Diese
Erfindung betrifft ein konfokales Mikroskop für konfokale Beobachtung einer
Probe.These
The invention relates to a confocal microscope for confocal observation of a
Sample.
In
einem konfokalen Mikroskop wird Beleuchtungs-Licht in einem Punkt
einer Probe konzentriert. Die Intensität des von dem Punkt emittierten Lichts
wird mittels eines Sensors gemessen. Der gleiche Vorgang wird wiederholt,
während
der gemessene Punkt die Probe zwei-dimensional abtastet. Daher kann
eine Bild-Intensitäts-Verteilung
der Probe mit hoher Auflösung
erhalten werden, was konfokale Beobachtung ermöglicht. Um die konfokale Beobachtung
effektiv durchzuführen,
wurde beispielsweise ein Mehr-Punkt-Abtast-System unter Verwendung einer Nipkow-Scheibe
vorgeschlagen (vergleiche hierzu, z.B., die ungeprüfte Veröffentlichung
der japanischen Patentanmeldung Nr. Hei 9-325279). In diesem Fall
werden benachbarte gemessene Punkte mit einem Intervall in Übereinstimmung
mit einem Intervall von benachbarten Pinholes (Durchtrittsöffnungen)
der Nipkow-Scheibe festgelegt, wodurch verhindert wird, dass von
den gemessenen Punkten emittiertes Licht miteinander auf dem Sensor
vermischt wird (es wird nämlich
ein konfokaler Effekt aufrechterhalten).In
a confocal microscope becomes illumination light in one point
concentrated on a sample. The intensity of the light emitted by the point
is measured by a sensor. The same process is repeated,
while
the measured point scans the sample two-dimensionally. Therefore, can
an image intensity distribution
the sample with high resolution
which allows confocal observation. To the confocal observation
to carry out effectively,
For example, a multi-point scanning system using a Nipkow disk has been used
(see, for example, the unaudited publication
Japanese Patent Application No. Hei 9-325279). In this case
Adjacent measured points coincide with an interval
with an interval of adjacent pinholes (passages)
the Nipkow disk set, which prevents that from
light emitted to the measured points on the sensor
is mixed (it is namely
maintain a confocal effect).
Das
Mehr-Punkt-Abtast-System weist jedoch das Problem einer geringen
Licht-Verwendungs-Effizienz auf, da das Öffnungsverhältnis der Pinholes der Nipkow-Scheibe
klein ist, so dass von dem von einer Lichtquelle emittierten Licht
lediglich ein geringer Anteil an Licht, der durch die Pinholes hindurch
tritt, eine Probe beleuchtet.The
However, multi-point scanning system has the problem of a small one
Light usage efficiency, since the aperture ratio of the pinholes of the Nipkow disc
is small, so that of the light emitted by a light source
only a small amount of light passing through the pinholes
occurs, lit a sample.
Es
ist daher die Aufgabe dieser Erfindung, ein konfokales Mikroskop
mit verbesserter Licht-Verwendungs-Effizienz bereitzustellen.It
Therefore, the object of this invention is a confocal microscope
with improved light utilization efficiency.
Ein
konfokales Mikroskop gemäß dieser
Erfindung weist auf: einen Beleuchtungsabschnitt, der Beleuchtungs-Licht
sowohl auf einen Zielpunkt als auch auf Nicht-Zielpunkte einer Probe
zu einer gleichzeitigen Beleuchtung konzentriert, wobei die Nicht-Zielpunkte
benachbart zu dem Zielpunkt sind; einen Licht-Empfangsabschnitt,
der Licht empfängt, welches
in einen mit dem Zielpunkt konjugierten (d.h. eineindeutig zugeordneten)
Licht-Empfangs-Teilbereich eintritt, ohne von dem Zielpunkt emittiertes
Licht und von den Nicht-Zielpunkten emittiertes Licht zu unterscheiden,
wenn der Beleuchtungsabschnitt den Zielpunkt und die Nicht-Zielpunkte
beleuchtet, und der ein Licht-Empfangs-Signal in Übereinstimmung mit
einer Intensität
des empfangenen Lichts ausgibt; einen Steuerabschnitt, der den Beleuchtungsabschnitt
zum Ändern
einer Anzahl der Nicht-Zielpunkte steuert und sukzessiv Licht-Empfangs-Signale
erfasst, die von dem Licht-Empfangsabschnitt
vor und nach dem Ändern
der Anzahl der Nicht-Zielpunkte ausgegeben werden; und einen Erzeugungsabschnitt,
der ein konfokales Signal in Übereinstimmung
mit einer Intensität
des von dem Zielpunkt emittierten Lichts auf Basis einer Beziehung
zwischen den von dem Steuerabschnitt erfassten Licht-Empfangs-Signalen
und der Anzahl der Nicht-Zielpunkte erzeugt.One
Confocal microscope according to this
The invention comprises: a lighting section, the illumination light
both on a target point and on non-target points of a sample
Concentrated to a simultaneous illumination, the non-target points
are adjacent to the destination; a light receiving section,
the light receives which
into a conjugate (i.e., one-to-one) with the target point
Light receiving portion occurs without emitted from the target point
To distinguish light and light emitted from non-target points,
when the illumination section is the target point and the non-target points
illuminated, and the a light-receiving signal in accordance with
an intensity
of the received light; a control section that controls the lighting section
to change
a number of the non-target points and successively controls light-receiving signals
detected by the light receiving section
before and after the change
the number of non-destination points spent; and a generating section,
which is a confocal signal in agreement
with an intensity
of the light emitted from the target point based on a relationship
between the light receiving signals detected by the control section
and the number of non-destination points generated.
Es
ist bevorzugt, dass der Erzeugungsabschnitt das konfokale Signal
und ein nicht-konfokales Signal, das der Intensität des von
den Nicht-Zielpunkten emittierten Lichts entspricht, erzeugt und
ein Differenzsignal zwischen dem konfokalen Signal und dem nicht-konfokalen
Signal erzeugt.It
it is preferable that the generating section transmits the confocal signal
and a non-confocal signal corresponding to the intensity of
corresponds to the non-target points of emitted light, generated and
a difference signal between the confocal signal and the non-confocal
Signal generated.
Der
Gegenstand, das Prinzip und die Verwendbarkeit der Erfindung werden
aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung besser verständlich,
wenn diese im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen, in denen
gleiche Teile mit identischen Bezugszeichen versehen sind, gelesen
wird.Of the
Subject matter, the principle and the utility of the invention
better understood from the following detailed description,
if these in conjunction with the accompanying drawings in which
identical parts are provided with identical reference numerals, read
becomes.
Das
schematische Diagramm in:The
schematic diagram in:
1 stellt
eine Gesamtstruktur eines konfokalen Mikroskops 10 dar; 1 represents a complete structure of a confocal microscope 10 group;
2 stellt
die Beziehung zwischen Mikrospiegeln 4A, Licht-Empfangsabschnitten 8A und
Mikrobereichen 2A dar; 2 represents the relationship between micromirrors 4A , Light receiving sections 8A and micro-regions 2A group;
3 stellt
ein Beleuchtungsmuster dar, mit dem lediglich ein Zielpunkt 2A beleuchtet
wird; 3 represents a lighting pattern with only one target point 2A is illuminated;
4 stellt
ein Beleuchtungsmuster, mit dem ein Zielpunkt 2A und zwei
Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden (a),
und ein Beleuchtungsmuster, mit dem ein Zielpunkt 2A und
vier Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden (b),
dar; 4 represents a lighting pattern with which a destination point 2A and two non-target points 2A illuminated simultaneously (a), and a lighting pattern with which a target point 2A and four non-target points 2A illuminated simultaneously (b);
5 stellt
ein Beleuchtungsmuster dar, mit dem acht Nicht-Zielpunkte 2A beleuchtet
werden; 5 represents a lighting pattern with eight non-target points 2A be illuminated;
6 stellt
zwei-dimensionales Abtasten von Zielpunkten 2A dar; 6 provides two-dimensional scanning of target points 2A group;
7 stellt
ein anderes Beleuchtungsmuster dar, mit dem ein Zielpunkt 2A und
zwei Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden; 7 represents another illumination pattern with which a target point 2A and two non-target points 2A illuminated at the same time;
8 stellt
ein anderes Beleuchtungsmuster dar, mit dem ein Zielpunkt 2A und
vier Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden; 8th represents another illumination pattern with which a target point 2A and four non-target points 2A illuminated at the same time;
9 stellt
eine Mehrzahl von Beleuchtungsmustern dar, bei denen die Anzahl
von Nicht-Zielpunkten gleich ist (zwei) und deren jeweilige Anordnung
gemäß einem zweiten
Ausführungsbeispiel
dieser Erfindung unterschiedlich ist; 9 Fig. 12 illustrates a plurality of illumination patterns in which the number of non-target points is equal (two) and their respective arrangement is different according to a second embodiment of this invention;
10 stellt
eine Mehrzahl von Beleuchtungsmustern dar, bei denen die Anzahl
von Nicht-Zielpunkten gleich ist (vier) und deren jeweilige Anordnung
gemäß einem
zweiten Ausführungsbeispiel
dieser Erfindung unterschiedlich ist; 10 Fig. 12 illustrates a plurality of illumination patterns in which the number of non-target points is the same (four) and their respective arrangement is different according to a second embodiment of this invention;
11 stellt
ein anderes Beleuchtungsmuster dar, mit dem ein Zielpunkt 2A und
zwei Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden; 11 represents another illumination pattern with which a target point 2A and two non-target points 2A illuminated at the same time;
12 stellt
ein anderes Beleuchtungsmuster dar, mit dem ein Zielpunkt 2A und
vier Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig beleuchtet werden; 12 represents another illumination pattern with which a target point 2A and four non-target points 2A illuminated at the same time;
13 stellt
ein Beleuchtungsmuster eines Vergleichs-Beispiels dar; 13 Fig. 10 illustrates a lighting pattern of a comparative example;
14 stellt
eine Differenz-Ermittlungs-Verarbeitung gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel dieser
Erfindung dar; und 14 FIG. 16 illustrates differential determination processing according to a third embodiment of this invention; FIG. and
15 stellt
einen Effekt der Differenz-Ermittlungs-Verarbeitung dar. 15 represents an effect of differential determination processing.
Zunächst werden
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen Ausführungsbeispiele
dieser Erfindung beschrieben.First, be
with reference to the attached
Drawings Embodiments
of this invention.
Erstes AusführungsbeispielFirst embodiment
Wie
in 1 dargestellt, weist ein konfokales Mikroskop 10 gemäß dem ersten
Ausführungsbeispiel
dieser Erfindung einen Beleuchtungsabschnitt 11 bis 16,
einen Bildformungsabschnitt 13 bis 17, einen optischen
Detektor 18 und einen Steuerabschnitt 19 auf.
Der Beleuchtungsabschnitt 11 bis 16 weist eine
Lichtquelle 11, eine Kondensorlinse 12, einen
dichroischen Spiegel 13, eine Spiegelvorrichtung 14 und Linsen 15 und 16 auf.
Der Bildformungsabschnitt 13 bis 17 weist die
Linsen 15 und 16, die Spiegelvorrichtung 14,
den dichroischen Spiegel 13 und eine Linse 17 auf.As in 1 shown, has a confocal microscope 10 According to the first embodiment of this invention, a lighting section 11 to 16 an image-forming section 13 to 17 , an optical detector 18 and a control section 19 on. The lighting section 11 to 16 has a light source 11 , a condenser lens 12 , a dichroic mirror 13 , a mirror device 14 and lenses 15 and 16 on. The image forming section 13 to 17 has the lenses 15 and 16 , the mirror device 14 , the dichroic mirror 13 and a lens 17 on.
Die
Spiegelvorrichtung 14 weist mehrere Mikrospiegel 4A auf,
die zwei-dimensional angeordnet sind (in 2 ist eine
Vielzahl von Mikrospiegeln 4A dargestellt). Die Neigungswinkel
der Mikrospiegel 4A kann mit hoher Geschwindigkeit eingestellt
werden (beispielsweise ist die Spiegelvorrichtung 14 eine
digitale Mikrospiegel-Vorrichtung).
Der optische Detektor 18 ist eine Bildaufnahme-Vorrichtung, beispielsweise
ein CCD. Der optische Detektor 18 weist mehrere Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A auf,
die zweidimensional angeordnet sind (in 2 ist eine
Vielzahl von Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A dargestellt). Jeder
der Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A weist mindestens ein
Pixel der Bildaufnahme-Vorrichtung auf. Die Spiegelvorrichtung 14 und
der optische Detektor 18 sind in Ebenen angeordnet, die
miteinander konjugiert sind. Zusätzlich
ist der optische Detektor 18 in einer Ebene angeordnet,
die mit einer Proben-Ebene 20 konjugiert
ist.The mirror device 14 has several micromirrors 4A on, which are arranged two-dimensionally (in 2 is a variety of micromirrors 4A shown). The inclination angle of the micromirrors 4A can be set at high speed (for example, the mirror device 14 a digital micromirror device). The optical detector 18 is an image pickup device, such as a CCD. The optical detector 18 has several light receiving sections 8A on, which are arranged two-dimensionally (in 2 is a variety of light receiving subregions 8A shown). Each of the light receiving sections 8A has at least one pixel of the image capture device. The mirror device 14 and the optical detector 18 are arranged in planes that are conjugated with each other. In addition, the optical detector 18 arranged in a plane with a sample level 20 is conjugated.
2 zeigt
die Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A der optischen Sensors 18,
wobei die Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A den Mikrospiegeln 4A der Spiegelvorrichtung 14 entsprechen. 2 zeigt
auch die Proben-Ebene 20, die in mehrere Mikrobereiche 2A entsprechend
der zwei-dimensionalen Anordnung der Mikrospiegel 4A (der
zwei-dimensionalen Anordnung der Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A) aufgeteilt
ist. Die Mikrobereiche 2A sind jeweils mit den Mikrospiegeln 4A konjugiert.
Zusätzlich
sind die Mikrobereiche 2A jeweils mit den Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A konjugiert. 2 zeigt,
dass jeder der Mikrobereiche 2A, der Mikrospiegel 4A und
der Licht- Empfangs-Teilbereiche 8A die
gleiche Größe hat.
Jedoch muss auf Grund von, beispielsweise, der Brennweite der Linsen 15 bis 17 die
Größe eines
jeden der Mikrobereiche 2A, die Größe eines jeden der Mikrospiegel 4A und
die Größe eines
jeden der Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A nicht immer gleich sein. 2 shows the light receiving sections 8A the optical sensor 18 , wherein the light receiving subregions 8A the micromirrors 4A the mirror device 14 correspond. 2 also shows the sample level 20 that in several micro areas 2A according to the two-dimensional arrangement of the micromirrors 4A (The two-dimensional arrangement of the light receiving sections 8A ) is divided. The microspaces 2A are each with the micromirrors 4A conjugated. In addition, the micro areas 2A each with the light receiving subregions 8A conjugated. 2 shows that each of the micro areas 2A , the micromirror 4A and the light receiving sections 8A the same size. However, due to, for example, the focal length of the lenses 15 to 17 the size of each of the micro-regions 2A the size of each of the micromirrors 4A and the size of each of the light receiving sections 8A not always be the same.
Von
der Lichtquelle 11 emittiertes Licht breitet sich durch
die Kondensorlinse 12 und den dichroischen Spiegel 13 hindurch
aus und beleuchtet dann die mehreren Mikrospiegel 4A gleichmäßig. Einige Mikrospiegel 4A sind
unter einem Beleuchtungswinkel geneigt (nachfolgend werden diese
Mikrospiegel als „eingeschaltete
Mikrospiegel 4A" bezeichnet). Die
anderen Mikrospiegel 4A sind unter einem Nicht-Beleuchtungswinkel
geneigt, der zu dem Beleuchtungswinkel verschieden ist (nachfolgend
werden diese Mikrospiegel als „ausgeschaltete
Mikrospiegel 4A" bezeichnet).
Die Mikrospiegel 4A können mit
einem von dem Steuerabschnitt 19 gelieferten Steuersignal
mit hoher Geschwindigkeit ein- und ausgeschaltet werden.From the light source 11 emitted light propagates through the condenser lens 12 and the dichroic mirror 13 through and then illuminates the multiple micromirrors 4A evenly. Some micromirrors 4A are tilted at an illumination angle (hereinafter these micromirrors will be referred to as "micromirrors" 4A "called.) The other micromirrors 4A are tilted at a non-illumination angle different from the illumination angle (hereinafter, these micromirrors will be referred to as "off micromirrors 4A "referred to). The micromirrors 4A can with one of the control section 19 supplied control signal at high speed on and off.
Ein
eingeschalteter Mikrospiegel 4A der mehreren Mikrospiegel 4A reflektiert
Licht, das von dem dichroischen Spiegel 13 kommt, und richtet
es auf die Linse 15. Dieses Licht läuft durch die Linsen 15 und 16 hindurch
und erreicht die Proben-Ebene 20 als
Beleuchtungs-Licht. Die Einfalls-Position der Beleuchtungs-Lichts
auf der Proben-Ebene 20 ist ein Mikrobereich 2A,
der mit einem eingeschalteten Mikrospiegel 4A der mehreren
Mikrospiegel 4A der Spiegelvorrichtung 14 konjugiert
ist. Das Beleuchtungs-Licht, das den Mikrobereich 2A erreicht,
wird auf einen Punkt des Mikrobereichs 2A konzentriert. An
ausgeschalteten Mikrospiegeln 4A reflektiertes Licht erreicht
die Proben-Ebene 20 nicht.An on-micromirror 4A the multiple micromirror 4A reflects light from the dichroic mirror 13 comes, and directs it to the lens 15 , This light passes through the lenses 15 and 16 through and reaches the sample level 20 as a lighting light. The incidence position of the illumination light at the sample level 20 is a micro range 2A that with a micromirror turned on 4A the multiple micromirror 4A the mirror device 14 is conjugated. The lighting-light, the micro-sphere 2A reaches, gets to a point of the micro range 2A concentrated. On off micromirrors 4A reflected light reaches the sample level 20 Not.
In
den Mikrobereichen 2A in der Proben-Ebene 20,
auf die das Beleuchtungs-Licht eingefallen ist, wird von dem Beleuchtungs-Licht
eine Leuchtstoff-Substanz angeregt, was ein Emittieren von Fluoreszenzlicht
von der Leuchtstoff-Substanz verursacht.
Dieses Fluoreszenzlicht breitet sich durch die Linsen 16 und 15 hindurch
aus und erreicht einen eingeschalteten Mikrospiegel 4A der
Spiegelvorrichtung 14. Das Fluoreszenzlicht wird von dem eingeschalteten
Mikrospiegel 4A reflektiert und auf den dichroischen Spiegel 13 hin
gerichtet. Das Fluoreszenzlicht fällt durch den dichroischen
Spiegel 13 und die Linse 17 hindurch auf den optischen
Detektor 18 ein. In dem optischen Detektor 18 fällt das
Fluoreszenzlicht auf einen mit einem eingeschalteten Mikrospiegel 4A der
Spiegelvorrichtung 14 konjugierten Licht-Empfangs-Teilbereich 8A aus
den mehreren Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A ein.In the micro areas 2A in the sample level 20 on which the illumination light is incident, a phosphor substance is excited by the illumination light, causing emission of fluorescent light from the phosphor substance. This fluorescent light propagates through the lenses 16 and 15 through and reaches an on micromirror 4A the mirror device 14 , The fluorescent light is emitted by the micromirror 4A reflected and on the dichroic mirror 13 directed towards. The fluorescent light falls through the dichroic mirror 13 and the lens 17 through to the optical detector 18 one. In the optical detector 18 the fluorescent light falls on one with an on micromirror 4A the mirror device 14 conjugate light receiving portion 8A from the multiple light receiving subregions 8A one.
Somit
wird in dem konfokalen Mikroskop 10 des ersten Ausführungsbeispiels
aus den mehreren Mikrobereichen 2A in der Proben-Ebene 20 eine
mit einem eingeschalteten Mikrospiegel 4A der Spiegelvorrichtung 14 konjugierter
Mikrobereich 2A beleuchtet. Von diesem Mikrobereich 2A emittiertes
Fluoreszenzlicht wird von einem eingeschalteten Mikrospiegel 4A reflektiert
und auf den optischen Detektor 18 hin gerichtet. Das Fluoreszenzlicht
wird von einem mit dem eingeschalteten Mikrospiegel 4A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A detektiert.
Somit kann Fluoreszenzlicht in jedem beliebigen Beleuchtungsmuster
detektiert werden, indem die Ein-/Aus-Zustände der Mikrospiegel 4A geändert werden.Thus, in the confocal microscope 10 of the first embodiment of the plurality of micro-regions 2A in the sample level 20 one with a micromirror on 4A the mirror device 14 conjugated micro-region 2A illuminated. From this micro-sphere 2A emitted fluorescent light is from an on micromirror 4A reflected and onto the optical detector 18 directed towards. The fluorescent light is from one with the micromirror turned on 4A conjugate light receiving portion 8A detected. Thus, fluorescent light can be detected in any illumination pattern by the on / off states of the micromirrors 4A be changed.
Wenn
ein in 3(a) dargestelltes Beleuchtungsmuster
in der Proben-Ebene 20 gebildet wird, werden darin eine
Mehrzahl von Mikrobereichen 2A mit einem vorgegebenen Intervall
D1 zueinander beleuchtet. In 3(a) repräsentieren
weiße
Bereiche beleuchtete Mikrobereiche 2A, wohingegen schraffierte
Bereiche nicht-beleuchtete Mikrobereiche 2A repräsentieren.
Von den beleuchteten Mikrobereichen 2A (nachfolgend als „Zielpunkte 2A" bezeichnet) emittiertes
Fluoreszenzlicht wird von den jeweils mit den Zielpunkten 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A detektiert. An diesem Punkt wird
das Intervall D1 von benachbarten Mikrobereichen 2A festgelegt,
um einen konfokalen Effekt aufrecht zu erhalten. Wenn die Zielpunkte 2A in
der Proben-Ebene 20 zwei-dimensional
abgetastet werden, kann eine Bild-Intensitäts-Verteilung in der Proben-Ebene 20 mit
hoher Auflösung
erhalten werden. Daraus ergibt sich, dass konfokale Beobachtung durchgeführt werden
kann.If a in 3 (a) illustrated illumination pattern in the sample plane 20 is formed therein, a plurality of micro-areas 2A illuminated with a predetermined interval D1 to each other. In 3 (a) White areas represent illuminated micro areas 2A whereas hatched areas are non-illuminated micro areas 2A represent. From the illuminated micro-areas 2A (hereinafter referred to as "destination points 2A "labeled" fluorescent light is emitted from each of the target points 2A conjugate light receiving portions 8A detected. At this point, the interval D1 of adjacent micro-regions 2A set to maintain a confocal effect. When the destination points 2A in the sample level 20 can be sampled two-dimensionally, an image intensity distribution in the sample level 20 be obtained with high resolution. As a result, confocal observation can be performed.
In
der nachfolgenden Beschreibung wird angenommen, dass das Intervall
D1 zum Beibehalten des konfokalen Effekts beispielsweise das Zweifache eines
Intervalls D2 von benachbarten Mikrobereichen 2A ist. Jeder
der Zielpunkte 2A mit dem Intervall D1 (= D2 × 3) und
acht dazu benachbarte Mikrobereiche 2A werden im Allgemeinen
als eine Einheit 21 bezeichnet (siehe in 3(b)).
Jede dieser Einheiten 21 weist insgesamt neun Mikrobereiche 2A (in
einer 3 × 3-Matrix)
auf. Das Zentrum der neun Mikrobereiche 2A einer einzelnen
Einheit 21 ist ein Zielpunkt 2A. Zur Verdeutlichung
sind in 3(b) die neun Mikrobereiche 2A für jede Einheit 21 jeweils
mit den Ziffern „1" bis „9" gekennzeichnet.In the following description, it is assumed that the interval D1 for maintaining the confocal effect is, for example, two times an interval D2 of adjacent micro-regions 2A is. Each of the destination points 2A with the interval D1 (= D2 × 3) and eight adjacent micro ranges 2A are generally considered a unit 21 designated (see in 3 (b) ). Each of these units 21 has a total of nine microareas 2A (in a 3x3 matrix). The center of the nine micro-areas 2A a single unit 21 is a destination point 2A , For clarity, in 3 (b) the nine micro areas 2A for each unit 21 each marked with the numbers "1" to "9".
Bei
dem in 3(b) dargestellten Beleuchtungsmuster,
bei dem lediglich die mit „5" in den Einheiten 21 bezeichneten
Zielpunkte 2A beleuchtet werden, fällt das von benachbarten Zielpunkten 2A emittierte
Fluoreszenzlicht auf zueinander benachbarte und mit den jeweiligen
Zielpunkten 2A konjugierte Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A ein,
so dass das Fluoreszenzlicht benachbarter Zielpunkte 2A nicht
miteinander vermischt wird. Somit ist ein von einem einzelnen Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegebenes
Signal ein konfokales Signal, das der Intensität des von einem einzelnen Zielpunkt 2A emittierten
Fluoreszenzlichts entspricht. Vergleichbar hierzu ist ein von einem
anderen Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegebenes Signal
ein der Intensität
des von einem anderen Zielpunkt 2A emittierten Fluoreszenzlichts
entsprechendes konfokales Signal.At the in 3 (b) illustrated illumination pattern, in which only those with "5" in the units 21 designated target points 2A illuminated, that falls from neighboring target points 2A emitted fluorescent light on adjacent to each other and with the respective target points 2A conjugate light receiving sections 8A one, allowing the fluorescent light of adjacent target points 2A not mixed together. Thus, one is from a single light-receiving subarea 8A output signal is a confocal signal, that of the intensity of a single target point 2A emitted fluorescent light corresponds. Comparable to this is one from another light receiving subarea 8A output signal one of the intensity of that from another target point 2A emitted fluorescent light corresponding confocal signal.
Im
Gegensatz dazu erzeugt das in 4(a) dargestellte
Beleuchtungsmuster, bei dem nicht nur die mit „5" in den Einheiten 21 bezeichneten
Zielpunkte 2A, sondern auch mit „1" und „9" bezeichnete benachbarte Mikrobereiche 2A (nachfolgend
als „Nicht-Zielpunkte 2A" bezeichnet) gleichzeitig
beleuchtet werden, verschiedene Ergebnisse. Da das Intervall zwischen
den Zielpunkten 2A und den Nicht-Zielpunkten 2A in
einer Einheit 21 zu klein ist, um den konfokalen Effekt
aufrecht zu erhalten, fällt nicht
nur von den Zielpunkten 2A emittiertes Fluoreszenzlicht,
sondern auch ein Teil des von jedem der Nicht-Zielpunkte 2A emittierten
Fluoreszenzlichts (Lecklichts) auf mit den Zielpunkten 2A konjugierte Licht-Empfangs-Teilbereiche 8A ein.In contrast, this generates in 4 (a) illustrated illumination patterns, in which not only those with "5" in the units 21 designated target points 2A , but also adjacent microareas labeled "1" and "9" 2A (hereafter referred to as "non-target points 2A At the same time, different results are illuminated, since the interval between the target points 2A and the non-target points 2A in one unit 21 too small to sustain the confocal effect, not only falls off the target points 2A emitted fluorescent light, but also a part of each of the non-target points 2A emitted fluorescent light (leak light) on with the target points 2A conjugate light receiving sections 8A one.
Der
mit dem Zielpunkt 2A konjugierte Licht-Empfangs-Teilbereich 8A empfängt ununterscheidbar
Fluoreszenzlicht von dem Zielpunkt 2A sowie Lecklicht von
den Nicht-Zielpunkten 2A und gibt ein der Intensität des empfangenen
Lichts entsprechendes Licht-Empfangs-Signal aus. In diesem Fall ist
das Licht-Empfangs-Signal die Summe aus einem der Intensität des von
dem Zielpunkt 2A emittierten Fluoreszenzlichts entsprechenden
konfokalen Signal und einem der Intensität des von den Nicht-Zielpunkten 2A emittierten
Lecklichts entsprechenden nicht-konfokalen Signal. Somit kann mit
dem Licht-Empfangs-Signal eine Bild-Intensitäts-Verteilung in der Proben-Ebene 20 nicht
mit hoher Auflösung
erreicht werden.The one with the destination point 2A conjugate light receiving subarea 8A receives indistinguishable fluorescent light from the target point 2A as well as leakage light from the non-target points 2A and outputs a light reception signal corresponding to the intensity of the received light. In this case, the light-receiving signal is the sum of one of the intensity of the target point 2A emitted fluorescent light corresponding confocal signal and one of the intensity of the non-target points 2A emitted leakage light corresponding non-confocal signal. Thus, with the light-receiving signal, an image intensity distribution in the sample plane 20 not with high resolution be achieved.
Jedoch
wird ein für
das in 4(b) dargestellte Beleuchtungsmuster
aufgenommenes Licht-Empfangs-Signal mit einem für das in 4(a) dargestellte
Beleuchtungsmuster aufgenommenen Licht-Empfangs-Signal kombiniert,
um das nicht-konfokale
Signal von dem Licht-Empfangs-Signal mittels einer vorgegebenen
Verarbeitung zu subtrahieren und lediglich das konfokale Signal
zu extrahieren. Somit kann mittels des bei der Signal-Verarbeitung extrahierten
konfokalen Signals eine Bild-Intensitäts-Verteilung in der Proben-Ebene 20 mit
hoher Auflösung
erreicht werden.However, one for the in 4 (b) illustrated illumination pattern received light reception signal with a for the in 4 (a) illustrated light-receiving signal combined to subtract the non-confocal signal from the light-receiving signal by means of a predetermined processing and to extract only the confocal signal. Thus, by means of the confocal signal extracted in the signal processing, an image intensity distribution in the sample plane 20 be achieved with high resolution.
Für die Signal-Verarbeitung
für zusätzlich das
in dem Licht-Empfangs-Signal
enthaltene nicht-konfokale Signal wie folgt abgeschätzt. Dazu wird
für das
in 5 dargestellten Beleuchtungsmuster angenommen,
dass, wenn in einer Einheit 21 außer einem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A alle anderen
Mikrobereiche 2A (mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichnete Nicht-Zielpunkte 2A)
gleichzeitig beleuchtet werden, das Licht-Empfangs-Signal, das von
einem mit dem Zielpunkt 2A konjugierten Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegeben
wird, den Wert „b" hat. Das Licht-Empfangs-Signal
(b) ist ein nicht-konfokales Signal, das in jeder Einheit 21 der
Gesamtintensität
des von den mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichneten Nicht-Zielpunkten 2A emittierten
Lecklichts entspricht. Es wird darauf hingewiesen, dass dabei angenommen
wird, dass kein Lecklicht von außerhalb der Einheit 21 einfällt.For the signal processing, in addition, the non-confocal signal included in the light-receiving signal is estimated as follows. This will be done for the in 5 illustrated illumination pattern assumed that when in one unit 21 except for a target point labeled "5" 2A all other micro ranges 2A Non-target points ("1" to "4" and "6" to "9") 2A ) at the same time illuminate the light-receiving signal from one to the target point 2A conjugate light receiving portion 8A has the value "b." The light-receiving signal (b) is a non-confocal signal that is in each unit 21 the total intensity of the non-target points designated by "1" to "4" and "6" to "9" 2A emitted leakage light corresponds. It should be noted that it is assumed that no leakage light from outside the unit 21 incident.
Zur
Vereinfachung wird angenommen, dass die Nicht-Zielpunkte 2A gleichmäßig zu dem Licht-Empfangs-Signal
beitragen. In diesem Fall sind für
die mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichneten Nicht-Zielpunkte 2A die
nicht-konfokalen Signale zueinander gleich, nämlich (1/8)b. Wenn in dem in 3(b) dargestellten Beleuchtungsmuster
lediglich der mit „5" in Einheit 21 bezeichnete
Zielpunkt 2A beleuchtet wird, wird außerdem das Licht-Empfangs-Signal
mit einem Wert „a" angenommen. Dieses Licht-Empfangs-Signal
(a) ist gleich dem konfokalen Signal, das der Intensität des von
dem Zielpunkt 2A emittierten Fluoreszenzlichts entspricht.For simplicity, it is assumed that the non-target points 2A contribute evenly to the light-receiving signal. In this case, the non-target points denoted by "1" to "4" and "6" to "9" are 2A the non-confocal signals are equal to each other, namely (1/8) b. If in the in 3 (b) illustrated illumination pattern only with "5" in unit 21 designated destination point 2A In addition, the light-receiving signal is assumed to have a value "a." This light-receiving signal (a) is equal to the confocal signal, that of the intensity of the target point 2A emitted fluorescent light corresponds.
Unter
Verwendung des konfokalen Signals (a) für einen Zielpunkt 2A in
der Einheit 21 und des nicht-konfokalen Signals (1/8)b
für jeden
der Nicht-Zielpunkte 2A in der Einheit 21 kann
ein Licht-Empfangs-Signal S1 mittels der nachfolgenden Gleichung
(1) ausgedrückt
werden, in der ein mit „5" bezeichneter Zielpunkt 2A und
zwei mit „1" und „9" bezeichnete Nicht-Zielpunkte 2A in
dem in 4(a) dargestellten Beleuchtungsmuster
gleichzeitig beleuchtet werden. S1 = a + (1/8)b × 2 (1) Using the confocal signal (a) for a target point 2A in the unit 21 and the non-confocal signal (1/8) b for each of the non-target points 2A in the unit 21 For example, a light-receiving signal S1 can be expressed by the following equation (1), in which a target point designated by "5" 2A and two non-target points labeled "1" and "9" 2A in the 4 (a) illuminated illumination patterns are illuminated simultaneously. S1 = a + (1/8) b × 2 (1)
Als
nächstes
wird das in 4(b) dargestellte Beleuchtungsmuster
beschrieben. Bei dem in 4(b) dargestellten
Beleuchtungsmuster werden in einer Einheit 21 ein mit „5" bezeichneter Zielpunkt 2A und
hierzu benachbart vier mit „2", „4", „6" und „8" bezeichnete Nicht-Zielpunkte 2A gleichzeitig
beleuchtet. In diesem Fall kann ein Licht-Empfangs-Signal S2, das von einem mit
dem Zielpunkt 2A konjugierten Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegeben wird,
mittels der nachfolgenden Gleichung (2) ausgedrückt werden. S2 = a + (1/8)b × 4 (2) Next is the in 4 (b) illustrated illumination pattern described. At the in 4 (b) illustrated illumination patterns are in one unit 21 a target point labeled "5" 2A and adjacent thereto four non-target points labeled "2", "4", "6" and "8" 2A illuminated at the same time. In this case, a light-receiving signal S2, that of one with the destination point 2A conjugate light receiving portion 8A is expressed by the following equation (2). S2 = a + (1/8) b × 4 (2)
Gemäß dem konfokalen
Mikroskop 10 dieses Ausführungsbeispiels erfasst beispielsweise
der Steuerabschnitt 19 ein Licht-Empfangs-Signal (S1), das von einem
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A,
der mit dem mit „5" in der Einheit 21 bezeichneten
Zielpunkt 2A konjugiert ist, ausgegeben wird, wenn die Spiegelvorrichtung 14 derart
gesteuert wird, dass das in 4(a) dargestellte
Beleuchtungsmuster in der Proben-Ebene 20 gebildet wird.
Danach ändert
er die Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A (von zwei auf vier).
Wenn das in 4(b) dargestellte Beleuchtungsmuster
in der Proben-Ebene 20 gebildet wird, erfasst er ein Licht-Empfangs-Signal
(S2), das von einem Licht-Empfangs-Teilbereich 8A, der
mit dem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A in
der Einheit 21 konjugiert ist, ausgegeben wird.According to the confocal microscope 10 This embodiment detects, for example, the control section 19 a light-receiving signal (S1) received from a light-receiving section 8A that with the "5" in the unit 21 designated destination point 2A is conjugated, is output when the mirror device 14 is controlled so that the in 4 (a) illustrated illumination pattern in the sample plane 20 is formed. After that he changes the number of non-target points 2A (from two to four). If that is in 4 (b) illustrated illumination pattern in the sample plane 20 is formed, it detects a light reception signal (S2) received from a light receiving section 8A , the one with the target point labeled "5" 2A in the unit 21 is conjugated.
Auf
diese Weise wendet der Steuerabschnitt 19 nach dem aufeinander
folgenden Erfassen der Licht-Empfangs-Signale (S1 und S2) in verschiedenen
Beleuchtungs-Zuständen,
bei denen die Bereiche, die nicht der Zielpunkt 2A in der
Einheit 21 sind, auf verschieden Arten beleuchtet werden
(die Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A wird verändert),
gleichzeitig die vorangegangene Gleichung (1) mit Bezug auf die Beziehung
zwischen dem einen Licht-Empfangs-Signal (S1) und der Anzahl an
Nicht-Zielpunkten 2A (zwei) sowie die vorangegangene Gleichung
(2) mit Bezug auf die Beziehung zwischen dem anderen Licht-Empfangs-Signal
(S2) und der Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A (vier)
an und erzeugt ein konfokales Signal (a) entsprechend der Intensität des von dem
Zielpunkt 2A emittierten Fluoreszenzlichts.In this way, the control section applies 19 after the successive detection of the light-receiving signals (S1 and S2) in different illumination states, in which the areas that are not the target point 2A in the unit 21 are illuminated in different ways (the number of non-target points 2A is changed) simultaneously with the foregoing equation (1) with respect to the relationship between the one light-receiving signal (S1) and the number of non-target points 2A (two) and the foregoing equation (2) with respect to the relationship between the other light-receiving signal (S2) and the number of non-target points 2A (four) and generates a confocal signal (a) corresponding to the intensity of the target point 2A emitted fluorescent light.
Das
mit den zwei in 4(a) und 4(b) dargestellten Typen an Beleuchtungsmustern
erzeugte konfokale Signal (a) ist ein Signal, das dem mit „5" in der Einheit 21 bezeichneten
Zielpunkt 2A zugeordnet ist. Das konfokale Signal entspricht
dem Licht-Empfangs-Signal des in 3(b) dargestellten Beleuchtungsmusters.That with the two in 4 (a) and 4 (b) Confocal signal (a) is a signal similar to that shown with "5" in the unit 21 designated destination point 2A assigned. The confocal signal corresponds to the light-receiving signal of in 3 (b) illustrated illumination pattern.
In
gleicher Weise kann unter der Annahme, dass ein mit „9" bezeichneter Mikrobereich 2A ein Zielpunkt 2A ist
und dass dieser das Zentrum einer Einheit 22 ist, mittels
zweier in 6(a) und 6(b) dargestellter
Typen von Beleuchtungsmustern ein konfokales Signal (a), das dem
mit „9" bezeichneten Zielpunkt 2A zugeordnet
ist, erzeugt werden.Likewise, assuming that a micro-region designated by "9" 2A a destination point 2A and that this is the center of a unit 22 is, by means of two in 6 (a) and 6 (b) illustrated types of illumination patterns a confocal signal (a), the target point designated by "9" 2A is assigned to be generated.
Auf
gleiche Weise wird jeder der mit „1" bis „4" und „6" bis „8" bezeichneten Mikrobereiche 2A als ein
Zielpunkt 2A bezeichnet. Mit zwei Typen von Beleuchtungsmustern,
die in der Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A verschieden sind,
wird ein konfokales Signal (a), das jedem der Zielpunkte 2A zugeordnet
ist, erzeugt. Wenn Zielpunkte 2A in der Proben-Ebene 20 zweidimensional
abgetastet werden, kann eine Bild-Intensitäts-Verteilung in der Proben-Ebene 20 mit
hoher Auflösung
erreicht werden. Im Ergebnis kann eine konfokale Beobachtung durchgeführt werden.In the same way, each of the microareas denoted by "1" to "4" and "6" to "8" becomes 2A as a destination point 2A designated. With two types of lighting patterns, the number of non-target points 2A are different, a confocal signal (a), which is each of the target points 2A is assigned, generated. If target points 2A in the sample level 20 can be sampled two-dimensionally, an image intensity distribution in the sample level 20 be achieved with high resolution. As a result, a confocal observation can be performed.
Bei
dem konfokalen Mikroskop 10 dieses Ausführungsbeispiels werden eine
Mehrzahl von mit dem Intervall D1 (= D2 × 3) angeordneten Zielpunkten 2A in
der Proben-Ebene 20 zum Beibehalten des konfokalen Effekts
beleuchtet. Da Nicht-Zielpunkte 2A,
die mit einem Intervall, das zu klein zum Beibehalten des konfokalen
Effekts bei den Zielpunkten 2A ist, angeordnet sind, gleichzeitig
beleuchtet werden, wird zusätzlich
die Licht-Verwendungs-Effizienz der Lichtquelle 11 im Vergleich
mit der eines konfokalen Mikroskops, das eine konventionelle Nipkow-Scheibe
verwendet, verbessert. Im Ergebnis wird bei diesem Ausführungsbeispiel
das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.At the confocal microscope 10 In this embodiment, a plurality of target points arranged with the interval D1 (= D2 × 3) become 2A in the sample level 20 illuminated to maintain the confocal effect. Because non-target points 2A with an interval that is too small to maintain the confocal effect at the target points 2A in addition, the light utilization efficiency of the light source becomes 11 improved compared to that of a confocal microscope using a conventional Nipkow disc. As a result, in this embodiment, the signal-to-noise ratio is improved.
Bei
dem konfokalen Mikroskop 10 dieses Ausführungsbeispiels wird zusätzlich die
Spiegelvorrichtung 14 (siehe in 2), die
eine Mehrzahl an Mikrospiegeln 4A aufweist, auf einem gemeinsamen optischen
Pfad, entlang dem Beleuchtungs-Licht von der Lichtquelle 11 auf
die Proben-Ebene 20 hin gerichtet wird, und einem gemeinsamen
optischen Pfad, entlang dem in der Proben-Ebene 20 emittiertes
Fluoreszenzlicht auf den optischen Detektor hin gerichtet wird,
verwendet. Im Ergebnis kann die gesamte Vorrichtung gegenüber dem
Stand der Technik vereinfacht werden.At the confocal microscope 10 This embodiment additionally becomes the mirror device 14 (see in 2 ), which have a plurality of micromirrors 4A has, on a common optical path, along the illumination light from the light source 11 to the sample level 20 directed, and a common optical path, along the in the sample plane 20 emitted fluorescent light is directed to the optical detector, used. As a result, the entire apparatus can be simplified over the prior art.
Die
Verarbeitung zum Ändern
der Ein-/Aus-Zustände
der Mikrospiegel 4A der Spiegelvorrichtung 14 und
zum zweidimensionalen Abtasten der Zielpunkte 2A in der
Proben-Ebene 20 kann wie folgt vereinfacht werden. Wenn
eine in 6(a) dargestellte Einheit 22,
in welcher in einer Proben-Ebene 20 ein mit „9" bezeichneter Mikrobereich 2A ein Zielpunkt
ist und mit „5" und „1" bezeichnete Mikrobereiche 2A Nicht-Zielpunkte sind,
eine Einheit 21, deren Zentrum ein mit „5" bezeichneter Mikrobereich 2A ist,
ersetzt, wird ein in 6(c) dargestelltes
Beleuchtungsmuster erzielt. Somit ist klar, dass das Beleuchtungsmuster
der Einheit 22 das gleiche ist wie das in 4(a) gezeigte
der Einheit 21.The processing for changing the on / off states of the micromirrors 4A the mirror device 14 and for two-dimensional scanning of the target points 2A in the sample level 20 can be simplified as follows. If an in 6 (a) represented unit 22 in which in a sample level 20 a micro-area labeled "9" 2A a target point is and micro areas labeled "5" and "1" 2A Non-aiming points are one unit 21 whose center is a micro-area denoted by "5" 2A is, replaced, becomes an in 6 (c) achieved lighting pattern achieved. Thus, it is clear that the lighting pattern of the unit 22 the same is like that in 4 (a) shown the unit 21 ,
Wenn
folglich das in 4(a) dargestellte Beleuchtungsmuster
der Einheit 21 in der Proben-Ebene 20 gebildet
wird, kann auf das in 6(a) dargestellte
Beleuchtungsmuster der Einheit 22 verzichtet werden, falls
in der Einheit 21 von mit Mikrobereichen, die mit „5" und „9" bezeichnet sind,
konjugierten Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A Licht-Empfangs-Signale (S1) erfasst
werden. Wenn das in 4(a) dargestellte
Beleuchtungsmuster gebildet wird, ist es zusätzlich bevorzugt, dass ein
Licht-Empfangs-Signal (S1) von einem Licht-Empfangs-Teilbereich 8A,
der in Einheit 21 mit einem mit „1" bezeichneten Mikrobereich konjugiert
ist, erfasst wird.If therefore the in 4 (a) illustrated illumination pattern of the unit 21 in the sample level 20 can be formed on the in 6 (a) illustrated illumination pattern of the unit 22 be waived if in the unit 21 of micro areas labeled "5" and "9", conjugate light receiving sections 8A Light reception signals (S1) are detected. If that is in 4 (a) In addition, when the illumination pattern is formed, it is additionally preferable that a light-receiving signal (S1) from a light-receiving section 8A who is in unity 21 is conjugated with a micro-area designated as "1".
Wenn
das in 4(a) dargestellte Beleuchtungsmuster
gebildet wird und Licht-Empfangs-Signale (S1) von Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A,
die mit den in der Einheit 21 mit „1", „5" und „9" bezeichneten beleuchteten
Mikrobereichen 2A konjugiert sind, erfasst werden, werden
konfokale Signale (a) mit Bezug auf diese Mikrobereiche 2A als
Zielpunkte 2A unter Verwendung der Licht-Empfangs-Signale (S1)
erzeugt. Beispielsweise wird ein Licht-Empfangs-Signal (S1) von
einem mit einem mit „1" bezeichneten Mikrobereich 2A konjugierter
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A verwendet, um ein konfokales Signal
(a) mit Bezug auf den mit „1" bezeichneten Mikrobereich 2A als
einen Zielpunkt 2A zu erzeugen.If that is in 4 (a) illustrated illumination pattern is formed and light receiving signals (S1) of light receiving portions 8A that with the in the unit 21 with "1", "5" and "9" designated illuminated micro-regions 2A are confocal signals (a) with respect to these micro-regions 2A as target points 2A generated using the light-receiving signals (S1). For example, a light-receiving signal (S1) becomes a micro-area designated by "1" 2A conjugated light-receiving section 8A used to obtain a confocal signal (a) with respect to the micro-region designated "1" 2A as a destination point 2A to create.
In
gleicher Weise werden für
in der Einheit 21 mit „2", „6" und „8" bezeichnete beleuchtete
Mikrobereiche 2A in einem in 7(a) dargestellten
Beleuchtungsmuster von mit diesen Mikrobereichen 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereichen 8A Licht-Empfangs-Signale
(S1) erfasst, um konfokale Signale (a) mit Bezug auf die Mikrobereiche 2A als Zielpunkte 2A unter
Verwendung der Licht-Empfangs-Signale (S1) zu erzeugen. Bei einem
in 7(b) dargestellten Beleuchtungsmuster
werden konfokale Signale (a) mit Bezug auf mit „3", „4" und „8" bezeichnete Mikrobereiche 2A unter
Verwendung der Licht-Empfangs-Signale
(S1) erzeugt.In the same way for in the unit 21 with "2", "6" and "8" designated illuminated micro-areas 2A in an in 7 (a) illustrated illumination pattern of these micro-areas 2A conjugate light receiving portions 8A Light reception signals (S1) detected to confocal signals (a) with respect to the micro-areas 2A as target points 2A using the light receive signals (S1). At an in 7 (b) The illumination patterns shown are confocal signals (a) with respect to microareas designated "3", "4" and "8" 2A generated using the light-receiving signals (S1).
Wenn
zwei Mikrobereiche 2A an einer oberen linken Position und
eine unteren rechten Position eines Zielpunkts 2A als Nicht-Zielpunkte
bezeichnet werden, wird es nur durch aufeinander folgendes Bilden
von drei Beleuchtungsmustern in der Proben-Ebene 20, wie
sie in 4(a), 7(a) und 7(b) dargestellt sind, möglich gemacht,
effektiv Licht-Empfangs-Signale
(S1), die in der Einheit 21 mit „1" bis „9" bezeichneten Mikrobereichen 2A zugeordnet
sind, zu ermitteln.If two micro-areas 2A at an upper left position and a lower right position of a target point 2A are referred to as non-target points, it is only by successively forming three illumination patterns in the sample plane 20 as they are in 4 (a) . 7 (a) and 7 (b) are shown, made possible, effective light-receiving signals (S1) in the unit 21 with "1" to "9" designated micro areas 2A are assigned to determine.
Jedoch
ist ein in 6(b) dargestelltes Beleuchtungsmuster
derart beschaffen, dass in der Einheit 22 der mit „9" bezeichnete Mikrobereich 2A in
der dargestellten Proben-Ebene 20 als ein Zielpunkt 2A festgelegt
wird und die mit „3", „6", „7" und „8" bezeichneten Mikrobereiche 2A als
Nicht-Zielpunkte 2A festgelegt
werden. Wenn die Einheit 22 die Einheit 21, deren
Zentrum der mit „5" bezeichnete Mikrobereich 2A ist,
ersetzt, wird sich das Beleuchtungsmuster in ein in 6(d) dargestelltes
Beleuchtungsmuster ändern,
welches zu dem in 4(b) dargestellten Beleuchtungsmuster
der Einheit 21 verschieden ist. Um vier Mikrobereiche 2A an
oberen, unteren, linken und rechten Positionen des Zielpunkts 2A als Nicht-Zielpunkte 2A zu
bezeichnen, ist es folglich notwendig, aufeinander folgend neun
in 4(b), 6(b) und 8 dargestellte
Beleuchtungsmuster in der Proben-Ebene 20 zu bilden.However, one is in 6 (b) illustrated illumination pattern such that in the unit 22 the micro-area labeled "9" 2A in the sample level shown 20 as a destination point 2A and the microareas labeled "3", "6", "7" and "8" 2A as non-target points 2A be determined. If the unit 22 the unit 21 whose center is the micro-area denoted by "5" 2A is replaced, the lighting pattern will turn into a 6 (d) changed illumination pattern, which corresponds to the in 4 (b) illustrated illumination pattern of the unit 21 is different. At four micro ranges 2A at upper, lower, left and right positions of the target point 2A as non-target points 2A It is therefore necessary to successively designate nine in 4 (b) . 6 (b) and 8th illustrated illumination pattern in the sample plane 20 to build.
Das
erste Ausführungsbeispiel
beschrieb den Fall, in welchem acht Nicht-Zielpunkte benachbart
zu einem Zielpunkt 2A gleichmäßig zu einem Licht-Empfangs-Signal
beitragen (die nicht-konfokalen Signale sind nämlich zueinander gleich). Diese Erfindung
ist jedoch nicht auf solch einen Fall beschränkt. Diese Erfindung ist auch
auf den Fall anwendbar, bei dem nicht-konfokale Signale in Abhängigkeit
von dem Positions-Verhältnis
zwischen einem Zielpunkt 2A und Nicht-Zielpunkten 2A gewichtet werden,
so dass die nicht-konfokalen Signale zueinander verschieden sind.The first embodiment described the case in which eight non-target points adjacent to a target point 2A contribute uniformly to a light-receiving signal (namely, the non-confocal signals are equal to each other). However, this invention is not limited to such a case. This invention is also applicable to the case where non-confocal signals are dependent on the positional relationship between a target point 2A and non-destination points 2A be weighted so that the non-confocal signals are different from each other.
Beispielsweise
hat unter der Annahme, dass ein mit „5" bezeichneter Mikrobereich 2A ein
Zielpunkt 2A ist und mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichnete Mikrobereiche 2A Nicht-Zielpunkte 2A sind,
das nicht-konfokale Signale eines mit „N" bezeichneten Nicht-Zielpunkts 2A den
Wert „KN × b" und die Summe der
(Gewichtungs-)Koeffizienten KN (= ΣKN) soll den Wert „1" haben.For example, suppose that a micro-region designated by "5" 2A a destination point 2A is and with "1" to "4" and "6" to "9" designated micro areas 2A Non-target points 2A are the non-confocal signals of a non-target point labeled "N" 2A the value "K N × b" and the sum of the (weighting) coefficients K N (= ΣK N ) should have the value "1".
Zweites AusführungsbeispielSecond embodiment
Zunächst wird
eine Mehrzahl an Beleuchtungsmustern mit der gleichen Anzahl an
Nicht-Zielpunkten 2A und verschiedenen Anordnungen beschrieben
(9 und 10).First, a plurality of illumination patterns with the same number of non-target points 2A and various arrangements ( 9 and 10 ).
In
den in 9 dargestellten vier Beleuchtungsmustern ist ein
in einer Einheit 21 mit „5" bezeichneter Mikrobereich 2A ein
Zielpunkt 2A und zwei dazu benachbarte Mikrobereiche 2A sind Nicht-Zielpunkte 2A,
wobei die Nicht-Zielpunkte 2A bezüglich des Zielpunktes 2A gegenüberliegend
angeordnet sind. Obwohl die Positionen der Nicht-Zielpunkte 2A in
Abhängigkeit
vom jeweiligen Beleuchtungsmuster verschieden sind, ist es möglich, acht
zu dem Zielpunkt 2A benachbarte und mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichnete Mikrobereiche 2A nacheinander
jeweils einzeln zu beleuchten, indem diese vier Beleuchtungsmuster
aufeinander folgend in der Proben-Ebene 20 gebildet werden.In the in 9 The four lighting patterns shown are one in one unit 21 Micro range denoted by "5" 2A a destination point 2A and two adjacent microareas 2A are non-target points 2A , where the non-target points 2A with respect to the destination point 2A are arranged opposite one another. Although the positions of non-target points 2A are different depending on the respective illumination pattern, it is possible to have eight to the target point 2A adjacent microareas designated "1" to "4" and "6" to "9" 2A one at a time, one at a time, illuminating each of these four illumination patterns consecutively in the sample plane 20 be formed.
In
diesem Fall werden für
die in 9 dargestellten Beleuchtungsmuster aufeinander
folgend vier Licht-Empfangs- Signale
(S1 (1) bis S1(4)), die von einem mit einem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegeben
werden, erfasst. Die Summe S3 dieser erfassten Licht-Empfangs-Signale
(S1(1) bis S1(4)) wird als ein endgültiges Licht-Empfangs-Signal
ermittelt und mittels der nachfolgenden Gleichung (3) ausgedrückt. S3 = S1(1) + S1(2) + S1(3)
+ S1(4)
= a × 4
+ (1/8)b × 8
= 4a + b (3) In this case, for the in 9 shown illumination pattern consecutively four light-receiving signals (S1 (1) to S1 (4)), that of a with a designated "5" target point 2A conjugate light receiving portion 8A be issued, recorded. The sum S3 of these detected light receiving signals (S1 (1) to S1 (4)) is detected as a final light receiving signal and expressed by the following equation (3). S3 = S1 (1) + S1 (2) + S1 (3) + S1 (4) = a × 4 + (1/8) b × 8 = 4a + b (3)
Auf
der anderen Seite wird bei den in 10 dargestellten
sechs Beleuchtungsmustern ein in einer Einheit 21 mit „5" bezeichneter Mirkobereich 2A als
ein Zielpunkt 2A bezeichnet und vier dazu benachbarte Mikrobereiche 2A werden
als Nicht-Zielpunkte 2A bezeichnet.
Obwohl die Positionen der Nicht-Zielpunkte
in Abhängigkeit
vom jeweiligen Beleuchtungsmuster verschieden sind, ist es möglich, acht
zu dem Zielpunkt 2A benachbarte und mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichnete Mikrobereiche 2A nacheinander
jeweils dreimal zu beleuchten, indem diese sechs Beleuchtungsmuster
aufeinander folgend in der Proben-Ebene 20 gebildet werden.On the other hand, at the in 10 illustrated six lighting patterns in one unit 21 with "5" designated Mirko range 2A as a destination point 2A and four adjacent micro areas 2A are considered non-target points 2A designated. Although the positions of the non-target points are different depending on the respective illumination pattern, it is possible to have eight to the target point 2A adjacent microareas designated "1" to "4" and "6" to "9" 2A one after the other three times in succession by illuminating these six illumination patterns consecutively in the sample plane 20 be formed.
In
diesem Fall werden für
die in 10 dargestellten Beleuchtungsmuster
aufeinander folgend sechs Licht-Empfangs-Signale (S1(1) bis S1(6)), die von einem
mit einem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A ausgegeben
werden, erfasst. Die Summe S4 dieser erfassten Licht-Empfangs-Signale
(S1(1) bis S1(6)) wird als ein endgültiges Licht-Empfangs-Signal
ermittelt und mittels der nachfolgenden Gleichung (4) ausgedrückt. S4 = S1(1) + S1(2) + S1(3)
+ S1(4) + S1(5) + S1(6)
= a × 6 + (1/8)b × 24 = 6a
+ 3b (4) In this case, for the in 10 6 are consecutively displayed six light receiving signals (S1 (1) to S1 (6)) from a target point designated by "5" 2A conjugate light receiving portion 8A be issued, recorded. The sum S4 of these detected light-receiving signals (S1 (1) to S1 (6)) is detected as a final light-receiving signal and expressed by the following equation (4). S4 = S1 (1) + S1 (2) + S1 (3) + S1 (4) + S1 (5) + S1 (6) = a × 6 + (1/8) b × 24 = 6a + 3b (4 )
Gemäß dem zweiten
Ausführungsbeispiel werden
die Licht-Empfangs-Signale
(S3 und S4) aufeinander folgend in verschiedenen Beleuchtungszuständen erhalten,
wobei all diese Teilbereiche außer dem
Zielpunkt 2A in der Einheit 21 auf verschieden Weisen
beleuchtet werden (die Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A ist in jedem
Beleuchtungsmuster verschieden), um ein konfokales Signal (a) entsprechend
der Intensität
des von dem Zielpunkt 2A emittierten Fluoreszenzlichts
zu erzeugen, indem gleichzeitig die vorangegangene Gleichung (3)
für die
Beziehung zwischen dem einen Licht-Empfangs-Signal (S3) und der
Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A (zwei) und die vorangegangene
Gleichung (4) für
die Beziehung zwischen dem anderen Licht-Empfangs-Signal (S4) und
der Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A (vier) angewendet
werden.According to the second embodiment, the light-receiving signals (S3 and S4) are sequentially obtained in different illumination states, all of these sub-areas except the target point 2A in the unit 21 illuminated in different ways (the number of non-target points 2A is different in each illumination pattern) to produce a confocal signal (a) corresponding to the intensity of the target point 2A At the same time, the previous equation (3) for the relationship between the one light-receiving signal (S3) and the number of non-target points is generated 2A (two) and the foregoing equation (4) for the relationship between the other light-receiving signal (S4) and the number of non-target points 2A (four) are applied.
Wie
aus den vorangegangenen Gleichungen (3) und (4) klar ist, ist der
Term mit Bezug auf die nicht-konfokalen Signale ein ganzzahliges
Vielfaches eine nicht-konfokalen Signals (b) entsprechend der Gesamtintensität an Lecklicht
von allen Mikrobereichen 2A (die in 5 dargestellten
sowie mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichneten Nicht-Zielpunkte 2A), die
kein mit „5" bezeichneter Zielpunkt 2A sind.
Auch wenn sich die Menge des Beitrags zu den Licht-Empfangs-Signalen
in Abhängigkeit
von der Positions-Beziehung zwischen dem Zielpunkt 2A und
den Nicht-Zielpunkten 2A ändert, kann somit das konfokale
Signal (a) mit Bezug auf den Zielpunkt 2A mit hoher Reproduzierbarkeit
ohne Beeinflussung durch die Änderung
erzeugt werden.As is clear from the foregoing equations (3) and (4), the term with respect to the non-confocal signals is an integer multiple a non-confocal signal (b) corresponding to the total intensity of leakage light from all micro-regions 2A (in the 5 non-target points represented as "1" to "4" and "6" to "9" 2A ), which is not a target point labeled "5" 2A are. Even if the amount of contribution to the light-receiving signals depends on the positional relationship between the target point 2A and the non-target points 2A Thus, the confocal signal (a) may change with respect to the target point 2A be produced with high reproducibility without being influenced by the change.
Die
in den zehn Typen von in 9 und 10 dargestellten
Beleuchtungsmustern erzeugten konfokalen Signale (a) sind Signale,
die in der Einheit 21 dem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A zugeordnet
sind. Die restlichen mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichneten Mikrobereiche 2A werden
aufeinander folgend als ein Zielpunkt 2A bezeichnet, wodurch konfokale
Signale (a) erzeugt werden, die diesen Zielpunkten 2A in
den zehn Typen an Beleuchtungsmustern (bei denen die Anzahl an Zielpunkten 2A unterschiedlich
ist) zugeordnet sind.The in the ten types of in 9 and 10 illustrated illumination patterns generated confocal signals (a) are signals that are in the unit 21 the target point labeled "5" 2A assigned. The remaining microareas denoted by "1" to "4" and "6" to "9" 2A become consecutive as a destination point 2A denoting that confocal signals (a) are generated which correspond to these target points 2A in the ten types of lighting patterns (where the number of target points 2A is different) are assigned.
Jedoch
gibt es auch in diesem Fall Beleuchtungsmuster, die gemeinsam verwendet
werden können,
wie es in dem Beispiel beschrieben wurde, wo die Beleuchtungsmuster
von 4(a) und 5(a) verglichen
wurden. Es werden somit 13 Typen an in 12 und 13 dargestellten
Beleuchtungsmustern zusätzlich
zu den zehn Typen an in 9 und 10 dargestellten
Beleuchtungsmustern gebildet, die alle notwendigen Beleuchtungsmuster
abdecken.However, even in this case, there are lighting patterns that can be shared, as described in the example where the lighting patterns of 4 (a) and 5 (a) were compared. There are thus 13 types in 12 and 13 illustrated illumination patterns in addition to the ten types of in 9 and 10 formed lighting patterns that cover all necessary lighting patterns.
Die
den mit „1" bis „9" in einer Einheit 21 bezeichneten
Mikrobereichen 2A zugeordneten Licht-Empfangs-Signale (S3)
können
in den zwölf
Typen an in 9 und 11 dargestellten
Beleuchtungsmustern effektiv erhalten werden. Die den mit „1" bis „9" bezeichneten Mikrobereichen 2A zugeordneten
Licht-Empfangs-Signale (S4) können
in den elf Typen an in 10 und 12 dargestellten
Beleuchtungsmustern effektiv erhalten werden.The one with "1" to "9" in one unit 21 designated micro-areas 2A associated light receive signals (S3) can be in the twelve types in 9 and 11 shown illumination patterns can be effectively obtained. The micro-regions labeled "1" to "9" 2A assigned light-receiving signals (S4) can be in the eleven types in 10 and 12 shown illumination patterns can be effectively obtained.
Da
die Zielpunkte 2A in der Proben-Ebene 20 mit einer
Mehrzahl von Beleuchtungsmustern (9, 10 und
so weiter) mit der gleichen Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A und
verschiedenen Anordnungen zwei-dimensional abgetastet werden, kann
somit gemäß dem zweiten
Ausführungsbeispiel eine
Bild-Intensitäts-Verteilung
in der Proben-Ebene 20 mit hoher Auflösung und hoher Reproduzierbarkeit
erhalten werden.Because the destination points 2A in the sample level 20 with a plurality of illumination patterns ( 9 . 10 and so on) with the same number of non-target points 2A Thus, according to the second embodiment, an image intensity distribution in the sample plane can be sampled two-dimensionally and in different arrangements 20 obtained with high resolution and high reproducibility.
Zusätzlich macht
gemäß dem zweiten
Ausführungsbeispiel
das gleichzeitige Beleuchten einer Mehrzahl von Zielpunkten 2A,
die mit dem Intervall D1 (= D2 × 3)
zum Beibehalten des konfokalen Effekts in der Proben-Ebene 20 angeordnet
sind, und von Nicht-Zielpunkten 2A, die mit einem Intervall,
das zu klein zum Beibehalten des konfokalen Effekts bei jedem Zielpunkt 2A ist,
angeordnet sind, es möglich, die
Licht-Verwendungs-Effizienz
der Lichtquelle 11 zu verbessern.In addition, according to the second embodiment, the simultaneous illumination of a plurality of target points makes 2A with the interval D1 (= D2 × 3) to maintain the confocal effect in the sample plane 20 are arranged and non-target points 2A with an interval that is too small to maintain the confocal effect at each target point 2A is, it is possible, the light-use efficiency of the light source 11 to improve.
In
diesem Fall wird der Durchschnittswert E der Licht-Verwendungs-Effizienz
durch die nachfolgende Gleichung (5) ausgedrückt, wobei die zum aufeinander
folgenden Bilden aller Beleuchtungsmuster (23 Typen) notwendige
Zeit berücksichtigt
wurde. E = {(12/23)·[3/9]
+ (1/23)·[4/9]
+
+ (10/23)·[5/9]}·[10/23]
= 0.189 (5)wobei:
- • die
Dividenden (3, 4 und 5) in den inneren []-Brüchen jeweils die Anzahl an
beleuchteten Mikrobereichen 2A repräsentieren;
- • die
Dividenden (12, 1 und 10) in den ()-Brüchen jeweils die Anzahl an
Beleuchtungsmustern je beleuchtetem Mikrobereich 2A repräsentieren;
und
- • der
Dividend (10) in dem äußeren []-Bruch
die Anzahl an Beleuchtungsmustern, die zum Erzeugen eines konfokalen
Signals berechnet wurden, repräsentiert.
In this case, the average value E of the light use efficiency is expressed by the following equation (5) taking the time necessary for successively forming all the illumination patterns (23 types) into consideration. E = {(12/23) · [3/9] + (1/23) · [4/9] + + (10/23) · [5/9]} · [10/23] = 0.189 (5 ) in which: - • the dividends (3, 4, and 5) in the inner [] fractions, respectively, the number of illuminated micro-regions 2A represent;
- • the dividends (12, 1 and 10) in the () fractions, respectively, the number of illumination patterns per illuminated micro-area 2A represent; and
- • the dividend (10) in the outer [] break represents the number of illumination patterns calculated to generate a confocal signal.
Um
die in Gleichung (5) ausgedrückte Licht-Verwendungs-Effizienz mit derjenigen
aus dem Stand der Technik zu vergleichen, wird die Licht-Verwendungs-Effizienz
E' mittels der nachfolgenden Gleichung
(6) berechnet, in welcher lediglich eine Mehrzahl von Zielpunkten 2A mit
dem Intervall D1 (= D2 × 3)
zum Beibehalten des konfokalen Effekts beleuchtet wird (unter Verwendung
der neun Typen an Beleuchtungsmustern, die in 13 dargestellt sind). E' = {(9/9)·[1/9]}·[1/9] = 0.0123 (6) In order to compare the light utilization efficiency expressed in equation (5) with that of the prior art, the light use efficiency E 'is calculated by the following equation (6) in which only a plurality of target points 2A is illuminated with the interval D1 (= D2 × 3) to maintain the confocal effect (using the nine types of illumination patterns used in FIG 13 are shown). E '= {(9/9)} [1/9]} · [1/9] = 0.0123 (6)
Wie
aus der vorangegangenen numerischen Berechnung klar ist, ist gemäß dem zweiten
Ausführungsbeispiel
die Licht-Verwendungs-Effizienz
der Lichtquelle 11 beachtlich verbessert, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert
ist. Somit kann die konfokale Beobachtung genau durchgeführt werden.As is clear from the foregoing numerical calculation, according to the second embodiment, the light-use efficiency of the light source is 11 considerably improved, whereby the signal-to-noise ratio is improved. Thus, the confocal observation can be accurately performed.
Drittes AusführungsbeispielThird embodiment
Der
Steuerabschnitt 19 erzeugt während des Erzeugens eines konfokalen
Signals (a) auch ein nicht-konfokales Signal (b), indem die vorangegangenen
Gleichungen (1) und (2) (oder die vorangegangenen Gleichungen (3)
und (4)) angewendet werden. Das nicht-konfokale Signal (b) ist ein
Signal, das der Gesamtintensität
des Lecklichts aller Mikrobereiche 2A (beispielsweise acht
mit „1" bis „4" und „6" bis „9" bezeichnete Nicht-Zielpunkte 2A,
wie in 5 dargestellt), die nicht der Zielpunkt 2A sind,
entspricht.The control section 19 Also generates a non-confocal signal (b) during generation of a confocal signal (a) by applying the foregoing equations (1) and (2) (or the foregoing equations (3) and (4)). The non-confocal signal (b) is a signal that is the total intensity of the leak of all micro-regions 2A (For example, eight non-target points labeled "1" to "4" and "6" to "9" 2A , as in 5 shown), which is not the destination point 2A are, corresponds.
Zusätzlich wird
ein Differenzsignal (a – b) zwischen
dem konfokalen Signal (a) und dem nicht-konfokalen Signal (b) als
eine Bild-Intensitäts-Verteilung
in der Proben-Ebene 20 erzeugt. Es ist zu berücksichtigen,
dass das Differenzsignal (a – b)
Information in einem Bereich repräsentiert, der kleiner als das
konfokale Signal (a) in der Proben-Ebene 20 ist. Die dem
Differenzsignal (a – b)
entsprechende Bild-Intensitäts-Verteilung
in der Proben-Ebene 20 hat somit eine höhere Auflösung als diejenige, die dem
konfokalen Signal (a) entspricht. Als nächstes wird diese Theorie qualitativ
beschrieben.In addition, a difference signal (a-b) between the confocal signal (a) and the non-confocal signal (b) becomes an image intensity distribution in the sample plane 20 generated. It should be noted that the difference signal (a-b) represents information in an area smaller than the confocal signal (a) in the sample plane 20 is. The image intensity distribution in the sample plane corresponding to the difference signal (a-b) 20 thus has a higher resolution than that corresponding to the confocal signal (a). Next, this theory will be qualitatively described.
Wenn
lediglich ein mit „5" bezeichneter Zielpunkt 2A in
einem in 14(a) dargestellten Beleuchtungsmuster
beleuchtet wird und sich dieser Zielpunkt 2A auf der optischen
Achse befindet (siehe 14(b) und 14(c)), ist das von dem mit dem Zielpunkt 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A emittierte Licht-Empfangs-Signal
ein konfokales Signal (a). Zusätzlich
hat der Beleuchtungs-Bereich in der Proben-Ebene 20 eine
in 14(b) dargestellte Form.If only a target point labeled "5" 2A in an in 14 (a) Illuminated pattern is illuminated and this target point 2A located on the optical axis (see 14 (b) and 14 (c) ), that is the one with the destination point 2A conjugate light receiving portion 8A emitted light-receiving signal a confocal signal (a). In addition, the lighting area has in the sample level 20 one in 14 (b) illustrated form.
Wenn
auf der anderen Seite mit „2" und „8" bezeichnete Nicht-Zielpunkte 2A benachbart
zu einem mit „5" bezeichneten Zielpunkt 2A in
einem in 14(d) dargestellten Beleuchtungsmuster
gleichzeitig beleuchtet werden und sich der Zielpunkt 2A auf
der optischen Achse befindet (siehe 14(e) und 14(f)), ist das von dem mit dem Zielpunkt 2A konjugierten
Licht-Empfangs-Teilbereich 8A emittierte Licht-Empfangs-Signal
ein nicht-konfokales Signal (b). Der Beleuchtungs-Bereich in der
Proben-Ebene 20 hat dann eine in 14(e) dargestellte
Form.If on the other side with "2" and "8" designated non-target points 2A adjacent to a target point labeled "5" 2A in an in 14 (d) Illuminated patterns are illuminated simultaneously and the target point 2A located on the optical axis (see 14 (e) and 14 (f) ), that is the one with the destination point 2A conjugate light receiving portion 8A emitted light-receiving signal a non-confocal signal (b). The lighting area in the sample level 20 then has one in 14 (e) illustrated form.
Information
in der Proben-Ebene 20, die in dem Differenzsignal (a – b) des
konfokalen Signals (a) und des nicht-konfokalen Signals (b) enthalten
ist, entspricht den in 14(g) und 14(h) dargestellten schraffierten Bereichen.
Somit ist klar, dass diese kleiner sind als die in 14(b) und 14(c) gezeigten. Mittels Durchführens der
Verarbeitung zum Erhalten der Differenz werden somit die Auflösungen in
Richtung der optischen Achse und in der Ebene verbessert.Information in the sample level 20 which is included in the difference signal (a-b) of the confocal signal (a) and the non-confocal signal (b) corresponds to those in 14 (g) and 14 (h) hatched areas shown. Thus, it is clear that these are smaller than those in 14 (b) and 14 (c) shown. By performing the processing for obtaining the difference, the resolutions in the direction of the optical axis and in the plane are thus improved.
Um
den Effekt der Verarbeitung zum Erhalten der Differenz quantitativ
zu repräsentieren,
wird in 15(b) eine optische Transfer-Funktion
einer dem Differenzsignal (a – b)
entsprechenden Bild-Intensitäts-Verteilung
dargestellt. Zum Vergleich wird in 15(a) zusätzlich eine
optische Transfer-Funktion einer dem konfokalen Signal (a) entsprechenden Bild-Intensitäts-Verteilung
dargestellt. In 15 repräsentiert die horizontale Achse
eine Frequenz Nz [1/μm]
in Richtung der optischen Achse, wohingegen die vertikale Achse
die optische Transfer-Funktion (OTF) repräsentiert.To quantitatively represent the effect of the processing for obtaining the difference, reference is made to FIG 15 (b) an optical transfer function of the difference signal (a - b) corresponding image intensity distribution. For comparison, in 15 (a) additionally an optical transfer function of the confocal signal (a) corresponding image intensity distribution shown. In 15 For example, the horizontal axis represents a frequency Nz [1 / μm] in the direction of the optical axis, whereas the vertical axis represents the optical transfer function (OTF).
In
dieser Simulation wird die Verarbeitung zum Erhalten der Differenz
mit den in 14(d) bis 14(f) dargestellten
nicht-konfokalen Signalen (b) durchgeführt. In dieser Simulation beträgt die Wellenlänge 0,55 μm, die numerische
Apertur ist 0,75 und die Vergrößerung ist
40. Die Größe eines
jeden Mikrobereichs 2A wird auf 25 μm festgelegt, so dass Lecklicht
von außerhalb
der Einheit 21 vernachlässigbar
ist. Aus dem Vergleich von 15(a) mit 15(b) ist klar, dass im Bereich der Frequenz
Nz von 0,0 bis 0,8 die optische Transfer-Funktion (a), wenn die
Verarbeitung zum Erhalten der Differenz durchgeführt wird, größere Werte
zeigt als die optische Transfer-Funktion (b), wenn die Verarbeitung nicht
durchgeführt
wird.In this simulation, the processing for obtaining the difference with the in 14 (d) to 14 (f) shown non-confocal signals (b) performed. In this simulation, the wavelength is 0.55 μm, the numerical aperture is 0.75 and the magnification is 40. The size of each micro-area 2A is set to 25 μm, allowing leakage light from outside the unit 21 is negligible. From the comparison of 15 (a) With 15 (b) It will be understood that, in the range of the frequency Nz of 0.0 to 0.8, the optical transfer function (a), when the processing for obtaining the difference is performed, shows larger values than the optical transfer function (b) the processing is not carried out.
Die
vorangegangenen Ausführungsbeispiele haben
Beispiele eines zwei Nicht-Zielpunkte 2A aufweisenden Beleuchtungsmusters
und eines vier Nicht-Zielpunkte 2A aufweisenden Beleuchtungsmusters
beschrieben. Jedoch ist diese Erfindung nicht auf diese Beispiele
beschränkt.
In anderen Worten, diese Erfindung kann für den Fall angewendet werden,
bei dem die Anzahl an Nicht-Zielpunkten mindestens „eins" ist und mindestens
zwei Typen an Beleuchtungsmustern, die in der Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A differieren,
verwendet werden. Darüber
hinaus kann in einem einzelnen einer Mehrzahl an Beleuchtungsmustern,
die in der Anzahl an Nicht-Zielpunkten 2A differieren,
die Beleuchtung der Nicht-Zielpunkte 2A abgeschirmt
sein. Wenn drei oder mehr Typen an Beleuchtungsmustern, die in der Anzahl
an Nicht-Zielpunkten 2A differieren, verwendet werden,
ist es außerdem
bevorzugt, dass gleichzeitig Gleichungen nach dem Fehler-Quadrat-Verfahren gelöst werden.
Da in diesem Fall die Datenmenge groß ist, wird die Genauigkeit
verbessert.The foregoing embodiments have examples of two non-target points 2A having a lighting pattern and one of four non-target points 2A described illumination pattern described. However, this invention is not limited to these examples. In other words, this invention can be applied to the case where the number of non-target points is at least "one" and at least two types of illumination patterns that are in the number of non-target points 2A differ, be used. In addition, in a single one of a plurality of illumination patterns, the number of non-target points 2A differ, the lighting of non-destination points 2A be shielded. When three or more types of lighting patterns, the number of non-target points 2A In addition, it is preferred that simultaneous equations be solved according to the error-squared method. In this case, since the amount of data is large, the accuracy is improved.
Die
vorangegangenen Ausführungsbeispiele haben
das Beispiel beschrieben, bei dem jede Einheit aus insgesamt neun
Mikrobereichen 2A in einer 3 × 3-Matrix zusammengesetzt
ist. Diese Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt. Es wird
bevorzugt, dass die Größe einer
Einheit 21 und eines Mikrobereichs 2A entsprechend
der Größe eines
Beleuchtungs-Bereichs, der ein Licht-Empfangs-Signal beeinflusst,
festgelegt werden. Die Matrix der Einheit 21 kann eine
gerade Zahl × eine
gerade Zahl sein. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Matrix eine
ungerade Zahl × eine
ungerade Zahl (beispielsweise 5 × 5) ist, da dann der Einfluss
des Lecklichts von einem Nicht-Zielpunkt isotrop berücksichtigt
werden kann.The foregoing embodiments have described the example in which each unit consists of a total of nine microareas 2A is composed in a 3 × 3 matrix. However, this invention is not limited to this example. It is preferred that the size of a unit 21 and a micro range 2A according to the size of a lighting area that influences a light-receiving signal. The matrix of the unit 21 can be an even number × an even number. However, it is preferable that the matrix is an odd number × odd number (for example, 5 × 5), since then the influence of the leak light from a non-target point can be considered isotropic.
Ferner
haben die vorangegangenen Ausführungsbeispiele
das Beispiel beschrieben, bei dem eine räumliche optische Modulations-Vorrichtung vom
Reflexionstyp (beispielsweise die Spiegelvorrichtung 14)
an dem optischen Beleuchtungs-Pfad und an dem optischen Empfangslicht-Pfad
beteiligt ist. Diese Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel
beschränkt.Further, the foregoing embodiments have described the example in which a reflection type spatial optical modulation device (for example, the mirror device 14 ) are involved in the illumination optical path and the received light optical path is. However, this invention is not limited to this example.
Für eine konfokale
Beobachtung einer Licht-durchlässigen
Proben-Ebene 20 können
identische räumliche
optische Modulations-Vorrichtungen sowohl in dem optischen Beleuchtungs-Pfad
als auch in dem optischen Empfangslicht-Pfad angeordnet sein und synchron gesteuert
werden. Zusätzlich kann
statt der räumlichen
optischen Modulations-Vorrichtung
vom Reflexionstyp eine durchlässige (d.h.
transparente) räumliche
optische Modulations-Vorrichtung (beispielsweise eine durchlässige optische
Vorrichtung mit mehreren zwei-dimensional angeordneten Flüssigkristall-Zellen) verwendet
werden.For a confocal observation of a light-transmissive sample plane 20 For example, identical spatial optical modulation devices may be arranged in both the illumination optical path and the received light optical path and controlled in synchronism. In addition, instead of the reflection type spatial optical modulation device, a transmissive (ie, transparent) spatial optical modulation device (for example, a transmissive optical device having a plurality of two-dimensionally arranged liquid crystal cells) may be used.