WO2015197934A1 - Synergistic combination of biomarkers for detecting and assessing hepatic fibrosis - Google Patents

Synergistic combination of biomarkers for detecting and assessing hepatic fibrosis Download PDF

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WO2015197934A1
WO2015197934A1 PCT/FR2015/051518 FR2015051518W WO2015197934A1 WO 2015197934 A1 WO2015197934 A1 WO 2015197934A1 FR 2015051518 W FR2015051518 W FR 2015051518W WO 2015197934 A1 WO2015197934 A1 WO 2015197934A1
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WO
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cxcl10
subject
protein
hepatic fibrosis
fibrosis
Prior art date
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PCT/FR2015/051518
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French (fr)
Inventor
Nadine Lambert
Bénédicte Watelet
Isabelle Catherine BATXELLI
Tarik Asselah
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Bio-Rad Innovations
Assistance Publique - Hopitaux De Paris
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Paris Diderot - Paris 7
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    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • liver fibrosis more particularly to hepatic fibrosis which may be present in a subject infected with one or more hepatitis viruses and / or who has hepatitis, more particularly chronic hepatitis.
  • the application provides methods and means for determining the stage (or degree) of hepatic fibrosis of such a subject. More particularly, the methods and means of the application make it possible to determine whether or not the stage (or degree) of hepatic fibrosis of this subject has passed the stage of mild fibrose.
  • the methods and means of the invention implement a combination of biomarkers, such as in particular the protein CXCL10 and hyaluronic acid (HA).
  • biomarkers such as in particular the protein CXCL10 and hyaluronic acid (HA).
  • Hepatic fibrosis results in particular from an excessive accumulation of molecular compounds of the altered extracellular matrix in the hepatic parenchyma.
  • the stage of liver tissue involvement is assessed by a hepatic fibrosis score, in particular by the F Metavir scoring system, which comprises 5 stages of F0 to F4 (cf. . Table 25 below).
  • the determination of the hepatic fibrosis score is of paramount importance for the practitioner, since it is a prognostic score.
  • the HA biomarker is used in clinical trials ELF TM (US 7,141,380 B2), HEPASCORE TM (Adams et al., 2005, US 2007/0225919 A1), FIBROSPECT TM (US 6,986,995 B2), FIBROMETER TM (US 8,489,335 B2) and SHASTA TM (Kelleher et al., 2005).
  • the CXCL10 protein is essentially known to be a bio-marker of the response to anti-HCV therapy by interferon, and has been poorly described in the context of hepatic fibrosis.
  • HA has the ability to induce the expression of the CXCL10 protein.
  • an increase in HA induces an increase in CXCL10.
  • the concentrations of the two molecules evolve in the same direction (the increase in the concentration of HA causes the increase in the concentration of CXCL10). It was therefore not expected a priori that the combination of these two molecules as biomarkers lead to an additional result compared to that which would be obtained with only one of the two molecules.
  • the present application describes the obtaining of a synergistic effect going beyond the simple juxtaposition of the two molecules as biomarkers.
  • Metavir F0-F1 fibrosis scores Metavir F2-F4 fibrosis, and reports that these trials are unsuccessful (Zeremski et al., 2009, page 179, left column, first sentence: "The combination of multiple parameters did not improve the ability to identify patients with minimal fibrosis "). The purpose of this application has thus overcome a technical bias.
  • the application relates to methods and means for determining the stage (or degree) of hepatic fibrosis of a subject, in particular to determine whether or not the stage (or degree) of liver fibrosis of said subject has progressed beyond the stage of light fibrose.
  • the inventors have identified particular biomarkers for this purpose, such as CXCL10 (chemokine ligand (CXC motif)) and HA (hyaluronic acid or hyaluronan).
  • CXCL10 chemokine ligand (CXC motif)
  • HA hyaluronic acid or hyaluronan
  • the inventors have more particularly identified particular combinations of biomarkers which, like the combination of CXCL10 with HA, lead to a synergistic effect.
  • Example 7 more particularly Tables 20, 21 and 23
  • Example 8 more particularly Table 24.
  • the detection of HA and that of CXCLIO are made in multiplexes: cf. Example 10 below.
  • the means of the invention comprise in particular:
  • biomarkers such as in particular CXCL10 and HA
  • Figure 1 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the hepatic fibrosis score established by Puncture Hepatic Biopsy (PBH) (Metavir F1 or F2 score) for a population of 118 patients (cf. example 1 below).
  • PH Puncture Hepatic Biopsy
  • Figure 2 shows the distribution of the serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the hepatic fibrosis score established by PBH (Fl or F2 score) for a population of 118 patients (cf. example 1 below).
  • HA serum hyaluronic acid
  • Figure 3 presents a classification model or algorithm that can be used to determine the stage of liver fibrosis without the use of PBH (Metavir score of liver fibrosis ⁇ F2 or> F2).
  • This model or algorithm was developed by modifying the algorithm described by Castera et al. (Castera et al., 2010 and Castera et al., 2014).
  • this modified model or algorithm includes a second level of analysis, for the treatment (without PBH) of those samples which give discordant results at the first level of analysis (cf. example 3 below).
  • Figure 4 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the degree of liver fibrosis (Metavir score ⁇ F2 or> F2) for a population of 310 patients (cf. example 3 below).
  • Figure 5 shows the distribution of serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the degree of hepatic fibrosis (Metavir score ⁇ F2 or> F2) for a population of 310 patients [cf. example 3 below].
  • HA serum hyaluronic acid
  • Figure 6 presents a classification model or algorithm that can be used to fine-tune the stage of liver fibrosis without the use of PBH (Metavir score of liver fibrosis F0-F1 or F2-F3 or F4).
  • This model or algorithm was developed by modifying the algorithm described by Boursier et al. 2012.
  • this modified model or algorithm includes a second level of analysis, for processing (without PBH) of those samples that give discordant results at the first level of analysis (cf. example 6 below).
  • Figure 7 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the degree of liver fibrosis (Metavir F0-F1 or F2-F3 or F4 score) for a population of 310 patients (cf. example 6 below).
  • Figure 8 shows the distribution of the serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the degree of hepatic fibrosis (Metavir score F0-F1 or F2-F3 or F4) for a population of 310 patients (cf. example 6 below).
  • HA serum hyaluronic acid
  • FIGS. 9, 10 and 11 each present a classification model or algorithm comprising the combination of the HA marker and the CXCL10 marker, for the classification of patients according to their stage of liver fibrosis (Metavir score of F0-F1 or F2 liver fibrosis). -F3).
  • This model or algorithm may further comprise a prior step for classifying patients according to whether their Metavir score of hepatic fibrosis is less than F4, or is equal to F4, for example by measuring the hardness of the liver, for example by FIBROSCAN TM .
  • Figures 10 and 11 Combination of HA, CXCLIO and one or more additional markers.
  • Figure 10 Combination of HA, CXCL10 and one or more additional additional markers [clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s)], in this case: Index Body Mass (BMI), Age at Time of Collection (Age), Viral Load at Time of Collection (CV).
  • BMI Index Body Mass
  • Alge Age at Time of Collection
  • CV Viral Load at Time of Collection
  • Figure 11 Combination of HA, CXCL10 and measurement of liver hardness, as measured for example by FIBROSCAN TM (FS).
  • Figure 12 presents a model or algorithm of classification that is not based on a linear function: this model or algorithm is based on a classification model CART ⁇ Classification And Regression Tree), and includes the combination of the marker HA and the marker CXCL10 ⁇ cf. example 7 below).
  • Figures 13A to 16B illustrate the performance of the HA + CXCL10 combination using the method known as Bootstrap (cf. Example 3 below; 1,000 randomly-sized subpopulations randomly drawn from a population of 310 patients; draw with discount).
  • Bootstrap cf. Example 3 below; 1,000 randomly-sized subpopulations randomly drawn from a population of 310 patients; draw with discount.
  • AUC area under the ROC curve
  • Good classification rate percentage of well-ranked patients
  • Figures 13A and 13B show in the form of histograms the values of the AUC and precision differences that were measured between the "fixed coefficients" (or “coef fx") decision rule and share the decision rule mROC “optimized coefficients" ("coef optim").
  • Figures 14A and 14B present in the form of histograms the values of the AUC differences and of the good classification rates which have been measured for the "fixed coefficients" (“coef fix”) decision rule mROC on the one hand.
  • Figures 16A and 16B compare the performances of the mROC function obtained on the population of 118 patients of Example 1 (markers HA + CXCL10, function ZI, see Table 2 below) to those of the function mROC obtained on the population of 310 patients of Example 3 (HA + CXCL10 markers, Z4 function, see Table 7 below), when both are applied to the population of 118 patients; cf. Example 9 below.
  • Figure 16B ordinate, sensitivity; on the abscissa, specificity; curves of ZI and Z4 (the two curves merge).
  • the application relates to a method for determining, more particularly for determining with a high probability, the stage (or degree) of liver fibrosis of a subject who is infected with one or more hepatitis viruses and / or is hepatitis, more specifically chronic hepatitis.
  • the hepatitis virus or viruses may for example be one or more viruses of hepatitis C and / or hepatitis B and / or hepatitis D, more particularly hepatitis C.
  • the said hepatitis C virus can be of any genotype.
  • the genotype of said hepatitis C virus may be genotype 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, more particularly genotype 1 or 4.
  • Said subject is a mammal, more particularly a human.
  • the demand method involves the quantification of different markers, all of which can be measured or determined in a substantially non-invasive manner (the degree of invasive intervention on the subject's body does not go beyond the simple collection of biological fluid ).
  • the demand method can be implemented in vitro.
  • the method of application is a method for determining, more particularly for determining with high probability, whether or not the stage (or degree) of hepatic fibrosis of said subject has passed the stage of mild fibrose.
  • Stage (or degree) of hepatic fibrosis which has not passed the stage of slight fibrosis means a stage which is less than or equal to that of mild fibrose.
  • Stage (or degree) of hepatic fibrosis which has passed the stage of mild fibrosis means a stage which is greater than that of mild fibrosis.
  • hepatic fibrosis The various stages of hepatic fibrosis are as follows (in the order of low degree to the highest degree):
  • the said stage of slight fibrosis is that of portal fibroids without septa.
  • the liver of this subject is either free of fibro- sis (absence of fibrosis) or of portal fribrose without septa.
  • the liver of this subject is therefore affected with portal fiabrosis with septa, or septal fibrosis without cirrhosis, or with cirrhosis.
  • Metavir score system There are different systems of hepatic fibrosis scores. The most common is the Metavir score system.
  • This mild fibrosis stage is therefore a degree of hepatic fibrosis which, according to the Metavir score system, has a Fl score.
  • a liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has not exceeded said stage of light fibrosis is therefore a score of at most F1, that is to say a score of FO or F1, according to the score system. Metavir.
  • a liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has exceeded said light fibrosis stage is therefore a score of at least F2, that is to say a score of F2, F3 or F4, according to the Metavir score system.
  • This mild fibrosis stage is therefore a degree of hepatic fibrosis which, according to the Ishak score system, has a F1 / F2 score.
  • a liver fibrosis score indicating that the liver of said subject did not exceed said light fibrosis stage is therefore a score of at most F2, ie a score of FO, F1 or F2, according to the system. of Ishak scores.
  • a liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has exceeded said light fibrosis stage is therefore a score of at least F3, that is to say a score of F3, F4, F5 or F6, according to the system of Ishak scores.
  • Determining whether the stage (or degree) of hepatic fibrosis of a subject infected with one or more hepatitis viruses and / or hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has progressed beyond the stage of light fibrosis is of particular importance to the practitioner.
  • the demand method can be used not only in the diagnosis of hepatic fibrosis or the hepatic fibrosis stage, but also in the treatment of liver disease, particularly to determine when a treatment must be administered to the subject.
  • the method of the invention may thus be a method for therapy of a subject, which comprises administering anti-hepatitis and / or hepatitis C and / or anti-hepatic treatment only when, at using the means of demand, it has been determined that the subject has passed the stage of mild fibrosis, or else a method for the therapy of a subject, which includes adjusting an anti-cancer treatment.
  • Said treatment may especially be a treatment aimed at blocking or slowing the progression of hepatic fibrosis, by eliminating the virus (in particular, in the case of hepatitis C) and / or by blocking the replication of the virus (especially in the case of hepatitis B).
  • the method of the application is applicable irrespective of the hepatic fibrosis stage of said subject: this stage may be that of the absence of hepatic fibrosis up to that of cirrhosis.
  • the hepatic fibrosis score of said subject may therefore be, according to the Metavir fibrosis scoring system, F0, Fl, F2, F3 or F4, more particularly F0, Fl, F2 or F3, more particularly F0, Fl or F2. , more particularly Fl, F2 or F3, more particularly Fl or F2.
  • Said subject may be a subject whose liver hardness has been previously measured, in particular by a non-invasive method such as pulse elastography (for example by FIBROSCAN TM).
  • a non-invasive method such as pulse elastography (for example by FIBROSCAN TM).
  • the demand method involves the quantification, more particularly the detection and quantification, of biological markers (or variables).
  • the biological markers (or biomarkers) selected for the implementation of the method include several different circulating molecules. They may further comprise zero, one or more additional label (s), which are not circulating molecules.
  • Circulating molecules The term "circulating molecules" is understood according to its usual meaning in the field.
  • the circulating molecules are molecules that are present in the blood of a mammal, more particularly a human being, in acellular form: they are contained neither in a circulating cell nor in a tissue cell.
  • the circulating molecules in the blood are also circulating in the plasma.
  • the circulating molecules in the blood are also circulating in the serum.
  • the circulating molecules may for example be proteins, glycoproteins, enzymes, polysaccharides, lipids, glycerides, hormones.
  • the circulating molecules may for example be molecules produced, or metabolites produced by the cells of the body of said subject.
  • the circulating molecules may for example be molecules (or metabolites) that are produced by the cells of the body of said subject, but which are not produced by a virus, more particularly a hepatitis virus.
  • the figured elements of blood, such as platelets, as well as viruses, such as hepatitis viruses, are circulating, but are not molecules: they are not therefore part of the circulating molecules in the sense of demand.
  • these circulating molecules are human circulating molecules. Examples of circulating molecules include:
  • GTT gamma glutamyl transpeptidase
  • ALT alanine aminotransferase
  • alpha 2 macroglobulin A2M
  • TRIP1 metalloproteinase inhibitor 1
  • SPP1 secreted phosphoprotein 1
  • interleukin-6 signal transducer IL6ST
  • MMP9 matrix metallopeptidase 9
  • angiopoietin 2 (ANGPT2)
  • MMP2 matrix metallopeptidase 2
  • MMP7 matrix metalloproteinase 7
  • TRIP1 metalloproteinase inhibitor 1
  • CXC motif CXCL1
  • Chemokine ligand 6 CXC motif (CXCL6)
  • IHH Indian Hedgehog protein
  • interferon-stimulated 3G transcription factor (IRF9)
  • MMP1 matrix metalloproteinase 1
  • a sample of a biological sample must be or have been made on said subject.
  • the circulating molecules selected for the implementation of the method comprise (or consist of) at least two different circulating molecules.
  • the selected circulating molecules include (or consist of) at least hyaluronic acid (HA) and CXCL10 protein (CXCL10).
  • the inventors demonstrate that the combination of the CXCL10 marker with the HA marker leads to a synergistic effect, namely to performances that go beyond the simple juxtaposition of their respective individual performances (AUC performance and / or good classification rate and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP).
  • AUC performance and / or good classification rate and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP are presented in the examples below, including:
  • Hyaluronic acid (HA) and CXCL10 protein (CXCL10) are well known to those skilled in the art.
  • HA is a hyalobiuronic acid polymer; its developed formula is as follows:
  • CXCL10 is chemokine ligand (CXC motif) [C-X-C chemokine motif 10], also known as C7; IFI10; INP10; IP-10; SCYB10; crg-2; gIP-10 or mob-1. Its human sequence is described in the databases under accession number NM 001565.
  • the precursor form of the protein CXCL10 (human) is a protein consisting of 98 amino acids, the sequence of which is:
  • the signal peptide of the precursor form of CXCLIO is a peptide consisting of 21 amino acids, which is equal to the 1-21 fragment of the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, namely: MNQTAILICC LIFLTLSGIQG [SEQ ID NO: 3] .
  • agonist which consists of 77 amino acids
  • antagonist form which consists of 75 amino acids
  • CXCLIO a form which results from cleavage after secretion (proteolytic cleavage by keratinocytes), which consists of 73 amino acids.
  • the agonist form of CXCLIO is a 77 amino acid protein that has the following sequence:
  • the antagonist form of CXCLIO is a 75 amino acid protein whose sequence is that of the truncated agonist form of the two N-terminal amino acids.
  • the antagonistic form of CXCLIO thus has the following sequence:
  • CXCLIO The form of CXCLIO that results from cleavage after secretion is a protein of
  • CXCLIO which results from a cleavage after secretion thus has the following sequence:
  • the circulating forms of the CXCL10 (human) protein therefore comprise the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9, more particularly:
  • the quantification comprises the quantification, or the detection and the quantification, of at least one, more particularly of several, more particularly of all the circulating forms of the protein.
  • CXCLIO comprises the quantification, or the detection and quantification, of at least one, more particularly several, more particularly of all the circulating forms, the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9.
  • the circulating molecules selected for the implementation of the method may consist of the protein CXCL10 and HA.
  • CXCL10 and HA are the only two circulating molecules that are selected or used as biomarkers.
  • one or more other (different) circulating proteins may be selected in addition to HA and CXCL10.
  • these other selected circulating molecules do not include alpha 2 macroglobulin (A2M).
  • A2M alpha 2 macroglobulin
  • the protein A2M is present in large quantities in the blood of human subjects. Therefore, it is not possible, or at least very difficult in routine, to measure the concentration of A2M in multiplex with that of HA and the CXCLIO protein.
  • these other selected circulating molecules do not include the "Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor” (GMCSF).
  • GMCSF Gramulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
  • these other selected circulating molecules do not include interleukin 12 (IL 12).
  • IL 12 interleukin 12
  • these other selected circulating molecules do not include interleukin 2 (IL2).
  • IL2 interleukin 2
  • these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 13 (MMP13).
  • MMP13 matrix metallopeptidase 13
  • these other selected circulating molecules do not include alanine aminotransferase (ALT).
  • these other selected circulating molecules do not include gamma glutamyl transpeptidase (GGT).
  • GTT gamma glutamyl transpeptidase
  • these other selected circulating molecules do not include the "InterCellular Molecule Adhesion” (ICAM1) protein. According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include interleukin 4 (IL4).
  • ICM1 InterCellular Molecule Adhesion
  • IL4 interleukin 4
  • these other selected circulating molecules do not comprise the chemokine motif ligand 6 CXC (CXCL9).
  • these other selected circulating molecules do not include the "Vascular Cell Adhesion Molecule 1" protein (VCAM1).
  • these other selected circulating molecules do not include "Retinol Binding Protein 4" (RBP4).
  • these other selected circulating molecules do not include metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1).
  • TRIP1 metalloproteinase inhibitor 1
  • these other circulating molecules selected do not include vimentin (VIM).
  • these other selected circulating molecules do not include secreted phosphoprotein 1 (SPP1).
  • SPP1 secreted phosphoprotein 1
  • these other selected circulating molecules do not include aspartate aminotransferase (AST).
  • these other circulating molecules selected do not include apolipoprotein Al (ApoAl).
  • these other selected circulating molecules do not include the interleukin-6 signal transducer (IL6ST).
  • IL6ST interleukin-6 signal transducer
  • these other selected circulating molecules do not include the kinase 2A cyclin dependent inhibitor (p14ARF).
  • these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 9 (MMP9). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include angiopoietin 2 (ANGPT2).
  • MMP9 matrix metallopeptidase 9
  • ANGPT2 angiopoietin 2
  • these other selected circulating molecules do not comprise the CXC motif chemokine ligand 11 (CXCL11). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 2 (MMP2).
  • MMP2 matrix metallopeptidase 2
  • these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 7 (MMP7).
  • MMP7 matrix metallopeptidase 7
  • these other selected circulating molecules do not include calcium-binding protein A4 S100 (S100A4).
  • these other selected circulating molecules do not include metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1).
  • TRIP1 metalloproteinase inhibitor 1
  • these other selected circulating molecules do not comprise the chitinase-3 protein 1 (CHI3L1).
  • these other selected circulating molecules do not include the collagen alpha-1 (1) chain (COL1A1).
  • these other selected circulating molecules do not include the chemokine 1 of the CXC motif growth-regulating alpha protein (CXCL1).
  • these other selected circulating molecules do not comprise the chemokine motif ligand CXC (CXCL6).
  • these other circulating molecules selected do not include the "Indian Hedgehog" (IHH) protein.
  • these other selected circulating molecules do not include the interferon-stimulated 3 G transcription factor (IRF9).
  • IRF9 interferon-stimulated 3 G transcription factor
  • these other selected circulating molecules do not include matrix metalloproteinase 1 (MMP1).
  • MMP1 matrix metalloproteinase 1
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the GMCSF, IL 12, IL 2 and MMP 13 proteins.
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, GMCSF, IL 12, IL2 and MMP13 proteins. According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1 and RBP4 proteins.
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1 and RBP4 proteins.
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, TIMP1, VIM and SPP1 proteins.
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1 or CXCL1 proteins.
  • these other selected circulating molecules do not comprise any of the proteins A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoAI, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 and MMP1.
  • the total number of circulating molecules (different) that are selected are six, five, four, three or two, more particularly five, four, three or two, more particularly four, three or two, more particularly three or two, more particularly two in number.
  • the selected biological markers may also comprise zero, one or more additional label (s), which are not circulating molecules, more particularly which do not are not circulating human molecules.
  • addition marker (s) means here that of the selected biological markers which is not not (are not) a circulating molecule (s), more particularly which is not (are) a circulating molecule (s) human (s).
  • the selected biological markers may comprise, in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCL10), one or more additional marker (s), which is (are) chosen from:
  • said additional marker (s) is (are) chosen from:
  • Clinical or anatomical characteristics are advantageously characteristics the measurement of which does not require detection or quantification in a biological fluid sample of said subject, and more generally the measurement of which can be done without taking a biological sample from said subject .
  • age, Body Mass Index (BMI), sex, and liver hardness are clinical or anatomical features (or markers) that can be quantified by extracorporeal measurement, without biological fluid sampling, and more. generally without taking a biological sample from said subject (the liver hardness can be measured by pulse elastography, in particular by FIBROSCAN TM), and more generally without any invasive intervention.
  • Examples of clinical or anatomical characteristics of said subject include in particular the age of said subject, the BMI of said subject, the sex of said subject, and the hardness of the liver of said subject (FS), more particularly the age of said subject, the BMI said subject, and the hardness of the liver of said subject (FS).
  • the age marker of said subject includes:
  • the "IMC of said subject” marker comprises in particular:
  • the total number of (different) clinical marker (s) or anatomical marker (s) which are selected as additional marker (s) is zero, one, two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, for example zero, for example one, for example two, for example one, two or three, for example one or two.
  • the clinical (s) or anatomic marker (s) selected is (are) one, two or three (different) marker (s), more particularly one or two marker (s) (different), for example a marker, for example two different markers, chosen from:
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
  • the virological characteristics (or markers) of said subject are characteristics that require detection or quantification in a biological fluid sample of said subject.
  • this sample of biological fluid is the same, or at least is of the same nature, as that used to detect or quantify said circulating molecules (such as CXCL10 and HA).
  • the viral load of said subject (CV), more particularly his viral load in the hepatitis virus
  • the genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) to which said subject is infected is infected.
  • the marker "nature of the virus (s) contained in the blood of said subject” includes in particular the nature of the hepatitis virus (s) contained in the blood of said subject: for example, HCV and / or HBV and / or VHD, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
  • the "viral load of said subject” (VC) marker comprises, in particular, the viral load of said subject, for example hepatitis virus, his viral load in HCV and / or in HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the marker "genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) of which said subject is infected” notably comprises the genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) to which said subject is infected, for example , genotype (s) 1 and / or 2 and / or 3 and / or 4 and / or 5 and / or 6 and / or 7.
  • virological characteristics of said subject include more particularly the viral load of said subject in hepatitis virus, more particularly the viral load of said subject in HCV and / or in HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV. , especially in HCV.
  • the total number of (different) virological marker (s) that are (are) selected as additional marker (s) is zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly one or two, more particularly one, more particularly zero.
  • no virological marker is selected, or only one virological marker is selected and is the viral load of said subject (more particularly his viral load of hepatitis virus, more particularly his HCV load and / or HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV).
  • the total number of additional additional marker (s) selected (s) in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCLIO) is zero, one, two, three, four, five, or more than five.
  • the total number of additional additional marker (s) as described above is zero, one, two, three, four or five, more particularly zero, one, two, , three or four, more particularly from zero, one, two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, more particularly from zero, more particularly from one, two, three, four or five, or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly one or two, more particularly one, more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five.
  • said circulating molecules and in particular in addition to HA and
  • said additional marker (s) may (for example) include (or consist of):
  • said additional marker (s) may (for example) comprise (or consist of):
  • the selected biological markers may comprise (or consist of): - six, five, four, three or two different circulating molecules as described above, more particularly five, four, three or two circulating molecules such as above described, more particularly four, three or two circulating molecules as described above, more particularly three or two circulating molecules as described above, more particularly two circulating molecules as described above, said different circulating molecules comprising at least less HA and CXCLIO, and
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his HCV load and / or
  • HBV and / or HDV more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
  • the total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly of zero, one, two, three, four or five, more particularly of zero, one, two, three or four, more particularly zero, one, two or three, more particularly zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly zero, more particularly one, two, three, four, five , or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly one or two, more particularly one , more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five.
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • these two different circulating molecules being constituted by HA and CXCL10,
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly zero, one, two, three, four or five, more particularly zero, one, two, three or four, plus particularly of zero, one, two or three, more particularly zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly zero, more particularly one, two, three, four, five, or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly of one or two, more particularly one, more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five.
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • these two different circulating molecules being constituted by HA and CXCL10,
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly zero, one, two or three, more particularly one, two or three, more particularly two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, more particularly from zero, more particularly from one, two or three, more particularly from one or two, more particularly from one, more particularly from two, more particularly from three, more particularly four.
  • the selected biomarkers may include (or consist of) HA and CXCL 10.
  • the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10, and the age of said subject (more particularly the age of said subject at the time the biological fluid sample required for the detection or quantification of circulating molecules).
  • the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10, and the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of circulating molecules).
  • the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10 and the liver hardness of said subject (FS).
  • the selected biological markers may comprise (or consist of): HA, CXCL10, and the viral load (CV) of said subject, more particularly, the viral load of said subject to hepatitis virus, for example, his load in HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
  • CV viral load
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules) was made, and
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken).
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was made)
  • the viral load (CV) of said subject more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the selected biomarkers may include (or consist of): - HA,
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules) was made, and
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
  • the viral load (CV) of said subject more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or
  • VHD more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the viral load (CV) of said subject more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or
  • HDV more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the age (more particularly the age of the subject at the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
  • the viral load (CV) of said subject more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
  • the selected biomarkers may include (or consist of):
  • the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
  • the viral load (CV) of said subject more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, especially in HCV, and - the hardness of the liver (FS) of said subject.
  • CV viral load
  • FS hardness of the liver
  • biomarkers are more particularly as follows:
  • the biomarker CXCLIO is the quantification value of the circulating forms of CXCL10 in said patient, more particularly the serum concentration of CXCLIO, expressed for example in mg / ml, in ⁇ g / ml, ng / ml or pg / ml, more particularly in pg / mL,
  • the biomarker HA is the quantification value of HA in said patient, more particularly may be the serum concentration of HA, expressed for example in mg / ml, in ⁇ g / ml, ng / ml or pg / ml, more particularly in ng / mL,
  • the biomarker BMI is the BMI of said subject, more particularly the BMI calculated as being the weight of said subject in kg divided by (the size of said subject in m) 2 , more particularly the BMI of said subject at the date on which a biological fluid sampling required for the detection or quantification of circulating molecules CXCL10 and HA,
  • the age marker is the age of said subject, for example expressed in number of years (integer or decimal), more particularly the age of said subject on the date on which the fluid sample was taken.
  • biological requirement for the detection or quantification of circulating molecules CXCL10 and HA for example expressed in number of years (integer or decimal), more particularly the age of said subject on the date on which the fluid sample was taken.
  • the biomarker CV is the viral load of said subject in the hepatitis virus, more particularly its load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV, for example expressed in copies / mL or in IU / mL or in a multiple of one of these units such as in 10 3 copies per mL, more particularly this load on the date on which the biological fluid sample required for the detection was made or the quantification of circulating molecules CXCL10 and HA,
  • the biomarker FS is the hardness of the liver of said subject, expressed for example in kPA (this measurement can be made non-invasively by pulse elastography, in particular by FIBROSCAN TM).
  • the method of the request comprises the step of quantifying, more particularly of detecting and quantifying, for said subject the selected biological markers (cf. above).
  • the selected circulating molecules (which comprise at least HA and CXCL10) are quantified, more particularly detected and quantified, in a biological fluid sample of said subject.
  • a method of the application may therefore include the step of taking a biological fluid sample from said subject. However, if the method is an in vitro method, this sampling step is a step prior to the method.
  • a sample of biological fluid of said subject is for example a sample of blood, serum, plasma or urine, more particularly a sample of blood, serum or plasma, more particularly a sample of serum or plasma, more particularly a sample of serum.
  • This biological fluid sample may have been transformed after collection. It may, for example, have undergone a purification and / or concentration and / or extraction treatment, for example by purification and / or concentration and / or extraction of or proteins and / or polypeptides and / or serum peptides, or by purification. and / or extraction and / or concentration of a protein fraction.
  • the purification and / or concentration can for example be made by filtration and / or density gradient.
  • the quantification values of the circulating molecules are concentration or proportion values, more particularly concentration values. They can be expressed in mg / mL, in ⁇ g / mL, ng / mL or pg / mL.
  • the quantification value of HA is a concentration value expressed in ng / mL.
  • the quantification value of CXCL10 is a concentration value expressed in pg / mL.
  • concentration or proportion values may be those measured in said biological fluid sample or in an extract or filtrate of this sample.
  • the quantification values may be those measured. in the purification filtrate of said biological sample.
  • the quantification values may be those measured in the serum.
  • each of the quantification values of said circulating molecules can be a concentration value (or proportion) of blood, plasma or serum, more particularly serum.
  • the quantification values of all the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCLIO are measured in the same sample, or at least in a sample of identical nature.
  • the quantification values of each of the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10 are all measured in a serum sample that has not undergone any post-collection treatment, or are all measured in a serum sample. who has undergone the same treatment after collection (for example, the same purification treatment).
  • the quantification values of all selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10 can be measured in an undiluted serum sample.
  • the quantification values of all the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10 can be measured in one and the same biological sample, more particularly in a single serum sample, more particularly in one and the same undiluted serum sample.
  • said quantification step can notably comprise the in vitro detection of each of the circulating molecules selected as biological markers, such as HA and CXCLIO.
  • the detection of each of the circulating molecules selected as biological markers, more particularly HA and CXCL10 are made in a multiplex (simultaneous detection in a single biological fluid sample ); cf. Example 10 below.
  • Some markers of the prior art, such as A2M have a very high serum concentration: their quantification can not be done in multiplex with markers whose serum concentration is much lower, such as HA and CXCLIO.
  • the combinations of biomarkers described in the application enable them to be implemented in a multiplex.
  • a specific ligand of this circulating molecule can be used.
  • This ligand can directly carry a detection marker (such as a chemiluminescent marker or a fluorophore).
  • This ligand may be used as capture ligand and / or detection ligand.
  • This ligand may for example be a molecule or an organic complex, or a molecule or an inorganic complex.
  • this ligand may be a protein (more particularly an antibody, more particularly a monoclonal antibody or a polyclonal antibody), a polysaccharide, a lipid, or a complex of protein (s) and / or polysaccharide (s) and / or or lipid (s).
  • proteins that specifically bind to HA such as an anti-HA (polyclonal or monoclonal) antibody, or such as recombinant human protein Aggrecan [G1-IGD-G2 protein sold by R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), catalog number 1220-PG-025] can be used as ligands.
  • one or more antibodies can be used as ligands.
  • This (or these) antibodies can bind specifically to one, more or all of the circulating forms of CXCL10.
  • an antibody polyclonal or monoclonal which specifically binds to one, more or all of the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9, more particularly to all the proteins of SEQ ID NO : 4 to 9 [e.g., human anti-CXCL10 mouse monoclonal antibody, commercially available from R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under catalog number MAB266 (clone 33036, Class IgG)].
  • the biological markers further comprise one or more additional marker (s), which are not circulating molecules, more particularly which are not human circulating molecules (cf. above), this or these additional marker (s) are also quantified.
  • the quantification value of this, or each of these, additional marker (s) may be determined by measuring or collecting it for or on said subject, by for example by collecting the quantization value of this or each of these additional marker (s) previously measured for or on said subject.
  • the quantization value of this marker can be determined (or previously determined) by collecting the age value of said subject [ for example, a value expressed in number of years (whole number or with decimal (s))].
  • the quantization value of this marker can be determined (or previously determined) by assigning a quantization value to the (female) nature. or male) of the sex of the subject [eg, value of 0 for a female, and value of 1 for a male].
  • the quantification value of this marker can be determined (or previously determined) by measuring in vitro the value of the charge or hepatitis virus concentration (more particularly, in HCV and / or HCV and / or HDV, more particularly HCV) in a sample of biological fluid previously obtained from said subject (human), more particularly by measuring in vitro the value of the quantity of hepatitis virus in a biological fluid sample previously obtained from said subject (human) and determining the value of this load or viral concentration.
  • the value of this hepatitis virus load may, for example, be expressed in copies / ml or in IU / ml, or in multiples of one of these units, such as in 10 3 copies per ml.
  • this or each of these additional marker (s) is advantageously the value of this marker on the date on which said biological fluid was taken to measure in vitro the concentrations of each of said circulating molecules (human), more particularly on the date on which said biological fluid was taken to measure in vitro the concentrations of HA and the protein CXCL10. Determination of hepatic fibrosis stage from quantification values of biological markers
  • the quantification values of the selected biomarkers are compared with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject in the of these reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging.
  • Said reference cohorts comprise or are:
  • a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed said light fibro- losis stage ie a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, are of Fl score, and
  • a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds the mild fibrosis stage that is, a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds that of the hepatic fibrosis stages. which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of score F1).
  • the quantification values of the selected biomarkers are compared with a predetermined value ("cut-off” or "threshold"), predetermined for the classification of said subject in either the first cohort is the second cohort.
  • the classification in the first cohort determines or indicates that the hepatic fibrosis stage of said subject did not exceed the stage of portal fribrose without septa.
  • the classification in the second cohort determines or indicates that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal fribrose without septa.
  • the individuals of said reference cohorts are individuals of the same species as said subject [for example humans, if said subject is a human], and are infected with one or more hepatitis viruses which belong to different genotypes.
  • the individuals of said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least two different genotypes, more particularly at least three, more particularly at least four, more particularly at least five, more particularly at least six, more particularly at least seven different genotypes.
  • individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least four different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, and 4.
  • individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least five different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, 4 and 5.
  • individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least six different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6.
  • Individuals of said first reference cohort include at least individuals whose hepatic fibrosis stage is that of fibroid without septa (Fl score according to the Metavir fibrosis scoring system).
  • the individuals of said first reference cohort may therefore consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fribrose without septa [F1 score according to the Metavir fibrosis scoring system].
  • Individuals of said first reference cohort may therefore consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa and of individuals who are infected with one or more hepatitis viruses and / or have hepatitis (more particularly chronic hepatitis), but who do not have hepatic fibrosis [F0 and F 1 scores according to the Metavir fibroids scoring system].
  • Individuals of said second reference cohort include at least individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fibroids with septa (s) (F2 score according to the Metavir fibrosis scoring system).
  • Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fribrose without septa [F2 score according to the Metavir fibrosis scoring system].
  • Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa and individuals whose hepatic fibrosis stage is that of septal fribrose without cirrhosis [F2 scores and F3 according to the Metavir fibrosis scoring system].
  • Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa, of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of septal fribrose without cirrhosis and individuals whose hepatic fibrosis stage is that of cirrhosis [F2, F3 and F4 scores according to the Metavir fibrosis scoring system].
  • the total number of individuals, which form said first reference cohort and said second reference cohort may be at least 100, more preferably at least 200, advantageously at least 300.
  • Each of these two cohorts consists of a plurality of individuals and represents 30% to 70% of the total population of individuals (the total of the individuals in the first and second reference cohorts being 100%). .
  • the total number of individuals constituting the first reference cohort and the second reference cohort is 100, the first reference cohort 30 individuals, and the second reference cohort 70 individuals.
  • each of these two cohorts consists of a plurality of individuals and represents 40%> to 60%> of the total population of the individuals, more particularly 40%> to 55%, more particularly 45% to 55%, more particularly 45% to 50%) of the total population of the individuals (the total of the individuals of said first reference cohort and said second reference cohort being 100%).
  • the number of individuals who make up the first and second reference cohorts is more than 300, and the first reference cohort consists of 40 to 60% of this total population of over 300 individuals (the second reference cohort is then the number of individuals that represents the complementary percentage to reach a total of 100%).
  • a demand method is therefore a method (in vitro) to determine (more particularly to determine with high probability) whether the hepatic fibrosis stage of a (human) subject infected with one or more hepatitis viruses and / or or has hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has not passed the stage of mild fibrose, or if it has on the contrary exceeded this stage, said stage of slight fibrosis being that of portal fribrose without septa ( according to the Metavir score of hepatic fibrosis, the stage The non-septal portal fibroose is the score Fl), said method comprising the following steps:
  • circulating molecules comprising or consisting of hyaluronic acid (HA) and protein CXCL10 (see “Circulating Molecules", “Selected Biological Markers” and “Detection and Quantification of Biological Markers” above),
  • ii) comparing the concentration values thus obtained for each of said circulating molecules, with their values, or with the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of those reference cohorts with respect to which he has the highest probability of belonging, said reference cohorts comprising or being: a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed said stage of slight fibrose, and
  • the classification in said second cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal friosis without septa.
  • a demand method is a method (in vitro) for determining (more particularly to determine with high probability) whether the hepatic fibrosis stage of a (human) subject infected with one or more hepatitis viruses. and / or hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has not passed the stage of mild fibrose, or if it has on the contrary exceeded this stage, said light fibroosis stage being that of portal fibrose without septa (according to the Metavir score of hepatic fibrosis, the stage of septal fiebrose without septa is the score Fl), said method comprising the following steps:
  • step i) b) above when one, two, three, four or five additional markers are chosen from said list of step i) b) above, and when said marker (s) additional (s) is (are) or include one or more marker (s) among age, Body Mass Index and liver hardness: by collecting the quantification value of this or each of these marker (s) additional (s) which has been previously determined for or on the subject,
  • step i) b) above when one, two, three, four or five additional markers are chosen from said list of step i) b) above, and when said marker (s) additional (s) is (are) or include the viral load: by measuring this viral load in vitro in a sample of biological fluid previously obtained from said subject, or by collecting the value of this viral load which has been previously determined for said subject,
  • step iii) comparing the quantification values obtained in step ii) with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of these cohorts of reference to which it has the highest probability of belonging, said reference cohorts comprising or being:
  • the classification in said second cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal friosis without septa.
  • BMI Body Mass Index
  • CV load. virus
  • FS liver hardness
  • no additional markers are selected, or additional liver hardness marker, or additional age and BMI markers, or additional age, BMI, and viral load markers are selected.
  • the different biological markers selected in step i) may for example comprise or consist of:
  • HA hyaluronic acid
  • CXCL10 CXCL10 protein
  • HA hyaluronic acid
  • CXCL10 protein
  • age and BMI or
  • HA hyaluronic acid
  • CXCL10 protein
  • age hyaluronic acid
  • CV viral load
  • HA hyaluronic acid
  • CXCL10 CXCL10 protein
  • FS liver hardness
  • This comparison can in particular be made by classification, more particularly by combining the assay (or measurement) values obtained for said subject in a classification model, more particularly in a multivariate classification model.
  • Such a classification model compares (in a combined manner) the assay values obtained for said subject with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to their hepatic fibrosis score, to classify said subject. in that of these reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging, for example by attributing to it an output value indicative of the hepatic fibrosis score of said subject.
  • Such a classification model may be constructed, in particular previously constructed, by making an inter-cohort comparison of the assay values obtained for said reference cohorts or distributions of these assay values.
  • such a classification model can be constructed, in particular previously constructed, by measuring or collecting the quantification values of the biological markers in pre-established reference cohorts according to their hepatic fibrosis score, and by analyzing these assay values, or their distribution, by a statistical method for constructing a classification model, more particularly a multivariate classification model, which induces or determines a hepatic fibrosis score from said quantification values.
  • a classification model can be (previously) constructed by: - setting up at least two pre-established reference cohorts according to the stage (or degree or score) of hepatic fibrosis,
  • a first reference cohort consisting of individuals whose hepatic fibrosis stage does not exceed said light fibrosis stage
  • a second reference cohort consisting of individuals whose hepatic fibrosis stage exceeds said light fibrosis stage (cf. "Determination of hepatic fibrosis stage from quantification values of biological markers" above),
  • said classification model can be (previously) constructed as follows:
  • a first reference cohort in which the stage (or degree or score) of liver fibrosis of the individuals does not exceed the stage of portal fiabrosis without septa (i.e., not exceeding the Metavir F1 fibrogen score), and
  • a second reference cohort in which the stage (or degree or score) of liver fibrosis of individuals exceeds the stage of portal fiabrosis without septa (i.e. exceeding the Metavir F1 fibrin score); ⁇ ) for each of said individuals, quantifying the different biological markers selected in step i) of claim 1,
  • step ⁇ making an inter-cohort comparison of the quantification values obtained in step ⁇ ), or the distribution of these values, to construct a classification model, which, based on quantification values of said selected biomarkers (more particularly , from the combination of these values), induces a ranking in one of said reference cohorts.
  • Said comparative step can be performed by classifying the quantification values obtained for said subject in a classification model, more particularly a multivariate classification model for assigning to said subject a score (Z) indicating whether the stage (or degree) of liver fibrosis said subject has or has not passed said light fibrosis stage.
  • Said classification model may be a model which, from the combination of the quantification values of said biological markers, induces a score value (Z) from the combination of the quantification values of said selected biological markers.
  • said comparison step can be performed by applying to the quantization values obtained for said subject a predetermined classification decision rule for classifying said subject in that of said reference cohorts with respect to which he has the highest probability of belonging (more particularly, to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
  • This decision rule can be a rule that compares the quantification values obtained for the selected biomarkers, with one or more predetermined threshold values by classification, to classify said subject in that of said reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging (ie to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
  • a model can be constructed by a mathematical function, a non-parametric technique, a heuristic classification procedure or a probabilistic prediction approach.
  • a typical example of a classification based on the quantification of biological markers is the discrimination of "healthy" versus "sick" subjects.
  • These characteristic values may for example represent protein concentration values and / or clinical and / or anatomical data and / or virological data.
  • Each sample 3 ⁇ 4 is associated with a discrete value y representing the clinical status of the individual i.
  • yi 0 if the patient has a liver fibrosis score F1
  • yi 1 if the patient has a liver fibrosis F2 score.
  • a model provides a decision rule (for example, a mathematical function, algorithm, or procedure) that uses the information available from Xj to predict yj in each sample observed. The aim is to use this model to predict the clinical status of the patient p, ie, p , from the available biological and / or clinical values, ie x p .
  • said decision rule of classification can for example be:
  • a linear or non-linear mathematical function in particular a linear mathematical function, such as a function generated by the mROC method (multivariate ROC method), or
  • regression method linear or nonlinear, such as, for example, logistic regression, more specifically logistic regression implementing an affine function (LOGIT);
  • a method of classification by learning or artificial intelligence for example, a learning or artificial intelligence algorithm, a non-parametric or heuristic classification method, or a probabilistic prediction method such as:
  • a decision tree such as the CART (Classification And Regression Tree) method
  • boosting method based on binary classifiers (eg Adaboost) or a method linked to boosting (bagging); or
  • KNN k-nearest neighbors
  • WKNN weighted k-nearest neighbors
  • SVM Support Vector Machines
  • Random Forest Random Forest or RF
  • a neural network (Neural Network); or
  • the multivariate ROC method is a generalization of the Receiver Operating Characteristic (ROC) method (see Reiser and Faraggi 1997, Su and Liu 1993, Shapiro, 1999). It calculates the area under the Area Under the Curve (AUC) curve for a linear combination of biomarkers and / or biomarker transformations (in the case of normalization), under the assumption of a normal distribution multivariate.
  • the mROC method has in particular been described in Kramar et al. 1999 and Kramar et al. 2001.
  • the mROC software version 1.0 available commercially from the designers (A. Kramar, A. Fortune, D. Farragi and B. Reiser) can for example be used to build a model mROC.
  • Andrew Kramar and Antoine Fortune can be contacted at, or via, the Biostatistics Unit of the Regional Center for the Fight against Cancer (CRLC) Val dAurelle - Paul Lamarque (208, rue des Apothicaires, Parc Euromédecine, 34298 adjoin Cedex 5; France). David Faraggi and Benjamin Reiser can be contacted at, or through, the Department of Statistics at Haifa University (Mount Carmel, Haifa 31905, Israel).
  • CRLC Biostatistics Unit of the Regional Center for the Fight against Cancer
  • Logistic regression (LR) using an affine function, or LOGIT function is a binomial regression model (Berkson 1944, Berkson 1951).
  • the family of artificial intelligence or machine learning methods is a family of algorithms which, instead of making explicit generalizations, compare the examples of a new problem with the examples considered in learning and which were stored in memory. These algorithms directly construct the hypotheses from the learning examples themselves.
  • a CART model is a decision tree.
  • An example is presented in Figure 12.
  • the quantification value of each biomarker (BMQi) is compared to a succession of threshold values (parameters h, i and j in Figure 12) which, following the decision tree, allows to classify the sample tested (in Figure 12: score ⁇ F2, or score> F2).
  • KN k-nearest neighbors
  • WKNN weighted k nearest neighbors
  • Random Forest (Random Forest or RF) consists of a set of simple prediction trees, each of which is able to produce an answer when presented with a subset of predictors (Breiman 2001, Liaw and Wiener 2002). The calculations are done with the software R. This software can be used to build RF models.
  • a neural network consists of an oriented weighted graph whose nodes symbolize the neurons.
  • the network is built from examples of each class (for example example, F2 versus Fl), and is then used to determine which class a new element belongs to; cf. Intrator and Intrator 1993, Riedmiller and Braun 1993, Riedmiller 1994, Anastasiadis et. al. 2005; cf. http://cran.r-project.org/web/packages/neuralnet/index.html.
  • the R software freely available at http://www.r-project.org/, (version 1.3 of Neuralnet, written by Stefan Fritsch and Frauke Guenther, following the work of Marc Suling) can for example be used to build a network of neurons.
  • the comparison of the quantification values of the selected biomarkers with their values or the distribution of their values in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject in that of these reference cohorts. for which he has the highest probability of belonging can therefore be achieved by following a method, and / or using an algorithm or software:
  • a non-linear function such as for example an affine function (for example, a LOGIT logistic regression), or
  • said comparison can therefore be carried out in particular by following a method, and / or by using an algorithm or software:
  • logistic regression (more particularly logistic regression implementing an affine function LOGIT),
  • mROC logistic regression
  • logistic regression more particularly logistic regression implementing an affine function LOGIT
  • CART logistic regression
  • Each of these algorithms, software or methods makes it possible to construct a classification model, based on the quantification values of each of said cohorts of reference, and combining the quantification values obtained on said subject in this model to induce the classification or the liver fibrosis score of said subject.
  • Example 7 more particularly Tables 20, 21 and 23
  • the classification model implemented is a multivariate classification model implementing a mathematical function, such as mROC or logistic regression (more particularly logistic regression). implementing an affine function LOGIT).
  • the classification model implemented is a model using automatic learning or artificial intelligence, such as CART.
  • the means of the request more particularly the selection of biological markers of demand, make it possible to achieve very good classification performance of said subject.
  • said comparison of the quantification values of said subject with their values, or with the distribution of their values, in said reference cohorts is made by classifying said subject in that of said reference cohorts vis-à- which it has the highest probability of belonging with a sensitivity (Se) and / or a Negative Prediction Value (VPN) and / or a specificity (Southeastern) and / or a Positive Prediction Value (VPP) and / or an area under the ROC curve (AUC) and / or a particularly good classification rate (CBR).
  • Sensitivity Se
  • Specificity Spe
  • Positive Prediction Value PV
  • Negative Prediction Value VPN
  • Area Under the ROC Curve AUC
  • Rate of Good classification CBR Rate
  • Negative test said light fibrose stage is not exceeded.
  • PPV represents the probability that the test subject actually passed the mild fibrosis stage (Metavir score of liver fibrosis of at least F2), knowing that the means of the request indicate that it has passed the said stage of mild fibrose (score Metavir of liver fibrosis of at least F2) [positive test result].
  • VPN therefore represents the probability that the test subject did not actually exceed the mild fibrosis stage (Metavir score of hepatic fibrosis of at most Fl), given that the means of the request indicate that it did not exceed that level. mild fibrosis (Metavir score of liver fibrosis of at least F2) [negative test result].
  • the rate of good classification is the percentage of correctly classified patients.
  • AUC Area under the ROC curve
  • AUC Area Under the Curve
  • Said comparison of the quantification values of said subject with their values, or the distribution of their values, in said reference cohorts can be made by following a classification model as described above.
  • said comparison can be made according to a function mROC, a function LOGIT or a tree CART, in particular a function mROC Z ⁇ to Z 13 , a function LOGITi to LOGIT 4 , a tree CARTi to CART 4 as described below .
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of less than 70%, not less than 75%, not less than 76%, not less than 77%, not less than 78%, not less than 80%, not less than 82% or not less than 83%.
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76%, of at least 77%, of at least 78% at least 80%, at least 82% or at least 83%.
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Negative Prediction Value (VPN) of at least 70%, of at least 75 %, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 80%, at least 81%, at least 82% or at least 83% .
  • VPN Negative Prediction Value
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Negative Prediction Value (NPV) of at least 75%, at least 76%, of at least 77%, at least 78%, at least 80%, at least 81%, at least 82% or at least 83%.
  • NPV Negative Prediction Value
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity of at least 59%, of at least 70%, of at least 71%, at least 80%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 89%, at least 90% or at least %.
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity of at least 85%, of at least 86%, of at least 87%, of at least 89%, at least 90% or at least 91%.
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Positive Prediction Value (VPP) of at least 54%, of at least 61 %, at least 62%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 90% or at least 91% .
  • VPP Positive Prediction Value
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a prediction value.
  • Positive (PPV) of at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 90% or at least 91%>.
  • said comparison is made (for example by m OC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above). ) and / or with a Negative Prediction Value (NPV) of at least 75% (as described above).
  • a sensitivity of at least 76% (as described above).
  • NPV Negative Prediction Value
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a specificity (Spe) of at least 59% (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a specificity (Spe) of at least 85%> (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a VPP of at least 54% (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a PPV of at least 85% (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPP of at least 54% (as described above).
  • a specificity Spe
  • VPP VPP
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPP of at least 85% (as described above).
  • Spe specificity
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a VPP of at least 54% (as described above).
  • a specificity Spe
  • VPP VPP
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a PPV of at least 85% (as described above).
  • a specificity Spe
  • PPV PPV
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPN of at least 75% (as described above).
  • a specificity Spe
  • a VPN at least 75%
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a VPN of at least 75% (as described above).
  • a specificity Spe
  • a VPN at least 75%
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a VPN of at least 75% (as described above) and / or a VPP at least 54% (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a VPN of at least 75% (as described above) and / or a VPP at least 85% (as described above).
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and with a VPN of at least 75% (as described above), as well as:
  • said comparison can be made (for example by mROC or logistic regression) by classifying said subject with an area under the ROC curve (AUC) of at least 0.700, of at least 0.704, from minus 0.720, not less than 0.729, not less than 0.730, not less than 0.731, not less than 0.840, not less than 0.844, not less than 0.860, not less than 0.865, not less than 0.868 at least 0.880, at least 0.882, at least 0.890, at least 0.895, at least 0.898, at least 0.899, at least 0.0900, at least 0.910 at least 0.920, at least 0.921, at least 0.930, at least 0.931, or at least 0.933.
  • AUC area under the ROC curve
  • the combination of only two markers HA and CXCL10 is sufficient to reach an AUC of at least 0.700, more particularly at least 0.704, more particularly at least 0.865 (cf. the examples below).
  • said comparison can be made, for example by mROC or logistic regression, by classifying said subject with an AUC of at least 0.800, more particularly at least 0.865, of at least 0.868, of at least 0.880, at least 0.882, at least 0.890, at least 0.895 or at least 0.898.
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a good classification rate (CBR rate) of at least 60%>, of at least 66 %>, at least 70%>, at least 72%, at least 73%, at least 75%, at least 77%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 85%, at least 86%, at least 88% or at least 89%.
  • CBR rate good classification rate
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a good classification rate (BCR rate) of at least 80%, of at least 81%, from 82%, at least 83%, at least 85%, at least 86%, at least 88% or at least 89%. All combinations of minimum sensitivity value and / or VPN and / or specificity and / or VPP are explicitly included in the description of the request.
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) in classifying said subject with a good classification rate of at least 80% and / or an AUC of at least 0.704.
  • said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or tree CART) by classifying said subject with a good classification rate of at least 70%> and / or an AUC of at least minus 0.800, more particularly with a good classification rate of at least 80%> and / or an AUC of at least 0.800.
  • VPP VPP
  • VPN VPN
  • AUC AUC
  • VPP - specificity
  • VPN VPN
  • AUC good classification rate
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) with at least one of the two performances 1 / and 21 below:
  • said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) with at least one of the two performances 1 / and 21 below:
  • a decision rule of the request (that it is mROC, CART, LR or other, cf below), more particularly a function mROC answering the formula of the function Z 10 , Z u , Z 12 or Z 13 ( see below), has a rate of unclassified patients of 0%.
  • a decision rule of the request (whether it is mROC, CART, LR or other), more particularly a function mROC corresponding to the formula of the function Zio, Zn, Z12 or Zi3, has at least one of its performance of AUC, Good classification rate, sensitivity, VPN, specificity and VPP, which is superior:
  • the inventors demonstrate that the synergistic effect observed with the combination of CXCL10 and HA is not dependent on the fact of implementing a mROC function for the classification of the subject; cf. examples below, including:
  • Example 7 more particularly Tables 20, 21 and 23
  • Example 8 more particularly Table 24.
  • Mathematical function (eg, mROC, logistic regression)
  • a mathematical function can be implemented to perform said step of comparing the quantification values of the biological markers of said subject with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of fibrosis. hepatitis, to classify the subject in that cohort of reference with respect to which he has the highest probability of belonging. The comparison is then made by combining the quantification values of each of the selected biological markers in this mathematical function.
  • This mathematical function can assign to said subject a score (Z), which is then compared to a predetermined threshold value ( ⁇ or cut-off) by multivariate classification, to classify said subject in that of said reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging (more specifically, to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
  • Said mathematical function may for example be a linear function such as a mROC function or a nonlinear function, for example an affine function such as a logistic regression function implementing an affine function LOGIT.
  • BMQ (BMQ - 1) / ⁇ .
  • a mROC function can be formulated as follows:
  • a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0
  • c, d, e, and f each being, independently of each other, a real number ranging from -10.0 to +10.0, ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ , ⁇ Age, ⁇ and ⁇ being each, independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1, 2 but different from zero;
  • the exponent t indicates, according to the use in the field, that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the quantification value measured for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value t ⁇
  • BMQ (BMQ - 1) / ⁇ .
  • the demand mROC functions such as the Zi 3 function above, as well as the Zi 2 to Zi functions described below, have the performance described above (AUC performance and / or bit rate). good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP).
  • the inventors further demonstrate that the performances of the combination of CXCL10 HA are particularly robust (performance of AUC and / or rate of good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP), therefore that the parameters of the mROC function are chosen within the indicated value ranges: cf.
  • Example 9 An example of a Z13 function is as follows:
  • a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0, more preferably from +0.3 to +5.5,
  • c being a real number ranging from -10.0 to +4.0
  • d being a real number ranging from -0.8 to +0.2
  • e being a real number ranging from -0.003 to +0.002
  • f is a real number ranging from +0.0 to +10.0
  • ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ Age, ⁇ and ⁇ being each, independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1, 2 but different from zero;
  • the threshold value of each of the mROC functions of the request may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25.
  • An mROC function of the for example, Z 13 and Z 12 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.704, more particularly a a good classification of at least 72% and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and / or an area under the ROC curve (AUC) of at least 0.898.
  • Mroc a function of the application may for example have more sensitivity at least 70% and / or at least 70% VPN, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%.
  • a mROC function of the request may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%.
  • the threshold value of Z 10 may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 1 to 68 to 23.71. Illustrations of functions Z 10 are presented in Examples 3, 5 and 8 below (functions Z 10 and Z 4).
  • a function Z 10 can for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of at least AUC of at least 0.898, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value of at least 0.868 (cf. Examples 3, 5 and 8 below).
  • a function Z 10 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77% (cf. Examples 1, 3, 5 and 6 below).
  • a function Z 10 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a VPP of at least 90% (cf. Examples 1, 3, 5 and 6 below).
  • function Z 10 is the function:
  • the threshold value of Z 4 may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 15, 170.
  • a Z 4 function may have a good classification rate of at least
  • AUC value of at least 0.704 more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of AUC at least 0.865, more specifically a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.882, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value at least 0.898 (cf. Examples 3, 5 and 8 below).
  • a function Z 4 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a
  • VPN of at least 70%> particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75% %, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77% (cf. examples 3 and 5 below).
  • a function Z 4 may for example have a specificity of at least 59% and / or a
  • VPP of at least 54% more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85% %, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a VPP of at least 90% (cf. examples 3 and 5 below).
  • Z ⁇ threshold value may for example be of -7 to 25, more preferably from 3 to 25, more preferably from 3 to 5, more preferably 3.382.
  • the function Z ⁇ may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC of at least 0.704 (cf. example 1 below).
  • Function can for example have a sensitivity of at least 78% and / or a
  • VPN of at least 81% (cf. example 1 below).
  • Function can for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54% (cf. example 1 below).
  • function Z 13 is the function:
  • the threshold value of Z 7 can for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 13.5.
  • a function Z 7 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more specifically a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 82% and a value of at least AUC of at least 0.865 (cf. example 6 below).
  • a function Z 7 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77%.
  • a function Z 7 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a PPV of at least 90%.
  • function Z 13 which is also an example of function Z 12 , is as follows:
  • the threshold value of Zn can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17.
  • a function Zn can for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72%> and a value of 'AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and a value of AUC of at least 0.882, more particularly a good classification rate of at least 83%> and an AUC value of at least 0.899 (see Examples 1, 3, 6, 7 and 8 below). ).
  • a Zn function may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%. >, more particularly a sensitivity of at least 76%> and / or a VPN of at least 75%>, more particularly a sensitivity of at least 80%> and / or a VPN of at least 78%> ( see examples 1, 3, 6 and 7 below).
  • a Zn function may have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70%, and / or a VPP of at least 61%.
  • %> more particularly a specificity of at least 85%> and / or a VPP of at least 85%>, more particularly a specificity of at least 86%> and / or a VPP of at least 86%> more particularly a specificity of at least 87%> and / or a VPP of at least 88%> (see Examples 1, 3, 6 and 7 below).
  • the threshold value of Z 3 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from -5.730.
  • the function Z 3 may for example have a classification good rate of at least 66% and / or an AUC of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value. at least 0.729, more particularly a classification good rate of not less than 73% and an AUC of not less than 0.731, more particularly a good classification rate of not less than 80% and an AUC value of at least 0.868 (cf. Examples 1 and 8 below).
  • the function Z 3 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%. , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 83% (cf. example 1 below).
  • the function Z 3 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 71% and / or a VPP of at least 62% (cf. example 1 below).
  • the threshold value of Z 5 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 16.543.
  • a Z5 function may have a good classification rate of at least
  • an AUC value of at least 0.704 more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0.868, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0,882, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value of at least 0,899 (cf. Examples 1, 3, 7 and 8 below).
  • a function Z 5 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75% , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 80% and / or a VPN of at least 78% (cf. Examples 1, 3 and 7 below).
  • a function Z 5 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 87% and / or a VPP of at least 88% (cf. Examples 1, 3 and 7 below).
  • the threshold value of Z 8 can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
  • a function Z 8 may have a good classification rate of at least
  • a function Z 8 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75% , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 80% and / or a VPN of at least 78%.
  • a function Z 8 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 87% and / or a PPV of at least 88%.
  • function Z 13 which is also an example of function Z 12 , is as follows:
  • the threshold value of Z 2 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
  • a function Z 2 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729 (cf. example 1 below).
  • a function Z 2 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 82% (cf. example 1 below).
  • a Z 2 function may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61% ⁇ cf. example 1 below).
  • function Z 13 which is also an example of function Z 12 , is as follows:
  • FS being the quantization value of liver hardness, for example in kDa
  • the threshold value of Z 6 can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
  • a function Z 6 may for example have a good classification rate of at least 66%) and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of AUC of at least 0.868, more particularly a good classification rate of at least 86% and an AUC value of at least 0.931 (cf. example 5 below).
  • a function Z 6 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 83% and / or a VPN of at least 81% (cf. example 5 below).
  • a function Z 6 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 89% and / or a PPV of at least 90% (cf. example 5 below).
  • function Z 13 which is also an example of function Z 12 , is as follows:
  • FS being the quantization value of liver hardness, for example in kDa
  • the threshold value of Z 9 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
  • a function Z9 can for example have a good classification rate of at least 66%) and / or a value of AUC of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 85% and a value of AUC of at least 0.868 (cf. example 6 below).
  • a function Z 9 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75% (cf. example 6 below).
  • a function Z 9 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%> , more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86% (see Example 6 below). -Dessous).
  • a logistic regression function can have the following form:
  • BMQi and BMQ 2 are two different bio markers (for example CXCL10 and HA), and in which Intercept, k and 1 are the numerical values of the constants of the logistic regression function.
  • a logistic regression function can be:
  • the threshold value of each of the LOGIT functions of the request may for example be 0.5.
  • a logistic demand regression function (using the affine LOGIT function), in particular LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 , can for example have a good classification rate of at least 66% and / or a area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72%> and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.882.
  • AUC area value under the ROC curve
  • a logistic regression function of the demand more particularly
  • LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 may have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% o and / or or a VPN of at least 75%>, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%.
  • a logistic regression function of the demand more particularly
  • LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 may for example have a specificity of at least 59% o and / or a VPP of at least 54%>, more particularly a specificity of at least 70% o and / or or a VPP of at least 61%>, more particularly a specificity of at least 85% o and / or a VPP of at least 85%>, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP at least 86%.
  • Machine learning can be used to compare the quantification values of biomarkers with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject. in those cohorts of reference to which he has the highest probability of belonging.
  • Said machine learning can be a learning by decision tree, more particularly by decision tree CART.
  • the quantization values obtained for said subject are each compared to a threshold value which is specific to the characteristic of the marker whose value is, following a decision tree, more particularly a decision tree CART.
  • This decision tree (more particularly this decision tree CART), more particularly said threshold values of this tree, can be [previously] determined by automatic learning, more particularly by establishing a decision tree (more particularly by setting up a decision tree).
  • a tree CART from the quantization values, or from the distribution of the quantization values, of said reference cohorts, more particularly of said first and second reference cohorts.
  • a decision tree, more particularly a decision tree CART can therefore be defined by a succession of threshold values, which are ordered according to a decision tree.
  • a decision tree implementing the markers HA and CXCLIO can be defined by three threshold values:
  • a first threshold value for example, h
  • the quantization value of one of the two bio markers for example, the quantization value of HA
  • said automatic learning can be a decision tree CART, which comprises a decision threshold h for the marker HA and decision thresholds i and j for the marker CXCL10, said thresholds h, i and j being as follows: if the quantization value of HA for said subject is less than h, the threshold of the marker CXCL 10 is j, and:
  • said subject is classified in said first cohort (Metavir fibrosis score ⁇ F2) if the quantization value of CXCL 10 is less than j, said subject is classified in said second cohort (Metavir fibro> F2 score) if the quantization value of CXCL 10 is greater than or equal to j, and
  • the threshold of the marker CXCL 10 is i
  • said subject is classified in said first cohort (Metavir fibrosis score ⁇ F2) if the quantification value of CXCL 10 is less than i, said subject is classified in said second cohort (Metavir fibrose score>
  • the CART tree is that of Figure 12, with:
  • the CART tree is that of Figure 12, with:
  • the CART tree is that of Figure 12, with:
  • a CART tree of the demand may for example have a good classification rate of at least 66%, more particularly at least 72%, more particularly from less than 80%, more particularly at least 83%, more particularly at least 84%, more particularly at least 85%.
  • a CART tree of the application may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%), more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%), more particularly a sensitivity of at least 77% and / or a VPN of at least 77%), more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 78%), more particularly a sensitivity of at least 82% and / or a VPN of at least 80%.
  • a CART tree of demand may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%), more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%), more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%), more particularly a specificity of at least 86%. % and / or a VPP of at least 86%), more particularly a specificity of at least 89% and / or a VPP of at least 90%), more particularly a specificity of at least 91% and / or a VPP of at least 91%.
  • Combination of machine learning and mathematical function can be made by combining machine learning and mathematical function, for example by combining decision tree and linear or non-linear function.
  • a decision tree more particularly by a CART tree, for one or at least one marker chosen from the viral load, the age, the BMI and the hardness of the liver, more particularly for (at least) the hardness marker of the liver then
  • linear or affine function more particularly by mROC or logistic regression, for markers chosen as described above, more particularly for at least the CXCL10 and HA markers.
  • the method begins with a step of measuring the hardness of the liver of said subject, for example by FIBROSCAN TM.
  • This step makes it possible, for example, to determine whether the liver of said subject is or is not suffering from cirrhosis (Metavir F4 stage). If he does not have cirrhosis, that is, if the hepatic fibrosis stage of said subject is less than the Metavir F4 score, a biological fluid sample can be analyzed to quantify the biological markers chosen as the above described, more particularly for at least CXCLIO and HA, so as to further determine his hepatic fibrosis stage (Metavir score of F0 or Fl, or Metavir score of F2 or F3). If the liver of said subject is suffering from cirrhosis (detected by measuring the hardness of the liver), the implementation of an analysis of a sample of biological fluid appears redundant, and is therefore not necessary.
  • the application relates to products, reagents or ligands for the detection and / or quantification of the selected biomarkers, more particularly to reagents or ligands which bind specifically to circulating molecules.
  • bio markers as described above, as well as manufactured articles, compositions, pharmaceutical compositions, kits, tubes, solid supports comprising such reagents or ligands, as well as computer systems (in particular computer program product and computer device), which are specially adapted to the implementation of the methods or products of the application.
  • the application relates in particular to a ligand which specifically binds to a bio-label which is a circulating molecule as described above, for example a ligand which specifically binds to HA or a ligand which binds in a specific manner.
  • CXCL10 more particularly to human CXCL10 protein. More particularly, this ligand specifically binds to the circulating form of this molecule, or if there are several, to at least one, to several, or all circulating forms of this molecule.
  • this ligand makes it possible not only to specifically detect the selected biomarker, but also to quantify it.
  • This ligand can in particular be a protein, a polypeptide, a peptide, for example an antibody (monoclonal or polyclonal), an antibody fragment, a recombinant protein, an aptamer, a polysaccharide, a lipid, or a combination of these products. More particularly a protein, an antibody (monoclonal or polyclonal), an antibody fragment or a recombinant protein.
  • Antibodies may for example be produced by immunization of a non-human mammal (such as a rabbit) with a protein encoded by said selected gene, or with an antigenic fragment of such a protein, optionally associated with or coupled to an adjuvant immunization (such as Freund's adjuvant or such as KLH -keyhole limpet hemocyanin-), for example by intraperitoneal or subcutaneous injection, and by collecting the antibodies thus obtained in the serum of said mammal.
  • an adjuvant immunization such as Freund's adjuvant or such as KLH -keyhole limpet hemocyanin-
  • Monoclonal antibodies can be produced according to a lymphocyte hybridization technique (hybridomas) such as the Kohler and Milstein 1975 (cf. also US 4,376,110), the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al., 1983, Cole et al., 1983), or the technique for immortalizing lymphocytes using the Epstein-Barr virus - EBV (Cole et al., 1985).
  • lymphocyte hybridization technique such as the Kohler and Milstein 1975 (cf. also US 4,376,110), the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al., 1983, Cole et al., 1983), or the technique for immortalizing lymphocytes using the Epstein-Barr virus - EBV (Cole et al., 1985).
  • Such antibodies may for example be IgG, IgM, IgE, IgA, IgD or any subclass of these immunoglobulins.
  • Genetically engineered antibodies can be produced, such as re
  • the antibodies used in the invention may be antibody fragments or artificial derivatives of such fragments, insofar as these fragments or derivatives have said specific binding property.
  • Such fragments may for example be Fab, F (ab ') 2, Fv, Fab / c, scFv (single chain Fragment variable) fragments.
  • ligands include antibodies that bind specifically to CXCL10, such as:
  • each of these antibodies can be implemented as a capture ligand and / or as a detection ligand.
  • ligands include proteins that specifically bind to HA, such as the recombinant human G1-IGD-G2 aggrecan protein marketed by R & D Systems Inc., Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413; under the catalog number 1220-PG-025, or the HABP protein (HA binding protein; protein derived from bovine cartilage) marketed by UNITED STATES BIOLOGICAL (4 Technology Way, Salem, MA 01970, U.S.A.) under the catalog number H7980-30.
  • HA recombinant human G1-IGD-G2 aggrecan protein
  • R & D Systems Inc., Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413; under the catalog number 1220-PG-025, or the HABP protein (HA binding protein; protein derived from bovine cartilage) marketed by UNITED STATES BIOLOGICAL (4 Technology Way, Salem, MA 01970, U.S.A.) under the catalog
  • this recombinant protein can be used as a capture ligand and / or as a detection ligand.
  • Each of said ligands may further comprise at least one marker for their detection, more particularly at least one detection marker which is not naturally present in the ligand structure, for example at least one entity selected from fluorophores (eg ATTO TM 550, ATTO TM 663, ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany), chromophores, enzymes (eg, peroxidase) horseradish, alkaline phosphatase), radioactive elements, isotopes of chemical elements.
  • fluorophores eg ATTO TM 550, ATTO TM 663, ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
  • chromophores eg, enzymes (eg, peroxidase) horseradish, alkaline phosphatase), radioactive elements, isotopes of chemical elements.
  • the application also relates to a set or association of at least two ligands, namely a first ligand that specifically binds to one of the selected circulating molecules and a second ligand that specifically binds to another of the circulating molecules selected, for example all or combination of a ligand specific for HA and a ligand specific for CXCLIO.
  • Each of said first and second ligands may or may not carry a marker for detection.
  • Said first and second ligands can each carry a marker for their detection. They can each wear the same marker, or wear different markers.
  • Said ligands may be in a mixture, or in separate forms or physically separated from each other, for example in combined preparation for simultaneous, separate or delayed use.
  • the combination or combination does not contain a ligand that binds to a circulating protein that would not be part of the circulating molecules selected as biomarkers as described above. More particularly, according to this embodiment, the combination or combination does not contain a ligand that binds to a circulating protein other than HA or CXCL10. More particularly, according to this embodiment, the combination or combination does not contain a ligand which binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM.
  • This set or combination may further include means for detecting and / or measuring viral load in hepatitis virus (e.g., HCV and / or HBV and / or HDV).
  • means for detecting and / or measuring viral load in hepatitis virus e.g., HCV and / or HBV and / or HDV.
  • the application also relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit each comprising at least one ligand or at least one set or combination of ligands of the application. More particularly, the application relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which are each adapted to the multiplex detection of circulating molecules, that is to say of molecules contained in acellular form in a ( sample of) biological fluid, such as CXCL10 and HA (cf. "Circulating Molecules" above).
  • the application relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which each comprise:
  • a first ligand for example, a first protein
  • a first ligand which specifically binds to one of the selected circulating molecules
  • a first ligand more particularly, a first protein, more particularly an antibody
  • binds in a manner specific to CXCL10 and
  • a second ligand for example, a second protein
  • a second ligand which specifically binds to another of the selected circulating molecules, for example a second ligand (more particularly, a second protein), which specifically binds to HA.
  • the application relates more particularly to an article of manufacture, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which each comprise this first ligand and this second ligand, as a combination product (or in combined form, or in combined preparation), in particular for their simultaneous use, separate or spread over time, especially for their simultaneous use in time.
  • the manufactured article, the composition, the pharmaceutical composition or the kit does not contain a ligand that would bind to a circulating protein that would not be part of the circulating molecules selected as bio-markers as described above. . More particularly, according to this embodiment, the manufactured article, composition, pharmaceutical composition or kit does not contain a ligand that would bind to a circulating protein other than HA or CXCL10. More particularly, the manufactured article, the composition, the pharmaceutical composition or the kit does not contain a ligand that binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4.
  • TIMP1 VIM
  • SPP1 AST
  • ApoA1 IL6ST
  • p14ARF p14
  • MMP9 ANGPT2
  • CXCL11 MMP2
  • MMP7 S100A4
  • TIMP1 CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 or MMP1.
  • the application is thus related to a manufactured article which is adapted to the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a (sample of) fluid biological, and which comprises a solid support on which ligands of said molecules are attached.
  • Said manufactured article may for example be:
  • kits in particular a kit comprising one or more tubes,
  • a solid or semi-solid support for example of plastic, polystyrene, polypropylene, glass, silicon, nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) or polymer, or comprising a magnetic material such as iron oxide, such as :
  • a well plate or microplate for example made of polypropylene and / or polystyrene, more particularly a well plate or microplate suitable for titration and / or high throughput screening (High Throughput Screening Microplates),
  • a chip or microarray integrated circuit made of conductive or semiconductor material, more particularly a wafer chip (or microarray) of silicon, more particularly a silicon chip (or microarray),
  • a capillary more particularly a glass capillary
  • a membrane for example, a nitrocellulose or PVDF membrane.
  • microplates for high throughput screening can be used (see Example 10).
  • the wells of these microplates have the ability to adsorb biomolecules, especially proteins. They generally have excellent thermal and chemical stability as well as excellent optical properties. They are generally made of polystyrene and / or polypropylene.
  • Each microplate contains a plurality of wells, generally 96 wells. These microplates are designed to receive rows of drops of said first and second ligands, whose volume is less than 100 nL per drop (usually 50 nL per drop). A robot spoofer can be used to drop these rows of drops.
  • the manufactured article can for example be in the form of a manufactured article that is suitable for the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a (sample of) biological fluid with a volume less than or equal to 500 ⁇ _ (more particularly lower than or equal to 400 ⁇ , more particularly less than or equal to 100 ⁇ ), wherein said solid support comprises a plurality of liquid sample receiving zones, said zones being fluidly independent of each other and each being adapted to the reception of a single liquid sample per zone, the maximum volume of liquid sample that each zone can receive not exceeding 500 ⁇ , (more particularly less than or equal to 400 ⁇ , more particularly less than or equal to 100 ⁇ ), and in which at least one of said liquid sample receiving zones comprises both said first ligand and said second ligand (More particularly, said first protein and said second protein).
  • Said liquid sample receiving zones may for example be the wells of a plate or microplate for titration and / or high throughput screening, the spot receiving wells of a silicon chip, the cylindrical portions of a capillary glass, a membrane, a glass slide, a tube.
  • said first ligand and said second ligand may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support in a configuration in which only one and even a liquid sample with a volume less than or equal to 500 ⁇ _ (more particularly less than or equal to 400 ⁇ , more particularly less than or equal to 100 ⁇ ) can contact both said first protein and said second protein.
  • said first ligand (more particularly, said first protein) may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support at a first attachment site
  • said second ligand (more particularly, said second protein) may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support at a second attachment site, wherein said first attachment site is in fluidic contact with said second attachment site.
  • the ligands of circulating molecules that are contained in an article of manufacture does not comprise a ligand that binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 or MMP1.
  • the ligands of circulating molecules that are contained in a manufactured article consist of:
  • a first ligand e.g., a first protein
  • HA binds specifically to HA
  • a second ligand for example, a second protein, more particularly an antibody
  • a second ligand for example, a second protein, more particularly an antibody
  • a manufactured article further includes instructions (e.g., an instruction sheet) for quantifying the molecules to which the ligands specifically bind, e.g. to quantify CXCL10 and HA, more particularly instructions (e.g. instructions) to quantify these molecules and determine a liver fibrosis stage or score from the obtained quantization values.
  • instructions e.g., an instruction sheet
  • CXCL10 and HA more particularly instructions (e.g. instructions) to quantify these molecules and determine a liver fibrosis stage or score from the obtained quantization values.
  • Said manufactured article may further include one or more of the following:
  • a needle and / or a syringe more particularly a needle and / or a syringe for taking an intracorporeal fluid, such as blood, and / or
  • a needle adapted for hepatic cytopuncture for example a needle of diameter 18 to 22G, and / or
  • a needle and / or catheter and / or biopsy gun adapted to the PBH; a computer or software program product, in particular a computer program product or statistical analysis software, for example a computer program product of the invention as hereinafter described.
  • the application also relates to a composition adapted to the detection of molecules in multiplex, more particularly to the detection in multiplex of molecules contained in acellular form in a fluid (such as the molecules CXCL10 and HA), which comprises in mixture: a first ligand carrying a first detection marker, and
  • the first detection marker may be the same or different from the second detection marker.
  • the first ligand and the second ligand are each specific for a different circulating molecule (circulating molecule selected as bio-label as described above).
  • said first ligand is a ligand (e.g., a protein) that specifically binds to HA and said second ligand is a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that binds specifically to CXCL10 (human), more particularly a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that specifically binds to one, at least one, or all of the circulating forms of the CXCL10 protein (human).
  • a ligand e.g., a protein
  • an antibody e.g., a protein, more particularly an antibody
  • first and second ligands may for example be used as detection ligands (for example, in the context of detection in sandwich configuration with capture ligands, see article manufactured above, see Example 10).
  • the application also relates to a kit, which includes:
  • nucleic acids which specifically bind to one or more hepatitis viruses, and which further comprises
  • ligands which bind to molecules contained in acellular form in a biological fluid, said ligands being contained in the kit in combined preparation for separate, delayed or simultaneous use over time, more particularly for simultaneous use in time, more particularly for use in a mixture.
  • Said ligands which bind to molecules contained in acellular form in a biological fluid are constituted by:
  • the first detection marker may be the same or different from the second detection marker.
  • the first ligand and the second ligand are each specific for a different circulating molecule (circulating molecule selected as bio-label as described above). More particularly, said first ligand is a ligand (e.g., a protein) that specifically binds to HA and said second ligand is a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that binds specifically to CXCL10 (human), more particularly a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that specifically binds to one, at least one, or all of the circulating forms of the CXCL10 protein (human).
  • a ligand e.g., a protein
  • an antibody e.g., a protein, more particularly an antibody
  • first and second ligands may for example be used as detection ligands (for example, in the context of detection in sandwich configuration with capture ligands, see article manufactured above, see Example 10).
  • the kit may further include a manufactured article as described above.
  • the application also relates to said ligand, together or combination of ligands, manufactured article, composition, pharmaceutical composition, kit for their use in a method for detecting or diagnosing liver disease which involves tissue damage of the liver, more particularly hepatic fibrosis, more particularly for determining the hepatic fibrosis score of a subject, more particularly liver fibrosis, more particularly for determining whether or not the liver fibrosis score of a subject has exceeded that of mild fibrosis, more particularly for determining whether fibrosis Hepatitis of a subject has a Metavir fibrosis score of at most Fl or at least F2.
  • the application also relates to said ligand, together or combination of ligands, manufactured article, composition, pharmaceutical composition, kit for their use in a method for the treatment of hepatopathy which involves tissue damage of the liver, more particularly liver fibrosis.
  • This use can include:
  • said ligand (s) in a method of the invention to determine whether or not the liver fibrosis score of a subject has exceeded that of mild fibrosis, more particularly to determine whether hepatic fibrosis a subject has a Metavir fibrosis score of at most Fl or at least F2, and
  • a treatment aimed at blocking the progression of hepatic fibrosis such as a treatment comprising standard or pegylated interferon, as monotherapy, or in combination therapy combining ribavirin
  • a treatment aimed at blocking the progression of hepatic fibrosis such as a treatment comprising standard or pegylated interferon, as monotherapy, or in combination therapy combining ribavirin
  • Metavir of at least F2 may further include not administering this treatment if, or as long as, this score does not exceed that of mild fibrose.
  • This treatment can for example be:
  • pegylated interferon alpha-2b such as PEG-INTRON®, Schering Plow Corporation, Kenilworth, NJ
  • ribavirin REBETOL®
  • pegylated interferon alpha-2a such as PEGASYS®, Roche Corp., F.Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland
  • pegylated interferon alpha-2a such as PEGASYS®, Roche Corp., F.Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland
  • the duration of treatment may for example be at least 24 weeks, for example 24 weeks for HCV genotype 2 or 3, or 48 weeks for HCV genotype 1, 4 or 5, or for a patient who does not respond to treatment after 24 weeks.
  • the application also relates to a medicament or combination drug intended for the treatment of hepatopathy involving tissue involvement of the liver, more particularly liver fibrosis (such as standard interferon or pegylated interferon, as monotherapy, or in combination therapy combining one or more other drugs.
  • active ingredients especially ribavirin
  • hepatopathy is understood in its ordinary meaning, namely an attack of the liver, more particularly tissue damage of the liver, more particularly liver lesions, including liver fibrosis.
  • the demand is particularly directed to chronic liver diseases (chronic attacks of the liver of 6 months or more).
  • liver fibrosis Different diseases cause and / or lead to liver damage, such as liver fibrosis.
  • liver fibrosis Different diseases cause and / or lead to liver damage, such as liver fibrosis.
  • liver fibrosis Different diseases cause and / or lead to liver damage, such as liver fibrosis.
  • liver fibrosis may be mentioned:
  • chronic viral hepatitis (including chronic hepatitis B, chronic hepatitis C, chronic hepatitis D;
  • steatosis and steatohepatitis associated with metabolic syndrome, obesity, diabetes).
  • alcoholic hepatitis steatosis and steatohepatitis (associated with metabolic syndrome, obesity, diabetes).
  • biliary diseases primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangie
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • the application is more particularly adapted to viral hepatitis, especially hepatitis C virus (HCV) and / or virus B (HBV) and / or virus D (HDV), including viral hepatitis to at least HCV (and optionally to HBV and / or VHD).
  • HCV hepatitis C virus
  • HBV hepatitis C virus
  • HBV virus B
  • HDV virus D
  • the application also relates to a computer program product intended to be stored in a memory of a processing unit, or to a removable memory medium intended to cooperate with a reader of said processing unit.
  • the computer program product includes instructions for implementing a method or a product of the application, in particular for the implementation of a statistical analysis adapted to the implementation of a method of the invention.
  • the invention [in particular adapted to the statistical analysis (multivariate) of the selected biomarkers] and / or for the construction of a classification model (multivariate) adapted to the implementation of a method or a product of the invention.
  • the application also relates to a computer installation, a computing device, or a computer, comprising a processing unit in the memory of which are stored or recorded:
  • EXAMPLE 1 Establishment and Application of HA + CXCL10 Combinations to a Population of Patients with a Fibrosis Degree Established by Hepatic Biopsy Puncture (PBH)
  • the patient population consisted of patients from Beaujon Hospital (100 boulevard du General Leclerc, 92110 Clichy, France) who had chronic hepatitis following infection with the Hepatitis C virus (HCV), and who all, or most HCV genotypes.
  • HCV Hepatitis C virus
  • the liver fibrosis score of these patients was established by Punction Biopsy Hepatic (PBH). This population consisted of 118 patients, of whom 73 had F1 fibrosis score, and 45 had F2 fibrosis score (PBH score based on the F Metavir score system, two independent readings by a confirmed pathologist). The studies carried out have been approved by the Local Ethics Committee in accordance with the Declaration of Helsinki. All patients gave their informed consent in writing.
  • Table 1 The characteristics of these 118 patients are presented in Table 1 below. Table 1:
  • Serum concentrations of CXCL10 protein and hyaluronic acid (HA) were measured in the serum of these patients using commercially available ELISA kits (solid phase sandwich).
  • the kit that was used was the QUANTIKINE® HUMAN CXCL10 / IP-10 ELISA kit, marketed by R & D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under the catalog number DIP100.
  • HYALURONAN QUANTIKINE® ELISA kit marketed by R & D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under the catalog reference DHYALO.
  • the serum concentration values of CXCL10 and HA were combined according to the mROC method, in order to establish a decision rule allowing to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis ⁇ F2) and those with non-significant fibrose. (Metavir score of hepatic fibrosis ⁇ F2).
  • the serum concentrations of CXCL10 and HA were also combined according to the mROC method to clinical parameters, such as body mass index (BMI), age at time of collection (age) and viral load of the patient. patient at the date of sampling (CV), in order to establish a decision rule allowing to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis ⁇ F2), and those with non-significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis ⁇ F2).
  • the mROC method is the Multivariate Receiver Operating Characteristic method, described in particular by Kramar et al. 1999 and Kramar et al. 2001.
  • BMQ biomarkers
  • HA serum hyaluronic acid concentration, expressed in ng / mL
  • CXCL10 serum concentration of protein CXCL10, expressed in pg / mL
  • Age age of the patient at the date of collection
  • BMI Body Mass Index of the patient at the date of collection (mass / height 2 )
  • CV Viral load of the patient at the date of sampling, expressed in 10 3 copies per mL
  • this patient is assigned to the Metavir class of hepatic fibrosis greater than or equal to F2, if the value of this Z function for this patient is greater than or equal to the value of the threshold maximizing the Youden index ( ⁇ ) which is associated with this function Z,
  • this patient is assigned to the class Metavir liver fibrosis scores lower than F2, if the value of this function Z for this patient is less than the value of the threshold ⁇ .
  • this Z function for a given patient is less than the threshold value of 3.322, this patient is assigned to the Metavir class of hepatic fibrosis less than F2.
  • AUC AUC of 0.704 for HA + CXCL10 combination without other marker [AUC of 0.729 for HA + CXCL10 + IMC + Age, and AUC of 0.731 for HA + CXCL10 + IMC + Age + CV], versus
  • VPN of 81% for HA + CXCL10 combination without other marker [82% or 83% sensitivity for combination HA + CXCL10 + IMC + Age or HA + CXCL10 + IMC + Age + CV] versus
  • VPN of 77% for CXCLIO used individually and 76% for HA used individually.
  • HA with CXCL10 optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomic (s) and / or virologic marker (s)), provided excellent performance in determining hepatic fibrosis stage.
  • additional markers clinical marker (s) or anatomic (s) and / or virologic marker (s)
  • EXAMPLE 2 Comparison with Publicly Available Noninvasive Tests (Same Patient Population as Example 1) The 118 patients in Example 1 were tested for comparison with liver fibrosis assay tests that were otherwise performed. publicly available (commercially available tests, or described in scientific articles).
  • the HEPASCORE TM test is commercially available from QUEST DIAGNOSTICS (3 Giralda Farms, Madison, NJ 07940, U.S.A.), and is described in Adams et al. 2005.
  • BIOPREDICTIVE 40, rue du Bac, 75007 Paris, France
  • BIOPREDICTIVE 40, rue du Bac, 75007 Paris, France
  • the SHASTA test is described in Kelleher et al. 2005.
  • A2M concentration of alpha 2 macro globulin
  • GGT concentration of gamma glutamyl transpeptidase
  • APOA1 concentration of apo lipoprotein Al
  • Hapto haptoglobin concentration
  • Bilirubin total bilirubin concentration
  • ASAT concentration of aspartate aminotransferase
  • Platelets platelet concentration
  • HA concentration of hyaluronic acid
  • Age age at the date of collection
  • biomarkers including 5 including 4 of which 3
  • Table 5 below furthermore compares these results with those obtained with the combination of the HA + CXCL10 bio markers (HA + CXCL10 combinations of Example 2 above) for the same patient population.
  • HA HA to CXCLIO makes it possible to achieve diagnostic performance that is at least comparable to, or even greater than, the tests that are currently publicly available, in particular in terms of the overall rate of good classification, good classification rate, sensitivity and VPN.
  • HA to CXCLIO presents in particular, the advantage of requiring the assay of only two biomarkers (HA and CXCL10), whereas for the HEPASCORE TM assay, four biomarkers must be assayed (A2M, GGT, Bilirubin and HA).
  • HA with CXCL10 presents a performance of improved sensitivity compared to the HEPASCORE TM test.
  • the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s))) therefore has diagnostic performance at least as satisfactory than those of the two tests that are currently the most used, namely HEPASCORE TM and FIBROTEST TM, while being much simpler (and therefore faster, less expensive, and safer) to implement.
  • Example 1 A population of patients independent of that of Example 1 was constituted. This independent population consisted of 310 patients from Hôpital Haut-Lévêque (1 Magellan Avenue, 33600 Pessac, France) with chronic hepatitis following infection with the Hepatitis C virus (HCV), and all of whom or most HCV genotypes.
  • HCV Hepatitis C virus
  • Hepatic Biopsy Puncture HBC is almost no longer used at this time, the fibrosis stage was determined using a combination of non-invasive tests based on different principles (blood tests and imaging), as recommended by the scientific community (see Castera 2012).
  • the multivariate classification algorithm of Castera et al. is that described in Castera et al. 2010 and Castera et al. 2014. It is based on the agreement between the results of FIBROTEST TM (blood test) and FIBROSCAN TM (imaging).
  • This algorithm allows the classification of patients into two classes (absence or presence of significant fibrosis) when the noninvasive FIBROTEST TM and FIBROSCAN TM tests are concordant.
  • the algorithm of Castera et al. recommend to practice a BPH.
  • the algorithm of Castera et al. has been modified by adding a second level of analysis. This second level of analysis is for samples that give rise to discordant results by the FIBROTEST TM and FIBROSCAN TM tests.
  • This second level of analysis implements several non-invasive tests, namely FIBROTEST TM (FT), FIBROSCAN TM (FS), HEPASCORE TM (HS), APRI and FORNS.
  • the FIBROSCAN TM test is an imaging technique that uses pulse elastography to determine the hardness of the liver (expressed in kPa equivalent of fibrosis); cf. Castera et al. 2005.
  • the FIBROSCAN TM device is marketed by ECHOSENS (30 place d'Italie, 75013 Paris, France).
  • At the second level of analysis at least three of these tests (at least three of FIBROTEST TM (FT), FIBROSCAN TM (FS), HEPASCORE TM (HS), APRI and FORNS) are applied to the samples that gave results. discordant at the end of the first level of analysis. The fibrosis stage obtained with each of these tests was thus determined. The stage mostly identified by all these tests was allocated to the sample analyzed. In the absence of a majority, the modified algorithm plans to allocate to the sample the label "stage of non determined fibrosis".
  • Table 6 The characteristics of the 310 patients are shown in Table 6 below. Table 6:
  • Serum CXCL10 and HA concentrations were combined according to the mROC method to establish a decision rule that discriminates between patients with significant fibrosis (Metavir ⁇ F2 score) and those with non-significant fibrosis (Metavir score ⁇ F2).
  • the serum CXCL10 and HA concentration values were also combined according to the mROC method with clinical parameters, such as body mass index at the time of collection (BMI), and the patient's viral load at the time of collection. (CV), in order to establish a decision rule allowing to discriminate the patients presenting a significant fibrosis (score Metavir ⁇ F2), of those presenting a non significant fibrosis (score Metavir ⁇ F2).
  • BMI body mass index at the time of collection
  • CV patient's viral load at the time of collection.

Abstract

The application relates to hepatic fibrosis, specifically to hepatic fibrosis that may appear in a patient infected with one or more hepatitis viruses and/or who is suffering from hepatitis, specifically chronic hepatitis. The application provides methods and means for determining the stage (or degree) of hepatic fibrosis of such a patient. Specifically, the methods and means of the application make it possible to determine whether or not the stage (or degree) of hepatic fibrosis of the patient has exceeded the stage of light fibrosis. The methods and means of the invention use a combination of biomarkers such as, in particular, the CXCL10 protein and hyaluronic acid (HA).

Description

TITRE  TITLE
COMBINAISON SYNERGIQUE DE BIOMARQUEURS POUR LA DÉTECTION ET L'ÉVALUATION D'UNE FÏBROSE HÉPATIQUE DOMAINE DE L'INVENTION SYNERGISTIC COMBINATION OF BIOMARKERS FOR THE DETECTION AND EVALUATION OF A HEPATIC FIBROSE FIELD OF THE INVENTION
La demande est relative aux fïbroses hépatiques, plus particulièrement aux fîbroses hépatiques qui peuvent être présentes chez un sujet infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou qui est atteint d'hépatite, plus particulièrement d'hépatite chronique. The application relates to liver fibrosis, more particularly to hepatic fibrosis which may be present in a subject infected with one or more hepatitis viruses and / or who has hepatitis, more particularly chronic hepatitis.
La demande fournit des méthodes et moyens pour déterminer le stade (ou degré) de fïbrose hépatique d'un tel sujet. Plus particulièrement, les méthodes et moyens de la demande permettent de déterminer si le stade (ou degré) de fïbrose hépatique de ce sujet a ou non dépassé le stade de la fïbrose légère.  The application provides methods and means for determining the stage (or degree) of hepatic fibrosis of such a subject. More particularly, the methods and means of the application make it possible to determine whether or not the stage (or degree) of hepatic fibrosis of this subject has passed the stage of mild fibrose.
Les méthodes et moyens de l'invention mettent en œuvre une combinaison de biomarqueurs, tels que notamment la protéine CXCL10 et l'acide hyaluronique (HA).  The methods and means of the invention implement a combination of biomarkers, such as in particular the protein CXCL10 and hyaluronic acid (HA).
ARRIÈRE-PLAN DE L'INVENTION BACKGROUND OF THE INVENTION
Diverses pathologies causent, ou conduisent à, des lésions tissulaires du foie, connues sous le nom de fïbrose hépatique. Une fïbrose hépatique résulte notamment d'une accumulation excessive de composés moléculaires de la matrice extracellulaire altérée dans le parenchyme hépatique. Various pathologies cause, or lead to, tissue lesions of the liver, known as hepatic fibrosis. Hepatic fibrosis results in particular from an excessive accumulation of molecular compounds of the altered extracellular matrix in the hepatic parenchyma.
Le stade d'atteinte tissulaire du foie, plus particulièrement la nature et l'étendue des lésions tissulaires hépatiques, est évalué par un score de fïbrose hépatique, notamment par le système de score F Metavir, qui comprend 5 stades de F0 à F4 {cf. tableau 25 ci- dessous). La détermination du score de fïbrose hépatique revêt un caractère primordial pour le praticien, puisqu'il s'agit d'un score pronostique.  The stage of liver tissue involvement, more particularly the nature and extent of hepatic tissue lesions, is assessed by a hepatic fibrosis score, in particular by the F Metavir scoring system, which comprises 5 stages of F0 to F4 (cf. . Table 25 below). The determination of the hepatic fibrosis score is of paramount importance for the practitioner, since it is a prognostic score.
En effet, c'est la base de cette détermination qui permet au praticien de parvenir à la décision d'administrer ou de ne pas administrer de traitement en vue de traiter ces lésions, ou à tout le moins en vue de pallier leurs effets. C'est également sur cette base que le praticien décide d'initier un traitement. Notamment, lorsque le score de fïbrose Metavir est d'au plus Fl (fïbrose légère), le praticien décide généralement de ne pas administrer de traitement, alors que, lorsque le score de fïbrose Metavir est d'au moins F2, il est préconisé d'administrer un traitement, et cela quel que soit le degré d'activité nécrotico- inflammatoire. Or, les traitements susceptibles d'être administrés entraînent des effets secondaires majeurs pour le patient (traitements incluant l'interféron) ou leur coût est très élevé (nouveaux agents antiviraux). Indeed, it is the basis of this determination that allows the practitioner to reach the decision to administer or not administer treatment to treat these lesions, or at least to mitigate their effects. It is also on this basis that the practitioner decides to initiate a treatment. In particular, when the Metzir fibrosis score is not more than mild fibrosis, the practitioner generally decides not to administer a treatment, whereas, when the Metavir fibrosis score is at least F2, it is recommended to treatment, irrespective of the degree of necrotic activity. inflammatory. However, the treatments that can be administered lead to major side effects for the patient (treatments including interferon) or their cost is very high (new antiviral agents).
Dans ce contexte, pouvoir déterminer de manière fiable si un patient a ou non dépassé le stade de la fïbrose légère est d'une importance cruciale pour le patient.  In this context, being able to reliably determine whether or not a patient has passed the stage of mild fibrosis is of crucial importance to the patient.
Or, s'il est relativement aisé d'identifier le stade de la cirrhose (score de fïbrose Metavir F4), par exemple par élastographie impulsionnelle (FIBROSCAN™), il est par contre beaucoup plus difficile de distinguer de manière non invasive mais pourtant cliniquement fiable :  However, while it is relatively easy to identify the stage of cirrhosis (Metavir F4 fibrosis score), for example by impulse elastography (FIBROSCAN ™), it is much more difficult to distinguish noninvasively but clinically. reliable:
- les stades pour lesquels la fïbrose est tout au plus légère (score de fïbrose Metavir - the stages for which fibrosis is at most light (Metavir fibrosis score)
F0 ou Fl) F0 or Fl)
- des stades de fïbrose avancée (score de fïbrose Metavir F2 ou F3).  - stages of advanced fibrosis (fibrosis score Metavir F2 or F3).
Il existe différents tests non invasifs qui peuvent être appliqués en clinique à un patient pour tenter de déterminer le stade de fïbrose hépatique. Ils mettent en œuvre différents biomarqueurs.  There are various non-invasive tests that can be applied clinically to a patient to try to determine the hepatic fibrosis stage. They implement different biomarkers.
Le biomarqueur HA est par exemple mis en œuvre dans les tests cliniques ELF™ (US 7 141 380 B2), HEPASCORE™ (Adams et al. 2005 ; US 2007/0225919 Al), FIBROSPECT™ (US 6 986 995 B2), FIBROMETER™ (US 8 489 335 B2) et SHASTA™ (Kelleher et al. 2005).  For example, the HA biomarker is used in clinical trials ELF ™ (US 7,141,380 B2), HEPASCORE ™ (Adams et al., 2005, US 2007/0225919 A1), FIBROSPECT ™ (US 6,986,995 B2), FIBROMETER ™ (US 8,489,335 B2) and SHASTA ™ (Kelleher et al., 2005).
Ces tests ne mettent toutefois pas en œuvre la protéine CXCL10.  These tests, however, do not implement the CXCL10 protein.
En effet, la protéine CXCL10 est essentiellement connue comme étant un bio marqueur de la réponse à la thérapie anti-VHC par interféron, et n'a que peu été décrit dans le cadre de la fïbrose hépatique.  Indeed, the CXCL10 protein is essentially known to be a bio-marker of the response to anti-HCV therapy by interferon, and has been poorly described in the context of hepatic fibrosis.
HA a la capacité d'induire l'expression de la protéine CXCL10. Ainsi, une augmentation de HA induit une augmentation de CXCL10. Les concentrations des deux molécules évoluent toutes deux dans le même sens (l'augmentation de la concentration de HA entraîne l'augmentation de la concentration en CXCL10). Il n'était donc a priori pas attendu que la combinaison de ces deux molécules à titre de bio marqueurs conduise à un résultat supplémentaire par rapport à celui qui serait obtenu avec seulement l'une des deux molécules. Or, la présente demande décrit l'obtention d'un effet synergique allant au-delà de la simple juxtaposition des deux molécules à titre de biomarqueurs.  HA has the ability to induce the expression of the CXCL10 protein. Thus, an increase in HA induces an increase in CXCL10. The concentrations of the two molecules evolve in the same direction (the increase in the concentration of HA causes the increase in the concentration of CXCL10). It was therefore not expected a priori that the combination of these two molecules as biomarkers lead to an additional result compared to that which would be obtained with only one of the two molecules. However, the present application describes the obtaining of a synergistic effect going beyond the simple juxtaposition of the two molecules as biomarkers.
En outre, l'art antérieur décrit des essais qui cherchent à associer la protéine CXCL10 à d'autres biomarqueurs pour tenter de discriminer de manière fiable les scores de fïbrose Metavir F0-F1 des scores de fïbrose Metavir F2-F4, et rapporte que ces essais sont infructueux (Zeremski et al. 2009, page 179, colonne de gauche, première phrase : « The combination of multiple parameters did not improve the ability to identify patients with minimal fibrosis »). L'objet de la présente demande a donc surmonté un préjugé technique. In addition, the prior art describes assays that seek to associate the CXCL10 protein with other biomarkers in an attempt to reliably discriminate scores. Metavir F0-F1 fibrosis scores Metavir F2-F4 fibrosis, and reports that these trials are unsuccessful (Zeremski et al., 2009, page 179, left column, first sentence: "The combination of multiple parameters did not improve the ability to identify patients with minimal fibrosis "). The purpose of this application has thus overcome a technical bias.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION SUMMARY OF THE INVENTION
La demande est relative à des méthodes et moyens qui permettent de déterminer le stade (ou degré) de fïbrose hépatique d'un sujet, plus particulièrement de déterminer si le stade (ou degré) de fïbrose hépatique dudit sujet a ou non dépassé le stade de la fïbrose légère. The application relates to methods and means for determining the stage (or degree) of hepatic fibrosis of a subject, in particular to determine whether or not the stage (or degree) of liver fibrosis of said subject has progressed beyond the stage of light fibrose.
Les inventeurs ont identifié des biomarqueurs particuliers à cet effet, tels que CXCLIO (ligand 10 à chémokine (motif CXC)) et HA (acide hyaluronique ou hyaluronan). Les inventeurs ont plus particulièrement identifié des combinaisons particulières de biomarqueurs qui, telle la combinaison de CXCLIO à HA, conduisent à un effet synergique.  The inventors have identified particular biomarkers for this purpose, such as CXCL10 (chemokine ligand (CXC motif)) and HA (hyaluronic acid or hyaluronan). The inventors have more particularly identified particular combinations of biomarkers which, like the combination of CXCL10 with HA, lead to a synergistic effect.
En effet, les inventeurs démontrent notamment que la combinaison du marqueur CXCLIO au marqueur HA conduit à des performances qui vont au-delà de la simple juxtaposition de leurs performances individuelles respectives (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP). Des démonstrations expérimentales sont présentées dans les exemples ci-dessous, notamment :  Indeed, the inventors demonstrate in particular that the combination of the CXCLIO marker with the HA marker leads to performances that go beyond the simple juxtaposition of their respective individual performances (AUC performance and / or rate of good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP). Experimental demonstrations are presented in the examples below, including:
- en exemple 1 {cf. Tableau 3),  - in example 1 {cf. Table 3),
- en exemple 3 {cf. Tableaux 8 et 10), et  - in example 3 {cf. Tables 8 and 10), and
- en exemple 7 {cf. Tableaux 20 et 21).  - in example 7 {cf. Tables 20 and 21).
Les inventeurs démontrent que l'effet synergique observé avec la combinaison de CXCLIO et HA n'est pas dépendant du fait de mettre en œuvre une fonction m OC pour la classification du sujet ; cf. les exemples ci-dessous, notamment :  The inventors demonstrate that the synergistic effect observed with the combination of CXCL10 and HA is not dependent on the fact of implementing an m OC function for the classification of the subject; cf. examples below, including:
- l'exemple 7, plus particulièrement les Tableaux 20, 21 et 23,  Example 7, more particularly Tables 20, 21 and 23,
- l'exemple 8, plus particulièrement le Tableau 24.  Example 8, more particularly Table 24.
Les inventeurs démontrent que les performances de la combinaison de CXCLIO à HA sont particulièrement robustes (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP): cf. exemple 9 ci- dessous. Des comparaisons avec des tests non invasifs de l'art antérieur sont par ailleurs présentées en exemples 2 et 4 ci-dessous. The inventors demonstrate that the performances of the combination of CXCL10 HA are particularly robust (performance of AUC and / or rate of good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP): cf. Example 9 below. Comparisons with non-invasive tests of the prior art are also presented in Examples 2 and 4 below.
Selon un mode de réalisation avantageux, la détection de HA et celle de CXCLIO sont faites en multiplex : cf. exemple 10 ci-dessous. Certains marqueurs de l'art antérieur, tels que A2M, ont une concentration sérique très élevée et ne peuvent donc pas être mis en œuvre en multiplex avec des marqueurs dont la concentration sérique est beaucoup plus basse (tels que HA et CXCLIO).  According to an advantageous embodiment, the detection of HA and that of CXCLIO are made in multiplexes: cf. Example 10 below. Some markers of the prior art, such as A2M, have a very high serum concentration and therefore can not be implemented in multiplex with markers whose serum concentration is much lower (such as HA and CXCLIO).
Les moyens de l'invention comprennent notamment :  The means of the invention comprise in particular:
des méthodes qui comprennent la quantification des biomarqueurs sélectionnés (tels que notamment CXCLIO et HA) ;  methods that include quantification of selected biomarkers (such as in particular CXCL10 and HA);
des produits ou réactifs qui sont spécialement adaptés à cette quantification ;  products or reagents that are specially adapted for this quantification;
des articles manufacturés, des compositions, des compositions pharmaceutiques, des kits, des tubes, des supports solides comprenant de tels produits ou réactifs, ainsi que  manufactured articles, compositions, pharmaceutical compositions, kits, tubes, solid supports comprising such products or reagents, as well as
- des systèmes informatiques (notamment, produit programme d'ordinateur et dispositif informatique), qui sont spécialement adaptés à la mise en œuvre des moyens de l'invention.  computer systems (in particular, a computer program product and a computing device), which are specially adapted to the implementation of the means of the invention.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
La Figure 1 présente la distribution de la concentration sérique en protéine CXCLIO selon le score de fîbrose hépatique établi par Ponction Biopsie Hépatique (PBH) (score Metavir Fl ou F2) pour une population de 118 patients {cf. exemple 1 ci-dessous). Figure 1 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the hepatic fibrosis score established by Puncture Hepatic Biopsy (PBH) (Metavir F1 or F2 score) for a population of 118 patients (cf. example 1 below).
La Figure 2 présente la distribution de la concentration sérique en acide hyaluronique (HA) selon le score de fîbrose hépatique établi par PBH (score Fl ou F2) pour une population de 118 patients {cf. exemple 1 ci-dessous). Figure 2 shows the distribution of the serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the hepatic fibrosis score established by PBH (Fl or F2 score) for a population of 118 patients (cf. example 1 below).
La Figure 3 présente un modèle ou algorithme de classification qui permet de déterminer le stade de fîbrose hépatique sans avoir recours à la PBH (score Metavir de fîbrose hépatique < F2 ou > F2). Ce modèle ou algorithme a été mis au point par modification de l'algorithme décrit par Castera et al. (Castera et al. 2010 et Castera et al. 2014). En sus du premier niveau d'analyse (FIBROTEST™ et FIBROSCAN™), ce modèle ou algorithme modifié comprend un deuxième niveau d'analyse, pour le traitement (sans PBH) de ceux des échantillons qui donnent des résultats discordants au premier niveau d'analyse {cf. exemple 3 ci-dessous). Figure 3 presents a classification model or algorithm that can be used to determine the stage of liver fibrosis without the use of PBH (Metavir score of liver fibrosis <F2 or> F2). This model or algorithm was developed by modifying the algorithm described by Castera et al. (Castera et al., 2010 and Castera et al., 2014). In addition to the first level of analysis (FIBROTEST ™ and FIBROSCAN ™), this modified model or algorithm includes a second level of analysis, for the treatment (without PBH) of those samples which give discordant results at the first level of analysis (cf. example 3 below).
La Figure 4 présente la distribution de la concentration sérique en protéine CXCLIO selon le degré de fîbrose hépatique (score Metavir < F2 ou > F2) pour une population de 310 patients {cf. exemple 3 ci-dessous).  Figure 4 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the degree of liver fibrosis (Metavir score <F2 or> F2) for a population of 310 patients (cf. example 3 below).
La Figure 5 présente la distribution de la concentration sérique en acide hyaluronique (HA) selon le degré de fîbrose hépatique (score Metavir < F2 ou > F2) pour une population de 310 patients [cf. exemple 3 ci-dessous].  Figure 5 shows the distribution of serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the degree of hepatic fibrosis (Metavir score <F2 or> F2) for a population of 310 patients [cf. example 3 below].
La Figure 6 présente un modèle ou algorithme de classification qui permet de déterminer de manière fine le stade de fîbrose hépatique sans avoir recours à la PBH (score Metavir de fîbrose hépatique F0-F1 ou F2-F3 ou F4). Ce modèle ou algorithme a été mis au point par modification de l'algorithme décrit par Boursier et al. 2012. En sus du premier niveau d'analyse (FIBROTEST™ et FIBROSCAN™), ce modèle ou algorithme modifié comprend un deuxième niveau d'analyse, pour le traitement (sans PBH) de ceux des échantillons qui donnent des résultats discordants au premier niveau d'analyse {cf. exemple 6 ci-dessous).  Figure 6 presents a classification model or algorithm that can be used to fine-tune the stage of liver fibrosis without the use of PBH (Metavir score of liver fibrosis F0-F1 or F2-F3 or F4). This model or algorithm was developed by modifying the algorithm described by Boursier et al. 2012. In addition to the first level of analysis (FIBROTEST ™ and FIBROSCAN ™), this modified model or algorithm includes a second level of analysis, for processing (without PBH) of those samples that give discordant results at the first level of analysis (cf. example 6 below).
La Figure 7 présente la distribution de la concentration sérique en protéine CXCLIO selon le degré de fîbrose hépatique (score Metavir F0-F1 ou F2-F3 ou F4) pour une population de 310 patients {cf. exemple 6 ci-dessous).  Figure 7 shows the distribution of the serum CXCL10 protein concentration according to the degree of liver fibrosis (Metavir F0-F1 or F2-F3 or F4 score) for a population of 310 patients (cf. example 6 below).
La Figure 8 présente la distribution de la concentration sérique en acide hyaluronique (HA) selon le degré de fîbrose hépatique (score Metavir F0-F1 ou F2-F3 ou F4) pour une population de 310 patients {cf. exemple 6 ci-dessous). Figure 8 shows the distribution of the serum hyaluronic acid (HA) concentration according to the degree of hepatic fibrosis (Metavir score F0-F1 or F2-F3 or F4) for a population of 310 patients (cf. example 6 below).
Les Figures 9, 10 et 11 présentent chacune un modèle ou algorithme de classification comprenant la combinaison du marqueur HA et du marqueur CXCLIO, pour la classification de patients en fonction de leur stade de fîbrose hépatique (score Metavir de fîbrose hépatique F0-F1 ou F2-F3).  FIGS. 9, 10 and 11 each present a classification model or algorithm comprising the combination of the HA marker and the CXCL10 marker, for the classification of patients according to their stage of liver fibrosis (Metavir score of F0-F1 or F2 liver fibrosis). -F3).
Ce modèle ou algorithme peut en outre comprendre une étape préalable permettant de classer les patients selon que leur score Metavir de fîbrose hépatique est inférieur à F4, ou est égal à F4, par exemple par mesure de la dureté du foie, par exemple par FIBROSCAN™.  This model or algorithm may further comprise a prior step for classifying patients according to whether their Metavir score of hepatic fibrosis is less than F4, or is equal to F4, for example by measuring the hardness of the liver, for example by FIBROSCAN ™ .
Figure 9 : combinaison de HA et CXCLIO.  Figure 9: Combination of HA and CXCLIO.
Figures 10 et 11 : combinaison de HA, CXCLIO et d'un ou plusieurs autres marqueurs additionnels. Figure 10 : combinaison de HA, CXCL10 et d'un ou plusieurs autres marqueurs additionnels [marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s)], en l'occurrence : Indice de Masse Corporelle (IMC), âge à la date du prélèvement (Âge), Charge Virale à la date du prélèvement (CV). Figures 10 and 11: Combination of HA, CXCLIO and one or more additional markers. Figure 10: Combination of HA, CXCL10 and one or more additional additional markers [clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s)], in this case: Index Body Mass (BMI), Age at Time of Collection (Age), Viral Load at Time of Collection (CV).
Figure 11 : combinaison de HA, CXCL10 et de la mesure de la dureté du foie, mesurée par exemple par FIBROSCAN™ (FS).  Figure 11: Combination of HA, CXCL10 and measurement of liver hardness, as measured for example by FIBROSCAN ™ (FS).
La Figure 12 présente un modèle ou algorithme de classification qui n'est pas basé sur une fonction linéaire : ce modèle ou algorithme est basé sur un modèle de classification CART {Classification And Régression Tree), et comprend la combinaison du marqueur HA et du marqueur CXCL10 {cf. exemple 7 ci-dessous). Figure 12 presents a model or algorithm of classification that is not based on a linear function: this model or algorithm is based on a classification model CART {Classification And Regression Tree), and includes the combination of the marker HA and the marker CXCL10 {cf. example 7 below).
Les Figures 13 A à 16B illustrent les performances de la combinaison HA+CXCL10 à l'aide de la méthode connue sous le nom de Bootstrap {cf. exemple 3 ci-dessous ; 1000 sous-populations de même taille tirées aléatoirement au sein d'une population de 310 patients ; tirage avec remise).  Figures 13A to 16B illustrate the performance of the HA + CXCL10 combination using the method known as Bootstrap (cf. Example 3 below; 1,000 randomly-sized subpopulations randomly drawn from a population of 310 patients; draw with discount).
Les valeurs d'AUC et de taux de bonne classification ont été mesurées : AUC values and good classification rates were measured:
- d'une part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients ceux initialement établis sur la population de 310 patients (« coefficients fixes » ou « coef fïx »), et  - on the one hand, when the decision rule mROC applied has as coefficients those initially established on the population of 310 patients ("fixed coefficients" or "coef fix"), and
- d'autre part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients ceux établis pour chacune des 1000 sous-populations (« coefficients optimisés » ou « coef optim »).  - on the other hand, when the decision rule mROC applied has as coefficients those established for each of the 1000 subpopulations ("optimized coefficients" or "optimum coef").
AUC = aire sous la courbe ROC  AUC = area under the ROC curve
Taux de bonne classification = pourcentage de patients bien classés  Good classification rate = percentage of well-ranked patients
Les Figures 13A et 13B présentent sous forme d'histogrammes les valeurs des différences d'AUC et de précision qui ont été mesurées entre d'une part la règle décisionnelle mROC à « coefficients fixes » (ou « coef fïx ») et d'autre part la règle décisionnelle mROC à « coefficients optimisés » (« coef optim »). Figures 13A and 13B show in the form of histograms the values of the AUC and precision differences that were measured between the "fixed coefficients" (or "coef fx") decision rule and share the decision rule mROC "optimized coefficients" ("coef optim").
En Figures 13 A et 13B, la règle décisionnelle mROC mettait en œuvre la combinaison HA+CXCL10.  In Figures 13A and 13B, the decision rule mROC implemented the HA + CXCL10 combination.
La Figure 13A présente l'histogramme des différences d'AUC avec les coefficients fixes ou optimisés pour la combinaison HA+CXCL10 en Bootstrap (B = 1 000) [axe des abscisses : 0,000 ; 0,005 ; 0,010]. La Figure 13B présente l'histogramme des différences de taux de bonne classification (pourcentage de patients bien classés) avec les coefficients fixes ou optimisés pour la combinaison HA+CXCL10 en Bootstrap (B = 1 000). Figure 13A shows the histogram of AUC differences with coefficients fixed or optimized for the HA + CXCL10 combination in Bootstrap (B = 1000) [abscissa axis: 0.000; 0.005; 0.010]. Figure 13B shows the histogram of good classification rate differences (percentage of well-ranked patients) with fixed or optimized coefficients for the HA + CXCL10 combination in Bootstrap (B = 1000).
Les Figures 14A et 14B présentent sous forme d'histogrammes les valeurs des différences d'AUC et de taux de bonne classification qui ont été mesurées pour la règle décisionnelle mROC à « coefficients fixes » (« coef fix ») entre d'une part la combinaison HA+CXCL10 et d'autre part le marqueur HA seul.  Figures 14A and 14B present in the form of histograms the values of the AUC differences and of the good classification rates which have been measured for the "fixed coefficients" ("coef fix") decision rule mROC on the one hand. combination HA + CXCL10 and secondly the HA marker alone.
La Figure 14A présente l'histogramme des différences d'AUC entre la combinaison HA+CXCL10 d'une part et le marqueur HA seul d'autre part, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fix ») [axe des abscisses : 0,02 ; 0,04 ; 0,06 ; 0,08 ; 0 ,10 ; 0,12].  Figure 14A shows the histogram of AUC differences between the combination HA + CXCL10 on the one hand and the HA marker alone on the other hand, in Bootstrap (B = 1000) with the fixed coefficients ("coef fix") [abscissa axis: 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0, 10; 0.12].
La Figure 14B présente l'histogramme des différences de taux de bonne classification entre la combinaison HA+CXCL10 d'une part et le marqueur HA seul d'autre part, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fix »).  Figure 14B presents the histogram of the differences of rates of good classification between the combination HA + CXCL10 on the one hand and the marker HA alone on the other hand, in Bootstrap (B = 1000) with the fixed coefficients ("coef fix"). ").
La Figure 15 présente l'histogramme des AUC pour la combinaison HA+CXCL10, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fixes ») [axe des abscisses : 0,84 ; 0,86 ; 0,88 ; 0,90 ; 0,92 ; 0,94 ; 0,96] ; cf. exemple 9 ci-dessous. Figure 15 shows the AUC histogram for the HA + CXCL10 combination, in Bootstrap (B = 1000) with the fixed coefficients ("fixed coefficients") [abscissa axis: 0.84; 0.86; 0.88; 0.90; 0.92; 0.94; 0.96]; cf. Example 9 below.
Les Figures 16A et 16B comparent les performances de la fonction mROC obtenue sur la population de 118 patients de l'exemple 1 (marqueurs HA+CXCL10 ; fonction ZI ; cf. Tableau 2 ci-dessous) à celles de la fonction mROC obtenue sur la population de 310 patients de l'exemple 3 (marqueurs HA+CXCL10 ; fonction Z4 ; cf. Tableau 7 ci- dessous), lorsqu'elles sont toutes deux appliquées à la population de 118 patients; cf. exemple 9 ci-dessous.  Figures 16A and 16B compare the performances of the mROC function obtained on the population of 118 patients of Example 1 (markers HA + CXCL10, function ZI, see Table 2 below) to those of the function mROC obtained on the population of 310 patients of Example 3 (HA + CXCL10 markers, Z4 function, see Table 7 below), when both are applied to the population of 118 patients; cf. Example 9 below.
Figure 16A : en ordonnée, fonction ZI de l'exemple 1 [Z = (0,3686) x CXCL101 + (0,3064) x HA1, avec CXCLIO = -0,013 et λΗΑ = 0,099] ; en abscisse, fonction Z4 de l'exemple 3 [Z = (1 ,999) x CXCL101 + (2,852) x HA1, avec CXCLIO = -0,1 16 et λΗΑ = -0,288]. Figure 16A: in ordinate, function ZI of example 1 [Z = (0.3686) x CXCL10 1 + (0.3064) x HA 1 , with CXCLIO = -0.013 and λΗΑ = 0.099]; on the abscissa, function Z4 of Example 3 [Z = (1, 999) × CXCL10 1 + (2.852) × HA 1 , with CXCLIO = -0.1 16 and λΗΑ = -0.288].
Figure 16B : en ordonnée, sensibilité ; en abscisse, spécificité ; courbes de ZI et Z4 (les deux courbes se confondent).  Figure 16B: ordinate, sensitivity; on the abscissa, specificity; curves of ZI and Z4 (the two curves merge).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION La demande est relative aux objets définis dans les revendications telles que déposées, aux objets décrits ci-dessous et aux objets illustrés en partie « exemples ». DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The application relates to the objects defined in the claims as filed, to the objects described below and to the objects illustrated in part "examples".
Dans la demande, à moins que cela ne soit autrement spécifié, ou que le contexte n'en dicte autrement, tous les termes ont leur sens habituel dans le(s) domaine(s) concerné(s).  In the request, unless otherwise specified, or the context dictates otherwise, all terms have their usual meaning in the area (s) concerned.
La demande est relative à une méthode pour déterminer, plus particulièrement pour déterminer avec une forte probabilité, le stade (ou degré) de fïbrose du foie d'un sujet qui est infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou qui est atteint d'hépatite, plus particulièrement d'hépatite chronique. The application relates to a method for determining, more particularly for determining with a high probability, the stage (or degree) of liver fibrosis of a subject who is infected with one or more hepatitis viruses and / or is hepatitis, more specifically chronic hepatitis.
Le ou les virus de l'hépatite peuvent par exemple être un ou des virus de l'hépatite C et/ou de l'hépatite B et/ou de l'hépatite D, plus particulièrement de l'hépatite C.  The hepatitis virus or viruses may for example be one or more viruses of hepatitis C and / or hepatitis B and / or hepatitis D, more particularly hepatitis C.
Ledit virus de l'hépatite C peut être de n'importe quel génotype. Par exemple, le génotype dudit virus de l'hépatite C peut être le génotype 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, plus particulièrement le génotype 1 ou 4.  The said hepatitis C virus can be of any genotype. For example, the genotype of said hepatitis C virus may be genotype 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, more particularly genotype 1 or 4.
Ledit sujet est un mammifère, plus particulièrement un humain.  Said subject is a mammal, more particularly a human.
La méthode de la demande met en œuvre la quantification de différents marqueurs, qui peuvent tous être mesurés ou déterminés de manière substantiellement non invasive (le degré d'intervention invasive sur le corps du sujet ne va pas au-delà du simple prélèvement de liquide biologique). La méthode de la demande peut être mise en œuvre in vitro.  The demand method involves the quantification of different markers, all of which can be measured or determined in a substantially non-invasive manner (the degree of invasive intervention on the subject's body does not go beyond the simple collection of biological fluid ). The demand method can be implemented in vitro.
Plus particulièrement, la méthode de la demande est une méthode pour déterminer, plus particulièrement pour déterminer avec une forte probabilité, si le stade (ou degré) de fïbrose hépatique dudit sujet a ou non dépassé le stade de la fïbrose légère. More particularly, the method of application is a method for determining, more particularly for determining with high probability, whether or not the stage (or degree) of hepatic fibrosis of said subject has passed the stage of mild fibrose.
Par « stade (ou degré) de fïbrose hépatique qui n'a pas dépassé le stade de la fïbrose légère », on entend un stade qui est inférieur ou égal à celui de la fïbrose légère.  "Stage (or degree) of hepatic fibrosis which has not passed the stage of slight fibrosis" means a stage which is less than or equal to that of mild fibrose.
Par « stade (ou degré) de fïbrose hépatique qui a dépassé le stade de la fïbrose légère », on entend un stade qui est supérieur à celui de la fïbrose légère.  "Stage (or degree) of hepatic fibrosis which has passed the stage of mild fibrosis" means a stage which is greater than that of mild fibrosis.
Les différents stades de la fïbrose hépatique sont les suivants (dans l'ordre du faible degré au plus fort degré) :  The various stages of hepatic fibrosis are as follows (in the order of low degree to the highest degree):
- absence de fïbrose,  - absence of fibrose,
- fïbrose portale sans septa, - fïbrose portale avec septas (c'est-à-dire avec au moins un ou plusieurs septa(s)), - portal fibrosis without septa, - portal fibrosis with septas (ie with at least one or more septa),
- fïbrose septale sans cirrhose, et  septal fribrose without cirrhosis, and
- cirrhose.  - cirrhosis.
Ledit stade de fïbrose légère est celui de la fïbrose portale sans septa.  The said stage of slight fibrosis is that of portal fibroids without septa.
Lorsque le stade de fïbrose hépatique dudit sujet n'a pas dépassé le stade de la fïbrose légère, le foie de ce sujet est donc soit dépourvu de fïbrose (absence de fïbrose), soit atteint d'une fïbrose portale sans septa.  When the hepatic fibrosis stage of said subject has not passed the stage of light fibro- sis, the liver of this subject is either free of fibro- sis (absence of fibrosis) or of portal fribrose without septa.
Lorsque le stade de fïbrose hépatique dudit sujet a dépassé le stade de la fïbrose légère, le foie de ce sujet est donc atteint d'une fïbrose portale avec septas, ou d'une fïbrose septale sans cirrhose, ou d'une cirrhose.  When the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of mild fibro- sis, the liver of this subject is therefore affected with portal fiabrosis with septa, or septal fibrosis without cirrhosis, or with cirrhosis.
Il existe différents systèmes de scores de fïbrose hépatique. Le plus courant est le système de scores Metavir.  There are different systems of hepatic fibrosis scores. The most common is the Metavir score system.
Tableau 25 : correspondance entre les stades de fïbrose et les scores de fïbrose Metavir  Table 25: Correspondence between fibrosis and fibrosis Metavir scores
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Ledit stade de fïbrose légère est donc un degré de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores Metavir, a un score de Fl . This mild fibrosis stage is therefore a degree of hepatic fibrosis which, according to the Metavir score system, has a Fl score.
Un score de fïbrose hépatique indiquant que le foie dudit sujet n'a pas dépassé ledit stade de fïbrose légère est donc un score d'au plus Fl, c'est-à-dire un score de FO ou Fl, selon le système de scores Metavir.  A liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has not exceeded said stage of light fibrosis is therefore a score of at most F1, that is to say a score of FO or F1, according to the score system. Metavir.
Un score de fïbrose hépatique indiquant que le foie dudit sujet a dépassé ledit stade de fïbrose légère est donc un score d'au moins F2, c'est-à-dire un score de F2, F3 ou F4, selon le système de scores Metavir.  A liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has exceeded said light fibrosis stage is therefore a score of at least F2, that is to say a score of F2, F3 or F4, according to the Metavir score system. .
Un autre système de scores de fïbrose hépatique est le système d'Ishak (Goodman 2007). Tableau 26 : correspondance entre les stades de fïbrose et les scores de fïbrose Ishak Another system of hepatic fibrosis scores is the Ishak system (Goodman 2007). Table 26: Correspondence between fibrosis and Ishak fibrosis scores
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Ledit stade de fïbrose légère est donc un degré de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores Ishak, a un score de F1/F2. This mild fibrosis stage is therefore a degree of hepatic fibrosis which, according to the Ishak score system, has a F1 / F2 score.
Un score de fïbrose hépatique indiquant que le foie dudit sujet n'a pas dépassé ledit stade de fïbrose légère est donc un score d'au plus F2, c'est-à-dire un score de FO, Fl ou F2, selon le système de scores Ishak.  A liver fibrosis score indicating that the liver of said subject did not exceed said light fibrosis stage is therefore a score of at most F2, ie a score of FO, F1 or F2, according to the system. of Ishak scores.
Un score de fïbrose hépatique indiquant que le foie dudit sujet a dépassé ledit stade de fïbrose légère est donc un score d'au moins F3, c'est-à-dire un score de F3, F4, F5 ou F6, selon le système de scores Ishak.  A liver fibrosis score indicating that the liver of said subject has exceeded said light fibrosis stage is therefore a score of at least F3, that is to say a score of F3, F4, F5 or F6, according to the system of Ishak scores.
Le fait de déterminer si le stade (ou degré) de fïbrose hépatique d'un sujet infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou atteint d'hépatite, plus particulièrement d'hépatite chronique, a ou non dépassé le stade de la fïbrose légère revêt une importance particulière pour le praticien. Determining whether the stage (or degree) of hepatic fibrosis of a subject infected with one or more hepatitis viruses and / or hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has progressed beyond the stage of light fibrosis is of particular importance to the practitioner.
En effet, la plupart des traitements (qu'il s'agisse de traitement anti-hépatite, anti- VHC ou anti-fïbrose hépatique), et plus particulièrement ceux qui comprennent l'administration d'interféron, présentent des effets secondaires extrêmement lourds. Ces traitements ne sont donc généralement administrés que lorsque le foie dudit sujet dépasse le stade de la fïbrose légère (score Metavir d'au moins F2).  Indeed, most treatments (be it anti-hepatitis, anti-HCV or hepatic fibrosis treatment), and more particularly those that include the administration of interferon, have extremely heavy side effects. These treatments are therefore generally only administered when the liver of said subject exceeds the stage of mild fibrose (Metavir score of at least F2).
Ainsi, la méthode de la demande peut donc être utilisée non seulement dans le diagnostic d'une fïbrose hépatique ou du stade de fïbrose hépatique, mais également dans le traitement d'une hépatopathie, notamment pour déterminer le moment auquel un traitement doit être administré au sujet. La méthode de l'invention peut donc ainsi être une méthode pour la thérapie d'un sujet, qui comprend le fait de n'administrer un traitement anti-hépatite et/ou anti-VHC et/ou anti-fïbrose hépatique que lorsque, à l'aide des moyens de la demande, il a été déterminé, que le sujet a dépassé le stade de la fïbrose légère, ou bien encore une méthode pour la thérapie d'un sujet, qui comprend le fait d'ajuster un traitement anti-hépatite et/ou anti-VHC et/ou anti-fïbrose hépatique en fonction de la réponse du tissu hépatique du patient, telle que déterminée à l'aide des moyens de la demande. Ledit traitement peut notamment être un traitement visant à bloquer ou ralentir la progression de la fïbrose hépatique, en éliminant le virus (notamment, dans le cas de l'hépatite C) et/ou en bloquant la réplication du virus (notamment dans le cas de l'hépatite B). Thus, the demand method can be used not only in the diagnosis of hepatic fibrosis or the hepatic fibrosis stage, but also in the treatment of liver disease, particularly to determine when a treatment must be administered to the subject. The method of the invention may thus be a method for therapy of a subject, which comprises administering anti-hepatitis and / or hepatitis C and / or anti-hepatic treatment only when, at using the means of demand, it has been determined that the subject has passed the stage of mild fibrosis, or else a method for the therapy of a subject, which includes adjusting an anti-cancer treatment. hepatitis and / or HCV and / or hepatic anti-hepatic fibrosis depending on the response of the patient's liver tissue, as determined using the means of the application. Said treatment may especially be a treatment aimed at blocking or slowing the progression of hepatic fibrosis, by eliminating the virus (in particular, in the case of hepatitis C) and / or by blocking the replication of the virus (especially in the case of hepatitis B).
Avantageusement, la méthode de la demande est applicable quel que soit le stade de fïbrose hépatique dudit sujet : ce stade peut être celui de l'absence de fïbrose hépatique jusqu'à celui de la cirrhose. Advantageously, the method of the application is applicable irrespective of the hepatic fibrosis stage of said subject: this stage may be that of the absence of hepatic fibrosis up to that of cirrhosis.
Le score de fïbrose hépatique dudit sujet peut donc être, selon le système de scores de fïbrose Metavir, de F0, Fl, F2, F3 ou F4, plus particulièrement de F0, Fl, F2 ou F3, plus particulièrement de F0, Fl ou F2, plus particulièrement de Fl, F2 ou F3, plus particulièrement de Fl ou F2.  The hepatic fibrosis score of said subject may therefore be, according to the Metavir fibrosis scoring system, F0, Fl, F2, F3 or F4, more particularly F0, Fl, F2 or F3, more particularly F0, Fl or F2. , more particularly Fl, F2 or F3, more particularly Fl or F2.
Ledit sujet peut être un sujet dont la dureté du foie a été préalablement mesurée, notamment par une méthode non invasive telle que l'élastographie impulsionnelle (par exemple par FIBROSCAN™).  Said subject may be a subject whose liver hardness has been previously measured, in particular by a non-invasive method such as pulse elastography (for example by FIBROSCAN ™).
La méthode de la demande met en œuvre la quantification, plus particulièrement la détection et la quantification, de marqueurs (ou variables) biologiques. The demand method involves the quantification, more particularly the detection and quantification, of biological markers (or variables).
Les marqueurs biologiques (ou biomarqueurs) sélectionnés pour la mise en œuvre de la méthode comprennent plusieurs molécules circulantes différentes. Ils peuvent en outre comprendre zéro, un ou plusieurs marqueur(s) additionnel(s), qui ne sont pas des molécules circulantes.  The biological markers (or biomarkers) selected for the implementation of the method include several different circulating molecules. They may further comprise zero, one or more additional label (s), which are not circulating molecules.
Molécules circulantes Le terme « molécules circulantes » est entendu conformément à sa signification usuelle dans le domaine. D'une manière générale, les molécules circulantes sont des molécules qui sont présentes dans le sang d'un mammifère, plus particulièrement d'un être humain, sous forme acellulaire : elles ne sont contenues ni dans une cellule circulante ni dans une cellule tissulaire. D'une manière générale, les molécules circulantes dans le sang sont également circulantes dans le plasma. D'une manière générale, les molécules circulantes dans le sang sont également circulantes dans le sérum. Les molécules circulantes peuvent par exemple être des protéines, des glycoprotéines, des enzymes, des polysaccharides, des lipides, des glycérides, des hormones. Les molécules circulantes peuvent par exemple être des molécules produites, ou des métabolites produits par les cellules de l'organisme dudit sujet. Plus particulièrement, les molécules circulantes peuvent par exemple être des molécules (ou métabolites) qui sont produits par les cellules de l'organisme dudit sujet, mais qui ne sont pas produits par un virus, plus particulièrement un virus de l'hépatite. Les éléments figurés du sang, tels que les plaquettes, ainsi que les virus, tel que les virus de l'hépatite, sont circulants, mais ne sont pas des molécules : ils ne font donc pas partie des molécules circulantes au sens de la demande. Lorsque ledit sujet est un humain, ces molécules circulantes sont des molécules circulantes humaines. Des exemples de molécules circulantes comprennent notamment : Circulating molecules The term "circulating molecules" is understood according to its usual meaning in the field. In general, the circulating molecules are molecules that are present in the blood of a mammal, more particularly a human being, in acellular form: they are contained neither in a circulating cell nor in a tissue cell. In general, the circulating molecules in the blood are also circulating in the plasma. In general, the circulating molecules in the blood are also circulating in the serum. The circulating molecules may for example be proteins, glycoproteins, enzymes, polysaccharides, lipids, glycerides, hormones. The circulating molecules may for example be molecules produced, or metabolites produced by the cells of the body of said subject. More particularly, the circulating molecules may for example be molecules (or metabolites) that are produced by the cells of the body of said subject, but which are not produced by a virus, more particularly a hepatitis virus. The figured elements of blood, such as platelets, as well as viruses, such as hepatitis viruses, are circulating, but are not molecules: they are not therefore part of the circulating molecules in the sense of demand. When said subject is a human, these circulating molecules are human circulating molecules. Examples of circulating molecules include:
- la protéine CXCL10 (forme complète et formes clivées),  the CXCL10 protein (complete form and cleaved forms),
- l'acide hyaluronique ou hyaluronan (HA),  hyaluronic acid or hyaluronan (HA),
- la gamma glutamyl transpeptidase (GGT),  gamma glutamyl transpeptidase (GGT),
- l'aspartate aminotransférase (AST),  aspartate aminotransferase (AST),
- l'alanine aminotransférase (ALT),  alanine aminotransferase (ALT),
- l'apo lipoprotéine Al (ApoAl),  apo lipoprotein Al (ApoAl),
- l'alpha 2 macroglobuline (A2M),  alpha 2 macroglobulin (A2M),
- l'inhibiteur 1 de métalloprotéinase (TIMP1),  the metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1),
- la vimentine (VIM),  - vimentin (VIM),
- la phosphoprotéine 1 sécrétée (SPP1),  secreted phosphoprotein 1 (SPP1),
- le transducteur de signal interleukin-6 (IL6ST),  the interleukin-6 signal transducer (IL6ST),
- l'inhibiteur de kinase 2A cycline dépendent (pl4ARF),  the kinase 2A cyclin inhibitor depend (p14ARF),
- la métallopeptidase 9 de matrice (MMP9),  matrix metallopeptidase 9 (MMP9),
- l'angiopoïétine 2 (ANGPT2),  angiopoietin 2 (ANGPT2),
- le ligand 11 à chémokine, motif CXC (CXCL11),  chemokine ligand 11, CXC motif (CXCL11),
- la métallopeptidase 2 de matrice (MMP2), - la métalloprotéinase 7 de matrice (MMP7), matrix metallopeptidase 2 (MMP2), matrix metalloproteinase 7 (MMP7),
- la protéine A4 liant le calcium S 100 (S100A4),  calcium-binding protein A4 S100 (S100A4),
- l'inhibiteur 1 de métalloprotéinase (TIMP1),  the metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1),
- la protéine 1 de type chitinase-3 (CHI3L1),  the protein 1 of chitinase-3 type (CHI3L1),
- la chaîne alpha-l(I) du collagène (COL1A1),  the alpha-1 (I) chain of collagen (COL1A1),
- la chimiokine 1 de la protéine alpha régulant la croissance, motif CXC (CXCL1), the chemokine 1 of the growth regulating alpha protein, CXC motif (CXCL1),
- le ligand 6 à chémokine, motif CXC (CXCL6), Chemokine ligand 6, CXC motif (CXCL6),
- la protéine « Indian Hedgehog » (IHH),  the Indian Hedgehog protein (IHH),
- le facteur de transcription 3G stimulé par interféron (IRF9),  the interferon-stimulated 3G transcription factor (IRF9),
- la métalloprotéinase 1 de matrice (MMP1).  matrix metalloproteinase 1 (MMP1).
Pour quantifier, plus particulièrement pour détecter et quantifier, une ou des molécules circulantes, un prélèvement d'un échantillon biologique, plus particulièrement un échantillon de fluide biologique, doit être ou avoir été fait sur ledit sujet.  To quantify, more particularly to detect and quantify, one or more circulating molecules, a sample of a biological sample, more particularly a sample of biological fluid, must be or have been made on said subject.
Conformément à la demande, les molécules circulantes sélectionnées pour la mise en œuvre de la méthode comprennent (ou consistent en) au moins deux molécules circulantes différentes. According to the application, the circulating molecules selected for the implementation of the method comprise (or consist of) at least two different circulating molecules.
Plus particulièrement, les molécules circulantes sélectionnées comprennent (ou consistent en) au moins l'acide hyaluronique (HA) et la protéine CXCL10 (CXCL10).  More particularly, the selected circulating molecules include (or consist of) at least hyaluronic acid (HA) and CXCL10 protein (CXCL10).
Les inventeurs démontrent que la combinaison du marqueur CXCL10 au marqueur HA conduit à un effet synergique, à savoir à des performances qui vont au-delà de la simple juxtaposition de leurs performances individuelles respectives (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP). Des démonstrations expérimentales sont présentées dans les exemples ci- dessous, notamment : The inventors demonstrate that the combination of the CXCL10 marker with the HA marker leads to a synergistic effect, namely to performances that go beyond the simple juxtaposition of their respective individual performances (AUC performance and / or good classification rate and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP). Experimental demonstrations are presented in the examples below, including:
- en exemple 1 (cf. Tableau 3),  - in example 1 (see Table 3),
- en exemple 3 (cf. Tableaux 8 et 10), et  - in example 3 (see Tables 8 and 10), and
- en exemple 7 (cf. Tableaux 20 et 21).  - in example 7 (see Tables 20 and 21).
Des comparaisons avec des tests non invasifs de l'art antérieur sont par ailleurs présentées en exemples 2 et 4 ci-dessous.  Comparisons with non-invasive tests of the prior art are also presented in Examples 2 and 4 below.
L'acide hyaluronique (HA) et la protéine CXCL10 (CXCL10) sont bien connus de la personne du métier. HA est un des principaux composants de la matrice extracellulaire. C'est un glycosaminoglycane de formule brute Ci4H23NOi2(Ci4H2iNOn)n (numéro CAS = 9004- 61-9). Sa masse molaire est d'environ 776,647 g/mol. HA est un polymère d'acide hyalobiuronique ; sa formule développée est la suivante : Hyaluronic acid (HA) and CXCL10 protein (CXCL10) are well known to those skilled in the art. HA is one of the main components of the extracellular matrix. This is a glycosaminoglycan of empirical formula H 23 Ci 4 iNO 2 (C 4 H 2 Inon) n (= number CAS 9004- 61-9). Its molar mass is about 776.647 g / mol. HA is a hyalobiuronic acid polymer; its developed formula is as follows:
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0001
CXCLIO est le ligand 10 à chémokine (motif CXC) [C-X-C motif chemokine 10], également connu sous la désignation de C7 ; IFI10 ; INP10 ; IP-10 ; SCYB10 ; crg-2 ; gIP-10 ou mob-1. Sa séquence humaine est décrite dans les bases de données sous le numéro d'accès NM 001565. CXCL10 is chemokine ligand (CXC motif) [C-X-C chemokine motif 10], also known as C7; IFI10; INP10; IP-10; SCYB10; crg-2; gIP-10 or mob-1. Its human sequence is described in the databases under accession number NM 001565.
La forme précurseur de la protéine CXCLIO (humaine) est une protéine constituée de 98 acides aminés, dont la séquence est :  The precursor form of the protein CXCL10 (human) is a protein consisting of 98 amino acids, the sequence of which is:
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRV EIIATMKK GEKRCLNPESKAIK LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO : 1]  MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRV EIIATMKK GEKRCLNPESKAIK LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO: 1]
ou or
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRV EIIATMKK GEKRCLNPESKAIK LLKAVSKEMSKRSP [SEQ ID NO : 2],  ## EQU1 ##
ces deux séquences ne différant que d'un acide aminé, qui est situé en partie C-terminale (ERS en partie C-terminale de SEQ ID NO : 1 versus EMS en partie C-terminale de SEQ ID NO : 2). these two sequences differing only from one amino acid, which is located partly C-terminal (ERS partly C-terminal of SEQ ID NO: 1 versus EMS partly C-terminal of SEQ ID NO: 2).
Le peptide signal de la forme précurseur de CXCLIO est un peptide constitué de 21 acides aminés, qui est égal au fragment 1-21 de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou 2, à savoir : MNQTAILICC LIFLTLSGIQG [SEQ ID NO : 3].  The signal peptide of the precursor form of CXCLIO is a peptide consisting of 21 amino acids, which is equal to the 1-21 fragment of the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, namely: MNQTAILICC LIFLTLSGIQG [SEQ ID NO: 3] .
Il existe au moins trois formes circulantes de la protéine CXCLIO, à savoir :  There are at least three circulating forms of the CXCLIO protein, namely:
- une forme dite agoniste, qui est constituée de 77 acides aminés,  a form called agonist, which consists of 77 amino acids,
- une forme dite antagoniste, qui est constituée de 75 acides aminés, et  a so-called antagonist form, which consists of 75 amino acids, and
- une forme qui résulte d'un clivage après sécrétion (clivage protéolytique par les kératinocytes), qui est constituée de 73 acides aminés. La forme agoniste de CXCLIO est une protéine de 77 acides aminés qui a la séquence suivante : a form which results from cleavage after secretion (proteolytic cleavage by keratinocytes), which consists of 73 amino acids. The agonist form of CXCLIO is a 77 amino acid protein that has the following sequence:
VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEK CLNPES KAIK LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO : 4], ou  VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEK CLNPES KAIK LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO: 4], or
VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPES KAIK LLKAVSKEMSKRSP [SEQ ID NO : 5]. La structure de cette protéine de 77 acides aminés a été déterminée par RMN (identité PDB = 1LV9, publiée le 18 septembre 2002 ; cf. Booth et al. 2002), et par rayons X (identité PDB à 3 Â = 107Y ; identité PDB à 2 Â = 108O ; identité PDB à 1,92 Â = 107Z ; Swaminathan et al. 2003). ## STR2 ## The structure of this protein of 77 amino acids was determined by NMR (PDB identity = 1LV9, published on September 18, 2002, see Booth et al., 2002), and by X-ray (3A PDB identity = 107Y, PDB identity). at 2 Å = 108O, PDB identity at 1.92 Å = 107Z, Swaminathan et al., 2003).
La forme antagoniste de CXCLIO est une protéine de 75 acides aminés dont la séquence est celle de la forme agoniste tronquée des 2 acides aminés N-terminaux. La forme antagoniste de CXCLIO a donc la séquence suivante :  The antagonist form of CXCLIO is a 75 amino acid protein whose sequence is that of the truncated agonist form of the two N-terminal amino acids. The antagonistic form of CXCLIO thus has the following sequence:
LSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPESKAI LSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPESKAI
K LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO : 6] ou K LLKAVSKERSKRSP [SEQ ID NO: 6] or
LSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPESKAILSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPESKAI
K LLKAVSKEMSKRSP [SEQ ID NO : 7]. K LLKAVSKEMSKRSP [SEQ ID NO: 7].
La forme de CXCLIO qui résulte d'un clivage après sécrétion est une protéine de The form of CXCLIO that results from cleavage after secretion is a protein of
73 acides aminés, dont la séquence est celle de la forme agoniste tronquée des 4 acides aminés C-terminaux. La forme de CXCLIO qui résulte d'un clivage après sécrétion a donc la séquence suivante : 73 amino acids, whose sequence is that of the truncated agonist form of the 4 C-terminal amino acids. The form of CXCLIO which results from a cleavage after secretion thus has the following sequence:
VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPES VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPES
KAIK LLKAVSKERS [SEQ ID NO : 8] ou KAIK LLKAVSKERS [SEQ ID NO: 8] or
VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKK GEKRCLNPES KAIK LLKAVSKEMS [SEQ ID NO : 9].  ## STR1 ##
Les formes circulantes de la protéine CXCLIO (humaine) comprennent donc les protéines de SEQ ID NO : 4 à 9, plus particulièrement :  The circulating forms of the CXCL10 (human) protein therefore comprise the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9, more particularly:
- SEQ ID NO : 4 et/ou NO : 5,  SEQ ID NO: 4 and / or NO: 5,
- SEQ ID NO : 6 et/ou NO : 7, et  SEQ ID NO: 6 and / or NO: 7, and
- SEQ ID NO : 8 et/ou NO : 9.  SEQ ID NO: 8 and / or NO: 9.
Conformément à la demande, la quantification, plus particulièrement la détection et la quantification de CXCLIO, comprend la quantification, ou la détection et la quantification, d'au moins une, plus particulièrement de plusieurs, plus particulièrement de toutes les formes circulantes de la protéine CXCLIO. Conformément à la demande, la quantification, plus particulièrement la détection et la quantification de CXCLIO, comprend la quantification, ou la détection et la quantification, d'au moins une, plus particulièrement de plusieurs, plus particulièrement de toutes les formes circulantes les protéines de SEQ ID NO : 4 à 9. According to the application, the quantification, more particularly the detection and quantification of CXCL10, comprises the quantification, or the detection and the quantification, of at least one, more particularly of several, more particularly of all the circulating forms of the protein. CXCLIO. According to the application, the quantification, more particularly the detection and quantification of CXCL10, comprises the quantification, or the detection and quantification, of at least one, more particularly several, more particularly of all the circulating forms, the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9.
Les molécules circulantes sélectionnées pour la mise en œuvre de la méthode peuvent être constituées par la protéine CXCLIO et par HA. Dans ce cas, CXCLIO et HA sont les deux seules molécules circulantes qui sont sélectionnées ou utilisées comme marqueurs biologiques. The circulating molecules selected for the implementation of the method may consist of the protein CXCL10 and HA. In this case, CXCL10 and HA are the only two circulating molecules that are selected or used as biomarkers.
Alternativement, une ou plusieurs autres protéines circulantes (différentes) peuvent être sélectionnées en sus de HA et CXCLIO. Alternatively, one or more other (different) circulating proteins may be selected in addition to HA and CXCL10.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'alpha 2 macroglobuline (A2M). En effet, contrairement à HA et à la protéine CXCLIO, la protéine A2M est présente en forte quantité dans le sang des sujets humains. De ce fait, il n'est pas possible, ou à tout le moins très difficile en routine, de mesurer la concentration de A2M en multiplex avec celles de HA et de la protéine CXCLIO.  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include alpha 2 macroglobulin (A2M). Indeed, unlike HA and the protein CXCLIO, the protein A2M is present in large quantities in the blood of human subjects. Therefore, it is not possible, or at least very difficult in routine, to measure the concentration of A2M in multiplex with that of HA and the CXCLIO protein.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le « Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor » (GMCSF).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the "Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor" (GMCSF).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'interleukine 12 (IL 12).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include interleukin 12 (IL 12).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'interleukine 2 (IL2).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include interleukin 2 (IL2).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la métallopeptidase 13 de matrice (MMP13).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 13 (MMP13).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'alanine aminotransférase (ALT).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include alanine aminotransferase (ALT).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la gamma glutamyl transpeptidase (GGT).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include gamma glutamyl transpeptidase (GGT).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la protéine « InterCellular Adhésion Molécule »(ICAM1). Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'interleukine 4 (IL4). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the "InterCellular Molecule Adhesion" (ICAM1) protein. According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include interleukin 4 (IL4).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le ligand 6 à chémokine motif CXC (CXCL9).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise the chemokine motif ligand 6 CXC (CXCL9).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la protéine « Vascular Cell Adhésion Molécule 1 » (VCAM1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the "Vascular Cell Adhesion Molecule 1" protein (VCAM1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la « Retinol Binding Protein 4 » (RBP4).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include "Retinol Binding Protein 4" (RBP4).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'inhibiteur 1 de métalloprotéinase (TIMP1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la vimentine (VIM).  According to an alternative or complementary embodiment, these other circulating molecules selected do not include vimentin (VIM).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la phosphoprotéine 1 sécrétée (SPP1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include secreted phosphoprotein 1 (SPP1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'aspartate aminotransférase (AST).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include aspartate aminotransferase (AST).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'apolipoprotéine Al (ApoAl).  According to an alternative or complementary embodiment, these other circulating molecules selected do not include apolipoprotein Al (ApoAl).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le transducteur de signal interleukin-6 (IL6ST).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the interleukin-6 signal transducer (IL6ST).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'inhibiteur de kinase 2A cycline dépendent (pl4ARF).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the kinase 2A cyclin dependent inhibitor (p14ARF).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la métallopeptidase 9 de matrice (MMP9). Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'angiopoïétine 2 (ANGPT2).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 9 (MMP9). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include angiopoietin 2 (ANGPT2).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le ligand 11 à chémokine motif CXC (CXCL11). Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la métallopeptidase 2 de matrice (MMP2). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise the CXC motif chemokine ligand 11 (CXCL11). According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 2 (MMP2).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la métallopeptidase 7 de matrice (MMP7).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metallopeptidase 7 (MMP7).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la protéine A4 liant le calcium S 100 (S100A4).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include calcium-binding protein A4 S100 (S100A4).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas l'inhibiteur 1 de métalloprotéinase (TIMP1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la protéine 1 de type chitinase-3 (CHI3L1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise the chitinase-3 protein 1 (CHI3L1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la chaîne alpha- 1(1) du collagène (COL1A1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the collagen alpha-1 (1) chain (COL1A1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la chémokine 1 de la protéine alpha régulant la croissance motif CXC (CXCL1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the chemokine 1 of the CXC motif growth-regulating alpha protein (CXCL1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le ligand 6 à chémokine motif CXC (CXCL6).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise the chemokine motif ligand CXC (CXCL6).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la protéine « Indian Hedgehog » (IHH).  According to an alternative or complementary embodiment, these other circulating molecules selected do not include the "Indian Hedgehog" (IHH) protein.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas le facteur de transcription 3 G stimulé par interféron (IRF9).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include the interferon-stimulated 3 G transcription factor (IRF9).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent pas la métalloprotéinase 1 de matrice (MMP1).  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not include matrix metalloproteinase 1 (MMP1).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines GMCSF, IL 12, IL2 et MMP13.  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the GMCSF, IL 12, IL 2 and MMP 13 proteins.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines A2M, GMCSF, IL 12, IL2 et MMP13. Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAMl et RBP4. According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, GMCSF, IL 12, IL2 and MMP13 proteins. According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1 and RBP4 proteins.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines A2M, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAMl et RBP4.  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1 and RBP4 proteins.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines A2M, TIMPl, VIM et SPPl .  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, TIMP1, VIM and SPP1 proteins.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines A2M, AST, ApoAl, IL6ST, pl4ARF, MMP9, ANGPT2, CXCLl l, MMP2, MMP7, S100A4, TIMPl, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 et MMPl .  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the A2M, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1 or CXCL1 proteins. CXCL6, IHH, IRF9 and MMP1.
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, ces autres molécules circulantes sélectionnées ne comprennent aucune des protéines A2M, GMCSF, IL 12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAMl, RBP4, TIMPl, VIM, SPPl, AST, ApoAl, IL6ST, pl4ARF, MMP9, ANGPT2, CXCLl l, MMP2, MMP7, S100A4, TIMPl, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 et MMPl . Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, le nombre total de molécules circulantes (différentes) qui sont sélectionnées sont au nombre de six, cinq, quatre, trois ou deux, plus particulièrement au nombre de cinq, quatre, trois ou deux, plus particulièrement au nombre de quatre, trois ou deux, plus particulièrement au nombre de trois ou deux, plus particulièrement au nombre de deux.  According to an alternative or complementary embodiment, these other selected circulating molecules do not comprise any of the proteins A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAMI, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoAI, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 and MMP1. According to an alternative or complementary embodiment, the total number of circulating molecules (different) that are selected are six, five, four, three or two, more particularly five, four, three or two, more particularly four, three or two, more particularly three or two, more particularly two in number.
Éventuel(s) marqueur(s) additionnel(s) [qui ne sont pas des molécules circulantes! Possible additional marker (s) [which are not circulating molecules!
En sus des molécules circulantes (et notamment en sus de HA et CXCL10), les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent en outre comprendre zéro, un ou plusieurs marqueur(s) additionnel(s), qui ne sont pas des molécules circulantes, plus particulièrement qui ne sont pas des molécules circulantes humaines. In addition to the circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCL10), the selected biological markers may also comprise zero, one or more additional label (s), which are not circulating molecules, more particularly which do not are not circulating human molecules.
Le terme « marqueur(s) additionnel(s) » (ou « marqueur(s) additionnel(s) sélectionné(s) ») signifie ici celui(ceux) des marqueurs biologiques sélectionnés qui n'est pas (ne sont pas) une(des) molécule(s) circulante(s), plus particulièrement qui n'est pas (ne sont pas) une(des) molécule(s) circulante(s) humaine(s). The term "additional marker (s)" (or "additional marker (s) selected") means here that of the selected biological markers which is not not (are not) a circulating molecule (s), more particularly which is not (are) a circulating molecule (s) human (s).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre, en sus desdites molécules circulantes (et notamment en sus de HA et CXCL10), un ou plusieurs marqueur(s) additionnel(s), qui est(sont) choisi(s) parmi :  For example, the selected biological markers may comprise, in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCL10), one or more additional marker (s), which is (are) chosen from:
- les éléments figurés du sang (par exemple, les plaquettes),  - figured elements of blood (for example, platelets),
- les caractéristiques (ou marqueurs) cliniques ou anatomiques dudit sujet, et the clinical or anatomical characteristics (or markers) of said subject, and
- les caractéristiques (ou marqueurs) viro logiques dudit sujet. the virological characteristics (or markers) of said subject.
Plus particulièrement, ledit(lesdits) marqueur(s) additionnel(s) est(sont) choisi(s) parmi :  More particularly, said additional marker (s) is (are) chosen from:
- les caractéristiques (ou marqueurs) cliniques ou anatomiques dudit sujet, et the clinical or anatomical characteristics (or markers) of said subject, and
- les caractéristiques (ou marqueurs) viro logiques dudit sujet. the virological characteristics (or markers) of said subject.
Les caractéristiques (ou marqueurs) cliniques ou anatomiques sont avantageusement des caractéristiques dont la mesure ne requiert pas une détection ou une quantification dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet, et plus généralement dont la mesure peut être faite sans prélèvement d'échantillon biologique dudit sujet. Par exemple, l'âge, l'Indice de Masse Corporelle (IMC), le sexe et la dureté du foie sont des caractéristiques (ou marqueurs) cliniques ou anatomiques qui peuvent être quantifiées par mesure extracorporelle, sans prélèvement de fluide biologique, et plus généralement sans prélèvement d'échantillon biologique dudit sujet (la dureté du foie peut être mesurée par élastographie impulsionnelle, notamment par FIBROSCAN™), et plus généralement sans aucune intervention invasive. Clinical or anatomical characteristics (or markers) are advantageously characteristics the measurement of which does not require detection or quantification in a biological fluid sample of said subject, and more generally the measurement of which can be done without taking a biological sample from said subject . For example, age, Body Mass Index (BMI), sex, and liver hardness are clinical or anatomical features (or markers) that can be quantified by extracorporeal measurement, without biological fluid sampling, and more. generally without taking a biological sample from said subject (the liver hardness can be measured by pulse elastography, in particular by FIBROSCAN ™), and more generally without any invasive intervention.
Des exemples de caractéristiques cliniques ou anatomiques dudit sujet comprennent notamment l'âge dudit sujet, l'IMC dudit sujet, le sexe dudit sujet, et la dureté du foie dudit sujet (FS), plus particulièrement l'âge dudit sujet, l'IMC dudit sujet, et la dureté du foie dudit sujet (F S).  Examples of clinical or anatomical characteristics of said subject include in particular the age of said subject, the BMI of said subject, the sex of said subject, and the hardness of the liver of said subject (FS), more particularly the age of said subject, the BMI said subject, and the hardness of the liver of said subject (FS).
Le marqueur « âge dudit sujet » comprend notamment :  The age marker of said subject includes:
- l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes,  the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken,
- l'âge dudit sujet à la date à laquelle le diagnostic d'une infection par virus de l'hépatite a été fait, - l'âge dudit sujet à la date à laquelle il a reçu pour la première fois une thérapie anti-hépatite, - the age of the subject at the date on which the diagnosis of a hepatitis virus infection was made, - the age of the subject on the date on which he first received anti-hepatitis therapy,
plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes. more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been made.
Le marqueur « IMC dudit sujet » comprend notamment :  The "IMC of said subject" marker comprises in particular:
- l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes,  the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken,
- l'IMC dudit sujet à la date à laquelle le diagnostic d'une infection par virus de l'hépatite a été fait,  - the BMI of that subject on the date on which the diagnosis of a hepatitis virus infection was made,
- l'IMC dudit sujet à la date à laquelle il a reçu pour la première fois une thérapie anti-hépatite,  - the BMI of that subject on the date on which he received for the first time an anti-hepatitis therapy,
plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes. more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken.
Des exemples de caractéristiques cliniques ou anatomiques dudit sujet comprennent donc plus particulièrement :  Examples of clinical or anatomical characteristics of said subject therefore more particularly include:
- l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes,  the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken,
- l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes,  the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken,
- le sexe dudit sujet (sexe masculin ou sexe féminin), et  - the sex of the subject (male or female), and
- la dureté du foie dudit sujet (FS).  the hardness of the liver of said subject (FS).
plus particulièrement : more particularly:
- l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes,  the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken,
- l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes, et  the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken, and
- la dureté du foie dudit sujet (FS).  the hardness of the liver of said subject (FS).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, le nombre total de (différents) marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) qui sont sélectionné(s) à titre de marqueur(s) additionnel(s) est de zéro, un, deux ou trois, plus particulièrement de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, par exemple zéro, par exemple un, par exemple deux, par exemple un, deux ou trois, par exemple un ou deux.  According to an alternative or complementary embodiment, the total number of (different) clinical marker (s) or anatomical marker (s) which are selected as additional marker (s) is zero, one, two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, for example zero, for example one, for example two, for example one, two or three, for example one or two.
Par exemple, le(les) marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) sélectionné(s) est(sont) un, deux ou trois marqueur(s) (différents), plus particulièrement un ou deux marqueur(s) (différents), par exemple un marqueur, par exemple deux marqueurs différents, choisi(s) parmi : For example, the clinical (s) or anatomic marker (s) selected is (are) one, two or three (different) marker (s), more particularly one or two marker (s) (different), for example a marker, for example two different markers, chosen from:
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
- la dureté du foie dudit sujet (FS).  the hardness of the liver of said subject (FS).
Les caractéristiques (ou marqueurs) virologiques dudit sujet sont quant à elles des caractéristiques qui nécessitent une détection ou une quantification dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet. Avantageusement, cet échantillon de fluide biologique est le même, ou à tout le moins est de même nature, que celui mis en œuvre pour détecter ou quantifier lesdites molécules circulantes (telles que CXCL10 et HA). The virological characteristics (or markers) of said subject are characteristics that require detection or quantification in a biological fluid sample of said subject. Advantageously, this sample of biological fluid is the same, or at least is of the same nature, as that used to detect or quantify said circulating molecules (such as CXCL10 and HA).
Des exemples de caractéristiques virologiques dudit sujet comprennent notamment :  Examples of virological characteristics of said subject include:
- la nature du(des) virus contenu(s) dans le sang dudit sujet,  - the nature of the virus (s) contained in the blood of said subject,
- la charge virale dudit sujet (CV), plus particulièrement sa charge virale en virus de l'hépatite,  the viral load of said subject (CV), more particularly his viral load in the hepatitis virus,
- le ou les génotype(s) du (ou des) virus de l'hépatite dont est infecté ledit sujet. the genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) to which said subject is infected.
Le marqueur « nature du(des) virus contenu(s) dans le sang dudit sujet » comprend notamment la nature du(des) virus de l'hépatite contenu(s) dans le sang dudit sujet : par exemple, VHC et/ou VHB et/ou VHD, plus particulièrement VHC et/ou VHB, plus particulièrement VHC. The marker "nature of the virus (s) contained in the blood of said subject" includes in particular the nature of the hepatitis virus (s) contained in the blood of said subject: for example, HCV and / or HBV and / or VHD, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
Le marqueur « charge virale dudit sujet » (CV) comprend notamment la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite par exemple, sa charge virale en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  The "viral load of said subject" (VC) marker comprises, in particular, the viral load of said subject, for example hepatitis virus, his viral load in HCV and / or in HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Le marqueur « génotype(s) du (ou des) virus de l'hépatite dont est infecté ledit sujet » comprend notamment le ou les génotype(s) du (ou des) virus de l'hépatite dont est infecté ledit sujet, par exemple, génotype(s) 1 et/ou 2 et/ou 3 et/ou 4 et/ou 5 et/ou 6 et/ou 7. Des exemples de caractéristiques virologiques dudit sujet comprennent plus particulièrement la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, plus particulièrement la charge virale dudit sujet en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC. The marker "genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) of which said subject is infected" notably comprises the genotype (s) of the hepatitis virus (or viruses) to which said subject is infected, for example , genotype (s) 1 and / or 2 and / or 3 and / or 4 and / or 5 and / or 6 and / or 7. Examples of virological characteristics of said subject include more particularly the viral load of said subject in hepatitis virus, more particularly the viral load of said subject in HCV and / or in HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV. , especially in HCV.
Selon un mode alternatif ou complémentaire, le nombre total de (différents) marqueur(s) virologique(s) qui est(sont) sélectionné(s) à titre de marqueur(s) additionnel(s) est de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, plus particulièrement de un ou deux, plus particulièrement de un, plus particulièrement de zéro.  According to an alternative or complementary mode, the total number of (different) virological marker (s) that are (are) selected as additional marker (s) is zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly one or two, more particularly one, more particularly zero.
Par exemple, aucun marqueur virologique n'est sélectionné, ou bien seulement un seul marqueur virologique est sélectionné et est la charge virale dudit sujet (plus particulièrement sa charge virale en virus de l'hépatite, plus particulièrement sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC). Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, le nombre total de marqueur(s) additionnel(s) différents sélectionné(s) en sus desdites molécules circulantes (et notamment en sus de HA et CXCLIO), est de zéro, un, deux, trois, quatre, cinq, ou plus de cinq.  For example, no virological marker is selected, or only one virological marker is selected and is the viral load of said subject (more particularly his viral load of hepatitis virus, more particularly his HCV load and / or HBV and / or in HDV, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV). According to an alternative or complementary embodiment, the total number of additional additional marker (s) selected (s) in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCLIO), is zero, one, two, three, four, five, or more than five.
Plus particulièrement, le nombre total de marqueur(s) additionnel(s) différents tel(s) que ci-dessus décrit(s) est de zéro, un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de zéro, un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de zéro, un, deux ou trois, plus particulièrement de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, plus particulièrement de zéro, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre ou cinq, ou plus de cinq, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de un, deux ou trois, plus particulièrement de un ou deux, plus particulièrement de un, plus particulièrement de deux, plus particulièrement de trois, plus particulièrement de quatre, plus particulièrement de cinq. Ainsi, en sus desdites molécules circulantes (et notamment en sus de HA et More particularly, the total number of additional additional marker (s) as described above is zero, one, two, three, four or five, more particularly zero, one, two, , three or four, more particularly from zero, one, two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, more particularly from zero, more particularly from one, two, three, four or five, or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly one or two, more particularly one, more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five. Thus, in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and
CXCLIO), ledit(lesdits) marqueur(s) additionnel(s) peut(peuvent) par exemple comprendre (ou consister en) : CXCLIO), said additional marker (s) may (for example) include (or consist of):
- zéro, un, deux ou trois (différents) marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) comme ci-dessus décrits, et - zéro ou un marqueur viro logique comme ci-dessus décrit. - zero, one, two or three (different) clinical marker (s) or anatomical (s) as described above, and zero or a virological marker as described above.
Ainsi, en sus desdites molécules circulantes (et notamment en sus de HA et CXCLIO), ledit(lesdits) marqueur(s) additionnel(s) peut(peuvent) par exemple comprendre (ou consister en) :  Thus, in addition to said circulating molecules (and in particular in addition to HA and CXCLIO), said additional marker (s) may (for example) comprise (or consist of):
- zéro marqueur clinique ou anatomique comme ci-dessus décrit, ou bien un, deux ou trois (différents) marqueurs choisis parmi l'âge, l'IMC et la dureté du foie, et  - zero clinical or anatomical marker as described above, or one, two or three (different) markers selected from age, BMI and liver hardness, and
- zéro marqueur virologique comme ci-dessus décrit, ou bien le marqueur virologique charge virale. Marqueurs biologiques sélectionnés :  - zero virological marker as described above, or the virological marker viral load. Selected biological markers:
Ainsi, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : - six, cinq, quatre, trois ou deux molécules circulantes différentes telles que ci-dessus décrites, plus particulièrement cinq, quatre, trois ou deux molécules circulantes telles que ci-dessus décrites, plus particulièrement quatre, trois ou deux molécules circulantes telles que ci-dessus décrites, plus particulièrement trois ou deux molécules circulantes telles que ci-dessus décrites, plus particulièrement deux molécules circulantes telles que ci-dessus décrites, lesdites molécules circulantes différentes comprenant au moins HA et CXCLIO, et Thus, the selected biological markers may comprise (or consist of): - six, five, four, three or two different circulating molecules as described above, more particularly five, four, three or two circulating molecules such as above described, more particularly four, three or two circulating molecules as described above, more particularly three or two circulating molecules as described above, more particularly two circulating molecules as described above, said different circulating molecules comprising at least less HA and CXCLIO, and
- zéro, un, deux, trois, quatre ou cinq, ou plus de cinq marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) parmi :  - zero, one, two, three, four or five, or more than five different additional marker (s) chosen from:
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- la dureté du foie dudit sujet (FS), et  the hardness of the liver of said subject (FS), and
- la charge virale dudit sujet (CV), plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his HCV load and / or
VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC. HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
Le nombre total de marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) ci-dessus est plus particulièrement de zéro, un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de zéro, un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de zéro, un, deux ou trois, plus particulièrement de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, plus particulièrement de zéro, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre, cinq, ou plus de cinq, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de un, deux ou trois, plus particulièrement de un ou deux, plus particulièrement de un, plus particulièrement de deux, plus particulièrement de trois, plus particulièrement de quatre, plus particulièrement de cinq. The total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly of zero, one, two, three, four or five, more particularly of zero, one, two, three or four, more particularly zero, one, two or three, more particularly zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly zero, more particularly one, two, three, four, five , or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly one or two, more particularly one , more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five.
Ainsi, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : Thus, the selected biomarkers may include (or consist of):
- deux molécules circulantes différentes telles que ci-dessus décrites, ces deux molécules circulantes différentes étant constituées par HA et CXCL10,  two different circulating molecules as described above, these two different circulating molecules being constituted by HA and CXCL10,
et  and
- zéro, un, deux, trois, quatre, cinq, ou plus de cinq marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) parmi :  - zero, one, two, three, four, five, or more than five different additional marker (s) chosen from:
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- la dureté du foie dudit sujet (FS), et  the hardness of the liver of said subject (FS), and
- la charge virale dudit sujet (CV), plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Le nombre total de marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) ci-dessus est plus particulièrement de zéro, un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de zéro, un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de zéro, un, deux ou trois, plus particulièrement de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, plus particulièrement de zéro, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre, cinq, ou plus de cinq, plus particulièrement de un, deux, trois, quatre ou cinq, plus particulièrement de un, deux, trois ou quatre, plus particulièrement de un, deux ou trois, plus particulièrement de un ou deux, plus particulièrement de un, plus particulièrement de deux, plus particulièrement de trois, plus particulièrement de quatre, plus particulièrement de cinq. The total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly zero, one, two, three, four or five, more particularly zero, one, two, three or four, plus particularly of zero, one, two or three, more particularly zero, one or two, more particularly zero or one, more particularly zero, more particularly one, two, three, four, five, or more than five, more particularly one, two, three, four or five, more particularly one, two, three or four, more particularly one, two or three, more particularly of one or two, more particularly one, more particularly two, more particularly three, more particularly four, more particularly five.
Ainsi, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : Thus, the selected biomarkers may include (or consist of):
- deux molécules circulantes différentes telles que ci-dessus décrites, ces deux molécules circulantes différentes étant constituées par HA et CXCL10,  two different circulating molecules as described above, these two different circulating molecules being constituted by HA and CXCL10,
et  and
- zéro, un, deux ou trois ou quatre marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) parmi :  - zero, one, two or three or four different additional marker (s) chosen from:
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- la dureté du foie dudit sujet (FS), et  the hardness of the liver of said subject (FS), and
- la charge virale dudit sujet (CV), plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  the viral load of said subject (CV), more particularly, the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Le nombre total de marqueur(s) additionnel(s) différents choisi(s) ci-dessus est plus particulièrement de zéro, un, deux ou trois, plus particulièrement de un, deux ou trois, plus particulièrement de deux ou trois, plus particulièrement de zéro, un ou deux, plus particulièrement de zéro ou un, plus particulièrement de zéro, plus particulièrement de un, deux ou trois, plus particulièrement de un ou deux, plus particulièrement de un, plus particulièrement de deux, plus particulièrement de trois, plus particulièrement de quatre. The total number of additional additional marker (s) chosen above is more particularly zero, one, two or three, more particularly one, two or three, more particularly two or three, more particularly from zero, one or two, more particularly from zero or one, more particularly from zero, more particularly from one, two or three, more particularly from one or two, more particularly from one, more particularly from two, more particularly from three, more particularly four.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) HA et CXCL 10. For example, the selected biomarkers may include (or consist of) HA and CXCL 10.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) HA, CXCL10, et l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes). Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) HA, CXCL10, et l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes). For example, the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10, and the age of said subject (more particularly the age of said subject at the time the biological fluid sample required for the detection or quantification of circulating molecules). For example, the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10, and the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of circulating molecules).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) HA, CXCL10 et la dureté du foie dudit sujet (FS).  For example, the selected biomarkers may comprise (or consist of) HA, CXCL10 and the liver hardness of said subject (FS).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : HA, CXCL10, et la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  For example, the selected biological markers may comprise (or consist of): HA, CXCL10, and the viral load (CV) of said subject, more particularly, the viral load of said subject to hepatitis virus, for example, his load in HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules) was made, and
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes).  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes) et  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was made) and
- la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  the viral load (CV) of said subject, more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : - HA, For example, the selected biomarkers may include (or consist of): - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules) was made, and
- la dureté du foie dudit sujet (FS).  the hardness of the liver of said subject (FS).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
- la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en the viral load (CV) of said subject, more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or
VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC. VHD, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
- la dureté du foie (FS) dudit sujet.  - the hardness of the liver (FS) of said subject.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en the viral load (CV) of said subject, more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or
VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC, etHDV, more particularly in HCV and / or HBV, more particularly in HCV, and
- la dureté du foie (FS) dudit sujet. Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) : - the hardness of the liver (FS) of said subject. For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'âge (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age (more particularly the age of the subject at the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
- la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC.  the viral load (CV) of said subject, more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly in HCV.
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'âge dudit sujet (plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the age of said subject (more particularly the age of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes), et  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules was taken), and
- la dureté du foie dudit sujet (FS).  the hardness of the liver of said subject (FS).
Par exemple, les marqueurs biologiques sélectionnés peuvent comprendre (ou consister en) :  For example, the selected biomarkers may include (or consist of):
- HA,  - HA,
- CXCL10,  - CXCL10,
- l'IMC dudit sujet (plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes),  the BMI of said subject (more particularly the BMI of said subject on the date on which the biological fluid sample required for the detection or quantification of the circulating molecules has been taken),
- la charge virale (CV) dudit sujet, plus particulièrement, la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, par exemple, sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC, et - la dureté du foie (FS) dudit sujet. the viral load (CV) of said subject, more particularly the viral load of said subject in the hepatitis virus, for example, his load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, especially in HCV, and - the hardness of the liver (FS) of said subject.
Dans les fonctions LOGIT, mROC et CART ici décrites (LOGITi à LOGIT4,
Figure imgf000032_0001
à Z13, CARTi à CART4 ; cf. ci-dessous), les biomarqueurs sont plus particulièrement comme suit : In the functions LOGIT, mROC and CART described here (LOGITi to LOGIT 4 ,
Figure imgf000032_0001
at Z13, CARTi at CART 4 ; cf. below), biomarkers are more particularly as follows:
- le biomarqueur CXCLIO est la valeur de quantification des formes circulantes de CXCLIO dans ledit patient, plus particulièrement la concentration sérique en CXCLIO, exprimée par exemple en mg/mL, en μg/mL, ng/mL ou pg/mL, plus particulièrement en pg/mL,  the biomarker CXCLIO is the quantification value of the circulating forms of CXCL10 in said patient, more particularly the serum concentration of CXCLIO, expressed for example in mg / ml, in μg / ml, ng / ml or pg / ml, more particularly in pg / mL,
- le biomarqueur HA est la valeur de quantification de HA dans ledit patient, plus particulièrement peut être la concentration sérique en HA, exprimée par exemple en mg/mL, en μg/mL, ng/mL ou pg/mL, plus particulièrement en ng/mL,  the biomarker HA is the quantification value of HA in said patient, more particularly may be the serum concentration of HA, expressed for example in mg / ml, in μg / ml, ng / ml or pg / ml, more particularly in ng / mL,
- le biomarqueur IMC est l'IMC dudit sujet, plus particulièrement l'IMC calculée comme étant la masse dudit sujet en kg divisée par (la taille dudit sujet en m)2, plus particulièrement l'IMC dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes CXCLIO et HA, the biomarker BMI is the BMI of said subject, more particularly the BMI calculated as being the weight of said subject in kg divided by (the size of said subject in m) 2 , more particularly the BMI of said subject at the date on which a biological fluid sampling required for the detection or quantification of circulating molecules CXCL10 and HA,
- le bio marqueur Âge est l'âge dudit sujet, par exemple exprimé en nombre d'années (nombre entier ou avec décimale(s)), plus particulièrement l'âge dudit sujet à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes CXCLIO et HA,  the age marker is the age of said subject, for example expressed in number of years (integer or decimal), more particularly the age of said subject on the date on which the fluid sample was taken. biological requirement for the detection or quantification of circulating molecules CXCL10 and HA,
- le biomarqueur CV est la charge virale dudit sujet en virus de l'hépatite, plus particulièrement sa charge en VHC et/ou en VHB et/ou en VHD, plus particulièrement en VHC et/ou VHB, plus particulièrement en VHC, par exemple exprimée en copies/mL ou en UI/mL ou en multiple de l'une de ces unités tel que en 103 copies par mL, plus particulièrement cette charge à la date à laquelle a été fait le prélèvement de fluide biologique requis pour la détection ou la quantification des molécules circulantes CXCLIO et HA, the biomarker CV is the viral load of said subject in the hepatitis virus, more particularly its load of HCV and / or HBV and / or HDV, more particularly HCV and / or HBV, more particularly HCV, for example expressed in copies / mL or in IU / mL or in a multiple of one of these units such as in 10 3 copies per mL, more particularly this load on the date on which the biological fluid sample required for the detection was made or the quantification of circulating molecules CXCL10 and HA,
- le biomarqueur FS est la dureté du foie dudit sujet, exprimée par exemple en kPA (cette mesure peut être faite de manière non invasive par élastographie impulsionnelle, notamment par FIBROSCAN™).  the biomarker FS is the hardness of the liver of said subject, expressed for example in kPA (this measurement can be made non-invasively by pulse elastography, in particular by FIBROSCAN ™).
Détection et quantification des marqueurs biologiques Pour déterminer si le foie d'un sujet infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou atteint d'une hépatite, plus particulièrement d'une hépatite chronique, n'a pas dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa, ou s'il a au contraire dépassé ce stade, la méthode de la demande comprend l'étape de quantifier, plus particulièrement de détecter et quantifier, pour ledit sujet les marqueurs biologiques sélectionnés {cf. ci-dessus). Detection and quantification of biological markers To determine whether the liver of a subject infected with one or more hepatitis viruses and / or hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has not passed the stage of portal friosis without septa, or if it has on the contrary gone beyond this stage, the method of the request comprises the step of quantifying, more particularly of detecting and quantifying, for said subject the selected biological markers (cf. above).
Les molécules circulantes sélectionnées (qui comprennent au moins HA et CXCL10) sont quantifiées, plus particulièrement détectées et quantifiées, dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet.  The selected circulating molecules (which comprise at least HA and CXCL10) are quantified, more particularly detected and quantified, in a biological fluid sample of said subject.
Une méthode de la demande peut donc comprendre l'étape de prélever un échantillon de fluide biologique dudit sujet. Toutefois, si la méthode est une méthode in vitro, cette étape de prélèvement est une étape préalable à la méthode.  A method of the application may therefore include the step of taking a biological fluid sample from said subject. However, if the method is an in vitro method, this sampling step is a step prior to the method.
Un échantillon de fluide biologique dudit sujet est par exemple un échantillon de sang, de sérum, de plasma ou d'urine, plus particulièrement un échantillon de sang, de sérum ou de plasma, plus particulièrement un échantillon de sérum ou de plasma, plus particulièrement un échantillon de sérum. Cet échantillon de fluide biologique peut avoir été transformé après collecte. Il peut par exemple avoir subi un traitement de purification et/ou concentration et/ou extraction, tel que par exemple par purification et/ou concentration et/ou extraction de ou des protéines et/ou polypeptides et/ou peptides sériques, ou par purification et/ou extraction et/ou concentration d'une fraction protéique. La purification et/ou concentration peut par exemple être faite par fïltration et/ou par gradient de densité.  A sample of biological fluid of said subject is for example a sample of blood, serum, plasma or urine, more particularly a sample of blood, serum or plasma, more particularly a sample of serum or plasma, more particularly a sample of serum. This biological fluid sample may have been transformed after collection. It may, for example, have undergone a purification and / or concentration and / or extraction treatment, for example by purification and / or concentration and / or extraction of or proteins and / or polypeptides and / or serum peptides, or by purification. and / or extraction and / or concentration of a protein fraction. The purification and / or concentration can for example be made by filtration and / or density gradient.
Les valeurs de quantification des molécules circulantes, plus particulièrement de HA et CXCL10, sont des valeurs de concentration ou de proportion, plus particulièrement des valeurs de concentration. Elles peuvent être par exprimées en mg/mL, en μg/mL, ng/mL ou pg/mL. Par exemple, la valeur de quantification de HA est une valeur de concentration exprimée en ng/mL. Par exemple, la valeur de quantification de CXCL10 est une valeur de concentration exprimée en pg/mL. The quantification values of the circulating molecules, more particularly HA and CXCL10, are concentration or proportion values, more particularly concentration values. They can be expressed in mg / mL, in μg / mL, ng / mL or pg / mL. For example, the quantification value of HA is a concentration value expressed in ng / mL. For example, the quantification value of CXCL10 is a concentration value expressed in pg / mL.
Ces valeurs de concentration ou de proportion, plus particulièrement ces valeurs de concentration, peuvent être celles mesurées dans ledit échantillon de fluide biologique ou dans un extrait ou filtrat de cet échantillon. Par exemple, si l'échantillon de fluide biologique prélevé subit un traitement de purification par fïltration avant mesure desdites concentrations ou proportions, les valeurs de quantification peuvent être celles mesurées dans le filtrat de purification dudit échantillon biologique. Par exemple, si l'échantillon de fluide biologique prélevé est du sang, et si le sérum est séparé de ce sang, les valeurs de quantification peuvent être celles mesurées dans le sérum. These concentration or proportion values, more particularly these concentration values, may be those measured in said biological fluid sample or in an extract or filtrate of this sample. For example, if the biological fluid sample taken undergoes purification purification by filtration before measuring said concentrations or proportions, the quantification values may be those measured. in the purification filtrate of said biological sample. For example, if the biological fluid sample taken is blood, and the serum is separated from that blood, the quantification values may be those measured in the serum.
Ainsi, chacune des valeurs de quantification desdites molécules circulantes, plus particulièrement de HA et CXCLIO, peut être une valeur de concentration (ou proportion) sanguine, plasmique ou sérique, plus particulièrement sérique.  Thus, each of the quantification values of said circulating molecules, more particularly of HA and CXCL10, can be a concentration value (or proportion) of blood, plasma or serum, more particularly serum.
Avantageusement, les valeurs de quantification de toutes les molécules circulantes sélectionnées, et plus particulièrement de HA et CXCLIO, sont mesurées dans le même échantillon, ou à tout le moins dans un échantillon de nature identique. Par exemple, les valeurs de quantification de chacune des molécules circulantes sélectionnées, et plus particulièrement de HA et CXCLIO, sont toutes mesurées dans un échantillon de sérum qui n'a subi aucun traitement après collecte, ou bien sont toutes mesurées dans un échantillon de sérum qui a subi le même traitement après collecte (par exemple, le même traitement de purification).  Advantageously, the quantification values of all the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCLIO, are measured in the same sample, or at least in a sample of identical nature. For example, the quantification values of each of the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10, are all measured in a serum sample that has not undergone any post-collection treatment, or are all measured in a serum sample. who has undergone the same treatment after collection (for example, the same purification treatment).
Avantageusement, les valeurs de quantification de toutes les molécules circulantes sélectionnées, et plus particulièrement de HA et CXCLIO, peuvent être mesurées dans un échantillon de sérum non dilué.  Advantageously, the quantification values of all selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10, can be measured in an undiluted serum sample.
Avantageusement, les valeurs de quantification de toutes les molécules circulantes sélectionnées, et plus particulièrement de HA et CXCLIO, peuvent être mesurées dans un seul et même échantillon biologique, plus particulièrement dans un seul et même échantillon de sérum, plus particulièrement dans un seul et même échantillon de sérum non dilué.  Advantageously, the quantification values of all the selected circulating molecules, and more particularly of HA and CXCL10, can be measured in one and the same biological sample, more particularly in a single serum sample, more particularly in one and the same undiluted serum sample.
Dans la méthode de la demande, ladite étape de quantification peut notamment comprendre la détection in vitro de chacune des molécules circulantes sélectionnées comme marqueurs biologiques, telles que HA et CXCLIO.  In the method of the application, said quantification step can notably comprise the in vitro detection of each of the circulating molecules selected as biological markers, such as HA and CXCLIO.
Selon un mode avantageux de réalisation, la détection de chacune des molécules circulantes sélectionnées comme marqueurs biologiques, plus particulièrement de HA et de CXCLIO (aux fins de leur quantification), sont faites en multiplex (détection simultanée dans un seul et même échantillon de fluide biologique) ; cf. exemple 10 ci- dessous. Certains marqueurs de l'art antérieur, tels que A2M, ont une concentration sérique très élevée : leur quantification ne peut donc être faite en multiplex avec des marqueurs dont la concentration sérique est beaucoup plus basse, tels que HA et CXCLIO. Les combinaisons de biomarqueurs décrites dans la demande permettent quant à elles une mise en œuvre en multiplex. Pour la quantification, plus particulièrement pour la détection et quantification, de chacune des molécules circulantes sélectionnées comme marqueurs biologiques, telles que HA et CXCLIO, un ligand spécifique de cette molécule circulante peut être utilisé. Ce ligand peut directement porter un marqueur de détection (tel qu'un marqueur chimio- luminescent ou un fluorophore). Ce ligand peut être utilisé à titre de ligand de capture et/ou de ligand de détection. According to an advantageous embodiment, the detection of each of the circulating molecules selected as biological markers, more particularly HA and CXCL10 (for the purpose of their quantification), are made in a multiplex (simultaneous detection in a single biological fluid sample ); cf. Example 10 below. Some markers of the prior art, such as A2M, have a very high serum concentration: their quantification can not be done in multiplex with markers whose serum concentration is much lower, such as HA and CXCLIO. The combinations of biomarkers described in the application enable them to be implemented in a multiplex. For the quantification, more particularly for the detection and quantification, of each of the circulating molecules selected as biological markers, such as HA and CXCL10, a specific ligand of this circulating molecule can be used. This ligand can directly carry a detection marker (such as a chemiluminescent marker or a fluorophore). This ligand may be used as capture ligand and / or detection ligand.
Ce ligand peut par exemple être une molécule ou un complexe organique, ou une molécule ou un complexe inorganique. Par exemple, ce ligand peut être une protéine (plus particulièrement un anticorps, plus particulièrement un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal), un polysaccharide, un lipide, ou un complexe de protéine(s) et/ou de polysaccharide(s) et/ou de lipide(s).  This ligand may for example be a molecule or an organic complex, or a molecule or an inorganic complex. For example, this ligand may be a protein (more particularly an antibody, more particularly a monoclonal antibody or a polyclonal antibody), a polysaccharide, a lipid, or a complex of protein (s) and / or polysaccharide (s) and / or or lipid (s).
Pour la quantification, plus particulièrement pour la détection et quantification de HA dans le fluide biologique, des protéines qui se lient de manière spécifique à HA, telles qu'un anticorps (polyclonal ou monoclonal) anti-HA, ou telles que la protéine humaine recombinante aggrécane [protéine G1-IGD-G2 commercialisée par la société R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue 1220-PG-025], peuvent être utilisées à titre de ligands.  For quantification, more particularly for the detection and quantification of HA in the biological fluid, proteins that specifically bind to HA, such as an anti-HA (polyclonal or monoclonal) antibody, or such as recombinant human protein Aggrecan [G1-IGD-G2 protein sold by R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), catalog number 1220-PG-025] can be used as ligands.
Pour la quantification, plus particulièrement pour la détection et la quantification de CXCLIO dans le fluide biologique, c'est-à-dire des formes circulantes de CXCLIO, un ou des anticorps (polyclonaux ou monoclonaux) peuvent être utilisés à titre de ligands. Ce (ou ces) anticorps peuvent se lier de manière spécifique à une, à plusieurs ou à toutes les formes circulantes de CXCLIO. Par exemple, peut être mis en œuvre un anticorps (polyclonal ou monoclonal) qui se lie de manière spécifique à une, à plusieurs ou à toutes les protéines de SEQ ID NO : 4 à 9, plus particulièrement à toutes les protéines de SEQ ID NO : 4 à 9 [par exemple, l'anticorps monoclonal de souris anti-CXCL10 humaine, commercialisé par R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue MAB266 (clone 33036, classe IgGl)].  For quantification, more particularly for the detection and quantification of CXCL10 in the biological fluid, i.e., circulating forms of CXCL10, one or more antibodies (polyclonal or monoclonal) can be used as ligands. This (or these) antibodies can bind specifically to one, more or all of the circulating forms of CXCL10. For example, can be implemented an antibody (polyclonal or monoclonal) which specifically binds to one, more or all of the proteins of SEQ ID NO: 4 to 9, more particularly to all the proteins of SEQ ID NO : 4 to 9 [e.g., human anti-CXCL10 mouse monoclonal antibody, commercially available from R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under catalog number MAB266 (clone 33036, Class IgG)].
Si les marqueurs biologiques comprennent en outre un ou plusieurs marqueur(s) additionnel(s), qui ne sont pas des molécules circulantes, plus particulièrement qui ne sont pas des molécules circulantes humaines {cf. ci-dessus), ce ou ces marqueur(s) additionnel(s) sont également quantifiés. If the biological markers further comprise one or more additional marker (s), which are not circulating molecules, more particularly which are not human circulating molecules (cf. above), this or these additional marker (s) are also quantified.
La valeur de quantification de ce, ou de chacun de ces, marqueur(s) additionnel(s) peut(peuvent) être déterminée en la mesurant ou en la collectant pour ou sur ledit sujet, par exemple en collectant la valeur de quantification de ce ou de chacun de ces marqueur(s) additionnel(s) préalablement mesurée pour ou sur ledit sujet. The quantification value of this, or each of these, additional marker (s) may be determined by measuring or collecting it for or on said subject, by for example by collecting the quantization value of this or each of these additional marker (s) previously measured for or on said subject.
Par exemple, si ce(ces) marqueur(s) additionnel(s) est(comprennent) le marqueur âge, la valeur de quantification de ce marqueur peut être déterminée (ou préalablement déterminée) en collectant la valeur de l'âge dudit sujet [par exemple, une valeur exprimée en nombre d'années (nombre entier ou avec décimale(s))].  For example, if this (these) additional marker (s) is (include) the age marker, the quantization value of this marker can be determined (or previously determined) by collecting the age value of said subject [ for example, a value expressed in number of years (whole number or with decimal (s))].
Par exemple, si ce(ces) marqueur(s) additionnel(s) est(comprennent) le marqueur sexe, la valeur de quantification de ce marqueur peut être déterminée (ou préalablement déterminée) en affectant une valeur de quantification à la nature (féminine ou masculine) du sexe dudit sujet [par exemple, valeur de 0 pour un sexe féminin, et valeur de 1 pour un sexe masculin].  For example, if this (these) additional marker (s) is (include) the sex marker, the quantization value of this marker can be determined (or previously determined) by assigning a quantization value to the (female) nature. or male) of the sex of the subject [eg, value of 0 for a female, and value of 1 for a male].
Par exemple, si ce(ces) marqueur(s) additionnel(s) est(comprennent) le marqueur Indice de Masse Corporelle, la valeur de quantification de ce marqueur peut être déterminée (ou préalablement déterminée) sur ledit sujet par mesure de la masse et de la taille dudit sujet (par exemple par mesure de la taille en m et de la masse en kg), pour calculer le rapport de la masse sur la taille au carré [IMC = masse divisée par (taille)2, plus particulièrement masse en kg divisée par (taille en m)2]. For example, if this (these) additional marker (s) is (include) the Body Mass Index marker, the quantization value of that marker can be determined (or previously determined) on said subject by mass measurement. and the size of said subject (for example by measuring the size in m and the mass in kg), to calculate the ratio of mass to size squared [BMI = mass divided by (size) 2 , more particularly weight in kg divided by (size in m) 2 ].
Par exemple, si ce(ces) marqueur(s) additionnel(s) est(comprennent) le marqueur charge virale, la valeur de quantification de ce marqueur peut être déterminée (ou préalablement déterminée) en mesurant in vitro la valeur de la charge ou concentration en virus de l'hépatite (plus particulièrement, en VHC et/ou VHC et/ou VHD, plus particulièrement VHC) dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet (humain), plus particulièrement en mesurant in vitro la valeur de la quantité en virus de l'hépatite dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet (humain) et en déterminant la valeur de cette charge ou concentration virale. La valeur de cette charge en virus de l'hépatite peut par exemple être exprimée en copies/mL ou en UI/mL, ou en multiple de l'une de ces unités tel que en 103 copies par mL. For example, if these (these) additional marker (s) are (include) the viral load marker, the quantification value of this marker can be determined (or previously determined) by measuring in vitro the value of the charge or hepatitis virus concentration (more particularly, in HCV and / or HCV and / or HDV, more particularly HCV) in a sample of biological fluid previously obtained from said subject (human), more particularly by measuring in vitro the value of the quantity of hepatitis virus in a biological fluid sample previously obtained from said subject (human) and determining the value of this load or viral concentration. The value of this hepatitis virus load may, for example, be expressed in copies / ml or in IU / ml, or in multiples of one of these units, such as in 10 3 copies per ml.
La valeur de ce ou de chacun de ces marqueur(s) additionnelle(s) est avantageusement la valeur de ce marqueur à la date à laquelle ledit fluide biologique a été prélevé pour mesurer in vitro les concentrations de chacune desdites molécules circulantes (humaines), plus particulièrement à la date à laquelle ledit fluide biologique a été prélevé pour mesurer in vitro les concentrations de HA et de la protéine CXCL10. Détermination du stade de fibrose hépatique à partir des valeurs de quantification des marqueurs biologiques The value of this or each of these additional marker (s) is advantageously the value of this marker on the date on which said biological fluid was taken to measure in vitro the concentrations of each of said circulating molecules (human), more particularly on the date on which said biological fluid was taken to measure in vitro the concentrations of HA and the protein CXCL10. Determination of hepatic fibrosis stage from quantification values of biological markers
Les valeurs de quantification des marqueurs biologiques sélectionnés (et notamment celles de HA et CXCLIO) sont comparées à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance. The quantification values of the selected biomarkers (and in particular those of HA and CXCLIO) are compared with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject in the of these reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging.
Lesdites cohortes de référence comprennent ou sont :  Said reference cohorts comprise or are:
- une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas ledit stade de fïbrose légère (c'est-à-dire une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl), et  a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed said light fibro- losis stage (ie a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, are of Fl score, and
- une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse ledit stade de fïbrose légère (c'est-à-dire une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl).  - a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds the mild fibrosis stage (that is, a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds that of the hepatic fibrosis stages. which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of score F1).
En d'autres termes, les valeurs de quantification des marqueurs biologiques sélectionnés (et notamment celles de HA et CXCLIO) sont comparées à une valeur de référence (« cut-off » ou « threshold »), prédéterminée pour la classification dudit sujet dans soit la première cohorte soit la deuxième cohorte.  In other words, the quantification values of the selected biomarkers (and in particular those of HA and CXCLIO) are compared with a predetermined value ("cut-off" or "threshold"), predetermined for the classification of said subject in either the first cohort is the second cohort.
Le classement dans la première cohorte détermine ou indique que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet n'a pas dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa.  The classification in the first cohort determines or indicates that the hepatic fibrosis stage of said subject did not exceed the stage of portal fribrose without septa.
Le classement dans la deuxième cohorte détermine ou indique que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet a dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa.  The classification in the second cohort determines or indicates that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal fribrose without septa.
Selon un aspect de la demande, les individus desdites cohortes de référence sont des individus de la même espèce que ledit sujet [par exemple des humains, si ledit sujet est un humain], et sont infectés par un ou des virus de l'hépatite qui appartiennent à différents génotypes. According to one aspect of the application, the individuals of said reference cohorts are individuals of the same species as said subject [for example humans, if said subject is a human], and are infected with one or more hepatitis viruses which belong to different genotypes.
Par exemple, les individus desdites cohortes de référence sont des humains infectés par VHC, et les souches de VHC de ces individus appartiennent à au moins deux génotypes différents, plus particulièrement au moins trois, plus particulièrement au moins quatre, plus particulièrement au moins cinq, plus particulièrement au moins six, plus particulièrement au moins sept génotypes différents. For example, the individuals of said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least two different genotypes, more particularly at least three, more particularly at least four, more particularly at least five, more particularly at least six, more particularly at least seven different genotypes.
Par exemple, les individus desdites cohortes de référence sont des humains infectés par VHC, et les souches de VHC de ces individus appartiennent à au moins quatre génotypes différents, qui comprennent les génotypes 1, 2, 3 et 4.  For example, individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least four different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, and 4.
Par exemple, les individus desdites cohortes de référence sont des humains infectés par VHC, et les souches de VHC de ces individus appartiennent à au moins cinq génotypes différents, qui comprennent les génotypes 1, 2, 3, 4 et 5.  For example, individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least five different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, 4 and 5.
Par exemple, les individus desdites cohortes de référence sont des humains infectés par VHC, et les souches de VHC de ces individus appartiennent à au moins six génotypes différents, qui comprennent les génotypes 1, 2, 3, 4, 5 et 6.  For example, individuals in said reference cohorts are HCV-infected humans, and the HCV strains of these individuals belong to at least six different genotypes, which include genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6.
Les individus de ladite première cohorte de référence comprennent au moins des individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose sans septa (score Fl selon le système de scores de fïbrose Metavir). Individuals of said first reference cohort include at least individuals whose hepatic fibrosis stage is that of fibroid without septa (Fl score according to the Metavir fibrosis scoring system).
Les individus de ladite première cohorte de référence peuvent donc être constitués d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale sans septa [score Fl selon le système de scores de fïbrose Metavir].  The individuals of said first reference cohort may therefore consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fribrose without septa [F1 score according to the Metavir fibrosis scoring system].
Les individus de ladite première cohorte de référence peuvent donc être constitués d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale sans septa et d'individus qui sont infectés par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou atteint d'hépatite (plus particulièrement d'hépatite chronique), mais qui n'ont pas de fïbrose hépatique [scores F0 et F 1 selon le système de scores de fïbrose Metavir]. Les individus de ladite deuxième cohorte de référence comprennent au moins des individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale avec septa(s) (score F2 selon le système de scores de fïbrose Metavir).  Individuals of said first reference cohort may therefore consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa and of individuals who are infected with one or more hepatitis viruses and / or have hepatitis (more particularly chronic hepatitis), but who do not have hepatic fibrosis [F0 and F 1 scores according to the Metavir fibroids scoring system]. Individuals of said second reference cohort include at least individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fibroids with septa (s) (F2 score according to the Metavir fibrosis scoring system).
Les individus de ladite deuxième cohorte de référence peuvent être constitués d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale sans septa [score F2 selon le système de scores de fïbrose Metavir].  Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fribrose without septa [F2 score according to the Metavir fibrosis scoring system].
Les individus de ladite deuxième cohorte de référence peuvent être constitués d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale sans septa et d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose septale sans cirrhose [scores F2 et F3 selon le système de scores de fïbrose Metavir]. Les individus de ladite deuxième cohorte de référence peuvent être constitués d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose portale sans septa, d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la fïbrose septale sans cirrhose et d'individus dont le stade de fïbrose hépatique est celui de la cirrhose [scores F2, F3 et F4 selon le système de scores de fïbrose Metavir]. Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa and individuals whose hepatic fibrosis stage is that of septal fribrose without cirrhosis [F2 scores and F3 according to the Metavir fibrosis scoring system]. Individuals of said second reference cohort may consist of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of portal fungosis without septa, of individuals whose hepatic fibrosis stage is that of septal fribrose without cirrhosis and individuals whose hepatic fibrosis stage is that of cirrhosis [F2, F3 and F4 scores according to the Metavir fibrosis scoring system].
Le nombre total d'individus, qui forment ladite première cohorte de référence et ladite deuxième cohorte de référence, peut être d'au moins 100, plus particulièrement d'au moins 200, avantageusement d'au moins 300. The total number of individuals, which form said first reference cohort and said second reference cohort, may be at least 100, more preferably at least 200, advantageously at least 300.
Chacune de ces deux cohortes est constituée d'une pluralité d'individus et représente 30% à 70% de la population totale des individus (le total des individus de ladite première cohorte de référence et de ladite deuxième cohorte de référence étant de 100%). Par exemple, le nombre des individus qui constituent ladite première cohorte de référence et ladite deuxième cohorte de référence est au total de 100, ladite première cohorte de référence est constituée de 30 individus et ladite deuxième cohorte de référence est constituée de 70 individus.  Each of these two cohorts consists of a plurality of individuals and represents 30% to 70% of the total population of individuals (the total of the individuals in the first and second reference cohorts being 100%). . For example, the total number of individuals constituting the first reference cohort and the second reference cohort is 100, the first reference cohort 30 individuals, and the second reference cohort 70 individuals.
Plus particulièrement, chacune de ces deux cohortes est constituée d'une pluralité d'individus et représente 40%> à 60%> de la population totale des individus, plus particulièrement 40%> à 55%, plus particulièrement 45% à 55%, plus particulièrement 45% à 50%) de la population totale des individus (le total des individus de ladite première cohorte de référence et de ladite deuxième cohorte de référence étant de 100%). Par exemple, le nombre des individus qui constituent ladite première cohorte de référence et ladite deuxième cohorte de référence est au total de plus de 300, et ladite première cohorte de référence est constituée d'un nombre d'individus représentant 40% à 60% de cette population totale de plus de 300 individus (ladite deuxième cohorte de référence est donc alors constituée du nombre d'individus qui représente le pourcentage complémentaire pour arriver à un total de 100%).  More specifically, each of these two cohorts consists of a plurality of individuals and represents 40%> to 60%> of the total population of the individuals, more particularly 40%> to 55%, more particularly 45% to 55%, more particularly 45% to 50%) of the total population of the individuals (the total of the individuals of said first reference cohort and said second reference cohort being 100%). For example, the number of individuals who make up the first and second reference cohorts is more than 300, and the first reference cohort consists of 40 to 60% of this total population of over 300 individuals (the second reference cohort is then the number of individuals that represents the complementary percentage to reach a total of 100%).
Une méthode de la demande est donc une méthode (in vitro) pour déterminer (plus particulièrement pour déterminer avec une forte probabilité) si le stade de fïbrose hépatique d'un sujet (humain) infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou atteint d'hépatite, plus particulièrement d'hépatite chronique, n'a pas dépassé le stade de la fïbrose légère, ou s'il a au contraire dépassé ce stade, ledit stade de fïbrose légère étant celui de la fïbrose portale sans septa (selon le score Metavir de fïbrose hépatique, le stade de fïbrose portale sans septa est le score Fl), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : A demand method is therefore a method (in vitro) to determine (more particularly to determine with high probability) whether the hepatic fibrosis stage of a (human) subject infected with one or more hepatitis viruses and / or or has hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has not passed the stage of mild fibrose, or if it has on the contrary exceeded this stage, said stage of slight fibrosis being that of portal fribrose without septa ( according to the Metavir score of hepatic fibrosis, the stage The non-septal portal fibroose is the score Fl), said method comprising the following steps:
i) dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet (humain), mesurer les quantités de plusieurs molécules circulantes (humaines) dans ledit échantillon, pour obtenir la valeur de la concentration de chacune desdites molécules circulantes, lesdites molécules circulantes (humaines) comprenant ou consistant en l'acide hyaluronique (HA) et la protéine CXCL10 (cf. « Molécules circulantes », « Marqueurs biologiques sélectionnés » et « Détection et quantification des marqueurs biologiques » ci- dessus),  i) in a sample of biological fluid previously obtained from said subject (human), measuring the amounts of several circulating molecules (human) in said sample, to obtain the value of the concentration of each of said circulating molecules, said circulating molecules (human ) comprising or consisting of hyaluronic acid (HA) and protein CXCL10 (see "Circulating Molecules", "Selected Biological Markers" and "Detection and Quantification of Biological Markers" above),
ii) comparer les valeurs de concentrations ainsi obtenues pour chacune desdites molécules circulantes, à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré) de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, lesdites cohortes de référence comprenant ou étant : une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas ledit stade de fïbrose légère, et  ii) comparing the concentration values thus obtained for each of said circulating molecules, with their values, or with the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of those reference cohorts with respect to which he has the highest probability of belonging, said reference cohorts comprising or being: a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed said stage of slight fibrose, and
une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse ledit stade de fïbrose légère,  a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds the light fibrosis stage,
le classement dans ladite première cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet n'a pas dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa, the classification in said first cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject did not exceed the stage of portal friosis without septa,
le classement dans ladite deuxième cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet a dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa. the classification in said second cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal friosis without septa.
Plus particulièrement, une méthode de la demande est une méthode (in vitro) pour déterminer (plus particulièrement pour déterminer avec une forte probabilité) si le stade de fïbrose hépatique d'un sujet (humain) infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite et/ou atteint d'hépatite, plus particulièrement d'hépatite chronique, n'a pas dépassé le stade de la fïbrose légère, ou s'il a au contraire dépassé ce stade, ledit stade de fïbrose légère étant celui de la fïbrose portale sans septa (selon le score Metavir de fïbrose hépatique, le stade de fïbrose portale sans septa est le score Fl), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : More specifically, a demand method is a method (in vitro) for determining (more particularly to determine with high probability) whether the hepatic fibrosis stage of a (human) subject infected with one or more hepatitis viruses. and / or hepatitis, more particularly chronic hepatitis, has not passed the stage of mild fibrose, or if it has on the contrary exceeded this stage, said light fibroosis stage being that of portal fibrose without septa (according to the Metavir score of hepatic fibrosis, the stage of septal fiebrose without septa is the score Fl), said method comprising the following steps:
i) sélectionner différents marqueurs (ou variables) biologiques, les différents marqueurs (ou variables) biologiques sélectionnés comprenant (ou consistant en) : a) différentes molécules circulantes (humaines), lesdites différentes molécules circulantes (humaines) comprenant ou consistant en HA et CXCL10 {cf. « Molécules circulantes », « Marqueurs biologiques sélectionnés » et « Détection et quantification des marqueurs biologiques » ci-dessus), et i) selecting different biological markers (or variables), the different biological markers (or variables) selected comprising (or consisting of): a) different circulating molecules (human), said different circulating molecules (human) comprising or consisting of HA and CXCL10 (cf. "Circulating Molecules", "Selected Biological Markers" and "Detection and Quantification of Biological Markers" above), and
b) zéro, un, deux, trois ou quatre marqueur(s) additionnel(s) parmi la liste de marqueurs constituée par l'âge, l'Indice de Masse Corporelle (IMC), la charge virale (CV), et la dureté du foie (FS) {cf. « Éventuel(s) marqueur(s) additionnel(s) », « Marqueurs biologiques sélectionnés » et « Détection et quantification des marqueurs biologiques » ci-dessus),  b) zero, one, two, three or four additional marker (s) from the list of markers consisting of age, Body Mass Index (BMI), viral load (CV), and hardness liver (FS) (cf. 'Possible additional marker (s)', 'Selected biological markers' and 'Detection and quantification of biological markers' above,
ii) quantifier les différents marqueurs (ou variables) biologiques sélectionnés à l'étape i)  ii) quantify the different biological markers (or variables) selected in step i)
en mesurant in vitro les concentrations de chacune desdites molécules circulantes (humaines) de l'étape i)a) ci-dessus, dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet, plus particulièrement en mesurant in vitro les quantités de chacune desdites molécules circulantes (humaines) de l'étape i)a) ci-dessus, dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet (humain) pour déterminer la valeur de la concentration de chacune desdites molécules circulantes [dans ledit échantillon et/ou dans ledit sujet], et  by measuring in vitro the concentrations of each of said circulating molecules (human) of step i) a) above, in a sample of biological fluid previously obtained from said subject, more particularly by measuring in vitro the amounts of each of said circulating molecules (human) of step i) a) above, in a biological fluid sample previously obtained from said subject (human) to determine the value of the concentration of each of said circulating molecules [in said sample and / or in that subject], and
lorsqu'un, deux, trois, quatre ou cinq marqueurs additionnel(s) est(sont) choisi(s) parmi ladite liste de l'étape i)b) ci-dessus, et lorsque ce (ou ces) marqueur(s) additionnel(s) est(sont) ou comprennent un ou plusieurs marqueur(s) parmi l'âge, l'Indice de Masse Corporelle et la dureté du foie : en collectant la valeur de quantification de ce ou chacun de ces marqueur(s) additionnel(s) qui a été préalablement déterminée pour ou sur ledit sujet,  when one, two, three, four or five additional markers are chosen from said list of step i) b) above, and when said marker (s) additional (s) is (are) or include one or more marker (s) among age, Body Mass Index and liver hardness: by collecting the quantification value of this or each of these marker (s) additional (s) which has been previously determined for or on the subject,
lorsqu'un, deux, trois, quatre ou cinq marqueurs additionnel(s) est(sont) choisi(s) parmi ladite liste de l'étape i)b) ci-dessus, et lorsque ce (ou ces) marqueur(s) additionnel(s) est(sont) ou comprennent la charge virale : en mesurant cette charge virale in vitro dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet, ou en collectant la valeur de cette charge virale qui a été préalablement déterminée pour ledit sujet,  when one, two, three, four or five additional markers are chosen from said list of step i) b) above, and when said marker (s) additional (s) is (are) or include the viral load: by measuring this viral load in vitro in a sample of biological fluid previously obtained from said subject, or by collecting the value of this viral load which has been previously determined for said subject,
iii) comparer les valeurs de quantification obtenues à l'étape ii) à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré) de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, lesdites cohortes de référence comprenant ou étant : iii) comparing the quantification values obtained in step ii) with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of these cohorts of reference to which it has the highest probability of belonging, said reference cohorts comprising or being:
une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas ledit stade de fïbrose légère, et  a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed said light fibrosis stage, and
une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse ledit stade de fïbrose légère,  a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds the light fibrosis stage,
le classement dans ladite première cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet n'a pas dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa, the classification in said first cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject did not exceed the stage of portal friosis without septa,
le classement dans ladite deuxième cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet a dépassé le stade de la fïbrose portale sans septa. the classification in said second cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has passed the stage of portal friosis without septa.
À ladite étape i)b), on sélectionne plus particulièrement zéro, un, deux ou trois marqueur(s) additionnel(s) parmi la liste de marqueurs constituée par l'âge, l'Indice de Masse Corporelle (IMC), la charge virale (CV) et la dureté du foie (FS), parmi cette liste {cf. « Éventuel(s) marqueur(s) additionnel(s) » ci-dessus).  In said step i) b), one more particularly selects zero, one, two or three additional marker (s) among the list of markers constituted by the age, the Body Mass Index (BMI), the load. virus (CV) and liver hardness (FS), among this list (cf. "Possible additional marker (s)" above).
Par exemple, on ne sélectionne aucun marqueur additionnel, ou l'on sélectionne le marqueur additionnel dureté du foie, ou les marqueurs additionnels âge et IMC, ou les marqueurs additionnels âge, IMC et charge virale. For example, no additional markers are selected, or additional liver hardness marker, or additional age and BMI markers, or additional age, BMI, and viral load markers are selected.
Ainsi, les différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) peuvent par exemple comprendre ou consister en :  Thus, the different biological markers selected in step i) may for example comprise or consist of:
- l'acide hyaluronique (HA) et la protéine CXCL10, ou  hyaluronic acid (HA) and CXCL10 protein, or
- l'acide hyaluronique (HA), la protéine CXCL10, l'âge et l'IMC, ou  hyaluronic acid (HA), CXCL10 protein, age and BMI, or
- l'acide hyaluronique (HA), la protéine CXCL10, l'âge, l'IMC et la charge virale (CV), ou  hyaluronic acid (HA), CXCL10 protein, age, BMI and viral load (CV), or
- l'acide hyaluronique (HA), la protéine CXCL10 et la dureté du foie (FS) ;  hyaluronic acid (HA), CXCL10 protein and liver hardness (FS);
cf. « Molécules circulantes », « Éventuel(s) marqueur(s) additionnel(s) », « Marqueurs biologiques sélectionnés » et « Détection et quantification des marqueurs biologiques » ci- dessus. Ladite étape de comparaison des valeurs de quantification des marqueurs biologiques à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré) de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, peut être réalisée par tout moyen que la personne du métier considère appropriée. cf. "Circulating Molecules", "Possible Additional Marker (s)", "Selected Biological Markers" and "Detection and Quantification of Biological Markers" above. Said step of comparing the quantification values of the biological markers with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of these cohorts of reference to which it has the highest probability membership, can be achieved by any means that the person skilled in the art considers appropriate.
Cette comparaison peut notamment être faite par classification, plus particulièrement en combinant les valeurs de dosage (ou de mesure) obtenues pour ledit sujet dans un modèle de classification, plus particulièrement dans un modèle de classification multivariée.  This comparison can in particular be made by classification, more particularly by combining the assay (or measurement) values obtained for said subject in a classification model, more particularly in a multivariate classification model.
Un tel modèle de classification compare (de manière combinée) les valeurs de dosage obtenues pour ledit sujet à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence pré-établies selon leur score de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, par exemple en lui attribuant une valeur de sortie indicatrice du score de fïbrose hépatique dudit sujet.  Such a classification model compares (in a combined manner) the assay values obtained for said subject with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to their hepatic fibrosis score, to classify said subject. in that of these reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging, for example by attributing to it an output value indicative of the hepatic fibrosis score of said subject.
Un tel modèle de classification peut être construit, notamment préalablement construit, en faisant une comparaison inter-cohorte des valeurs de dosage obtenues pour lesdites cohortes de référence ou des distributions de ces valeurs de dosage.  Such a classification model may be constructed, in particular previously constructed, by making an inter-cohort comparison of the assay values obtained for said reference cohorts or distributions of these assay values.
Plus particulièrement, un tel modèle de classification peut être construit, notamment préalablement construit, en mesurant ou collectant les valeurs de quantification des marqueurs biologiques dans des cohortes de référence pré-établies selon leur score de fïbrose hépatique, et en analysant ces valeurs de dosage, ou leur distribution, par une méthode statistique pour construire un modèle de classification, plus particulièrement un modèle de classification multivarié, qui induit ou détermine un score de fïbrose hépatique à partir desdites valeurs de quantification.  More particularly, such a classification model can be constructed, in particular previously constructed, by measuring or collecting the quantification values of the biological markers in pre-established reference cohorts according to their hepatic fibrosis score, and by analyzing these assay values, or their distribution, by a statistical method for constructing a classification model, more particularly a multivariate classification model, which induces or determines a hepatic fibrosis score from said quantification values.
Un modèle de classification peut par exemple être (préalablement) construit par : - constitution d'au moins deux cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré ou score) de fïbrose hépatique,  For example, a classification model can be (previously) constructed by: - setting up at least two pre-established reference cohorts according to the stage (or degree or score) of hepatic fibrosis,
une première cohorte de référence consistant en des individus, dont le stade de fïbrose hépatique ne dépasse pas ledit stade de fïbrose légère, et  a first reference cohort consisting of individuals whose hepatic fibrosis stage does not exceed said light fibrosis stage, and
une deuxième cohorte de référence consistant en des individus, dont le stade de fïbrose hépatique dépasse ledit stade de fïbrose légère {cf. « Détermination du stade de fïbrose hépatique à partir des valeurs de quantification des marqueurs biologiques » ci-dessus),  a second reference cohort consisting of individuals whose hepatic fibrosis stage exceeds said light fibrosis stage (cf. "Determination of hepatic fibrosis stage from quantification values of biological markers" above),
- quantification de chacun desdits différents marqueurs biologiques sélectionnés dans ladite première cohorte de référence et dans ladite deuxième cohorte de référence, - comparaison (mathématique et/ou statistique) des valeurs de quantification que lesdits marqueurs prennent dans la première cohorte de référence à celles qu'ils prennent (respectivement) dans la deuxième cohorte de référence. quantifying each of said different biological markers selected in said first reference cohort and in said second reference cohort, - comparison (mathematical and / or statistical) of the quantification values that said markers take in the first cohort of reference to those they take (respectively) in the second reference cohort.
Plus particulièrement, ledit modèle de classification peut être (préalablement) construit comme suit :  More particularly, said classification model can be (previously) constructed as follows:
a) pour une population d'individus qui sont de la même espèce que ledit sujet, et qui sont infectés par le ou les mêmes virus de l'hépatite que ledit sujet, déterminer le stade (ou degré ou score) de fîbrose hépatique de chacun desdits individus de la population, et les classer en sous-populations selon leur stade (ou degré ou score) de fîbrose hépatique, constituant ainsi des cohortes de référence établies selon leur stade (ou degré ou score) de fîbrose hépatique, lesdites cohortes de référence comprenant ou étant :  (a) for a population of individuals who are of the same species as the subject and who are infected with the same hepatitis virus or viruses as the subject, determine the stage (or degree or score) of liver fibrosis of each of said individuals in the population, and classify them into subpopulations according to their stage (or degree or score) of hepatic fibrosis, thus constituting reference cohorts established according to their stage (or degree or score) of liver fibrosis, said reference cohorts including or being:
une première cohorte de référence dans laquelle le stade (ou degré ou score) de fîbrose hépatique des individus ne dépasse pas le stade de la fîbrose portale sans septa (c'est-à-dire ne dépassant pas le score de fîbrose Metavir Fl), et  a first reference cohort in which the stage (or degree or score) of liver fibrosis of the individuals does not exceed the stage of portal fiabrosis without septa (i.e., not exceeding the Metavir F1 fibrogen score), and
une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade (ou degré ou score) de fîbrose hépatique des individus dépasse le stade de la fîbrose portale sans septa (c'est-à-dire dépassant le score de fîbrose Metavir Fl) ; β) pour chacun desdits individus, quantifier les différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) de la revendication 1,  a second reference cohort in which the stage (or degree or score) of liver fibrosis of individuals exceeds the stage of portal fiabrosis without septa (i.e. exceeding the Metavir F1 fibrin score); β) for each of said individuals, quantifying the different biological markers selected in step i) of claim 1,
et and
γ) faire une comparaison inter-cohorte des valeurs de quantification obtenues à l'étape β), ou de la distribution de ces valeurs, pour construire un modèle de classification, qui, à partir de valeurs de quantification desdits marqueurs biologiques sélectionnés (plus particulièrement, à partir de la combinaison de ces valeurs), induit un classement dans l'une desdites cohortes de référence.  γ) making an inter-cohort comparison of the quantification values obtained in step β), or the distribution of these values, to construct a classification model, which, based on quantification values of said selected biomarkers (more particularly , from the combination of these values), induces a ranking in one of said reference cohorts.
Ladite étape de comparaison peut être réalisée en classant les valeurs de quantification obtenues pour ledit sujet dans un modèle de classification, plus particulièrement un modèle de classification multivariée pour affecter audit sujet un score (Z) indiquant si le stade (ou degré) de fîbrose hépatique dudit sujet a ou non dépassé ledit stade de fîbrose légère. Ledit modèle de classification peut être un modèle qui, à partir de la combinaison des valeurs de quantification desdits marqueurs biologiques, induit une valeur de score (Z) à partir de la combinaison des valeurs de quantification desdits marqueurs biologiques sélectionnés. Said comparative step can be performed by classifying the quantification values obtained for said subject in a classification model, more particularly a multivariate classification model for assigning to said subject a score (Z) indicating whether the stage (or degree) of liver fibrosis said subject has or has not passed said light fibrosis stage. Said classification model may be a model which, from the combination of the quantification values of said biological markers, induces a score value (Z) from the combination of the quantification values of said selected biological markers.
Plus particulièrement, ladite étape de comparaison peut être réalisée en appliquant aux valeurs de quantification obtenues pour ledit sujet une règle décisionnelle de classification préétablie pour classer ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance (plus particulièrement, pour classer ledit sujet dans ladite première cohorte de référence ou dans ladite deuxième cohorte de référence).  More particularly, said comparison step can be performed by applying to the quantization values obtained for said subject a predetermined classification decision rule for classifying said subject in that of said reference cohorts with respect to which he has the highest probability of belonging (more particularly, to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
Cette règle décisionnelle peut être une règle qui compare les valeurs de quantification obtenues pour les marqueurs biologiques sélectionnés, à une ou des valeurs seuils prédéterminée(s) par classification, pour classer ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance (c'est-à-dire pour classer ledit sujet dans ladite première cohorte de référence ou dans ladite deuxième cohorte de référence).  This decision rule can be a rule that compares the quantification values obtained for the selected biomarkers, with one or more predetermined threshold values by classification, to classify said subject in that of said reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging (ie to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
Par exemple, un modèle peut être construit par une fonction mathématique, une technique non paramétrique, une procédure de classification heuristique ou encore une approche de prédiction probabiliste. Un exemple typique de classification fondée sur la quantification de marqueurs biologiques consiste en la discrimination de sujets "sains" versus "malades". La formalisation de ce problème consiste en m échantillons indépendants, décrits par n variables aléatoires. Chaque individu i (i =1 , . .. , m) est caractérisé par un vecteur ¾ décrivant les n valeurs caractéristiques: Xy, i = \ , . ..m j = \ , . ..n. Ces valeurs caractéristiques peuvent par exemple représenter des valeurs de concentrations protéiques et/ou des données cliniques et/ou anatomiques et/ou des données virologiques. Chaque échantillon ¾ est associé à une valeur discrète y représentant le statut clinique de l'individu i. A titre d'exemple, yi = 0 si le patient i a un score de fïbrose hépatique Fl , yi = 1 si le patient i a un score de fïbrose hépatique F2. Un modèle offre une règle décisionnelle (par exemple, une fonction mathématique, un algorithme ou une procédure), qui utilise l'information disponible depuis Xj pour prédire yj dans chaque échantillon observé. L'objectif est d'utiliser ce modèle afin de prédire le statut clinique du patient p, à savoir yp, à partir des valeurs biologiques et/ou cliniques disponibles, à savoir xp. Différents modèles de classification sont connus de la personne du métier (cf. Hastie, Tibishirani et Friedman, 2009 ; Falissard, 2005 ; Theodoridis et Koutroumbos 2009). Les règles décisionnelles des modèles de classification multivariée peuvent par exemple être fondées sur une formule mathématique du type y =f(xi,X2,■■■xn) où / est une fonction mathématique linéaire ou non linéaire (régression logistique, mROC, par exemple), ou sur un algorithme d'apprentissage automatique ou d'intelligence artificielle dont les caractéristiques consistent en une série de paramètres de réglage identifiés comme étant les plus efficaces pour la discrimination des sujets (par exemple, KNN, WKNN, SVM, RF). Tout modèle de classification que la personne du métier considère approprié peut être utilisé ou mis en œuvre. For example, a model can be constructed by a mathematical function, a non-parametric technique, a heuristic classification procedure or a probabilistic prediction approach. A typical example of a classification based on the quantification of biological markers is the discrimination of "healthy" versus "sick" subjects. The formalization of this problem consists of m independent samples, described by n random variables. Each individual i (i = 1, ..., m) is characterized by a vector ¾ describing the n characteristic values: Xy, i = \,. ..mj = \,. ..not. These characteristic values may for example represent protein concentration values and / or clinical and / or anatomical data and / or virological data. Each sample ¾ is associated with a discrete value y representing the clinical status of the individual i. By way of example, yi = 0 if the patient has a liver fibrosis score F1, yi = 1 if the patient has a liver fibrosis F2 score. A model provides a decision rule (for example, a mathematical function, algorithm, or procedure) that uses the information available from Xj to predict yj in each sample observed. The aim is to use this model to predict the clinical status of the patient p, ie, p , from the available biological and / or clinical values, ie x p . Different classification models are known to those skilled in the art (see Hastie, Tibishirani and Friedman 2009, Falissard 2005, Theodoridis and Koutroumbos 2009). For example, the decision rules of multivariate classification models can be based on a mathematical formula of the type y = f (xi, X2, ■■■ x n ) where / is a linear or nonlinear mathematical function (logistic regression, mROC, by example), or on a machine learning or artificial intelligence algorithm whose characteristics consist of a series of tuning parameters identified as most effective for subject discrimination (eg KNN, WKNN, SVM, RF) . Any classification model that the skilled person considers appropriate may be used or implemented.
Conformément à la demande, ladite règle décisionnelle de classification peut par exemple être :  In accordance with the request, said decision rule of classification can for example be:
- une méthode d'analyse statistique, plus particulièrement d'analyse statistique multivariée, par exemple :  a method of statistical analysis, more particularly multivariate statistical analysis, for example:
une méthode ROC (Receiver Operating Characteristics),  a Receiver Operating Characteristics (ROC) method,
une fonction mathématique linéaire ou non linéaire, notamment une fonction mathématique linéaire, tel qu'une fonction générée par la méthode mROC (méthode ROC multivariée), ou  a linear or non-linear mathematical function, in particular a linear mathematical function, such as a function generated by the mROC method (multivariate ROC method), or
une méthode de régression, linéaire ou non linéaire, comme par exemple la régression logistique, plus particulièrement la régression logistique mettant en œuvre une fonction affine (LOGIT);  a regression method, linear or nonlinear, such as, for example, logistic regression, more specifically logistic regression implementing an affine function (LOGIT);
une méthode PLS-DA (Partial Least Squares - Discriminant Analysis) ; une méthode LDA (Linear Discriminant Analysis) ;  a PLS-DA method (Partial Least Squares - Discriminant Analysis); an LDA (Linear Discriminant Analysis) method;
- une méthode de classification par apprentissage ou intelligence artificielle, par exemple, un algorithme d'apprentissage ou d'intelligence artificielle, une méthode de classification non paramétrique, ou heuristique, ou de prédiction probabiliste, telle que :  a method of classification by learning or artificial intelligence, for example, a learning or artificial intelligence algorithm, a non-parametric or heuristic classification method, or a probabilistic prediction method such as:
un arbre décisionnel, telle que la méthode CART (Classification And Régression Tree) ; ou  a decision tree, such as the CART (Classification And Regression Tree) method; or
une méthode de type boosting, fondée sur des classifîeurs binaires (ex : Adaboost) ou une méthode liée au boosting (bagging) ; ou  a boosting method, based on binary classifiers (eg Adaboost) or a method linked to boosting (bagging); or
une méthode des k plus proches voisins (k-nearest neighbors ou KNN), ou plus généralement la méthode des k plus proches voisins pondérés (weighed k- nearest neighbors ou WKNN), ou une méthode (par exemple, un algorithme) Machines à Vecteurs de support (Support Vector Machine ou SVM) ; ou a k-nearest neighbors (KNN) method, or more generally the weighted k-nearest neighbors (WKNN) method, or a method (for example, an algorithm) Support Vector Machines (SVM); or
une forêt aléatoire (Random Forest ou RF); ou  a random forest (Random Forest or RF); or
un réseau bayésien ; ou  a Bayesian network; or
un réseau de neurones (Neural Network) ; ou  a neural network (Neural Network); or
un treillis de Galois (ou Formai Concept Analy sis).  a lattice of Galois (or Formal Concept Analy sis).
La méthode ROC multivariée (mROC) est une généralisation de la méthode ROC (Receiver Operating Characteristic) (cf. Reiser et Faraggi 1997 ; Su et Liu 1993, Shapiro, 1999). Elle calcule l'aire sous la courbe ROC (Area Under the Curve ou AUC) relative à une combinaison linéaire de biomarqueurs et/ou de transformations de biomarqueurs (dans le cas d'une normalisation), sous l'hypothèse d'une distribution normale multivariée. La méthode mROC a notamment été décrite dans Kramar et al. 1999 et Kramar et al. 2001. Le logiciel mROC version 1.0, disponible commercialement auprès des concepteurs (A. Kramar, A. Fortune, D. Farragi et B. Reiser) peut par exemple être utilisé pour construire un modèle mROC. Andrew Kramar et Antoine Fortune peuvent être contactés auprès de, ou via, l'Unité de Biostatistique du Centre Régional de Lutte contre le Cancer (CRLC) Val dAurelle - Paul Lamarque (208, rue des Apothicaires ; Parc Euromédecine ; 34298 Montpellier Cedex 5 ; France). David Faraggi et Benjamin Reiser peuvent être contactés auprès du, ou via le, Département de Statistique de l'Université de Haifa (Mount Carmel ; Haifa 31905 ; Israël). Un modèle mROC peut prendre la forme d'une fonction linéaire de type Z = a(BMQi) + b(BMQ2) + + w(BMQn) avec BMQ = biomarqueur, n étant le nombre de biomarqueurs BMQ, BMQi étant la valeur de quantification d'un des biomarqueurs sélectionnés (i allant de 1 à n) ou la valeur de la transformée Box-Cox de cette valeur de quantification [Box et Cox 1964 : pour un biomarqueur BMQ, la transformée Box-Cox de la valeur de quantification de BMQ est BMQ1, qui est égal à (BMQ¾, - 1) / λ], et avec a, b, ... et w étant les paramètres de la fonction mROC. The multivariate ROC method (mROC) is a generalization of the Receiver Operating Characteristic (ROC) method (see Reiser and Faraggi 1997, Su and Liu 1993, Shapiro, 1999). It calculates the area under the Area Under the Curve (AUC) curve for a linear combination of biomarkers and / or biomarker transformations (in the case of normalization), under the assumption of a normal distribution multivariate. The mROC method has in particular been described in Kramar et al. 1999 and Kramar et al. 2001. The mROC software version 1.0, available commercially from the designers (A. Kramar, A. Fortune, D. Farragi and B. Reiser) can for example be used to build a model mROC. Andrew Kramar and Antoine Fortune can be contacted at, or via, the Biostatistics Unit of the Regional Center for the Fight Against Cancer (CRLC) Val dAurelle - Paul Lamarque (208, rue des Apothicaires, Parc Euromédecine, 34298 Montpellier Cedex 5; France). David Faraggi and Benjamin Reiser can be contacted at, or through, the Department of Statistics at Haifa University (Mount Carmel, Haifa 31905, Israel). A mROC model can take the form of a linear function of type Z = a (BMQi) + b (BMQ 2 ) + + w (BMQn) with BMQ = biomarker, n being the number of biomarkers BMQ, BMQi being the value of quantification of one of the selected biomarkers (i ranging from 1 to n) or the value of the Box-Cox transform of this quantization value [Box and Cox 1964: for a BMQ biomarker, the Box-Cox transform of the quantization value BMQ is BMQ 1 , which is equal to (BMQ ¾ , - 1) / λ], and with a, b, ... and w being the parameters of the mROC function.
La régression logistique (LR) mettant en œuvre une fonction affine, ou fonction LOGIT, est un modèle de régression binomiale (Berkson 1944 ; Berkson 1951). Un modèle de régression logistique peut prendre la forme d'une fonction affine de type LOGIT = Intercept + k(BMQi) + 1(BMQ2) + ...+ w(BMQn), avec BMQ = biomarqueur, n le nombre de biomarqueurs BMQ, BMQi = la valeur de quantification d'un des biomarqueurs sélectionnés (i allant de 1 à n), et avec Intercept, k, 1, ...et z les paramètres de la fonction LOGIT. Logistic regression (LR) using an affine function, or LOGIT function, is a binomial regression model (Berkson 1944, Berkson 1951). A logistic regression model can take the form of an affine function of type LOGIT = Intercept + k (BMQi) + 1 (BMQ 2 ) + ... + w (BMQn), with BMQ = biomarker, n the number of biomarkers BMQ, BMQi = the quantization value of one of the selected biomarkers (i ranging from 1 to n), and with Intercept, k, 1, ... and z the parameters of the LOGIT function.
La famille des méthodes d'intelligence artificielle ou d'apprentissage automatique est une famille d'algorithmes qui, au lieu de procéder à une généralisation explicite, comparent les exemples d'un nouveau problème avec les exemples considérés en apprentissage et qui ont été stockés en mémoire. Ces algorithmes construisent directement les hypothèses à partir des exemples d'apprentissage eux-mêmes. The family of artificial intelligence or machine learning methods is a family of algorithms which, instead of making explicit generalizations, compare the examples of a new problem with the examples considered in learning and which were stored in memory. These algorithms directly construct the hypotheses from the learning examples themselves.
Un exemple de ce type d'algorithme est l'algorithme CART dont l'acronyme signifie « Classification And Régression Trees » (Breiman 1984). Un modèle CART est un arbre de décision. Un exemple en est présenté en Figure 12. La valeur de quantification de chacun des biomarqueurs (BMQi) est comparée à une succession de valeurs seuils (paramètres h, i et j en Figure 12) qui, en suivant l'arbre de décision, permet de classer l'échantillon testé (en Figure 12 : score < F2, ou score > F2).  An example of this type of algorithm is the CART algorithm whose acronym stands for "Classification And Regression Trees" (Breiman 1984). A CART model is a decision tree. An example is presented in Figure 12. The quantification value of each biomarker (BMQi) is compared to a succession of threshold values (parameters h, i and j in Figure 12) which, following the decision tree, allows to classify the sample tested (in Figure 12: score <F2, or score> F2).
Un exemple autre de ce type d'algorithme est l'algorithme des k plus proches voisins (k-nearest neighbors ou K N), et une de ses extensions possibles connue sous le nom d'algorithme des k plus proches voisins pondérés (weighted k nearest neighbors ou WKNN) (Hechenbichler et Schliep, 2004). Dans le contexte de classification d'une nouvelle observation x, l'idée fondatrice simple est de faire voter les plus proches voisins de cette observation. La classe (ou statut clinique) de x est déterminée en fonction de la classe majoritaire parmi les k plus proches voisins de l'observation x. Des bibliothèques de fonctions spécifiques K NN sont disponibles par exemple dans le logiciel R (http://www. R-project.org/). Le logiciel R a été initialement développé par John Chambers et les laboratoires Bell (cf. Chambers 2008). La version actuelle de cette suite logicielle est la version 2.1 1.1. Le code source est disponible librement sous les termes de la licence publique générale « Free Software Foundation' s GNU », sur le site http://www. R-project.org/. Ce logiciel peut être utilisé pour construire un modèle WKNN.  Another example of this type of algorithm is the k-nearest neighbors (KN) algorithm, and one of its possible extensions known as the k nearest weighted neighbor algorithm (weighted k nearest neighbors or WKNN) (Hechenbichler and Schliep, 2004). In the context of classifying a new observation x, the simple founding idea is to have the nearest neighbors vote on this observation. The class (or clinical status) of x is determined according to the majority class among the k nearest neighbors of the observation x. Specific function libraries K NN are available for example in the R software (http: // www. R- project.org/). The R software was originally developed by John Chambers and Bell Laboratories (see Chambers 2008). The current version of this software suite is version 2.1 1.1. The source code is freely available under the terms of the GNU Free Software Foundation's General Public License, at http: // www. R-project.org/. This software can be used to build a WKNN model.
Une Forêt Aléatoire (Random Forest ou RF) est constituée d'un ensemble d'arbres simples de prévision, chacun étant capable de produire une réponse lorsqu'on lui présente un sous-ensemble de prédicteurs (Breiman 2001 ; Liaw et Wiener 2002). Les calculs sont réalisés avec le logiciel R. Ce logiciel peut être utilisé pour construire des modèles RF.  A Random Forest (Random Forest or RF) consists of a set of simple prediction trees, each of which is able to produce an answer when presented with a subset of predictors (Breiman 2001, Liaw and Wiener 2002). The calculations are done with the software R. This software can be used to build RF models.
Un réseau de neurones est constitué d'un graphe pondéré orienté dont les nœuds symbolisent les neurones. Le réseau est construit à partir d'exemples de chaque classe (par exemple, F2 versus Fl), et est ensuite utilisé pour déterminer à quelle classe appartient un nouvel élément ; cf. Intrator et Intrator 1993, Riedmiller et Braun 1993, Riedmiller 1994, Anastasiadis et. al. 2005 ; cf. http://cran.r-project.org/web/packages/neuralnet/index.html. Le logiciel R librement disponible sur http://www.r-project.org/, (version 1.3 de Neuralnet, écrit par Stefan Fritsch et Frauke Guenther, suivant le travail de Marc Suling) peut par exemple être utilisé pour construire un réseau de neurones. A neural network consists of an oriented weighted graph whose nodes symbolize the neurons. The network is built from examples of each class (for example example, F2 versus Fl), and is then used to determine which class a new element belongs to; cf. Intrator and Intrator 1993, Riedmiller and Braun 1993, Riedmiller 1994, Anastasiadis et. al. 2005; cf. http://cran.r-project.org/web/packages/neuralnet/index.html. The R software freely available at http://www.r-project.org/, (version 1.3 of Neuralnet, written by Stefan Fritsch and Frauke Guenther, following the work of Marc Suling) can for example be used to build a network of neurons.
Conformément à la demande, la comparaison des valeurs de quantification des biomarqueurs sélectionnés, à leurs valeurs ou à la distribution de leurs valeurs dans des cohortes de référence préétablies selon le stade de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, peut donc être notamment réalisée en suivant une méthode, et/ou en utilisant un algorithme ou un logiciel : As requested, the comparison of the quantification values of the selected biomarkers with their values or the distribution of their values in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject in that of these reference cohorts. for which he has the highest probability of belonging, can therefore be achieved by following a method, and / or using an algorithm or software:
- qui est basé sur une fonction mathématique, tel que par exemple :  - which is based on a mathematical function, such as for example:
- une fonction linéaire (par exemple, une fonction mROC) ou - a linear function (for example, a mROC function) or
- une fonction non linéaire, telle que par exemple une fonction affine (par exemple, une régression logistique LOGIT), ou a non-linear function, such as for example an affine function (for example, a LOGIT logistic regression), or
- qui n'est pas basé sur une fonction mathématique, tel que par exemple une méthode, un logiciel, ou un algorithme par apprentissage ou intelligence artificielle (par exemple, un arbre de décision CART).  which is not based on a mathematical function, such as for example a method, a software, or an algorithm by learning or artificial intelligence (for example, a decision tree CART).
Plus particulièrement, ladite comparaison peut donc être notamment réalisée en suivant une méthode, et/ou en utilisant un algorithme ou un logiciel :  More particularly, said comparison can therefore be carried out in particular by following a method, and / or by using an algorithm or software:
- mROC,  - mROC,
- de régression logistique (plus particulièrement de régression logistique mettant en œuvre une fonction affine LOGIT),  logistic regression (more particularly logistic regression implementing an affine function LOGIT),
- KNN, WKNN (plus particulièrement WKNN),  KNN, WKNN (more particularly WKNN),
- RF, ou  - RF, or
- N, ou  - N, or
- CART,  - CART,
plus particulièrement mROC, régression logistique (plus particulièrement régression logistique mettant en œuvre une fonction affine LOGIT) ou CART. more particularly, mROC, logistic regression (more particularly logistic regression implementing an affine function LOGIT) or CART.
Chacun de ces algorithmes, logiciels ou méthodes permet de construire un modèle de classification, à partir des valeurs de quantification de chacune desdites cohortes de référence, et de combiner les valeurs de quantification obtenues sur ledit sujet dans ce modèle pour en induire le classement ou le score de fïbrose hépatique dudit sujet. Each of these algorithms, software or methods makes it possible to construct a classification model, based on the quantification values of each of said cohorts of reference, and combining the quantification values obtained on said subject in this model to induce the classification or the liver fibrosis score of said subject.
Les inventeurs démontrent que l'effet synergique observé avec la combinaison de CXCLIO et HA n'est pas dépendant du fait de mettre en œuvre une fonction mROC pour la classification du sujet ; cf. les exemples ci-dessous, notamment : The inventors demonstrate that the synergistic effect observed with the combination of CXCLIO and HA is not dependent on the fact of implementing an mROC function for the classification of the subject; cf. examples below, including:
- l'exemple 7, plus particulièrement les Tableaux 20, 21 et 23,  Example 7, more particularly Tables 20, 21 and 23,
- l'exemple 8, plus particulièrement le Tableau 24. Selon un mode de réalisation, le modèle de classification mis en œuvre est un modèle de classification multivariée mettant en œuvre une fonction mathématique, tel que mROC ou la régression logistique (plus particulièrement régression logistique mettant en œuvre une fonction affine LOGIT).  Example 8, more particularly Table 24. According to one embodiment, the classification model implemented is a multivariate classification model implementing a mathematical function, such as mROC or logistic regression (more particularly logistic regression). implementing an affine function LOGIT).
Selon un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, le modèle de classification mis en œuvre est un modèle par apprentissage automatique ou intelligence artificielle, tel que CART.  According to an alternative or complementary embodiment, the classification model implemented is a model using automatic learning or artificial intelligence, such as CART.
Performances (sensibilité, VPN, spécificité, VPN, taux de bonne classification,Performance (sensitivity, VPN, specificity, VPN, good classification rate,
AUC) AUC)
Les moyens de la demande, plus particulièrement la sélection de marqueurs biologiques de la demande, permettent d'atteindre de très bonnes performances de classement dudit sujet. The means of the request, more particularly the selection of biological markers of demand, make it possible to achieve very good classification performance of said subject.
Ainsi, grâce aux moyens de la demande, ladite comparaison des valeurs de quantification dudit sujet à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans lesdites cohortes de référence est faite en classant ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance avec une sensibilité (Se) et/ou une Valeur de Prédiction Négative (VPN) et/ou une spécificité (Spé) et/ou une Valeur de Prédiction Positive (VPP) et/ou une aire sous la courbe ROC (AUC) et/ou un Taux de bonne classification (TauxBC) particulièrement élevé(s).  Thus, by means of the request, said comparison of the quantification values of said subject with their values, or with the distribution of their values, in said reference cohorts is made by classifying said subject in that of said reference cohorts vis-à- which it has the highest probability of belonging with a sensitivity (Se) and / or a Negative Prediction Value (VPN) and / or a specificity (Spé) and / or a Positive Prediction Value (VPP) and / or an area under the ROC curve (AUC) and / or a particularly good classification rate (CBR).
Les termes sensibilité (Se), spécificité (Spé), Valeur de Prédiction Positive (VPP), Valeur de Prédiction Négative (VPN), aire sous la courbe ROC (AUC) et Taux de bonne classification (TauxBC) sont entendus conformément à leur signification usuelle dans le domaine. Pour mémoire : The terms Sensitivity (Se), Specificity (Spe), Positive Prediction Value (PPV), Negative Prediction Value (VPN), Area Under the ROC Curve (AUC), and Rate of Good classification (CBR Rate) are understood according to their usual meaning in the field. For memory :
Se = VP / (VP + FN), avec VP = le nombre de vrais positifs et FN = le nombre de faux négatifs ;  Se = VP / (VP + FN), with VP = the number of true positives and FN = the number of false negatives;
Sp = VN / (VN + FP), avec VN = le nombre de vrais négatifs et FP = le nombre de faux positifs ; Sp = VN / (VN + FP), with VN = the number of true negatives and FP = the number of false positives;
VPP = VP / (VP + FP) avec VP = les Vrais Positifs et FP = Faux Positifs ;  VPP = VP / (VP + FP) with VP = Real Positive and FP = False Positive;
VPN = VN / (VN+FN), avec VN = Vrais Négatifs et FN = Faux Négatifs ; avec test positif = ledit stade de fïbrose légère est dépassé et VPN = VN / (VN + FN), with VN = True Negative and FN = False Negative; with positive test = said stage of slight fibrose is exceeded and
test négatif = ledit stade de fïbrose légère n'est pas dépassé. Negative test = said light fibrose stage is not exceeded.
VPP représente donc la probabilité que le sujet testé ait effectivement dépassé ledit stade de fïbrose légère (score Metavir de fïbrose hépatique d'au moins F2), sachant que les moyens de la demande indiquent qu'il a dépassé ledit stade de fïbrose légère (score Metavir de fïbrose hépatique d'au moins F2) [résultat positif du test].  Thus, PPV represents the probability that the test subject actually passed the mild fibrosis stage (Metavir score of liver fibrosis of at least F2), knowing that the means of the request indicate that it has passed the said stage of mild fibrose (score Metavir of liver fibrosis of at least F2) [positive test result].
VPN représente donc la probabilité que le sujet testé n'ait effectivement pas dépassé ledit stade de fïbrose légère (score Metavir de fïbrose hépatique d'au plus Fl), sachant que les moyens de la demande indiquent qu'il n'a pas dépassé ledit stade de fïbrose légère (score Metavir de fïbrose hépatique d'au moins F2) [résultat négatif du test].  VPN therefore represents the probability that the test subject did not actually exceed the mild fibrosis stage (Metavir score of hepatic fibrosis of at most Fl), given that the means of the request indicate that it did not exceed that level. mild fibrosis (Metavir score of liver fibrosis of at least F2) [negative test result].
Le Taux de bonne classification est le pourcentage de patients correctement classés.  The rate of good classification is the percentage of correctly classified patients.
L'aire sous la courbe ROC (AUC) est l'aire sous la courbe ROC (Area Under the Curve ou AUC) relative à une combinaison linéaire de biomarqueurs et/ou de transformations de biomarqueurs (dans le cas d'une normalisation), sous l'hypothèse d'une distribution normale multivariée.  Area under the ROC curve (AUC) is the area under the Area Under the Curve (AUC) curve for a linear combination of biomarkers and / or biomarker transformations (in the case of normalization), under the assumption of a multivariate normal distribution.
Ladite comparaison des valeurs de quantification dudit sujet à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans lesdites cohortes de référence peut être faite en suivant un modèle de classification tel que ci-dessus décrit. Said comparison of the quantification values of said subject with their values, or the distribution of their values, in said reference cohorts can be made by following a classification model as described above.
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite selon une fonction mROC, une fonction LOGIT ou un arbre CART, notamment une fonction mROC Z\ à Z13, une fonction LOGITi à LOGIT4, un arbre CARTi à CART4 telles que ci-dessous décrites. More particularly, said comparison can be made according to a function mROC, a function LOGIT or a tree CART, in particular a function mROC Z \ to Z 13 , a function LOGITi to LOGIT 4 , a tree CARTi to CART 4 as described below .
Conformément à la demande, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 76%, d'au moins 77%, d'au moins 78%, d'au moins 80%, d'au moins 82% ou d'au moins 83%. According to the request, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of less than 70%, not less than 75%, not less than 76%, not less than 77%, not less than 78%, not less than 80%, not less than 82% or not less than 83%.
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76%, d'au moins 77%, d'au moins 78%, d'au moins 80%, d'au moins 82% ou d'au moins 83%.  More particularly, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76%, of at least 77%, of at least 78% at least 80%, at least 82% or at least 83%.
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une Valeur de Prédiction Négative (VPN) d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 76%, d'au moins 77%, d'au moins 78%, d'au moins 80%, d'au moins 81%, d'au moins 82% ou d'au moins 83%. According to an alternative or complementary mode of realization, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Negative Prediction Value (VPN) of at least 70%, of at least 75 %, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 80%, at least 81%, at least 82% or at least 83% .
Plus particulièrement, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une Valeur de Prédiction Négative (VPN) d'au moins 75%, d'au moins 76%, d'au moins 77%, d'au moins 78%, d'au moins 80%, d'au moins 81%, d'au moins 82% ou d'au moins 83%.  More particularly, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Negative Prediction Value (NPV) of at least 75%, at least 76%, of at least 77%, at least 78%, at least 80%, at least 81%, at least 82% or at least 83%.
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité d'au moins 59%, d'au moins 70%, d'au moins 71%, d'au moins 80%, d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 87%, d'au moins 89%, d'au moins 90% ou d'au moins 91%. According to an alternative or complementary mode of realization, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity of at least 59%, of at least 70%, of at least 71%, at least 80%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 89%, at least 90% or at least %.
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 87%, d'au moins 89%, d'au moins 90% ou d'au moins 91%.  More particularly, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity of at least 85%, of at least 86%, of at least 87%, of at least 89%, at least 90% or at least 91%.
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une Valeur de Prédiction Positive (VPP) d'au moins 54%, d'au moins 61%, d'au moins 62%, d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 87%, d'au moins 88%, d'au moins 90% ou d'au moins 91%. According to an alternative or complementary mode of realization, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a Positive Prediction Value (VPP) of at least 54%, of at least 61 %, at least 62%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 90% or at least 91% .
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une Valeur de Prédiction Positive (VPP) d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 87%, d'au moins 88%, d'au moins 90% ou d'au moins 91%>. More particularly, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a prediction value. Positive (PPV) of at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 90% or at least 91%>.
Toutes les combinaisons de valeur minimale de sensibilité et/ou de VPN et/ou de spécificité et/ou de VPP sont explicitement inclues dans la description de la demande. All combinations of minimum sensitivity value and / or VPN and / or specificity and / or VPP are explicitly included in the description of the request.
Ainsi, selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par m OC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une Valeur de Prédiction Négative (VPN) d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit). Thus, according to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by m OC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above). ) and / or with a Negative Prediction Value (NPV) of at least 75% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et/ou une spécificité (Spé) d'au moins 59% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a specificity (Spe) of at least 59% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et/ou une spécificité (Spé) d'au moins 85%>(comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a specificity (Spe) of at least 85%> (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et/ou une VPP d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a VPP of at least 54% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et/ou une VPP d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and / or a PPV of at least 85% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPP d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit). According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPP of at least 54% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPP d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit). According to an alternative or complementary mode of realization, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPP of at least 85% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPP d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a VPP of at least 54% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPP d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a PPV of at least 85% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPN d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit). According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 54% (as described above) and / or with a VPN of at least 75% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une spécificité (Spé) d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit) et/ou avec une VPN d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit).  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a specificity (Spe) of at least 85% (as described above) and / or with a VPN of at least 75% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une VPN d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit) et/ou une VPP d'au moins 54% (comme ci-dessus décrit). According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a VPN of at least 75% (as described above) and / or a VPP at least 54% (as described above).
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une VPN d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit) et/ou une VPP d'au moins 85% (comme ci-dessus décrit). Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec une sensibilité (Se) d'au moins 76% (comme ci-dessus décrit) et avec une VPN d'au moins 75% (comme ci-dessus décrit), ainsi qu'avec :  According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a VPN of at least 75% (as described above) and / or a VPP at least 85% (as described above). According to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a sensitivity (Se) of at least 76% (as described above) and with a VPN of at least 75% (as described above), as well as:
- une spécificité (Spé) d'au moins 85%, et/ou - une VPP d'au moins 85%. - a specificity (Spé) of at least 85%, and / or - a PPV of at least 85%.
Grâce aux moyens de la demande, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC ou régression logistique) en classant ledit sujet avec une aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,700, d'au moins 0,704, d'au moins 0,720, d'au moins 0,729, d'au moins 0,730, d'au moins 0,731, d'au moins 0,840, d'au moins 0,844, d'au moins 0,860, d'au moins 0,865, d'au moins 0,868, d'au moins 0,880, d'au moins 0,882, d'au moins 0,890, d'au moins 0,895, d'au moins 0,898, d'au moins 0,899, d'au moins 0,0900, d'au moins 0,910, d'au moins 0,920, d'au moins 0,921, d'au moins 0,930, d'au moins 0,931, ou d'au moins 0,933. Thanks to the means of the request, said comparison can be made (for example by mROC or logistic regression) by classifying said subject with an area under the ROC curve (AUC) of at least 0.700, of at least 0.704, from minus 0.720, not less than 0.729, not less than 0.730, not less than 0.731, not less than 0.840, not less than 0.844, not less than 0.860, not less than 0.865, not less than 0.868 at least 0.880, at least 0.882, at least 0.890, at least 0.895, at least 0.898, at least 0.899, at least 0.0900, at least 0.910 at least 0.920, at least 0.921, at least 0.930, at least 0.931, or at least 0.933.
En effet, la combinaison des deux seuls marqueurs HA et CXCL10 suffit à atteindre une AUC d'au moins 0,700, plus particulièrement d'au moins 0,704, plus particulièrement d'au moins 0,865 {cf. les exemples ci-dessous).  Indeed, the combination of only two markers HA and CXCL10 is sufficient to reach an AUC of at least 0.700, more particularly at least 0.704, more particularly at least 0.865 (cf. the examples below).
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite, par exemple par mROC ou régression logistique, en classant ledit sujet avec une AUC d'au moins 0,800, plus particulièrement d'au moins 0,865, d'au moins 0,868, d'au moins 0,880, d'au moins 0,882, d'au moins 0,890, d'au moins 0,895 ou d'au moins 0,898.  More particularly, said comparison can be made, for example by mROC or logistic regression, by classifying said subject with an AUC of at least 0.800, more particularly at least 0.865, of at least 0.868, of at least 0.880, at least 0.882, at least 0.890, at least 0.895 or at least 0.898.
Grâce aux moyens de la demande, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec un Taux de bonne classification (TauxBC) d'au moins 60%>, d'au moins 66%>, d'au moins 70%>, d'au moins 72%, d'au moins 73%, d'au moins 75%, d'au moins 77%, d'au moins 80%, d'au moins 81%, d'au moins 82% , d'au moins 83%, d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 88% ou d'au moins 89%. Thanks to the means of the request, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a good classification rate (CBR rate) of at least 60%>, of at least 66 %>, at least 70%>, at least 72%, at least 73%, at least 75%, at least 77%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 85%, at least 86%, at least 88% or at least 89%.
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec un Taux de bonne classification (TauxBC) d'au moins 80%, d'au moins 81%, d'au moins 82% , d'au moins 83%o, d'au moins 85%, d'au moins 86%, d'au moins 88% ou d'au moins 89%. Toutes les combinaisons de valeur minimale de sensibilité et/ou de VPN et/ou de spécificité et/ou de VPP sont explicitement inclues dans la description de la demande.  More particularly, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) by classifying said subject with a good classification rate (BCR rate) of at least 80%, of at least 81%, from 82%, at least 83%, at least 85%, at least 86%, at least 88% or at least 89%. All combinations of minimum sensitivity value and / or VPN and / or specificity and / or VPP are explicitly included in the description of the request.
Ainsi, selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec un taux de bonne classification d'au moins 80% et/ou une AUC d'au moins 0,704. Thus, according to an alternative or complementary embodiment, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) in classifying said subject with a good classification rate of at least 80% and / or an AUC of at least 0.704.
Selon un mode alternatif ou complémentaire de réalisation, ladite comparaison est faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) en classant ledit sujet avec un taux de bonne classification d'au moins 70%> et/ou une AUC d'au moins 0,800, plus particulièrement avec un taux de bonne classification d'au moins 80%> et/ou une AUC d'au moins 0,800.  According to an alternative or complementary mode of realization, said comparison is made (for example by mROC, logistic regression or tree CART) by classifying said subject with a good classification rate of at least 70%> and / or an AUC of at least minus 0.800, more particularly with a good classification rate of at least 80%> and / or an AUC of at least 0.800.
Toutes les combinaisons de valeurs minimales : All combinations of minimum values:
- sensibilité et spécificité, ou de  - sensitivity and specificity, or
- sensibilité et VPP, ou de  - sensitivity and VPP, or
- sensibilité et VPN, ou de  - sensitivity and VPN, or
- sensibilité et AUC, ou de  - sensitivity and AUC, or
- sensibilité et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity and rate of good classification, or
- spécificité et VPP, ou de  - specificity and VPP, or
- spécificité et VPN, ou de  - specificity and VPN, or
- spécificité et AUC, ou de  - specificity and AUC, or
- spécificité et taux de bonne classification, ou de  - specificity and rate of good classification, or
- VPP et VPN, ou de  - VPP and VPN, or
- VPP et AUC, ou de  - VPP and AUC, or
- VPP et taux de bonne classification, ou de  - VPP and good classification rate, or
- VPN et AUC, ou de  - VPN and AUC, or
- VPN et taux de bonne classification, ou de  - VPN and good classification rate, or
- AUC et taux de bonne classification, ou de  - AUC and rate of good classification, or
- sensibilité, spécificité et VPP, ou de  - sensitivity, specificity and VPP, or
- sensibilité, spécificité et VPN, ou de  - sensitivity, specificity and VPN, or
- sensibilité, spécificité et AUC, ou de  - sensitivity, specificity and AUC, or
- sensibilité, spécificité et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, specificity and rate of good classification, or
- sensibilité, VPP et VPN, ou de  - sensitivity, VPP and VPN, or
- sensibilité, VPP et AUC, ou de  - sensitivity, VPP and AUC, or
- sensibilité, VPP et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, PPV and good classification rate, or
- sensibilité, VPN et AUC, ou de  - sensitivity, VPN and AUC, or
- sensibilité, VPN et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, VPN and good classification rate, or
- sensibilité, AUC et taux de bonne classification, ou de - sensibilité, spécificité, VPP et VPN, ou de - sensitivity, AUC and good classification rate, or - sensitivity, specificity, VPP and VPN, or
- sensibilité, spécificité, VPP et AUC, ou de  - sensitivity, specificity, VPP and AUC, or
- sensibilité, spécificité, VPP et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, specificity, VPP and good classification rate, or
- sensibilité, spécificité, VPN et AUC, ou de  - sensitivity, specificity, VPN and AUC, or
- sensibilité, spécificité, VPN et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, specificity, VPN and good classification rate, or
- sensibilité, VPP, VPN et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, VPP, VPN and good classification rate, or
- spécificité, VPP, VPN et AUC, ou de  - specificity, VPP, VPN and AUC, or
- spécificité, VPP, VPN et taux de bonne classification, ou de  - specificity, VPP, VPN and good classification rate, or
- sensibilité, spécificité, VPP, VPN et AUC, ou de  - sensitivity, specificity, VPP, VPN and AUC, or
- sensibilité, spécificité, VPP, VPN et taux de bonne classification, ou de  - sensitivity, specificity, VPP, VPN and good classification rate, or
- spécificité, VPP, VPN, AUC et taux de bonne classification, ou de  - specificity, VPP, VPN, AUC and good classification rate, or
- sensibilité, spécificité, VPP, VPN, AUC et taux de bonne classification, sont explicitement inclues dans la description de la demande.  - sensitivity, specificity, VPP, VPN, AUC and good classification rate, are explicitly included in the description of the application.
Par exemple, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) avec au moins l'une des deux performances 1/ et 21 ci-dessous : For example, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) with at least one of the two performances 1 / and 21 below:
1/ une spécificité d'au moins 59% et/ou une Valeur de Prédiction Positive d'au moins 54%, et/ou  1 / a specificity of at least 59% and / or a Positive Prediction Value of at least 54%, and / or
21 un taux de bonne classification d'au moins 66%> et/ou une aire sous la courbe ROC d'au moins 0,704.  21 a good classification rate of at least 66%> and / or an area under the ROC curve of at least 0.704.
Plus particulièrement, ladite comparaison peut être faite (par exemple par mROC, régression logistique ou arbre CART) avec au moins l'une des deux performances 1/ et 21 ci-dessous :  More particularly, said comparison can be made (for example by mROC, logistic regression or CART tree) with at least one of the two performances 1 / and 21 below:
1/ une spécificité d'au moins 85% et/ou une Valeur de Prédiction Positive d'au moins 85%, et/ou  1 / a specificity of at least 85% and / or a Positive Prediction Value of at least 85%, and / or
21 un taux de bonne classification d'au moins 80% et/ou une aire sous la courbe ROC d'au moins 0,800. Une règle décisionnelle de la demande (qu'elle soit mROC, CART, LR ou autre, cf. ci-dessous), plus particulièrement une fonction mROC répondant à la formule de la fonction Z10, Zu, Z12 ou Z13 (cf. ci-dessous), a un taux de patients non classés de 0%. En outre, une règle décisionnelle de la demande (qu'elle soit mROC, CART, LR ou autre), plus particulièrement une fonction mROC répondant à la formule de la fonction Zio, Zn , Z12 ou Zi3, a au moins l'une de ses performances d'AUC, de Taux de bonne classification, de sensibilité, de VPN, de spécificité et de VPP, qui est supérieure : 21 a good classification rate of at least 80% and / or an area under the ROC curve of at least 0.800. A decision rule of the request (that it is mROC, CART, LR or other, cf below), more particularly a function mROC answering the formula of the function Z 10 , Z u , Z 12 or Z 13 ( see below), has a rate of unclassified patients of 0%. In addition, a decision rule of the request (whether it is mROC, CART, LR or other), more particularly a function mROC corresponding to the formula of the function Zio, Zn, Z12 or Zi3, has at least one of its performance of AUC, Good classification rate, sensitivity, VPN, specificity and VPP, which is superior:
- tant à celle obtenue dans les mêmes conditions mais sans le marqueur HA, - to that obtained under the same conditions but without the HA marker,
- qu'à celle obtenue dans les mêmes conditions mais sans le marqueur CXCL10. - than that obtained under the same conditions but without the marker CXCL10.
Les inventeurs démontrent en effet que la combinaison du marqueur CXCL10 au marqueur HA conduit à un effet synergique, à savoir à des performances qui vont au-delà de la simple juxtaposition de leurs performances individuelles respectives (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP). Des démonstrations expérimentales sont présentées dans les exemples ci- dessous, notamment : The inventors in fact demonstrate that the combination of the CXCL10 marker with the HA marker leads to a synergistic effect, namely to performances that go beyond the simple juxtaposition of their respective individual performances (AUC performance and / or good rate). classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP). Experimental demonstrations are presented in the examples below, including:
- en exemple 1 {cf. Tableau 3),  - in example 1 {cf. Table 3),
- en exemple 3 {cf. Tableaux 8 et 10), et  - in example 3 {cf. Tables 8 and 10), and
- en exemple 7 {cf. Tableaux 20 et 21).  - in example 7 {cf. Tables 20 and 21).
Pour réaliser ladite étape de comparaison des valeurs de quantification des marqueurs biologiques dudit sujet à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré) de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, différents moyens de classification tels que mROC (fonction linéaire), régression logistique (fonction affine) ou arbre décisionnel (arbre CART par exemple) peuvent être mis en œuvre {cf. ci-dessus). To carry out said step of comparing the quantification values of the biological markers of said subject with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of hepatic fibrosis, to classify said subject in that of these reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging, various classification means such as mROC (linear function), logistic regression (affine function) or decision tree (CART tree for example) can to be implemented (cf. above).
Plus particulièrement, les inventeurs démontrent que l'effet synergique observé avec la combinaison de CXCL10 et HA n'est pas dépendant du fait de mettre en œuvre une fonction mROC pour la classification du sujet ; cf. les exemples ci-dessous, notamment :  More particularly, the inventors demonstrate that the synergistic effect observed with the combination of CXCL10 and HA is not dependent on the fact of implementing a mROC function for the classification of the subject; cf. examples below, including:
- l'exemple 7, plus particulièrement les Tableaux 20, 21 et 23,  Example 7, more particularly Tables 20, 21 and 23,
- l'exemple 8, plus particulièrement le Tableau 24.  Example 8, more particularly Table 24.
Fonction mathématique (par exemple, mROC, régression logistique) Une fonction mathématique peut être mise en œuvre pour réaliser ladite étape de comparaison des valeurs de quantification des marqueurs biologiques dudit sujet à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade (ou degré) de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance. La comparaison est alors faite en combinant les valeurs de quantification de chacun des marqueurs biologiques sélectionnés dans cette fonction mathématique. Cette fonction mathématique peut affecter audit sujet un score (Z), qui est alors comparé à une valeur seuil (δ ou cut-off) prédéterminée par classification multivariée, pour classer ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance (plus particulièrement, pour classer ledit sujet dans ladite première cohorte de référence ou dans ladite deuxième cohorte de référence). Mathematical function (eg, mROC, logistic regression) A mathematical function can be implemented to perform said step of comparing the quantification values of the biological markers of said subject with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the stage (or degree) of fibrosis. hepatitis, to classify the subject in that cohort of reference with respect to which he has the highest probability of belonging. The comparison is then made by combining the quantification values of each of the selected biological markers in this mathematical function. This mathematical function can assign to said subject a score (Z), which is then compared to a predetermined threshold value (δ or cut-off) by multivariate classification, to classify said subject in that of said reference cohorts with respect to which it has the highest probability of belonging (more specifically, to classify said subject in said first reference cohort or in said second reference cohort).
Ladite fonction mathématique peut par exemple être une fonction linéaire telle qu'une fonction mROC ou une fonction non linéaire, par exemple une fonction affine telle qu'une fonction de régression logistique mettant en œuvre une fonction affine LOGIT.  Said mathematical function may for example be a linear function such as a mROC function or a nonlinear function, for example an affine function such as a logistic regression function implementing an affine function LOGIT.
Une fonction mROC de la demande peut avoir la forme suivante Z = a(BMQil) + b(BMQ2 l) + c(BMQ3 l) + d(BMQ4 l) + e(BMQ5 l), dans laquelle BMQi, BMQ2, BMQ3, BMQ4 et BMQ5 sont cinq biomarqueurs différents (par exemple CXCL10, HA, IMC, âge et charge virale), dans laquelle a, b, c, d et e sont les valeurs numériques des constantes de la fonction mROC, et dans laquelle l'exposant t indique que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur de quantification mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur t λ A mROC function of the request can have the following form Z = a (BMQi l ) + b (BMQ 2 l ) + c (BMQ 3 l ) + d (BMQ 4 l ) + e (BMQ 5 l ), in which BMQi , BMQ 2 , BMQ 3 , BMQ 4 and BMQ 5 are five different biomarkers (eg CXCL10, HA, BMI, age and viral load), in which a, b, c, d and e are the numerical values of the constants of the function mROC, and in which the exponent t indicates that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the quantification value measured for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value t λ
mesurée selon la formule suivante : BMQ = (BMQ - 1) / λ. measured according to the following formula: BMQ = (BMQ - 1) / λ.
Conformément à la demande, une fonction mROC peut être formulée comme suit : As requested, a mROC function can be formulated as follows:
Z = a(CXCL10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(CVl) + f(FSl) Z = a (CXCL10 l ) + b (HA l ) + c (IMC l ) + d (Age l ) + e (CV l ) + f (FS l )
[fonction Zi3] [function Z i3 ]
avec : with:
a et b étant chacun, indépendamment l'un de l'autre, un nombre réel positif allant de +0,1 à +6,0, a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0,
c, d, e, et f étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de - 10,0 à +10,0, οχουο, λΗΑ, ΐΜο, ^Age, ον et λρβ étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -6,0 à 1 ,2 mais différent de zéro ; c, d, e, and f each being, independently of each other, a real number ranging from -10.0 to +10.0, οχουο, λ Η Α, ΐΜο, ^ Age, ον and λρβ being each, independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1, 2 but different from zero;
cf. exemple 8. cf. example 8.
Dans la fonction Zi3 ci-dessus, comme toutes les fonctions mROC ici indiquées, l'exposant t indique, conformément à l'usage en la matière, que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur de quantification mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur t λ In function Zi 3 above, like all the mROC functions indicated here, the exponent t indicates, according to the use in the field, that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the quantification value measured for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value t λ
mesurée selon la formule suivante : BMQ = (BMQ - 1) / λ. Les fonctions mROC de la demande, telles que la fonction Zi3 ci-dessus, ainsi que les fonctions Zi2 à Zi décrites ci-dessous, présentent les performances qui ont été décrites ci-dessus (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP). measured according to the following formula: BMQ = (BMQ - 1) / λ. The demand mROC functions, such as the Zi 3 function above, as well as the Zi 2 to Zi functions described below, have the performance described above (AUC performance and / or bit rate). good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP).
Les inventeurs démontrent en outre que les performances de la combinaison de CXCLIO à HA sont particulièrement robustes (performances d'AUC et/ou Taux de bonne classification et/ou sensibilité et/ou VPN et/ou spécificité et/ou VPP), dès lors que les paramètres de la fonction mROC sont choisis dans les plages de valeurs indiquées : cf. exemple 9 ci-dessous. Un exemple de fonction Z13 est le suivant :  The inventors further demonstrate that the performances of the combination of CXCL10 HA are particularly robust (performance of AUC and / or rate of good classification and / or sensitivity and / or VPN and / or specificity and / or VPP), therefore that the parameters of the mROC function are chosen within the indicated value ranges: cf. Example 9 below. An example of a Z13 function is as follows:
Z = a(CXCL10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(CVl) + f(FSl) Z = a (CXCL10 l ) + b (HA l ) + c (IMC l ) + d (Age l ) + e (CV l ) + f (FS l )
[fonction Zi2] [Zi function 2 ]
avec : with:
a et b étant chacun, indépendamment l'un de l'autre, un nombre réel positif allant de +0, 1 à +6,0, plus particulièrement de +0,3 à +5,5, a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0, more preferably from +0.3 to +5.5,
c étant un nombre réel allant de -10,0 à +4,0, c being a real number ranging from -10.0 to +4.0,
d étant un nombre réel allant de -0,8 à +0,2, d being a real number ranging from -0.8 to +0.2,
e étant un nombre réel allant de -0,003 à +0,002, e being a real number ranging from -0.003 to +0.002,
f étant un nombre réel allant de +0,0 à +10,0, f is a real number ranging from +0.0 to +10.0,
λοχουο, λΗΑ, ΐΜο ^Age, ον et λρβ étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -6,0 à 1 ,2 mais différent de zéro ; λοχουο, λ Η Α, ΐΜο ^ Age, ον and λρβ being each, independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1, 2 but different from zero;
cf. exemple 8 ci-dessous. La valeur seuil de chacune des fonctions mROC de la demande, plus particulièrement de Z13 et Z12, peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de 3 à 25, plus particulièrement de 10 à 25. Une fonction mROC de la demande, plus particulièrement Z13 et Z12, peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,898. cf. Example 8 below. The threshold value of each of the mROC functions of the request, more particularly of Z 13 and Z 12 , may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25. An mROC function of the for example, Z 13 and Z 12 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.704, more particularly a a good classification of at least 72% and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and / or an area under the ROC curve (AUC) of at least 0.898.
Une fonction mROC de la demande, plus particulièrement Z13 et Z12, peut par exemple avoir plus une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%. Mroc a function of the application, more particularly Z 13 and Z 12, may for example have more sensitivity at least 70% and / or at least 70% VPN, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%.
Une fonction mROC de la demande, plus particulièrement Z13 et Z12, peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%. A mROC function of the request, more particularly Z 13 and Z 12 , may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%.
Un exemple de fonction Z13, qui est également un exemple de fonction Z12, est le suivant : An example of a function Z 13 , which is also an example of a function Z 12 , is as follows:
Z = a(CXCL10t) + b(HAt) Z = a (CXCL10 t ) + b (HA t )
[fonction Zi0] [Zi function 0 ]
avec with
0,812≤a≤ 5,089  0.812≤a≤ 5.089
2,033≤ b≤ 4,462  2,033≤ b≤ 4,462
-0,262≤ CXCLIO≤ 0,030  -0.262≤ CXCLIO≤ 0.030
-0,382≤λΗΑ≤ -0,219 -0.382≤λ ΗΑ ≤ -0.219
a, b, CXCLIO, et HA étant différents de zéro.  a, b, CXCLIO, and HA being different from zero.
La valeur seuil de Z10 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de 3 à 25, plus particulièrement de 10 à 25, plus particulièrement de 1 1 ,68 à 23,71. Des illustrations de fonctions Z10 sont présentées en exemples 3, 5 et 8 ci-dessous (fonctions Z10 et Z4). The threshold value of Z 10 may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 1 to 68 to 23.71. Illustrations of functions Z 10 are presented in Examples 3, 5 and 8 below (functions Z 10 and Z 4).
Une fonction Z10 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,898, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 83% et une valeur d'AUC d'au moins 0,868 {cf. exemples 3, 5 et 8 ci- dessous). A function Z 10 can for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of at least AUC of at least 0.898, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value of at least 0.868 (cf. Examples 3, 5 and 8 below).
Une fonction Z10 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 78% et/ou une VPN d'au moins 77% {cf. exemples 1 , 3, 5 et 6 ci-dessous). A function Z 10 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77% (cf. Examples 1, 3, 5 and 6 below).
Une fonction Z10 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 90% et/ou une VPP d'au moins 90% {cf. exemples 1 , 3, 5 et 6 ci-dessous). A function Z 10 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a VPP of at least 90% (cf. Examples 1, 3, 5 and 6 below).
Un exemple de fonction Z10 est la fonction : An example of function Z 10 is the function:
Z = (1 ,999) x CXCL101 + (2,852) x HA1 Z = (1, 999) x CXCL10 1 + (2,852) x HA 1
[fonction Z4] [Z function 4 ]
avec CXCLIO = -0,1 16 et avec λΗΑ = -0,288. with CXCLIO = -0.1 16 and with λ Η Α = -0.288.
La valeur seuil de Z4 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de 3 à 25, plus particulièrement de 10 à 25, plus particulièrement de 15, 170. The threshold value of Z 4 may for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 15, 170.
Une fonction Z4 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moinsFor example, a Z 4 function may have a good classification rate of at least
66%) et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,882, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 83% et une valeur d'AUC d'au moins 0,898 {cf. exemples 3, 5 et 8 ci- dessous). 66%) and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of AUC at least 0.865, more specifically a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.882, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value at least 0.898 (cf. Examples 3, 5 and 8 below).
Une fonction Z4 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70%> et/ou uneA function Z 4 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a
VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 78% et/ou une VPN d'au moins 77% {cf. exemples 3 et 5 ci-dessous). VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75% %, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77% (cf. examples 3 and 5 below).
Une fonction Z4 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou uneA function Z 4 may for example have a specificity of at least 59% and / or a
VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 90% et/ou une VPP d'au moins 90% {cf. exemples 3 et 5 ci-dessous). VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85% %, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a VPP of at least 90% (cf. examples 3 and 5 below).
Un autre exemple de fonction Z13 est la fonction : Another example of function Z 13 is the function:
Z = 0,386 x CXCL101 + 0,3064 x HA1 Z = 0.386 x CXCL10 1 + 0.3064 x HA 1
[fonction Zi]  [Zi function]
avec CXCLIO = -0,013 et λΗΑ = 0,099. with CX CLIO = -0.013 and λ ΗΑ = 0.099.
La valeur seuil de Z\ peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de 3 à 25, plus particulièrement de 3 à 5, plus particulièrement de 3,382. Z \ threshold value may for example be of -7 to 25, more preferably from 3 to 25, more preferably from 3 to 5, more preferably 3.382.
La fonction Z\ peut par exemple avoir un taux de bonne de classification d'au moins 66% et/ou une AUC d'au moins 0,704 {cf. exemple 1 ci-dessous). The function Z \ may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC of at least 0.704 (cf. example 1 below).
La fonction
Figure imgf000063_0001
peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 78% et/ou uneFunction
Figure imgf000063_0001
can for example have a sensitivity of at least 78% and / or a
VPN d'au moins 81% {cf. exemple 1 ci-dessous). VPN of at least 81% (cf. example 1 below).
La fonction
Figure imgf000063_0002
peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54% {cf. exemple 1 ci-dessous). Un autre exemple de fonction Z13 est la fonction : Function
Figure imgf000063_0002
can for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54% (cf. example 1 below). Another example of function Z 13 is the function:
Z = (1 ,849) x CXCL101 + (2,368) x HA1 Z = (1, 849) x CXCL10 1 + (2.368) x HA 1
[fonction Z7] [function Z 7 ]
avec CXCLIO = -0, 1 16 et λΗΑ = -0,27. La valeur seuil de Z7 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de 3 à 25, plus particulièrement de 10 à 25, plus particulièrement de 13,5. with CXCLIO = -0, 1 16 and λ Η Α = -0.27. The threshold value of Z 7 can for example be from -7 to 25, more particularly from 3 to 25, more particularly from 10 to 25, more particularly from 13.5.
Une fonction Z7 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 82% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865 {cf. exemple 6 ci-dessous). A function Z 7 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more specifically a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 82% and a value of at least AUC of at least 0.865 (cf. example 6 below).
Une fonction Z7 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 78% et/ou une VPN d'au moins 77%. A function Z 7 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 77%.
Une fonction Z7 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 90% et/ou une VPP d'au moins 90%. A function Z 7 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 90% and / or a PPV of at least 90%.
Un autre exemple de fonction Z13, qui est également un exemple de fonction Z12, est le suivant : Another example of function Z 13 , which is also an example of function Z 12 , is as follows:
Z = a(CXCL10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(CVl) Z = a (CXCL10 l ) + b (HA l ) + c (IMC l ) + d (Age l ) + e (CV l )
[fonction Zn]  [Zn function]
avec with
0,748≤a≤ 5,357  0.748≤a≤ 5.357
2,075≤ b≤ 4,690  2,075≤ b≤ 4,690
-0,848≤ c≤ 3,697  -0.848≤ c≤ 3.697
-0,746≤d≤ 0,147  -0.746≤d≤ 0.147
-0,003≤ e≤ 0,002  -0.003≤ e≤ 0.002
-0,262≤ CXCLIO≤ 0,047  -0.262≤ CXCLIO≤ 0.047
-0,882≤λΗΑ≤ -0,219 -0.882≤λ ΗΑ ≤ -0.219
-5,545≤ IMC≤ 0,485 -0, 1 16≤ âge≤ 0,828 -5,545 ≤ IMC ≤ 0.485 -0, 1 16≤ age ≤ 0.828
0,236≤ λον≤ 0,305 0.236≤ λ ον ≤ 0.305
a, b, c, d, e, CXCLIO, λΗΑ, ιΜο ον étant différent de zéro. La valeur seuil de Zn peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17. a, b, c, d, e, CXCLIO, λ Η Α, ι Μ ο ον being different from zero. The threshold value of Zn can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17.
Des illustrations de fonctions Zn sont présentées en exemples 1 , 3, 6, 7 et 8 ci- dessous (fonctions Z3, Z5 et Z8). Illustrations of Zn functions are presented in Examples 1, 3, 6, 7 and 8 below (Z 3 , Z 5 and Z 8 functions ).
Une fonction Zn peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,882, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 83%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,899 (cf. exemples 1 , 3, 6, 7 et 8 ci- dessous). A function Zn can for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72%> and a value of 'AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and a value of AUC of at least 0.882, more particularly a good classification rate of at least 83%> and an AUC value of at least 0.899 (see Examples 1, 3, 6, 7 and 8 below). ).
Une fonction Zn peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70%> et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75%> et/ou une VPN d'au moins 75%>, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76%> et/ou une VPN d'au moins 75%>, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 80%> et/ou une VPN d'au moins 78%> (cf. exemples 1 , 3, 6 et 7 ci-dessous).  A Zn function may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%. >, more particularly a sensitivity of at least 76%> and / or a VPN of at least 75%>, more particularly a sensitivity of at least 80%> and / or a VPN of at least 78%> ( see examples 1, 3, 6 and 7 below).
Une fonction Zn peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59%> et/ou une VPP d'au moins 54%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70%> et/ou une VPP d'au moins 61%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85%> et/ou une VPP d'au moins 85%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86%> et/ou une VPP d'au moins 86%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 87%> et/ou une VPP d'au moins 88%> (cf. exemples 1 , 3, 6 et 7 ci-dessous).  For example, a Zn function may have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70%, and / or a VPP of at least 61%. %>, more particularly a specificity of at least 85%> and / or a VPP of at least 85%>, more particularly a specificity of at least 86%> and / or a VPP of at least 86%> more particularly a specificity of at least 87%> and / or a VPP of at least 88%> (see Examples 1, 3, 6 and 7 below).
Un exemple de fonction Zn est la fonction : An example of a Zn function is the function:
Z = (0,2914) x CXCL101 + (0,2569) x HA1 + (-9,3855) x IMC1 + (0,01419) x Âge1 + Z = (0.2914) x CXCL10 1 + (0.2569) x HA 1 + (-9.3855) x BMI 1 + (0.01419) x Age 1 +
(0,0140) x CV' [fonction Z3] (0,0140) x CV ' [function Z 3 ]
avecwith
οχουο = -0,013  οχουο = -0,013
λΗΑ = 0,099 λ ΗΑ = 0.099
Àâge = 1,086At age = 1,086
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000066_0001
λον = 0,159.  λον = 0.159.
La valeur seuil de Z3 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de -5,730. The threshold value of Z 3 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from -5.730.
La fonction Z3 peut par exemple avoir un taux de bonne de classification d'au moins 66% et/ou une AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne de classification d'au moins 73% et une AUC d'au moins 0,731 , plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,868 {cf. exemples 1 et 8 ci-dessous). The function Z 3 may for example have a classification good rate of at least 66% and / or an AUC of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value. at least 0.729, more particularly a classification good rate of not less than 73% and an AUC of not less than 0.731, more particularly a good classification rate of not less than 80% and an AUC value of at least 0.868 (cf. Examples 1 and 8 below).
La fonction Z3 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70%> et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 83% {cf. exemple 1 ci-dessous). The function Z 3 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%. , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 83% (cf. example 1 below).
La fonction Z3 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 71% et/ou une VPP d'au moins 62% {cf. exemple 1 ci-dessous). The function Z 3 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 71% and / or a VPP of at least 62% (cf. example 1 below).
Un exemple de fonction Zn est la fonction : An example of a Zn function is the function:
Z = (1,999) x CXCL101 + (2,958) x HA1 + (0,616) x IMC1 + (-0,053) x Âgel+ (-0,00024) x CV' Z = (1,999) x CXCL10 1 + (2,958) x HA 1 + (0.616) x BMI 1 + (-0,053) x Age l + (-0,00024) x CV '
[fonction ¾]  [function ¾]
avecwith
οχουο = -0,116  οχουο = -0,116
λΗΑ = -0,288λ ΗΑ = -0.288
âge = 0,433
Figure imgf000067_0001
at age = 0.433
Figure imgf000067_0001
λον = 0,279.  λον = 0.279.
La valeur seuil de Z5 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de 16,543. The threshold value of Z 5 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 16.543.
Une fonction Z5 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins For example, a Z5 function may have a good classification rate of at least
66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,868, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,882, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 83% et une valeur d'AUC d'au moins 0,899 {cf. exemples 1 , 3, 7 et 8 ci-dessous). 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0.868, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0,882, more particularly a good classification rate of at least 83% and an AUC value of at least 0,899 (cf. Examples 1, 3, 7 and 8 below).
Une fonction Z5 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70%> et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 80% et/ou une VPN d'au moins 78% {cf. exemples 1 , 3 et 7 ci-dessous). A function Z 5 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75% , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 80% and / or a VPN of at least 78% (cf. Examples 1, 3 and 7 below).
Une fonction Z5 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 87% et/ou une VPP d'au moins 88% {cf. exemples 1 , 3 et 7 ci-dessous). A function Z 5 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 87% and / or a VPP of at least 88% (cf. Examples 1, 3 and 7 below).
Un exemple de fonction Zn est la fonction : An example of a Zn function is the function:
Z = (1,853) x CXCL10l + (2,51 1) x HA1 + (0,4246) x IMC1 + (- 0,0343) x Âge1 Z = (1.853) x CXCL10 l + (2.51 1) x HA 1 + (0.4246) x BMI 1 + (- 0.0343) x Age 1
+ (- 0,00027) x CVl + (- 0.00027) x CV l
[fonction Z8] [function Z 8 ]
avecwith
οχουο = -0, 1 16  οχουο = -0, 1 16
λΗΑ = -0,27 λ ΗΑ = -0.27
^âgS = 0,536
Figure imgf000068_0001
^ age S = 0.536
Figure imgf000068_0001
λον = 0,288. λ ον = 0.288.
La valeur seuil de Z8 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de 14,7. The threshold value of Z 8 can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
Une fonction Z8 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moinsFor example, a function Z 8 may have a good classification rate of at least
66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,868, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 82% et une valeur d'AUC d'au moins 0,868 (cf. exemples 6 et 8 ci-dessous). 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and an AUC value of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0.868, more particularly a good classification rate of at least 82% and an AUC value of at least 0.868 (see Examples 6 and 8 below).
Une fonction Z8 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70%> et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 80% et/ou une VPN d'au moins 78%. A function Z 8 may for example have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75% , more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 80% and / or a VPN of at least 78%.
Une fonction Z8 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 87% et/ou une VPP d'au moins 88%. A function Z 8 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%, more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 87% and / or a PPV of at least 88%.
Un autre exemple de fonction Z13, qui est également un exemple de fonction Z12, est le suivant : Another example of function Z 13 , which is also an example of function Z 12 , is as follows:
Z = (0,3313) x CXCL101 + (0,25154) x HA1 + (-9,8818) x IMC1 + (0,0143) x Âge1 Z = (0.3313) x CXCL10 1 + (0.25154) x HA 1 + (-9.8818) x BMI 1 + (0.0143) x Age 1
[fonction Z2] [Z 2 function]
avecwith
οχουο = -0,013  οχουο = -0,013
λΗΑ = 0,099λ ΗΑ = 0.099
Figure imgf000068_0002
Figure imgf000068_0002
λΐΜο = -0,923. La valeur seuil de Z2 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de 14,7. λΐΜο = -0.923. The threshold value of Z 2 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
Une fonction Z2 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729 {cf. exemple 1 ci- dessous). A function Z 2 may for example have a good classification rate of at least 66% and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729 (cf. example 1 below).
Une fonction Z2 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 82% {cf. exemple 1 ci-dessous). A function Z 2 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 82% (cf. example 1 below).
Une fonction Z2 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61% {cf. exemple 1 ci-dessous). A Z 2 function may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61% { cf. example 1 below).
Un autre exemple de fonction Z13, qui est également un exemple de fonction Z12, est le suivant : Another example of function Z 13 , which is also an example of function Z 12 , is as follows:
Z = (1,686) x CXCL101 + (2,216) x HAl+ (6,947) x FS Z = (1.686) x CXCL10 1 + (2,216) x HA l + (6,947) x FS
[fonction Z6] [Z 6 function]
FS étant la valeur de quantification de la dureté du foie, par exemple en kDa, avec FS being the quantization value of liver hardness, for example in kDa, with
λοχουο = -0,016  λοχουο = -0,016
λΗΑ = 0,2888 λ ΗΑ = 0.2888
λΡδ = -0,888. λ Ρδ = -0.888.
La valeur seuil de Z6 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de 14,7. The threshold value of Z 6 can for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
Une fonction Z6 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66%) et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,868, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 86% et une valeur d'AUC d'au moins 0,931 {cf. exemple 5 ci-dessous). Une fonction Z6 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 83% et/ou une VPN d'au moins 81% {cf. exemple 5 ci-dessous). A function Z 6 may for example have a good classification rate of at least 66%) and / or an AUC value of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80% and a value of AUC of at least 0.868, more particularly a good classification rate of at least 86% and an AUC value of at least 0.931 (cf. example 5 below). A function Z 6 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%, more particularly a sensitivity of at least 83% and / or a VPN of at least 81% (cf. example 5 below).
Une fonction Z6 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 89% et/ou une VPP d'au moins 90% {cf. exemple 5 ci-dessous). A function Z 6 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%. more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86%, more particularly a specificity of at least 89% and / or a PPV of at least 90% (cf. example 5 below).
Un autre exemple de fonction Z13, qui est également un exemple de fonction Z12, est le suivant : Another example of function Z 13 , which is also an example of function Z 12 , is as follows:
Z7 = (1,585) x CXCL101 + (2,181) x HA1 + (2,910) x FS Z 7 = (1.585) x CXCL10 1 + (2.181) x HA 1 + (2.910) x FS
[fonction Z9]  [Z9 function]
FS étant la valeur de quantification de la dureté du foie, par exemple en kDa, avec  FS being the quantization value of liver hardness, for example in kDa, with
λοχουο = -0,016  λοχουο = -0,016
λΗΑ = -0,27 λ ΗΑ = -0.27
λΡδ = -0,27. λ Ρδ = -0.27.
La valeur seuil de Z9 peut par exemple être de -7 à 25, plus particulièrement de -7 à 17, plus particulièrement de 14,7. The threshold value of Z 9 may for example be from -7 to 25, more particularly from -7 to 17, more particularly from 14.7.
Une fonction Z9 peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66%) et/ou une valeur d'AUC d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72% et une valeur d'AUC d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80% et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 85% et une valeur d'AUC d'au moins 0,868 {cf. exemple 6 ci-dessous).  A function Z9 can for example have a good classification rate of at least 66%) and / or a value of AUC of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72% and a value of AUC of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80% and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 85% and a value of AUC of at least 0.868 (cf. example 6 below).
Une fonction Z9 peut par exemple avoir une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75% {cf. exemple 6 ci-dessous). Une fonction Z9 peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86% (cf. exemple 6 ci-dessous). A function Z 9 may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%, plus particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75% (cf. example 6 below). A function Z 9 may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%, more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%> , more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP of at least 86% (see Example 6 below). -Dessous).
Une fonction de régression logistique peut avoir la forme suivante : A logistic regression function can have the following form:
LOGIT = Intercept + k(BMQi) + 1(BMQ2), LOGIT = Intercept + k (BMQi) + 1 (BMQ 2 ),
dans laquelle BMQi et BMQ2 sont deux bio marqueurs différents (par exemple CXCL10 et HA), et dans laquelle Intercept, k et 1 sont les valeurs numériques des constantes de la fonction de régression logistique. wherein BMQi and BMQ 2 are two different bio markers (for example CXCL10 and HA), and in which Intercept, k and 1 are the numerical values of the constants of the logistic regression function.
Par exemple :  For example :
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + 1(AH)  LOGIT = Intercept + k (CXCL10) + 1 (AH)
[fonction LOGITi]  [LOGITi function]
avec with
-5≤ Intercept≤ -1  -5≤ Intercept≤ -1
0,001≤k≤ 0,010  0.001≤k≤ 0.010
0,010≤1≤ 0,050.  0.010≤1≤ 0.050.
Plus particulièrement, une fonction de régression logistique peut être :  More specifically, a logistic regression function can be:
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + 1(HA)  LOGIT = Intercept + k (CXCL10) + 1 (HA)
[fonction LOGIT2] [LOGIT 2 function]
avec with
-4,481≤ Intercept≤ -2,398  -4,481≤ Intercept≤ -2,398
0,003≤k≤ 0,008  0.003≤k≤ 0.008
0,013≤1≤ 0,045,  0.013≤1≤ 0.045,
(cf. exemple 8, Tableau 24). (see Example 8, Table 24).
Des illustrations de fonctions de régression logistique LOGITi et LOGIT2 sont présentées en exemple 7 ci-dessous, à savoir : LOGITi and Logit 2 logistic regression function illustrations are presented in Example 7 below, namely:
LOGIT3 = Intercept + k(CXCL10) + 1(HA)  LOGIT3 = Intercept + k (CXCL10) + 1 (HA)
[fonction LOGIT3]  [LOGIT3 function]
avec with
-3,57≤ Intercept≤ -2,67  -3.57≤ Intercept≤ -2.67
0,003≤ k≤ 0,007 et 0,02≤ 1≤ 0,04 (cf. exemple 7, Tableau 19) ; 0.003≤ k≤ 0.007 and 0.02≤ 1 0,0 0.04 (see Example 7, Table 19);
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + 1(HA)  LOGIT = Intercept + k (CXCL10) + 1 (HA)
[fonction LOGIT4] [LOGIT 4 function]
avec with
Intercept = -3, 164  Intercept = -3, 164
k= 0,005 et  k = 0.005 and
1 = 0,024 (cf. exemple 7, Tableau 22).  1 = 0.024 (see Example 7, Table 22).
La valeur seuil de chacune des fonctions LOGIT de la demande, plus particulièrement de LOGITi, LOGIT2, LOGIT3, LOGIT4, peut par exemple être de 0,5. The threshold value of each of the LOGIT functions of the request, more particularly of LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 , LOGIT 4 , may for example be 0.5.
Une fonction de régression logistique de la demande (mettant en œuvre en fonction affine LOGIT), plus particulièrement LOGITi, LOGIT2, LOGIT3 et LOGIT4, peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66% et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,704, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 72%> et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,729, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et une valeur d'AUC d'au moins 0,865, plus particulièrement un taux de bonne classification d'au moins 80%> et/ou une valeur d'aire sous la courbe ROC (AUC) d'au moins 0,882. A logistic demand regression function (using the affine LOGIT function), in particular LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 , can for example have a good classification rate of at least 66% and / or a area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.704, more particularly a good classification rate of at least 72%> and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.729, more particularly a good classification rate of at least 80%> and an AUC value of at least 0.865, more particularly a good classification rate of at least 80%> and / or an area value under the ROC curve (AUC) of at least 0.882.
Une fonction de régression logistique de la demande, plus particulièrement A logistic regression function of the demand, more particularly
LOGITi, LOGIT2, LOGIT3 et LOGIT4, peut par exemple avoir plus une sensibilité d'au moins 70%> et/ou une VPN d'au moins 70%>, particulièrement une sensibilité d'au moins 75%o et/ou une VPN d'au moins 75%>, plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%. LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 , for example, may have a sensitivity of at least 70%> and / or a VPN of at least 70%>, particularly a sensitivity of at least 75% o and / or or a VPN of at least 75%>, more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%.
Une fonction de régression logistique de la demande, plus particulièrement A logistic regression function of the demand, more particularly
LOGITi, LOGIT2, LOGIT3 et LOGIT4, peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59%o et/ou une VPP d'au moins 54%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 70%o et/ou une VPP d'au moins 61%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 85%o et/ou une VPP d'au moins 85%>, plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%. LOGITi, LOGIT 2 , LOGIT 3 and LOGIT 4 , may for example have a specificity of at least 59% o and / or a VPP of at least 54%>, more particularly a specificity of at least 70% o and / or or a VPP of at least 61%>, more particularly a specificity of at least 85% o and / or a VPP of at least 85%>, more particularly a specificity of at least 86% and / or a VPP at least 86%.
Apprentissage automatique (par exemple, CART) Alternativement ou complémentairement, l'apprentissage automatique peut être mis en œuvre pour comparer les valeurs de quantification des biomarqueurs à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade de fïbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance. Ledit apprentissage automatique peut être un apprentissage par arbre de décision, plus particulièrement par arbre de décision CART. Automatic learning (for example, CART) Alternatively or additionally, machine learning can be used to compare the quantification values of biomarkers with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject. in those cohorts of reference to which he has the highest probability of belonging. Said machine learning can be a learning by decision tree, more particularly by decision tree CART.
Par exemple, les valeurs de quantification obtenues pour ledit sujet sont chacune comparées à une valeur seuil qui est propre au, ou caractéristique du marqueur dont est la valeur, en suivant un arbre de décision, plus particulièrement un arbre de décision CART. Cet arbre de décision (plus particulièrement cet arbre de décision CART), plus particulièrement lesdites valeurs seuils de cet arbre, peuvent être [préalablement] déterminées par apprentissage automatique, plus particulièrement par établissement d'un arbre de décision (plus particulièrement par établissement d'un arbre CART), à partir des valeurs de quantification, ou de la distribution des valeurs de quantification, desdites cohortes de référence, plus particulièrement desdites première et deuxième cohortes de référence. Un arbre de décision, plus particulièrement un arbre de décision CART, peut donc être défini par une succession de valeurs seuils, qui s'ordonnent selon un arbre de décision.  For example, the quantization values obtained for said subject are each compared to a threshold value which is specific to the characteristic of the marker whose value is, following a decision tree, more particularly a decision tree CART. This decision tree (more particularly this decision tree CART), more particularly said threshold values of this tree, can be [previously] determined by automatic learning, more particularly by establishing a decision tree (more particularly by setting up a decision tree). a tree CART), from the quantization values, or from the distribution of the quantization values, of said reference cohorts, more particularly of said first and second reference cohorts. A decision tree, more particularly a decision tree CART, can therefore be defined by a succession of threshold values, which are ordered according to a decision tree.
Par exemple, un arbre de décision mettant en œuvre les marqueurs HA et CXCLIO peut être défini par trois valeurs seuils :  For example, a decision tree implementing the markers HA and CXCLIO can be defined by three threshold values:
- une première valeur seuil (par exemple, h) s'appliquant à la valeur de quantification de l'un des deux bio marqueurs (par exemple, la valeur de quantification de HA), et créant un embranchement à deux ramifications selon que la valeur de quantification est inférieure ou supérieure à la valeur seuil, puis  a first threshold value (for example, h) applying to the quantization value of one of the two bio markers (for example, the quantization value of HA), and creating a branching branch according to whether the value quantization is less than or greater than the threshold value, then
- deux autres valeurs seuils ( par exemple, i et j) qui s'appliquent chacune à la valeur de quantification de l'autre des deux biomarqueurs (par exemple, la valeur de quantification de CXCLIO), l'une de ces deux autres valeurs seuils s'appliquant sur l'une des deux ramifications et l'autre des deux autres valeurs seuils s'appliquant sur l'autre des deux ramifications.  two other threshold values (for example, i and j) which each apply to the quantization value of the other of the two biomarkers (for example, the quantization value of CXCL10), one of these other two values thresholds applying to one of the two branches and the other of the two other threshold values applying to the other of the two branches.
Un tel arbre CART est représenté en Figure 12. Conformément à la Figure 12, ledit apprentissage automatique peut être un arbre de décision CART, qui comprend un seuil de décision h pour le marqueur HA et des seuils de décision i et j pour le marqueur CXCL10, lesdits seuils h, i et j étant comme suit : si la valeur de quantification de HA pour ledit sujet est inférieure à h, le seuil du marqueur CXCL 10 est j , et : Such a CART tree is represented in FIG. 12. According to FIG. 12, said automatic learning can be a decision tree CART, which comprises a decision threshold h for the marker HA and decision thresholds i and j for the marker CXCL10, said thresholds h, i and j being as follows: if the quantization value of HA for said subject is less than h, the threshold of the marker CXCL 10 is j, and:
ledit sujet est classé dans ladite première cohorte (score de fïbrose Metavir < F2) si la valeur de quantification de CXCL 10 est inférieure à j, ledit sujet est classé dans ladite deuxième cohorte (score de fïbrose Metavir > F2) si la valeur de quantification de CXCL 10 est supérieure ou égale à j, et  said subject is classified in said first cohort (Metavir fibrosis score <F2) if the quantization value of CXCL 10 is less than j, said subject is classified in said second cohort (Metavir fibro> F2 score) if the quantization value of CXCL 10 is greater than or equal to j, and
si la valeur de quantification de HA pour ledit sujet est supérieure ou égale à h, le seuil du marqueur CXCL 10 est i, et  if the quantization value of HA for said subject is greater than or equal to h, the threshold of the marker CXCL 10 is i, and
ledit sujet est classé dans ladite première cohorte (score de fïbrose Metavir < F2) si la valeur de quantification de CXCL 10 est inférieure à i, ledit sujet est classé dans ladite deuxième cohorte (score de fïbrose Metavir > said subject is classified in said first cohort (Metavir fibrosis score <F2) if the quantification value of CXCL 10 is less than i, said subject is classified in said second cohort (Metavir fibrose score>
F2) si la valeur de quantification de CXCL 10 est supérieure ou égale à i. F2) if the quantization value of CXCL 10 is greater than or equal to i.
Par exemple, l'arbre CART est celui de la Figure 12, avec : For example, the CART tree is that of Figure 12, with:
40≤h≤80 40≤h≤80
150≤ i≤ 300 150≤ i≤ 300
400≤j≤620 400≤j≤620
[arbre CARTi].  [CARTi tree].
Par exemple, l'arbre CART est celui de la Figure 12, avec : For example, the CART tree is that of Figure 12, with:
41,96≤h≤ 77,43 41.96≤h≤ 77.43
159,09≤i≤ 266,7 159.09 ± 266.7
410,75 < j < 613,49 410.75 <j <613.49
[arbre CART2] ; cf. exemple 8. Par exemple, l'arbre CART est celui de la Figure 12, avec : [CART 2 tree]; cf. example 8. For example, the tree CART is that of Figure 12, with:
42,18≤h≤ 77,4  42.18≤h≤ 77.4
209,3≤i≤ 266,7 209.3≤i≤ 266.7
454,7≤j≤ 553,1 [arbre CART3] ; cf. exemples 7 et 8. 454.7≤j≤ 553.1 [CART tree 3 ]; cf. Examples 7 and 8.
Par exemple, l'arbre CART est celui de la Figure 12, avec : For example, the CART tree is that of Figure 12, with:
h = 47,29 h = 47.29
i = 209,3 i = 209.3
j = 503,4 j = 503.4
[arbre CART4] ; cf. exemples 7 et 8. [CART tree 4 ]; cf. Examples 7 and 8.
Un arbre CART de la demande, plus particulièrement CARTi, CART2, CART3 et CART4, peut par exemple avoir un taux de bonne classification d'au moins 66%, plus particulièrement d'au moins 72%, plus particulièrement d'au moins 80%, plus particulièrement d'au moins 83%, plus particulièrement d'au moins 84%, plus particulièrement d'au moins 85%. A CART tree of the demand, more particularly CARTi, CART 2 , CART 3 and CART 4 , may for example have a good classification rate of at least 66%, more particularly at least 72%, more particularly from less than 80%, more particularly at least 83%, more particularly at least 84%, more particularly at least 85%.
Un arbre CART de la demande, plus particulièrement CARTi, CART2, CART3 et CART4, peut par exemple avoir plus une sensibilité d'au moins 70% et/ou une VPN d'au moins 70%, particulièrement une sensibilité d'au moins 75% et/ou une VPN d'au moins 75%), plus particulièrement une sensibilité d'au moins 76% et/ou une VPN d'au moins 75%), plus particulièrement une sensibilité d'au moins 77% et/ou une VPN d'au moins 77%), plus particulièrement une sensibilité d'au moins 78% et/ou une VPN d'au moins 78%), plus particulièrement une sensibilité d'au moins 82% et/ou une VPN d'au moins 80%. A CART tree of the application, more particularly CARTi, CART 2 , CART 3 and CART 4 , may for example have a sensitivity of at least 70% and / or a VPN of at least 70%, particularly a sensitivity of at least 75% and / or a VPN of at least 75%), more particularly a sensitivity of at least 76% and / or a VPN of at least 75%), more particularly a sensitivity of at least 77% and / or a VPN of at least 77%), more particularly a sensitivity of at least 78% and / or a VPN of at least 78%), more particularly a sensitivity of at least 82% and / or a VPN of at least 80%.
Un arbre CART de la demande, plus particulièrement CARTi, CART2, CART3 et CART4, peut par exemple avoir une spécificité d'au moins 59% et/ou une VPP d'au moins 54%), plus particulièrement une spécificité d'au moins 70% et/ou une VPP d'au moins 61%), plus particulièrement une spécificité d'au moins 85% et/ou une VPP d'au moins 85%), plus particulièrement une spécificité d'au moins 86% et/ou une VPP d'au moins 86%), plus particulièrement une spécificité d'au moins 89% et/ou une VPP d'au moins 90%), plus particulièrement une spécificité d'au moins 91% et/ou une VPP d'au moins 91%. A CART tree of demand, more particularly CARTi, CART 2 , CART 3 and CART 4 , may for example have a specificity of at least 59% and / or a VPP of at least 54%), more particularly a specificity of at least 70% and / or a VPP of at least 61%), more particularly a specificity of at least 85% and / or a VPP of at least 85%), more particularly a specificity of at least 86%. % and / or a VPP of at least 86%), more particularly a specificity of at least 89% and / or a VPP of at least 90%), more particularly a specificity of at least 91% and / or a VPP of at least 91%.
Combinaison d'apprentissage automatique et de fonction mathématique Alternativement ou complémentairement, ladite comparaison peut être faite en combinant apprentissage automatique et fonction mathématique, par exemple en combinant arbre de décision et fonction linéaire ou non linéaire. Combination of machine learning and mathematical function Alternatively or additionally, said comparison can be made by combining machine learning and mathematical function, for example by combining decision tree and linear or non-linear function.
Par exemple, cette comparaison peut être faite :  For example, this comparison can be made:
- par arbre de décision, plus particulièrement par arbre CART, pour un ou au moins un marqueur choisi parmi la Charge Virale, l'âge, l'IMC et la dureté du foie, plus particulièrement pour (au moins) le marqueur dureté du foie, puis  by a decision tree, more particularly by a CART tree, for one or at least one marker chosen from the viral load, the age, the BMI and the hardness of the liver, more particularly for (at least) the hardness marker of the liver then
- par fonction linéaire ou affine, plus particulièrement par mROC ou régression logistique, pour des marqueurs choisis comme ci-dessus décrits, plus particulièrement pour au moins les marqueurs CXCLIO et HA.  by linear or affine function, more particularly by mROC or logistic regression, for markers chosen as described above, more particularly for at least the CXCL10 and HA markers.
Des illustrations sont présentées en exemple 6 ci-dessous et en Figures 9, 10, 11 : comparaison à une valeur seuil pour une des valeurs (en l'occurrence, la valeur de la dureté du foie), suivie par une comparaison à l'aide d'une fonction linéaire pour les marqueurs CXCLIO et HA (Figure 9), ou pour les marqueurs CXCLIO, HA, âge, IMC et CV (Figure 10), ou pour les marqueurs CXCLIO, HA et FS (Figure 11).  Illustrations are presented in Example 6 below and in Figures 9, 10, 11: comparison with a threshold value for one of the values (in this case, the value of liver hardness), followed by a comparison to the using a linear function for the CXCLIO and HA markers (Figure 9), or for the CXCLIO, HA, age, BMI, and CV markers (Figure 10), or for the CXCLIO, HA, and FS markers (Figure 11).
Ainsi, selon un mode de réalisation, la méthode commence par une étape de mesure de la dureté du foie dudit sujet, par exemple par FIBROSCAN™. Cette étape permet par exemple de déterminer si le foie dudit sujet est ou non atteint d'une cirrhose (stade Metavir F4). S'il n'est pas atteint d'une cirrhose, c'est-à-dire si le stade de fïbrose hépatique dudit sujet est inférieur au score Metavir F4, un échantillon de fluide biologique peut être analysé pour quantifier les marqueurs biologiques choisis comme ci-dessus décrit, plus particulièrement pour au moins CXCLIO et HA, de sorte à déterminer plus avant son stade de fïbrose hépatique (score Metavir de F0 ou Fl, ou bien score Metavir de F2 ou F3). Si le foie dudit sujet est atteint d'une cirrhose (détectée par mesure de la dureté du foie), la mise en œuvre d'une analyse d'un échantillon de fluide biologique apparaît redondante, et n'est donc pas nécessaire.  Thus, according to one embodiment, the method begins with a step of measuring the hardness of the liver of said subject, for example by FIBROSCAN ™. This step makes it possible, for example, to determine whether the liver of said subject is or is not suffering from cirrhosis (Metavir F4 stage). If he does not have cirrhosis, that is, if the hepatic fibrosis stage of said subject is less than the Metavir F4 score, a biological fluid sample can be analyzed to quantify the biological markers chosen as the above described, more particularly for at least CXCLIO and HA, so as to further determine his hepatic fibrosis stage (Metavir score of F0 or Fl, or Metavir score of F2 or F3). If the liver of said subject is suffering from cirrhosis (detected by measuring the hardness of the liver), the implementation of an analysis of a sample of biological fluid appears redundant, and is therefore not necessary.
Autres objets de la demande Selon un aspect complémentaire, la demande est relative à des produits, réactifs ou ligands pour la détection et/ou la quantification des biomarqueurs sélectionnés, plus particulièrement à des réactifs ou ligands qui se lient de manière spécifique à des molécules circulantes sélectionnées à titre de bio marqueurs comme ci-dessus décrit, ainsi qu'à des articles manufacturés, des compositions, des compositions pharmaceutiques, des kits, des tubes, des supports solides comprenant de tels réactifs ou ligands, ainsi qu'à des systèmes informatiques (notamment, produit programme d'ordinateur et dispositif informatique), qui sont spécialement adaptés à la mise en œuvre des méthodes ou produits de la demande. Other objects of the application According to a complementary aspect, the application relates to products, reagents or ligands for the detection and / or quantification of the selected biomarkers, more particularly to reagents or ligands which bind specifically to circulating molecules. selected as bio markers as described above, as well as manufactured articles, compositions, pharmaceutical compositions, kits, tubes, solid supports comprising such reagents or ligands, as well as computer systems (in particular computer program product and computer device), which are specially adapted to the implementation of the methods or products of the application.
La demande est notamment relative à un ligand qui se lie de manière spécifique à un bio marqueur qui est une molécule circulante telle que décrite ci-dessus, par exemple un ligand qui se lie de manière spécifique à HA ou un ligand qui se lie de manière spécifique à CXCL10 (plus particulièrement à la protéine CXCL10 humaine). Plus particulièrement, ce ligand se lie de manière spécifique à la forme circulante de cette molécule, ou s'il en existe plusieurs, à au moins une, à plusieurs, ou à toutes les formes circulantes de cette molécule. The application relates in particular to a ligand which specifically binds to a bio-label which is a circulating molecule as described above, for example a ligand which specifically binds to HA or a ligand which binds in a specific manner. specific to CXCL10 (more particularly to human CXCL10 protein). More particularly, this ligand specifically binds to the circulating form of this molecule, or if there are several, to at least one, to several, or all circulating forms of this molecule.
De préférence, ce ligand permet non seulement de détecter spécifiquement le biomarqueur sélectionné, mais également de le quantifier.  Preferably, this ligand makes it possible not only to specifically detect the selected biomarker, but also to quantify it.
Ce ligand peut notamment être une protéine, un polypeptide, un peptide, par exemple un anticorps (monoclonal ou polyclonal), un fragment d'anticorps, une protéine recombinante, un aptamère, un polysaccharide, un lipide, ou une combinaison de ces produits, plus particulièrement une protéine, un anticorps (monoclonal ou polyclonal), un fragment d'anticorps ou une protéine recombinante.  This ligand can in particular be a protein, a polypeptide, a peptide, for example an antibody (monoclonal or polyclonal), an antibody fragment, a recombinant protein, an aptamer, a polysaccharide, a lipid, or a combination of these products. more particularly a protein, an antibody (monoclonal or polyclonal), an antibody fragment or a recombinant protein.
Des anticorps peuvent par exemple être produits par immunisation d'un mammifère non-humain (tel qu'un lapin) par une protéine codée par ledit gène choisi, ou par un fragment antigénique d'une telle protéine, éventuellement associée ou couplée à un adjuvant d'immunisation (tel qu'un adjuvant de Freund ou tel que KLH -keyhole limpet hemocyanin-), par exemple par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée, et par collecte des anticorps ainsi obtenus dans le sérum dudit mammifère.  Antibodies may for example be produced by immunization of a non-human mammal (such as a rabbit) with a protein encoded by said selected gene, or with an antigenic fragment of such a protein, optionally associated with or coupled to an adjuvant immunization (such as Freund's adjuvant or such as KLH -keyhole limpet hemocyanin-), for example by intraperitoneal or subcutaneous injection, and by collecting the antibodies thus obtained in the serum of said mammal.
Des anticorps monoclonaux peuvent être produits selon une technique d'hybridation lymphocytaire (hybridomes) telle que la technique de Kôhler and Milstein 1975 {cf. également US 4 376 110), la technique d'hybridomes à cellules B humaines (Kosbor et al. 1983; Cole et al. 1983), ou la technique d'immortalisation des lymphocytes à l'aide du virus d'Epstein-Barr -EBV- (Cole et al. 1985). De tels anticorps peuvent par exemple être des IgG, IgM, IgE, IgA, IgD ou toute sous-classe de ces immunoglobulines. Des anticorps modifiés par génie génétique peuvent être produits, tels que des anticorps recombinant, chimères, humanisés par greffage d'un ou plusieurs CDR -Complementary Determining Région-. Monoclonal antibodies can be produced according to a lymphocyte hybridization technique (hybridomas) such as the Kohler and Milstein 1975 (cf. also US 4,376,110), the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al., 1983, Cole et al., 1983), or the technique for immortalizing lymphocytes using the Epstein-Barr virus - EBV (Cole et al., 1985). Such antibodies may for example be IgG, IgM, IgE, IgA, IgD or any subclass of these immunoglobulins. Genetically engineered antibodies can be produced, such as recombinant, chimeric, humanized antibodies by grafting one or more CDR -Complementary Determining Region-.
Les anticorps mis en œuvre dans l'invention peuvent être des fragments d'anticorps ou des dérivés artificiels de tels fragments, dans la mesure où ces fragments ou dérivés présentent ladite propriété de liaison spécifique. De tels fragments peuvent par exemple être des fragments Fab, F(ab')2, Fv, Fab/c, scFv {single chain Fragment variable).  The antibodies used in the invention may be antibody fragments or artificial derivatives of such fragments, insofar as these fragments or derivatives have said specific binding property. Such fragments may for example be Fab, F (ab ') 2, Fv, Fab / c, scFv (single chain Fragment variable) fragments.
Des exemples de ligands comprennent les anticorps qui se lient de manière spécifique à CXCL10, tels que :  Examples of ligands include antibodies that bind specifically to CXCL10, such as:
- l'anticorps monoclonal de souris anti-CXCL10 humaine commercialisé par R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue MAB266 (clone 33036, classe IgGl),  the human anti-CXCL10 mouse monoclonal antibody marketed by R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, U.S.A.), under the catalog number MAB266 (clone 33036, class IgG1),
- l'anticorps polyclonal de chèvre anti-CXCL10 humaine disponible auprès de R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A. ; the human anti-CXCL10 goat polyclonal antibody available from R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE; Minneapolis, MN 55413; U.S.A .;
Référence catalogue AF-266-NA pour une forme non couplée à la biotine), Catalog number AF-266-NA for a form not coupled to biotin),
- l'anticorps monoclonal de souris anti-CXCL10 humaine disponible auprès de R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A. ; Référence catalogue MAB266).  the human anti-CXCL10 mouse monoclonal antibody available from R & D SYSTEMS, Inc. (McKinley Place NE 614, Minneapolis, MN 55413, U.S.A., MAB266 catalog number).
Dans le cadre d'une mise en œuvre en configuration « sandwich », chacun de ces anticorps peut être mis en œuvre comme ligand de capture et/ou comme ligand de détection.  In the context of implementation in "sandwich" configuration, each of these antibodies can be implemented as a capture ligand and / or as a detection ligand.
Des exemples de ligands comprennent les protéines qui se lient de manière spécifique à HA, telles que la protéine recombinante humaine aggrécane G1-IGD-G2 commercialisée par la société R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue 1220-PG-025, ou la protéine HABP {HA binding protein ; protéine issue du cartilage bovin) commercialisée par UNITED STATES BIOLOGICAL (4 Technology Way, Salem, MA 01970, U.S.A.) sous la référence catalogue H7980-30.  Examples of ligands include proteins that specifically bind to HA, such as the recombinant human G1-IGD-G2 aggrecan protein marketed by R & D Systems Inc., Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413; under the catalog number 1220-PG-025, or the HABP protein (HA binding protein; protein derived from bovine cartilage) marketed by UNITED STATES BIOLOGICAL (4 Technology Way, Salem, MA 01970, U.S.A.) under the catalog number H7980-30.
Dans le cadre d'une mise en œuvre en configuration « sandwich », cette protéine recombinante peut être mise en œuvre comme ligand de capture et/ou comme ligand de détection.  In the context of implementation in "sandwich" configuration, this recombinant protein can be used as a capture ligand and / or as a detection ligand.
Chacun desdits ligands peut en outre comprendre au moins un marqueur pour leur détection, plus particulièrement au moins un marqueur de détection qui n'est pas naturellement présent dans la structure du ligand, par exemple au moins une entité choisie parmi les fluorophores (par exemple ATTO™ 550, ATTO™ 663 ; ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany), les chromophores, les enzymes (par exemple, la péroxydase de raifort, une phosphatase alcaline), les éléments radioactifs, les isotopes d'éléments chimiques. Each of said ligands may further comprise at least one marker for their detection, more particularly at least one detection marker which is not naturally present in the ligand structure, for example at least one entity selected from fluorophores (eg ATTO ™ 550, ATTO ™ 663, ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany), chromophores, enzymes (eg, peroxidase) horseradish, alkaline phosphatase), radioactive elements, isotopes of chemical elements.
La demande est également relative à un ensemble ou association d'au moins deux ligands, à savoir un premier ligand qui se lie de manière spécifique à une des molécules circulantes sélectionnées et un deuxième ligand qui se lie de manière spécifique à une autre des molécules circulantes sélectionnées, par exemple l'ensemble ou l'association d'un ligand spécifique de HA et d'un ligand spécifique de CXCLIO. The application also relates to a set or association of at least two ligands, namely a first ligand that specifically binds to one of the selected circulating molecules and a second ligand that specifically binds to another of the circulating molecules selected, for example all or combination of a ligand specific for HA and a ligand specific for CXCLIO.
Chacun desdits premier et deuxième ligands peut ou non porter un marqueur pour sa détection. Lesdits premier et deuxième ligands peuvent chacun porter un marqueur pour leur détection. Ils peuvent chacun porter le même marqueur, ou bien porter des marqueurs différents.  Each of said first and second ligands may or may not carry a marker for detection. Said first and second ligands can each carry a marker for their detection. They can each wear the same marker, or wear different markers.
Lesdits ligands peuvent être en mélange, ou bien sous formes distinctes ou physiquement séparées l'une de l'autre, par exemple en préparation combinée pour une utilisation simultanée, séparée ou différée dans le temps.  Said ligands may be in a mixture, or in separate forms or physically separated from each other, for example in combined preparation for simultaneous, separate or delayed use.
Selon un mode réalisation, l'ensemble ou association ne contient pas de ligand qui se lierait à une protéine circulante qui ne ferait pas partie des molécules circulantes sélectionnées à titre de biomarqueurs comme ci-dessus décrit. Plus particulièrement, selon ce mode réalisation, l'ensemble ou association ne contient pas de ligand qui se lierait à une protéine circulante autre que HA ou CXCLIO. Plus particulièrement, selon ce mode réalisation, l'ensemble ou association ne contient pas de ligand qui se lierait à A2M, GMCSF, IL 12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoAl, IL6ST, pl4ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1 1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 ou MMP1.  According to one embodiment, the combination or combination does not contain a ligand that binds to a circulating protein that would not be part of the circulating molecules selected as biomarkers as described above. More particularly, according to this embodiment, the combination or combination does not contain a ligand that binds to a circulating protein other than HA or CXCL10. More particularly, according to this embodiment, the combination or combination does not contain a ligand which binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM. , SPP1, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 or MMP1.
Cet ensemble ou association peut en outre comprendre des moyens pour la détection et/ou la mesure de la charge virale en virus de l'hépatite (par exemple, VHC et/ou VHB et/ou VHD).  This set or combination may further include means for detecting and / or measuring viral load in hepatitis virus (e.g., HCV and / or HBV and / or HDV).
La demande est également relative à un article manufacturé, une composition, une composition pharmaceutique, un kit qui chacun comprennent au moins un ligand ou au moins un ensemble ou association de ligands de la demande. Plus particulièrement, la demande est relative à un article manufacturé, une composition, une composition pharmaceutique, un kit qui sont chacun adaptés à la détection en multiplex de molécules circulantes, c'est-à-dire de molécules contenues sous forme acellulaire dans un (échantillon de) fluide biologique, telles que CXCL10 et HA {cf. « Molécules circulantes » ci-dessus). The application also relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit each comprising at least one ligand or at least one set or combination of ligands of the application. More particularly, the application relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which are each adapted to the multiplex detection of circulating molecules, that is to say of molecules contained in acellular form in a ( sample of) biological fluid, such as CXCL10 and HA (cf. "Circulating Molecules" above).
Plus particulièrement, la demande est relative à un article manufacturé, une composition, une composition pharmaceutique, un kit qui chacun comprennent :  More particularly, the application relates to a manufactured article, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which each comprise:
- un premier ligand (par exemple, une première protéine), qui se lie de manière spécifique à une des molécules circulantes sélectionnées, par exemple un premier ligand (plus particulièrement, une première protéine, plus particulièrement un anticorps), qui se lie de manière spécifique à CXCL10, et  a first ligand (for example, a first protein), which specifically binds to one of the selected circulating molecules, for example a first ligand (more particularly, a first protein, more particularly an antibody), which binds in a manner specific to CXCL10, and
- un deuxième ligand (par exemple, une deuxième protéine), qui se lie de manière spécifique à une autre des molécules circulantes sélectionnées, par exemple un deuxième ligand (plus particulièrement, une deuxième protéine), qui se lie de manière spécifique à HA.  a second ligand (for example, a second protein), which specifically binds to another of the selected circulating molecules, for example a second ligand (more particularly, a second protein), which specifically binds to HA.
La demande est plus particulièrement relative à un article manufacturé, une composition, une composition pharmaceutique, un kit qui chacun comprennent ce premier ligand et ce deuxième ligand, comme produit de combinaison (ou sous forme combinée, ou en préparation combinée), notamment pour leur utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, plus particulièrement pour leur utilisation simultanée dans le temps.  The application relates more particularly to an article of manufacture, a composition, a pharmaceutical composition, a kit which each comprise this first ligand and this second ligand, as a combination product (or in combined form, or in combined preparation), in particular for their simultaneous use, separate or spread over time, especially for their simultaneous use in time.
Selon un mode réalisation, l'article manufacturé, la composition, la composition pharmaceutique ou le kit ne contient pas de ligand qui se lierait à une protéine circulante qui ne ferait pas partie des molécules circulantes sélectionnées à titre de bio marqueurs comme ci-dessus décrit. Plus particulièrement, selon ce mode réalisation, l'article manufacturé, la composition, la composition pharmaceutique ou le kit ne contient pas de ligand qui se lierait à une protéine circulante autre que HA ou CXCL10. Plus particulièrement, l'article manufacturé, la composition, la composition pharmaceutique ou le kit ne contient pas de ligand qui se lierait à A2M, GMCSF, IL 12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoAl, IL6ST, pl4ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL11, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 ou MMP1.  According to one embodiment, the manufactured article, the composition, the pharmaceutical composition or the kit does not contain a ligand that would bind to a circulating protein that would not be part of the circulating molecules selected as bio-markers as described above. . More particularly, according to this embodiment, the manufactured article, composition, pharmaceutical composition or kit does not contain a ligand that would bind to a circulating protein other than HA or CXCL10. More particularly, the manufactured article, the composition, the pharmaceutical composition or the kit does not contain a ligand that binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4. , TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL11, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 or MMP1.
La demande est ainsi relative à un article manufacturé qui est adapté à la détection en multiplex de molécules contenues sous forme acellulaire dans un (échantillon de) fluide biologique, et qui comprend un support solide sur lequel sont fixés des ligands desdites molécules. The application is thus related to a manufactured article which is adapted to the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a (sample of) fluid biological, and which comprises a solid support on which ligands of said molecules are attached.
Ledit article manufacturé peut par exemple être :  Said manufactured article may for example be:
- un ou des tubes,  - one or more tubes,
- un kit, notamment un kit comprenant un ou des tubes,  a kit, in particular a kit comprising one or more tubes,
- un support solide ou semi-solide, par exemple, en plastique, polystyrène, polypropylène, verre, silicium, nitrocellulose, poly(vinylidene fluoride) [PVDF] ou polymère, ou comprenant un matériau magnétique tel que de l'oxyde de fer, tel que :  a solid or semi-solid support, for example of plastic, polystyrene, polypropylene, glass, silicon, nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) or polymer, or comprising a magnetic material such as iron oxide, such as :
o une plaque ou microplaque à puits, par exemple en polypropylène et/ou en polystyrène, plus particulièrement une plaque ou microplaque à puits adaptée à la titration et/ou au criblage à haut débit (High Throughput Screening microplates),  a well plate or microplate, for example made of polypropylene and / or polystyrene, more particularly a well plate or microplate suitable for titration and / or high throughput screening (High Throughput Screening Microplates),
o une puce ou un microréseau (à circuit intégré) en matériau conducteur ou semi-conducteur, plus particulièrement une puce (ou un microréseau) à galette (wafer) de silicium, plus particulièrement une puce (ou un microréseau) en silicium,  a chip or microarray (integrated circuit) made of conductive or semiconductor material, more particularly a wafer chip (or microarray) of silicon, more particularly a silicon chip (or microarray),
o un capillaire, plus particulièrement un capillaire en verre,  a capillary, more particularly a glass capillary,
o une bille magnétique dont le diamètre moyen est inférieur au micromètre, o une lame de verre,  a magnetic ball whose mean diameter is less than a micrometer, a glass slide,
o une membrane (par exemple, une membrane en nitrocellulose ou en PVDF).  a membrane (for example, a nitrocellulose or PVDF membrane).
Plus particulièrement, des microplaques pour criblage à haut débit peuvent être utilisées (cf. exemple 10). Les puits de ces microplaques ont la capacité d'adsorber les biomolécules, plus particulièrement les protéines. Elles possèdent généralement une excellente stabilité thermique et chimique ainsi que d'excellentes propriétés optiques. Elles sont généralement en polystyrène et/ou en polypropylène. Chaque microplaque contient une pluralité de puits, généralement 96 puits. Ces microplaques sont conçues pour recevoir des rangées de gouttes desdits premier et deuxième ligands, dont le volume est inférieur à 100 nL par goutte (généralement 50 nL par goutte). Un robot spotteur peut être utilisé pour déposer ces rangées de gouttes.  More particularly, microplates for high throughput screening can be used (see Example 10). The wells of these microplates have the ability to adsorb biomolecules, especially proteins. They generally have excellent thermal and chemical stability as well as excellent optical properties. They are generally made of polystyrene and / or polypropylene. Each microplate contains a plurality of wells, generally 96 wells. These microplates are designed to receive rows of drops of said first and second ligands, whose volume is less than 100 nL per drop (usually 50 nL per drop). A robot spoofer can be used to drop these rows of drops.
Lesdits premier et deuxième ligands peuvent être fixés, immobilisés ou greffés sur l'article manufacturé, ou y être liés par covalence. L'article manufacturé peut par exemple sous la forme d'un article manufacturé qui est adapté à la détection en multiplex de molécules contenues sous forme acellulaire dans un (échantillon de) fluide biologique de volume inférieur ou égal à 500 μΙ_, (plus particulièrement inférieur ou égal à 400μί, plus particulièrement inférieur ou égal à 100 μί), dans lequel ledit support solide comprend une pluralité de zones de réception d'échantillons liquides, lesdites zones étant fluidiquement indépendantes les unes des autres et étant chacune adaptée à la réception d'un seul échantillon liquide par zone, le volume maximal d'échantillon liquide que chaque zone peut recevoir n'excédant pas 500 μΐ, (plus particulièrement inférieur ou égal à 400μί, plus particulièrement inférieur ou égal à 100 μί), et dans lequel au moins l'une desdites de zones de réception d'échantillons liquides comprend à la fois ledit premier ligand et ledit deuxième ligand (plus particulièrement, ladite première protéine et ladite deuxième protéine). Lesdites zones de réception d'échantillons liquides peuvent par exemple être les puits d'une plaque ou microplaque de titration et/ou de criblage haut débit, les puits de réception de spots d'une puce en silicium, des portions cylindriques d'un capillaire en verre, une membrane, une lame de verre, un tube. Said first and second ligands can be fixed, immobilized or grafted on the manufactured article, or covalently bonded thereto. The manufactured article can for example be in the form of a manufactured article that is suitable for the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a (sample of) biological fluid with a volume less than or equal to 500 μΙ_ (more particularly lower than or equal to 400μί, more particularly less than or equal to 100 μί), wherein said solid support comprises a plurality of liquid sample receiving zones, said zones being fluidly independent of each other and each being adapted to the reception of a single liquid sample per zone, the maximum volume of liquid sample that each zone can receive not exceeding 500 μΐ, (more particularly less than or equal to 400 μί, more particularly less than or equal to 100 μί), and in which at least one of said liquid sample receiving zones comprises both said first ligand and said second ligand (More particularly, said first protein and said second protein). Said liquid sample receiving zones may for example be the wells of a plate or microplate for titration and / or high throughput screening, the spot receiving wells of a silicon chip, the cylindrical portions of a capillary glass, a membrane, a glass slide, a tube.
Dans l'article manufacturé, ledit premier ligand et ledit deuxième ligand (plus particulièrement, ladite première protéine et ladite deuxième protéine) peuvent être fixés (ou immobilisés, ou greffés, ou liés par covalence) audit support solide dans une configuration selon laquelle un seul et même échantillon liquide de volume inférieur ou égal à 500 μΙ_, (plus particulièrement inférieur ou égal à 400μί, plus particulièrement inférieur ou égal à 100 μί) peut contacter tant ladite première protéine que ladite deuxième protéine.  In the manufactured article, said first ligand and said second ligand (more particularly, said first protein and said second protein) may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support in a configuration in which only one and even a liquid sample with a volume less than or equal to 500 μΙ_ (more particularly less than or equal to 400 μί, more particularly less than or equal to 100 μί) can contact both said first protein and said second protein.
Dans l'article manufacturé, ledit premier ligand (plus particulièrement, ladite première protéine) peut être fixé (ou immobilisé, ou greffé, ou lié par covalence) audit support solide en un premier site de fixation, et ledit deuxième ligand (plus particulièrement, ladite deuxième protéine) peut être fixé (ou immobilisé, ou greffé, ou lié par covalence) audit support solide en un deuxième site de fixation, dans lequel ledit premier site de fixation est en contact fluidique avec ledit deuxième site de fixation.  In the article of manufacture, said first ligand (more particularly, said first protein) may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support at a first attachment site, and said second ligand (more particularly, said second protein) may be fixed (or immobilized, or grafted, or covalently bound) to said solid support at a second attachment site, wherein said first attachment site is in fluidic contact with said second attachment site.
Chacun de ces premiers et deuxième ligands peut être utilisé comme ligand de capture (par exemple, dans le cadre d'une détection en configuration sandwich mettant par ailleurs en œuvre des ligands de détection qui portent au moins un marqueur de détection ; cf. composition ci-dessous, cf. exemple 10). Selon un mode de réalisation, les ligands de molécules circulantes qui sont contenus dans un article manufacturé ne comprend pas de ligand qui se lierait à A2M, GMCSF, IL 12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPPl, AST, ApoAl, IL6ST, pl4ARF, MMP9, ANGPT2, CXCLl l, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 ou MMP1. Each of these first and second ligands can be used as a capture ligand (for example, in the context of a detection in sandwich configuration also implementing detection ligands which carry at least one detection marker; below, see example 10). According to one embodiment, the ligands of circulating molecules that are contained in an article of manufacture does not comprise a ligand that binds to A2M, GMCSF, IL12, IL2, MMP13, ALT, GGT, ICAM1, IL4, CXCL9, VCAM1, RBP4, TIMP1, VIM, SPP1, AST, ApoA1, IL6ST, p14ARF, MMP9, ANGPT2, CXCL1, MMP2, MMP7, S100A4, TIMP1, CHI3L1, COL1A1, CXCL1, CXCL6, IHH, IRF9 or MMP1.
Selon un mode de réalisation, les ligands de molécules circulantes qui sont contenus dans un article manufacturé sont constitués par :  According to one embodiment, the ligands of circulating molecules that are contained in a manufactured article consist of:
un premier ligand (par exemple, une première protéine), qui se lie de manière spécifique à HA, et  a first ligand (e.g., a first protein), which binds specifically to HA, and
- un deuxième ligand (par exemple, une deuxième protéine, plus particulièrement un anticorps), qui se lie de manière spécifique à CXCL10.  a second ligand (for example, a second protein, more particularly an antibody), which binds specifically to CXCL10.
Optionnellement, un article manufacturé comprend en outre des instructions (par exemple, une feuille d'instructions) pour quantifier les molécules auxquelles les ligands se lient spécifiquement, par exemple pour quantifier CXCL10 et HA, plus particulièrement des instructions (par exemple, une feuille d'instructions) pour quantifier ces molécules et déterminer un stade ou score de fibrose hépatique à partir des valeurs de quantification obtenues.  Optionally, a manufactured article further includes instructions (e.g., an instruction sheet) for quantifying the molecules to which the ligands specifically bind, e.g. to quantify CXCL10 and HA, more particularly instructions (e.g. instructions) to quantify these molecules and determine a liver fibrosis stage or score from the obtained quantization values.
Ledit article manufacturé peut en outre comprendre un ou plusieurs des éléments suivants :  Said manufactured article may further include one or more of the following:
- un instrument pour le prélèvement dudit échantillon, notamment :  - an instrument for taking the sample, in particular:
o une aiguille et/ou une seringue, plus particulièrement une aiguille et/ou une seringue pour le prélèvement d'un liquide intracorporel, tel que du sang, et/ou  a needle and / or a syringe, more particularly a needle and / or a syringe for taking an intracorporeal fluid, such as blood, and / or
o une aiguille adaptée à la cyto-ponction hépatique, par exemple une aiguille de diamètre 18 à 22G), et/ou  a needle adapted for hepatic cytopuncture, for example a needle of diameter 18 to 22G, and / or
o une aiguille et/ou un cathéter et/ou un pistolet à biopsie adaptés à la PBH ; un produit programme d'ordinateur ou logiciel, notamment un produit programme d'ordinateur ou logiciel d'analyse statistique, par exemple un produit programme d'ordinateur de l'invention tel que ci-dessous décrit.  o a needle and / or catheter and / or biopsy gun adapted to the PBH; a computer or software program product, in particular a computer program product or statistical analysis software, for example a computer program product of the invention as hereinafter described.
La demande est également relative à une composition adaptée à la détection de molécules en multiplex, plus particulièrement à la détection en multiplex de molécules contenues sous forme acellulaire dans un fluide (telles que les molécules CXCL10 et HA), qui comprend en mélange : - un premier ligand qui porte un premier marqueur de détection, et The application also relates to a composition adapted to the detection of molecules in multiplex, more particularly to the detection in multiplex of molecules contained in acellular form in a fluid (such as the molecules CXCL10 and HA), which comprises in mixture: a first ligand carrying a first detection marker, and
- un deuxième ligand qui porte un deuxième marqueur de détection.  a second ligand which carries a second detection marker.
Ledit premier marqueur de détection peut être identique ou différent dudit deuxième marqueur de détection.  The first detection marker may be the same or different from the second detection marker.
Le premier ligand et le deuxième ligand sont chacun spécifiques d'une molécule circulante différente (molécule circulante sélectionnée à titre de bio marqueur comme décrit ci-dessus).  The first ligand and the second ligand are each specific for a different circulating molecule (circulating molecule selected as bio-label as described above).
Plus particulièrement, ledit premier ligand est un ligand (par exemple, une protéine) qui se lie de manière spécifique à HA et ledit deuxième ligand est un ligand (par exemple, une protéine, plus particulièrement un anticorps) qui se lie de manière spécifique à CXCL10 (humaine), plus particulièrement un ligand (par exemple, une protéine, plus particulièrement un anticorps) qui se lie de manière spécifique à une, au moins une, des ou toutes les formes circulantes de la protéine CXCL10 (humaine).  More particularly, said first ligand is a ligand (e.g., a protein) that specifically binds to HA and said second ligand is a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that binds specifically to CXCL10 (human), more particularly a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that specifically binds to one, at least one, or all of the circulating forms of the CXCL10 protein (human).
Ces premiers et deuxième ligands peuvent par exemple être utilisés comme ligands de détection (par exemple, dans le cadre d'une détection en configuration sandwich avec des ligands de capture ; cf. article manufacturé ci-dessus ; cf. exemple 10).  These first and second ligands may for example be used as detection ligands (for example, in the context of detection in sandwich configuration with capture ligands, see article manufactured above, see Example 10).
La demande est également relative à un kit, qui comprend : The application also relates to a kit, which includes:
- des acides nucléiques qui se lient de manière spécifique à un ou des virus de l'hépatite, et qui comprend en outre  nucleic acids which specifically bind to one or more hepatitis viruses, and which further comprises
- des ligands qui se lient à des molécules contenues sous forme acellulaire dans un fluide biologique, lesdits ligands étant contenus dans le kit en préparation combinée pour une utilisation séparée, différée ou simultanée dans le temps, plus particulièrement pour une utilisation simultanée dans le temps, plus particulièrement pour une utilisation en mélange.  ligands which bind to molecules contained in acellular form in a biological fluid, said ligands being contained in the kit in combined preparation for separate, delayed or simultaneous use over time, more particularly for simultaneous use in time, more particularly for use in a mixture.
Lesdits ligands qui se lient à des molécules contenues sous forme acellulaire dans un fluide biologique sont constitués par :  Said ligands which bind to molecules contained in acellular form in a biological fluid are constituted by:
- un premier ligand qui porte un premier marqueur de détection, et  a first ligand carrying a first detection marker, and
- un deuxième ligand qui porte un deuxième marqueur de détection.  a second ligand which carries a second detection marker.
Ledit premier marqueur de détection peut être identique ou différent dudit deuxième marqueur de détection.  The first detection marker may be the same or different from the second detection marker.
Le premier ligand et le deuxième ligand sont chacun spécifiques d'une molécule circulante différente (molécule circulante sélectionnée à titre de bio marqueur comme décrit ci-dessus). Plus particulièrement, ledit premier ligand est un ligand (par exemple, une protéine) qui se lie de manière spécifique à HA et ledit deuxième ligand est un ligand (par exemple, une protéine, plus particulièrement un anticorps) qui se lie de manière spécifique à CXCL10 (humaine), plus particulièrement un ligand (par exemple, une protéine, plus particulièrement un anticorps) qui se lie de manière spécifique à une, au moins une, des ou toutes les formes circulantes de la protéine CXCL10 (humaine). The first ligand and the second ligand are each specific for a different circulating molecule (circulating molecule selected as bio-label as described above). More particularly, said first ligand is a ligand (e.g., a protein) that specifically binds to HA and said second ligand is a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that binds specifically to CXCL10 (human), more particularly a ligand (e.g., a protein, more particularly an antibody) that specifically binds to one, at least one, or all of the circulating forms of the CXCL10 protein (human).
Ces premiers et deuxième ligands peuvent par exemple être utilisés comme ligands de détection (par exemple, dans le cadre d'une détection en configuration sandwich avec des ligands de capture ; cf. article manufacturé ci-dessus ; cf. exemple 10).  These first and second ligands may for example be used as detection ligands (for example, in the context of detection in sandwich configuration with capture ligands, see article manufactured above, see Example 10).
Le kit peut en outre comprendre un article manufacturé tel que décrit ci-dessus.  The kit may further include a manufactured article as described above.
La demande est également relative audit ligand, ensemble ou association de ligands, article manufacturé, composition, composition pharmaceutique, kit pour leur utilisation dans une méthode pour détecter ou diagnostiquer une hépatopathie qui comporte une atteinte tissulaire du foie, plus particulièrement une fibrose hépatique, plus particulièrement pour déterminer le score de fibrose hépatique d'un sujet, plus particulièrement une fibrose hépatique, plus particulièrement pour déterminer si le score de fibrose hépatique d'un sujet a ou non dépassé celui de la fibrose légère, plus particulièrement pour déterminer si la fibrose hépatique d'un sujet a un score de fibrose Metavir d'au plus Fl ou bien d'au moins F2. The application also relates to said ligand, together or combination of ligands, manufactured article, composition, pharmaceutical composition, kit for their use in a method for detecting or diagnosing liver disease which involves tissue damage of the liver, more particularly hepatic fibrosis, more particularly for determining the hepatic fibrosis score of a subject, more particularly liver fibrosis, more particularly for determining whether or not the liver fibrosis score of a subject has exceeded that of mild fibrosis, more particularly for determining whether fibrosis Hepatitis of a subject has a Metavir fibrosis score of at most Fl or at least F2.
La demande est également relative audit ligand, ensemble ou association de ligands, article manufacturé, composition, composition pharmaceutique, kit pour leur utilisation dans une méthode pour le traitement d'une hépatopathie qui comporte une atteinte tissulaire du foie, plus particulièrement une fibrose hépatique.  The application also relates to said ligand, together or combination of ligands, manufactured article, composition, pharmaceutical composition, kit for their use in a method for the treatment of hepatopathy which involves tissue damage of the liver, more particularly liver fibrosis.
Cette utilisation peut notamment comprendre : This use can include:
- la mise en œuvre dudit(desdits) ligand(s) dans une méthode de l'invention pour déterminer si le score de fibrose hépatique d'un sujet a ou non dépassé celui de la fibrose légère, plus particulièrement pour déterminer si la fibrose hépatique d'un sujet a un score de fibrose Metavir d'au plus Fl ou bien d'au moins F2, et  the use of said ligand (s) in a method of the invention to determine whether or not the liver fibrosis score of a subject has exceeded that of mild fibrosis, more particularly to determine whether hepatic fibrosis a subject has a Metavir fibrosis score of at most Fl or at least F2, and
- le fait d'administrer audit sujet un traitement visant à bloquer la progression de la fibrose hépatique (tel qu'un traitement comprenant interféron standard ou pégylé, en monothérapie, ou en plurithérapie associant ribavirine), si le sujet présente un score de fibrose hépatique qui a dépassé celui de la fibrose légère (score de fibrose administering to said subject a treatment aimed at blocking the progression of hepatic fibrosis (such as a treatment comprising standard or pegylated interferon, as monotherapy, or in combination therapy combining ribavirin), if the subject presents a liver fibrosis score which exceeded that of mild fibrosis (fibrosis score
Metavir d'au moins F2). Cette méthode peut en outre comprendre le fait de ne pas administrer ce traitement si, ou tant que, ce score ne dépasse pas celui de la fïbrose légère. Metavir of at least F2). This method may further include not administering this treatment if, or as long as, this score does not exceed that of mild fibrose.
Ce traitement peut par exemple être :  This treatment can for example be:
interféron alpha-2b pégylé (tel que PEG-INTRON®, Schering Plough Corporation, Kenilworth, NJ) à une dose d'environ 1,5 g/kg/semaine, et ribavirine (REBETOL® ; pegylated interferon alpha-2b (such as PEG-INTRON®, Schering Plow Corporation, Kenilworth, NJ) at a dose of about 1.5 g / kg / week, and ribavirin (REBETOL®;
Schering Plough Corporation, Kenilworth, NJ) à une dose de 800 à 1200 mg/kg/jour (si l'hépatopathie implique un VHC de génotype 2 ou 3, une dose d'environ 800 mg/kg et par jour est généralement conseillée), ou Schering Plow Corporation, Kenilworth, NJ) at a dose of 800 to 1200 mg / kg / day (if hepatopathy involves genotype 2 or 3 HCV, a dose of approximately 800 mg / kg daily is generally recommended) , or
interféron alpha-2a pégylé (tel que PEGASYS® ; Roche Corp., F. Hoffmann-La Roche Ltd. ; Basel, Suisse) à une concentration de 180 g/kg/semaine et ribavirine pegylated interferon alpha-2a (such as PEGASYS®, Roche Corp., F.Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) at a concentration of 180 g / kg / week and ribavirin
(COPEGUS®, Roche Corp. ; F. Hoffmann-La Roche Ltd. ; Basel, Suisse) à raison de 1000 à 1200 mg/kg/jour. (COPEGUS®, Roche Corp., F.Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) at 1000 to 1200 mg / kg / day.
La durée du traitement peut par exemple être d'au moins 24 semaines, par exemple de 24 semaines pour une hépatopathie à VHC de génotype 2 ou 3, ou de 48 semaines pour une hépatopathie à VHC de génotype 1, 4 ou 5, ou pour un patient non-répondeur au traitement au bout de 24 semaines.  The duration of treatment may for example be at least 24 weeks, for example 24 weeks for HCV genotype 2 or 3, or 48 weeks for HCV genotype 1, 4 or 5, or for a patient who does not respond to treatment after 24 weeks.
La demande est également relative à un médicament ou association médicamenteuse destiné au traitement d'une hépatopathie comportant une atteinte tissulaire du foie, plus particulièrement une fïbrose hépatique (tel que interféron standard ou interféron pégylé, en monothérapie, ou en plurithérapie associant un ou plusieurs autres principes actifs, notamment de la ribavirine), pour son utilisation dans la méthode de traitement de l'invention.  The application also relates to a medicament or combination drug intended for the treatment of hepatopathy involving tissue involvement of the liver, more particularly liver fibrosis (such as standard interferon or pegylated interferon, as monotherapy, or in combination therapy combining one or more other drugs. active ingredients, especially ribavirin), for its use in the method of treatment of the invention.
Dans la demande, le terme hépatopathie est entendu dans son sens ordinaire, à savoir une atteinte du foie, plus particulièrement une atteinte tissulaire du foie, plus particulièrement des lésions du foie, notamment une fïbrose hépatique. In the application, the term hepatopathy is understood in its ordinary meaning, namely an attack of the liver, more particularly tissue damage of the liver, more particularly liver lesions, including liver fibrosis.
La demande s'adresse plus particulièrement aux hépatopathies chroniques (agressions chroniques du foie de 6 mois ou plus).  The demand is particularly directed to chronic liver diseases (chronic attacks of the liver of 6 months or more).
Différentes maladies causent et /ou conduisent à des lésions du foie, telles qu'une fïbrose hépatique. Peuvent notamment être citées :  Different diseases cause and / or lead to liver damage, such as liver fibrosis. In particular, may be mentioned:
les hépatites chroniques virales (notamment l'hépatite chronique B, l'hépatite chronique C, l'hépatite chronique D ;  chronic viral hepatitis (including chronic hepatitis B, chronic hepatitis C, chronic hepatitis D;
les stéatoses et stéato-hépatites (associées au syndrome métabolique, à l'obésité, au diabète). les hépatites alcooliques ; steatosis and steatohepatitis (associated with metabolic syndrome, obesity, diabetes). alcoholic hepatitis;
l'hématochromatose génétique et les surcharges en fer secondaire  genetic hematochromatosis and secondary iron overload
Les maladies auto-immunes ;  Autoimmune diseases;
les maladies biliaires (cirrhose biliaire primitive et cholangie sclérosante primitive) ;  biliary diseases (primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangie);
les intoxications par médicament ou substance toxique ;  intoxications by drug or toxic substance;
des maladies métaboliques ;  metabolic diseases;
des stéatohépatites non alcooliques (NASH).  nonalcoholic steatohepatitis (NASH).
La demande est plus particulièrement adaptée aux hépatites virales, notamment aux hépatites à virus C (VHC) et/ou à virus B (VHB) et/ou à virus D (VHD), notamment aux hépatites virales à au moins VHC (et optionnellement à VHB et/ou VHD).  The application is more particularly adapted to viral hepatitis, especially hepatitis C virus (HCV) and / or virus B (HBV) and / or virus D (HDV), including viral hepatitis to at least HCV (and optionally to HBV and / or VHD).
La demande est également relative à un produit programme d'ordinateur, destiné à être stocké dans une mémoire d'une unité de traitement, ou sur un support mémoire amovible destiné à coopérer avec un lecteur de ladite unité de traitement. Le produit programme d'ordinateur comprend des instructions pour la mise en œuvre d'une méthode ou d'un produit de la demande, notamment pour la mise en œuvre d'une analyse statistique adaptée à la mise en œuvre d'une méthode de l'invention [notamment adaptée à l'analyse statistique (multivariée) des biomarqueurs choisis] et/ou pour la construction d'un modèle de classification (multivariée) adapté à la mise en œuvre d'une méthode ou d'un produit de l'invention.  The application also relates to a computer program product intended to be stored in a memory of a processing unit, or to a removable memory medium intended to cooperate with a reader of said processing unit. The computer program product includes instructions for implementing a method or a product of the application, in particular for the implementation of a statistical analysis adapted to the implementation of a method of the invention. the invention [in particular adapted to the statistical analysis (multivariate) of the selected biomarkers] and / or for the construction of a classification model (multivariate) adapted to the implementation of a method or a product of the invention.
La demande est également relative à installation informatique, un dispositif informatique, ou ordinateur, comprenant une unité de traitement dans la mémoire de laquelle sont stockés ou enregistrés :  The application also relates to a computer installation, a computing device, or a computer, comprising a processing unit in the memory of which are stored or recorded:
- un produit programme d'ordinateur de la demande, et, optionnellement,  - a computer program product of the application, and, optionally,
- des valeurs de quantification des biomarqueurs sélectionnés.  quantification values of the selected biomarkers.
Le terme "comprenant", avec lequel "incluant" ou "contenant" est synonyme, est un terme ouvert, et n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) de méthode additionnel(s) qui ne serait(seraient) pas explicitement indiqué(s), tandis que le terme "consistant" ou "constitué" est un terme fermé, qui exclut la présence de tout autre élément additionnel, étape, ou ingrédient qui ne serait pas explicitement exposé. Le terme "consistant essentiellement" ou " essentiellement constitué" est un terme partiellement ouvert, qui n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s), dans la mesure où cet(ces) élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s) n'affecte(nt) pas matériellement les propriétés de base de l'invention. The term "comprising", with which "including" or "containing" is synonymous, is an open term, and does not exclude the presence of one or more element (s), ingredient (s) or step (s) of additional method (s) that would not be explicitly stated, while the term "consistent" or "constituted" is a closed term, which excludes the presence of any additional element, step, or ingredient that does not would not be explicitly exposed. The term "substantially consisting of" or "essentially consisting of" is a partially open term, which does not exclude the presence of one or more element (s), ingredient (s) or additional step (s) in the as far as this (these) element (s), ingredient (s) or additional step (s) does not materially affect the basic properties of the invention.
Par conséquent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") inclut les termes "consistant", "constitué", aussi bien que les termes "consistant essentiellement" et " essentiellement constitué".  Therefore, the term "comprising" (or "comprises (include)") includes the terms "consisting", "consisting", as well as the terms "consisting essentially" and "essentially consisting".
Dans le but de faciliter la lecture de la demande, la description a été séparée en divers paragraphes, sections et modes de réalisation. Il ne doit pas être considéré que ces séparations déconnectent la substance d'un paragraphe, section ou mode de réalisation, de celle d'un autre paragraphe, section ou mode réalisation. Au contraire, la description englobe toutes les combinaisons possibles des différents paragraphes, sections, phrases et modes de réalisations qu'elle contient. In order to facilitate the reading of the application, the description has been separated into various paragraphs, sections and embodiments. It should not be considered that these separations disconnect the substance of a paragraph, section or embodiment, from that of another paragraph, section, or embodiment. On the contrary, the description encompasses all possible combinations of the different paragraphs, sections, sentences and embodiments that it contains.
Le contenu des références bibliographiques citées dans la demande est spécifiquement incorporé par référence dans le contenu de la demande.  The content of the bibliographic references cited in the application is specifically incorporated by reference into the content of the application.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratif. Ils ne limitent en aucune façon l'invention. The following examples are given for illustrative purposes only. They do not limit the invention in any way.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : établissement et application de combinaisons HA+CXCL10 à une population de patients dont le degré de fibrose est établi par Ponction Biopsie Hépatique (PBH) EXAMPLES EXAMPLE 1 Establishment and Application of HA + CXCL10 Combinations to a Population of Patients with a Fibrosis Degree Established by Hepatic Biopsy Puncture (PBH)
La population de patients était formée de patients de l'Hôpital Beaujon (100, boulevard du Général Leclerc ; 92110 Clichy ; France), qui présentaient une hépatite chronique suite à une infection par le virus de l'Hépatite C (VHC), et couvrant tous, ou la plupart des génotypes de VHC.  The patient population consisted of patients from Beaujon Hospital (100 boulevard du General Leclerc, 92110 Clichy, France) who had chronic hepatitis following infection with the Hepatitis C virus (HCV), and who all, or most HCV genotypes.
Le score de fibrose hépatique de ces patients a été établi par Ponction Biopsie Hépatique (PBH). Cette population était constituée de 118 patients, parmi lesquels 73 présentaient un score de fïbrose Fl, et 45 présentaient un score de fibrose F2 (score établi par PBH selon le système de scores F Metavir, deux lectures indépendantes par un anatomo-pathologiste confirmé). Les études réalisées ont été approuvées par le Comité Éthique local, conformément à la Déclaration d'Helsinki. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé par écrit.  The liver fibrosis score of these patients was established by Punction Biopsy Hepatic (PBH). This population consisted of 118 patients, of whom 73 had F1 fibrosis score, and 45 had F2 fibrosis score (PBH score based on the F Metavir score system, two independent readings by a confirmed pathologist). The studies carried out have been approved by the Local Ethics Committee in accordance with the Declaration of Helsinki. All patients gave their informed consent in writing.
Les caractéristiques de ces 118 patients sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : The characteristics of these 118 patients are presented in Table 1 below. Table 1:
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SD = déviation standard ; UI = unité internationale SD = standard deviation; IU = international unit
Les concentrations sériques de la protéine CXCL10 et de l'acide hyaluronique (HA) ont été mesurées dans le sérum de ces patients à l'aide de kits ELISA disponibles dans le commerce (sandwich en phase solide). Serum concentrations of CXCL10 protein and hyaluronic acid (HA) were measured in the serum of these patients using commercially available ELISA kits (solid phase sandwich).
Pour la concentration sérique de CXCL10 humaine, le kit qui a été utilisé était le kit QUANTIKINE® HUMAN CXCL10/IP-10 ELISA, commercialisé par R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, U.S.A.), sous la référence catalogue DIP100. For the serum concentration of human CXCL10, the kit that was used was the QUANTIKINE® HUMAN CXCL10 / IP-10 ELISA kit, marketed by R & D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under the catalog number DIP100.
Pour la concentration sérique de l'acide hyaluronique (HA), le kit qui a été utilisé était le kit HYALURONAN QUANTIKINE® ELISA, commercialisé par R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, U.S.A.), sous la référence catalogue DHYALO.  For the serum concentration of hyaluronic acid (HA), the kit that was used was the HYALURONAN QUANTIKINE® ELISA kit, marketed by R & D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under the catalog reference DHYALO.
La distribution des concentrations des molécules CXCL10 et HA selon le score de fïbrose hépatique est présentée en Figure 1 et Figure 2, respectivement. The distribution of the concentrations of the CXCL10 and HA molecules according to the hepatic fibrosis score is shown in Figure 1 and Figure 2, respectively.
Les valeurs de concentrations sériques de CXCL10 et HA ont été combinées selon la méthode mROC, afin d'établir une règle décisionnelle permettant de discriminer les patients présentant une fïbrose significative (score Metavir de fïbrose hépatique≥ F2), de ceux présentant une fïbrose non significative (score Metavir de fïbrose hépatique < F2).The serum concentration values of CXCL10 and HA were combined according to the mROC method, in order to establish a decision rule allowing to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis ≥ F2) and those with non-significant fibrose. (Metavir score of hepatic fibrosis <F2).
Les valeurs de concentrations sériques de CXCL10 et HA ont également été combinées selon la méthode mROC à des paramètres cliniques, tels que l'indice de masse corporelle (IMC), l'âge à la date du prélèvement (Age) et la charge virale du patient à la date du prélèvement (CV), afin d'établir une règle décisionnelle permettant de discriminer les patients présentant une fïbrose significative (score Metavir de fïbrose hépatique≥ F2), de ceux présentant une fïbrose non significative (score Metavir de fïbrose hépatique < F2). La méthode mROC est la méthode Receiver Operating Characteristic multivariée, décrite notamment par Kramar et al. 1999 et Kramar et al. 2001. The serum concentrations of CXCL10 and HA were also combined according to the mROC method to clinical parameters, such as body mass index (BMI), age at time of collection (age) and viral load of the patient. patient at the date of sampling (CV), in order to establish a decision rule allowing to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis ≥ F2), and those with non-significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis < F2). The mROC method is the Multivariate Receiver Operating Characteristic method, described in particular by Kramar et al. 1999 and Kramar et al. 2001.
La méthode mROC génère une fonction linéaire qui combine les différents biomarqueurs (BMQ) [Z = a(BMQi) + b(BMQ2) + ...], ainsi que la valeur de référence (seuil maximisant l'indice de Youden, δ) qui confère les meilleures performances à cette fonction linéaire. Les fonctions linéaires ainsi générées et les valeurs de référence qui leur sont respectivement associées sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous. The mROC method generates a linear function that combines the different biomarkers (BMQ) [Z = a (BMQi) + b (BMQ 2 ) + ...], as well as the reference value (threshold maximizing the Youden index, δ ) which gives the best performance to this linear function. The linear functions thus generated and the reference values which are respectively associated with them are indicated in Table 2 below.
Dans cet exemple, tout comme dans les autres exemples et partout ailleurs dans le texte de la demande, l'exposant t indiqué dans le libellé des fonctions « Z = » indique que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur mesurée selon In this example, as in the other examples and elsewhere in the text of the request, the exponent t indicated in the function label "Z =" indicates that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the measured value for the biomarker (BMQ), in order to normalize this measured value according to
t λ  t λ
la formule suivante : BMQ = (BMQ - 1) / λ. Les valeurs de ces paramètres λ sont indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous. the following formula: BMQ = (BMQ - 1) / λ. The values of these parameters λ are shown in Table 2 below.
Tableau 2 : Table 2:
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Dans le Tableau 2 ci-dessus : In Table 2 above:
HA = concentration sérique en acide hyaluronique, exprimée en ng/mL  HA = serum hyaluronic acid concentration, expressed in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10, exprimée en pg/mL CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10, expressed in pg / mL
Âge = âge du patient à la date du prélèvement Age = age of the patient at the date of collection
IMC = Indice de Masse Corporelle du patient à la date du prélèvement (masse / taille2) CV = Charge Virale du patient à la date du prélèvement, exprimée en 103 copies par mL BMI = Body Mass Index of the patient at the date of collection (mass / height 2 ) CV = Viral load of the patient at the date of sampling, expressed in 10 3 copies per mL
Si l'on applique à un patient donné une fonction Z, alors : If we apply a Z function to a given patient, then:
- ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fïbrose hépatique supérieurs ou égaux à F2, si la valeur de cette fonction Z pour ce patient est supérieure ou égale à la valeur du seuil maximisant l'indice de Youden (δ) qui est associé à cette fonction Z ,  - this patient is assigned to the Metavir class of hepatic fibrosis greater than or equal to F2, if the value of this Z function for this patient is greater than or equal to the value of the threshold maximizing the Youden index (δ) which is associated with this function Z,
- inversement, ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fïbrose hépatique inférieurs à F2, si la valeur de cette fonction Z pour ce patient est inférieure à la valeur du seuil δ.  - inversely, this patient is assigned to the class Metavir liver fibrosis scores lower than F2, if the value of this function Z for this patient is less than the value of the threshold δ.
Par exemple, pour la fonction linéaire qui combine les biomarqueurs HA et CXCL10, sans les combiner à d'autres marqueurs [à savoir, la fonction Z = (0,3686) x CXCL101 + (0,3064) x HA1] : For example, for the linear function that combines HA and CXCL10 biomarkers, without combining them with other markers [ie, the function Z = (0.3686) x CXCL10 1 + (0.3064) x HA 1 ]:
- si la valeur de cette fonction Z pour un patient donné est supérieure ou égale la valeur de seuil de 3,382, ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fïbrose hépatique supérieurs ou égaux à F2,  - if the value of this Z-function for a given patient is greater than or equal to the threshold value of 3,382, that patient is assigned to the Metavir class of hepatic fibrosis greater than or equal to F2,
- inversement, si la valeur de cette fonction Z pour un patient donné est inférieure à la valeur de seuil de 3,382, ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fïbrose hépatique inférieurs à F2.  conversely, if the value of this Z function for a given patient is less than the threshold value of 3.322, this patient is assigned to the Metavir class of hepatic fibrosis less than F2.
Par exemple, pour la fonction linéaire qui combine les biomarqueurs HA et CXCL10 ainsi que les biomarqueurs IMC et Âge [à savoir, la fonction Z = (0,3313) x CXCL101 + (0,25154) x HA1 + (0,0143) x Âge1 - (9,8818) x IMC1] : For example, for the linear function that combines the HA and CXCL10 biomarkers as well as the BMI and Age biomarkers [ie, the function Z = (0.3313) x CXCL10 1 + (0.25154) x HA 1 + (0, 0143) x Age 1 - (9.8818) x BMI 1 ]:
- si la valeur de cette fonction Z pour un patient donné est supérieure ou égale la valeur de seuil de -6,263, ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fïbrose hépatique supérieurs ou égaux à F2, - inversement, si la valeur de cette fonction Z pour un patient donné est inférieure à la valeur de seuil de -6,263, ce patient est affecté dans la classe des scores Metavir de fibrose hépatique inférieurs à F2. L'application de ces modèles de classification à la population de 118 patients afin de discriminer les patients présentant une fibrose significative (score Metavir de fibrose hépatique≥ F2) de ceux présentant une fibrose non significative (score Metavir de fibrose hépatique < F2) a conduit aux résultats de sensibilité (Se), spécificité (Spé), valeur prédictive positive (VPP), valeur prédictive négative (VPN), taux de bonne classification (pourcentage de patients bien classés) et d'aire sous le courbe ROC (AUC), qui sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. - if the value of this Z-function for a given patient is greater than or equal to the threshold value of -6.263, that patient is assigned to the Metavir class of liver fibrosis greater than or equal to F2, - Conversely, if the value of this Z function for a given patient is less than the threshold value of -6.263, this patient is assigned to the Metavir liver fibrosis score class less than F2. The application of these classification models to the population of 118 patients in order to discriminate patients with significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis≥ F2) from those with non-significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis <F2) led sensitivity (Se), specificity (Spé), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), good classification rate (percentage of well-graded patients) and area under the ROC curve (AUC), which are shown in Table 3 below.
Tableau 3 Table 3
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Certaines performances se trouvent être améliorées par la combinaison des biomarqueurs HA et CXCL10, par rapport à ces mêmes biomarqueurs utilisés individuellement. Some performances are improved by the combination of HA and CXCL10 biomarkers, compared to these same biomarkers used individually.
C'est notamment le cas de la valeur d'AUC, qui, pour la combinaison des biomarqueurs HA+CXCL10, est supérieure à 0,7, alors qu'elle est inférieure à 0,7 pour chacun des biomarqueurs utilisés individuellement : AUC de 0,704 pour la combinaison HA+CXCL10 sans autre marqueur [AUC de 0,729 pour HA+CXCL10+IMC+Âge, et AUC de 0,731 pour HA+CXCL10+IMC+Âge+CV], versus This is particularly the case of the value of AUC, which, for the combination of HA + CXCL10 biomarkers, is greater than 0.7, whereas it is less than 0.7 for each of the biomarkers used individually: AUC of 0.704 for HA + CXCL10 combination without other marker [AUC of 0.729 for HA + CXCL10 + IMC + Age, and AUC of 0.731 for HA + CXCL10 + IMC + Age + CV], versus
AUC de 0,583 pour CXCLIO utilisé individuellement et de 0,681 pour HA utilisé individuellement,  AUC of 0.583 for CXCLIO used individually and 0.681 for HA used individually,
C'est également le cas des performances de sensibilité : This is also the case with sensitivity performance:
sensibilité de 78% pour la combinaison HA+CXCL10 sans autre marqueur [sensibilité de 76% pour la combinaison HA+CXCL10+IMC+Âge ou HA+CXCL10+IMC+Âge+CV], versus  sensitivity of 78% for HA + CXCL10 combination without other marker [76% sensitivity for combination HA + CXCL10 + IMC + Age or HA + CXCL10 + BMI + Age + CV] versus
sensibilité de 73%> pour CXCLIO utilisé individuellement et 62%> pour HA utilisé individuellement.  sensitivity of 73%> for CXCLIO used individually and 62%> for HA used individually.
C'est également le cas des performances de VPN : This is also true of VPN performance:
VPN de 81% pour la combinaison HA+CXCL10 sans autre marqueur [sensibilité de 82% ou 83% pour la combinaison HA+CXCL10+IMC+Âge ou HA+CXCL10+IMC+Âge+CV], versus  VPN of 81% for HA + CXCL10 combination without other marker [82% or 83% sensitivity for combination HA + CXCL10 + IMC + Age or HA + CXCL10 + IMC + Age + CV] versus
VPN de 77% pour CXCLIO utilisé individuellement et 76% pour HA utilisé individuellement.  VPN of 77% for CXCLIO used individually and 76% for HA used individually.
On constate ainsi que la combinaison des deux biomarqueurs HA et CXCLIO crée un effet synergique, allant au-delà de la simple addition des performances individuelles de ces biomarqueurs. It can be seen that the combination of the two biomarkers HA and CXCLIO creates a synergistic effect, going beyond the simple addition of the individual performances of these biomarkers.
Cet effet synergique est inattendu, car la concentration de HA et l'expression de CXCLIO évoluent toutes deux dans le même sens. En effet, HA induit l'expression de CXCLIO. Ainsi, si la concentration de HA augmente, l'expression de CXCLIO augmente également. Or, il n'était pas attendu que la combinaison de deux biomarqueurs, qui évoluent ensemble et dans le même sens, puisse apporter une information supplémentaire par rapport à celle que chacun apporte individuellement.  This synergistic effect is unexpected because the concentration of HA and the expression of CXCLIO both evolve in the same direction. Indeed, HA induces the expression of CXCLIO. Thus, if the concentration of HA increases, the expression of CXCL10 also increases. However, it was not expected that the combination of two biomarkers, which evolve together and in the same direction, could provide additional information compared to that which each brings individually.
La combinaison de HA à CXCLIO, optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s)), a présenté d'excellentes performances pour déterminer le stade de fïbrose hépatique. EXEMPLE 2 : comparaison avec des tests non invasifs publiquement disponibles (même population de patients que l'exemple 1) Les 118 patients de l'exemple 1 ont été testés à titre comparatif avec des tests de mesure du stade de fïbrose hépatique qui sont par ailleurs publiquement disponibles (tests disponibles dans le commerce, ou décrits dans des articles scientifiques). The combination of HA with CXCL10, optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomic (s) and / or virologic marker (s)), provided excellent performance in determining hepatic fibrosis stage. EXAMPLE 2 Comparison with Publicly Available Noninvasive Tests (Same Patient Population as Example 1) The 118 patients in Example 1 were tested for comparison with liver fibrosis assay tests that were otherwise performed. publicly available (commercially available tests, or described in scientific articles).
Cinq tests ont été mis en œuvre : le test HEPASCORE™, le test FIBROTEST™, le test APRI, le test FORNS et le test SHASTA. Five tests were implemented: the HEPASCORE ™ test, the FIBROTEST ™ test, the APRI test, the FORNS test and the SHASTA test.
Le test HEPASCORE™ est commercialisé par QUEST DIAGNOSTICS (3 Giralda Farms, Madison, NJ 07940, U.S.A.) , et est décrit dans Adams et al. 2005. The HEPASCORE ™ test is commercially available from QUEST DIAGNOSTICS (3 Giralda Farms, Madison, NJ 07940, U.S.A.), and is described in Adams et al. 2005.
Le test FIBROTEST™ est commercialisé par BIOPREDICTIVE (40, rue du Bac, 75007 Paris, France), et est décrit dans Imbert-Bismut et al. 2001.  The FIBROTEST ™ test is marketed by BIOPREDICTIVE (40, rue du Bac, 75007 Paris, France), and is described in Imbert-Bismut et al. 2001.
Le test APRI est décrit dans Wai et al. 2003. The APRI test is described in Wai et al. 2003.
Le test FORNS est décrit dans Forns et al. 2002. The FORNS test is described in Forns et al. 2002.
Le test SHASTA est décrit dans Kelleher et al. 2005.  The SHASTA test is described in Kelleher et al. 2005.
Celui de ces tests qui est actuellement le plus utilisé est le test FIBROTEST™.  The one of these tests that is currently the most used is the FIBROTEST ™ test.
Chacun de ces tests a été mis en œuvre conformément aux instructions du fabricant, ou, le cas échéant, conformément aux instructions des auteurs de l'article scientifique.  Each of these tests has been carried out in accordance with the manufacturer's instructions or, where appropriate, in accordance with the instructions of the authors of the scientific article.
Les paramètres de ces cinq tests sont rapportés dans le Tableau 4 ci-dessous. The parameters of these five tests are reported in Table 4 below.
A2M = concentration en alpha 2 macro globuline  A2M = concentration of alpha 2 macro globulin
GGT = concentration en gamma glutamyl transpeptidase  GGT = concentration of gamma glutamyl transpeptidase
APOA1 = concentration en apo lipoprotéine Al  APOA1 = concentration of apo lipoprotein Al
Hapto = concentration en haptoglobine  Hapto = haptoglobin concentration
Bilirubine = concentration en bilirubine totale Bilirubin = total bilirubin concentration
ASAT = concentration en aspartate aminotransférase  ASAT = concentration of aspartate aminotransferase
Plaquettes = concentration en plaquettes  Platelets = platelet concentration
Cholestérol = concentration en cholestérol total  Cholesterol = total cholesterol concentration
Albumine = concentration en albumine  Albumin = albumin concentration
AST = concentration en aspartate aminotransférase AST = concentration of aspartate aminotransferase
HA = concentration en acide hyaluronique  HA = concentration of hyaluronic acid
Âge = âge à la date du prélèvement  Age = age at the date of collection
Sexe = sexe du patient (féminin ou masculin) Tableau 4 : Sex = sex of the patient (female or male) Table 4:
Nom du test FIBROTEST™ HEPASCORE™ APRI FORNS SHASTA Test Name FIBROTEST ™ HEPASCORE ™ APRI FORNS SHASTA
Nombre de 7 6 2 4 3 Number of 7 6 2 4 3
biomarqueurs dont 5 dont 4 dont 3  biomarkers including 5 including 4 of which 3
impliqués dans le biomarqueurs biomarqueurs biomarqueurs  involved in biomarkers biomarkers biomarkers
test biochimiques biochimiques biochimiques  biochemical biochemical biochemical tests
nécessitant dosage nécessitant nécessitant  requiring dosage requiring requiring
dosage dosage  dosing dosage
Biomarqueurs A2M A2M ASAT GGT Albumine biochimiques GGT GGT Plaquettes Plaquettes AST  Biomarkers A2M A2M ASAT GGT Biochemical Albumin GGT GGT Pads AST Pads
APOA1 Bilirubine Cholestérol HA  APOA1 Bilirubin Cholesterol HA
Hapto HA  Hapto HA
Bilirubine  bilirubin
Biomarqueurs Age Age - Age - cliniques Sexe Sexe Biomarkers Age Age - Age - clinics Gender Sex
Seuils de 0,48 : > F2 > 0,5 : > F2 > 1,5 : > F2 > 6,9 : > F2 Seuil 1 Seuil 2 référence 0,28 : < F2 < 0,5 : < F2 < 0,5 : < F2 < 4,21 : < F2 > 0,8 : > F2 > 0,3 : > F2 préconisés par le < 0,8 : < F2 < 0,3 : < F2 test entre 0,28 et 0,47 : entre 0,5 et 1,5 : entre 4,21 et  Thresholds of 0.48:> F2> 0.5:> F2> 1.5:> F2> 6.9:> F2 Threshold 1 Threshold 2 reference 0.28: <F2 <0.5: <F2 <0, 5: <F2 <4.21: <F2> 0.8:> F2> 0.3:> F2 recommended by the <0.8: <F2 <0.3: <F2 test between 0.28 and 0, 47: between 0.5 and 1.5: between 4.21 and
sujets sujets 6,9 : sujets  subjects subjects 6,9: subjects
indéterminés ne indéterminés ne indéterminés  indeterminate indeterminate indeterminate
pouvant être pouvant être ne pouvant être  may be able to be unable to be
classés classés classés classified graded
Ces cinq tests non invasifs ont été appliqués à la population de 118 patients de l'exemple 1, afin de discriminer les patients présentant une fibrose significative (score Metavir de fîbrose hépatique > F2), de ceux présentant une fibrose non significative (score Metavir de fîbrose hépatique < F2). These five non-invasive tests were applied to the population of 118 patients of Example 1, in order to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis> F2), and those with non-significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis <F2).
Les résultats de sensibilité (Se), spécificité (Spé), valeur prédictive positive (VPP), valeur prédictive négative (VPN), taux de bonne classification et d'aire sous la courbe ROC (AUC) qui ont été obtenus, sont reportés dans le tableau 5 ci-dessous.  The results of sensitivity (Se), specificity (Spe), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), good classification rate and area under the ROC curve (AUC) that have been obtained, are reported in Table 5 below.
Le Tableau 5 ci-dessous présente en outre une comparaison de ces résultats avec ceux obtenus avec la combinaison des bio marqueurs HA+CXCL10 (combinaisons HA+CXCL10 de l'exemple 2 ci-dessus) pour la même population de patients.  Table 5 below furthermore compares these results with those obtained with the combination of the HA + CXCL10 bio markers (HA + CXCL10 combinations of Example 2 above) for the same patient population.
Tableau 5 Table 5
Figure imgf000098_0001
(*) : taux calculé sur les patients ayant pu être classés
Figure imgf000098_0001
(*): calculated rate on the patients who could be classified
($) : taux calculé sur la population totale (n = 118) ($): calculated rate on total population (n = 118)
La combinaison de HA à CXCLIO permet d'atteindre des performances diagnostiques au moins comparables, voire supérieures, aux tests qui sont actuellement publiquement disponibles, notamment en termes de taux global de bonne classification, de taux de bonne classification, de sensibilité et de VPN. The combination of HA to CXCLIO makes it possible to achieve diagnostic performance that is at least comparable to, or even greater than, the tests that are currently publicly available, in particular in terms of the overall rate of good classification, good classification rate, sensitivity and VPN.
Plus particulièrement, on observe que les performances atteintes par la combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) sont très nettement supérieures à celles des tests SHASTA, APRI et FORNS. More particularly, it is observed that the performances achieved by the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s) )) are much higher than those of the SHASTA, APRI and FORNS tests.
Par rapport au test FIBROTEST™, la combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) présente notamment : Compared to the FIBROTEST ™ test, the combination of HA to CXCLIO (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) presents especially :
- l'avantage de permettre une classification de tous les patients, alors qu'avec le test FIBROSTEST™, 22% des patients ne reçoivent pas de score de fibrose, et en outre - the advantage of allowing a classification of all patients, whereas with the FIBROSTEST ™ test, 22% of patients do not receive a fibrosis score, and
- l'avantage de ne requérir le dosage que de deux bio marqueurs (HA et CXCLIO), alors que pour le test FIBROTEST™, cinq biomarqueurs doivent être dosés (A2M, GGT,- the advantage of only requiring the assay of two bio-markers (HA and CXCLIO), whereas for the FIBROTEST ™ test, five biomarkers must be assayed (A2M, GGT,
APOA1, Hapto et Bilirubine). APOA1, Hapto and Bilirubin).
Par rapport au test HEPASCORE™, la combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) présente notamment l'avantage de ne requérir le dosage que de deux biomarqueurs (HA et CXCLIO), alors que pour le test HEPASCORE™, quatre biomarqueurs doivent être dosés (A2M, GGT, Bilirubine et HA). On observe également que la combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) présente une performance de sensibilité améliorée par rapport au test HEPASCORE™. La combinaison de HA à CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) a donc des performances diagnostiques au moins aussi satisfaisantes que celles des deux tests qui sont actuellement les plus utilisés, à savoir HEPASCORE™ et FIBROTEST™, tout en étant beaucoup plus simple (et donc plus rapide, moins coûteuse, et plus sûre) à mettre en œuvre. Compared to the HEPASCORE ™ test, the combination of HA to CXCLIO (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s))) presents in particular, the advantage of requiring the assay of only two biomarkers (HA and CXCL10), whereas for the HEPASCORE ™ assay, four biomarkers must be assayed (A2M, GGT, Bilirubin and HA). It is also observed that the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) presents a performance of improved sensitivity compared to the HEPASCORE ™ test. The combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s))) therefore has diagnostic performance at least as satisfactory than those of the two tests that are currently the most used, namely HEPASCORE ™ and FIBROTEST ™, while being much simpler (and therefore faster, less expensive, and safer) to implement.
EXEMPLE 3 : établissement et application de combinaisons HA+CXCL10 à une population de patients indépendante de celle de l'exemple 1 EXAMPLE 3 Establishment and Application of HA + CXCL10 Combinations to a Patient Population Independent of Example 1
Une population de patients indépendante de celle de l'exemple 1 a été constituée. Cette population indépendante était formée de 310 patients de l'Hôpital Haut-Lévêque (1, avenue Magellan ; 33600 Pessac ; France) présentant une hépatite chronique suite à une infection par le virus de l'Hépatite C (VHC), et couvrant tous, ou la plupart des génotypes de VHC. A population of patients independent of that of Example 1 was constituted. This independent population consisted of 310 patients from Hôpital Haut-Lévêque (1 Magellan Avenue, 33600 Pessac, France) with chronic hepatitis following infection with the Hepatitis C virus (HCV), and all of whom or most HCV genotypes.
Les études réalisées ont été approuvées par le Comité Éthique local, conformément à la Déclaration d'Helsinki. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé par écrit.  The studies carried out have been approved by the Local Ethics Committee in accordance with the Declaration of Helsinki. All patients gave their informed consent in writing.
La Ponction Biopsie Hépatique (PBH) n'étant quasiment plus utilisée à l'heure actuelle, le stade de fibrose a été déterminé en utilisant une combinaison de tests non invasifs basés sur des principes différents (tests sanguins et imagerie), tel que recommandé par la communauté scientifique (cf. Castera 2012). Since Hepatic Biopsy Puncture (HBC) is almost no longer used at this time, the fibrosis stage was determined using a combination of non-invasive tests based on different principles (blood tests and imaging), as recommended by the scientific community (see Castera 2012).
Pour ce faire, une modification de l'algorithme de classification multivariée de Castera et al. a été mise au point.  To do this, a modification of the multivariate classification algorithm of Castera et al. has been developed.
L'algorithme de classification multivariée de Castera et al. est celui décrit dans Castera et al. 2010 et Castera et al. 2014. Il est basé sur la concordance entre les résultats du FIBROTEST™ (test sanguin) et du FIBROSCAN™ (imagerie). The multivariate classification algorithm of Castera et al. is that described in Castera et al. 2010 and Castera et al. 2014. It is based on the agreement between the results of FIBROTEST ™ (blood test) and FIBROSCAN ™ (imaging).
Cet algorithme permet la classification des patients en deux classes (absence ou présence d'une fibrose significative) lorsque les tests non invasifs FIBROTEST™ et FIBROSCAN™ sont concordants.  This algorithm allows the classification of patients into two classes (absence or presence of significant fibrosis) when the noninvasive FIBROTEST ™ and FIBROSCAN ™ tests are concordant.
Lorsque les résultats des tests FIBROTEST™ et FIBROSCAN™ sont discordants, l'algorithme de Castera et al. recommande de pratiquer une BPH. Pour déterminer le stade de fibrose, sans disposer et sans mettre en œuvre une PBH, l'algorithme de Castera et al. a été modifié par ajout d'un deuxième niveau d'analyse. Ce deuxième niveau d'analyse est destiné aux échantillons qui donnent lieu à des résultats discordants par les tests FIBROTEST™ et FIBROSCAN™. Ce deuxième niveau d'analyse met en œuvre plusieurs tests non invasifs, en l'occurrence FIBROTEST™ (FT), FIBROSCAN™ (FS), HEPASCORE™ (HS), APRI et FORNS. When the results of the FIBROTEST ™ and FIBROSCAN ™ tests are discordant, the algorithm of Castera et al. recommend to practice a BPH. To determine the stage of fibrosis, without having and without implementing a PBH, the algorithm of Castera et al. has been modified by adding a second level of analysis. This second level of analysis is for samples that give rise to discordant results by the FIBROTEST ™ and FIBROSCAN ™ tests. This second level of analysis implements several non-invasive tests, namely FIBROTEST ™ (FT), FIBROSCAN ™ (FS), HEPASCORE ™ (HS), APRI and FORNS.
Les tests FIBROTEST™, HEPASCORE™, APRI et FORNS ont été décrits à l'exemple 2 ci-dessus.  The FIBROTEST ™, HEPASCORE ™, APRI and FORNS tests were described in Example 2 above.
Le test FIBROSCAN™ est une technique d'imagerie mettant en œuvre l'élastographie impulsionnelle, qui permet de déterminer la dureté du foie (exprimée en kPa équivalent de fibrose) ; cf. Castera et al. 2005. Le dispositif FIBROSCAN™ est commercialisé par la société ECHOSENS (30 place d'Italie, 75013 Paris, France). The FIBROSCAN ™ test is an imaging technique that uses pulse elastography to determine the hardness of the liver (expressed in kPa equivalent of fibrosis); cf. Castera et al. 2005. The FIBROSCAN ™ device is marketed by ECHOSENS (30 place d'Italie, 75013 Paris, France).
Lors du deuxième niveau d'analyse, au moins trois de ces tests (au moins trois parmi FIBROTEST™ (FT), FIBROSCAN™ (FS), HEPASCORE™ (HS), APRI et FORNS) sont appliqués aux échantillons qui ont donné des résultats discordants à l'issue du premier niveau d'analyse. Le stade de fibrose obtenu avec chacun de ces tests a ainsi été déterminé. Le stade majoritairement identifié par l'ensemble de ces tests a été alloué à l'échantillon analysé. A défaut de majorité, l'algorithme modifié prévoit d'allouer à l'échantillon l'étiquette « stade de fibrose non déterminé ».  At the second level of analysis, at least three of these tests (at least three of FIBROTEST ™ (FT), FIBROSCAN ™ (FS), HEPASCORE ™ (HS), APRI and FORNS) are applied to the samples that gave results. discordant at the end of the first level of analysis. The fibrosis stage obtained with each of these tests was thus determined. The stage mostly identified by all these tests was allocated to the sample analyzed. In the absence of a majority, the modified algorithm plans to allocate to the sample the label "stage of non determined fibrosis".
L'algorithme (ou le modèle) de classification ainsi modifié est présenté en Figure 3. The classification algorithm (or model) thus modified is presented in Figure 3.
Il permet de classer les patients selon leur stade de fibrose en deux classes : fibrose significative (score Metavir de fibrose hépatique > F2) et fibrose non significative (score Metavir de fibrose hépatique < F2), et cela sans recourir à une PBH. It classifies patients according to their stage of fibrosis in two classes: significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis> F2) and non-significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis <F2), without using a PBH.
L'application de cet algorithme modifié à la population de 310 patients formée a permis d'identifier 141 patients présentant une fibrose non significative (score Metavir de fibrose hépatique < F2) et 169 patients présentant une fibrose significative (score Metavir de fibrose hépatique > F2). The application of this modified algorithm to the 310 patient population resulted in the identification of 141 patients with non-significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis <F2) and 169 patients with significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis> F2 ).
Les caractéristiques des 310 patients sont présentées dans le Tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 : The characteristics of the 310 patients are shown in Table 6 below. Table 6:
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Figure imgf000102_0001
SD = déviation standard ; UI = unité internationale SD = standard deviation; IU = international unit
Pour chacun des 310 patients de la population, les concentrations sériques en HA et CXCL10 ont été mesurées comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus. La distribution de ces concentrations selon le degré de fibrose hépatique (score Metavir < F2 ou > F2) est présentée en Figure 4 (CXCL10) et en Figure 5 (HA). For each of the 310 patients in the population, serum concentrations of HA and CXCL10 were measured as described in Example 1 above. The distribution of these concentrations according to the degree of liver fibrosis (Metavir score <F2 or> F2) is presented in Figure 4 (CXCL10) and Figure 5 (HA).
Les valeurs de concentrations sériques en CXCL10 et HA ont été combinées selon la méthode mROC afin d'établir une règle décisionnelle permettant de discriminer les patients présentant une fibrose significative (score Metavir≥ F2), de ceux présentant une fibrose non significative (score Metavir < F2). Serum CXCL10 and HA concentrations were combined according to the mROC method to establish a decision rule that discriminates between patients with significant fibrosis (Metavir≥ F2 score) and those with non-significant fibrosis (Metavir score < F2).
Les valeurs de concentrations sériques en CXCL10 et HA ont également été combinées selon la méthode mROC à des paramètres cliniques, tels que l'indice de masse corporelle à la date du prélèvement (IMC), et la charge virale du patient à la date du prélèvement (CV), afin d'établir une règle décisionnelle permettant de discriminer les patients présentant une fibrose significative (score Metavir≥ F2), de ceux présentant une fibrose non significative (score Metavir < F2).  The serum CXCL10 and HA concentration values were also combined according to the mROC method with clinical parameters, such as body mass index at the time of collection (BMI), and the patient's viral load at the time of collection. (CV), in order to establish a decision rule allowing to discriminate the patients presenting a significant fibrosis (score Metavir≥ F2), of those presenting a non significant fibrosis (score Metavir <F2).
Pour une description de la méthode mROC, cf. notamment l'exemple 1 ci-dessus.  For a description of the mROC method, cf. especially example 1 above.
La fonction linéaire ainsi générée par la méthode mROC, ainsi que la valeur de référence qui confère les meilleures performances à cette fonction linéaire (seuil maximisant l'indice de Youden, δ), sont indiquées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les valeurs des paramètres λ The linear function thus generated by the mROC method, as well as the reference value that gives the best performance to this linear function (threshold maximizing the Youden index, δ), are indicated in Table 7 below. The values of the parameters λ
t λ  t λ
de la transformée Box-Cox [BMQ = (BMQ - 1) / λ] sont également indiquées dans le Tableau 7 ci-dessous. of the Box-Cox transform [BMQ = (BMQ - 1) / λ] are also shown in Table 7 below.
Tableau 7 : Table 7:
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Dans le Tableau 7 ci-dessus : In Table 7 above:
HA = concentration sérique en acide hyaluronique, exprimée en ng/mL  HA = serum hyaluronic acid concentration, expressed in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10, exprimée en pg/mL CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10, expressed in pg / mL
Âge = âge du patient à la date du prélèvement Age = age of the patient at the date of collection
IMC = Indice de Masse Corporelle à la date du prélèvement (masse / taille2) BMI = Body Mass Index at the date of collection (mass / size 2 )
CV = Charge Virale du patient à la date du prélèvement, en UI/mL CV = Viral load of the patient at the date of sampling, in IU / mL
L'exposant t indiqué dans le libellé des fonctions « Z = » indique que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur mesurée selon la formule suivante : BMQ1 = (BMQX - 1) / λ. The exponent t indicated in the "Z =" function label indicates that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the measured value for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value measured according to the following formula: BMQ 1 = (BMQ X - 1) / λ.
Pour l'application d'une fonction Z à un patient donné et la comparaison de la valeur de Z ainsi obtenue au seuil maximisant l'indice de Youden, cf. exemple 1 ci-dessus. L'application de chacun de ces modèles de classification à la population de 310 patients afin de discriminer les patients présentant une fîbrose significative (score Metavir > F2), de ceux présentant une fîbrose non significative (score Metavir < F2) a conduit aux résultats de sensibilité (Se), spécificité (Spé), valeur prédictive positive (VPP), valeur prédictive négative (VPN), taux de bonne classification et d'aire sous la courbe ROC (AUC), qui sont présentés dans le Tableau 8 ci-dessous. For the application of a Z function to a given patient and the comparison of the value of Z thus obtained to the threshold maximizing the Youden index, cf. Example 1 above. The application of each of these classification models to the population of 310 patients in order to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score> F2) and those with non-significant fibrosis (Metavir score <F2) led to the results of sensitivity (Se), specificity (Spe), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), good classification and area under the ROC (AUC), which are presented in Table 8 below .
Tableau 8 Table 8
Taux de Rate
Taux de  Rate
patients  patients
Biomarqueurs Se Spé VPP VPN bonne AUC non  Biomarkers Spe VPP VPN good AUC no
classification  classification
classés  classified
HA 0% 76% 79% 82% 74% 78% 0,840 HA 0% 76% 79% 82% 74% 78% 0.840
CXCL10 0% 72% 76% 78% 69% 74% 0,810CXCL10 0% 72% 76% 78% 69% 74% 0.810
HA + CXCL10 0% 78% 90% 90% 77% 83% 0,898 HA + CXCL10 0% 78% 90% 90% 77% 83% 0.898
HA + CXCL10 + HA + CXCL10 +
0% 80% 87% 88% 78% 83% 0,899 IMC + Âge + CV La combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combiné à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) permet d'obtenir d'excellents résultats de classification (taux de patients non classés, sensibilité, spécificité, VPP et VPN), et cela avec seulement deux biomarqueurs et sans PBH. 0% 80% 87% 88% 78% 83% 0.899 BMI + Age + CV The combination of HA with CXCLIO (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) provides excellent results. classification (unclassified patient rate, sensitivity, specificity, PPV and NPV), with only two biomarkers and no PBH.
Plus particulièrement, on observe que les performances de Se, Spé, VPP, VPN, taux de bonne classification et AUC de la combinaison HA+CXCLIO (optionnellement combiné à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) sont supérieures aux performances du marqueur HA seul, ainsi qu'à celles du marqueur CXCLIO seul. More particularly, it is observed that the performances of Se, Spe, VPP, VPN, good classification rate and AUC of the combination HA + CXCLIO (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomic marker (s)) ( s) and / or virological marker (s))) are superior to the performances of the HA marker alone, as well as those of the CXCL10 marker alone.
Les performances de la combinaison HA+CXCLIO (optionnellement combiné à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) vont donc au-delà de la simple juxtaposition des performances individuelles de chacun des deux marqueurs de la combinaison.  The performances of the HA + CXCLIO combination (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) therefore go beyond the simple juxtaposition of the individual performances of each of the two markers of the combination.
On constate ainsi que la combinaison de HA à CXCLIO (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs cliniques, anatomiques, virologiques) crée un effet synergique inattendu, allant au-delà de la simple addition des performances individuelles des biomarqueurs HA et CXCLIO (synergie démontrée sur une population de 310 patients).  It can be seen that the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more clinical, anatomical, virological markers) creates an unexpected synergistic effect, going beyond the simple addition of the individual performances of the HA and CXCLIO biomarkers (synergy demonstrated on a population of 310 patients).
Pour plus avant démontrer que les performances de la combinaison de HA à CXCLIO vont au-delà de ce qui serait attendu de la simple addition de leurs performances respectives, un test qui ne combine pas HA à CXCLIO, mais qui se contente de les juxtaposer, a été réalisé sur la population de 310 patients de l'exemple. To further demonstrate that the performance of the combination of HA to CXCLIO goes beyond what would be expected from the simple addition of their respective performances, a test that does not combine HA CXCLIO, but which is content to juxtapose them, was performed on the population of 310 patients in the example.
Ce test de juxtaposition repose sur le fait que la simple addition des performances respectives des biomarqueurs HA et CXCLIO correspond à l'addition de l'information apportée par HA à celle apportée par CXCLIO : selon ce test de juxtaposition, le test est positif (score de fîbrose supérieur ou égal à F2) lorsqu'au moins un des deux biomarqueurs indique que le test est positif (score de fîbrose supérieur ou égal à F2). This juxtaposition test is based on the fact that the simple addition of the respective performances of the HA and CXCLIO biomarkers corresponds to the addition of the information provided by HA to that provided by CXCLIO: according to this juxtaposition test, the test is positive (score greater than or equal to F2) when at least one of the two biomarkers indicates that the test is positive (fibrosis score greater than or equal to F2).
La classification obtenue avec le test de juxtaposition est alors la suivante : The classification obtained with the juxtaposition test is then the following:
Tableau 9 : Score de fïbrose donné par Score de fïbrose donné par Score de fïbrose donné par le test HA seul le test CXCLlO seul le test qui juxtapose HA à {cf. exemple 3) {cf. exemple 3) CXCL10 Table 9: Fibrosis score given by fibrosis score given by fibrosis score given by HA test only CXCL10 test only the test which juxtaposes HA to (cf. example 3) {cf. example 3) CXCL10
>F2 >F2 >F2 > F2> F2> F2
>F2 <F2 >F2> F2 <F2> F2
<F2 >F2 >F2<F2> F2> F2
<F2 <F2 <F2 <F2 <F2 <F2
Les performances de cet test de juxtaposition appliqué à la population de 310 patients de l'exemple 3 sont les suivantes : Taux de patients non classés = 0% ; sensibilité (Se) = 90% ; spécificité (Spé) = 57% ; Valeur de Prédiction Positive (VPP) = 72% ; Valeur de Prédiction Négative (VPN) = 83%> ; taux de bonne classification = 75%>. The performance of this juxtaposition test applied to the population of 310 patients of Example 3 are as follows: Unclassified patient rate = 0%; sensitivity (Se) = 90%; specificity (Spe) = 57%; Positive Prediction Value (PPV) = 72%; Negative Prediction Value (VPN) = 83%>; good classification rate = 75%>.
La présentation de ces résultats comparés à ceux obtenus pour chacun des deux marqueurs individuellement, et comparés à ceux obtenus avec la combinaison des deux marqueurs est présentée ci-dessous. Tableau 10  The presentation of these results compared to those obtained for each of the two markers individually, and compared with those obtained with the combination of the two markers is presented below. Table 10
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Figure imgf000107_0001
NA = non applicable Par rapport à chaque marqueur pris individuellement : NA = not applicable With respect to each marker taken individually:
- la juxtaposition de HA à CXCLIO permet d'augmenter fortement la sensibilité et la VPN par rapport à chaque marqueur pris séparément ;  the juxtaposition of HA to CXCL10 makes it possible to increase the sensitivity and the VPN with respect to each marker taken separately;
- par contre, la spécificité et la VPP sont diminuées, ce qui conduit à un taux de bonne classification de 75% (situé entre le taux obtenu pour HA seul et pour CXCLIO seul).  - On the other hand, the specificity and the VPP are reduced, which leads to a good classification rate of 75% (located between the rate obtained for HA alone and for CXCLIO alone).
En revanche, lorsque l'on combine HA à CXCLIO, on obtient non pas une diminution de la spécificité et de la VPP, mais une très forte augmentation (90%> versus 57% pour Spé et 90% versus 72% pour VPP).  On the other hand, when HA is combined with CXCLIO, we do not obtain a decrease in specificity and PPV, but a very strong increase (90%> versus 57% for Spé and 90% versus 72% for VPP).
Cet effet synergique ne pouvait être attendu ni au vu des performances de spécificité et de VPP obtenues avec la juxtaposition des deux marqueurs, ni au vu de celles obtenues avec chacun des deux biomarqueurs pris individuellement. This synergistic effect could not be expected either in view of the specificity and VPP performances obtained with the juxtaposition of the two markers, nor in view of those obtained with each of the two biomarkers taken individually.
En outre, le taux de bonne classification, qui permet d'évaluer globalement les performances des biomarqueurs, est très nettement supérieur avec la combinaison des deux biomarqueurs (83%) par rapport à leur juxtaposition (75%). In addition, the rate of good classification, which makes it possible to evaluate overall the performance of biomarkers, is very much higher with the combination of the two biomarkers (83%) compared to their juxtaposition (75%).
Un effet synergique a par ailleurs également été observé en exemple 1 ci-dessus (population de 118 patients). A synergistic effect has also been observed in example 1 above (population of 118 patients).
Cet effet synergique n'est donc pas lié à la règle décisionnelle utilisée, mais bien de manière plus générale, à la combinaison HA+CXCL10. This synergistic effect is thus not related to the decision rule used, but more generally to the HA + CXCL10 combination.
Pour illustrer l'effet synergique de la combinaison HA+CXCL10 par rapport à HA seul ou CXCLIO seul, la méthode de ré-échantillonnage connue sous le nom de Boots trap (cf. Efron 1979) a été mise en œuvre de sorte à évaluer le gain apporté par la combinaison HA+CXCL10. To illustrate the synergistic effect of the combination HA + CXCL10 with respect to HA alone or CXCLIO alone, the resampling method known as Boots trap (see Efron 1979) was implemented in order to evaluate the gain brought by the combination HA + CXCL10.
À partir de la population de 310 patients, 1000 sous-populations de même taille ont été tirées aléatoirement (tirage avec remise, de sorte qu'un même patient peut être présent plusieurs fois au sein d'une même sous-population). From the population of 310 patients, 1000 subpopulations of the same size were randomly drawn (remission, so that the same patient may be present several times within the same subpopulation).
Les valeurs d'AUC et de Taux de bonne classification ont été mesurées sur chacune de ces 1000 sous-populations: - d'une part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients ceux initialement établis sur la population de 310 patients (« coefficients fixes » ou « coef fix »), et The AUC and Good Classification Rate values were measured for each of these 1000 subpopulations: - on the one hand, when the decision rule mROC applied has for coefficients those initially established on the population of 310 patients ("fixed coefficients" or "coef fix"), and
- d'autre part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients ceux établis pour chacune des 1000 sous-populations (« coefficients optimisés » ou « coef optim »).  - on the other hand, when the decision rule mROC applied has as coefficients those established for each of the 1000 subpopulations ("optimized coefficients" or "optimum coef").
La valeur d'AUC est la valeur de l'aire sous la courbe ROC.  The value of AUC is the value of the area under the ROC curve.
La valeur du Taux de bonne classification est la valeur du pourcentage de patients bien classés.  The value of the Good Classification Rate is the value of the percentage of well-ranked patients.
Les résultats sont présentés en Figures 13A, 13B, 14A et 14B. The results are shown in Figures 13A, 13B, 14A and 14B.
Les Figures 13A et 13B présentent sous forme d'histogrammes les valeurs des différences d'AUC et de précision qui ont été mesurées entre d'une part la règle décisionnelle mROC à « coefficients fixes » (ou « coef fix ») et d'autre part la règle décisionnelle mROC à « coefficients optimisés » (« coef optim »). Figures 13A and 13B present in the form of histograms the values of the AUC and precision differences which were measured between the "fixed coefficients" (or "coef fix") and the "mcc fixed" decision rule. share the decision rule mROC "optimized coefficients" ("coef optim").
En Figures 13 A et 13B, la règle décisionnelle mROC mettait en œuvre la combinaison HA+CXCL10.  In Figures 13A and 13B, the decision rule mROC implemented the HA + CXCL10 combination.
La Figure 13 A présente l'histogramme des différences d'AUC entre les coefficients fixes et les coefficients optimisés pour la combinaison HA+CXCL10 en Bootstrap (B = 1 000) [axe des abscisses : 0,000 ; 0,005 ; 0,010].  Figure 13A shows the histogram of the AUC differences between the fixed coefficients and the optimized coefficients for the HA + CXCL10 combination in Bootstrap (B = 1000) [abscissa axis: 0.000; 0.005; 0.010].
La Figure 13B présente l'histogramme des différences de taux de bonne classification (pourcentage de patients bien classés) avec les coefficients fixes ou optimisés pour la combinaison HA+CXCL10 en Bootstrap (B = 1 000).  Figure 13B shows the histogram of good classification rate differences (percentage of well-ranked patients) with fixed or optimized coefficients for the HA + CXCL10 combination in Bootstrap (B = 1000).
Comme illustré en Figures 13A et 13B, il a été constaté : As illustrated in FIGS. 13A and 13B, it has been found:
- qu'en terme d'AUC, la moyenne de la différence est de 0,001 (avec un intervalle de confiance à 95% de [-0,002 ; 0,008]) ; et  - in terms of AUC, the average of the difference is 0.001 (with a 95% confidence interval of [-0.002, 0.008]); and
- qu'en terme de taux de bonne classification, la moyenne de la différence est de 1,04 (avec un intervalle de confiance à 95% de [-0,33 ; 3,55]).  - in terms of the good classification rate, the average of the difference is 1.04 (with a 95% confidence interval of [-0.33, 3.55]).
Les Figures 13A et 13B montrent qu'il y a peu d'écart de performances que l'on applique des coefficients fixes ou des coefficients qui sont optimisés pour la population étudiée. Ainsi, les Figures 13 A et 13B démontrent que les performances ne sont pas dues aux coefficients mais aux marqueurs eux-mêmes, puisque quels que soient les coefficients mis en œuvre (coefficients optimisés ou coefficients fixes), les performances obtenues sont comparables. Figures 13A and 13B show that there is little difference in performance when applying fixed coefficients or coefficients that are optimized for the study population. Thus, FIGS. 13A and 13B show that the performances are not due to the coefficients but to the markers themselves, since whatever coefficients are used (optimized coefficients or fixed coefficients), the performances obtained are comparable.
Les Figures 14A et 14B présentent sous forme d'histogrammes les valeurs des différences d'AUC et de taux de bonne classification qui ont été mesurées pour la règle décisionnelle mROC entre d'une part la combinaison HA+CXCL10 et d'autre part le marqueur HA seul. FIGS. 14A and 14B show in the form of histograms the values of the AUC differences and of the good classification rates which have been measured for the decision rule mROC between on the one hand the combination HA + CXCL10 and on the other hand the marker HA alone.
La Figure 14A présente l'histogramme des différences d'AUC entre la combinaison HA+CXCL10 d'une part et le marqueur HA seul d'autre part, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fïx ») [axe des abscisses : 0,02 ; 0,04 ; 0,06 ; 0,08 ; 0 ,10 ; 0,12]. Figure 14A shows the histogram of AUC differences between the HA + CXCL10 combination on the one hand and the HA marker alone on the other hand, in Bootstrap (B = 1000) with fixed coefficients ("coef fx"). [abscissa axis: 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0, 10; 0.12].
La Figure 14B présente l'histogramme des différences de taux de bonne classification (pourcentage de patients bien classés) entre la combinaison HA+CXCL10 d'une part et le marqueur HA seul d'autre part, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fïx »).  Figure 14B presents the histogram of the differences of rates of good classification (percentage of well-ranked patients) between the combination HA + CXCL10 on the one hand and the HA marker alone on the other hand, in Bootstrap (B = 1000) with the fixed coefficients ("coef fix").
Comme illustré en Figures 14A et 14B, il a été constaté : As illustrated in FIGS. 14A and 14B, it has been found:
- qu'en terme d'AUC, le gain de la combinaison HA+CXCL10 par rapport au marqueur HA seul est toujours supérieur à zéro, la moyenne de cette différence étant de that in terms of AUC, the gain of the HA + CXCL10 combination with respect to the HA marker alone is always greater than zero, the average of this difference being
0,06 (avec un intervalle de confiance à 95% de [0,027 ; 0,092]), et 0.06 (with a 95% confidence interval of [0.027, 0.092]), and
- qu'en terme de taux de bonne classification, le gain de la combinaison - in terms of good classification rate, the gain of the combination
HA+CXCL10 par rapport au marqueur HA seul est supérieur à zéro dans 99% des cas, la moyenne de la différence étant de 5,5%> (avec un intervalle de confiance à 95%> de [1,29 ;HA + CXCL10 relative to the HA marker alone is greater than zero in 99% of cases, with the difference average being 5.5%> (with a 95% confidence interval> [1.29;
10]). 10]).
Ces gains viennent confirmer que la combinaison HA+CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs cliniques, anatomiques, virologiques) crée un effet synergique inattendu, allant au-delà de la simple addition des performances individuelles des biomarqueurs HA et CXCL10, et que cet effet synergique est indépendant du modèle de classification utilisé. EXEMPLE 4 : comparaison avec des tests non invasifs publiquement disponibles (même population de patients que l'exemple 3) These gains confirm that the HA + CXCL10 combination (optionally combined with one or more clinical, anatomical, virological markers) creates an unexpected synergistic effect, going beyond the simple addition of the individual performances of the HA and CXCL10 biomarkers, and that this synergistic effect is independent of the classification model used. EXAMPLE 4: Comparison with Publicly Available Noninvasive Tests (Same Patient Population as Example 3)
Les 310 patients de l'exemple 3 ont été testés à titre comparatif avec des tests de mesure du stade de fïbrose hépatique qui sont par ailleurs publiquement disponibles (tests disponibles dans le commerce, ou décrits dans des articles scientifiques). The 310 patients of Example 3 were tested for comparison with liver fibrosis assays that are otherwise publicly available (commercially available tests, or described in scientific articles).
Cinq tests ont été mis en œuvre : le test HEPASCORE™, le test FIBROTEST™, le test APRI, le test FORNS et le test FIBROSCAN™. Five tests were implemented: the HEPASCORE ™ test, the FIBROTEST ™ test, the APRI test, the FORNS test and the FIBROSCAN ™ test.
Le test HEPASCORE™ est commercialisé par QUEST DIAGNOSTICS (3 Giralda Farms, Madison, NJ 07940, U.S.A.), et est décrit dans Adams et al. 2005.  The HEPASCORE ™ test is commercially available from QUEST DIAGNOSTICS (3 Giralda Farms, Madison, NJ 07940, U.S.A.), and is described in Adams et al. 2005.
Le test FIBROTEST™ est commercialisé par BIOPREDICTIVE (40, rue du Bac, 75007 The FIBROTEST ™ test is marketed by BIOPREDICTIVE (40, rue du Bac, 75007
Paris, France), et est décrit dans Imbert-Bismut et al. 2001. Paris, France), and is described in Imbert-Bismut et al. 2001.
Le test APRI est décrit dans Wai et al. 2003.  The APRI test is described in Wai et al. 2003.
Le test FORNS est décrit dans Forns et al. 2002.  The FORNS test is described in Forns et al. 2002.
Le test FIBROSCAN™ est une technique d'imagerie mettant en œuvre l'élastographie impulsionnelle, qui permet de déterminer la dureté du foie (exprimée en kPa équivalent de fïbrose) ; cf. Castera et al. 2005. Le dispositif FIBROSCAN™ est commercialisé par la société ECHOSENS (30 place d'Italie, 75013 Paris, France). The FIBROSCAN ™ test is an imaging technique that uses pulse elastography to determine the hardness of the liver (expressed in kPa fibro equivalent); cf. Castera et al. 2005. The FIBROSCAN ™ device is marketed by ECHOSENS (30 place d'Italie, 75013 Paris, France).
Chacun de ces tests a été mis en œuvre conformément aux instructions du fabricant, ou, le cas échéant, conformément aux instructions des auteurs de l'article scientifique.  Each of these tests has been carried out in accordance with the manufacturer's instructions or, where appropriate, in accordance with the instructions of the authors of the scientific article.
Les paramètres de ces cinq tests sont rapportés dans le Tableau 11 ci-dessous.  The parameters of these five tests are reported in Table 11 below.
A2M = concentration en alpha 2 macro globuline  A2M = concentration of alpha 2 macro globulin
GGT = concentration en gamma glutamyl transpeptidase  GGT = concentration of gamma glutamyl transpeptidase
APOA1 = concentration en apo lipoprotéine Al  APOA1 = concentration of apo lipoprotein Al
Hapto = concentration en haptoglobine Hapto = haptoglobin concentration
Bilirubine = concentration en bilirubine totale  Bilirubin = total bilirubin concentration
ASAT = concentration en aspartate aminotransférase  ASAT = concentration of aspartate aminotransferase
Plaquettes = concentration en plaquettes  Platelets = platelet concentration
Cholestérol = concentration en cholestérol total  Cholesterol = total cholesterol concentration
HA = concentration en acide hyaluronique HA = concentration of hyaluronic acid
Âge = âge à la date du prélèvement  Age = age at the date of collection
Sexe = sexe du patient (féminin ou masculin) Tableau 11 : Sex = sex of the patient (female or male) Table 11:
Nom du test FIBROTEST™ HEPASCORE™ APRI FORNS FIBROSCAN™ Test Name FIBROTEST ™ HEPASCORE ™ APRI FORNS FIBROSCAN ™
Nombre de 7 6 2 4 0 Number of 7 6 2 4 0
biomarqueurs dont 5 dont 4 dont 3 (mesure de l'élastométrie en impliqués dans le biomarqueurs biomarqueurs biomarqueurs kPa)  biomarkers including 5 including 4 including 3 (measurement of elastometry involved in biomarkers biomarker biomarkers kPa)
test biochimiques biochimiques biochimiques  biochemical biochemical biochemical tests
nécessitant dosage nécessitant nécessitant  requiring dosage requiring requiring
dosage dosage  dosing dosage
Biomarqueurs A2M A2M ASAT GGT - biochimiques GGT GGT Plaquettes Plaquettes  Biomarkers A2M A2M ASAT GGT - Biochemical GGT GGT Platelets Platelets
APOA1 Bilirubine Cholestérol  APOA1 Bilirubin Cholesterol
Hapto HA  Hapto HA
Bilirubine  bilirubin
Biomarqueurs Age Age - Age - cliniques Sexe Sexe Biomarkers Age Age - Age - clinics Gender Sex
Seuils de 0,48 : > F2 > 0,5 : > F2 > 1,5 : > F2 > 6,9 : > F2 < 7.1 : < F2 référence 0,28 : < F2 < 0,5 : < F2 < 0,5 : < F2 < 4,21 : < F2 > 7.1 : > F2 préconisés par le > 9.5 : > F3  Thresholds of 0.48:> F2> 0.5:> F2> 1.5:> F2> 6.9:> F2 <7.1: <F2 reference 0.28: <F2 <0.5: <F2 <0 , 5: <F2 <4,21: <F2> 7.1:> F2 recommended by the> 9.5:> F3
test entre 0,28 et 0,47 : entre 0,5 et 1,5 : entre 4,21 et >12.5 : F4  test between 0.28 and 0.47: between 0.5 and 1.5: between 4.21 and> 12.5: F4
sujets sujets 6,9 : sujets  subjects subjects 6,9: subjects
indéterminés ne indéterminés ne indéterminés  indeterminate indeterminate indeterminate
pouvant être pouvant être ne pouvant être  may be able to be unable to be
classés classés classés classified graded
Ces cinq tests non invasifs ont été appliqués à la population de 310 patients de l'exemple 3, afin de discriminer les patients présentant une fibrose significative (score Metavir de fîbrose hépatique > F2), de ceux présentant une fibrose non significative (score Metavir de fîbrose hépatique < F2). These five non-invasive tests were applied to the population of 310 patients of Example 3, in order to discriminate between patients with significant fibrosis (Metavir score of liver fibrosis> F2), and those with non-significant fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis <F2).
Les résultats de sensibilité (Se), spécificité (Spé), valeur prédictive positive (VPP), valeur prédictive négative (VPN), taux de bonne classification et d'aire sous la courbe ROC (AUC), qui ont été obtenus sont reportés dans le Tableau 12 ci-dessous.  The results of sensitivity (Se), specificity (Spe), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), good classification rate and area under the ROC curve (AUC), which have been obtained are reported in Table 12 below.
Le Tableau 12 ci-dessous présente en outre une comparaison de ces résultats avec ceux obtenus avec la combinaison des bio marqueurs HA+CXCL10 (combinaisons HA+CXCL10 de l'exemple 3 ci-dessus) pour la même population de patients.  Table 12 below furthermore compares these results with those obtained with the combination of HA + CXCL10 bio-markers (HA + CXCL10 combinations of Example 3 above) for the same patient population.
Tableau 12 Table 12
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(*) : taux calculé sur les patients ayant pu être classés (*): calculated rate on the patients who could be classified
($) : taux calculé sur la population totale (n = 310) On observe que les performances atteintes par la combinaison de HA à CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) sont très nettement supérieures à celles des tests APRI et FOR S. ($): calculated rate on total population (n = 310) It is observed that the performances achieved by the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) are significantly higher than the APRI and FOR S tests.
Par rapport au test FIBROTEST™, la combinaison de HA à CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) présente notamment : Compared with the FIBROTEST ™ test, the combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) presents especially :
- l'avantage de permettre une classification de tous les patients, alors qu'avec le test FIBROSTEST™, 15% des patients de la population ne peuvent recevoir de score de fîbrose,  - the advantage of allowing a classification of all patients, whereas with the FIBROSTEST ™ test, 15% of patients in the population can not receive a fibrose score,
- l'avantage de présenter de meilleures performances de spécificité et VPP (en sus du meilleur taux de bonne classification), et en outre  - the advantage of presenting better performance of specificity and VPP (in addition to the best rate of good classification), and in addition
- l'avantage de ne requérir le dosage que de deux bio marqueurs (HA et CXCL10), alors que pour le test FIBROTEST™, cinq biomarqueurs doivent être dosés (A2M, GGT, - the advantage of requiring the assay of only two biomarkers (HA and CXCL10), whereas for the FIBROTEST ™ test, five biomarkers must be assayed (A2M, GGT,
APOA1, Hapto et Bilirubine). APOA1, Hapto and Bilirubin).
Par rapport au test HEPASCORE™, la combinaison de HA à CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) présente notamment l'avantage de ne requérir le dosage que de deux biomarqueurs (HA et CXCL10), alors que pour le test HEPASCORE™, quatre biomarqueurs doivent être dosés (A2M, GGT, Bilirubine et HA). Compared to the HEPASCORE ™ test, the combination of HA to CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) presents In particular, the advantage of requiring the assay of only two biomarkers (HA and CXCL10), whereas for the HEPASCORE ™ assay, four biomarkers must be assayed (A2M, GGT, Bilirubin and HA).
Il est à noter que les performances des différents tests non invasifs ici mesurées avec les tests HEPASCORE™, FIBROTEST™, FIBROSCAN™, APRI et FORNS (exemple 4) sont probablement favorisées, étant donné que ces tests font partie du référentiel qui a été utilisé pour déterminer le stade de fîbrose des patients {cf. exemple 3 ci-dessus ; cf. Figure 3). Ce n'était pas le cas pour les mesures comparatives de l'exemple 2 ci-dessus (stade de fîbrose déterminé par PBH). It should be noted that the performances of the different non-invasive tests measured here with the HEPASCORE ™, FIBROTEST ™, FIBROSCAN ™, APRI and FORNS tests (example 4) are probably favored, since these tests are part of the repository that was used. to determine the stage of fibrosis of patients (cf. Example 3 above; cf. Figure 3). This was not the case for the comparative measurements of Example 2 above (fibrin stage determined by PBH).
La combinaison de HA à CXCL10 (optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s))) a donc des performances diagnostiques très satisfaisantes, tout en étant beaucoup plus simple (et donc plus rapide, moins coûteuse, et plus sûre) à mettre en œuvre que les tests non invasifs qui sont actuellement disponibles. The combination of HA with CXCL10 (optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virological marker (s))) therefore has very satisfactory diagnostic performance, while being much simpler (and therefore faster, less expensive, and safer) to implement than the non-invasive tests that are currently available.
EXEMPLE 5 : combinaison des biomarqueurs HA et CXCL10 et de FIBROSCA ™ EXAMPLE 5 Combination of HA and CXCL10 and FIBROSCA ™ Biomarkers
Les résultats du test FIBROSCAN™ des 310 patients de l'exemple 4 ont été traités et analysés par la méthode mROC, seuls ou en combinaison avec les résultats du test HA+CXCL10 de ces mêmes patients (résultats HA+CXCL10 décrits en exemple 3 ci- dessus). The results of the FIBROSCAN ™ test of the 310 patients of example 4 were treated and analyzed by the mROC method, alone or in combination with the results of the HA + CXCL10 test of these same patients (results HA + CXCL10 described in example 3 hereof). - above).
Pour une description de la méthode mROC, cf. notamment l'exemple 1 ci-dessus. For a description of the mROC method, cf. especially example 1 above.
La fonction linéaire ainsi générée par la méthode mROC et la valeur de référence (seuil maximisant l'indice de Youden, δ), qui confère les meilleures performances à cette règle décisionnelle, sont indiquées dans le Tableau 13 ci-dessous. Les valeurs des paramètres λ  The linear function thus generated by the method mROC and the reference value (threshold maximizing the Youden index, δ), which confers the best performances to this decision rule, are indicated in Table 13 below. The values of the parameters λ
t λ  t λ
de la transformée Box-Cox [BMQ = (BMQ - 1) / λ] sont également indiquées dans le Tableau 13 ci-dessous. of the Box-Cox transform [BMQ = (BMQ - 1) / λ] are also shown in Table 13 below.
Tableau 13 : Table 13:
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Dans le Tableau 13 ci-dessus : In Table 13 above:
HA = concentration sérique en acide hyaluronique, exprimée en ng/mL  HA = serum hyaluronic acid concentration, expressed in ng / mL
CXCLIO = concentration sérique en protéine CXCLIO, exprimée en pg/mL  CXCLIO = serum concentration of protein CXCLIO, expressed in pg / mL
FS = mesure de dureté du foie exprimée en kPa équivalent fïbrose (FIBROSCAN™ )  FS = measurement of liver hardness expressed in kPa equivalent fibro (FIBROSCAN ™)
Pour l'application d'une fonction Z à un patient donné et la comparaison de la valeur de Z ainsi obtenue au seuil maximisant l'indice de Youden, cf. exemple 1 ci-dessus. For the application of a Z function to a given patient and the comparison of the value of Z thus obtained to the threshold maximizing the Youden index, cf. Example 1 above.
L'application des fonctions ci-dessus aux 310 patients de la population a permis leur classification en stade de fïbrose < F2 and ≥ F2 (score Metavir). Les résultats de sensibilité (Se), spécificité (Spé), valeur de prédiction négative (VPN), valeur de prédiction positive (VPP=, taux de bonne classification et d'aire sous la courbe ROC (AUC) sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous. Tableau 14 The application of the above functions to the 310 patients in the population allowed them to be classified as fibrosis <F2 and ≥ F2 (Metavir score). The sensitivity (Se), specificity (Spe), negative prediction value (NPV), positive prediction value (VPP =, good classification and area under the ROC curve (AUC) results are presented in Table 14. below Table 14
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La combinaison de HA à CXCLIO donne de meilleures performances diagnostiques que le test FIBROSCAN™ seul. The combination of HA to CXCLIO gives better diagnostic performance than the FIBROSCAN ™ test alone.
La combinaison de HA à CXCLIO et en outre à FS donne encore de meilleures performances. EXEMPLE 6 : établissement et application de combinaisons HA+CXCL10 pour une classification fine des stades de fibrose (F0-F1/F2-F3/F4) (même population de patients que l'exemple 3) Pour chacun des 310 patients de la population de l'exemple 3, une détermination fine du stade de fibrose a été conduite à l'aide d'un algorithme de classification multivariée. Combining HA with CXCLIO and further with FS gives even better performance. EXAMPLE 6: Establishment and Application of Combinations HA + CXCL10 for a Fine Classification of Fibrosis (F0-F1 / F2-F3 / F4) Stages (Same Patient Population as Example 3) For each of the 310 patients in the population of In Example 3, a fine determination of the fibrosis stage was conducted using a multivariate classification algorithm.
Cet algorithme a été mis au point par modification de l'algorithme de Boursier et al. 2012 (cf. Figure 2C de Boursier et al. 2012). This algorithm was developed by modifying the algorithm of Boursier et al. 2012 (see Figure 2C of Boursier et al 2012).
L'algorithme de Boursier et al. 2012 a été modifié de sorte à permettre la classification des patients qui présentent des résultats discordants au FIBROSCAN™ et au FIBROSTEST™, sans avoir à recourir à la PBH, tout en permettant une classification fine du stade de fibrose (F0-F1/F2-F3/F4).  The algorithm of Boursier et al. 2012 has been modified to allow for the classification of patients with discordant FIBROSCAN ™ and FIBROSTEST ™ results, without the need for PBH, while allowing for a fine classification of the fibrosis stage (F0-F1 / F2- F3 / F 4).
L'algorithme ainsi modifié est présenté en Figure 6. The modified algorithm is shown in Figure 6.
L'algorithme modifié comprend un deuxième niveau d'analyse (cf. Figure 6), qui met en œuvre la combinaison de plusieurs tests non invasifs, en l'occurrence FIBROSCAN™ The modified algorithm includes a second level of analysis (see Figure 6), which implements the combination of several non-invasive tests, in this case FIBROSCAN ™
(FS), HEPASCORE™ (HS), APRI et FORNS. (FS), HEPASCORE ™ (HS), APRI and FORNS.
Le test FIBROSCAN™ a été décrit à l'exemple 3 ci-dessus.  The FIBROSCAN ™ test was described in Example 3 above.
Les tests HEPASCORE™, APRI et FORNS ont été décrits à l'exemple 2 ci-dessus.  The HEPASCORE ™, APRI and FORNS tests were described in Example 2 above.
Lors du deuxième niveau d'analyse, au moins trois de ces tests sont appliqués aux échantillons qui ont donné des résultats discordants à l'issue du premier niveau d'analyse. At the second level of analysis, at least three of these tests are applied to samples that gave discordant results after the first level of analysis.
Le stade de fibrose obtenu avec chacun de ces tests a ainsi été déterminé. Le stade majoritairement identifié par l'ensemble de ces tests a été alloué à l'échantillon analysé. A défaut de majorité, l'algorithme modifié prévoit d'allouer à l'échantillon l'étiquetteThe fibrosis stage obtained with each of these tests was thus determined. The stage mostly identified by all these tests was allocated to the sample analyzed. In the absence of a majority, the modified algorithm plans to allocate to the sample the label
« stade de fibrose non déterminé ». "Non-determinate fibrosis stage".
Les caractéristiques des patients 310 patients sont présentées dans le Tableau 15 ci- dessous. Tableau 15 : The characteristics of the patients 310 patients are shown in Table 15 below. Table 15:
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SD = déviation standard ; UI = unité internationale SD = standard deviation; IU = international unit
Pour chacun des 310 patients de la population, les concentrations sériques en HA et CXCL10 ont été mesurées comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus. La distribution de ces concentrations selon le degré de fïbrose hépatique (score Metavir F0-F1 ou F2-F3 ou F4) est présentée en Figure 7 (CXCL10) et en Figure 8 (HA). Les mesures de FIBROSCAN™ (dureté du foie exprimée en kPa équivalent fïbrose) ont été comparées à la valeur seuil préconisée par ce test pour classer le stade de fïbrose hépatique par rapport au score Metavir F4, à savoir le seuil de 12,5 kPa. Conformément aux instructions du fabricant : For each of the 310 patients in the population, serum concentrations of HA and CXCL10 were measured as described in Example 1 above. The distribution of these concentrations according to the degree of hepatic fibrosis (Metavir score F0-F1 or F2-F3 or F4) is presented in Figure 7 (CXCL10) and Figure 8 (HA). Measurements of FIBROSCAN ™ (liver hardness expressed in kPa equivalent fibroids) were compared with the threshold value recommended by this test to classify the hepatic fibrosis stage relative to the Metavir F4 score, namely the threshold of 12.5 kPa. According to the manufacturer's instructions:
- ceux des patients dont la valeur de mesure par FIBROSCAN™ (FS) était inférieure à 12,5 kPa ont été affectés à la classe « score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F4 », et  - those patients whose FIBROSCAN ™ (FS) measurement value was less than 12.5 kPa were assigned to the "Metavir Hepatic F4 score", and
- ceux des patients dont la valeur de mesure par FIBROSCAN™ (FS) était supérieure ou égale à 12,5 kPa ont été affectés à la classe « score Metavir de fïbrose hépatique égal à F4 ».  - those patients whose measurement value with FIBROSCAN ™ (FS) was greater than or equal to 12.5 kPa were assigned to the class "Metavir score liver fibrosis equal to F4".
Les patients dont le score Metavir de fïbrose hépatique a ainsi été déterminé comme étant inférieur à F4 ont été plus avant classifïés à l'aide de la combinaison de marqueurs HA+CXCL10 (2eme niveau d'analyse). À cet effet, les valeurs de concentrations sériques en CXCL10 et HA ont été combinées selon la méthode mROC afin d'établir une règle décisionnelle permettant de déterminer le stade de fïbrose (score Metavir F0-F1 ou F2- F3). Les valeurs de concentrations sériques en CXCL10 et HA ont également été combinées : Patients whose Metavir score of hepatic fibrosis has been determined as lower than F4 were further classified using the combination of markers HA + CXCL10 (2nd level of analysis). For this purpose, the serum concentrations of CXCL10 and HA were combined according to the mROC method to establish a decision rule for determining the fibrosis stage (Metavir F0-F1 or F2-F3 score). The serum concentration values in CXCL10 and HA were also combined:
- à des paramètres cliniques, tels que l'indice de masse corporelle (IMC), l'âge et la charge virale du patient (CV),  - clinical parameters, such as body mass index (BMI), age and viral load of the patient (CV),
- aux valeurs mesurées par FIBROSCAN™,  - the values measured by FIBROSCAN ™,
conformément à la méthode mROC, afin d'établir une règle décisionnelle permettant de déterminer le stade de fïbrose (score Metavir F0-F1 ou F2-F3). according to the mROC method, in order to establish a decisional rule allowing to determine the fibrosis stage (Metavir score F0-F1 or F2-F3).
Pour une description de la méthode mROC, cf. notamment l'exemple 1 ci-dessus. La fonction linéaire ainsi générée par la méthode mROC et la valeur de référence (seuil maximisant l'indice de Youden, δ), qui confère les meilleures performances à cette règle décisionnelle, sont indiquées dans le Tableau 16 ci-dessous. Les valeurs des paramètres λ  For a description of the mROC method, cf. especially example 1 above. The linear function thus generated by the mROC method and the reference value (threshold maximizing the Youden index, δ), which gives the best performance to this decision rule, are shown in Table 16 below. The values of the parameters λ
t λ  t λ
de la transformée Box-Cox [BMQ = (BMQ - 1) / λ] sont également indiquées dans le Tableau 16 ci-dessous. Les figures 9, 10 et 11 présentent une illustration de l'algorithme de classification multivariée qui a ainsi été mis au point et appliqué. Tableau 16 : of the Box-Cox transform [BMQ = (BMQ - 1) / λ] are also shown in Table 16 below. Figures 9, 10 and 11 show an illustration of the multivariate classification algorithm that has been developed and applied. Table 16:
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FS = mesure de dureté du foie exprimée en kPa équivalent fïbrose (FIBROSCAN™ ) FS = measurement of liver hardness expressed in kPa equivalent fibro (FIBROSCAN ™)
Dans le Tableau 16 ci-dessus : In Table 16 above:
HA = concentration sérique en acide hyaluronique, exprimée en ng/mL  HA = serum hyaluronic acid concentration, expressed in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10, exprimée en pg/mL CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10, expressed in pg / mL
FS = FIBROSCAN™ = mesure de dureté du foie exprimée en kPa équivalent de fïbrose Âge = âge du patient à la date du prélèvement FS = FIBROSCAN ™ = measurement of liver hardness expressed in kPa equivalent of fibrose Age = age of the patient at the date of sampling
IMC = Indice de Masse Corporelle à la date du prélèvement (masse / taille2) BMI = Body Mass Index at the date of collection (mass / size 2 )
CV = Charge Virale du patient à la date du prélèvement, en UI/mL CV = Viral load of the patient at the date of sampling, in IU / mL
L'exposant t indiqué dans le libellé des fonctions « Z = » indique que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur mesurée selon la formule suivante : BMQ1 = (ΒΜς>λ - 1) / λ. The exponent t indicated in the "Z =" function label indicates that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the measured value for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value measured according to the following formula: BMQ 1 = (ΒΜς> λ - 1) / λ.
Pour l'application d'une fonction Z à un patient donné et la comparaison de la valeur de Z ainsi obtenue au seuil maximisant l'indice de Youden, cf. exemple 1 ci-dessus. For the application of a Z function to a given patient and the comparison of the value of Z thus obtained to the threshold maximizing the Youden index, cf. Example 1 above.
Chacune des fonctions Z indiquées dans le Tableau 16 ci-dessus peut être directement appliquée à un patient dont le score Metavir de fïbrose hépatique est inférieur à F4. Each of the Z functions listed in Table 16 above can be directly applied to a patient whose Metavir score of hepatic fibrosis is less than F4.
Si le score de fïbrose hépatique du patient est connu, et si ce score est inférieur au score Metavir F4, un examen par FIBROSCAN™ (ni aucun autre examen) n'est préalablement pas nécessaire : une formule Z du Tableau 16 peut être directement appliquée aux données de ce patient. If the liver fibrosis score of the patient is known, and if this score is lower than the Metavir F4 score, a FIBROSCAN ™ examination (or any other examination) is not necessary beforehand: a formula Z of Table 16 can be directly applied to this patient's data.
Si, par contre, le score de fïbrose hépatique du patient n'est pas connu, un examen doit être mené de sorte à déterminer si ce score est inférieur à F4, par exemple par FIBROSCAN™ pour alors procéder comme illustré en Figure 9, 10 ou 11 selon la formule Z choisie.  If, on the other hand, the patient's hepatic fibrosis score is not known, an examination should be carried out to determine if this score is less than F4, for example by FIBROSCAN ™, then proceed as shown in Figure 9, 10 or 11 according to the chosen formula Z.
L'application de cette classification aux 310 patients de la population a permis de classer les patients en 3 stades de Fibrose (score Metavir de fïbrose hépatique F0-F1 ou F2-F3 ou F4) avec les taux de bonne classification qui sont présentés dans le Tableau 17 ci-dessous. Tableau 17 (taux de bonne classification) : The application of this classification to the 310 patients in the population classified patients into 3 stages of Fibrosis (Metavir score of hepatic fibrosis F0-F1 or F2-F3 or F4) with the good classification rates presented in the table. Table 17 below. Table 17 (good classification rate):
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La combinaison de HA à CXCL10, optionnellement combinée à un ou plusieurs marqueurs additionnels (marqueur(s) clinique(s) ou anatomique(s) et/ou marqueur(s) virologique(s)), permet d'atteindre d'excellents taux de bonne classification parmi la population des patients dont le score Metavir de fïbrose hépatique est inférieur à F4. The combination of HA with CXCL10, optionally combined with one or more additional markers (clinical marker (s) or anatomical (s) and / or virologic marker (s)), achieves excellent rates good classification among the population of patients whose Metavir score of hepatic fibrosis is less than F4.
EXEMPLE 7 : EXAMPLE 7
- les méthodes qui ne sont pas basées sur une fonction linéaire peuvent être utilisées ; et  - methods that are not based on a linear function can be used; and
- démonstration expérimentale d'une formulation mROC générale  - experimental demonstration of a general mROC formulation
La méthode mROC est une méthode de classification multivariée basée sur une fonction linéaire. Pour une description de la méthode mROC, cf. exemple 1. Pour des exemples de fonctions linéaires mROC, cf. exemples 1 à 6 ci-dessus. The mROC method is a multivariate classification method based on a linear function. For a description of the mROC method, cf. example 1. For examples of linear functions mROC, cf. Examples 1 to 6 above.
Les méthodes de classification mutlivariée, qui comme la méthode mROC sont basées sur une fonction linéaire ne sont pas les seules méthodes pouvant être mises en œuvre pour établir un modèle de classification des patients à partir de la combinaison des biomarqueurs CXCL 10 et HA.  Mutlivariate classification methods, which like the mROC method are based on a linear function, are not the only methods that can be implemented to establish a patient classification model from the combination of CXCL 10 and HA biomarkers.
En effet, des méthodes de classification multivariée qui ne sont pas basées sur une fonction linéaire peuvent être utilisées. Par exemple, peuvent être utilisées : - les méthodes de classification multivariée qui sont basées sur une fonction qui n'est pas une fonction linéaire, par exemple les méthodes de classification multivariée qui sont basées sur une fonction affine, telle que la méthode de Régression Logistique (LR), ouIndeed, multivariate classification methods that are not based on a linear function can be used. For example, can be used: - multivariate classification methods that are based on a function that is not a linear function, for example multivariate classification methods that are based on an affine function, such as the Logistic Regression (LR) method, or
- les méthodes de classification multivariée qui ne sont pas basées sur une fonction (mathématique), telles que les méthodes basées sur un arbre de décision, par exemple la méthode CART (Classification And Régression Tree). - multivariate classification methods that are not based on a (mathematical) function, such as decision-tree based methods, for example the CART (Classification And Regression Tree) method.
Le modèle de Régression Logistique a été décrit par Berkson 1944.  The Logistic Regression model was described by Berkson 1944.
Le modèle CART a été décrit par Breiman et al. 1984. La population de patients est identique à celle présentée en exemple 3 ci-dessus. Cette population était constituée de 310 patients dont le stade de fïbrose a été déterminé selon l'algorithme de classification présenté en Figure 3. Les caractéristiques de ces patients sont présentées dans le Tableau 6 ci-dessus. Un groupe d'apprentissage et un groupe de validation ont été tirés aléatoirement à 10 reprises parmi la population de 310 patients.  The CART model has been described by Breiman et al. 1984. The patient population is identical to that shown in Example 3 above. This population consisted of 310 patients whose fribrose stage was determined according to the classification algorithm presented in Figure 3. The characteristics of these patients are presented in Table 6 above. A learning group and a validation group were randomly drawn 10 times from the population of 310 patients.
Le groupe d'apprentissage était constitué de 2/3 des patients, soit 207 patients, et le groupe de validation était constitué de 1/3 des patients, soit 103 patients. Trois méthodes ont été comparées :  The learning group consisted of 2/3 of the patients, ie 207 patients, and the validation group consisted of 1/3 of the patients, ie 103 patients. Three methods were compared:
- la méthode mROC (à fonction linéaire),  - the mROC (linear function) method,
- la méthode LR (à fonction affine), et  the LR (affine function) method, and
- la méthode CART (pas de fonction mathématique ; classification par arbre de décsion). Les fonctions mROC utilisées sont celles de l'exemple 3 ci-dessus (cf. Tableau 7 ci- dessus). Pour mémoire : Tableau 18 : - the CART method (no mathematical function, classification by decsion tree). The mROC functions used are those of Example 3 above (see Table 7 above). For memory : Table 18:
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L'exposant t indiqué dans le libellé des fonctions « Z = » indique que la valeur à appliquer dans la fonction linéaire est la transformée Box-Cox (Box et Cox 1964) de la valeur mesurée pour le biomarqueur (BMQ), afin de normaliser cette valeur mesurée selon la formule suivante : BMQ1 = (BMQλ - 1) / λ. The exponent t indicated in the "Z =" function label indicates that the value to be applied in the linear function is the Box-Cox transform (Box and Cox 1964) of the measured value for the biomarker (BMQ), in order to normalize this value measured according to the following formula: BMQ 1 = (BMQ λ - 1) / λ.
Les modèles de classifications CART et LR ont été établis sur les groupes d'apprentissage (cf. Tableau 19 ci-dessous). The CART and LR classification models were established on learning groups (see Table 19 below).
Tableau 19 : Table 19:
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Les valeurs des paramètres indiquées dans le Tableau 19 ci-dessus (méthode LR) correspondent aux bornes inférieure et supérieure des valeurs des paramètres des 10 populations tirées au hasard. The parameter values given in Table 19 above (LR method) correspond to the lower and upper bounds of the parameter values of the 10 populations drawn at random.
Les performances ont été validées sur le groupe de validation (score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2, ou score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2). La valeur moyenne des résultats de sensibilité (Se), de spécificité (Spé), de valeur de prédiction négative (VPN), de valeur de prédiction positive (VPP), d'aire sous la courbe ROC (AUC) et de taux de bonne classification, qui ont été obtenus sur l'ensemble des 10 réplicats pour le groupe d'apprentissage et pour le groupe de validation sont présentés dans le Tableau 20 et dans le Tableau 21 ci-dessous, respectivement. The performances were validated on the validation group (Metavir score of hepatic fibrosis less than F2, or Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2). The mean value of sensitivity (Se), specificity (Spe), negative prediction value (NPV), positive prediction value (PPV), area under the ROC (AUC), and good rate classification, which were obtained on all 10 replicates for the learning group and for the validation group are presented in Table 20 and Table 21 below, respectively.
Tableau 20 : Table 20:
Groupe d'apprentissage n = 207 Learning Group n = 207
Taux de bonne  Good rate
Combinaison Méthode Se Spé VPP VPN AUC classification  Combination Method Se Spé VPP VPN AUC classification
HA + CXCL10 mROC 76 92 92 76 83 0,898 HA + CXCL10 mROC 76 92 92 76 83 0.898
HA mROC 78 79 82 75 78 0,845HA mROC 78 79 82 75 78 0.845
CXCL10 mROC 72 75 78 70 74 0,802CXCL10 mROC 72 75 78 70 74 0.802
HA + CXCL10 CART 77 91 91 77 83 NAHA + CXCL10 CART 77 91 91 77 83 NA
HA CART 78 79 82 75 78 NAHA CART 78 79 82 75 78 NA
CXCL10 CART 72 75 78 70 74 NACXCL10 CART 72 75 78 70 74 NA
HA + CXCL10 LR 76 86 86 75 80 0,878HA + CXCL10 LR 76 86 86 75 80 0.878
HA LR 68 84 84 68 75 0,845HA LR 68 84 84 68 75 0.845
CXCL10 LR 72 73 76 68 72 0,802 CXCL10 LR 72 73 76 68 72 0.802
Tableau 21 : Table 21:
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HA = concentration sérique en acide hyaluronique (HA), en ng/mL
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HA = serum hyaluronic acid (HA) concentration, in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10 (CXCL10), en pg/mL  CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10 (CXCL10), in pg / mL
NA = non applicable  NA = not applicable
Il a ainsi pu être constaté que les performances de la combinaison HA+CXCL10 sont supérieures à celles de HA seul et à celles de CXCL10 seul. C'est plus particulièrement le cas des performances de spécificité, VPP, VPN, Taux de bonne classification et d'AUC.It has thus been found that the performances of the HA + CXCL10 combination are superior to those of HA alone and those of CXCL10 alone. This is particularly the case of the performance of specificity, VPP, VPN, rate of good classification and AUC.
Le fait que la combinaison de HA à CXCL10 atteigne de meilleures performances que le marqueur HA seul et que le marqueur CXCL10 seul indique que la combinaisonThe fact that the combination of HA with CXCL10 achieves better performance than the HA marker alone and that the CXCL10 marker alone indicates that the combination
HA+CXCL10 a un effet synergique allant au-delà de la simple juxtaposition des deux marqueurs (au sujet de la synergie, cf. également exemples 1 et 3 ci-dessus). HA + CXCL10 has a synergistic effect going beyond the simple juxtaposition of the two markers (on synergy, see also Examples 1 and 3 above).
On constate également que les performances sont similaires quelle que soit la méthode de classification multivariée utilisée.  We also note that the performance is similar regardless of the multivariate classification method used.
Les performances, plus particulièrement l'effet synergique, de la combinaison de HA et de CXCL10 ne sont pas liés à la nature de la méthode de classification multivariée utilisée. Ceci prouve qu'une méthode de classification multivariée autre que mROC peut être utilisée.  The performances, more particularly the synergistic effect, of the combination of HA and CXCL10 are not related to the nature of the multivariate classification method used. This proves that a multivariate classification method other than mROC can be used.
Plus particulièrement, alternativement aux méthodes de classification multivariée qui sont basées sur une fonction linéaire telles que mROC, peuvent être utilisées : - aussi bien les méthodes de classification multivariée qui sont basées sur une fonction qui n'est pas une fonction linéaire, par exemple les méthodes de classification multivariée qui sont basées sur une fonction affine, telles que la méthode LR, More specifically, alternatively to multivariate classification methods that are based on a linear function such as mROC, can be used: - multivariate classification methods that are based on a function that is not a linear function, for example, multivariate classification methods that are based on an affine function, such as the LR method,
- que les méthodes de classification qui ne sont pas basées sur une fonction (mathématique), telles que les méthodes basées sur un arbre de décision par exemple la méthode CART.  - that classification methods that are not based on a (mathematical) function, such as methods based on a decision tree, for example the CART method.
Les méthodes mROC, CART et LR ont également été appliquées sur la population totale des 310 patients de l'exemple 3. Des exemples de règles décisionnelles obtenues sur la population des 310 patients pour les méthodes CART et LR sont présentés dans le Tableau 22 ci-dessous (score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2, ou score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2). Les fonctions mROC utilisées sont celles de l'exemple 3 ci-dessus {cf. Tableau 7 ci-dessus).  The methods mROC, CART and LR were also applied to the total population of 310 patients in example 3. Examples of decision rules obtained on the population of 310 patients for the CART and LR methods are presented in Table 22 below. beneath (Metavir score of hepatic fibrosis less than F2, or Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2). The mROC functions used are those of Example 3 above (cf. Table 7 above).
Tableau 22 : Table 22:
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HA = concentration sérique en acide hyaluronique, en ng/mL HA = serum hyaluronic acid concentration, in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10, en pg/mL Conformément à la méthode mROC, lorsque la valeur de la fonction Z4 pour un patient donné était supérieure ou égale à 15, 170 (combinaison HA+CXCL10), on a attribué à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2. Inversement, lorsque la valeur de la fonction Z4 pour un patient donné était inférieure à 15, 170, on a attribué à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2. CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10, in pg / mL In accordance with the mROC method, when the value of the Z 4 function for a given patient was greater than or equal to 15, 170 (HA + CXCL10 combination), this patient was assigned a Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2. . Conversely, when the value of the Z 4 function for a given patient was less than 15, 170, this patient was assigned a Metavir score of hepatic fibrosis less than F2.
De même, lorsque la valeur de la fonction Z5 pour un patient donné était supérieure ou égale à 16,543 (combinaison HA+CXCL10+IMC+Age+CV), on a attribué à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2. Inversement, lorsque la valeur Z5 pour un patient donné était inférieure à 16,543, on a attribué à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2. Similarly, when the value of the Z 5 function for a given patient was greater than or equal to 16.543 (combination HA + CXCL10 + IMC + Age + CV), this patient was assigned a Metavir score of liver fibrosis greater than or equal to F2. Conversely, when the Z5 value for a given patient was less than 16.543, this patient was assigned a Metavir score of hepatic fibrosis less than F2.
Conformément à la méthode CART (cf. Figure 12), lorsque la concentration sérique en acide hyaluronique (HA) en ng/mL d'un patient était inférieure à la valeur du paramètre h (47,29), on lui a affecté :  According to the CART method (see Figure 12), when the serum hyaluronic acid (HA) concentration in ng / mL of a patient was lower than the value of the parameter h (47,29), it was assigned:
- un score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2, lorsque sa concentration sérique en protéine CXCL10 en pg/mL était inférieure à la valeur du paramètre j (503,4), et  a Metavir score of hepatic fibrosis less than F2, when its serum concentration of CXCL10 protein in pg / ml was lower than the value of parameter j (503.4), and
- un score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2, lorsque sa concentration sérique en protéine CXCL10 en pg/mL était supérieure ou égale à la valeur du paramètre j (503,4).  a Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2, when its serum concentration of CXCL10 protein in pg / ml was greater than or equal to the value of the parameter j (503.4).
De même, conformément à la méthode CART (cf. Figure 12), lorsque la concentration sérique en acide hyaluronique (HA) en ng/mL d'un patient était supérieure à la valeur du paramètre h (47,29), on lui a affecté : Similarly, according to the CART method (see Figure 12), when the serum hyaluronic acid (HA) concentration in ng / mL of a patient was greater than the value of the parameter h (47,29), it was affected:
- un score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2, lorsque sa concentration sérique en protéine CXCL10 en pg/mL était inférieure à la valeur du paramètre i (209,3), et  a Metavir score of hepatic fibrosis less than F2, when its serum CXCL10 protein concentration in pg / ml was lower than the value of parameter i (209.3), and
- un score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2, lorsque sa concentration sérique en protéine CXCL10 en pg/mL était supérieure ou égale à la valeur du paramètre i (209,3).  a Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2, when its serum CXCL10 protein concentration in pg / ml was greater than or equal to the value of parameter i (209.3).
Conformément à la méthode LR, lorsque la valeur de la fonction LOGIT d'un patient donné était supérieure ou égale à la valeur du seuil logit (0,5), on a affecté à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique supérieur ou égal à F2. Inversement, lorsque la valeur de la fonction LOGIT d'un patient donné était inférieure à la valeur du seuil logit (0,5), on a affecté à ce patient un score Metavir de fïbrose hépatique inférieur à F2. Les résultats de sensibilité (Se), de spécificité (Spé), de valeur de prédiction négative (VPN), de valeur de prédiction positive (VPP), d'aire sous la courbe ROC (AUC) et de taux de bonne classification, qui ont été obtenus pour ces règles décisionnelles sur la population de 310 patients sont présentés dans le Tableau 23 ci-dessous. In accordance with the LR method, when the value of the LOGIT function of a given patient was greater than or equal to the value of the logit threshold (0.5), this patient was assigned a Metavir score of hepatic fibrosis greater than or equal to F2. Conversely, when the value of the LOGIT function of a given patient was less than the logit threshold value (0.5), that patient was assigned a Metavir score of hepatic fibrosis less than F2. Sensitivity (Se), Specificity (Spe), Negative Predictive Value (NPV), Positive Prediction Value (PPV), Area Under OCR (AUC), and Good Classification rates, which were obtained for these decision rules on the population of 310 patients are shown in Table 23 below.
Tableau 23 : Table 23:
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HA = concentration sérique en acide hyaluronique (HA), en ng/mL  HA = serum hyaluronic acid (HA) concentration, in ng / mL
CXCL10 = concentration sérique en protéine CXCL10 (CXCL10), en pg/mL  CXCL10 = serum concentration of protein CXCL10 (CXCL10), in pg / mL
Âge = âge du patient à la date du prélèvement  Age = age of the patient at the date of collection
IMC = Indice de Masse Corporelle à la date du prélèvement (masse / taille2) BMI = Body Mass Index at the date of collection (mass / size 2 )
CV = Charge Virale du patient à la date du prélèvement, en UI/mL  CV = Viral load of the patient at the date of sampling, in IU / mL
NA = non applicable  NA = not applicable
Il a ainsi pu être constaté que les performances de la combinaison du biomarqueur HA au biomarqueur CXCL10 sont totalement indépendantes de la nature de la méthode de classification multivariée utilisée. It has thus been found that the performances of the combination of the biomarker HA with the biomarker CXCL10 are totally independent of the nature of the multivariate classification method used.
EXEMPLE 8 : formulation générale EXAMPLE 8: General Formulation
Les gammes de valeurs des paramètres et seuils mis en œuvre par les méthodes de classification peuvent être calculées, en utilisant la méthode de Bootstrap {cf. Efron 1979). Conformément à cette méthode, une population aléatoire de 310 patients a été tirée aléatoirement 1000 fois de suite.  The ranges of values of the parameters and thresholds implemented by the classification methods can be calculated using the Bootstrap method (cf. Efron 1979). According to this method, a random population of 310 patients was randomly drawn 1000 times in a row.
Les résultats de ces calculs pour les méthodes mROC, CART et LR sont présentés dans le Tableau 24 ci-dessous. Tableau 24 : The results of these calculations for the methods mROC, CART and LR are shown in Table 24 below. Table 24:
Méthode classification multivariée Exemple de  Multivariate classification method Example of
Paramètres  Settings
Règle décisionnelle seuil(s) Performance  Decision Rule threshold (s) Performance
0,812≤a≤ 5,089 AUC≥ 0,865 mROC 2,033≤ b≤ 4,462 [0,865≤ AUC≤ 0,931]  0.812≤a≤ 5.089 AUC≥ 0.865 mCRO 2.033≤ b≤ 4.462 [0.865≤ AUC≤ 0.931]
-0,262≤ CXCLIO≤ 11,68 < δ < 23,71 Taux BC≥ 80%-0.262≤ C XCLIO≤ 11.68 <δ <23.71 Rate BC≥ 80%
Z = aiCXCLlO4) + biHA4) 0,030 [80%≤ TauxBC≤ 88%] Z = aiCXCL10 4 ) + biHA 4 ) 0.030 [80% ≤ BCR rate 88%]
[fonction Zw] -0,382≤λΗΑ≤ -0,219 [function Z w ] -0,382 λ ΗΑ ≤ -0,219
0,748≤a≤ 5,357  0.748≤a≤ 5.357
2,075≤ b≤ 4,690  2,075≤ b≤ 4,690
-0,848≤ c≤ 3,697 AUC≥ 0,868 mROC -0,746≤d≤ 0,147 [0,868≤ AUC≤ 0,933]  -0.848≤ c≤ 3.697 AUC≥ 0.868 mROC -0.746≤d≤ 0.147 [0.868≤ AUC≤ 0.933]
-0,003≤ e≤ 0,002 Taux BC≥ 80% -0.003≤ e≤ 0.002 Rate BC≥ 80%
Z = aiCXCLlO4) + MHA4) + ciIMC4) + diÂge') + Z = aiCXCL10 4 ) + MHA 4 ) + ciIMC 4 ) + size ') +
-0,262≤ CXCLIO≤ 11≤ δ≤ 25,87 [80%≤ TauxBC≤ 88%] e(CV) 0,047  -0.262 ≤ CXCLIO ≤ 11 δ ≤ 25.87 [80% ≤ BCR rate ≤ 88%] e (CV) 0.047
[fonction Zn] [Zn function]
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Figure imgf000132_0001
-0,116≤ âge≤ 0,828 -0,116≤ age ≤ 0.828
0,236≤ λον≤ 0,305 0.236≤ λ ον ≤ 0.305
CART (Classification And Régression 41,96≤h≤  CART (Classification And Regression 41.96≤h≤
Méthode de Tree) 77,43 Taux BC≥81% classification 159,0≤i≤ 266,7 [81%≤ TauxBC≤ 89%]  Tree Method) 77.43 Rate BC≥81% Classification 159.0≤i≤ 266.7 [81% ≤ RateBC≤ 89%]
NA  N / A
multivariée cf. Figure 12 (marqueurs HA et 410,7≤j≤ 613,5  multivariate cf. Figure 12 (HA markers and 410.7≤j≤ 613.5
non basée CXCL10) [arbre  not based CXCL10) [tree
sur une CART2] on a CART 2 ]
fonction LR (régression logistique)  LR function (logistic regression)
linéaire -4,481≤ Intercept≤- AUC≥ 0,844  linear -4,481≤ Intercept≤- AUC≥ 0,844
2,398 Logit = 0,5 par [0,844≤ AUC≤ 0,921] 2,398 Logit = 0.5 by [0.844≤ AUC≤ 0.921]
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + LOGIT = Intercept + k (CXCL10) +
0,003≤k≤ 0,008 exemple Taux BC≥ 77% 1(HA)  0.003≤k≤ 0.008 example Rate BC≥ 77% 1 (HA)
[fonction LOGIT2] 0,013≤1≤ 0,045 [77%≤ TauxBC≤ 86%] [LOGIT 2 function] 0.013≤1≤ 0.045 [77% ≤ BC Rate≤86%]
TauxBC = taux de bonne classification ; NA = non applicable. RateBC = good classification rate; NA = not applicable.
Dans le Tableau 24, a, b, c, d, e, CXCLIO, λΗΑ, ιΜο ον, Intercept, k et 1 sont chacun différents de zéro. In Table 24, a, b, c, d, e, C X C LI O, λ ΗΑ , ι Μ ο ν, Intercept, k and 1 are each different from zero.
L'ensemble des différentes fonctions mROC peut ainsi être formulé comme suit : The set of different functions mROC can be formulated as follows:
Z = a(CXCL10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(CVl) + f(FSl) Z = a (CXCL10 l ) + b (HA l ) + c (IMC l ) + d (Age l ) + e (CV l ) + f (FS l )
[fonction Zi2] [Zi function 2 ]
avec : with:
a et b étant chacun, indépendamment l'un de l'autre, un nombre réel positif allant de +0,1 à +6,0, plus particulièrement de +0,3 à +5,5,  a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0, more particularly from +0.3 to +5.5,
c étant un nombre réel allant de -10,0 à +4,0,  c being a real number ranging from -10.0 to +4.0,
d étant un nombre réel allant de -0,8 à +0,2,  d being a real number ranging from -0.8 to +0.2,
e étant un nombre réel allant de -0,003 à +0,002,  e being a real number ranging from -0.003 to +0.002,
f étant un nombre réel allant de +0,0 à +10,0,  f is a real number ranging from +0.0 to +10.0,
λοχουο, λΗΑ, ΐΜο ^Age, ον et λρβ étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -6,0 à 1,2 mais différent de zéro. λοχουο, λ Η Α, ΐΜο ^ Age, ον and λρβ being each, independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1.2 but different from zero.
L'ensemble des différentes fonctions mROC peut ainsi être formulée comme suit : The set of different functions mROC can be formulated as follows:
Z = a(CXCL 10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(C V1) + f(FSl) Z = a (CXCL 10 1 ) + b (HA 1 ) + c (IMC 1 ) + d (Age 1 ) + e (CV 1 ) + f (FS 1 )
[fonction Zi3] [Zi function 3 ]
avec : with:
a et b étant chacun, indépendamment l'un de l'autre, un nombre réel positif allant de +0,1 à +6,0,  a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0,
c, d, e, et f étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -10,0 à +10,0,  c, d, e, and f each being, independently of one another, a real number ranging from -10.0 to +10.0,
λοχουο, λΗΑ, ΐΜο ^Age, ον et λρβ étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -6,0 à 1,2 mais différent de zéro. L'ensemble des fonctions LOGIT peut ainsi être formulé comme suit : λοχουο, λ Η Α, ΐΜο ^ Age, ον λρβ and each being independently of each other, a real number ranging from -6.0 to 1.2 but different from zero. The set of LOGIT functions can be formulated as follows:
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + 1(AH)  LOGIT = Intercept + k (CXCL10) + 1 (AH)
[fonction LOGITi]  [LOGITi function]
avec -5≤ Intercept≤ -1 with -5≤ Intercept≤ -1
0,001≤k≤ 0,010  0.001≤k≤ 0.010
0,010≤1≤ 0,050. L'ensemble des différents arbres CART peut être formulé comme suit :  0.010≤1≤ 0.050. The set of different CART trees can be formulated as follows:
arbre décisionnel de la Figure 12, avec  decision tree of Figure 12, with
40≤h≤80  40≤h≤80
150≤ i≤ 300  150≤ i≤ 300
400≤j≤620  400≤j≤620
[arbre CARTi].  [CARTi tree].
Pour chaque fonction mROC ou fonction LR ou arbre CART, les valeurs des paramètres peuvent être choisies conformément aux plages de valeurs indiquées. For each function mROC or function LR or tree CART, the values of the parameters can be selected according to the ranges of values indicated.
Une fois la valeur de chacun des paramètres choisis, la fonction mROC ou la fonction LR ou l'arbre CART qui en résulte peut être testée sur une population de référence, par exemple sur la population de 310 patients décrite en exemple 3. Ainsi, on peut par exemple tester qu'avec les paramètres choisis, la fonction mROC ou la fonction LR ou l'arbre CART conduit bien à la(les) performance(s) attendue(s) ou souhaitée(s), notamment à la valeur d' AUC et/ou à la valeur de taux de bonne classification attendue(s) ou souhaitée(s).  Once the value of each of the chosen parameters, the function mROC or the function LR or the resulting tree CART can be tested on a reference population, for example on the population of 310 patients described in example 3. Thus, can for example test that with the chosen parameters, the function mROC or the function LR or the tree CART leads well to the (the) expected performance (s) or wished (s), in particular to the value of AUC and / or the expected or desired good classification rate value.
Les performances peuvent être mesurées sur une population de patients VHC positifs, présentant un stade de fïbrose hépatique couvrant au moins les stades Fl à F3 (score Metavir), telle que la population de 118 patients de l'exemple 1 ou la population de 310 patients de l'exemple 3. The performances can be measured on a population of HCV-positive patients presenting a hepatic fibrosis stage covering at least stages Fl to F3 (Metavir score), such as the population of 118 patients of example 1 or the population of 310 patients. of Example 3.
Le seuil associé peut par exemple être le seuil maximisant l'indice de Youden (δ), dont la valeur est un nombre réel allant de -7 à 25.  The associated threshold may for example be the threshold that maximizes the Youden index (δ), the value of which is a real number ranging from -7 to 25.
EXEMPLE 9 : robustesse de la combinaison HA+CXCL10 EXAMPLE 9: Robustness of the combination HA + CXCL10
Pour illustrer la robustesse de la combinaison HA+CXCL10, la méthode de rééchantillonnage connue sous le nom de Bootstrap {cf. Efron 1979) a été mise en œuvre sur la population de 310 patients de l'exemple 3 ci-dessus. À partir de cette population de 310 patients, 1000 sous-populations de même taille ont été tirées aléatoirement (tirage avec remise, de sorte qu'un même patient peut être présent plusieurs fois au sein d'une même sous-population). Les valeurs d'AUC et de taux de bonne classification ont été mesurées sur chacune de ces 1000 sous-populations: To illustrate the robustness of the HA + CXCL10 combination, the resampling method known as Bootstrap (cf. Efron 1979) was implemented on the 310 patient population of Example 3 above. From this population of 310 patients, 1000 subpopulations of the same size were randomly drawn (remission, so that the same patient may be present several times within the same subpopulation). AUC and good classification rates were measured for each of these 1000 subpopulations:
- d'une part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients et seuil ceux initialement établis sur la population de 310 patients (« coefficients fixes » ou « coef fïx »), et  - on the one hand, when the decision rule mROC applied has for coefficients and threshold those initially established on the population of 310 patients ("fixed coefficients" or "coef fix"), and
- d'autre part, lorsque la règle décisionnelle mROC appliquée a pour coefficients et seuil ceux établis pour chacune des 1000 sous-populations (« coefficients optimisés » ou « coef optim ») ;  - on the other hand, when the decision rule mROC applied has as coefficients and threshold those established for each of the 1000 subpopulations ("optimized coefficients" or "optimum coef");
cf. exemple 3 ci-dessus. cf. Example 3 above.
La valeur du taux de bonne classification est la valeur du pourcentage de patients bien classés.  The value of the good classification rate is the value of the percentage of well-ranked patients.
La valeur d'AUC est la valeur de l'aire sous la courbe ROC.  The value of AUC is the value of the area under the ROC curve.
La variabilité entre les AUC obtenues avec la règle mROC à « coefficients fixes » (« coef fïx ») et les AUC obtenues avec la règle mROC à « coefficients optimisés » (« coef optim ») a été déterminée (Figure 15). The variability between the AUCs obtained with the mROC "fixed coefficients" ("coef fix") rule and the AUCs obtained with the mROC "optimized coefficients" ("coef optim") rule was determined (Figure 15).
La Figure 15 présente l'histogramme des AUC pour la combinaison HA+CXCL10, en Bootstrap (B = 1 000) avec les coefficients fixes (« coef fixes ») [axe des abscisses : 0,84 ; 0,86 ; 0,88 ; 0,90 ; 0,92 ; 0,94 ; 0,96]. La Figure 17 démontre que sur 1000 populations différentes, les performances de la combinaison HA+CXCL10 sont robustes (valeurs d'AUC comprises entre 0,84 et 0,96, ce qui sont des performances élevées).  Figure 15 shows the AUC histogram for the HA + CXCL10 combination, in Bootstrap (B = 1000) with the fixed coefficients ("fixed coefficients") [abscissa axis: 0.84; 0.86; 0.88; 0.90; 0.92; 0.94; 0.96]. Figure 17 shows that over 1000 different populations, the performances of the combination HA + CXCL10 are robust (values of AUC between 0.84 and 0.96, which are high performances).
Il a par ailleurs été constaté que les performances en terme d'AUC sont similaires que l'on utilise la règle mROC à « coefficients fixes » (« coef fïx ») [coefficients fixés à partir de la population initiale de 310 patients et appliqués à chacune des sous-populations bootstrap] ou bien que l'on utilise la règle mROC à « coefficients optimisés » (« coef optim ») [coefficients de la règle mROC optimisés pour chacune des 1000 sous-populations bootstrap].  It was also found that the performance in terms of AUC is similar, using the "fixed coefficients" ("coef fx") mROC rule [coefficients fixed from the initial population of 310 patients and applied to each one of the bootstrap subpopulations] or that we use the "optimized coefficients" ("optimized coefficients") mROC rule [optimized coefficients of the mROC rule for each of the 1000 bootstrap subpopulations].
Les performances de la fonction mROC obtenue sur la population de 118 patients de l'exemple 1 (marqueurs HA+CXCL10 ; fonction
Figure imgf000135_0001
; cf. Tableau 2 ci-dessus) ont été comparées à celles de la fonction mROC obtenue sur la population de 310 patients de l'exemple 3 (marqueurs HA+CXCL10 ; fonction Z4 ; cf. Tableau 7 ci-dessus), lorsqu'elles sont toutes deux appliquées à la population de 1 18 patients. The performance of the mROC function obtained on the population of 118 patients of Example 1 (markers HA + CXCL10, function
Figure imgf000135_0001
; cf. Table 2 above) were compared to those of the mROC function obtained on the population of 310 patients of Example 3 (markers HA + CXCL10, function Z 4 , see Table 7 above), when both are applied to the population of 1 18 patients.
Les résultats de cette comparaison sont illustrés en Figures 16A et 16B. The results of this comparison are illustrated in Figures 16A and 16B.
Figure 16A : en ordonnée, fonction ZI de l'exemple 1 [Z = (0,3686) x CXCL101 + (0,3064) x HA1, avec CXCLIO = -0,013 et λΗΑ = 0,099] ; en abscisse, fonction Z4 de l'exemple 3 [Z = (1 ,999) x CXCL101 + (2,852) x HA1, avec CXCLIO = -0, 1 16 et λΗΑ = -0,288]. Figure 16A: in ordinate, function ZI of example 1 [Z = (0.3686) x CXCL10 1 + (0.3064) x HA 1 , with CXCLIO = -0.013 and λΗΑ = 0.099]; on the abscissa, function Z4 of Example 3 [Z = (1, 999) × CXCL10 1 + (2.852) × HA 1 , with CXCLIO = -0, 1 16 and λΗΑ = -0.288].
Figure 16B : en ordonnée, sensibilité ; en abscisse, spécificité ; courbes de ZI et Z4.  Figure 16B: ordinate, sensitivity; on the abscissa, specificity; curves of ZI and Z4.
La transposition de la règle obtenue à partir de la population de 310 patients (fonction Z4), sur la population de 1 18 patients, permet d'obtenir des AUC similaires à celles obtenues avec les coefficients optimisés sur cette population (fonction Zi). On a ainsi pu constater qu'en dépit d'une grande différence de coefficients, les deux scores sont très corrélés et les courbes ROC sont proches. Les différences de sensibilité et spécificité s'expliquent essentiellement par le seuil qui lui aussi provient de la population de 310 patients. On pourrait parfaitement déterminer un seuil permettant d'obtenir des performances similaires. The transposition of the rule obtained from the population of 310 patients (function Z 4 ), on the population of 1 18 patients, makes it possible to obtain AUC similar to those obtained with the coefficients optimized on this population (function Zi). It has been found that despite a large difference in coefficients, the two scores are highly correlated and the ROC curves are close. The differences in sensitivity and specificity are mainly explained by the threshold which also comes from the population of 310 patients. One could perfectly determine a threshold allowing to obtain similar performances.
EXEMPLE 10 : combinaison de HA à CXCL10 en multiplex EXAMPLE 10 Combination of HA to CXCL10 in Multiplex
Des microplaques à puits pour criblage à haut débit (High Throughput Screening microplates) sont utilisées. Il s'agit de microplaques en polystyrène à 96 puits LUMITRAC™ 600 (fond F, « high binding », cheminée noire, volume maximal théorique d'un puits = 392 μί) disponibles auprès de GREINER BIO-ONE GmbH ; Maybachstrasse 2 ; DE 72636 Frickenhausen ; Allemagne (Référence catalogue 655 097). High Throughput Screening microplates are used. These are LUMITRAC ™ 600 96-well polystyrene microplates (F bottom, "high binding", black chimney, theoretical maximum well volume = 392 μί) available from GREINER BIO-ONE GmbH; Maybachstrasse 2; DE 72636 Frickenhausen; Germany (Catalog No. 655,097).
À l'aide d'un robot spotteur, on dépose des rangées de spots sur le fond de chaque puits (spot = goutte d'environ 50nL). Chaque spot contient un ligand de capture, à savoir soit un ligand de capture anti-CXCL10 humaine, soit un ligand de capture anti-HA humain. Le ligand de capture se fixe sur la surface du puits.  With the help of a robot spotteur, rows of spots are deposited on the bottom of each well (spot = drop of about 50nL). Each spot contains a capture ligand, either a human anti-CXCL10 capture ligand or a human anti-HA capture ligand. The capture ligand binds to the surface of the well.
Le ligand de capture anti-CXCL10 humaine est un anticorps monoclonal de souris anti- CXCL10 humaine, commercialisé par R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue MAB266 (clone 33036, classe IgGl). Le ligand de capture anti-HA humain est une protéine recombinante humaine aggrécane G1-IGD-G2 commercialisée par la société R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue 1220-PG-025. The anti-human CXCL10 capture ligand is a human anti-CXCL10 mouse monoclonal antibody, marketed by R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE; Minneapolis, MN 55413; USA), under the catalog number MAB266 (clone 33036, class IgG). The human anti-HA capture ligand is a human G1-IGD-G2 aggrecan recombinant protein marketed by R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under the catalog number 1220-PG- 025.
Les échantillons sont des échantillons de sérum ou de plasma de patients infectés par le VHC. Ils proviennent de l'Hôpital Haut-Levêque (1, avenue Magellan ; 33600 Pessac ; France) ou de l'Hôpital Beaujon (100, boulevard du Général Leclerc ; 92110 Clichy ; France). Il s'agit par exemple de ou des patients de l'exemple 3 ou de l'exemple 1. The samples are samples of serum or plasma from patients infected with HCV. They come from the Haut-Levêque Hospital (1 Magellan Avenue, 33600 Pessac, France) or the Beaujon Hospital (100, boulevard du Général Leclerc, 92110 Clichy, France). For example, these are patients of Example 3 or of Example 1.
Une gamme étalon de CXCL10 a été préparée en diluant une protéine CXCL10 recombinante (PEPROTECH ; Princeton Business Park ; 5 Crescent Avenue ; P.O. Box 275 ; Rocky Hill, NJ 08553 ; U.S.A. ; Référence catalogue 300-12) dans une solution tampon PBS {Phosphate Buffer Saline) à pH 7,4 contenant de l'albumine de sérum bovin à 5%, du glycérol à 20% et un conservateur à 0,1% (PROCLIN® 300 ; produit SUPELCO commercialisé par SIGMA- ALDRICH CHIMIE ; 38297 Saint-Quentin-Fallavier CEDEX ; France). A standard range of CXCL10 was prepared by diluting a recombinant CXCL10 protein (PEPROTECH, Princeton Business Park, Crescent Avenue, PO Box 275, Rocky Hill, NJ 08553, USA Catalog No. 300-12) in a PBS buffer solution (Phosphate). Saline buffer) at pH 7.4 containing 5% bovine serum albumin, 20% glycerol and a 0.1% preservative (PROCLIN® 300, SUPELCO product sold by SIGMA-ALDRICH CHIMIE, 38297 St. Quentin-Fallavier CEDEX, France).
Une gamme étalon de HA a été préparée en diluant un acide hyaluronique humain recombinant (R&D SYSTEMS ; Minneapolis ; U.S.A.) dans la solution tampon PBS à pH 7,4 qui contient de l'albumine de sérum bovin à 5%, du glycérol à 20%> et le conservateur PROCLIN® 300 à 0,1%. Dans chaque puits de la microplaque, sont distribués successivement (sur chaque spot) :A standard range of HA was prepared by diluting a recombinant human hyaluronic acid (R & D SYSTEMS, Minneapolis, USA) in PBS buffer solution pH 7.4 which contains 5% bovine serum albumin, 20% glycerol %> and the PROCLIN® 300 0.1% preservative. In each well of the microplate, are distributed successively (on each spot):
40 de la solution tampon PBS à pH 7,4 qui contient de l'albumine de sérum bovin à 5%, du glycérol à 20% et le conservateur PROCLIN® 300 à 0,1%, et 40 of the pH 7.4 PBS buffer solution which contains 5% bovine serum albumin, 20% glycerol and the 0.1% PROCLIN® 300 preservative, and
40 d'échantillon à analyser, ou d'une solution de la gamme étalon CXCL10, ou d'une solution de la gamme étalon HA. 40 sample to be analyzed, or a solution of the CXCL10 standard range, or a solution of the HA standard range.
Le mélange est mis en incubation pendant 40 min à 37°C sous agitation. The mixture is incubated for 40 min at 37 ° C with stirring.
Trois lavages successifs sont réalisés, chacun avec au moins 400 d'une solution de lavage (solution tampon TRIS 10 mM à pH 7,4 contenant NaCl 218 mM, TWEEN® 20 (SIGMA- ALDRICH CHIMIE ; 38297 Saint-Quentin-Fallavier CEDEX ; France ; Référence catalogue 2287) à 0,1%, et le conservateur PROCLIN® 300 à 0,002%.  Three successive washes were performed, each with at least 400 of a wash solution (10 mM TRIS buffer solution pH 7.4 containing 218 mM NaCl, TWEEN® 20 (SIGMA-ALDRICH CHEMISTRY, 38297 Saint-Quentin-Fallavier CEDEX; France, catalog number 2287) at 0.1%, and the conservator PROCLIN® 300 at 0.002%.
Dans chaque puits réactionnels, sont ensuite distribués (sur chaque spot) 50 μΐ, d'une solution tampon PBS 10 mM à pH 7,4 contenant du NaCl à 150 mM, du glycérol à 10%, de l'IgG de souris (MERIDIAN LIFE SCIENCE, Inc. ; 5171 Wilfong Road ; Memphis TN 38134 ; U.S.A. ; Référence catalogue A66185M) à 50 g/L, le conservateur PROCLIN® 300 à 0,1%, ainsi qu'un ligand de détection de la CXCL10 humaine à une concentration de 0,2 μ§/ηιΙ. et un ligand de ΓΗΑ humain à une concentration de 0,2 à 0,5 μg/mL. 50 μl of 10 mM PBS buffer solution containing 150 mM NaCl, 10% glycerol and mouse IgG are then dispensed into each reaction well (on each spot) (MERIDIAN). LIFE SCIENCE, Inc. 5171 Wilfong Road; Memphis TN 38134; USA Catalog No. A66185M) at 50 g / L, the curator 0.1% PROCLIN® 300, as well as a detection ligand for human CXCL10 at a concentration of 0.2 μ§ / ηιΙ. and a human lig ligand at a concentration of 0.2 to 0.5 μg / mL.
Le ligand pour la détection de CXCL10 est un anticorps polyclonal de chèvre anti- CXCL10 humaine couplé à la biotine, disponible auprès de R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A. ; Référence catalogue BAF266). Le ligand pour la détection de ΓΗΑ humain est la protéine recombinante aggrécane Gl- IGD-G2 couplée à la biotine, disponible auprès de R&D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE ; Minneapolis, MN 55413 ; U.S.A.), sous la référence catalogue 1220-PG-025. Le mélange est mis en incubation pendant 15 min à 37°C sous agitation.  The ligand for the detection of CXCL10 is a biotin-coupled human anti-CXCL10 goat polyclonal antibody, available from R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place, NE, Minneapolis, MN 55413, U.S.A., catalog number BAF266). The ligand for the detection of human est is the recombinant aggrecan Gl-IGD-G2 protein coupled to biotin, available from R & D SYSTEMS, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA), under catalog number 1220 -PG-025. The mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C. with stirring.
Trois lavages successifs sont réalisés, chacun avec au moins 400 d'une solution de lavage (solution tampon TRIS 10 mM à pH 7,4 contenant NaCl 218 mM, TWEEN® 20 (SIGMA- ALDRICH CHIMIE ; 38297 Saint-Quentin-Fallavier CEDEX ; France ; Référence catalogue 2287) à 0,1%, et le conservateur PROCLIN® 300 à 0,002%.  Three successive washes were performed, each with at least 400 of a wash solution (10 mM TRIS buffer solution pH 7.4 containing 218 mM NaCl, TWEEN® 20 (SIGMA-ALDRICH CHEMISTRY, 38297 Saint-Quentin-Fallavier CEDEX; France, catalog number 2287) at 0.1%, and the conservator PROCLIN® 300 at 0.002%.
Dans chaque puits réactionnel, est ensuite distribué le rapporteur, à savoir (sur chaque spot) 50 d'une solution tampon citrate 50 mM, pH 6,7, contenant NaCl 150 mM, EDTA 5,6 mM, TRITON® 2%, sérum de mouton 10%, IgG de souris 500 μg/mL, le conservateur PROCLIN® 300 0,5%, lait de vache (100% écrémé) 15%, glycérol 10%, NaN3 0,095%) et contenant en outre de la streptavidine couplée à la péroxydase de raifort (streptavidin-POD, disponible auprès de ROCHE DIAGNOSTICS GmbH ; Roche Applied Science ; 68298 Mannheim ; Allemagne ; Référence catalogue 11089153001) (cf. Nakane et Kawaoi 1974) à 3 μg/mL. In each reaction well, the reporter is then distributed, ie (on each spot) 50 of a 50 mM citrate buffer solution, pH 6.7, containing 150 mM NaCl, 5.6 mM EDTA, 2% TRITON®, serum of sheep 10%, mouse IgG 500 μg / mL, preservative PROCLIN® 300 0.5%, cow's milk (100% skimmed) 15%, glycerol 10%, NaN 3 0.095%) and additionally containing streptavidin coupled with horseradish peroxidase (streptavidin-POD, available from ROCHE DIAGNOSTICS GmbH, Roche Applied Science, 68298 Mannheim, Germany, Catalog No. 11089153001) (see Nakane and Kawaoi 1974) at 3 μg / mL.
Le mélange est mis en incubation pendant 15 min à 37°C sous agitation.  The mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C. with stirring.
Dans chaque puits réactionnel, sont ensuite distribués le substrat pour la révélation des réactions de chimioluminescence, à savoir (sur chaque spot) 25μΙ, de solution enhancerllum ol XLSE024L et 25 μΜ de solution de péroxyde XLSE024P [25 μΐ, de la solution (A) et 25 μΐ, de la solution (B) de l'ELISTAR ETA C Ultra ELISA, commercialisé par CYANAGEN ; Via degli Stradelli Guelfi 40/C ; 40138 Bologna ; Italie ; Référence catalogue XLSE024.0020]. In each reaction well, the substrate is then distributed for the revelation of the chemiluminescence reactions, namely (on each spot) 25 μl, of the XLSE024L enhancer solution and 25 μl of the peroxide solution XLSE024P [25 μl, of the solution (A)). and 25 μl of solution (B) of ELISTAR ETA C Ultra ELISA, marketed by CYANAGEN; Via degli Stradelli Guelfi 40 / C; 40138 Bologna; Italy; Catalog number XLSE024.0020].
Le mélange est mis en incubation pendant 1 min à 37°C sous agitation. L'acquisition du signal de luminescence est réalisée pendant 180 secondes. Les résultats des lectures sont directement traités par un système d'analyse d'image et enregistrés en Unités Relatives de Luminescence ou Relative light Unit (RLU). The mixture is incubated for 1 min at 37 ° C with stirring. The acquisition of the luminescence signal is carried out for 180 seconds. The results of the readings are directly processed by an image analysis system and recorded in Relative Units of Luminescence or Relative Light Unit (RLU).
Pour l'interprétation des résultats, pour chaque échantillon la concentration des bio marqueurs CXCLIO et HA est recalculée à l'aide de la gamme étalon de CXCLIO recombinant pour CXCLIO en pg/mL et de la gamme étalon de HA recombinant pour HA en ng/mL. For the interpretation of the results, for each sample the concentration of CXCLIO and HA bio markers is recalculated using the CXCLIO standard range of recombinant CXCLIO in pg / mL and the recombinant HA standard range for HA in ng / ml. mL.
Alternativement, le ligand de détection de la CXCLIO humaine et le ligand de ΓΗΑ humain peuvent être placés non pas chacun dans des spots distincts, mais au contraire tous deux dans un même spot. Dans ce cas, la détection sera faite de sorte à différencier les CXCLIO liées des HA liés, par exemple non pas en chimioluminescence, mais en fluorescence (à l'aide de deux fluorophores différents, l'un porté par le ligand de détection de CXCLIO, l'autre porté par le ligand de détection de HA). Alternatively, the detection ligand of the human CXCL10 and the human and ligand can be placed not each in separate spots, but instead both in the same spot. In this case, the detection will be made in such a way as to differentiate the bound CXCLIOs from the linked HAs, for example not in chemiluminescence, but in fluorescence (with the aid of two different fluorophores, one carried by the detection ligand of CXCLIO , the other worn by the HA detection ligand).
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US 6 986 995 B2  US 6,986,995 B2
US 8 489 335 B2 US 8,489,335 B2

Claims

REVENDICATIONS
1. Une méthode in vitro pour déterminer si le stade de fîbrose hépatique d'un sujet infecté par un ou plusieurs virus de l'hépatite a ou non dépassé celui des stades de fîbrose hépatique qui, selon le système de scores de fîbrose Metavir, est de score Fl, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 1. An in vitro method for determining whether the hepatic fibrosis stage of a subject infected with one or more hepatitis viruses has exceeded that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of the score F1, said method comprising the following steps:
i) sélectionner différents marqueurs biologiques, lesdits différents marqueurs biologiques sélectionnés consistant en : i) selecting different biological markers, said different selected biological markers consisting of:
a) l'acide hyaluronique ainsi que la protéine CXCLIO,  a) hyaluronic acid and the CXCLIO protein,
et  and
b) zéro, un, deux, trois ou quatre marqueur(s) additionnel(s) choisi(s) parmi la liste de marqueurs constituée par l'âge, l'Indice de Masse Corporelle, la charge virale et la dureté du foie,  (b) zero, one, two, three or four additional marker (s) selected from the list of markers consisting of age, body mass index, viral load and liver hardness,
ii) quantifier les différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) ii) quantify the different biological markers selected in step i)
en mesurant in vitro la concentration d'acide hyaluronique et la concentration de protéine CXCLIO dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet, et  by measuring in vitro the concentration of hyaluronic acid and the concentration of CXCL10 protein in a sample of biological fluid previously obtained from said subject, and
lorsqu'un, deux, trois ou quatre marqueurs additionnel(s) est(sont) choisi(s) parmi ladite liste de l'étape i)b) ci-dessus, et lorsque ce (ou ces) marqueur(s) additionnel(s) est(sont) ou comprennent un ou plusieurs marqueur(s) parmi l'âge, l'Indice de Masse Corporelle et la dureté du foie : en collectant la valeur de quantification de ce ou chacun de ces marqueur(s) additionnel(s) qui a été préalablement déterminée pour ou sur ledit sujet,  when one, two, three or four additional markers are (are) selected from said list of step i) b) above, and when this (or these) additional marker (s) ( s) is (are) or includes one or more markers among age, body mass index and liver hardness: by collecting the quantification value of that or each additional marker (s) ( s) which has been previously determined for or on the subject,
lorsqu'un, deux, trois ou quatre marqueurs additionnel(s) est(sont) choisi(s) parmi ladite liste de l'étape i)b) ci-dessus, et lorsque ce (ou ces) marqueur(s) additionnel(s) est(sont) ou comprennent la charge virale : en mesurant cette charge virale in vitro dans un échantillon de fluide biologique préalablement obtenu à partir dudit sujet, ou en collectant la valeur de cette charge virale qui a été préalablement déterminée pour ledit sujet, et  when one, two, three or four additional markers are (are) selected from said list of step i) b) above, and when this (or these) additional marker (s) ( s) is (are) or includes the viral load: by measuring this viral load in vitro in a biological fluid sample previously obtained from said subject, or by collecting the value of this viral load which has been previously determined for said subject, and
iii) comparer les valeurs de quantification obtenues à l'étape ii) à leurs valeurs, ou à la distribution de leurs valeurs, dans des cohortes de référence préétablies selon le stade de fîbrose hépatique, pour classer ledit sujet dans celle de ces cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance, lesdites cohortes de référence étant : iii) comparing the quantification values obtained in step ii) with their values, or the distribution of their values, in pre-established reference cohorts according to the hepatic fibrosis stage, to classify said subject in that of these reference cohorts vis-a-vis of which he has the highest probability of belonging, the reference cohorts being:
une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl, et  a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score, and
une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl,  a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score,
le classement dans ladite première cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet n'a pas dépassé celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl, the classification in said first cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has not exceeded that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score,
le classement dans ladite deuxième cohorte indiquant que le stade de fïbrose hépatique dudit sujet a dépassé celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl . the classification in said second cohort indicating that the hepatic fibrosis stage of said subject has exceeded that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score.
2. La méthode de la revendication 1, dans laquelle la comparaison de l'étape iii) est faite en combinant les valeurs de quantification obtenues pour ledit sujet dans un modèle de classification préalablement construit comme suit : 2. The method of claim 1, wherein the comparison of step iii) is made by combining the quantization values obtained for said subject in a classification model previously constructed as follows:
a) pour une population d'individus qui sont de la même espèce que ledit sujet, et qui sont infectés par le ou les mêmes virus de l'hépatite que ledit sujet, déterminer le stade de fïbrose hépatique de chacun desdits individus de la population, et les classer en sous- populations selon leur stade de fïbrose hépatique, constituant ainsi des cohortes de référence établies selon leur stade de fïbrose hépatique, lesdites cohortes de référence comprenant ou étant : (a) for a population of individuals who are of the same species as the said subject and who are infected with the same hepatitis virus or viruses as the said subject, determine the hepatic fibrosis of each of the said individuals in the population, and classify them into subpopulations according to their hepatic fibrosis stage, thus constituting reference cohorts established according to their hepatic fibrosis stage, said reference cohorts comprising or being:
une première cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus ne dépasse pas celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl, et  a first reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals does not exceed that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score, and
une deuxième cohorte de référence dans laquelle le stade de fïbrose hépatique des individus dépasse celui des stades de fïbrose hépatique qui, selon le système de scores de fïbrose Metavir, est de score Fl ;  a second reference cohort in which the hepatic fibrosis stage of the individuals exceeds that of the hepatic fibrosis stages which, according to the Metavir fibrosis scoring system, is of Fl score;
β) pour chacun desdits individus, quantifier les différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) de la revendication 1, β) for each of said individuals, quantifying the different biological markers selected in step i) of claim 1,
et γ) faire une comparaison inter-cohorte des valeurs de quantification obtenues à l'étape β), ou de la distribution de ces valeurs, pour construire un modèle de classification, qui, à partir de valeurs de quantification desdits marqueurs biologiques sélectionnés, induit un classement dans l'une desdites cohortes de référence. and γ) making an inter-cohort comparison of the quantification values obtained in step β), or of the distribution of these values, to construct a classification model, which, based on quantification values of said selected biological markers, induces a ranking in one of the said reference cohorts.
3. La méthode de la revendication 1 ou 2, dans laquelle lesdits différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) consistent en : 3. The method of claim 1 or 2, wherein said different biological markers selected in step i) consist of:
a) l'acide hyaluronique ainsi que la protéine CXCL10,  a) hyaluronic acid as well as the protein CXCL10,
et  and
b) zéro, un, deux ou trois marqueur(s) additionne l(s) choisi(s) parmi la liste de marqueurs constituée par l'âge, l'Indice de Masse Corporelle, la charge virale et la dureté du foie.  (b) zero, one, two or three additional marker (s) from the list of markers consisting of age, Body Mass Index, viral load and liver hardness.
4. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdits différents marqueurs biologiques sélectionnés à l'étape i) consistent en : 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein said different biological markers selected in step i) consist of:
- l'acide hyaluronique et la protéine CXCL10, ou  hyaluronic acid and the CXCL10 protein, or
- l'acide hyaluronique, la protéine CXCL10, l'âge et l'Indice de Masse Corporelle, ou hyaluronic acid, CXCL10 protein, age and Body Mass Index, or
- l'acide hyaluronique, la protéine CXCL10, l'âge, l'Indice de Masse Corporelle et la charge virale, ou hyaluronic acid, CXCL10 protein, age, body mass index and viral load, or
- l'acide hyaluronique, la protéine CXCL10 et la dureté du foie. hyaluronic acid, CXCL10 protein and liver hardness.
5. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite comparaison de l'étape iii) de la revendication 1 est faite : The method according to any one of claims 1 to 4, wherein said comparison of step iii) of claim 1 is made:
- par apprentissage automatique, ou  - by automatic learning, or
- par régression logistique, ou  - by logistic regression, or
- par mROC.  - by mROC.
6. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite comparaison de l'étape iii) de la revendication 1 est faite : The method according to any one of claims 1 to 5, wherein said comparison of step iii) of claim 1 is made:
par apprentissage automatique en suivant l'arbre décisionnel de la Figure 12 avec by machine learning by following the decision tree of Figure 12 with
40≤h≤80  40≤h≤80
150 < i≤ 300  150 <i≤ 300
400≤j≤620 ou 400≤j≤620 or
par régression logistique à l'aide de la fonction LOGITi, ladite fonction LOGITi étant : by logistic regression using the LOGITi function, said LOGITi function being:
LOGIT = Intercept + k(CXCL10) + 1(HA), avec  LOGIT = Intercept + k (CXCL10) + 1 (HA), with
-5≤ Intercept≤ -1  -5≤ Intercept≤ -1
0,001≤k≤ 0,010  0.001≤k≤ 0.010
0,010≤1≤ 0,050.  0.010≤1≤ 0.050.
ou or
par mROC à l'aide de la fonction Z13, ladite fonction Z13 étant by mROC using the function Z 13 , said function Z 13 being
Z = a(CXCL10l) + b(HAl) + c(IMCl) + d(Âgel) + e(CVl) + f(FSl) Z = a (CXCL10 l ) + b (HA l ) + c (IMC l ) + d (Age l ) + e (CV l ) + f (FS l )
avec :  with:
a et b étant chacun, indépendamment l'un de l'autre, un nombre réel positif allant de +0, 1 à +6,0 mais différent de zéro,  a and b being each, independently of each other, a positive real number ranging from +0.1 to +6.0 but not equal to zero,
c, d, e, et f étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -10,0 à +10,0,  c, d, e, and f each being, independently of one another, a real number ranging from -10.0 to +10.0,
l'exposant t indiqué indiquant que la valeur à appliquer dans la fonction est la transformée Box-Cox de la valeur mesurée pour le marqueur considéré (BMQ), t λ afin de normaliser cette valeur mesurée selon la formule suivante : BMQ = (BMQ - 1) / λ, et  the exponent t indicated that the value to be applied in the function is the Box-Cox transform of the measured value for the considered marker (BMQ), t λ in order to normalize this measured value according to the following formula: BMQ = (BMQ - 1) / λ, and
la valeur de λ pour chacun des marqueurs CXCL10 (λεχ< ιο), HA ( HA), IMC ( ΐΜθ), Âge (^Âge), CV (λον) et FS ( Fs) étant chacun, indépendamment les uns des autres, un nombre réel allant de -6,0 à 1 ,2 mais différent de zéro. the value of λ for each of the markers CXCL10 (λ ε χ), HA ( H A), IMC (ΐΜθ), age (Â g ), CV (λον) and FS ( F s) being each, independently from each other, a real number ranging from -6.0 to 1, 2 but different from zero.
7. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ladite comparaison de l'étape iii) de la revendication 1 est faite en classant ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance avec une sensibilité d'au moins 75% et/ou avec une Valeur de Prédiction Négative d'au moins 75%. 7. The method according to any of claims 1 to 6, wherein said comparison of step iii) of claim 1 is made by classifying said subject in that of said reference cohorts against which he has the highest probability of belonging with a sensitivity of at least 75% and / or a Negative Prediction Value of at least 75%.
8. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ladite comparaison de l'étape iii) de la revendication 1 est faite en classant ledit sujet dans celle desdites cohortes de référence vis-à-vis de laquelle il a la plus forte probabilité d'appartenance avec au moins l'une des deux performances 1/ et 21 ci-dessous : 1/ une spécificité d'au moins 85% et/ou une Valeur de Prédiction Positive d'au moins 85%, The method according to any one of claims 1 to 7, wherein said comparison of step iii) of claim 1 is made by classifying said subject in that of said reference cohorts against which he has the highest probability of belonging with at least one of the two performances 1 / and 21 below: 1 / a specificity of at least 85% and / or a Positive Prediction Value of at least 85%,
21 un taux de bonne classification d'au moins 80%> et/ou une aire sous la courbe ROC d'au moins 0,800.  21 a good classification rate of at least 80% and / or an area under the ROC curve of at least 0.800.
9. La méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle, à l'étape ii) de la revendication 1 , la mesure de la concentration d'acide hyaluronique et la mesure de la concentration de protéine CXCL10 sont faites en multiplex. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein in step ii) of claim 1, the measurement of the concentration of hyaluronic acid and the measurement of the concentration of protein CXCL10 are made in multiplex.
10. Un article manufacturé qui est adapté à la détection en multiplex de molécules contenues sous forme acellulaire dans un échantillon de fluide biologique, et qui comprend un support solide sur lequel sont fixés des ligands desdites molécules, dans lequel les ligands desdites molécules sont constitués par : 10. A manufactured article which is adapted for the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a biological fluid sample, and which comprises a solid support to which ligands of said molecules are attached, wherein the ligands of said molecules are constituted by :
- une première protéine, qui est une protéine qui se lie de manière spécifique à HA, et  a first protein, which is a protein that binds specifically to HA, and
- une deuxième protéine, qui est une protéine qui se lie de manière spécifique à la protéine CXCL10.  a second protein, which is a protein that specifically binds to the CXCL10 protein.
1 1. L'article manufacturé de la revendication 10, dans lequel ledit support solide est une plaque ou microplaque à puits, une puce en silicium, un capillaire en verre, une lame de verre, des billes magnétiques, une membrane. 1. The manufactured article of claim 10, wherein said solid support is a well plate or microplate, a silicon chip, a glass capillary, a glass slide, magnetic beads, a membrane.
12. Une composition qui est adaptée à la détection en multiplex de molécules contenues sous forme acellulaire dans un échantillon de fluide biologique, et comprend en mélange des ligands desdites molécules, dans laquelle les ligands desdites molécules sont constitués par : 12. A composition which is adapted to the multiplex detection of molecules contained in acellular form in a sample of biological fluid, and comprises in a mixture of ligands of said molecules, in which the ligands of said molecules are constituted by:
- une première protéine, qui est une protéine qui se lie de manière spécifique à HA, et qui porte un premier marqueur de détection, et  a first protein, which is a protein which binds specifically to HA, and which carries a first detection marker, and
- une deuxième protéine, qui est une protéine qui se lie de manière spécifique à la protéine CXCL10, et qui porte un deuxième marqueur de détection,  a second protein, which is a protein which binds specifically to the CXCL10 protein, and which carries a second detection marker,
dans laquelle ledit premier marqueur de détection est différent dudit deuxième marqueur de détection. wherein said first detection marker is different from said second detection marker.
13. Un kit qui comprend des acides nucléiques qui se lient de manière spécifique à un ou des virus de l'hépatite, et qui comprend en outre des ligands qui se lient à des molécules contenues sous forme acellulaire dans un fluide biologique, lesdits ligands étant contenus dans le kit en préparation combinée pour une utilisation simultanée, lesdits ligands étant constitués par : A kit which comprises nucleic acids which specifically bind to one or more hepatitis viruses, and which further comprises ligands which bind to acellular-contained molecules in a biological fluid, said ligands being contained in the kit in a combined preparation for simultaneous use, said ligands being constituted by:
- une première protéine qui se lie de manière spécifique à HA, et qui porte un premier marqueur de détection, et  a first protein which binds specifically to HA, and which carries a first detection marker, and
- une deuxième protéine qui se lie de manière spécifique à CXCL10, et qui porte un deuxième marqueur de détection,  a second protein which binds specifically to CXCL10 and which carries a second detection marker,
dans lequel ledit deuxième marqueur de détection est différent dudit premier marqueur de détection. wherein said second detection marker is different from said first detection marker.
14. Le kit de la revendication 13, qui comprend en outre l'article manufacturé de la revendication 10 ou 11. The kit of claim 13 which further comprises the manufactured article of claim 10 or 11.
15. Produit programme d'ordinateur, destiné à être stocké dans une mémoire d'une unité de traitement, ou sur un support mémoire amovible destiné à coopérer avec un lecteur de ladite unité de traitement, caractérisé en ce qu'il comprend des instructions pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 15. Computer program product, intended to be stored in a memory of a processing unit, or on a removable memory medium intended to cooperate with a reader of said processing unit, characterized in that it comprises instructions for the implementation of a method according to any one of claims 1 to 9.
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