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Einleitung – Hintergrund und
Stand der Technik
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Die
vorliegende Erfindung hat hauptsächlich Anwendungen in
der Mikroskopie, ist jedoch nicht auf diesen Bereich beschränkt.
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Um
dreidimensionale Abbildungen von Objekten zu erhalten, bedient man
sich oft der Technik des optischen Schneidens. Ein sogenannter optischer
Schnitt ist eine Abbildung, welche nur Informationen aus einem bestimmten
Tiefenbereich enthält. Ein optisches System zur Erstellung
optischer Schnitte bildet deshalb selektiv Objektdetails ab, welche
sich in der Fokusebene befinden, wobei Objektdetails, welche sich
nicht in dieser Ebene befinden, im Schnittbild unterdrückt
werden.
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Durch
die Aufnahme einer Serie von optischen Schnitten an unterschiedlichen
Fokuspositionen kann ein 3D Objekt schrittweise abgetastet werden.
Somit kann eine dreidimensionale Abbildung des Objektes erstellt
oder seine Topologie analysiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht die Erstellung von optischen
Schnitten auf besonders einfache Weise und kann zum Beispiel in
der Biologie, Medizin oder den Materialwissenschaften zur Analyse
von Objekten verwendet werden.
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Eines
der ersten Verfahren zur Erzeugung von optischen Schnitten war das
konfokale Mikroskop von Minsky [1]. Hier wird die Abbildung von
Bilddetails außerhalb der Fokusebene durch eine Anordnung
von konfokalen Blenden unterdrückt.
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Ein
anderer Ansatz zur Erzeugung von optischen Schnitten ist die strukturierte
Beleuchtung, wie sie zum Beispiel von Wilson et al. in
[2] beschrieben ist. Hier wird eine Struktur, zum Beispiel ein Gitter,
in die abzubildende Probe projiziert. Dies erzeugt eine Modulation
der Lichtverteilung in der Probe. Wie zum Beispiel in [2] gezeigt
wurde, ist die Modulationstiefe in der Fokusebene am stärksten
und kennzeichnet in diesem Sinne die Fokusebene. Bei der strukturierten
Beleuchtung wird zuerst eine Modulation dem Beleuchtungslicht aufgeprägt,
danach eine Serie von Abbildungen für verschiedene Positionen
(Phasenschritte) der projizierten Struktur aufgenommen und im letzten
Schritt das optische Schnittbild aus den aufgenommenen Daten berechnet.
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Hierzu
wurden verschiedene Anordnungen vorgeschlagen. Im Patent von Wilson
et al., [3] wird ein Gitter in einer der Probe konjugierten
Ebene angeordnet und lateral zur optischen Achse verschoben. Bei Gerstner
et al. [4][5] wird dagegen eine in den Strahlengang eingebrachte
planparallele Platte gekippt, welche die in die Probe projizierte
Beleuchtungsstruktur lateral verschiebt. Eine andere Lösung
wurde von Neil et al. [6] vorgeschlagen. Hier entsteht
die Beleuchtungsstruktur in der Probe direkt durch Interferenz.
Alle Verfahren [2–6] haben die Eigenschaft, dass sie die
Aufnahme von mindestens 3 Einzelbildern erfordern. Weiterhin gibt es
Probleme und Artefakte durch Ungenauigkeiten bei der Positionierung
der projizierten Struktur, da sie die exakte und gleichzeitig schnelle
Einstellung eines mechanischen Elementes erfordert. Details zu Artefakten und
deren Kompensation kann man zum Beispiel in [7] finden.
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Ein
weitere wesentlicher Aspekt von Implementierungen des Verfahrens
der Strukturierten Beleuchtung ist die Abbildung einer Probe unter
Nutzung verschiedener Wellenlängen. Zur Zeit bekannte Implementierungen
haben hier Probleme beim Wechsel der Wellenlänge: durch
verbleibende axiale chromatische Aberration, welche vom verwendeten
Objektiv abhängig sein kann, muss die Projizierte Struktur
(in der Regel eine Maske) axial neu positioniert werden. Dies erfordert
in bekannten Mikroskopanordnungen relativ große Stellwege
und somit viel Zeit für die Bewegung von mechanischen Elementen.
Die vorliegende Erfindung schlägt Anordnungen mit zusätzlichen
Korrekturelementen vor, wodurch ein Wechsel der Abbildungswellenlänge
keine mechanische axiale Bewegung der projizierten Maskenstruktur
mehr erfordert und somit Zeitvorteile bringt.
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Eine
andere Ausgestaltung des Prinzips der strukturierten Beleuchtung
arbeitet mit kontinuierlich bewegten Beleuchtungsstrukturen, welche
in die Probe projiziert werden [8, 9]. Hier wird eine bewegliche
Maske sowohl zur Kodierung der Beleuchtungsstruktur und anschließender
Projektion auf die Probe als auch zur Dekodierung genutzt. Hierbei
ist charakteristisch, dass das von der Probe ausgehende Licht die
Maske durchläuft. In [8] wurde eine Anordnung beschrieben,
welche für die Implementierung in einem Weitfeld-Mikroskop geeignet
ist. Die Anordnung in [9] ist vorrangig für die Verwendung
in Kombination mit einem Linienscanner geeignet. Beide Verfahren
in [8] und [9] haben gemeinsam, dass zwei verschiedene Signale auf
einem ortsauflösenden Detektor integriert werden, wobei
sich das gewünschte optische Schnittbild durch einfache
Subtraktion der beiden Bilddatensätze ergibt. Gemeinsamer
Nachteil der Anordnungen [8] und [9] ist, dass das von der Probe
ausgehende und zu detektierende Licht vor der Registrierung am Detektor
beim Durchgang durch die Maske geschwächt wird. Dies ist
vor allem bei der Beobachtung schwacher Lichtsignale von Bedeutung, wie
sie insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie auftreten.
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Durch die Erfindung gelöste Aufgabe/Zusammenfassung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode und Anordnungen
zur Erzeugung von optischen Schnittbildern mittels strukturierter
Beleuchtung. Im Vergleich zum Stand der Technik [2–7] ist
es jedoch möglich, optische Schnittbilder durch Projektion
von nur zwei Beleuchtungsmustern auf die Probe zu erhalten. Dies
ermöglicht eine schnellere Probenabtastung und zusätzlich
ein besseres Signal-Rauschverhältnis der erzeugten optischen
Schnitte bei gleicher Anzahl der detektierten Photonen.
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Weiterhin
wird eine Anordnung vorgeschlagen, mit der das erfindungsgemäße
Verfahren ohne bewegliche mechanische Komponenten implementiert
werden kann. Dies reduziert den Justieraufwand, Kosten für mechanische
Aktuatoren und Bildartefakte aufgrund von Positionierfehlern. Zusätzlich
kann die Geschwindigkeit der Probenabtastung durch den Wegfall von
Positionierzeiten erhöht werden. Im Vergleich zu [8] und
[9] sind ebenfalls keine bewegten oder rotierenden optischen Elemente
notwendig.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Erzeugung von optischen
Schnittbildern, wobei die Probe mit verschiedenen Wellenlängen
abgetastet wird. Eine aus der Literatur bekannte Anordnung [4] erfordert
für eine sequentielle Abtastung bei mehreren Wellenlängen
eine Refokussierung der in die Probe projizierten Struktur, um axiale
chromatische Fehler der Optik zu kompensieren. Erfindungsgemäß wird
hier eine Anordnung von Korrekturelementen vorgeschlagen, welche
das Problem der axialen chromatischen, oft auch objektivabhängigen
Korrektur ohne axiale mechanische Bewegung der projizierten Struktur
im Beleuchtungsstrahlengang löst. Durch den Wegfall der
Bewegung mechanischer Komponenten wird die gleichzeitige Abtastung des
Objektes bei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht.
Dies ergibt einen wesentlicher Zeitvorteil. Durch Kombination mit
der erfindungsgemäßen strukturierten Beleuchtung
mit nur zwei Projektionsschritten und die Implementierung der Umschaltung
oder sogar zeitgleichen Projektion der zwei erforderlichen Beleuchtungsstrukturen
ohne bewegliche mechanische Elemente ergibt sich ein sehr deutlicher
Geschwindigkeitsvorteil gegenüber dem Stand der Technik.
Dies kann vor allem in der Fluoreszenzmikroskopie bei der Mehrkanal-Beobachtung
nützlich sein.
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Beschreibung der Erfindung
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Teil A: Methode zur Generierung optischer
Schnittbilder durch Projektion von nur zwei Lichtverteilungen
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Für
die strukturierte Beleuchtung muss das auf das Objekt projizierte
Beleuchtungslicht eine Modulation in mindestens einer Raumrichtung
aufweisen.
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Verfahren
zur Strukturierten Beleuchtung entsprechend dem Stand der Technik
benötigen die Projektion von mindestens drei Strukturen
bzw. die Projektion von mindestens drei Phasenlagen einer Struktur.
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Erfindungsgemäß werden
genau zwei Strukturen projiziert, wobei es vorteilhaft ist, wenn
die Intensitätsverteilung der zweiten Struktur komplementär
zur ersten ist und die gemittelten Intensitäten beider
Beleuchtungsverteilungen nicht stark voneinander abweichen.
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Obwohl
auch die Nutzung zweidimensionaler Beleuchtungsstrukturen denkbar
ist, soll das Prinzip im Folgenden wegen der einfacheren Darstellung
an einer Gitterstruktur erklärt werden. Ohne Einschränkung
der Allgemeinheit wird die Projektion einer sinusförmigen
Gitterstruktur in die zu untersuchende Probe angenommen.
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Die
erste Struktur, welche in die Probe abgebildet wird, hat die Form: G1(a, b) = 1 + Acos(ωa
+ δ). <1>
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Die
zweite, zur ersten Struktur komplementäre Struktur ist
dann: G2(a,
b) = 1 – Acos(ωa + δ) = 1 + Acos(ωa
+ π + δ). <2>
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Hier
sind a und b die lateralen lokalen Koordinaten im System der projizierten
Struktur, ω ist Gitterfrequenz und die δ die Phasenlage
des Gitters. Wie aus Gleichung <2> ersichtlich, entspricht
die komplementäre Beleuchtungsstruktur einer Verschiebung
der periodischen Struktur um den Phasenwinkel π. Es ist
anzumerken, dass die Projektion einer Struktur und ihrer komplementären
Struktur erfindungsgemäß ohne bewegliche mechanische
Komponenten implementiert werden kann. Dies eliminiert mögliche
Phasenfehler durch positionier-Ungenauigkeiten und wird später
erläutert. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn an der Probe
die über das Gesichtsfeld gemittelten Intensitäten
beider Projektionen nicht zu stark voneinander abweichen.
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Die
in die Probe projizierten Lichtverteilungen G1(a,
b) und G2(a, b) werden in der Probe gestreut,
reflektiert, von ihr transmittiert, absorbiert oder regen Fluoreszenz
oder Lumineszenz an. Beliebige Kombinationen dieser genannten Wechselwirkungen
sind ebenfalls denkbar, auch bei verschiedenen Wellenlängen.
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Die
in der Probe erzeugte Projektion der Intensitätsverteilung
G1(a, b) wird vom Ort der Probe auf einen
ortsauflösenden Detektor abgebildet. Die Intensitätsverteilungen
G1(a, b) und G2(a,
b) sowie die Objektebene (Probe) und der Detektor befinden sich
in zueinander konjugierten Bildebenen. Bei der Implementierung in
einem Mikroskop ist es vorteilhaft, wenn sich die projizierte Beleuchtungsstruktur
in einer zur Feldblende konjugierten Ebene befindet.
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Bei
Projektion von G1(a, b) wird am Detektor
die Intensitätsverteilung I1(x, y) = K(x, y) + S(x, y)·cos[x·g(x,
y) + α(x, y)] <3>gemessen.
Bei der Projektion der zweiten dazu komplementären Struktur
G2(a, b) ergibt sich die komplementäre
Intensitätsverteilung I2(x, y) = K(x, y) – S(x, y)·cos[x·g(x,
y) + α(x, y)] <4>am
Detektor. Hierbei sind (x, y) die Koordinaten in der Detektorebene,
g(x, y) ist die Modulationsfrequenz (Gitterfrequenz) in Richtung
der x-Koordinate, wobei g = 2Π/T gilt und T die Gitterperiode
in x-Richtung ist. Übliche Flächendetektoren wie
CCD's oder CMOS Sensoren sind Pixel-basiert, weshalb die Koordinaten
(x, y) auch in diskreten Pixelkoordinaten angegeben werden können.
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Der
Parameter α(x, y) ist die Phase der periodischen Struktur.
Die Größe K(x, y) ist die konventionelle Abbildung,
welche auch Bildinformationen von Ebenen außerhalb der
Fokusebene enthält. In der Mikroskopie entspricht der K(x,
y) der Weitfeld-Abbildung der Probe.
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Mit
Hilfe der Gleichungen <3> und <4> kann die konventionelle
Abbildung einfach berechnet werden:
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Die
Größe S(x, y) ist das gesuchte optische Schnittbild,
welches auch der Modulationstiefe durch die strukturierte Beleuchtung
entspricht (siehe auch [2, 4]). Das Gleichungssystem, bestehend
aus <3> und <4>, enthält
insgesamt 4 unbekannte Größen für jeden
Ort des Detektors mit den Koordinaten (x, y): das konventionelle
Schnittbild K(x, y), das gesuchte Schnittbild S(x, y), die Gitterfrequenz
g(x, y), sowie die lokale Phase α(x, y).
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Bei
perfekter Geometrie der in die Probe projizierten Beleuchtungsverteilung
und perfekter optischer Abbildung wären die Gitterfrequenz
und die Phase nicht von den Koordinaten (x, y) abhängig.
Unter praktischen Bedingungen und bei leichten Abbildungsfehlern
der Optik ist diese Annahme jedoch nur eine Näherung.
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Die
Verfahren gemäß dem Stand der Technik [2–7]
nehmen eine lokal konstante Gitterfrequenz g an. Deshalb verbleiben
3 unbekannte Größen und die bisherigen Verfahren
[2–7] benötigen mindestens die Messung von 3 Phasenschritten α der
projizierten Struktur, um ein Schnittbild zu berechnen.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Kalibriermessung
durchgeführt, in welcher die lokale Phase α(x,
y) und optional die lokale Gitterfrequenz g(x, y) für jeden
Ort im Detektorkoordinatensystem (x, y) bestimmt wird. Somit kann
erfindungsgemäß die Anzahl der erforderlichen
Projektionsschritte zur Erzeugung eines optischen Schnittbildes
auf nur zwei reduziert werden.
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Der
Kalibrierschritt verwendet vorzugsweise ein ebenes Kalibrierobjekt,
welches reflektiert oder fluoreszierende Eigenschaften oder Lumineszens
aufweist. Dieser Vorgang, insbesondere das Einschwenken der Kalibrierprobe
und der Kalibriervorgang können automatisiert sein. Die
Kalibrierprobe kann dabei am Ort der zu untersuchenden Probe oder
in einer dazu konjugierten Bildebene lokalisiert sein. Zur Kalibrierung
werden mit Hilfe des Kalibrierobjektes zwei Datensätze
C1(x, y) und C2(x,
y) bei der Projektion der Strukturen G1(a,
b) bzw. G2(a, b) aufgenommen.
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Die
lokale Phase α(x, y) und die lokale Gitterfrequenz g(x,
y) können nun durch Fouriertransformation oder Wavelet-Transformation
eines Ausschnittes des aufgenommenen Kalibrierdatensatzes bestimmt
werden. Die Größen g(x, y) und α(x, y)
sind theoretisch ortsunabhängige Konstanten. Durch Imperfektionen
bei der optischen Abbildung kann ihre Korrektur bzw. die Bestimmung
lokaler Abweichungen jedoch vorteilhaft sein. Die Kalibration muss
nur selten durchgeführt werden, zum Beispiel wenn Detektor,
Objektiv oder andere optische Komponenten gewechselt oder justiert
wurden. Erfindungsgemäß können weiter
unten erläuterte Anordnungen verwendet werden, bei denen
eine fest im optischen System verankerte, unbewegliche Maske in
die Probe projiziert wird. Dadurch kann das System im Abbildungsbetrieb
mit nur zwei Projektionsschritten auskommen. Der bei anderen Verfahren
nach dem Stand der Technik übliche dritte oder sogar weitere
Schritte entfallen damit. Dies führt auch insbesondere
bei der Fluoreszenzmikroskopie zu geringeren Probenbelastungen und
geringerem Photo-bleaching.
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Im
Folgenden wird angenommen, dass die lokale Phase α(x, y)
und die lokale Gitterfrequenz g(x, y) wie beschrieben aus der Kalibrierung
ermittelt wurden oder durch a-priori Wissen bekannt sind.
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Für
die Berechnung des Schnittbildes werden unter Verwendung von <3> und <4> nun folgende Größen
eingeführt:
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Nun
lasst sich das gesuchte Schnittbild mit Hilfe der Gleichungen <3>, <4>, <6> und <7> einfach berechnen:
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Weiterhin
kann es Inhomogenitäten in der Beleuchtungsverteilung der
beiden Strukturen am Detektor geben. Diese können sowohl
durch die Imperfektionen der projizierten Struktur selbst, Inhomogenitäten
bei der Projektion in die Probe oder der anschließenden
Abbildung auf den Detektor entstehen. Erfindungsgemäß können
deshalb die Daten I
1(x, y) und I
2(x, y) zur Kompensation von Inhomogenitäten
normiert werden:
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Dabei
sind
die Mittelwerte
von C
1(x, y) bzw. C
2(x,
y) über ein Gebiet F, welches die Koordinaten (x, y) beinhaltet
und eine ganzzahlige Anzahl von Perioden der Struktur überdeckt.
Die Kompensation von nachteiligen Effekten durch die Inhomogenität
der Intensitäten der abgebildeten Beleuchtungsstrukturen
oder auch Inhomogenitäten des Detektors können
durch die Verwendung der normierten Größen N
1(x, y) und N
2(x,
y) anstelle der aufgenommenen Größen I
1(x, y) und I
2(x,
y) in den Gleichungen <5> bis <8> erfolgen.
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Teil B: Beschreibung von Anordnungen zur
Implementierung der Erfindung
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Das
in Teil A beschriebene Verfahren kann in einer Vielzahl von Anordnungen
verwirklicht werden, insbesondere in weitfeld-Fluoreszenz Mikroskopen
und in Weitfeld-Mikroskopen zur Untersuchung und Tiefenerfassung
von Oberflächen im Auflichtbetrieb.
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Im
folgenden sollen die Zeichnungen und Anordnungen zur Implementierung
des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert
werden.
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1 zeigt
eine vereinfachte Anordnung zur Implementierung des Verfahrens.
Zur vereinfachten Darstellung wurden optional vorhandene Zwischenbilder
und relay-Optiken nicht gezeichnet. Die Beleuchtungseinheit (1) generiert
erfindungsgemäß zwei verschiedene Lichtverteilungen.
Dabei befindet sich in Ebene (3) eine Beleuchtete Maskenstruktur,
ein beleuchteter DMD chip (digital mirror device, auch als DLP Technik
von Texas Instruments bekannt) oder aber eine Zwischenabbildung
einer Lichtverteilung, welche eine Modulation in mindestens einer
Raumrichtung aufweist. Die in der Ebene (3) vorhandene
Lichtverteilung wird über den Strahlteiler (7)
und das Objektiv (5) auf oder in das zu untersuchende Objekt (9) projiziert.
Dabei sind die Ebene (3) und die nominale Objektebene (9) zueinander
konjugiert. Der Strahlteiler (7) kann ein halbdurchlässiger Spiegel
oder auch ein dichroitischer Strahlteiler sein. Multi-Band Strahlteiler
können ebenfalls eingesetzt werden. Die auf die Probe projizierte
Lichtverteilung wird nun über ein Objektiv und weitere
Zwischenoptiken auf die Detektionseinheit (11) abgebildet.
Die Ebene (13) ist dabei eine Bildebene oder Zwischenbildebene,
welche konjugiert zu den Ebenen (9) und (3) ist.
In einem Mikroskopsystem ist es vorteilhaft, wenn die Ebene (3) mit
der zu projizierenden Lichtverteilung konjugiert zur Ebene der Leuchtfeldblende
ist. Innerhalb der Detektionseinheit (11) kann sich dabei
ein Ortsaufgelöster Detektor, wie zum Beispiel ein CCD
oder ein CMOS-Sensor befinden. Alternativ dazu kann die Einheit (11) auch
das sich in Ebene (13) befindliche Bild weiter auf einen oder
mehrere Detektoren abbilden.
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2 zeigt
eine erfindungsgemäße Anordnung zur Realisierung
der Beleuchtungseinheit (1). Die beiden Lichtquellen (19) und (23) sind
dabei derart angeordnet, dass sie eine Maskenstruktur in Ebene (3) unter Nutzung
eine Strahlteilers (21) von verschiedenen Seiten beleuchten.
Die Lichtquellen (19) und (23) können dabei
in ihrer Intensität und optional auch in der spektralen
Zusammensetzung des emittierten Lichtes gesteuert werden. Die Maske
in Ebene (3) hat dabei Bereiche, welche besonders stark
reflektieren und dazu komplementäre Bereiche mit besonders
hoher Transmission. Eine solche Maske kann nicht nur binäre
Strukturen sondern auch Grauwertverteilungen enthalten. In Ebene (3) kann
sich eine Strukturierte Spiegeloberfläche befinden. Erfindungsgemäß hat
das von beiden Lichtquellen (19) und (23) in Richtung (22) von
der Einheit (1) abgegebene Licht eine über die
ausgeleuchtete Fläche gemittelte Intensitäten,
welche nicht zu stark voneinander abweichen. Dabei werden von beiden
Lichtquellen zueinander komplementäre Lichtverteilungen
durch Transmission (Lichtquelle (19)) und durch Reflexion
(Lichtquelle (23)) an der Maskenstruktur in Ebene (3) erzeugt. Obwohl
dies nicht direkt aus der Zeichnung hervorgeht, sind die Elemente (21) bis (24) als
Teil der gesamten Beleuchtungseinheit (1) zu verstehen.
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Es
ist hervorzuheben, dass eine solche Anordnung zwei verschiedene
Beleuchtungsverteilungen zur Verfügung stellt, welche die
simultane oder zeitsequentielle Projektion von zwei Strukturen bzw.
zwei verschiedenen Phasenlagen derselben Struktur ohne jegliche
beweglichen mechanische Elemente ermöglicht. Dies führt
zu Geschwindigkeitsvorteilen und auch zu reduziertem Justieraufwand
bei der Implementierung des erfindungsgemäßen
Verfahrens und ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber dem
Stand der Technik.
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Bei
zeitsequentiellem Betrieb emittiert entweder die Lichtquelle (19) oder
die Quelle (23) Licht, wobei die Aufnahmen der Abbildung
der Probe mittels der Detektionseinheit (11) dazu synchronisiert
sind.
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In
einer weiteren Ausprägung der Erfindung werden beide Lichtverteilungen
bzw. Beleuchtungsstrukturen zeitgleich abgestrahlt. Zu einer Kodierung
der beiden Verteilungen kann dazu die Polarisation des abgestrahlten
Lichtes oder seine spektrale Charakteristik genutzt werden. Hierzu
werden die beiden optionalen Polarisationsfilter bzw. Spektralfilter (20) und (24) in 2 genutzt.
Im Falle von Polarisationsfiltern sind diese gekreuzt zueinander
angeordnet, sodass das in Richtung (22) abgestrahlte Licht,
welches die Filter (20) bzw. (24) durchlaufen
hat, zwei zueinander orthogonale Polarisationsrichtungen aufweist.
Alternativ zu linear polarisiertem Licht kann eine Kennzeichnung
bzw. Trennung der Projektionskanäle durch links- oder rechtszirkular polarisiertes
Licht erfolgen.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung zur zeitsimultanen
und durch Polarisation oder spektrale Charakteristik kodierten Abstrahlung
von zwei komplementären Beleuchtungsstrukturen hat zusätzliche
Geschwindigkeitsvorteile und ermöglicht die Erzeugung von
Schnittbildern in Echtzeit, wie es insbesondere bei der Materialmikroskopie
im Auflichtbetrieb und zur Konstruktion von Oberflächenvermessungssystemen
für mikroskopische und makroskopische Objekte wünschenswert
ist.
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3 zeigt
eine erfindungsgemäße und vorteilhafte Anordnung
zur Implementierung der Lichtquellen (19) und (23).
Hier sind die Lichtquellen (19) und (23), welche
Teil der Beleuchtungseinheit (1) sind, durch den Ausgang
von zwei Lichtleitern (37) und (39) ersetzt. Der
Aufbau enthält weiterhin eine Anzahl von n Lichtquellen,
wovon in 3 nur die Lichtquelle 1 (25) und
die Lichtquelle n (27) dargestellt sind. Diese Lichtquellen können
auch verschiedene spektrale Anteile des von einer einzigen Quelle
erzeugten und räumlich aufgespalteten Lichtes darstellen.
Die verschiedenen Lichtquellen können unterschiedliche
spektrale Eigenschaften haben. Ein Lichtwellenleiter (31) ist
mit den Aktuatoren (33) und (35) verbunden und
nutzt die Kopplungsoptiken (29). Die gesamte Anordnung
arbeitet als erfindungsgemäß als schaltbare Weiche,
welche es ermöglicht, eine beliebige Lichtquelle mit einem
der beiden Lichtleiterausgänge (19) oder (23) zu
verbinden. Dies hat zwei Hauptvorteile: erstens wird nur ein Exemplar
einer Lichtquelle benötigt, was die Kosten senkt und die
gleiche spektrale Verteilung in beiden Projektionsschritten sicher
stellt. Zweitens können die Ausgänge (19) und (23) als
fest justierte Punktlichtquellen fungieren, auf welche die restliche
Optik der Projektionseinheit justiert ist und bleibt. Dies reduziert
den Justieraufwand.
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In 4 ist
eine mögliche Ausgestaltung der Maske dargestellt, welche
Teil der in 2 gezeigten Projektionseinheit
sein kann. Im einfachsten Fall befinden sich auf einem transparenten
Substrat (41) alternierend angeordnete homogene Gebiete (47) mit
hoher Reflektivität (49) und geringer Transparenz
sowie homogene Gebiete (45) mit hoher Transparenz (43).
Hierbei ist die Gesamtfläche jeweils der transparenten
und der intransparenten Flächen gleich groß. Obwohl
in diesem Beispiel eine binäre Struktur gewählt
wurde, sind auch Maskendesigns mit mehreren Stufen für
Transmission und Reflexion oder sogar kontinuierliche Verteilungen denkbar.
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In 5 ist
eine Anordnung für eine Projektionseinrichtung (1) entsprechend
dem Stand der Technik [2] dargestellt, wobei eine Maske (52) im
Durchlicht betrieben und von einem Aktuator (51) senkrecht
zur optischen Achse bewegt wird. Eine solche Vorrichtung kann auch
für die Implementierung des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Schnittbildgenerierung aus zwei Projektionsschritten
verwendet werden. Gegenüber dem Stand der Technik mit drei
Projektionsschritten ermöglicht dies eine höhere
Probenabtastgeschwindigkeit und geringeres Photo-bleaching. Im Vergleich
zur erfindungsgemäßen Implementierung mit feststehender
Maske in 2 erfordert dies jedoch den
Aktuator (51), welcher eine sehr hohe Reproduzierbarkeit
bei der Einstellung der beiden projizierten Lichtverteilungen liefern
muss.
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In 6 werden
Aspekte zur Kalibrierung und zur chromatischen Korrektur einer erfindungsgemäßen Anordnung
erläutert. Hier wurde die diagrammatische Darstellung von 1 durch
eine zusätzlich dargestellte Zwischenoptik (55) ergänzt.
Zur Kalibrierung kann ein Element (53) in den Strahlengang
geschwenkt werden. Die Ebene des Elementes (53) entspricht
einer Zwischenbildebene und ist zu (3) und (13) konjugiert.
Die Lage und Gestalt des Zwischenbildes und das im Fall einer ebenen
Probe von der Probe zurück in die Ebene des Elementes (53) abgebildete
Zwischenbild können deckungsgleich sein. Aus diesem Grund
kann das Einschwenken von Element (53) äquivalent
zur Montage einer Justierprobe vor dem Objektiv (5) sein.
Das einschwenken des Elementes (53) kann dabei vollautomatisch
und im Inneren der optischen Anordnung geschehen. Dies vereinfacht
die Benutzung und ermöglicht eine vollautomatische Kalibrierung,
d. h. die Bestimmung der lokalen Phase α(x, y) und optional
der lokale Gitterfrequenz g(x, y) für jeden Ort im Detektorkoordinatensystem
(x, y). Zusätzlich kann des Kalibrierobjekt nicht verschmutzen
oder verloren gehen, da es Teil der optischen Anordnung ist. Das
Element (53) kann eine diffus reflektierende, fluoreszierende
oder eine nur bei einer bestimmten Wellenlänge reflektierende
Oberfläche haben. Eine Kalibrierung kann, unabhängig
von Element (53), jederzeit auch durch ein Testobjekt erfolgen,
welche vor dem Objektiv (5) im Probenraum positioniert
wird.
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Ein
weiteres Problem von Anordnungen entsprechend dem Stand der Technik
ist eine Schwankung der Beleuchtungsintensität während
der Projektion. Dies ist zum Beispiel in [7] diskutiert. Insbesondere
Quecksilber-Hochdrucklampen können bauartbedingte Schwankungen
der Beleuchtungsintensität aufweisen, welche zu Artefakten
beim Verfahren der strukturierten Beleuchtung führen können.
Erfindungsgemäß kann dies durch eine, gleichzeitig
mit der Bildaufnahme erfolgende Messung der relativen Beleuchtungsdosis
der verschiedenen Projektionsschritte auf dem Detektor (11) führen.
Diese Information über die relativen Beleuchtungsintensitäten
kann dann in der Berechnung des Schnittbildes genutzt werden und
somit zur Reduzierung von Artefakten beitragen. Zur Messung der
relativen Beleuchtungsdosis kann die Beleuchtungsstruktur, welche
sich am Ort (3) befindet oder dorthin abgebildet wird,
Testgebiete am Rand einer jeden projizierten Struktur haben. Ein
Element, welches auch das Kalibrationselement (53) sein
kann, wird nun erfindungsgemäß nur Teilweise in
den Strahlengang am Ort eines Zwischenbildes der projizierten Struktur,
z. B. Ort von (53), eingeschwenkt, sodass es auf dem Detektor (11) nur
am Rand des Gesichtsfeldes abgebildet ist. Dieses Element verbleibt
während der gesamten Projektionsprozedur zur Schnittbildgenerierung
im Strahlengang. Dies erlaubt die Protokollierung der relativen
Intensitäten der Projektionsschritte auf dem Detektor (11) unabhängig
von der betrachteten Probe und deren Eigenschaften.
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Ein
zusätzliches Problem bei Anordnungen entsprechend dem Stand
der Technik und Hindernis beim Erreichen hoher System-Geschwindigkeiten
tritt bei der Abbildung mit mehreren Wellenlängen auf,
insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie. Durch chromatische Aberrationen,
insbesondere axiale chromatische Aberrationen, sind die Ebenen (1) und (13) in 6 nicht
mehr exakt zueinander konjugiert. Dies wird bei Anordnungen entsprechend
dem Stand der Technik [3, 4, 5] gelöst durch eine Refokussierung
der abgebildeten Maske, entsprechend einer axialen Verschiebung
von Ebene (3) in 6. Hierbei
sind oft große Verstellwege erforderlich, was zu langen
Positionierzeiten der und damit insgesamt zu langen Prozesszeiten
bei der optischen Abtastung mit mehreren Wellenlängen führt.
Insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie ist jedoch die simultane
oder zumindest zeitnahe Aufnahme mittels verschiedener Wellenlängen
oft erforderlich.
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Erfindungsgemäß wird
diese Aufgabe durch spektrale Korrekturmaßnahmen, ohne
die Bewegung der projizierten Struktur oder Maske gelöst.
Hierzu werden optional in den Ebenen (15) und/oder (17) und
optional auch in der Detektionseinheit (11) (siehe 6)
Korrekturelemente eingesetzt. Diese Korrekturelemente können
zum Beispiel Linsen mit bekannten Dispersionseigenschaften, diffraktive
optische Elemente oder Hologramme sein, welche die spektralen Eigenschaften
der Optik beeinflussen. Diffraktive optisches Korrekturelemente
können spezifisch für die Korrektur einer bestimmten
optischen Konfiguration gefertigt werden. Bei einem Wechsel des
Objektives der Anordnung kann ein Wechsel der Korrekturelemente
ebenfallserforderlich sein.
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Eventuell
zusätzlich vorhandene Korrekturmaßnahmen innerhalb
der Detektionseinheit (11) werden weiter unten mit Hilfe
von 10 erläutert. Es ist vorteilhaft, wenn
die Korrekturelemente (15) und (17) in einem im
Wesentlichen kollimierten Teil des Strahlengangs lokalisiert sind.
Die Korrektur der axialen chromatischen Aberration kann hierbei
auf zwei Wegen erfolgen, wobei beide Ausführungen auf die
axiale Bewegung der projizierten Struktur verzichten können.
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In
der ersten Variante, der chromatischen Teilkorrektur, wird durch
den Einsatz der Korrekturelemente sicher gestellt, dass die Ebenen (3) und (13) bei
allen verwendeten Abbildungswellenlängen zueinander konjugiert
sind.
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Durch
eine derartige Korrektur kann es, obwohl die Ebenen (3) und (13) zueinander
konjugiert bleiben, zu einer verbleibenden Wellenlängen-Abhängigkeit
der axialen Position des Projektionsortes der Beleuchtungsstruktur
auf der Probe (9) kommen. Dies kann einfach per Software
kompensiert werden, indem bei einer Abtastung einer physikalischen
axialen Position der Probe die axial leicht verschobenen Abbildungsorte
beim schichtweisen Aufbau des 3D Datensatzes der Probe berücksichtigt
und zugewiesen werden. Alternativ dazu kann die Probe selbst axial
um den Betrag des axialen Versatzes beim Wechsel der Wellenlänge
verschoben werden. Dies kann in den meisten Mikroskop-Anordnungen
Probenseitig schneller erfolgen als die axiale Bewegung der Beleuchtungsseitigen
Struktur (Maske oder DMD).
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In
der zweiten Variante wird durch vollständige axiale chromatische
Korrekt sicher gestellt, dass die Ebenen (3) der projizierten
Struktur, (9) in der Probe und (13) auf dem Detektor
konjugiert zueinander sind für alle genutzten Wellenlängen.
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7 zeigt
eine weitere erfindungsgemäße Ausführung
der Beleuchtungseinheit (1). Hier ist in Ebene (3) ein
DMD chip (digital mirror device, auch als DLP Technik von Texas
Instruments bekannt) angeordnet. Die Lichtquelle (23) beleuchtet
mittels des Strahlteilers (21) den DMD Chip. Die zu projizierende,
auf dem Chip dargestellte Beleuchtungsverteilung wird mm durch (21) hindurch
abgestrahlt. Anstelle des DMD Chips sind auch LCD-Module denkbar,
welche in Ebene (3) angebracht sind und im Durchlicht und
mittels der in 2 dargestellten Lichtquelle (19) betrieben
werden. Eine solche Anordnung hat den Vorteil, dass die zu projizierende Struktur
per Software und sehr schnell geändert werden kann. Eine
Anpassung der projizierten Struktur an eine andere Optik, wie sie
zum Beispiel bei einem Wechsel des Objektives notwendig sein kann,
ist somit einfach und schnell möglich.
-
8 zeigt
ein erfindungsgemäßes Implementierungsbeispiel
für die Detektionseinheit (11). Hier wird das
einfallende Licht mittels eines Strahlteilers (57) auf
zwei Flächendetektoren (z. B. CCD's) verteilt, welche sich
in den beiden konjugierten Ebenen (13) befinden. Der Strahlteiler (57) kann
zum Beispiel ein dichroitischer Spiegel oder ein Polarisationsstrahlteiler
sein. Somit können, je nach verwendetem Strahlteiler, zwei
Spektrale Bereiche oder zwei Polarisationszustände der
Abbildung zeitgleich und getrennt beobachtet werden.
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Wenn
die beiden projizierten Lichtverteilungen durch Polarisation entsprechend 2 kodiert
sind, kann Projektion und Aufnahme der beiden Beleuchtungsstrukturen
zeitgleich und in Echtzeit erfolgen. Dies ermöglicht die
Konstruktion von schnellen Aufbauten zur Oberflächenvermessung
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, welche prinzipbedingt
deutlich schneller als bisherige Verfahren [2–6] sind.
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9 zeigt
eine weitere Möglichkeit zur Implementierung der Detektionseinrichtung (11),
welche einen Strahlteiler (59) und einen Vollspiegel (61) verwendet.
Der Strahlteiler (59) kann ebenfalls ein dichroitischer Spiegel
oder ein Polarisationsstrahlteiler sein. Die parallele Detektion
ist ähnlich zu der in 8 dargestellten Implementierung.
Es kann jedoch parallele Beobachtung mit nur einem einzigen in der
Ebene (13) positionierten Detektor erfolgen, wodurch bei
reduzierter Auflösung Kosten gespart werden können.
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10 erläutert
erfindungsgemäße Modifikationen bestehender Optikanordnungen,
welche die zeitgleiche, Erstellung von Schnittbildern in verschiedenen
spektralen Kanälen ermöglicht, ohne die projizierte Lichtverteilung
(z. B. Maske) axial zu bewegen. Diese Maßnahme kann in
Kombination mit oder unabhängig von der anhand von 6 erläuterten
spektralen Korrekturelemente (15) und (17) erfolgen.
Entsprechend dem Stand der Technik gibt es Anordnungen, welche die
Abbildung eines Objektes in verschiedene Kanäle (z. B. spektral
oder Polarisation) zerlegen und diese Kanäle zeitgleich
nebeneinander auf einem ortsauflösenden Detektor, wie z.
B. ein CCD Chip, abbilden [10]. Bei axialer chromatischer Aberration,
kann die axiale Position des eingangsseitigen Zwischenbildes (13) von
der Wellenlänge abhängen. Die optische Einheit (63) spaltet
dabei die Abbildung anhand ihrer spektralen Charakteristik in mehrere
Kanäle, wobei hier vier dargestellt sind. Danach können
in den Einzelkanälen entsprechend dem Stand der Technik
spektrale Filter (65) in einem im Wesentlichen kollimierten
Bereich des Strahlengangs angeordnet sein. Die optische Einheit (69) fokussiert
die parallelen Kanäle derart, dass sie nebeneinander auf
einem ortsauflösenden Detektor (71) abgebildet
werden. In 10 sind 4 Kanäle linear
nebeneinander angeordnet, die Projektion in 4 verschiedene Quadranten
des Detektors ist ebenfalls üblich. Erfindungsgemäß wird
diese Anordnung durch ein oder mehrere Korrekturelemente (67) modifiziert,
welche vorzugsweise im kollimierten Teil des parallelen Strahlengangs
und vorzugsweise nach den spektralen Filtern (65) angeordnet
sind. Die Korrekturelemente (67) können jeweils
mit den Filtern (65) eine Einheit bilden. Die Korrekturelemente
sind vorzugsweise diffraktive optische Elemente. Diese Korrektur
stellt sicher, dass trotz der in Abhängigkeit von der Wellenlänge
leicht verschiedenen axialen Eingangsposition des Zwischenbildes (13),
alle spektralen Kanäle parallel und zeitgleich auf den
Detektor (71) fokussiert werden. Die diffraktiven optischen
Elemente oder Hologramme (67) können für
verschiedene Kanäle auch nebeneinander auf dem gleichen
Substrat untergebracht sein.
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Durch
die Kombination der erfindungsgemäßen zeitgleichen
Detektion verschiedener spektraler Kanäle ohne die Bewegung
mechanischer Elemente und die erfindungsgemäße
Implementierung von Verfahren und Anordnung zur Schnittbildgenerierung
aus zwei Beleuchtungsschritten ohne bewegliche mechanische Elemente
können optische Systeme mit Tiefendiskriminierung und hoher
optischer Effizienz konstruiert werden, welche deutlich schneller
und dabei trotzdem einfacher und preiswerter zu konstruieren sind
als bisher mit dem Stand der Technik möglich.
-
Teil C: Zusammenfassende Beschreibung
des Prozessablaufes
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In
einem ersten Schritt werden eine oder mehrere der später
auch zur Schnittbildgenerierung verwendeten Beleuchtungsstrukturen
auf ein bekanntes Kalibrierobjekt projiziert. Aus diesen Daten werden
die lokale Phase der projizierten Struktur und optional die lokale
Strukturperiode und/oder die Intensitätsverteilung der Projektionsschritte
für jeden Ort auf Detektor bestimmt.
-
In
einem zweiten Prozessschritt, welcher beliebig oft und für
verschiedene Wellenlängen und verschiedene axiale Positionen
der Probe wiederholt werden kann, werden zwei Projektionsstrukturen
auf die Probe projiziert und mit Hilfe der zuvor aufgenommenen Kalibrierdaten
ein optisches Schnittbild berechnet. Die Implementierungen zur strukturierten
Beleuchtung entsprechend dem Stand der Technik benötigen
mindestens drei Projektionsschritte und sind dadurch weniger effizient.
Zusätzlich wurden erfindungsgemäße Anordnungen
vorgeschlagen, welche die Projektion der beiden Beleuchtungsstrukturen
ohne bewegliche mechanische Elemente und in einer Ausführung
sogar zeitgleich ermöglichen. Die Selektion der projizierten
Lichtverteilung kann durch elektronische Steuerung von Lichtquellen
und/oder optischen Schaltern erfolgen. Weitere erfindungsgemäße
Anordnungen ermöglichen den Wechsel der Abbildungswellenlänge
ohne Bewegung von mechanischen Elementen.
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Die
Kalibrierung muss nur bei einer Änderung am optischen System,
wie zum Beispiel einem Objektivwechsel und eventuell der erstmaligen
Nutzung einer neuen Wellenlänge vorgenommen werden.
-
Literaturverweise
-
- [1] Marvin Minsky, "Microscopy Apparatus", US patent 3013467 , 1961
- [2] M. A. A. Neil, R. Juskaitis, and T. Wilson: "Method
of Obtaining Optical Sectioning by using Structured Light in a conventional
microscope", Optics Letters, Vol. 22, No. 24, p. 1905, 1997
- [3] Wilson et al., "Microscopy Imaging Apparatus and Method", US patent 6376818 , 2002
- [4] Gerstner et al., "Assembly for Increasing the Depth Discrimination
of an Optical Imaging System", US patent 681945 B2 , 2004
- [5] Gerstner et al., "Assembly for Increasing the Depth Discrimination
of an Optical Imaging System", Internationales Patent WO02/12945 , 2002
- [6] M. A. A. Neil et al., "Real Time 3D Fluorescence
Microscopy by Two-Beam Interference Illumination", Optics Communications,
153, 1998
- [7] Schaefer, "Structured illumination microscopy: artefact
analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach",
Journal of Microscopy 216(2), 165–174, 2004
- [8] Wilson et al., "Confocal Microscopy Apparatus and Method", US patent 6687052 , 2004
- [9] Ralf Wolleschensky, "Verfahren und Anordnung zur Tiefenaufgelösten
optischen Erfassung einer Probe", Europäisches Patent EP 1420281 , 2004
- [10] Mark Hopkins, "Multi-Spectral Two-Dimensional Imaging Spectrometer",
US patent US5926283
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 3013467 [0063]
- - US 6376818 [0063]
- - US 681945 B2 [0063]
- - WO 02/12945 [0063]
- - US 6687052 [0063]
- - EP 1420281 [0063]
- - US 5926283 [0063]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Wilson et
al. [0006]
- - Wilson et al., [0007]
- - Gerstner et al. [0007]
- - Neil et al. [0007]
- - M. A. A. Neil, R. Juskaitis, and T. Wilson: "Method of Obtaining
Optical Sectioning by using Structured Light in a conventional microscope",
Optics Letters, Vol. 22, No. 24, p. 1905, 1997 [0063]
- - M. A. A. Neil et al., "Real Time 3D Fluorescence Microscopy
by Two-Beam Interference Illumination", Optics Communications, 153,
1998 [0063]
- - Schaefer, "Structured illumination microscopy: artefact analysis
and reduction utilizing a parameter optimization approach", Journal
of Microscopy 216(2), 165–174, 2004 [0063]
