WO2013053381A1 - Method and device for determining a substance concentration by means of fluorescence spectroscopy - Google Patents

Method and device for determining a substance concentration by means of fluorescence spectroscopy Download PDF

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WO2013053381A1 PCT/EP2011/067718 EP2011067718W WO2013053381A1 WO 2013053381 A1 WO2013053381 A1 WO 2013053381A1 EP 2011067718 W EP2011067718 W EP 2011067718W WO 2013053381 A1 WO2013053381 A1 WO 2013053381A1
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    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction

Definitions

  • the first reference phase position results at a known substance concentration in the sample, preferably in the absence of the substance in the sample, and can be obtained, in particular, by dividing said first radiation into at least two portions before striking the sample by means of a beam splitter one of which is directed to the sample and the other essentially directly to the detector. If one now uses the phase shift of the signal with the first modulation frequency and the signal with the second modulation frequency, the evaluation according to the method described by Jameson et al. proposes proposed solution, it is possible to eliminate the effects of stray light and autofluorescence of the sample within certain limits evaluation technology.
  • a “beam splitter” is understood to mean any optical element which is suitable for dividing the first radiation into at least two components, namely a (preferably comparatively small) component, in particular scattered component, which passes directly to the detector as reference radiation, and one
  • the beam splitter serves at least partially to redirect the fluorescence radiation emitted by the specimen in the direction of the detector, which advantageously can be linked to a filter function so that only certain, preferably relatively, ones are associated
  • a dichroic mirror may be used in this context (see below), but the invention would not be restricted to such beam headers
  • First radiation essentially in that due to scattered light effects of the overall arrangement, in particular so the mirror environment, a small proportion of radiation passes directly to the detector.
  • At least one first radiation source which is designed to emit at least one first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum;
  • At least one first modulation means adapted to modulate the intensity of the first radiation having at least a first and a second modulation frequency which are different;
  • At least one beam splitter adapted and arranged to direct a first portion of the first radiation to the sample and a second portion of the first radiation to the detector;
  • the reference object is generally chosen such that it shows substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration to be determined, but a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature occurs.
  • the invention is limited in this context to the use of ruby as a reference object.
  • the evaluation electronics are designed to evaluate the first or third radiation detected by the detector with the fourth modulation frequency with respect to its phase position relative to a third reference phase position in order additionally to optically determine a temperature of the sample.
  • At least the second radiation source, the sample, the detector and optionally the filter element are arranged on a common side of the beam dispenser, preferably within the housing, whereby a particularly achieve compact design and a correspondingly flexible usability of the device.
  • FIG. 2 shows schematically another embodiment of the device according to the invention, which is suitable for carrying out an alternative embodiment of the method according to the invention.
  • FIG. 1 schematically shows a device for determining a substance concentration, preferably an oxygen concentration by means of fluorescence spectroscopy, which device is denoted by the reference numeral 1 in its entirety.
  • the device 1 comprises at reference 2 a first radiation source in the form of a green luminescence diode (LED) with a wavelength of

Abstract

The invention relates to a method and a device for determining a substance concentration by means of fluorescence spectroscopy. A sample (5) is impinged with at least one first electromagnetic radiation (S1), the intensity of which is modulated with at least two different modulation frequencies (f1, f2). A fluorescent radiation (S1') emitted by the sample (5) is determined by means of a detector (6) and analyzed with respect to the phase position of the fluorescent radiation relative to a respective first reference phase position for each modulation frequency, said reference phase position resulting for a known substance concentration in the sample (5), preferably an absence of the substance in the sample. The detector (6) is also impinged with at least one second electromagnetic radiation, the intensity of which is modulated with at least one third modulation frequency (f3) that is different from the first and the second modulation frequency. The second radiation (S2) does not interact with the sample (5), and the second radiation (S2) that is incident on the detector (6) is analyzed with respect to the phase position of the second radiation relative to a second reference phase position in order to determine the substance concentration in the sample (5) independently of state changes.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung einer Stoffkonzentration  Method and device for determining a substance concentration
mittels Fluoreszenzspektroskopie  by fluorescence spectroscopy
Beschreibung description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 zum Bestimmen einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoff- konzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, wobei eine Probe mit wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung beaufschlagt wird, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, wobei die erste Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, in ihrer Intensität moduliert wird, und wobei eine von der Probe ausge- sandte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Detektors bestimmt und für jede Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage mittels einer Auswerteelektronik ausgewertet wird, welche erste Referenzphasenlage sich bei einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe ergibt, vorzugsweise bei einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen. The present invention relates to a method according to the preamble of claim 1 for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, wherein a sample is subjected to at least a first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum, wherein the first radiation with at least a first and a second modulation frequency which are different in their intensity is modulated, and wherein a fluorescence emitted by the sample fluorescence emitted by a detector and evaluated for each modulation frequency with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position by means of an evaluation, which first reference phase position results in a known substance concentration in the sample, preferably in the absence of the substance in the sample, to determine the substance concentration in the sample.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 3 zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, umfassend: wenigstens eine erste Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums; wenigstens eine erste Modufationseinrichtung, die zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist; we- nigstens eine Probe, die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren; einen Detektor, der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist; wenigstens einen Strahlteiler, der dazu ausge- bildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung auf die Probe und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den Detektor zu lenken und eine Auswerteelektronik, die in signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor steht und die dazu ausgebildet ist, eine von der Probe ausgesandte und mittels des Detektors bestimmte Fluoreszenzstrahlung für die erste und die zweite Mo- dulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage auszuwerten, welche erste Referenzphasenlage einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe entspricht, vorzugsweise einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen. Furthermore, the invention relates to a device according to the preamble of claim 3 for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, comprising: at least a first radiation source, which is designed to emit at least a first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum; at least one first modulating means adapted to modulate the intensity of the first radiation having at least a first and a second modulation frequency which are different; at least one sample, which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is adapted to emit a dependent on the concentration of the substance to be determined fluorescence radiation; a detector configured to detect the first radiation and disposed in the optical path of the first radiation; at least one beam splitter configured and arranged to direct a first portion of the first radiation to the sample and a second portion of the first radiation to the detector and one Evaluation electronics which is in operative operative connection with the detector and which is designed to evaluate a fluorescence radiation emitted by the sample and determined by the detector for the first and the second modulation frequency with regard to their phase position relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position a known substance concentration in the sample, preferably a lack of the substance in the sample to determine the substance concentration in the sample.
Ein derartiges Verfahren bzw. eine derartige Vorrichtung sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Dabei macht man sich den physikalischen Effekt zunutze, dass die von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung zumindest bei bestimmten Stoffen und bei geeigneter Wahl der Wellenlänge der ersten Strahlung sich in Abhängigkeit von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes in ihrem Abklingverhalten verändert („Quenching" bei Sauerstoff). Die Konzentrati- onsbestimmung erfolgt anhand der Phasenverschiebung zwischen der Anregungsstrahlung und der Fiuoreszenzstrahlung. Dies ist beispielsweise in dem Artikel„The Measurement and Analysis of Heterogeneous Emissions by Mul- tifrequency Phase and Modulation Fluorometry" von Jameson et al. , Applied Spectroscopy Reviews 20(1), 55-106 (1984), beschrieben, welcher beispielswei- se von Lakowicz in dem Buch„Principles of Fluorescence Spectroscopy", 3. Auflage, Springer (2006) zitiert wird. Such a method or such a device are generally known to the person skilled in the art. In this case, the physical effect is utilized that the fluorescence radiation emitted by the sample, at least for certain substances and with a suitable choice of the wavelength of the first radiation, changes in its decay behavior as a function of the concentration of the substance to be determined ("quenching" in the case of oxygen). Concentration is determined by the phase shift between the excitation radiation and the fluorescence radiation, for example, in the article "The Measurement and Analysis of Heterogeneous Emissions by Multiprequency Phase and Modulation Fluorometry" by Jameson et al. , Applied Spectroscopy Reviews 20 (1), 55-106 (1984), which is cited, for example, by Lakowicz in the book "Principles of Fluorescence Spectroscopy", 3rd Edition, Springer (2006).
Mit dem von Jameson et al. vorgeschlagenen und bei Lakowicz zitierten Ansatz einer Zwei-Frequenz-Messung (zwei unterschiedliche Modulationsfrequenzen für die erste Strahlung) lassen sich Streulicht- und Autofluoreszenz-Einflüsse eliminieren, welche nicht auf die zu messende Stoffkonzentration in der Probe zurückzuführen sind. Hierzu gehören auch weitere„optische Fehler", wie Einflüsse von Filtermaterial, Klebstoffen oder dergleichen. Diese Einflüsse addieren sich in der Auswerteelektronik zusammen mit der auf den zu messenden Stoff rück- führbaren Phasenverschiebung zu einer Gesamt-Phasenverschiebung des Fluoreszenzsignals (Fluoreszenzstrahlung) gegenüber dem Anregesignal (zur ersten Strahlungsquelle ausgesandte erste Strahlung). With the Jameson et al. proposed and quoted by Lakowicz approach of a two-frequency measurement (two different modulation frequencies for the first radiation) can eliminate stray light and autofluorescence influences, which are not due to the measured substance concentration in the sample. This also includes other "optical defects", such as influences of filter material, adhesives or the like These influences add up in the evaluation electronics together with the phase shift attributable to the substance to be measured to an overall phase shift of the fluorescence signal (fluorescence radiation) with respect to the excitation signal (First radiation emitted to the first radiation source).
Mit dem vorbekannten Ansatz ist es - wie bereits ausführt - möglich, optische Störeinflüsse durch Streulicht, Autofluoreszenz der Probe oder dergleichen bei der Auswertung zu eliminieren. Es hat sich jedoch als nachteilig herausgestellt, dass insbesondere Störeinflüsse seitens der Auswerteelektronik selbst, wie deren Temperaturgang etc., mit den vorbekannten Ansätzen nicht erkannt bzw. eliminiert werden können, was die erreichbare Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung negativ beeinflusst. With the previously known approach it is possible, as already stated, to eliminate optical interference caused by scattered light, autofluorescence of the sample or the like in the evaluation. However, it has proved disadvantageous that in particular disturbances on the part of the evaluation itself, such as their temperature response, etc., can not be detected or eliminated with the previously known approaches, which adversely affects the achievable accuracy of the concentration determination.
Die Gesamt-Phasenverschiebung des auszuwertenden Detektionssignals ergibt sich nämlich als Summe mehrerer Phasenverschiebungsanteile, insbesondere eines ersten Phasenverschiebungsanteils aufgrund der eingesetzten Auswerteelektronik, eines zweiten Phasenverschiebungsanteils aufgrund der im Strah- lengang vorhandenen optischen Elemente sowie eines dritten Phasenverschiebungsanteils, welcher durch die Probe selbst und insbesondere durch den dort vorhandenen Stoff, dessen Konzentration bestimmt werden soll, bedingt ist. The total phase shift of the detection signal to be evaluated is obtained as the sum of a plurality of phase shift components, in particular a first phase shift component due to the evaluation electronics used, a second phase shift component due to the optical elements present in the beam path and a third phase shift component generated by the sample itself and in particular by the sample existing substance whose concentration is to be determined is conditional.
Der Erfindung liegt die technische Aufgabe zurgrunde, das Verfahren und die Vorrichtung der eingangs genannten Art hinsichtlich der erreichbaren Messgenauigkeit zu verbessern. Dabei ist angestrebt, die durch die eingesetzte Auswerteelektronik und die verwendeten optischen Elemente hervorgerufene Phasenverschiebung bei der Auswertung zu eliminieren, um anschließend über die verbleibende Phasenverschiebung mit erhöhter Genauigkeit auf die zu bestim- mende Stoffkonzentration an der Probe schließen zu können. The invention is based on the technical task of improving the method and the device of the type mentioned in terms of the achievable measurement accuracy. In this case, it is desirable to eliminate the phase shift caused by the evaluation electronics used and the optical elements used in the evaluation, in order subsequently to be able to conclude with increased accuracy on the substance concentration to be determined on the sample via the remaining phase shift.
Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie mittels einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 3. Vorteilhafte Weiterbildungen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind jeweils Gegenstand von Unteransprüchen, deren Wortlaut hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird, um unnötige Textwiederholungen nach Möglichkeit zu vermeiden. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere zum Bestimmen einer Sauerstoffkonzentration. This object is achieved by means of a method having the features of claim 1 and by means of a device having the features of claim 3. Advantageous developments of this method and the device according to the invention are the subject of subclaims, the wording of which is hereby incorporated by express reference in the description to avoid unnecessary text repetition whenever possible. The method according to the invention or the device according to the invention is particularly suitable for determining an oxygen concentration.
Dabei ist verfahrenstechnisch vorgesehen, dass eine Probe, die geeignet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs (z. B. Sauerstoff, 02) in ihren Eigenschaften abhängige, vorzugsweise zu der Konzentration proportionale Fluoreszenzstrahlung zu emittieren, mit wenigstens einer ersten elektromag- netischen Strahlung beaufschlagt wird. Diese Strahlung ist vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt. Weiterhin ist vorgesehen, dass die genannte erste Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, in ihrer Intensität moduliert wird, wie es bereits aus dem Stand der Technik bekannt ist. Anschließend wird eine von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Detektors bestimmt und für jede Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage mittels einer Auswerteelektronik ausgewertet. Die erste Referenzphasenlage ergibt sich bei einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe, vorzugsweise bei einem Fehlen des Stoffs in der Probe, und lässt sich insbesondere dadurch erhalten, dass die genannte erste Strahlung vor dem Auftreffen auf die Probe mittels eines Strahlteilers in wenigstens zwei Anteile aufgeteilt wird, von denen einer auf die Probe und der andere im Wesentlichen direkt auf den Detektor geleitet wird. Wenn man nun anhand der Phasenverschiebung des Signals mit der ersten Modulationsfrequenz und des Signals mit der zweiten Modulationsfrequenz die Auswertung nach dem von Jameson et al. vorgeschlagenen Lösungsansatz vornimmt, gelingt es, die Einflüsse von Streulicht und Autofluoreszenz der Probe in bestimmten Grenzen auswertetechnisch zu eliminieren. In this case, it is procedurally provided that a sample which is suitable for emitting fluorescence radiation which is dependent on the concentration of the substance to be determined (for example oxygen, O 2 ) and whose properties are preferably proportional to the concentration, is provided with at least one first electromag - is subjected to magnetic radiation. This radiation is preferably located in the visible region of the electromagnetic spectrum. It is further provided that the said first radiation having at least a first and a second modulation frequency, which are different, is modulated in intensity, as is already known from the prior art. Subsequently, a fluorescence radiation emitted by the sample is determined by means of a detector and evaluated for each modulation frequency with respect to its phase position relative to a respective first reference phase position by means of evaluation electronics. The first reference phase position results at a known substance concentration in the sample, preferably in the absence of the substance in the sample, and can be obtained, in particular, by dividing said first radiation into at least two portions before striking the sample by means of a beam splitter one of which is directed to the sample and the other essentially directly to the detector. If one now uses the phase shift of the signal with the first modulation frequency and the signal with the second modulation frequency, the evaluation according to the method described by Jameson et al. proposes proposed solution, it is possible to eliminate the effects of stray light and autofluorescence of the sample within certain limits evaluation technology.
Unter einem„Strahlteiler" wird im Rahmen dieser Beschreibung jedes optische Element verstanden, welches dazu geeignet ist, die erste Strahlung in wenigstens zwei Anteile aufzuteilen, nämlich einen (vorzugsweise vergleichsweise kleinen) Anteil, insbesondere Streuanteils der als Referenzstrahlung direkt zum Detektor gelangt, und einen anderen (vergleichsweise deutlich größeren) Anteil, der als Anregungsstrahlung für die Probe dient. Außerdem dient der Strahlteiler dazu, die von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung zumindest teilweise in Richtung Detektor umzulenken. Hiermit kann vorteilhafterweise eine Filterfunktion verknüpft sein, so dass nur bestimmte, vorzugsweise relativ langwellige An- teile der Fluoreszenzstrahlung zum Detektor gelangen. Beispielsweise kann in diesem Zusammenhang ein dichroitischer Spiegel Anwendung finden (siehe unten), ohne dass die Erfindung jedoch auf derartige Strahlteiter beschränkt wäre. Bei einem solchen Spiegel erfolgt die„Aufteilung" der ersten Strahlung im Wesentlichen dadurch, dass aufgrund von Streulichteffekten der Gesamtanordnung, insbesondere also der Spiegelumgebung, ein kleiner Strahlungsanteil direkt zum Detektor gelangt. Wie der Fachmann weiterhin erkennt, können für die Auftei- lung der ersten Strahlung und für die Umlenkung/Filterung der Fluoreszenzstrahlung auch mehrere getrennte Elemente Verwendung finden. In the context of this description, a "beam splitter" is understood to mean any optical element which is suitable for dividing the first radiation into at least two components, namely a (preferably comparatively small) component, in particular scattered component, which passes directly to the detector as reference radiation, and one In addition, the beam splitter serves at least partially to redirect the fluorescence radiation emitted by the specimen in the direction of the detector, which advantageously can be linked to a filter function so that only certain, preferably relatively, ones are associated For example, a dichroic mirror may be used in this context (see below), but the invention would not be restricted to such beam headers First radiation essentially in that due to scattered light effects of the overall arrangement, in particular so the mirror environment, a small proportion of radiation passes directly to the detector. As the person skilled in the art continues to recognize, for the purpose of tion of the first radiation and for the deflection / filtering of the fluorescence radiation also find several separate elements use.
Um zusätzlich auch die Einflüsse der eingesetzten Auswerteelektronik eliminie- ren zu können, insbesondere deren Temperaturgang wird im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgeschlagen, dass der Detektor zusätzlich mit wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung beaufschlagt wird, welche vorzugsweise ebenfalls im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. Dabei wird die genannte zweite Strahlung mit wenigstens einer dritten Modulationsfrequenz in ihrer Frequenz moduliert, welche dritte Modulationsfrequenz von der ersten Modulationsfrequenz und der zweiten Modulationsfrequenz verschieden ist. Wesentlich dabei ist, dass die zweite Strahlung erfindungsgemäß nicht mit der Probe wechselwirkt und nach ihrem Eintreffen einen Detektor hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer zweiten Referenz- phasenlage mittels der Auswerteelektronik ausgewertet wird. In order additionally to be able to eliminate the influences of the evaluation electronics used, in particular their temperature response, it is proposed in the course of the method according to the invention that the detector additionally be subjected to at least a second electromagnetic radiation, which is preferably also located in the visible region of the electromagnetic spectrum. In this case, the said second radiation is modulated in frequency with at least one third modulation frequency, which third modulation frequency is different from the first modulation frequency and the second modulation frequency. It is essential here that the second radiation according to the invention does not interact with the sample and, after its arrival, a detector is evaluated with respect to its phase position relative to a second reference phase position by means of the evaluation electronics.
Auf diese Weise lässt sich die Stoffkonzentration in der Probe unabhängig von Zustandsänderungen, insbesondere temperaturbedingten Zustandsänderungen oder einer Phasendrift der Auswerteelektronik bestimmen. Wesentlich dabei ist, dass zusätzlich zu der vorbekannten Zwei-Frequenz-Technik zusätzlich eineIn this way, the substance concentration in the sample can be determined independently of changes in state, in particular temperature-induced changes in state or a phase drift of the evaluation. It is essential that in addition to the previously known two-frequency technology in addition to a
Zwei-Strahlungsquellen-Technik zum Einsatz kommt, wobei die Auswertung aller Signale mittels ein und derselben Auswerteelektronik erfolgt. Da die zweite Strahlung nicht mit der Probe sondern im Wesentlichen nur mit der Auswerteelektronik„wechselwirkt", kann sie dazu verwendet werden, das Gesamt- Messergebnis bzw. die ermittelte Gesamt-Phasenverschiebung hinsichtlich der Einflüsse, insbesondere des Temperaturgangs, der Auswertelektronik zu korrigieren. Als zweite Referenzphasenlage kann hierbei eine Phasenlage der zweiten Strahlung bzw. des zugehörigen Detekttonssignals am Detektor herangezogen werden, welche sich unter Referenzbedingungen, beispielsweise bei einer bekannten Referenztemperatur, ergibt. Two-radiation source technology is used, wherein the evaluation of all signals by means of one and the same transmitter takes place. Since the second radiation does not "interact" with the sample but essentially only with the evaluation electronics, it can be used to correct the overall measurement result or the determined total phase shift with regard to the influences, in particular the temperature response, of the evaluation electronics second reference phase position can hereby be a phase of the second radiation or the associated Detekttonssignals be used on the detector, which results under reference conditions, for example at a known reference temperature.
Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmte erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst zunächst folgende Elemente: A device according to the invention intended for carrying out the method according to the invention initially comprises the following elements:
— wenigstens eine erste Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums; — wenigstens eine erste Modulationseinrichtung, dazu zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist;At least one first radiation source, which is designed to emit at least one first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum; At least one first modulation means adapted to modulate the intensity of the first radiation having at least a first and a second modulation frequency which are different;
— wenigstens eine Probe, die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren;- At least one sample, which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is adapted to emit a dependent on the concentration of the substance to be determined fluorescence radiation;
— einen Detektor, der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist; A detector which is designed to detect the first radiation and is arranged in the beam path of the first radiation;
— wenigstens einen Strahlteiler, der dazu ausgebildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung auf die Probe und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den Detektor zu lenken;  At least one beam splitter adapted and arranged to direct a first portion of the first radiation to the sample and a second portion of the first radiation to the detector;
— eine Auswerteelektronik, die in signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor steht und die dazu ausgebildet ist, eine von der Probe ausgesandte und mittels des Detektors bestimmte Fluoreszenzstrahlung für die erste und die zweite Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage auszuwerten, welche erste Referenzphasenlage einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe entspricht, vorzugsweise einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.  - An evaluation, which is in operative signal connection with the detector and which is adapted to evaluate a emitted from the sample and determined by the detector fluorescence radiation for the first and the second modulation frequency with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position a known substance concentration in the sample, preferably a lack of the substance in the sample to determine the substance concentration in the sample.
Diese bereits aus dem Stand der Technik bekannten Elemente werden erfindungsgemäß noch ergänzt durch wenigstens eine zweite Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, welche vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. Die zweite Strahlungsquelle ist derart angeordnet, dass die zweite Strahlung den Detektor ohne Wechselwirkung mit der Probe erreicht. Weiterhin ist wenigstens eine zweite Modulationseinrichtung vorgesehen, die zum Modellieren der Intensität der zweiten Strahlung mit wenigstens einer dritten Modulationsfrequenz ausgebildet ist. Die dritte Modulationsfrequenz ist von der ersten Modulationsfrequenz und der zweiten Modulationsfrequenz verschieden. Schließlich ist der Detektor zum Detektieren der zweiten Strahlung ausgebildet, und die Auswerteelektronik ist dazu ausgebildet, die vom Detektor detektierte zweite Strahlung hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu der bereits angesprochenen zweiten Referenzphasenlage auszuwerten, um die Stoffkonzentration in der Probe unabhängig von Zustandsänderungen, ins- besondere von temperaturbedingten Zustandsänderungen, der Auswerteelektronik zu bestimmen. According to the invention, these elements, which are already known from the prior art, are supplemented by at least one second radiation source, which is designed to emit at least one second electromagnetic radiation, which is preferably located in the visible region of the electromagnetic spectrum. The second radiation source is arranged such that the second radiation reaches the detector without interaction with the sample. Furthermore, at least one second modulation device is provided, which is designed to model the intensity of the second radiation with at least one third modulation frequency. The third modulation frequency is different from the first modulation frequency and the second modulation frequency. Finally, the detector is designed to detect the second radiation, and the evaluation electronics are designed to evaluate the second radiation detected by the detector with regard to its phase position relative to the already mentioned second reference phase position in order to monitor the substance concentration in the sample independently of changes in state, in particular special of temperature-related state changes, to determine the transmitter.
Kern der vorliegenden Erfindung ist demnach die vorstehend beschriebene Aus- gestaltung der Vorrichtung mit einem (Photo-)Detektor nebst zugehöriger Auswertelektronik, zwei Strahlungsquellen und drei unterschiedlichen Modulationsfrequenzen - zwei Modulationsfrequenzen für die erste Strahlung und eine Modulationsfrequenz für die zweite Strahlung. Mit Hilfe dieser Anordnung lassen sich im Wesentlichen alle bekannten Störeffekte kompensieren. The core of the present invention is therefore the embodiment of the device described above with a (photo) detector and associated evaluation electronics, two radiation sources and three different modulation frequencies - two modulation frequencies for the first radiation and a modulation frequency for the second radiation. With the aid of this arrangement, essentially all known disturbing effects can be compensated.
Eine besonders bevorzugte Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass die erste Strahlung oder eine dritte elektromagnetische Strahlung, die vorzugsweise ebenfalls im sichtbaren Bereich der elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist und die im Wesentlichen parallel zu der ersten Strahlung geführt wird, mit einer vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität modelliert wird. Dabei ist die vierte Modulationsfrequenz von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden. Mit der so modulierten ersten oder dritten Strahlung wird anschließend ein an der Probe angeordnetes Referenzobjekt bestrahlt, welches Referenzobjekt im Wesentlichen keine Verände- rung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Stoffkonzentration zeigt. Allerdings wird das Referenzobjekt so gewählt, dass es eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von seiner Temperatur zeigt. Anschließend wird die am Detektor eintreffende erste oder dritte Strahlung bzw. eine entsprechende Fluoreszenzstrahlung von der Pro- be/dem Referenzobjekt mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage mittels der Auswerteelektronik ausgewertet, um zusätzlich eine Temperatur der Probe optisch zu bestimmen. Die genannte dritte Referenzphasenlage ergibt sich beispielsweise für eine bekannte Probentemperatur. A particularly preferred embodiment of the method according to the invention provides that the first radiation or a third electromagnetic radiation, which is preferably also located in the visible region of the electromagnetic spectrum and which is guided substantially parallel to the first radiation, with a fourth modulation frequency in their intensity is modeled. In this case, the fourth modulation frequency is different from the first, second and third modulation frequency. The thus modulated first or third radiation then irradiates a reference object arranged on the sample, which reference object shows substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration to be determined. However, the reference object is chosen to show a change in its fluorescence behavior as a function of its temperature. Subsequently, the first or third radiation arriving at the detector or a corresponding fluorescence radiation from the sample / the reference object with the fourth modulation frequency is evaluated with respect to its phase position relative to a third reference phase position by means of the evaluation electronics in order additionally to optically determine a temperature of the sample. Said third reference phase position results, for example, for a known sample temperature.
Auf diese Weise ist es im Rahmen der beschriebenen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht erforderlich, die Probentemperatur, welche einen wichtigen Einfiuss auf die zu erzielende Messgenauigkeit haben kann, mittels eines zusätzlichen, elektronischen Messelements zu bestimmen, sondern die Temperaturbestimmung der Probe kann parallel zu der optischen Bestimmung der Stoffkonzentration ebenfalls optisch mittels derselben Auswerteanord- nung erfolgen, so dass sich Zustandsänderungen der Auswerteelektronik bedingte Ungenauigkeiten der Temperaturbestimmung ebenfalls mit kompensieren lassen. In this way, it is not necessary in the context of the described development of the method according to the invention to determine the sample temperature, which can have an important influence on the measurement accuracy to be achieved, by means of an additional, electronic measuring element, but the temperature determination of the sample can be parallel to the optical Determination of the substance concentration also optically by means of the same evaluation arrangement tion, so that changes in state of the evaluation conditional inaccuracies of the temperature determination can also be compensated.
Eine erste Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass die erste Strahlungsquelle und/oder die zweite Strahlungsquelle als Lumineszenz- Diode oder Leuchtdiode (LED) ausgebildet ist. Vorzugsweise weist die erste Strahlungsquelle eine Wellenlänge von etwa 505 nm und die zweite Strahlungsquelle eine Wellenlänge von 680 nm auf. Wie der Fachmann erkennt, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch keinesfalls auf derartige Strahlungsquellen, insbesondere nicht auf die genannten Wellenlängen beschränkt. A first development of the device according to the invention provides that the first radiation source and / or the second radiation source is designed as a luminescence diode or light-emitting diode (LED). Preferably, the first radiation source has a wavelength of about 505 nm and the second radiation source has a wavelength of 680 nm. However, as the person skilled in the art realizes, the device according to the invention is by no means limited to such radiation sources, in particular not to the wavelengths mentioned.
Eine wieder andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass der Strahlteiler als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. Derartige Spiegel reflektieren nur einen Teil des Lichtspektrums und sind für den Rest durchlässig. Es ist somit möglich, einfallendes Licht nach der Wellenlänge und somit nach der Farbe zu trennen. Derartige Strahlteiler arbeiten sehr verlustarm, was einen besonderen Anwendungsvorteil darstellt. Bei Verwendung eines dichroiti- schen Spiegels als Strahlteiler ist es möglich, die Fluoreszenzstrahlung von der Probe bei ihrer Umlenkung in Richtung Detektor zu filtern, so dass nur relativ langwellige Strahlungsanteile zum Detektor gelangen, um die Analysegenauigkeit zu verbessern. Außerdem besitzt ein derartiger Spiegel die Eigenschaft, einen kleinen Teil der anfangs eingestrahlten ersten und/oder dritten Strahlung durch innere„Störeffekte" unmittelbar in Richtung Detektor umzulenken, wo sie als Referenz nutzbar ist, ohne die Auswertung durch übermäßige Intensität zu stören. Yet another development of the device according to the invention provides that the beam splitter is designed as a dichroic mirror. Such mirrors only reflect part of the light spectrum and are permeable to the rest. It is thus possible to separate incident light according to the wavelength and thus to the color. Such beam splitters work very low loss, which represents a special application advantage. When using a dichroic mirror as a beam splitter, it is possible to filter the fluorescence radiation from the sample during its deflection in the direction of the detector so that only relatively long-wave radiation components reach the detector in order to improve the analysis accuracy. In addition, such a mirror has the property of directing a small portion of the initially irradiated first and / or third radiation through internal "interference effects" directly in the direction of the detector, where it can be used as a reference, without disturbing the evaluation by excessive intensity.
Im Rahmen einer bevorzugten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorgesehen sein, dass die Auswertelektronik als so genanntes„Field- Programmable-Gate-Array" (FPGA) ausgebildet ist, was eine sehr kompakte und zuverlässige Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht. As part of a preferred development of the device according to the invention can be provided that the evaluation electronics as a so-called "Field Programmable Gate Array" (FPGA) is formed, which allows a very compact and reliable embodiment of the device according to the invention.
Eine wieder andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass entweder die erste Modulationseinrichtung dazu ausgebildet ist, die erste Strahlung mit einer vierten IVIodulationsfrequenz in ihrer Intensität zu modulieren oder dass wenigstens eine dritte Strahlungsquelle vorgesehen ist, die zum Aus- senden wenigstens einer dritten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, und die in Wechselwirkung steht mit einer dritten Moduiationseinrichtung, die dazu ausgebildet ist, die dritte Strahlung mit einer vierten Modulationsfrequenz in ih- rer I ntensität zu modulieren. In beiden Fällen ist die vierte Modulationsfrequenz von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden. In diesem Zusammenhang ist weiterhin vorgesehen, dass die Probe ein Referenzobjekt oder einen Referenzbereich umfasst, welcher beispielsweise in Rubin ausgebildet ist oder solches bzw. in seinen Eigenschaften vergleichbares Material ent- hält. Das Referenzobjekt ist allgemein derart gewählt, dass es im Wesentlichen keine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Stoffkonzentration zeigt, wobei jedoch eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Temperatur auftritt. Keinesfalls ist die Erfindung in diesem Zusammenhang auf die Verwendung von Rubin als Referenzobjekt beschränkt. Weiterhin ist in diesem Zusammenhang die Auswerteelektronik dazu ausgebildet, die vom Detektor detektierte erste oder dritte Strahlung mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage auszuwerten, um zusätzlich eine Temperatur der Probe optisch zu bestimmen. Yet another refinement of the device according to the invention provides that either the first modulation device is designed to modulate the intensity of the intensity of the first radiation at a fourth IVIodulation frequency or that at least one third radiation source is provided, which at least one third electromagnetic radiation is formed, preferably in the visible region of the electromagnetic spectrum, and which interacts with a third modulating device, which is designed to modulate the third radiation with a fourth modulation frequency in its intensity. In both cases, the fourth modulation frequency is different from the first, second and third modulation frequencies. In this context, it is further provided that the sample comprises a reference object or a reference region, which is formed, for example, in ruby or contains such material or comparable material in its properties. The reference object is generally chosen such that it shows substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration to be determined, but a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature occurs. In no case, the invention is limited in this context to the use of ruby as a reference object. Furthermore, in this connection, the evaluation electronics are designed to evaluate the first or third radiation detected by the detector with the fourth modulation frequency with respect to its phase position relative to a third reference phase position in order additionally to optically determine a temperature of the sample.
Auf eine entsprechende Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde bereits weiter oben detailliert eingegangen, so dass sich diesbezüglich weitere Ausführungen erübrigen. Wie sich aus dem Vorhergehenden ergibt, kann die optische Temperaturbestimmung der Probe also entweder derart erfolgen, dass die von der vorhandenen ersten Strahlungsquelle ausgesandte erste Strahlung mit der vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität moduliert wird, oder es kann eine zusätzliche dritte Strahlungsquelle vorgesehen sein, deren Strahlung (dritte Strahlung) dann entsprechend mit der vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität moduliert wird. On a corresponding development of the method according to the invention has already been discussed in detail above, so that in this respect further explanations are unnecessary. As can be seen from the foregoing, the optical temperature determination of the sample can thus be carried out either in such a way that the first radiation emitted by the existing first radiation source is modulated in intensity with the fourth modulation frequency, or an additional third radiation source can be provided whose radiation (Third radiation) is then modulated in accordance with the fourth modulation frequency in intensity.
Eine andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass zwischen dem Strahlteiier und der Probe wenigstens ein Lichtleiter oder allge- mein ein transparenter Körper mit entsprechenden Eigenschaften für die erste Strahlung und/oder dritte Strahlung angeordnet ist. Über diesen Lichtleiter wird die erste und/oder die dritte Strahlung m öglichst verlustfrei zu der Probe geführt, um diese mit der ersten und/oder dritten Strahlung zu beaufschlagen. Außerdem kann der genannte Lichtleiter dazu dienen , die von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung zu dem Strahlteiler zurückzuführen , von welchem sie anschließend zu dem Detektor gelangt. Another development of the device according to the invention provides that at least one optical fiber or generally a transparent body with corresponding properties for the first radiation and / or third radiation is arranged between the beam element and the sample. About this light guide is the first and / or the third radiation is guided as loss-free as possible to the sample, in order to apply these to the first and / or third radiation. In addition, said light guide can serve to return the fluorescence radiation emitted by the sample to the beam splitter, from which it then passes to the detector.
Eine äußerst bevorzugte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass die Auswerteelektronik Verstärker- und Filterm ittel und/oder wen igstens einen Lock-I n-Verstärker umfasst, mit welchem sich die Detektorsig na- le hinsichtlich ihrer Phasenlage genau besti mmen und auswerten lassen , wie vorstehend detail liert beschrieben . Dazu sind die Sende- bzw. Modulationsfreq uenzen der Strahlungsquel len mit dem Lock-I n-Verstärker synchronisiert. An extremely preferred further development of the device according to the invention provides that the evaluation electronics comprise amplifier and filter means and / or at least one lock-in amplifier with which the detector signals can be exactly determined and evaluated with respect to their phase position, as described in detail above. For this purpose, the transmission or modulation frequencies of the radiation sources are synchronized with the lock-I n amplifier.
Bei einer wieder anderen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorgesehen sein , dass zumindest die erste Strahlungsquelle, die zweite Strahl ungsq uelle, der Strahlteiler und der Detektor sowie vorzugsweise auch die dritte Strahlungsquelle , soweit vorhanden , und/oder wenigstens ein Absch nitt des Lichtleiters in einer integrierten Anordnung mit einem im Wesentlichen lichtundurchlässigen Gehäuse in oder an diesem Gehäuse angeordnet sind . Auf die- se Weise lassen sich insbesondere störende Streulichteinflüsse bereits konstruktiv weitgehend eliminieren . In yet another development of the device according to the invention can be provided that at least the first radiation source, the second ungsq uelle source, the beam splitter and the detector and preferably also the third radiation source, if any, and / or at least one ex nection of the light guide in one integrated arrangement are arranged with a substantially opaque housing in or on this housing. In this way, it is in particular possible to largely eliminate disturbing scattered light influences already structurally.
Eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass vor dem Detektor wenigstens ein optisches Filterelement angeordnet ist, wel- ches vorzugsweise als einfaches Glasfüter ausgebildet sein kann. Anders als bei den vorbekannten Messapparaturen , welche zum Eliminieren von Störein- flüssen auf die Verwendung teurer Spezialfilter in Form von Mehrschichtsystemen oder dergleichen angewiesen sind , ergibt sich hierdurch ein besonderer Kostenvortei l für eine entsprechend weitergebildete erfindungsgemäße Vorrich- tung . I m Rahmen der vorl iegenden Erfindung dient das Filterelement dazu , eine ü bermäßige Einstrahlung der ersten und/oder dritten Strah lung auf den Detektor zu verhindern . Es wird somit ledig lich ein Material benötigt, welches i n einem bzw. zwei konkreten Wellenlängenbereich (en) für die genan nte Strahlung weitgehend undurchlässig ist. Die erste und/oder dritte Strahlung dient am Detektor bzw. in der Auswerteelektronik lediglich als Referenz, so dass nur eine relativ geringe Intensität benötigt wird - auch um die eigentliche Messstrahlung (Fluoreszenzstrahlung von der Probe) nicht zu überdecken. A further embodiment of the device according to the invention provides that in front of the detector at least one optical filter element is arranged, which may preferably be designed as a simple glass filler. In contrast to the previously known measuring apparatuses, which rely on the use of expensive special filters in the form of multilayer systems or the like in order to eliminate disturbing influences, this results in a special cost advantage for a correspondingly further developed apparatus according to the invention. Within the scope of the present invention, the filter element serves to prevent excessive irradiation of the first and / or third radiation onto the detector. It is thus single Lich a material needed which is largely impermeable in one or two specific wavelength range (s) for the genan nth radiation. The first and / or third radiation is used at the detector or in the evaluation only as a reference, so that only a relative low intensity is required - even to the actual measuring radiation (fluorescence radiation from the sample) not to cover.
Schließlich kann im Zuge einer wieder anderen Weiterbitdung der erfindungs- gemäßen Vorrichtung auch vorgesehen sein, dass zumindest die zweite Strahlungsquelle, die Probe, den Detektor sowie gegebenenfalls das Filterelement auf einer gemeinsamen Seite des Strahlteiiers angeordnet sind, vorzugsweise innerhalb des Gehäuses, wodurch sich ein besonders kompakter Aufbau und eine entsprechend flexible Verwendbarkeit der Vorrichtung erreichen lässt. Finally, in the course of yet another refinement of the device according to the invention, it can also be provided that at least the second radiation source, the sample, the detector and optionally the filter element are arranged on a common side of the beam dispenser, preferably within the housing, whereby a particularly achieve compact design and a correspondingly flexible usability of the device.
Weiter Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung Figur 1 zeigt schematisch eine erste Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet; Further advantages and features of the present invention will become apparent from the following description of embodiments with reference to the drawing Figure 1 shows schematically a first embodiment of the device according to the invention, which is suitable for carrying out the method according to the invention;
Figur 2 zeigt schematisch eine andere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung , welche sich zur Durchführung einer alternativen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet. Figure 2 shows schematically another embodiment of the device according to the invention, which is suitable for carrying out an alternative embodiment of the method according to the invention.
Figur 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration mittels Fluoreszenzspektroskopie, welche Vorrichtung in ihrer Gesamtheit mit dem Bezugszeichen 1 bezeichnet ist. Die Vorrichtung 1 umfasst bei Bezugszeichen 2 eine erste Strahlungsquelle in Form einer grünen Lumineszenz-Diode (LED) mit einer Wellenlänge von FIG. 1 schematically shows a device for determining a substance concentration, preferably an oxygen concentration by means of fluorescence spectroscopy, which device is denoted by the reference numeral 1 in its entirety. The device 1 comprises at reference 2 a first radiation source in the form of a green luminescence diode (LED) with a wavelength of
505 nm. Die erste Strahlungsquelle 2 ist somit in der Lage, eine erste elektromagnetische Strahlung auszusenden, die im sichtbaren Bereich dieses elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der ersten Strahlungsquelle 2 weist die Vorrichtung 1 eine erste Modulationseinrichtung 3 auf, die dazu ausgebildet ist, die Intensität der von der ersten Strahlungsquelle ausgesendeten Strahlung, welche in Figur 1 mit dem Bezugszeichen S1 bezeichnet ist, mit einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz f1 bzw. f2 sinusförmig zu modulieren, wobei gilt: f1 Φ f2. Im Strahlengang der ersten Strahlung S 1 ist zunächst ein Strahlteiter 4 in Form eines dichroiti- schen Spiegels angeordnet, welcher dazu ausgebildet ist, die erste Strahlung S1 (durchgezogene, dicke Pfeile in Figur 1 ) größtenteils in Richtung einer Probe 5 durchzulassen. Ein kleinerer Teil der ersten Strahlung S1 gelangt aufgrund von Streulichteffekten der Spiegelumgebung bzw. der Gesamtanordnung in Richtung eines Detektors 6. Hierauf wird weiter unten noch genauer eingegan- gen. 505 nm. The first radiation source 2 is thus able to emit a first electromagnetic radiation, which is located in the visible region of this electromagnetic spectrum. In operative signal connection with the first radiation source 2, the device 1 has a first modulation device 3, which is designed to measure the intensity of the radiation emitted by the first radiation source, which is denoted by the reference symbol S1 in FIG. 1, with a first and a second Modulation frequency f1 and f2 sinusoidally modulate, where: f1 Φ f2. In the beam path of the first radiation S 1, initially a beam divider 4 in the form of a dichroic mirror is arranged, which is designed to be the first radiation S1 (solid, thick arrows in Figure 1) largely pass in the direction of a sample 5. A smaller part of the first radiation S1 passes in the direction of a detector 6 due to scattered light effects of the mirror environment or of the overall arrangement. This will be discussed in more detail below.
Zwischen dem Strahlteiler 4 und der Probe 5 ist ein transparenter Körper 7 in Form einer optischen Faser, eines Lichtstabs oder dergleichen angeordnet, durch welchen die erste Strahlung S1 zu der Probe 5 gelangt. Vor dem Detektor 6 ist im Strahlengang noch ein Filterelement 8 angeordnet, auf dessen Eigenschaften ebenfalls weiter unten noch genauer eingegangen wird. In signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor 6 stehen elektrische Verstärker- /Filtermittel oder dergleichen 9 sowie ein Lock-In-Verstärker 10. Die Verstärker- /Filtermittel 9 und der Lock-In-Verstärker 10 bilden zusammen eine Auswertelek- tronik 1 1 der Vorrichtung 1. Between the beam splitter 4 and the sample 5, a transparent body 7 in the form of an optical fiber, a light rod or the like is arranged, through which the first radiation S1 reaches the sample 5. In front of the detector 6, a filter element 8 is still arranged in the beam path, whose properties will also be discussed in more detail below. In electrical signal connection with the detector 6 are electrical amplifier / filter means or the like 9 and a lock-in amplifier 10. The amplifier / filter means 9 and the lock-in amplifier 10 together form a Auswertelek- tronik 1 1 of the device. 1 ,
Des Weiteren umfasst die Vorrichtung 1 noch eine zweite Strahlungsquelle 12, welche derart relativ zu dem Strahlteiler 4 angeordnet ist, dass eine von ihr ausgesandte zweite Strahlung S2 ohne Wechselwirkung mit der Probe 5 im We- sentlichen direkt zu dem Filterelement 8 bzw. dem Detektor 6 gelangt. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der zweiten Strahlungsquelle 12 weist die Vorrichtung 1 noch eine weitere (zweite) Modulationseinrichtung 13 auf, welche dazu ausgebildet ist, die von der zweiten Strahlungsquelle 12 ausgesandte Strahlung S2 in ihrer Intensität mit einer dritten Modulationsfrequenz f3 sinusförmig zu modulieren. Dabei ist die dritte Modulationsfrequenz f3 von der ersten Modulationsfrequenz f1 und der zweiten Modulationsfrequenz f2 verschieden. Furthermore, the device 1 also comprises a second radiation source 12, which is arranged relative to the beam splitter 4 in such a way that a second radiation S2 emitted by it does not interact directly with the filter element 8 or the detector 6 without interaction with the sample 5 arrives. In operative signal connection with the second radiation source 12, the device 1 also has a further (second) modulation device 13 which is designed to sinusoidally modulate the intensity of the radiation S2 emitted by the second radiation source 12 with a third modulation frequency f3. In this case, the third modulation frequency f3 is different from the first modulation frequency f1 and the second modulation frequency f2.
Die von der zweiten Strahlungsquelle 12 ausgesandte elektromagnetische Strahlung S2 ist in Figur 1 mittels dünner, durchgezogener Pfeile symbolisiert. Bei der zweiten Strahlungsquelle 12 handelt es sich gemäß Figur 1 ebenfalls um eine LED-Strahlungsquelle mit einer Wellenlänge von 680 nm. Allerdings ist die vorliegende Erfindung keinesfalls auf die vorstehend lediglich exemplarisch angeführten Arten von Strahlungsquellen beschränkt. Die von der ersten Strahlungsquelle 2 ausgesandte erste Strahlung S1 gelangt - wie bereits ausgeführt - über den transparenten Körper 7 als Anregungsstrah- lung zu der Probe 5. Bei der Probe 5 handelt es sich um eine Probe (Spot), welche in der Lage ist, einen Stoff, beispielsweise Sauerstoff, dessen Konzentration mit der Vorrichtung 1 bestimmt werden soll, anzulagern. Der genannte Stoff in der Probe 5 wird durch die erste Strahlung S1 zum Aussenden von Fluoreszenzstrahlung angeregt, welche in Figur 1 mit dem Bezugszeichen S 1 ' bezeichnet und mittels gestrichelter Pfeile symbolisiert ist und welche in ihren Eigenschaften (z.B. Intensität, Phasenlage, Abklingverhalten) von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs in/an der Probe 5 abhängig ist, vorzugsweise wenigstens angenähert proportional. Diese Fluoreszenzstrahlung S1 ' gelangt über den transparenten Körper 7 zurück zum Strahlteiler 4 und wird dort teilweise in Richtung des Fifterelements 8 bzw. des Detektors 6 umgelenkt. Der Detektor 6 empfängt bzw. detektiert also zunächst die unveränderte erste Strahlung S1 , die zweite Strahlung oder Referenzstrahlung S2 sowie die von der Probe 5 emittierte Fluoreszenzstrahlung S 1 \ In Bezug auf Letztere übernimmt der Strahlteiler 4 zusätzlich noch eine Filterfunktion, wobei nur relativ langwellige Anteile zum Detektor 6 reflektiert werden. The emitted from the second radiation source 12 electromagnetic radiation S2 is symbolized in Figure 1 by means of thin, solid arrows. According to FIG. 1, the second radiation source 12 is likewise an LED radiation source having a wavelength of 680 nm. However, the present invention is in no way limited to the types of radiation sources given above by way of example only. The first radiation S 1 emitted by the first radiation source 2 passes through the transparent body 7 as an excitation beam, as already explained. The sample 5 is a sample (spot) which is able to store a substance, for example oxygen, whose concentration is to be determined by the device 1. Said substance in the sample 5 is excited by the first radiation S1 for emitting fluorescence radiation, which in FIG. 1 is designated by the reference symbol S 1 'and symbolized by dashed arrows and which in their properties (eg intensity, phase position, decay behavior) the concentration of the substance to be determined in / on the sample 5 is dependent, preferably at least approximately proportional. This fluorescence radiation S1 'passes via the transparent body 7 back to the beam splitter 4 and is partially deflected there in the direction of the fifter element 8 or the detector 6. Thus, the detector 6 initially receives or detects the unchanged first radiation S1, the second radiation or reference radiation S2 and the fluorescence radiation S 1 emitted by the sample 5. With respect to the latter, the beam splitter 4 additionally assumes a filter function, with only relatively long-wave components are reflected to the detector 6.
Das Filterelement 8 ist als einfaches Glasfilter ausgebildet und dient dazu, im Wesentlichen nur die relativ zu den Strahlungen S1 , S2 schwache Fluoreszenzstrahlung S 1 ' von der Probe 5 in Richtung Detektor 6 durchzulassen. Für die im Vergleich zu der genannten Strahlung S1 ' relativ starken Referenzstrahlungsanteile S1 , S2 ist das Filterelement 8 dagegen im Wesentlichen undurchlässig ausgebildet und verhindert deren übermäßiges Auftreffen auf den Detektor 6. Die vom Detektor 6 detektierte Strahlung wird anschließend mittels der Auswerteelektronik 1 1 , welche nach Art eines FPGA ausgebildet ist, zur Bestimmung der Stoffkonzentration an der Probe 5 hinsichtlich ihrer Phasenverschiebung ausgewertet. Die Phasenverschiebungen des Signals S1 ' gegenüber dem SignalThe filter element 8 is designed as a simple glass filter and serves to transmit substantially only the relative to the radiation S1, S2 weak fluorescence radiation S 1 'of the sample 5 in the direction of the detector 6. For the relatively high reference radiation portions S1, S2 compared to the said radiation S1 ', the filter element 8, on the other hand, is essentially impermeable and prevents its excessive impact on the detector 6. The radiation detected by the detector 6 is subsequently detected by means of the evaluation electronics 11 is designed in the manner of an FPGA, evaluated for determining the substance concentration at the sample 5 with respect to their phase shift. The phase shifts of the signal S1 'with respect to the signal
51 erlauben - aufgrund der beiden enthaltenen Modulationsfrequenzen - die Eliminierung von optischen Störeinflüssen. Die Phasenverschiebung des Signal51 allow - due to the two included modulation frequencies - the elimination of optical interference. The phase shift of the signal
52 ermöglicht in neuartiger Weise die Eliminierung von Störeinflüssen der Auswertelektronik einschließlich des Detektors. Wie der Fachmann weiß, sind zu diesem Zweck die Sendefrequenzen (Modulationsfrequenzen) der Strahlungsquellen 2, 12 mit dem Lock-In-Verstärker 10 synchronisiert. 52 enables in a new way the elimination of disturbing influences of the evaluation electronics including the detector. As is known to those skilled in the art, the transmission frequencies (modulation frequencies) of the radiation sources 2, 12 are synchronized with the lock-in amplifier 10 for this purpose.
Wie mitteis der gestrichelten Box in Figur 1 symbolisiert ist, sind die erste Strahlungsquelle 2, die zweite Strahlungsquelle 12, der Strahlteiler 4, der transparen- te Körper 7 (zumindest teilweise) und das Filterelement 8 innerhalb eines Gehäuses 14 angeordnet, welches für elektromagnetische Störstrahlung von außerhalb der Vorrichtung 1 im Wesentlichen undurchlässig ist. As is symbolized in the dashed box in FIG. 1, the first radiation source 2, the second radiation source 12, the beam splitter 4, the transparent te body 7 (at least partially) and the filter element 8 is disposed within a housing 14 which is substantially impermeable to electromagnetic radiation from outside the device 1.
Die Figur 2 zeigt eine Abwandlung der Vorrichtung 1 gemäß Figur 1 , wobei die Abgabemittelvorrichtung gemäß Figur 2 in ihrer Gesamtheit mit dem Bezugszeichen bezeichnet ist. Es wird im Folgenden nur auf die Unterschiede zwischen den Vorrichtungen gemäß Figur 1 und Figur 2 näher eingegangen, wobei ansonsten gleiche Bezugszeichen gleiche oder gleichwirkende Elemente bezeichnen. FIG. 2 shows a modification of the device 1 according to FIG. 1, wherein the delivery device according to FIG. 2 is designated in its entirety by the reference numeral. In the following, only the differences between the devices according to FIG. 1 and FIG. 2 will be described in greater detail, otherwise identical reference symbols designating the same or equivalent elements.
Zusätzlich zu der ersten Strahlungsquelle 2 weist die Vorrichtung 1 ' gemäß Figur 2 vor dem Strahlteiler 4 noch eine dritte Strahlungsquelle 22 auf, welche ebenfalls als LED ausgebildet ist und vorzugsweise eine andere Wellenlänge aufweist als die erste Strahlungsquelle 2. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der dritten Strahlungsquelle 22 weist die Vorrichtung 1 ' eine dritte Modulationseinrichtung 23, welche dazu ausgebildet ist, die von der dritten Strahlungsquelle 22 ausgesandte elektromagnetische Strahlung in ihrer Intensität mit einer vierten Modulationsfrequenz f4 zu modulieren, wobei die vierte Modulationsfrequenz f4 von den ersten bis dritten Modulationsfrequenzen f1 -f3 verschieden ist. Die von der dritten Strahlungsquelle 23 ausgesandte elektromagnetische Strahlung ist in Figur 2 mit dem Bezugszeichen S3 bezeichnet und wird durch strichpunktierte Pfeile symbolisiert. In addition to the first radiation source 2, the device 1 'according to FIG. 2 also has a third radiation source 22 in front of the beam splitter 4, which is likewise designed as an LED and preferably has a different wavelength than the first radiation source 2. In operative signal connection with the third radiation source 22, the device 1 'has a third modulation device 23, which is designed to modulate the intensity of the electromagnetic radiation emitted by the third radiation source 22 with a fourth modulation frequency f4, wherein the fourth modulation frequency f4 from the first to third modulation frequencies f1 -f3 is different. The electromagnetic radiation emitted by the third radiation source 23 is denoted by the reference symbol S3 in FIG. 2 and is symbolized by dash-dotted arrows.
Zwischen dem Strahlteiler 4 und der Probe 5 weist die Vorrichtung 1 ' neben dem transparenten Körper 7 noch einen weiteren transparenten Köper 7' auf, über welchen die dritte Strahlung S3 nach Passieren des Strahlteilers 4 zumindest anteilig zu der Probe 5 gelangt. Between the beam splitter 4 and the sample 5, the device 1 'has, in addition to the transparent body 7, a further transparent body 7', via which the third radiation S3 reaches the sample 5 at least partially after passing through the beam splitter 4.
Die Probe 5 weist gemäß der Ausgestaltung in Figur 2 einen ersten Probenabschnitt 5a auf, welcher in seiner Ausgestaltung und Funktion der Probe 5 gemäß Figur 1 entspricht. Mit anderen Worten: in ihrem Abschnitt 5a ist die Probe 5 gemäß Figur 2 wiederum dazu ausgebildet, eine von der Konzentration des mit der Vorrichtung 1 ' zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren. Entsprechend ist die Vorrichtung 1 ' dazu ausgebildet, dass die erste Strahlung S1 in dem Bereich 5a auf die Probe 5 auftritt, so dass entsprechend der Abschnitt 5a der Probe 5 die Fluoreszenzstrahlung S1 ' aussendet, wie weiter oben anhand von Figur 1 ausführlich beschrieben. According to the embodiment in FIG. 2, the sample 5 has a first sample section 5a, which corresponds in its design and function to the sample 5 according to FIG. In other words: in its section 5a, the sample 5 according to FIG. 2 is again designed to emit fluorescence radiation dependent on the concentration of the substance to be determined by the device 1 '. Accordingly, the device 1 'is designed so that the first radiation S1 occurs in the region 5a on the sample 5, so that accordingly the section 5a of the sample 5 emits the fluorescence radiation S1 ', as described in detail above with reference to FIG.
Gemäß Figur 2 weist die Probe 5 jedoch noch einen zweiten Bereich oder Ab- 5 schnitt 5b auf, welcher von dem ersten Bereich oder Abschnitt 5a durch eine optische Barriere 5c getrennt ist. Die optische Barriere 5c bewirkt, dass keine Strahlung aus dem einen Bereich 5a der Probe 5 in den anderen Bereich 5b der Probe 5 gelangt, und umgekehrt. Die Vorrichtung 1 ' ist dazu ausgebildet, dass die dritte Strahlung S3 nach Passieren des Strahlteilers 4 anteilig auf den Be- i o reich 5b der Probe 5 gelenkt wird, wobei es sich um einen Referenzbereich However, according to FIG. 2, the sample 5 still has a second region or section 5b, which is separated from the first region or section 5a by an optical barrier 5c. The optical barrier 5c causes no radiation from the one region 5a of the sample 5 in the other region 5b of the sample 5 passes, and vice versa. The device 1 'is designed such that the third radiation S3 is directed proportionally to the loading 5b of the sample 5 after passing through the beam splitter 4, this being a reference region
handelt. in diesem Bereich 5b umfasst die Probe 5 ein Referenzmaterial oder Referenzobjekt, dessen Fluoreszenzstrahlung S3' nicht von einer Konzentration des zu 15 bestimmenden Stoffs sondern im Wesentlichen nur von einer Temperatur der Probe 5 abhängt. Vorzugsweise ist der Bereich 5b der Probe 5 deshalb in Rubin ausgebildet oder umfasst zumindest ein entsprechendes bzw. vergleichbares Material. 0 Gemäß der Ausgestaltung in Figur 2 gelangen demnach vom Strahlteiler 4 folgende Strahlungsanteile über das Filterelement 8 zum Detektor 6: ein Teil der unveränderten ersten Strahlung S1 , ein Teil der unveränderten zweiten Strahlung (Referenzstrahlung) S2, die vom Bereich 5a der Probe 5 ausgesandte Fluoreszenzstrahlung S1 ', ein Teil der unverfälschten dritten Strahlung S3 sowie die5 von dem Bereich 5b der Probe 5 ausgesandte Fluoreszenzstrahlung S3'. Die Auswerteelektronik 1 1 kann dann wiederum die Konzentration des zu bestimmenden Stoffs an der Probe 5 (Bereich 5a) ermitteln, wobei zusätzlich anhand der von dem Bereich 5b ausgesandten Fluoreszenzstrahlung S3' die Temperatur der Probe 5 über eine Phasenverschiebung beispielsweise gegenüber dem Re-0 ferenzsignal S3 bestimmbar ist, so dass sich Temperatureinflüsse bei der Konzentrationsbestimmung eliminieren bzw. zumindest berücksichtigen lassen.  is. In this region 5b, the sample 5 comprises a reference material or reference object whose fluorescence radiation S3 'does not depend on a concentration of the substance to be determined but essentially only on a temperature of the sample 5. The region 5b of the sample 5 is therefore preferably formed in ruby or comprises at least one corresponding or comparable material. Accordingly, according to the embodiment in FIG. 2, the radiation components arrive from the beam splitter 4 via the filter element 8 to the detector 6: a part of the unchanged first radiation S1, a part of the unchanged second radiation (reference radiation) S2, the fluorescence radiation emitted by the region 5a of the sample 5 S1 ', a part of the unadulterated third radiation S3 and the5 fluorescence radiation S3' emitted by the region 5b of the sample 5. The transmitter 1 1 can in turn determine the concentration of the substance to be determined on the sample 5 (area 5 a), wherein in addition based on the emitted from the area 5 b fluorescence radiation S3 ', the temperature of the sample 5 via a phase shift, for example, with respect to the Re-0 reference signal S3 is determinable, so that eliminate temperature effects in the concentration determination or at least take into account.
Wie der Fachmann weiß, sind zu diesem Zweck die Sendefrequenzen (Modula- tionsfrequenzen) der Strahlungsquellen 2, 12, 22 mit dem Lock-In-Verstärker 105 synchronisiert. Das Filterelement 8 ist wiederum als einfaches Glasfilter ausgebildet und dient dazu, im Wesentlichen nur die relativ zu den Strahlungen S 1 , S2 und S3 relativ schwachen Fluoreszenzstrahlungen S V, S3' von der Probe 5 in Richtung Detektor 6 durchzulassen. Für die im Vergleich zu den Fluoreszenzstrahlungen S1 ' und S3' relativ starken Referenzstrahlungsanteile S1 , S2 und S3 ist das Filterelement 8 also im Wesentlichen undurchlässig ausgebildet und verhindert deren übermäßiges Auftreffen auf den Detektor 6. As is known to those skilled in the art, the transmission frequencies (modulation frequencies) of the radiation sources 2, 12, 22 are synchronized with the lock-in amplifier 105 for this purpose. The filter element 8 is in turn designed as a simple glass filter and serves to transmit substantially only the relative to the radiation S 1, S2 and S3 relatively weak fluorescence radiation SV, S3 'of the sample 5 in the direction of the detector 6. For the reference radiation portions S1, S2 and S3, which are relatively strong in comparison with the fluorescence radiations S1 'and S3', the filter element 8 is thus essentially impermeable and prevents its excessive impact on the detector 6.

Claims

Ansprüche claims
1 . Verfahren zum Bestimmen einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, wobei eine Probe (5) mit wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung (S1 ) beaufschlagt wird, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, wobei die erste Strahlung mit wenigstens einer ersten (f1 ) und einer zweiten Modulationsfrequenz (f2), welche unterschiedlich sind, in ihrer Intensität moduliert wird, und wobei eine von der Probe (5) ausgesandte Fluoreszenzstrahlung (S 1 ') mittels eines Detektors (6) bestimmt und für jede Modulationsfrequenz (f1 , f2) hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage mittels einer Auswerteelektronik (1 1 ) ausgewertet wird, welche erste Referenzphasenlage sich bei einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe (5) ergibt, vorzugsweise bei einem Fehlen des Stoffs in der Probe (5), um die Stoffkonzentration in der Probe (5) zu bestimmen, 1 . Method for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, wherein a sample (5) is acted on by at least one first electromagnetic radiation (S1), preferably in the visible region of the spectrum, the first radiation having at least a first (f1) and a first ( second modulation frequency (f2), which are different in intensity is modulated, and wherein one of the sample (5) emitted fluorescence radiation (S 1 ') determined by a detector (6) and for each modulation frequency (f1, f2) in terms of their Phase relationship is evaluated relative to a respective first reference phase position by means of an evaluation (1 1), which first reference phase position results in a known substance concentration in the sample (5), preferably in a lack of the substance in the sample (5), the substance concentration in to determine the sample (5)
dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that
der Detektor (6) zusätzlich mit wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung (S2) beaufschlagt wird, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, wobei die zweite Strahlung mit wenigstens einer dritten, von der ersten und der zweiten Modulationsfrequenz verschiedenen Modulationsfrequenz (f3) in ihrer Intensität moduliert wird, und wobei die zweite Strahlung nicht mit der Probe (5) wechselwirkt, wobei die am Detektor (6) eintreffende zweite Strahlung hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer zweiten Referenzphasenlage mittels der Auswerteelektronik ( 1 ) ausgewertet wird, um die Stoffkonzentration in der Probe unabhängig von Zustandsänderungen, insbesondere temperaturbedingten Zu- standsänderungen, der Auswertelektronik (1 1 ) zu bestimmen.  the detector (6) additionally receives at least one second electromagnetic radiation (S2), preferably in the visible region of the spectrum, the second radiation modulating its intensity with at least one third modulation frequency (f3) different from the first and the second modulation frequency is, and wherein the second radiation does not interact with the sample (5), wherein the second radiation arriving at the detector (6) is evaluated in terms of their phase position relative to a second reference phase position by means of the evaluation (1) to the substance concentration in the sample independently of state changes, in particular temperature-induced state changes, the evaluation electronics (1 1) to determine.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , 2. The method according to claim 1,
dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that
die erste Strahlung (S 1 ) oder eine dritte elektromagnetische Strahlung (S3), vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, welche dritte Strahlung im Wesentlichen parallel zu der ersten Strahlung geführt wird, mit einer vierten Modulationsfrequenz (f4) in ihrer Intensität moduliert wird, welche vierte Modulationsfrequenz von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden ist, und dass mit der ersten oder dritten Strahlung ein in der Probe (5) enthaltenes Referenzobjekt (5b) bestrahlt wird, welches Referenzobjekt im Wesentlichen keine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Stoffkonzentration, jedoch eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Temperatur zeigt, wobei die am Detektor (6) eintreffende Fluoreszenzstrahlung (S1 \ S3') mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage mittels der Auswerteelektronik (1 1 ) ausgewertet wird, um zusätzlich eine Temperatur der Probe (5) zu bestimmen. the first radiation (S 1) or a third electromagnetic radiation (S3), preferably in the visible region of the spectrum, which third radiation is guided substantially parallel to the first radiation, modulated in intensity with a fourth modulation frequency (f4) which fourth modulation frequency is different from the first, second and third modulation frequencies, and that the first or third radiation irradiates a reference object (5b) contained in the sample (5), the reference object substantially not changing its fluorescence behavior as a function of the substance concentration, however, shows a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature, the fluorescence radiation (S1 \ S3 ') arriving at the detector (6) having the fourth modulation frequency being evaluated with respect to its phase position relative to a third reference phase position by means of the evaluation electronics (11) is to additionally determine a temperature of the sample (5).
3. Vorrichtung (1 , 1 ') zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, umfassend: 3. Device (1, 1 ') for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, comprising:
— wenigstens eine erste Strahlungsquelle (2), die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung (S1 ) ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums;  - At least a first radiation source (2), which is designed to emit at least a first electromagnetic radiation (S1), preferably in the visible region of the spectrum;
— wenigstens eine erste Modulationseinrichtung (3), dazu zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten (f1 ) und einer zweiten Modulationsfrequenz (f2), welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist;  - at least one first modulation device (3), for modulating the intensity of the first radiation having at least a first (f1) and a second modulation frequency (f2), which are different, is formed;
— wenigstens eine Probe (5), die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung (S1 ') zu emittieren;  - At least one sample (5), which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is adapted to emit a dependent on the concentration of the substance to be determined fluorescence radiation (S1 ');
— einen Detektor (6), der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist; - A detector (6), which is designed to detect the first radiation and arranged in the beam path of the first radiation;
— wenigstens einen Strahlteiler (4), der dazu ausgebildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung (S 1 ) auf die Probe (5) und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den Detektor (6) zu lenken; - at least one beam splitter (4), which is designed and arranged to direct a first part of the first radiation (S 1) onto the sample (5) and a second part of the first radiation onto the detector (6);
— eine Auswerteelektronik (1 1 ), die in signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor (6) steht und die dazu ausgebildet ist, eine von der Probe (5) ausgesandte und mittels des Detektors bestimmte Fluoreszenzstrahlung für die erste (f1 ) und die zweite Modulations- frequenz (f2) hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage auszuwerten, welche erste Referenzphasenlage einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe (5) entspricht, vorzugsweise einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen, - An evaluation (1 1), which is in operative operative connection with the detector (6) and which is adapted to one of the sample (5) emitted and determined by means of the detector fluorescence radiation for the first (f1) and the second modulation frequency (f2) with respect to its phase relationship relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position corresponds to a known substance concentration in the sample (5), preferably a lack of the substance in the sample to determine the substance concentration in the sample,
gekennzeichnet durch marked by
— wenigstens eine zweite Strahlungsquelle (12), die zum Aussenden wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung (S2) ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, welche zweite Strahlungsquelle derart angeordnet ist, dass die zweite Strahlung den Detektor (6) ohne Wechselwirkung mit der Probe (5) erreicht;  At least one second radiation source (12), which is designed to emit at least one second electromagnetic radiation (S2), preferably in the visible region of the spectrum, which second radiation source is arranged such that the second radiation reaches the detector (6) without interaction with the second radiation source Reached sample (5);
— wenigstens eine zweite Modulationseinrichtung (13), die zum Modulieren der Intensität der zweiten Strahlung (S2) mit wenigstens einer dritten Modulationsfrequenz (f3), welche von der ersten Modulationsfrequenz (f1 ) und der zweiten Modulationsfrequenz (f2) verschieden ist, ausgebildet ist;  - at least one second modulation means (13) adapted to modulate the intensity of the second radiation (S2) with at least one third modulation frequency (f3) different from the first modulation frequency (f1) and the second modulation frequency (f2);
wobei der Detektor (6) zum Delektieren der zweiten Strahlung (S2) ausgebildet ist und wobei die Auswerteelektronik (1 1 ) dazu ausgebildet ist, die vom Detektor detektierte zweite Strahlung hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer zweiten Referenzphasenlage auszuwerten, um die Stoffkonzentration in der Probe (5) unabhängig von Zustandsänderungen, insbesondere temperaturbedingten Zustandsänderungen, der Auswerteelektronik (1 1 ) zu bestimmen. wherein the detector (6) is designed for detecting the second radiation (S2) and wherein the evaluation electronics (1 1) is designed to evaluate the second radiation detected by the detector with respect to its phase position relative to a second reference phase position, the substance concentration in the sample (5) independently of changes in state, in particular temperature-related changes in state, to determine the transmitter (1 1).
Vorrichtung (1 , 1 ') nach Anspruch 3, Device (1, 1 ') according to claim 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste Strahlungsquelle (2) und/oder die zweite Strahlungsquelle (12) als Lumineszenz-Diode, LED, ausgebildet ist, vorzugsweise mit einer Strahlungswellenlänge von etwa 505 nm für die erste Strahlungsquelle (2) und etwa 680 nm für die zweite Strahlungsquelle (12). characterized in that the first radiation source (2) and / or the second radiation source (12) is formed as a luminescent diode, LED, preferably with a radiation wavelength of about 505 nm for the first radiation source (2) and about 680 nm for the second radiation source (12).
Vorrichtung (1 , 1 ') nach Anspruch 3 oder 4, Device (1, 1 ') according to claim 3 or 4,
dadurch gekennzeichnet, dass characterized in that
der Strahlteiler (4) als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. the beam splitter (4) is designed as a dichroic mirror.
6. Vorrichtung (1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass 6. Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 5, characterized in that
die Auswertelektronik (1 1 ) als Field Programmable Gate Array, FPGA, ausgebildet ist.  the evaluation electronics (1 1) as a Field Programmable Gate Array, FPGA, is formed.
7. Vorrichtung (1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 6, 7. Device (1 ') according to at least one of claims 3 to 6,
dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that
die erste Modulationseinrichtung (3) dazu ausgebildet ist, die erste Strahlung (S1 ) mit einer vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität zu modulieren, welche vierte Modulationsfrequenz (f4) von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden ist, oder dass  the first modulation device (3) is designed to modulate the intensity of the first radiation (S1) with a fourth modulation frequency, which fourth modulation frequency (f4) is different from the first, second and third modulation frequencies, or
wenigstens eine dritte Strahlungsquelle (S2) vorgesehen ist, die zum Aussenden wenigstens einer dritten elektromagnetischen Strahlung (S3) ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, und die in Wechselwirkung steht mit einer dritten Modulationseinrichtung(23), die dazu ausgebildet ist, die dritte Strahlung (S3) mit einer vierten Modulationsfrequenz (f4) in ihrer Intensität zu modulieren, welche vierte Modulationsfrequenz (f4) von der ersten (f1), zweiten (f2) und dritten (f3) Modulationsfrequenz verschieden ist;  at least one third radiation source (S2) is provided, which is designed to emit at least one third electromagnetic radiation (S3), preferably in the visible region of the spectrum, and which interacts with a third modulation device (23), which is designed to intensity modulation of third radiation (S3) having a fourth modulation frequency (f4), the fourth modulation frequency (f4) being different from the first (f1), second (f2) and third (f3) modulation frequencies;
wobei die Probe (5) ein Referenzobjekt (5b), vorzugsweise Rubin, um- fasst, welches Referenzobjekt (5a) im Wesentlichen keine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Stoffkonzentration, jedoch eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Temperatur zeigt, und wobei die Auswerteelektronik (1 1 ) dazu ausgebildet ist, die vom Detektor (6) detektierte Fluoreszenzstrahlung (S 1 \ S3') mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage auszuwerten, um zusätzlich eine Temperatur der Probe zu bestimmen.  wherein the sample (5) comprises a reference object (5b), preferably ruby, which reference object (5a) exhibits substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration but a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature, and the evaluation electronics (1 1) is designed to evaluate the fluorescence radiation (S 1 \ S3 ') detected by the detector (6) with the fourth modulation frequency with regard to its phase position relative to a third reference phase position in order additionally to determine a temperature of the sample.
8. Vorrichtung (1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 7, 8. Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 7,
dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that
zwischen dem Strahlteiler (4) und der Probe (5) wenigstens ein Lichtleiter (7, 7') für die erste Strahlung (S1 ) und/oder die dritte Strahlung (S3) und/oder die Fluoreszenzstrahlung (SV, S3') angeordnet ist.  between the beam splitter (4) and the sample (5) at least one light guide (7, 7 ') for the first radiation (S1) and / or the third radiation (S3) and / or the fluorescence radiation (SV, S3') is arranged ,
Vorrichtung (1 , V) nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Device (1, V) according to at least one of claims 3 to 8, characterized in that
die Auswerteelektronik (1 1 ) Verstärker- und Filtermittel (9) und/oder wenigstens einen Lock-In-Verstärker (10) umfasst.  the transmitter (1 1) comprises amplifier and filter means (9) and / or at least one lock-in amplifier (10).
Vorrichtung (1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 9, characterized in that
zumindest die erste Strahlungsquelle (2), die zweite Strahlungsquelle (12), der Strahlteiler (4) und der Detektor (6) sowie vorzugsweise die dritte Strahlungsquelle (22) gemäß Anspruch 7 und/oder wenigstens ein Abschnitt des Lichtleiters (7, 7') gemäß Anspruch 8 in einer integrierten Anordnung mit einem im Wesentlichen lichtundurchlässigen Gehäuse (14) in und/oder an dem Gehäuse (14) angeordnet sind.  at least the first radiation source (2), the second radiation source (12), the beam splitter (4) and the detector (6) and preferably the third radiation source (22) according to claim 7 and / or at least a portion of the light guide (7, 7 '). ) according to claim 8 in an integrated arrangement with a substantially opaque housing (14) in and / or on the housing (14) are arranged.
Vorrichtung (1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 10, characterized in that
vor dem Detektor (6) wenigstens ein optisches Filterelement (8) angeord net ist, vorzugsweise ein einfaches Glasfilter,  in front of the detector (6) at least one optical filter element (8) is angeord net, preferably a simple glass filter,
Vorrichtung (1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 1 1, characterized in that
zumindest die zweite Strahlungsquelle (12), die Probe (5), der Detektor (6) sowie ggf. das Filterelement (8) gemäß Anspruch 1 1 auf einer gemeinsamen Seite des Strahlteilers (4) angeordnet sind, vorzugsweise innerhalb der Gehäuses (14) gemäß Anspruch 10.  at least the second radiation source (12), the sample (5), the detector (6) and optionally the filter element (8) according to claim 1 1 are arranged on a common side of the beam splitter (4), preferably within the housing (14) according to claim 10.
13. Vorrichtung ( 1 , 1 ') nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 12, 13. Device (1, 1 ') according to at least one of claims 3 to 12,
dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that
ein einziger gemeinsamer Photodetektor (6) samt Auswerteelektronik (1 1 ) dazu ausgebildet und eingerichtet ist, elektromagnetische Strahlung von mindestens zwei Strahlungsquellen (2, 12) bei wenigstens drei verschiedenen Modulationsfrequenzen (f1 - f3) zu empfangen und auszuwerten, um insbesondere Störeinflüsse der Auswerteelektronik (1 1 ), vorzugsweise Temperatur abhängige Störeinflüsse, zu kompensieren.  a single common photodetector (6) together with evaluation (1 1) is designed and adapted to receive and evaluate electromagnetic radiation from at least two radiation sources (2, 12) at at least three different modulation frequencies (f1 - f3), in particular interfering with the evaluation (1 1), preferably temperature-dependent interference, to compensate.
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