun hinter einer konfokalen Lochblende in der Detektion das Spektrum vermessen, so kann hieraus die Höheninformation abgeleitet werden. Auch möglich ist die Verwendung einer durchstimmbaren Lichtquelle mit sequenzieller konfokaler Detektion, wodurch ebenfalls ein Spektrum erhalten wird. Zumeist handelt es sich bei den kommerziellen Sensoren um Punktdetektoren, die stets den Nachteil der fehlenden x-y-Parallelisierung aufweisen. Eine chromatisch multifokale Anordnung mit Lochblenden-Array ist beispielsweise beschrieben in DE 10 2007 019 267 A1 . Die Fokalpunkte decken allerdings das Bildfeld nur zum Teil ab, so dass weiterhin eine Rasterbewegung notwendig ist. Außerdem existieren linienscannende Systeme, beispielsweise beschrieben in Lin et al., Applied Optics 37, 6764 (1998), und Systeme, die auf einer Nipkow-Scheibe basieren, siehe beispielsweise Tiziani et al., Opt. Eng. 39, 32 (2000). Letztere wurden allerdings bislang stets mit Farbkamera-Systemen realisiert, die nur eine eingeschränkte Höhenauflösung ermöglichen und darüber hinaus Schwierigkeiten bei Farbobjekten aufweisen, weil es hier zu einer Überlagerung von Höhen- und Farbinformation beziehungsweise spektraler Reflektivität kommt. Interessant ist in diesem Zusammenhang ein Ansatz, bei dem eine multifokale chromatische Anordnung mithilfe eines DMD (Digital Micromirror Device) realisiert wird. Zum Einsatz kommt hier ein durchstimmbarer Titan-Saphir-Laser, mit welchem der chromatische Höhenscan durchgeführt wird. In Kombination mit einem Schalten des DMD ist damit ein Aufbau realisiert, der hochgenaue 3D-Topographie-Daten ohne jegliche mechanische Bewegungselemente ermöglicht. Allerdings kann es hier zu Bildartefakten durch das DMD kommen und in der Regel ist die Schaltgeschwindigkeit des DMD begrenzt. Auch kann kein Weitfeldbild parallel erhalten werden.
Eine Weiterentwicklung des chromatisch konfokalen Punktsensors ist die sogenannte chromatisch konfokale Spektralinterferometrie, beispielsweise beschrieben bei Papastathopoulos et al., Applied Optics 45, 8244 (2006). Dabei ist zusätzlich zur chromatischen Konfokalität ein Interferometer-Aufbau realisiert. Solch ein Aufbau kann auch als Weißlicht-Interferometer mit erweiterter Schärfentiefe angesehen werden. Neben dem spektralen Maximum kann hier auch die spektrale Phase ausgewertet werden, in welcher ebenso eine Höheninformation enthalten ist.
Oben wurde erwähnt, dass die chromatisch konfokalen Weitfeldverfahren bisher im Wesentlichen unter Verwendung einer durchstimmbaren Lichtquelle oder einer Farbkamera verwirklicht wurden. Für die spektrale Weitfeld-Bildgebung mit hoher Auflösung existieren mittlerweile mehrere Ansätze. Beispielsweise gibt es FFT-Spektrometer-Systeme (FFT = Fast Fourier Transformation), bei denen das Spektrum aus Weglängenänderungen in einem Interferometeraufbau und anschließender Fourier-Analyse abgeleitet wird. Weiterhin gibt es die Technologie des „Image Slicing Spectrometer”, bei der einzelne Bildanteile zueinander versetzt so auf einem großen Flächensensor abgebildet werden, dass Lücken entstehen, die zur Gewinnung der spektralen Information mittels eines vorgeschalteten dispersiven Elements genutzt werden können. Es existiert auch bereits Stand der Technik im Hinblick auf eine Kombination eines solchen Spektrometers mit einer 3D-Bildgebung im Sinn einer strukturierten Beleuchtung.
Außerdem werden 3D-Bragg-Gitter eingesetzt, um durch sequenzielle Aufnahme von monochromatischen Bildern hyperspektrale Aufnahmen mit hoher räumlicher und spektraler Auflösung zu erhalten.
Eine Kombination dieser Technologien mit einem chromatisch konfokalen Weitfeldsystem ist bisher nicht bekannt.
Bei einem gattungsgemäßen Lichtmikroskop sind eine polychromatische Lichtquelle zum Aussenden von Beleuchtungslicht in Richtung einer Probe und Fokussiermittel zum Fokussieren von Beleuchtungslicht auf die Probe, wobei die Fokussiermittel zum Erzeugen einer Tiefenauflösung eine chromatische Längsaberration aufweisen, vorhanden. Ein gattungsgemäßes Lichtmikroskop umfasst außerdem eine Detektionseinrichtung, die ein zwei-dimensionales Array von Detektorelementen aufweist, zum Nachweisen von Probenlicht, welches von der Probe kommt.
Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop ist vorgesehen, dass mit einer polychromatischen Lichtquelle Beleuchtungslicht in Richtung einer Probe gesendet wird, dass mit Fokussiermitteln das Beleuchtungslicht auf die Probe fokussiert wird, wobei eine Tiefenauflösung durch eine chromatische Längsaberration der Fokussiermittel erreicht wird, und dass mit einer Detektionseinrichtung, die ein zwei-dimensionales Array von Detektorelementen umfasst, Probenlicht nachgewiesen wird, welches von der Probe kommt.
Bei bekannten Lichtmikroskopen und Verfahren ist nachteilig, dass nur ein Anteil der Informationen, die über das von der Lichtquelle zur Probe ausgestrahlte Beleuchtungslicht gewonnen werden können, genutzt wird.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Lichtmikroskop bereitzustellen, welches die Messung zusätzlicher Informationen zu einer mikroskopischen Probe ermöglicht. Außerdem soll ein Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop angegeben werden, mit dem zusätzliche Informationen zu einer mikroskopischen Probe gewonnen werden können.
Diese Aufgabe wird durch das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 16 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops und bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.
Bei dem Lichtmikroskop der oben genannten Art ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass zum Nachweisen von sowohl konfokalen Anteilen als auch nicht-konfokalen Anteilen des Probenlichts ein Strahlengang von der Probe zur Detektionseinrichtung frei von Elementen zum vollständigen Ausblenden von nicht-konfokalen Anteilen ist.
Bei dem Verfahren der oben genannten Art werden erfindungsgemäß sowohl konfokale Anteile als auch nicht-konfokale Anteile des Probenlichts auf die Detektionseinrichtung geleitet.
Als ein Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, dass nicht-konfokale Anteile des Probenlichts, die bei Konfokalmikroskopen gemäß dem Stand der Technik ausgeblendet werden, zumindest teilweise mit der Detektionseinrichtung nachgewiesen werden. Unter konfokalen Anteilen des Probenlichts sollen diejenigen Anteile verstanden werden, die aus einer Ebene eines Fokus des Beleuchtungslichts in oder an der Probe stammen. Diese Ebene kann senkrecht zur optischen Achse des Lichtmikroskops definiert sein.
Nicht-konfokale Anteile des Probenlichts sollen entsprechend als solche Anteile des Probenlichts verstanden werden, die aus einer anderen Ebene als der Fokusebene des Beleuchtungslichts stammen. Bei bekannten Konfokalmikroskopen werden diese Lichtanteile ausgeblendet. Hierzu ist bekannt, ein Pinhole, das heißt eine Blende mit kleinem kreisförmigen oder schlitzförmigen Durchlass, an einer zur untersuchten Probenebene konjugierten Ebene anzuordnen. Statt des Pinholes kann auch das strukturierte Element hierzu eingesetzt werden. Im Gegensatz hierzu werden erfindungsgemäß die nicht-konfokalen Lichtanteile nicht oder nur teilweise ausgeblendet. Vorteilhafterweise ist es dadurch möglich, aus dem nachgewiesenen Probenlicht ein Weitfeldbild der Probe zu erstellen. Unter einem Weitfeldbild ist im Sinne der Erfindung ein Bild zu verstehen, für das sowohl Probenlicht aus der Fokusebene des Beleuchtungslichts als auch Probenlicht, das aus Bereichen außerhalb der Fokusebene des Beleuchtungslichts stammt, genutzt wird. Zudem können geeignete Mittel zum Erstellen eines Konfokalbildes der Probe vorhanden sein, womit ausschließlich die konfokalen Anteile des Probenlichts dargestellt werden.
Vorteilhafterweise können somit durch eine einzige Messung oder eine einzige Messreihe ein großer Informationsgehalt, insbesondere sowohl ein Konfokal- als auch ein Weitfeldbild, gewonnen werden, wobei mechanische Bewegungen von Komponenten des Lichtmikroskops nicht oder nur in geringem Umfang notwendig sind.
Unter dem Beleuchtungslicht kann beliebiges Licht verstanden werden, das zur Probe hin gestrahlt wird. Das Beleuchtungslicht kann monochromatisch sein oder auch einen oder mehrere Wellenlängenbereiche umfassen. Unter Probenlicht wird hingegen Licht verstanden, das infolge der Einstrahlung von Beleuchtungslicht auf die Probe von dieser ausgesendet wird. Somit kann das Probenlicht zurückgeworfenes, insbesondere gestreutes und/oder reflektiertes, Beleuchtungslicht sein. Das Probenlicht kann aber auch durch Eigenlumineszenz entstanden sein, insbesondere durch Fluoreszenz oder durch Phosphoreszenz.
Die polychromatische Lichtquelle kann beispielsweise einen oder mehrere durchstimmbare Laser umfassen. Alternativ oder zusätzlich kann die Lichtquelle eine Weißlichtquelle, eine Halogenlampe und/oder eine Diode, insbesondere eine Superlumineszenz-Diode, umfassen. Das Beleuchtungslicht kann beispielsweise im Infrarotbereich, im sichtbaren Wellenlängenbereich oder im Ultraviolettbereich liegen.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops befindet sich zwischen der Lichtquelle und den Fokussiermitteln ein strukturiertes Element zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht aus dem von der Lichtquelle ausgesandten Beleuchtungslicht. Somit leiten hier die Fokussiermittel strukturiertes Beleuchtungslicht auf die Probe.
Unter dem strukturierten Element kann prinzipiell jedes Element verstanden werden, mit welchem dem Beleuchtungslicht an der Probenebene eine bestimmte räumliche Struktur aufgeprägt wird. Bevorzugt kann das strukturierte Element eine Nipkow-Scheibe, ein Mikrolinsen-Array, ein Gitter, insbesondere ein 1D-Gitter oder 2D-Gitter, ein Fresnel-Biprisma oder ein Element zum Erzeugen eines Speckle-Musters aufweisen. Im Falle eines Gitters oder eines Elements zum Erzeugen eines Speckle-Musters umfasst das Beleuchtungslicht zweckmäßigerweise kohärente Anteile oder ist vollständig kohärent. Unter einem Speckle-Muster ist ein scheinbar zufälliges Muster zu verstehen, das durch Interferenz kohärenter Lichtwellen entsteht, die an einem unregelmäßig strukturierten Element gebeugt werden.
Als ein wesentlicher Vorteil dieser Ausführung kann erachtet werden, dass eine große Anzahl verschiedener xyz-Bereiche der Probe gleichzeitig oder kurz hintereinander untersucht werden können. So können über die wellenlängenabhängige Fokuslage verschiedene z-Positionen abgebildet werden. Hierbei ist vorteilhafterweise keine Rasterbewegung, also kein Verschieben der Probe relativ zu einem Objektiv des Lichtmikroskops, notwendig. Zudem können über das strukturierte Element verschiedene xy-Bereiche der Probe untersucht werden, ohne dass eine Rasterbewegung erforderlich ist. Je nach Ausgestaltung des strukturierten Elements können unterschiedliche xy-Bereiche gleichzeitig abgebildet werden, etwa bei einem Gitter als strukturiertem Element, oder nacheinander, wie bei einer rotierenden Lochblende oder einer Nipkow-Scheibe als strukturiertem Element. In beiden Fällen ist ein Verschieben der Probe relativ zum Objektiv vorteilhafterweise nicht nötig.
Damit auch nicht-konfokale Anteile des Probenlichts die Detektionseinrichtung erreichen, ist bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops zwischen dem strukturierten Element und der Probe ein Strahlteiler vorhanden, der für Beleuchtungslicht durchlässig und für von der Probe kommendes Probenlicht reflektiv ist, oder umgekehrt. Hierdurch kann verhindert werden, dass Probenlicht auf dem Weg zur Detektionseinrichtung durch das strukturierte Element verlaufen muss. Insbesondere wenn das strukturierte Element so bemessen ist, dass es nicht-konfokale Lichtanteile ausblendet, können hiermit vorteilhafterweise nicht-konfokale Anteile des Probenlichts dennoch zur Detektionseinrichtung gelangen. Gleichzeitig kann hierbei eine für die Konfokalmikroskopie erforderliche Beleuchtung der Probe bereitgestellt werden. Ein Ausblenden nicht-konfokaler Anteile des Probenlichts kann beispielsweise bei einer Nipkow-Scheibe als strukturiertes Element auftreten, wenn deren Öffnungen eine Größe aufweisen, die kleiner oder gleich einer Airy-Scheibe ist. Dabei stellt die Airy-Scheibe die durch Beugung bedingte minimale Beleuchtungskreisschreibe am Fokus des Beleuchtungslichts auf der Probe dar.
Bevorzugt ist der Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler und zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und dem Probenort sind Mittel zum Verändern der Polarisationsrichtung von Licht vorhanden, um die Polarisationsrichtung von Probenlicht zu ändern und damit Probenlicht zur Detektionseinrichtung weiterzuleiten. Diese Mittel können beispielsweise mit einer λ/4-Platte gebildet sein, mit der zur Probe hinlaufendes Beleuchtungslicht und von der Probe kommendes Probenlicht jeweils in der Polarisationsrichtung gedreht wird. Als Folge stehen die Polarisationsrichtung vom Beleuchtungslicht und vom Probenlicht am Polarisationsstrahlteiler senkrecht zueinander. Dadurch ist eine räumliche Trennung des Beleuchtungslichts und des Probenlichts effizient möglich. Zweckmäßigerweise kann zwischen der Lichtquelle und dem Polarisationsstrahlteiler ein Polarisationsfilter vorhanden sein, so dass nur polarisiertes Beleuchtungslicht auf den Polarisationsstrahlteiler und anschließend auf die Probe trifft.
Um Streulicht herauszufiltern, dessen Polarisationsrichtung nicht mit der Polarisationsrichtung des nachzuweisenden Probenlichts übereinstimmt, kann zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und der Detektionseinrichtung ein weiterer Polarisationsfilter vorhanden sein. Alternativ oder zusätzlich zu dem Polarisationsstrahlteiler ist bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante vorgesehen, dass von der Probe kommendes Probenlicht durch das strukturierte Element hindurch auf die Detektoreinheit geleitet wird und dass Strukturen des strukturierten Elements groß genug zum Durchlassen von nicht-konfokalen Anteilen des Probenlichts sind. Bei diesen Strukturen kann es sich beispielsweise um Lochdurchmesser einer Nipkow-Scheibe, Linsendurchmesser eines Mikrolinsen-Arrays oder der Periodizitätskonstante eines Gitters handeln. Bei einer Anordnung des strukturierten Elements in einer zur Probenebene konjugierten Ebene können diese Strukturen groß genug sein, wenn sie größer als die Airy-Scheibe, bevorzugt mindestens doppelt oder dreimal so groß wie die Airy-Scheibe, sind. Dabei bezeichnet die Airy-Scheibe die Querschnittsfläche des Beleuchtungslichts am Fokus an der Probe. Der Durchmesser der Airy-Scheibe kann definiert sein als die 1,2-fache Wellenlänge des Beleuchtungslichts dividiert durch die numerische Apertur des Objektivs.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops ist vorgesehen, dass das strukturierte Element an einer Seite verspiegelt ist, wobei von der Probe kommendes Probenlicht auf die verspiegelte Seite des strukturierten Elements geleitet wird und dort teilweise reflektiert und teilweise transmittiert wird, dass die Detektionseinrichtung einen ersten und einen zweiten Detektor aufweist, dass der erste Detektor zum Messen von Probenlicht angeordnet ist, welches von der Probe kommend am strukturierten Element transmittiert wird, und dass der zweite Detektor zum Messen von Probenlicht angeordnet ist, welches von der Probe kommend am strukturierten Element reflektiert wird. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass durch das strukturierte Element ein konfokaler Strahlengang erreicht wird. In diesem Fall kann mit Probenlicht, das am strukturierten Element transmittiert wird, ein Konfokalbild der Probe aufgenommen werden, bei dem nicht-konfokale Lichtanteile am strukturierten Element ausgeblendet wurden. Hingegen weist das am strukturierten Element reflektierte Probenlicht in diesem Fall auch nicht-konfokale Anteile auf, so dass hiermit ein Weitfeldbild der Probe erzeugt werden kann.
Die Fokussiermittel können Teil eines Objektivs sein oder ein Objektiv umfassen. Zum Erzeugen einer wellenlängenabhängigen Fokuslage weisen die Fokussiermittel bei einer bevorzugten Ausgestaltung ein brechend und/oder beugend wirkendes Mikrolinsen-Array, also eine zwei-dimensionale Anordnung von Mikrolinsen, auf. Durch die chromatische Längsaberration der Fokussiermittel hängt die Lage des Fokus entlang der optischen Achse von der Wellenlänge des Beleuchtungslichts ab. Breitbandiges Beleuchtungslicht oder Beleuchtungslicht mit verschiedenen spektralen Anteilen wird deshalb auf unterschiedliche Tiefen entlang der optischen Achse fokussiert. Dies ermöglicht die Aufnahme von Bildern der Probe zu verschiedenen Tiefen oder z-Werten, ohne dass ein mechanisches Verstellen des Lichtmikroskops notwendig ist. Mit einem Mikrolinsen-Array können vorteilhafterweise mehrere Probenpunkte, die zueinander in einer Ebene quer zur optischen Achse benachbart sind, gleichzeitig untersucht werden. Auch diese xy-Ebene kann ohne eine Rasterbewegung abgebildet werden. Dadurch wird ein hoher Grad der Parallelisierung erreicht, bei der eine große Anzahl verschiedener xyz-Bereiche der Probe gleichzeitig oder allein durch Bewegen des strukturierten Elements aufgenommen werden können.
Für eine besonders hohe Auflösung in z-Richtung über die chromatische Aberration der Fokussiermittel ist eine möglichst genaue Kenntnis und Auswahl der Lichtwellenlänge wünschenswert. Hierzu kann zum einen das von der Probe kommende Probenlicht mit spektraler Auflösung nachgewiesen werden. Zum anderen können hierzu alternativ oder zusätzlich verschiedene Spektralbereiche des Beleuchtungslichts der Lichtquelle sequenziell auf die Probe geleitet werden. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass eine Wellenlängenselektionseinrichtung zum Auswählen eines variabel einstellbaren spektralen Bereichs des Beleuchtungslichts vorhanden ist, um über die Fokussiermittel Beleuchtungslicht auf verschiedene Positionen entlang der optischen Achse zu fokussieren, und dass elektronische Steuerungsmittel zum Auswählen eines spektralen Bereichs mittels der Wellenlängenselektionseinrichtung vorhanden sind. Die Wellenlängenselektionseinrichtung weist bevorzugt ein Prisma, ein Gitter, einen Farbfilter und/oder einen akustooptischen durchstimmbaren Filter (AOTF, Acousto-Optical Tunable Filter) auf.
Kürzere Messzeiten und weniger mechanische Bewegungen werden bei einer Ausführungsvariante erreicht, bei der das strukturierte Element, beispielsweise ein Gitter, von zwei Seiten beleuchtet werden kann, so dass zwei Phasen des strukturierten Elements auf die Probenebene abgebildet werden können. Dies ist insbesondere wünschenswert, wenn mehrere Bilder mit verschiedenen Phasen des strukturierten Elements aufgenommen und durch Nutzen des Moiré-Effekts zu einem einzigen Bild mit verbesserter Auflösung verrechnet werden. Dabei ist vorgesehen, dass eine Ablenkeinrichtung zum wahlweisen Leiten von Beleuchtungslicht auf einen ersten oder einen zweiten Lichtweg vorhanden ist und dass das strukturierte Element auf einer Seite verspiegelt ist, wobei Beleuchtungslicht des ersten Lichtweges auf die verspiegelte Seite des strukturierten Elements geleitet wird und am strukturierten Element in Richtung der Probe reflektiert wird, wobei Beleuchtungslicht des zweiten Lichtweges auf eine andere Seite des strukturierten Elements geleitet wird und vom strukturierten Element in Richtung der Probe transmittiert wird und wobei das transmittierte Beleuchtungslicht und das reflektierte Beleuchtungslicht zueinander phasenverschobene Abbildungen des strukturierten Elements an der Probe erzeugen.
Es ist bevorzugt, dass die Ablenkeinrichtung einen schaltbaren Spiegel, insbesondere einen Galvanometer-Spiegel, einen Mikrospiegelaktor (DMD, digital micromirror device) oder ein mikro-elektromechanisches System (MEMS), einen akustooptischen Modulator (AOM), einen akustooptischen Deflektor (AOD), einen elektrooptischen Modulator (EOM) oder eine auf Polarisationsdrehung basierende Schalteinheit aufweist. Zum Leiten von Beleuchtungslicht entlang dem ersten und/oder zweiten Lichtweg kann jeweils mindestens eine Lichtleitfaser vorhanden sein.
Alternativ oder zusätzlich zum Bereitstellen der zwei Lichtwege mittels der Ablenkeinrichtung kann auch ein Verrücken des strukturierten Elements erfolgen. Hierzu ist bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops vorgesehen, dass Positioniermittel zum Verschieben und/oder Drehen des strukturierten Elements vorhanden sind und dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden sind, die dazu eingerichtet sind, mit der Detektionseinrichtung Bilder der Probe zu verschiedenen Positionen des strukturierten Elements aufzunehmen und die Bilder zu einem Probenbild zu verrechnen. Es ist bevorzugt, dass die Detektionseinrichtung eine spektral auflösende Detektionseinrichtung ist. Vorteilhafterweise kann hier Probenlicht verschiedener Wellenlängen gleichzeitig nachgewiesen und voneinander unterschieden werden. Dadurch kann eine Verbesserung der z-Auflösung erreicht werden.
Die Detektionseinrichtung kann insbesondere ein Smart-Pixel-Array-Detektor sein, also ein Flächendetektorchip mit einer Recheneinheit auf dem Chip, womit eine Demodulationsberechnung der empfangenen Signale direkt am Detektor möglich ist. Zum Erzeugen der spektralen Auflösung der Detektionseinrichtung können spektrale Filtermittel vorhanden sein, insbesondere ein akustooptischer durchstimmbarer Filter (AOTF), ein Prisma, ein Gitter und/oder mindestens ein Farbfilter. Alternativ kann die Detektionseinrichtung ein Interferometer aufweisen.
Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass zum Bestimmen eines Höhenprofils einer Probe Bilder der Probe aufgenommen werden, die sich in dem nachgewiesenen Wellenlängenbereich des Probenlichts unterscheiden, dass ein Modulationskontrast für Bildpunkte von jedem Bild bestimmt wird, dass aus den Bildpunkten, die in den verschiedenen Bildern die gleiche Position haben, derjenige Bildpunkt ausgewählt wird, der den größten Modulationskontrast aufweist, und dass dem ausgewählten Bildpunkt abhängig vom zugehörigen Wellenlängenbereich eine Höheninformation der Probe zugeordnet wird, wobei zu jedem der verschiedenen Wellenlängenbereiche jeweils eine Höheninformation vorab gespeichert ist. Ein Bild der Probe kann hierbei mit einer einzigen Position des strukturierten Elements aufgenommen sein oder durch Verrechnen mehrerer Bilder, die zu verschiedenen Positionen oder verschiedenen Phasen des strukturierten Elements aufgenommen werden, berechnet werden. Unter dem Modulationskontrast kann im einfachsten Fall ein Helligkeitsunterschied zwischen benachbarten Bildpunkten im selben Bild verstanden werden. Beleuchtungslicht, das wegen seiner Wellenlänge von den Fokussiermitteln gerade auf eine zu untersuchende Probenoberfläche fokussiert wird, erzeugt ein scharfes Bild der Probe mit hohem Modulationskontrast. Beleuchtungslicht anderer Wellenlänge erzeugt hingegen ein verschwommenes Bild, das einen niedrigen Modulationskontrast hat. Insbesondere kann über das strukturierte Element ein Muster auf der Probenoberfläche abgebildet werden, welches abhängig von der Wellenlänge des Beleuchtungslichts unterschiedlich scharf ist. Damit beruht der Modulationskontrast auf der Schärfe der Abbildung des strukturierten Elements auf der Probenoberoberfläche. Weil die Höhe der Probenoberfläche von der xy-Position der verschiedenen Probenbereiche abhängen kann, erfolgt ein Bestimmen und Vergleichen des Modulationskontrasts für eine Vielzahl von xy-Bereichen innerhalb eines Bildes, bevorzugt für jeden Bildpunkt.
Bei bisher beschriebenen Ausführungen wird eine z-Auflösung durch die Aufspaltung der Fokusse für verschiedene Wellenlängen erreicht. Zusätzlich kann aber auch die Phasenlage des Beleuchtungslichts an der Probenoberfläche genutzt werden, die vom Abstand der Probe zum Objektiv und damit vom Höhenprofil der Probe abhängt. Hierzu kann eine spektrale Interferometrie durchgeführt werden. Dabei wird Beleuchtungslicht einer bekannten Wellenlänge auf die Probe geleitet. Mit einem Interferometer wird Probenlicht teilweise auf die Probe zurückgeleitet, so dass es dort konstruktiv interferieren kann. Hierzu muss mit dem Interferometer eine Länge eines Interferometer-Referenzwegs passend eingestellt werden, was vom Abstand zur Probenoberfläche abhängt. Daher enthält diese einzustellende Länge eine Information über das Probenprofil. Demgemäß kann bei einer bevorzugten Verfahrensvariante vorgesehen sein, dass mit einem Interferometer, insbesondere einem Linnik-Interferometer, ein Teil des Probenlichts auf einen Referenzweg mit einstellbarer Länge geleitet und anschließend auf die Probe zurückgeleitet wird, wobei an einer Oberfläche der Probe eine konstruktive Interferenz zwischen Beleuchtungslicht und zurückgeleitetem Probenlicht von einem Höhenprofil der Probe sowie von der Länge des Referenzwegs abhängt, dass die Länge des Referenzwegs variiert wird und diejenige Länge ausgewählt wird, bei der mit der Detektionseinrichtung ein maximales Signal empfangen wird und dass aus der ausgewählten Länge des Referenzwegs mit Hilfe von vorab gespeicherten Werten auf das Höhenprofil der Probe geschlossen wird.
Hierzu ist eine genaue Kenntnis der Wellenlänge des nachgewiesenen Lichts nötig.
Insbesondere zu diesem Zweck ist bei einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante vorgesehen, dass zum Verbessern der spektralen Auflösung eine Wellenlängenauswahl sowohl über spektrale Filtermittel der Detektionseinrichtung als auch über eine Wellenlängenselektionseinrichtung an der Lichtquelle erfolgt. Vorteilhafterweise wird hierdurch die z-Auflösung weiter verbessert und ein Interferometer kann wie oben beschrieben sinnvoll eingesetzt werden.
Um ein Konfokalbild der Probe zu erstellen, ohne dass ein mechanisches Ausblenden von nicht-konfokalen Lichtanteilen nötig ist, ist bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass zur Erzeugung eines Konfokalbildes die Detektorelemente als digitale Blende genutzt werden, wobei zur Erstellung des Konfokalbildes diejenigen Detektorelemente genutzt werden, auf die solche Probenbereiche, die im Fokus des Beleuchtungslichts liegen, scharf abgebildet werden. Bevorzugt ist die Detektionseinrichtung in einer Ebene angeordnet ist, die zur Probenebene konjugiert ist. Hierbei werden Detektorelemente, auf die allein nicht-konfokale Lichtanteile treffen, nicht genutzt. Alternativ können Informationen dieser Detektorelemente dazu verwendet werden, den nicht-konfokalen Lichtanteil auf den übrigen Detektorelementen, auf denen die konfokalen Lichtanteile abgebildet werden, zu schätzen und zu subtrahieren. Bei dieser Ausführung kann zusätzlich oder alternativ ein Weitfeldbild der Probe mit den nicht-konfokalen sowie den konfokalen Anteilen des Probenlichts berechnet werden.
Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein sogenanntes HiLo-Verfahren eingesetzt werden. Hierbei ist vorgesehen, dass ein erstes Bild der Probe aufgenommen wird, wobei sich zum Erzeugen einer strukturierten Beleuchtung ein strukturiertes Element im Strahlengang befindet, dass zur Untersuchung von Probenbereichen, die insbesondere mit der strukturierten Beleuchtung bei der Aufnahme des ersten Bildes nicht beleuchtet wurden, ein zweites Bild aufgenommen wird, wobei sich das strukturierte Element nicht im Strahlengang befindet, und dass das erste und das zweite Bild zu einem Probenbild verrechnet werden. Hierdurch werden die unterschiedlichen Informationen, die mit und ohne Verwendung eines strukturierten Elements gewonnen werden können, zusammengeführt.
Zur Bestimmung eines Höhenprofils einer Probe oder zum Unterscheiden verschiedener Messtiefen kann vorgesehen sein, dass Probenlicht mit spektraler Auflösung nachgewiesen und eine Schärfefunktion über die Wellenlänge ermittelt wird. Hieraus wird diejenige Wellenlänge, bei der die Schärfe maximal ist, als Probenhöhe ermittelt. Dies entspricht dem Prinzip der Fokusvariation und erlaubt eine sehr hohe Tiefenauflösung.
Eine Messauflösung in einer Probenebene, die quer zu einer optischen Achse liegt, kann bei einer Verfahrensvariante weiter verbessert werden, bei der eine Polarisationskodierung von Beleuchtungslicht und/oder Probenlicht erfolgt. Hierbei ist vorgesehen, dass in der Probenebene nebeneinander liegende Bereiche mit Beleuchtungslicht verschiedener Polarisationen bestrahlt wird oder dass eine ortsabhängige Probenlichtspolarisierung, bei der Probenlicht abhängig von dessen Position quer zur optischen Achse eine bestimmte Polarisation aufgeprägt wird, erfolgt. Sodann wird Probenlicht für verschiedene Polarisationen separat nachgewiesen und es wird dem nachgewiesenen Probenlicht abhängig von dessen Polarisation eine Ortsinformation innerhalb der Probenebene zugeordnet.
Beispielsweise kann Beleuchtungs- oder Probenlicht als links- und rechtszirkular polarisiert unterschieden werden. Alternativ können aber auch verschiedene lineare Polarisationen als Unterscheidungsmerkmal eingesetzt werden. Zum Erzeugen einer räumlichen Struktur des polarisierten Beleuchtungslicht in der Probenebene können zusätzliche optische Elemente, beispielsweise ein oder mehrere Gitter, im Strahlengang angeordnet werden.
Grundsätzlich kann in der Probenebene eine Auflösungsverbesserung auch anstelle oder zusätzlich zu einer Polarisationskodierung durch eine Farbkodierung erfolgen. Dabei wird Beleuchtungslicht abhängig von dessen Wellenlänge auf verschiedene Probenbereiche gesendet oder Probenlicht wird abhängig von dessen Lage quer zur optischen Achse gefiltert. Unterschiedliche Wellenlängen des nachgewiesenen Lichts können dann unterschiedlichen xy-Werten in der Probenebene zugeordnet werden. Für eine Tiefenauflösung kann bei dieser Ausführung zweckmäßigerweise auf optische Mittel mit einer chromatischen Längsaberration verzichtet werden. Stattdessen kann eine andere Lichteigenschaft zur Tiefenkodierung genutzt werden, beispielsweise die Polarisation des nachzuweisenden Lichts.
Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop ist bevorzugt zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Verfahrensvarianten eingerichtet.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Hierin zeigen:
1: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;
2: eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops und
3: eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops.
Gleiche und gleichwirkende Bestandteile sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100. Als wesentliche Komponenten umfasst das Lichtmikroskop 100 eine polychromatische Lichtquelle 10 zum Aussenden von Beleuchtungslicht 15, ein strukturiertes Element 30, mit welchem dem Beleuchtungslicht 15 eine räumliche Struktur aufgeprägt wird und Fokussiermittel 50 zum Fokussieren des Beleuchtungslichts 15 auf eine Probe 60. Weiterhin umfasst das Lichtmikroskop 100 eine Detektionseinrichtung 80, mit der Probenlicht 16, welches von der Probe 60 in Richtung der Fokussiermittel 50 ausgesendet wird, nachgewiesen wird. Bei dem Probenlicht 16 kann es sich insbesondere um Beleuchtungslicht 15 handeln, welches an der Probe 16 reflektiert und/oder gestreut wird. Grundsätzlich kann das Probenlicht 16 aber auch Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht sein, das in Folge der Absorption von Beleuchtungslicht durch die Probe abgestrahlt wird.
Die Lichtquelle 10 kann beispielsweise einen oder mehrere Laser, eine Halogenlampe oder eine Diode umfassen. Das ausgestrahlte Beleuchtungslicht 15 kann einen verhältnismäßig breiten Wellenlängenbereich aufweisen und wird mit optischen Abbildungsmitteln 12, beispielsweise mit einer oder mehreren Linsen, zu einer Wellenlängenselektionseinrichtung 20 geleitet. Die Wellenlängenselektionseinrichtung 20 kann einen AOTF oder ein oder mehrere Prismen, Gitter oder Farbfilter umfassen. Mit elektronischen Steuerungsmitteln 90 kann die Wellenlängenselektionseinrichtung 20 zum sequentiellen Auswählen schmalbandiger Wellenlängenbereiche des Beleuchtungslichts 15 betrieben werden.
Der mit der Wellenlängenselektionseinrichtung 20 ausgewählte Anteil des Beleuchtungslichts 15 wird sodann zu einer Ablenkeinrichtung 25 geleitet. Diese kann beispielweise einen Galvanometer-Spiegel oder einen anderen schaltbaren Spiegel aufweisen. Alternativ kann die Ablenkeinrichtung auch einen akustooptischen Deflektor umfassen. Die elektronischen Steuerungsmittel 90 sind dazu eingerichtet, mindestens zwei verschiedene Einstellungen der Ablenkeinrichtung 25 vorzunehmen, in denen das Beleuchtungslicht 15 wahlweise auf einen ersten Lichtweg 17 oder einen zweiten Lichtweg 18 abgelenkt wird.
Auf dem ersten Lichtweg 17 wird das Beleuchtungslicht 15 auf eine verspiegelte Seite des strukturierten Elements 30 geleitet. Hierzu wird bei der dargestellten Ausführungsform eine Lichtleitfaser 27 benutzt. Das Beleuchtungslicht 15 wird über eine Linse 26 in die Lichtleitfaser 27 eingekoppelt und aus der Lichtleitfaser 27 austretendes Beleuchtungslicht wird über eine weitere Linse 28 auf einen Strahlteiler 29, beispielsweise einen halbtransparenten Spiegel, und damit weiter auf die verspiegelte Seite des strukturierten Elements 30 geleitet.
Auf dem zweiten Lichtweg 18 wird das Beleuchtungslicht mit einer Linse 21 in eine Lichtleitfaser 22 eingekoppelt und am anderen Ende der Lichtleitfaser mit einer Linse 23 auf eine andere Seite des strukturierten Elements 30 geleitet, welche nicht verspiegelt ist.
Anstelle von Lichtleitfasern kann das Beleuchtungslicht 15 auf den beiden Lichtwegen 17, 18 aber auch allein mit Spiegeln und/oder Linsen geführt werden. Zusätzlich können auch Polarisationsfiltermittel zum Polarisieren des Beleuchtungslichts 15 vorhanden sein.
Auf dem zweiten Lichtweg 18 wird das Beleuchtungslicht 15 durch das strukturierte Element 30 transmittiert, wobei dem Beleuchtungslicht 15 eine Struktur aufgeprägt wird, womit es auch als strukturiertes Beleuchtungslicht bezeichnet werden kann.
Das strukturierte Element 30 befindet sich in einer Feldebene, die zu einer Probenebene konjugiert ist, so dass das strukturierte Element 30 scharf an der Probenebene abgebildet wird.
Bei dem strukturierten Element 30 kann es sich beispielsweise um eine ein- oder zweidimensionale Gitterstruktur handeln. Werden die beiden Lichtwege 17, 18 sequentiell genutzt, so können nacheinander zwei Phasen des strukturierten Elements 30 am Probenort abgebildet werden. Um weitere Phasen des strukturierten Elements 30 auf der Probe 60 abzubilden, sind die elektronischen Steuerungsmittel 90 dazu eingerichtet, das strukturierte Element 30 in der Richtung des Doppelpfeils, das heißt quer zu einer optischen Achse des Lichtmikroskops 100, zu verschieben und/oder das strukturierte Element 30 zu drehen. Durch Nutzung der beiden Lichtwege 17, 18 kann vorteilhafterweise die Anzahl der zur Messung benötigter Positionen des strukturierten Elements 30 verringert werden.
Über den Strahlteiler 29 wird Beleuchtungslicht 15 des ersten Lichtwegs 17, welches am strukturierten Element reflektiert wird, und Beleuchtungslicht 15 des zweiten Lichtwegs 18, welches am strukturierten Elements 30 transmittiert wird, auf demselben Strahlengang zur Probe 60 geleitet.
Hierbei durchläuft das Beleuchtungslicht 15 weitere optische Abbildungsmittel 31 sowie einen Strahlteiler 40. Mit dem Strahlteiler 40 wird Beleuchtungslicht 15, das zur Probe 60 hin läuft, und Probenlicht 16, das von der Probe 60 kommt, getrennt. Hierzu kann der Strahlteiler 40 als Polarisationsstrahlteiler 40 ausgeführt sein. In diesem Fall sind zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 40 und der Probe 60 Mittel zum Verändern der Polarisationsrichtung von Licht vorhanden, beispielsweise eine λ/4-Platte 41. Durch die λ/4-Platte wird die Polarisationsrichtung des Beleuchtungslichts 15 auf dem Weg zur Probe 60 gedreht und die Polarisationsrichtung des zurücklaufenden Probenlichts 16 wird erneut gedreht. Dadurch unterscheiden sich am Strahlteiler 40 die Polarisationsrichtungen des Beleuchtungslichts 15 und des Probenlichts 16 um 90°, so dass eine effiziente Trennung möglich ist.
Zum Fokussieren des Beleuchtungslichts 15 auf die Probe 60 sind Fokussiermittel 50 vorhanden. Diese umfassen hier ein beugendes Element 48, das eine chromatische Längsaberration aufweist, sowie ein Objektiv 49. Alternativ kann das beugende Element 48 auch Bestandteil des Objektivs 49 sein. Wegen der chromatischen Längsaberration hängt die Fokuslage des Beleuchtungslichts 15 entlang der optischen Achse von der Wellenlänge des Beleuchtungslichts 15 ab. In 1 sind 3 verschiedene Fokusse 51 für unterschiedliche Wellenlängen des Probenlichts 16 dargestellt.
Indem Licht verschiedener Wellenlängen separat ausgewertet wird, können so unterschiedliche Tiefen, das heißt verschiedene Schnitte entlang der optischen Achse, untersucht werden. Dadurch kann ein Höhenprofil der Probe 60 erstellt werden. Bei einer teilweise transparenten Probe kann auch eine Untersuchung innerhalb der Probe in verschiedenen Tiefen erfolgen.
Von der Probe 60 zurückgeworfenes Probenlicht 16 wird am Polarisationsstrahlteiler 40 in einen Detektionskanal geleitet, in dem es über einen Polarisationsfilter 42 und optische Abbildungsmittel 43 auf die Detektionseinrichtung 80 gelangt. Durch den Polarisationsfilter 42 kann Streulicht mit anderer Polarisationsrichtung herausgefiltert werden.
Zur Untersuchung verschiedener Tiefen in der Probe 60 kann ein Durchstimmen der Wellenlänge des Beleuchtungslichts 15, insbesondere mittels der Wellenlängenselektionseinrichtung 20, und/oder mit spektralen Filtermitteln an der Detektionseinrichtung 80 erfolgen. Die elektronischen Steuerungsmittel 90 sind hier dazu eingerichtet, mit der Wellenlängenselektionseinrichtung 20 und/oder den spektralen Filtermitteln an der Detektionseinrichtung 80 die Wellenlänge des nachzuweisenden Lichts durchzustimmen, um so eine Rasterung der Probe in z-Richtung zu erreichen, ohne dass ein Verschieben der Probe 60 erforderlich ist.
Eine sequentielles Verändern der Wellenlänge von sowohl dem auf die Probe geleiteten Beleuchtungslicht als auch dem mit den Filtermitteln auf die Detektionseinrichtung 80 geleiteten Probenlicht kann vorteilhaft sein, wenn eine einstellbare Bandbreite von Wellenlängenbereichen der Lichtquelle nicht mit der gewünschten spektralen Auflösung erfolgen kann und/oder eine spektrale Auflösung der Detektionseinrichtung, beispielsweise durch den Einsatz einer begrenzten Anzahl an Farbfiltern, nicht die gewünschte Auflösung ermöglicht. In diesem Fall kann eine erhöhte spektrale Auflösung erreicht werden, indem sowohl an der Lichtquelle ein bestimmter Wellenlängenbereich ausgewählt wird als auch eine Wellenlängenfilterung an der Detektionseinrichtung erfolgt. Diese Ausführung kann auch dann vorteilhaft sein, wenn die Abbildung unterschiedlicher Gitterphasen durch eine Farbkodierung erfolgt.
Ein Höhenprofil der Probe 60 kann bestimmt werden, indem zu den verschiedenen Wellenlängen jeweils ein Modulationskontrast für Bildpunkte bestimmt wird, die in einer xy-Ebene, also quer zur optischen Achse, benachbart sind. Dabei ist der Modulationskontrast bei derjenigen Wellenlänge am stärksten ausgeprägt, deren z-Fokuslage mit der Probenoberfläche übereinstimmt. In einer Wertetabelle ist zu jeder Wellenlänge eine z-Fokuslage hinterlegt, so dass aus den bestimmten Wellenlängen eine Position der Probenoberfläche in z-Richtung ermittelt werden kann.
Das Höhenprofil der Probe 60 kann auch auf andere Weise als mit dem Modulationskontrast bestimmt werden. So kann für jede Wellenlänge aus den mehreren Bildern zu verschiedenen Gitterphasen des strukturierten Elements 30 ein Schnittbild der Probe berechnet werden. Eine Bestimmung des Höhenprofils kann dann erfolgen, indem aus Bildpunkten, die in ihrer Position in den verschiedenen Schnittbildern einander entsprechen, derjenige mit der größten Intensität oder dem größten Kontrast ausgewählt wird.
Zum Verrechnen der Bilder zu verschiedenen Gitterphasen umfasst die Detektionseinrichtung 80 einen Smart Pixel Array Detector. Zur Reduzierung der Messzeit kann zudem vorgesehen sein, dass die Gitterphasen durch eine Polarisationskodierung des Beleuchtungslichts auf die Probe abgebildet werden.
Zusätzlich oder alternativ zum Verschieben des strukturierten Elements 30 kann auch eine Manipulation des strukturierten Beleuchtungslichts 15 in einer Pupillenebene des Objektivs 50 erfolgen. Ein Gitter des strukturierten Elements 30 wird gemäß der Fourier-Transformation in der Pupillenebene im Wesentlichen als Punktmuster dargestellt, welches den einzelnen Beugungsordnungen des Gitters entspricht. In der Pupillenebene können nun Ablenkmittel, beispielsweise ein elektrooptischer Modulator, ein akustooptischer Deflektor oder ein Galvanometer-Spiegel, angeordnet sein. Hiermit kann eine Winkelmodulation des Beleuchtungslichts, das in der Pupillenebene einem Punktmuster entspricht, erfolgen, womit ebenfalls zwischen unterschiedlichen Gitterlagen geschaltet werden kann, ohne dass ein Verschieben oder Drehen des strukturierten Elements 30 erforderlich ist.
Alternativ kann das strukturierte Element 30 auch mit einem zweidimensionalen Pinhole-Array anstelle des Gitters gebildet sein. In diesem Fall wird nur der Lichtweg 18 genutzt. Dabei können die Detektorelemente der Detektionseinrichtung 80 als digitales Pinhole verwendet werden, wobei zum Erstellen eines konfokalen Bildes nur die scharf auf die Detektionselemente abgebildeten Bereiche der verschiedenen Bilder der Probe genutzt werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100 ist schematisch in 2 dargestellt. Es wird wiederum Beleuchtungslicht 15 der Lichtquelle 10 auf ein strukturiertes Element 30 geleitet, wozu optische Abbildungsmittel 32 sowie die Komponenten 12, 25, 90, 21, 22, 23 und 40 eingesetzt werden, die bereits mit Bezug auf 1 beschrieben wurden.
Durch das strukturierte Element 30 transmittiertes Beleuchtungslicht 15 wird auch hier über eine λ/4-Platte 41 und Fokussiermittel 50 auf die Probe 60 geleitet.
Im Unterschied zu 1 befindet sich hier der Strahlteiler 40 jedoch nicht zwischen dem strukturierten Element 30 und der Probe 60, sondern zwischen der Lichtquelle 10 und dem strukturierten Element 30. Als Folge durchläuft von der Probe ausgehendes Probenlicht 16 die Fokussiermittel 50 und wird über optische Abbildungsmittel 53 scharf auf das strukturierte Element 30 abgebildet. Das strukturierte Element 30 wird hier durch die elektronischen Steuerungsmittel 90 gedreht und zu verschiedenen Drehpositionen werden jeweils Bilder der Probe mit der Detektionseinrichtung 80 aufgenommen. Eine Seite des strukturierten Elements 30, die der Probe 60 zugewandt ist, ist verspiegelt. Hierdurch wird Probenlicht 16 an dem strukturierten Element 30 teilweise reflektiert und teilweise transmittiert.
Das transmittierte Probenlicht 16 wird mit dem Strahlteiler 40 räumlich vom Beleuchtungslicht 15 getrennt und mit einem ersten Detektor 81 der Detektionseinrichtung 80 nachgewiesen. Hierbei kann die Strukturierung des strukturierten Elements 30 als Pinhole einer konfokalen Abbildung dienen. Dadurch weist Probenlicht 16, das an dem strukturierten Element 30 transmittiert wird, allein konfokale Anteile auf. Nicht-konfokale Lichtanteile werden am strukturierten Element 30 ausgeblendet. Dadurch kann der Detektor 81 ein konfokales Bild der Probe 60 aufnehmen.
Beleuchtungslicht 16, das am strukturierten Element 30 reflektiert wird, weist hingegen sowohl konfokale als auch nicht-konfokale Anteile auf. Das reflektierte Probenlicht 16 wird sodann über optische Abbildungsmittel 53, einen Umlenkspiegel 54, einen Polarisationsfilter 55 und über weitere optische Abbildungsmittel 56 auf einen zweiten Detektor 82 der Detektionseinrichtung 80 abgebildet. Der zweite Detektor 82 zeichnet dadurch ein Weitfeldbild der Probe 60 auf, welches Bildinformationen aus verschiedenen Tiefen und nicht nur aus der Fokuslage des Beleuchtungslichts 15 enthält.
Eine Tiefenauflösung erfolgt auch bei dieser Ausführung über die wellenlängenabhängige Fokuslage 51 des Beleuchtungslichts 15.
Im dargestellten Beispiel sind die beiden Detektoren 81 und 82 durch separate Kamerachips ausgeführt. Alternativ kann aber auch ein einziger Kamerachip eingesetzt werden, wobei die beiden Detektoren 81 und 82 verschiedene Bereiche des Kamerachips darstellen.
Die Tiefenauflösung, also die Auflösung entlang der optischen Achse an der Probe 60, kann erhöht werden, wenn mit besserer spektraler Auflösung gemessen wird. Hierzu ist bei einem weiteren Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 100, das ausschnittsweise in 3 gezeigt ist, ein Interferometer 70 vorhanden. Als optionale Erweiterung ist das Interferometer 70 auch in den 1 und 2 zwischen den Fokussiermitteln 50 und dem strukturierten Element 30 dargestellt.
Das Interferometer 70 ist hier als Linnik-Interferometer ausgeführt. Es umfasst einen Strahlteiler 71, mit dem ein Teil des Probenlichts 16 auf einen Referenzweg 72 geleitet wird. Auf dem Referenzweg 72 sind ein, vorzugsweise achromatisches, Objektiv 74 und ein Spiegel 75 vorhanden, welcher im Fokus des Objektivs 74 angeordnet ist und aus dem Objektiv 74 austretendes Probenlicht 16 zu diesem zurückstrahlt. Optional kann der Spiegel 75 über die elektronischen Steuerungsmittel 90 bewegt werden. Durch Verschieben des Spiegels 75 kann die Länge des Referenzwegs 72 und damit der für die spektrale Interferometre erforderliche Gangunterschied eingestellt werden.
Es kann weiterhin eine λ/4-Platte 73 zwischen dem Strahlteiler 71 und dem Objektiv 74 vorhanden sein, um die Polarisationsrichtung des Probenlichts 16 zu drehen.
Beleuchtungslicht 15, das am Strahlteiler 71 transmittiert wird, gelangt, wie zu 1 beschrieben, über eine λ/4-Platte 41 und die Fokussiermittel 50 auf die Probe 60.
Vorteilhafterweise können hiermit über die chromatischen Informationen hinaus weitere Informationen erhalten werden, die hinsichtlich einer Höhenauswertung der Probe genutzt werden können. Denn der Gangunterschied, der mit dem Interferometer 70 zu einer vorgegebenen Wellenlänge einzustellen ist, hängt vom Abstand der Probenoberfläche und damit von dem Höhenprofil der Probe ab. So kann die Position des Spiegels 75, mit der ein Gangunterschied für konstruktive Interferenz an der Probenoberfläche eingestellt wird, ebenfalls dazu genutzt werden, das Höhenprofil zu ermitteln.
Hierbei sollte das nachgewiesene Licht mir einer spektralen Auflösung in der Größenordnung von 0,1 nm gemessen werden, was allein mit einer einfachen Farbkamera als Detektionseinrichtung nicht möglich ist. Daher wird hier bevorzugt eine durchstimmbare Lichtquelle zusammen mit einer spektral auflösenden Detektionseinrichtung eingesetzt.
Mit dem erfindungsgemäßen Lichtmikroskop können viele Informationen über eine mikroskopische Probe erhalten werden. Dabei können insbesondere ein Konfokalbild sowie ein Weitfeldbild der Probe aufgenommen werden, ohne dass ein Umbauen oder Entfernen von Komponenten aus dem Lichtmikroskop erforderlich ist. Auf ein Rastern der Probe durch mechanisches Verschieben von Komponenten kann weitestgehend verzichtet werden. So können verschiedene xy-Punkte der Probe durch Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht untersucht werden, wobei kein Umpositionieren von Komponenten oder allenfalls ein Verstellen des strukturierten Elements nötig ist. Eine z-Auflösung wird mit Hilfe einer chromatischen Längsaberration erzeugt, wobei die z-Auflösung von der Messgenauigkeit der Wellenlänge des nachzuweisenden Lichts abhängt. Die Wellenlänge kann bei Ausführungsvarianten besonders exakt bestimmt werden, bei denen die Lichtquelle durchstimmbar ist und die Detektionseinrichtung zudem spektral auflösend ist.
Bezugszeichenliste

10: Lichtquelle
12: optische Abbildungsmittel, Linse
15: Beleuchtungslicht
16: Probenlicht
17: erster Lichtweg
18: zweiter Lichtweg
20: Wellenlängenselektionseinrichtung
21: Linse
22: Lichtleitfaser
23: Linse
25: Ablenkeinrichtung
26: Linse
27: Lichtleitfaser
28: Linse
29: halbtransparenter Spiegel
30: strukturiertes Element
31: optische Abbildungsmittel, Linse
32: optische Abbildungsmittel, Linse
40: Strahlteiler, Polarisationsstrahlteiler
41: λ/4-Platte
42: Polarisationsfilter
43: optische Abbildungsmittel, Linse
48: beugendes Element mit chromatischer Längsaberration
49: Objektiv
50: Fokussiermittel
51: Fokus des Beleuchtungslichts
53: optische Abbildungsmittel, Linse
54: Umlenkspiegel
55: Polarisationsfilter
56: optische Abbildungsmittel, Linse
60: Probe
70: Interferometer
71: Strahlteiler
72: Referenzweg
73: λ/4-Platte
74: achromatisches Objektiv
75: Spiegel
80: Detektionseinrichtung
90: elektronische Steuerungsmittel
100: Lichtmikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102007018048 A1 [0006]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Lichtmikroskop mit einer polychromatischen Lichtquelle (10) zum Aussenden von Beleuchtungslicht (15) in Richtung einer Probe (60), Fokussiermitteln (50) zum Fokussieren von Beleuchtungslicht (15) auf die Probe (60), wobei die Fokussiermittel (50) zum Erzeugen einer Tiefenauflösung eine chromatische Längsaberration aufweisen, und einer Detektionseinrichtung (80), die ein zwei-dimensionales Array von Detektorelementen umfasst, zum Nachweisen von Probenlicht (16), welches von der Probe (60) kommt, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweisen von sowohl konfokalen Anteilen als auch nicht-konfokalen Anteilen des Probenlichts (16) ein Strahlengang von der Probe (60) zur Detektionseinrichtung (80) frei von Elementen zum vollständigen Ausblenden von nicht-konfokalen Anteilen ist.
Lichtmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Lichtquelle (10) und den Fokussiermitteln (50) ein strukturiertes Element (30) zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht (15) aus dem von der Lichtquelle (10) ausgesandten Beleuchtungslicht (15) vorhanden ist.
Lichtmikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem strukturierten Element (30) und der Probe (60) ein Strahlteiler (40) vorhanden ist, der für Beleuchtungslicht (15) durchlässig und für von der Probe (60) kommendes Probenlicht (16) reflektiv ist, oder umgekehrt.
Lichtmikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (40) ein Polarisationsstrahlteiler (40) ist und dass zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (40) und der Probe eine λ/4-Platte (41) vorhanden ist, um die Polarisationsrichtung von Probenlicht (16) zu drehen und damit Probenlicht (16) zur Detektionseinrichtung (80) weiterzuleiten.
Lichtmikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass von der Probe (60) kommendes Probenlicht (16) durch das strukturierte Element (30) auf die Detektionseinrichtung (80) geleitet wird und dass Strukturen des strukturierten Elements (30) groß genug zum Durchlassen von nicht-konfokalen Anteilen des Probenlichts (16) sind.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das strukturierte Element (30) an einer Seite verspiegelt ist, wobei von der Probe (60) kommendes Probenlicht (16) auf die verspiegelte Seite des strukturierten Elements (30) geleitet wird und dort teilweise reflektiert und teilweise transmittiert wird, dass die Detektionseinrichtung (80) einen ersten und einen zweiten Detektor (81, 82) aufweist, dass der erste Detektor (81) zum Messen von Probenlicht (16) angeordnet ist, welches von der Probe (60) kommend am strukturierten Element (30) transmittiert wird, und dass der zweite Detektor (82) zum Messen von Probenlicht (16) angeordnet ist, welches von der Probe (60) kommend am strukturierten Element (30) reflektiert wird.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das strukturierte Element (30) eine Nipkow-Scheibe, ein Mikrolinsen-Array, ein Gitter, insbesondere ein 1D-Gitter oder 2D-Gitter, ein Fresnel-Biprisma oder ein Element zum Erzeugen eines Speckle-Musters aufweist.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussiermittel (50) zum Erzeugen einer wellenlängenabhängigen Fokuslage (51) ein lichtbrechendes und/oder lichtbeugendes Mikrolinsen-Array (48) umfassen.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wellenlängenselektionseinrichtung (20) zum Auswählen eines variabel einstellbaren spektralen Bereichs des Beleuchtungslichts (15) vorhanden ist, um über die Fokussiermittel (50) Beleuchtungslicht (15) auf verschiedene Positionen entlang einer optischen Achse des Lichtmikroskops zu fokussieren, und dass elektronische Steuerungsmittel (90) zum Auswählen eines spektralen Bereichs mittels der Wellenlängenselektionseinrichtung (20) vorhanden sind.
Lichtmikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlängenselektionseinrichtung (20) ein Prisma, ein Gitter, einen Farbfilter und/oder einen akustooptischen durchstimmbaren Filter (AOTF, Acousto-Optical Tunable Filter) aufweist.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ablenkeinrichtung (25) zum wahlweisen Leiten von Beleuchtungslicht (15) auf einen ersten oder einen zweiten Lichtweg (17, 18) vorhanden ist, dass das strukturierte Element (30) auf einer Seite verspiegelt ist, wobei Beleuchtungslicht (15) des ersten Lichtweges (17) auf die verspiegelte Seite des strukturierten Elements (30) geleitet wird und am strukturierten Element (30) in Richtung der Probe (60) reflektiert wird und wobei Beleuchtungslicht (15) des zweiten Lichtweges (18) auf eine andere Seite des strukturierten Elements (30) geleitet wird und vom strukturierten Element (30) in Richtung der Probe (60) transmittiert wird und wobei das transmittierte Beleuchtungslicht (15) und das reflektierte Beleuchtungslicht (15) zueinander phasenverschobene Abbildungen des strukturierten Elements (30) an der Probe (60) erzeugen.
Lichtmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung (25) einen schaltbaren Spiegel, insbesondere einen Galvanometer-Spiegel, einen Mikrospiegelaktor (DMD, digital micromirror device) oder ein mikro-elektromechanisches System (MEMS), einen akustooptischen Modulator (AOM), einen akustooptischen Deflektor (AOD), einen elektrooptischen Modulator (EOM) und/oder eine auf Polarisationsdrehung basierende Schalteinheit aufweist.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Positioniermittel zum Verschieben und/oder Drehen des strukturierten Elements (30) vorhanden sind und dass elektronische Steuerungsmittel (90) vorhanden sind, die dazu eingerichtet sind, mit der Detektionseinrichtung (80) Bilder der Probe (60) zu verschiedenen Positionen des strukturierten Elements (30) aufzunehmen und die Bilder zu einem Probenbild zu verrechnen.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (80) eine spektral auflösende Detektionseinrichtung (80) ist.
Lichtmikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Erzeugen der spektralen Auflösung der Detektionseinrichtung (80) spektrale Filtermittel vorhanden sind, insbesondere ein akustooptischer durchstimmbarer Filter (AOTF), ein Prisma, ein Gitter und/oder mindestens ein Farbfilter, oder die Detektionseinrichtung (80) ein Interferometer aufweist.
Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop, bei dem mit einer polychromatischen Lichtquelle (10) Beleuchtungslicht (15) in Richtung einer Probe (60) gesendet wird, bei dem mit Fokussiermitteln (50) das Beleuchtungslicht (15) auf die Probe (60) fokussiert wird, wobei eine Tiefenauflösung durch eine chromatische Längsaberration der Fokussiermittel (50) erreicht wird, und bei dem mit einer Detektionseinrichtung (80), die ein zwei-dimensionales Array von Detektorelementen umfasst, Probenlicht (16) nachgewiesen wird, welches von der Probe (60) kommt, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl konfokale Anteile als auch nicht-konfokale Anteile des Probenlichts (16) auf die Detektionseinrichtung (80) geleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bestimmen eines Höhenprofils einer Probe (60) Bilder der Probe (60) aufgenommen werden, die sich in dem nachgewiesenen Wellenlängenbereich des Probenlichts (16) unterscheiden, dass ein Modulationskontrast für Bildpunkte von jedem Bild bestimmt wird, dass aus den Bildpunkten, die in den verschiedenen Bildern die gleiche Position haben, derjenige Bildpunkt ausgewählt wird, der den größten Modulationskontrast aufweist, und dass dem ausgewählten Bildpunkt abhängig vom zugehörigen Wellenlängenbereich eine Höheninformation der Probe (60) zugeordnet wird, wobei zu jedem der verschiedenen Wellenlängenbereiche jeweils eine Höheninformation vorab gespeichert ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (80) in einer Ebene angeordnet ist, die zur Probenebene konjugiert ist, dass zur Erzeugung eines Konfokalbildes die Detektorelemente der Detektionseinrichtung (80) als digitale Blende genutzt werden, wobei zur Erstellung des Konfokalbildes diejenigen Detektorelemente genutzt werden, auf die solche Probenbereiche, die im Fokus des Beleuchtungslichts (15) liegen, scharf abgebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem Interferometer (70), insbesondere einem Linnik-Interferometer (70), ein Teil des Probenlichts (16) auf einen Referenzweg (72) mit einstellbarer Länge geleitet und anschließend auf die Probe (60) zurückgeleitet wird, wobei an einer Oberfläche der Probe (60) eine konstruktive Interferenz zwischen Beleuchtungslicht (15) und zurückgeleitetem Probenlicht (16) von einem Höhenprofil der Probe (60) sowie von der Länge des Referenzwegs (72) abhängt, dass die Länge des Referenzwegs (72) variiert wird und diejenige Länge ausgewählt wird, bei der mit der Detektionseinrichtung ein maximales Signal empfangen wird, dass aus der ausgewählten Länge des Referenzwegs (72) mit Hilfe von vorab gespeicherten Werten auf das Höhenprofil der Probe (60) geschlossen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass zum Verbessern der spektralen Auflösung eine Wellenlängenauswahl sowohl über spektrale Filtermittel der Detektionseinrichtung (80) als auch über eine Wellenlängenselektionseinrichtung (20) an der Lichtquelle (10) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes Bild der Probe (60) aufgenommen wird, wobei sich zum Erzeugen einer strukturierten Beleuchtung ein strukturiertes Element (30) im Strahlengang befindet, dass zur Untersuchung von Probenbereichen, die mit der strukturierten Beleuchtung bei der Aufnahme des ersten Bildes nicht beleuchtet wurden, ein zweites Bild aufgenommen wird, wobei sich das strukturierte Element (30) nicht im Strahlengang befindet, und dass das erste und das zweite Bild zu einem Probenbild verrechnet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zum Verbessern einer Messauflösung in einer Probenebene, die quer zu einer optischen Achse liegt, eine Polarisationskodierung von Beleuchtungslicht (15) und/oder Probenlicht (16) erfolgt, wobei in der Probenebene nebeneinander liegende Bereiche mit Beleuchtungslicht (15) verschiedener Polarisationen bestrahlt wird oder wobei eine ortsabhängige Probenlichtspolarisierung, bei der Probenlicht (16) abhängig von dessen Position quer zur optischen Achse eine bestimmte Polarisation aufgeprägt wird, erfolgt, wobei Probenlicht (16) für verschiedene Polarisationen separat nachgewiesen wird und wobei dem nachgewiesenen Probenlicht (16) abhängig von dessen Polarisation eine Ortsinformation innerhalb der Probenebene zugeordnet wird.