WO2012022119A1 - 一种多重检测免疫层析芯片 - Google Patents

一种多重检测免疫层析芯片 Download PDF

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detection
solid phase
conjugate
pad
quality control
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周蕾
郭兆彪
杨瑞馥
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中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
    • Y10T156/10—Methods of surface bonding and/or assembly therefor
    • Y10T156/1052—Methods of surface bonding and/or assembly therefor with cutting, punching, tearing or severing

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of immunodiagnosis, and relates to a multi-detection immunochromatography chip, which organically combines the immunolayering technology with the chip technology, and can simultaneously detect a plurality of target objects in a sample. Background technique
  • Immunochromatography is a mature on-site rapid detection technology whose physical structure includes the following parts: adhesive backing [a], sample pad [b], bonding pad [c], analytical film [d], and absorbent pad [e], wherein the conjugate (f) of the tracer-bioactive molecule is immobilized in the binding pad, and different kinds of biomolecules are immobilized on the analysis membrane as the detection band [g] and the control band [h].
  • the sample pad [b], the bonding pad [c], the analysis film [d], and the absorbent pad [e] are fixed to the adhesive backing [a] according to a certain overlapping relationship, thereby ensuring continuity of liquid flow inside the chromatography test paper. .
  • the operator only needs to add a liquid sample to the sample pad [b], and the sample penetrates into the bonding pad [c] to re-dissolve the fixed conjugate [f] therein, and in the absorbent pad [e] and Driven by the capillary action, the belt [g] and the quality control belt [h] are moved in the direction of the absorbent pad.
  • the detection zone [g] and A specific immune response occurs on the control band [h], resulting in a detectable signal [j].
  • the chip technology is produced in response to the need for high-throughput detection of the target (nucleic acid or protein) by bioanalysis, which fixes the nucleic acid or protein as a detection probe to different regions of the glass substrate [k] by a spotter. Relatively separate detection matrices, each region in the matrix corresponds to the detection of a target.
  • the sample is directly added to the detection matrix area of the chip, and after incubation (making nucleic acid hybridization or immune reaction occurs), washing, tracing, etc., a detectable signal is generated on the chip according to the presence or absence of the target in a specific area. [j].
  • the homogeneous reaction with immunochromatography is different in one step.
  • the chip technology, especially the protein chip technology is heterogeneous.
  • the invention aims to disclose a multiplex detection immunochromatography chip, which can overcome the shortcomings of the prior art, the immunochromatography technology can not be high-throughput detection and the complicated operation of the chip technology can not be used in the field, by adopting the immunochromatographic reaction mode and The chip detection matrix is organically integrated, and finally realizes high-throughput detection based on the simple operation in the field, that is, simultaneous sampling of multiple target objects can be detected by one sample loading.
  • the object of the present invention is achieved by the following scheme.
  • the structural composition of the immunochromatographic chip of the invention is:
  • the adhesive backing [1] is a hard material coated with pressure sensitive adhesive on one side: PVC board.
  • the sample pad [2] is a substance having a large bed volume and a uniform microstructure: absorbent paper, cellulose film, glass fiber, non-woven fabric or blood filter film.
  • the bonding pad [3] is a material having a larger bed volume and a uniform microstructure: glass fiber, polyester film or non-woven fabric; a plurality of detection conjugates [6] and a kind are fixed in the bonding pad [3]
  • the quality control conjugate [7]; the detection conjugate [6] is formed by the combination of the tracer [8] and the liquid phase detection probe [9], and corresponds one-to-one with the specificity of the target [10] to be examined;
  • the control conjugate [7] is formed by the combination of the tracer [8] and the liquid phase control probe [11], which can control whether the chromatographic process is normal or not.
  • the analysis membrane [4] is a substance with a microscopic structure: a nitrocellulose membrane or a nylon membrane; an analysis membrane unit [4] is provided with a detection matrix unit [12]; each detection matrix unit [12] includes a detection Region [13] and a quality control region [14]; detection region [13] consists of a variety of solid phase detection probes [15], and the quality control region [14] consists of a solid phase quality control probe [16]
  • the position of each solid phase detection probe [15] in the detection zone [13] is clearly fixed corresponding to the specific detection of one of the tested targets [10], while the solid phase quality control in the quality control zone [14]
  • the position of the needle [16] is clearly fixed for quality control of whether the entire chromatography process is normal.
  • the absorbent pad [5] is a substance having a large bed volume: absorbent paper or cellulose film.
  • each test target [10] corresponds to two detection probes, one is fixed as a solid phase detection probe [15] on the analysis membrane [4], and one is used as a liquid phase detection probe [9] and a tracer. [8] The combination becomes fixed at the knot Test the conjugate [6] in the pad [3].
  • the position of the solid phase detection probe [15] in the detection zone [13] on the analysis membrane [4] is clearly fixed, corresponding to the specific detection of each of the tested targets [10], and the target to be examined [10] And detecting a specific immune reaction between the liquid phase detection probes [9] in the conjugate [6], and changing the tracer bound at the well-defined position of the solid phase detection probe [15] by the immune reaction [8]
  • the amount, the presence or absence and concentration of the target [10] is revealed by the change in the amount of the tracer [8].
  • the solid phase quality control probe [16] is clearly fixed in the quality control area [14] on the analysis membrane [4], and can be combined with the quality control probe [7] in the liquid phase quality control probe [11]. Direct combination, so that the quality control chromatography process is normal or not.
  • the immunochromatographic chip of the invention comprises a sandwich mode immunochromatographic chip, an indirect mode immunochromatographic chip and a competitive mode immunochromatographic chip; wherein the sandwich mode immunochromatographic chip comprises a double antibody sandwich mode detection antigen and a double antigen sandwich mode detection Two kinds of antibodies; the indirect mode is to detect a specific antibody in a serum sample, the conjugate is a tracer and a secondary antibody of the test antibody; the competition mode is used for a small molecule such as a hapten having only one antigenic determinant The substance is tested.
  • the preparation method of the immunochromatographic chip of the invention is:
  • binding pad [3] The control conjugate [7] and the detection conjugate [6] are mixed to obtain a conjugate mixture, and the conjugate mixture is applied to the glass fiber and polyester as the bonding pad [3]. On the film or non-woven fabric, dry for use;
  • Analytical membrane [4] preparation The antigen and antibody as the solid phase detection probe [15] and the solid phase quality control probe [16] are spotted on the nitrocellulose membrane or nylon membrane in the form of round spots, each The positions of the probes are clearly fixed and can be accurately addressed, respectively forming the detection area [13] and the quality control area [14], thereby forming a detection matrix unit [12]; in each detection matrix unit [12], solid phase detection
  • the needle [15] and its defined fixed position correspond to the target [10]
  • the solid phase quality control probe [16] requires only one type and also has a fixed fixed position; continuous spraying on the analysis membrane [4] Several detection matrix units [12], drying ones; (see Figure 3)
  • the immunochromatographic chip of the present invention is bonded and sheared: the sample pad [2], the bonding pad [3], the analytical film [4] and the absorbent pad [5] are sequentially pasted as an adhesive backing [1].
  • the dividing point between the self-detecting matrix unit [12] [17] cuts the immunochromatographic chip of the present invention into a separately usable finished product, and obtains the immunochromatographic chip of the present invention;
  • the shaped immunochromatographic chip can be used directly or placed in a plastic housing. (See Figure 4)
  • a method for detecting a biological target using the immunochromatographic chip of the invention A. Adding a sample: dropping a liquid sample or a pretreated liquid sample onto the sample pad [2] of the immunochromatographic chip of the present invention;
  • the detection principle of the immunochromatographic chip of the present invention is as follows: as shown in FIG. 5, after the liquid sample is added to the sample pad [2] in the detection, the liquid sample penetrates into the bonding pad [3] from the sample pad [2]; Under the action of the liquid sample matrix, the immobilized detection conjugate [6] and the quality control conjugate [7] in the binding pad [3] will be re-dissolved freely, and will be separated from the test target [10] in the sample.
  • an immunochromatographic chip is designed by organically merging the immunochromatographic reaction mode with the chip detection matrix, and finally realizes the high premise of simple operation on site. Flux detection, that is, simultaneous sampling to achieve simultaneous detection of multiple target analytes.
  • FIG. 1 Structure of the immunochromatographic chip
  • Liquid phase detection Probe 10, target to be tested, 11, liquid phase quality control probe, 12, detection matrix unit, 13, detection area, 14, quality control area, 15, solid phase detection probe, 16, solid phase quality control Needle
  • FIG. 3 Schematic diagram of the preparation of the analytical membrane
  • FIG. 4 Schematic diagram of immunochromatographic chip sticking and shearing
  • FIG. 1 Schematic diagram of immunochromatographic chip detection
  • FIG. 7 Schematic diagram of double antigen sandwich mode immunochromatography chip detection
  • Bl adhesive backing, B2, sample pad, B3, bond pad, B4, analytical film, B5, absorbent pad, B6, detection conjugate, B7, quality control conjugate, B8, tracer, B9, goat anti-human IgG, B10, human antibody, B11, goat anti-rabbit IgG, B12, detection matrix unit, B13, detection zone, B14, QC, B15, solid phase detection antigen, B16, solid phase control antibody
  • FIG. 9 Schematic diagram of indirect mode immunochromatography chip detection
  • B6 detection of conjugate, B7, quality control conjugate, B8, tracer, B9, goat anti-human IgG, B10, human antibody, B11, goat anti-rabbit IgG, B15, solid phase detection antigen, B16, solid Phase control antibody
  • FIG. 11 Schematic diagram of the competitive mode immunochromatographic chip detection.
  • AA influenza virus antibody detection, AB, parainfluenza antibody detection, AC, respiratory syncytial virus antibody detection, AD, Mycoplasma pneumoniae antibody detection, AE, Chlamydia pneumoniae antibody detection, AF, Legionella pneumophila antibody detection, AG, influenza Haemophilus antibody detection, AH, Klebsiella pneumoniae antibody detection, X , ELISA OD value, y, immunochromatographic chip determination of T/C value
  • BA influenza virus antibody detection, BB, parainfluenza antibody detection, BC, respiratory syncytial virus antibody detection, BD, Mycoplasma pneumoniae antibody detection, BE, Chlamydia pneumoniae antibody detection, BF, hobby Legionella antibody detection, BG, Haemophilus influenzae antibody detection, BH, Klebsiella pneumoniae antibody detection, x, ELISA determination of OD value;; Immunochromatographic chip determination of T/C value
  • CA opium detection, CB, morphine test, CC, heroin test, CD, cocaine test, CE, coca leaf test, CF, amphetamine test, CG, gemcitabine test, CH, mescaline test , ⁇ , concentration (ng/ml), y, immunochromatographic chip to determine T / C value.
  • Influenza virus parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae antibodies in blood using immunochromatographic chips based on double antigen sandwich mode Detection, to quickly identify the cause of fever in patients with fever.
  • binding pad [A3]: Influenza virus surface antigen A, parainfluenza virus surface antigen A, respiratory syncytial virus surface antigen VIII, Mycoplasma pneumoniae surface antigen A, Chlamydia pneumoniae surface antigen A, Legionella pneumophila surface antigen A Haemophilus influenzae surface antigen A and K. pneumoniae surface antigen A were combined with fluorescein Cy5 to prepare 8 detection conjugates [A6]; digoxin was combined with Cy5 to prepare quality control conjugate [A7] ; control the conjugate [A7] and detect the conjugate [A6] in PB buffer
  • Detection performance evaluation Immune layer with samples of clinical influenza virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae antibody positive or negative
  • the detection performance of the chip was evaluated.
  • the chip can accurately distinguish between positive and negative clinical samples, and the sensitivity is the same as the ELISA.
  • influenza virus parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae antibodies in blood using an indirect-mode immunochromatographic chip, To quickly identify the cause of fever in patients with fever.
  • A. Add sample: Mix ⁇ serum sample with 900 ⁇ 1 sample dilution ( ⁇ ⁇ 7. 2 0. 03 ⁇ PB with 0.5% PEG20000, 0.05% SDS, 2% BSA), and mix the ⁇ mixed liquid The sample is added dropwise to the sample pad [ ⁇ 2] of the immunochromatographic chip;
  • Detection performance evaluation Immune layer with clinical influenza virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae antibody positive or negative
  • the detection performance of the chip was evaluated.
  • the chip can accurately distinguish between positive and negative clinical samples, and the sensitivity is the same as the ELISA.
  • Detection of illicit drugs in urine using a competitive-based immunochromatographic chip including crow, morphine, heroin, cocaine, cocaine, amphetamine, methamphetamine, and mescaline.
  • Analytical membrane [C4] preparation opioid monoclonal antibody, morphine monoclonal antibody, heroin monoclonal antibody, cocaine monoclonal antibody, cocaine monoclonal antibody, amphetamine monoclonal antibody, methotrexate Mmg/ml, 9 kinds of bioactive molecules are used as a solid phase detection antibody [C15], and 9 kinds of bioactive molecules are 0. lmg/ml. , a 15 ⁇ l/dot circular spot form forms a 2. 5 cm X 3 cm detection matrix unit [C12] on a 2.
  • the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip is used for detecting a specific antibody in a serum sample, and the detection conjugate is formed by linking a tracer to a specific antigen of the test antibody.
  • the structural composition of the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip (Fig. 6) is:
  • the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip consists of a viscous underlay [Al], a sample pad [A2], a binding pad [A3], an analytical membrane [A4], and an absorbent pad [A5];
  • Adhesive backing [A1] is a hard material coated with pressure sensitive adhesive on one side: PVC board, which can make sample pad [A2], bonding pad [A3], analytical film [A4] and absorbent pad [A5] as appropriate.
  • the overlapping relationship is fixed and fixed to ensure continuity of liquid flow inside the double antigen sandwich mode chromatography chip;
  • the sample pad [A2] is an absorbent paper which is a position where a liquid sample is added during use of the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip;
  • the binding pad [A3] is a glass fiber; the binding pad [A3] is immobilized with several detection conjugates [A6] and a quality control conjugate [A7]; the detection conjugate [A6] is composed of a tracer [A8] and The liquid phase detection antigen [A9] is ligated and has a one-to-one correspondence with the specificity of the test antibody [A10]; the quality control conjugate [A7] is composed of the tracer [A8] and the liquid phase control antigen [Al 1] Connected to form a quality control chromatographic process that is normal or not;
  • the analysis membrane [A4] is a nitrocellulose membrane; wherein the analysis membrane [A4] is provided with a detection matrix unit [A12]; each detection matrix unit [A12] includes a detection zone [A13] and a quality control zone [ A14]; detection zone [A13] consists of a variety of solid phase detection antigens [A15], the quality control zone [A14] consists of a solid phase control antibody [A16]; each solid phase in the detection zone [A13]
  • the position of the detection antigen [A15] is clearly fixed corresponding to the specific detection of a test antibody [A10], and the position of the solid phase control antibody [A16] in the quality control region [A14] is clearly fixed for quality control of the entire chromatography. Whether the process is normal;
  • the absorbent pad [A5] is absorbent paper.
  • the preparation method of the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip is:
  • binding pad [A3] The quality control conjugate [A7] and the detection conjugate [A6] were mixed to obtain a conjugate mixture, and the conjugate mixture was applied to the glass fiber as the bonding pad [A3], and baked. Dry standby
  • Analytical membrane [A4] preparation The solid phase detection antigen [A15] and the solid phase control antibody [A16] were spotted on the nitrocellulose membrane in the form of round spots, and the position of each antigen and antibody was clearly fixed. Addressing, respectively forming a detection area [A13] and a quality control area [A14], thereby forming a detection matrix unit [A12]; in each detection matrix unit [A12], the solid phase detection antigen [A15] and its clear fixed position
  • the solid phase control antibody [A16] requires only one type and also has a fixed fixed position; on the analysis membrane [A4], a continuous number of detection matrix units [A12], Drying standby
  • the immunochromatographic chip of the present invention is affixed and sheared: the sample pad [A2], the bonding pad [A3], the analytical film [A4] and the absorbent pad [A5] are sequentially attached to the adhesive backing [A1].
  • the sample pad [A2], the bonding pad [A3], the analytical film [A4] and the absorbent pad [A5] are sequentially attached to the adhesive backing [A1].
  • the dividing point between the self-detecting matrix unit [A12] [17] cuts the immunochromatographic chip of the present invention into a separately usable finished product, and obtains the immunochromatographic chip of the present invention;
  • the shaped immunochromatographic chip can be used directly or placed in a plastic housing.
  • a method for detecting a biological target using the above double antigen sandwich mode immunochromatographic chip of the present invention :
  • the detection principle of the double antigen sandwich mode immunochromatographic chip of the invention (Fig. 7) is:
  • the liquid sample After the liquid sample is added to the sample pad [A2] in the test, the liquid sample penetrates from the sample pad [A2] into the bonding pad [A3]; under the action of the liquid sample matrix, the binding detection conjugate fixed in the bonding pad [A3] [A6] and the quality control conjugate [A7] will be re-dissolved freely, and with the test antibody [A10] in the sample - leaving the binding pad [A3] into the analysis membrane [A4], under capillary action, through the detection zone [A13] and the control region [A14] surge toward the absorbent pad [A5]; in this process, a site-specific binding of the conjugate [A6] to the test antibody [A10] is detected while The other site of the test antibody [A10] specifically binds to the solid phase detection antigen [A15] in the detection region [A13], and the quality control conjugate [A7] will directly bind to the QC region [ The solid phase control antibody [A16] of A14] is bound; thereby
  • the indirect mode immunochromatographic chip is used to detect a specific antibody in a serum sample, and the detection conjugate is formed by linking the tracer to the secondary antibody of the test antibody.
  • the detection of human serum samples will be described as an example.
  • the structural composition of the indirect mode immunochromatographic chip (Fig. 8) is - the indirect mode immunochromatographic chip consists of an adhesive backing [Bl], a sample pad [B2], a bonding pad [B3], an analytical film [B4], and an absorbent pad. [B5] constitute;
  • the adhesive backing [B1] is a hard surface material coated with pressure sensitive adhesive on one side: PVC board, which can make sample pad [B2], bonding pad [B3], analytical film [B4] and absorbent pad [B5] as appropriate.
  • PVC board which can make sample pad [B2], bonding pad [B3], analytical film [B4] and absorbent pad [B5] as appropriate.
  • the overlapping relationship is fixed and fixed to ensure continuity of liquid flow inside the indirect mode chromatography chip;
  • the sample pad [B2] is a cellulose film which is a position at which a liquid sample is added during use of an indirect mode immunochromatographic chip
  • the binding pad [B3] is a polyester film; the binding pad [B3] is immobilized with a detection conjugate [B6] and a quality control conjugate [B7] ; the detection conjugate [B6] is composed of a tracer [B8] and The goat anti-human IgG [B9] is ligated to specifically react with the human antibody [B10]; the quality control conjugate [B7] is composed of the tracer [B8] and the goat anti-rabbit IgG [B11].
  • the quality control chromatography process is normal or not;
  • the analysis membrane [B4] is a nylon membrane; wherein the analysis membrane [B4] is provided with a detection matrix unit [B12]; each detection matrix unit [B12] includes a detection zone [B13] and a quality control zone [B14]
  • the detection zone [B13] consists of a plurality of solid phase detection antigens [B15], and the quality control zone [B14] consists of a solid phase control antibody [B16], ie rabbit IgG; each solid in the detection zone [B13]
  • the position of the phase detection antigen [B15] is clearly fixed corresponding to the specific detection of a human antibody [B10], while the position of the solid phase control antibody [B16] in the quality control region [B14] is clearly fixed for quality control. Whether the chromatographic process is normal;
  • the absorbent pad [B5] is a cellulose film.
  • the preparation method of the indirect mode immunochromatographic chip is:
  • binding pad [B3] mixing the quality control conjugate [B7] and the detection conjugate [B6] to obtain a conjugate mixture, and applying the conjugate mixture to the polyester film as the bonding pad [B3], Drying standby
  • Analytical membrane [B4] preparation The solid phase detection antigen [B15] and the solid phase control antibody [B16] were spotted on the nylon membrane in the form of round spots. The position of each antigen and antibody was clearly fixed and can be accurately addressed. , respectively forming a detection zone [B13] and a quality control zone [B] to form a detection matrix unit [B12]; in each detection matrix unit [B12], the solid phase detection antigen [B15] and its clear fixed position and The human antibody [B10] is a corresponding one, and the solid phase control antibody [B16] only needs one kind and also has a fixed fixed position; several detection matrix units [B12] are continuously sprayed on the analysis membrane [B4], and dried. Standby
  • the immunochromatographic chip of the present invention is bonded and sheared: the sample pad [B2], the bonding pad [B3], analysis
  • the film [B4] and the absorbent pad [B5] are sequentially pasted on the PVC board as the adhesive backing [Bl] to ensure mutual overlap relationship; the dividing point between the self-detecting matrix elements [B12] [17] will
  • the immunochromatographic chip of the invention is cut into a separately usable finished product, and the immunochromatographic chip of the invention is obtained; the shaped immunochromatographic chip can be directly used or placed in a plastic outer casing.
  • the detection principle of the indirect mode immunochromatographic chip of the present invention (Fig. 9) is:
  • the liquid sample After the liquid sample is added to the sample pad [B2] in the test, the liquid sample penetrates into the bond pad [B3] from the sample pad [B2]; under the action of the liquid sample matrix, the fixed detection conjugate in the bond pad [B3] [B6] and the quality control conjugate [B7] will be re-dissolved freely, and with the test human antibody [B10] in the sample, leaving the binding pad [B3] into the analysis membrane [B4], under capillary action, through detection
  • the region [B13] and the quality control region [B14] are in the direction of the absorbent pad [B5]; in this process, a site-specific binding of the conjugate [B6] to the test antibody [B10] is detected.
  • the solid phase control antibody [B16] of the control region [B14] is a rabbit IgG-binding; thus, the solid phase detection antigen [B15] and the human antibody to be examined are clearly immobilized by analyzing the position in the detection region [B13] on the membrane [B4].
  • the structural composition of the competitive mode immunochromatographic chip (Fig. 10) is:
  • the competitive mode immunochromatographic chip consists of a viscous underlay [Cl], a sample pad [C2], a binding pad [C3], an analytical membrane [C4], and an absorbent pad [C5];
  • Adhesive backing [C1] is a single-sided pressure-sensitive hard material: PVC board, which can make sample pad [C2], bonding pad [C3], analytical film [C4] and absorbent pad [C5] as appropriate The overlapping relationship is fixed and fixed to ensure continuity of liquid flow inside the competitive mode chromatography chip;
  • the sample pad [C2] is a glass fiber that is a location where a liquid sample is added during use of a competitive mode immunochromatographic chip
  • the binding pad [C3] is a nonwoven fabric; the binding pad [C3] is immobilized with several detection conjugates [C6] and one quality control conjugate [C7] ; the detection conjugate [C6] is composed of a tracer [C8] And the liquid phase detection antigen [C9] is linked and has a completely identical antigenic determinant corresponding to the specificity of the test antigen [C10]; the quality control conjugate [C7] is composed of the tracer [C8] and the ground.
  • the combination of Gaoxin [C11] can control the normalization of the chromatographic process;
  • the analysis membrane [C4] is a nitrocellulose membrane; wherein the analysis membrane [C4] is provided with a detection matrix unit [C12]; each detection matrix unit [C12] includes a detection zone [C13] and a quality control zone [ C14] ; detection zone [C13] consists of multiple solid phase detection antibodies [C15], the quality control zone [C14] consists of a solid phase control antibody [C16]; each solid phase in the detection zone [C13]
  • the position of the detection antibody [C15] is clearly fixed corresponding to the specific detection of a test antigen [C10], and the solid phase control antibody [C16] in the QC region [C14] is clearly fixed for the position of the rabbit anti-digoxigenin. Whether the quality of the entire chromatography process is normal;
  • the absorbent pad [C5] is absorbent paper.
  • the preparation method of the competition mode immunochromatographic chip is:
  • binding pad [C3] The control conjugate [C7] and the detection conjugate [C6] were mixed to obtain a conjugate mixture, and the conjugate mixture was applied to a nonwoven fabric as a bonding pad [C3]. Drying standby B.
  • Analytical membrane [C4] preparation The solid phase detection antibody [C15] and the solid phase control antibody [C16] were spotted on the nylon membrane in the form of round spots. The position of each antibody was clearly fixed and can be accurately addressed.
  • detection zone [C13] and QC zone [C14] Forming detection zone [C13] and QC zone [C14] to form a detection matrix unit [C12]; in each detection matrix unit [C12], solid phase detection antibody [C15] and its clear fixed position and antigen to be tested [C10] - a corresponding, solid phase quality control antibody [C16] only needs one and also has a fixed fixed position; several detection matrix units [C12] are continuously sprayed on the analysis membrane [C4], and dried for standby;
  • the immunochromatographic chip of the present invention is bonded and cut: the sample pad [C2], the bonding pad [C3], the analysis film [C4], and the absorbent pad [C5] are sequentially attached to the adhesive backing [C1].
  • the dividing point between the self-detecting matrix unit [C12] [17] cuts the immunochromatographic chip of the present invention into a separately usable finished product, and obtains the immunochromatographic chip of the present invention;
  • the shaped immunochromatographic chip can be used directly or placed in a plastic housing.
  • a method for detecting a biological target using the above-described competitive mode immunochromatographic chip of the present invention :
  • A. Adding a sample dropping a liquid sample or a pretreated liquid sample to the sample pad [C2] of the invention immunochromatographic chip;
  • the detection principle of the competitive mode immunochromatographic chip of the present invention (Fig. 11) is:
  • the liquid sample After the liquid sample is added to the sample pad [C2] in the test, the liquid sample penetrates into the bond pad [C3] from the sample pad [C2] ; under the action of the liquid sample matrix, the fixed detection conjugate in the bond pad [C3] [C6] and the quality control conjugate [C7] will be re-dissolved freely, and enter the analysis membrane [C4] with the test antigen [C10] in the sample, and the test membrane [C4], under capillary action, through the detection The zone [C13] and the quality control zone [C14] surge toward the absorbent pad [C5]; in this process, the test conjugate [C6] and the test antigen [C10] are tested in a competitive manner.
  • the solid phase detection antibody [C15] specifically binds in the measurement zone [C13], and the quality control conjugate [C7] directly binds to the solid phase control antibody [C16] in the control region [C14].
  • the specific competitive immune response between the antibodies [C15] was detected such that a change in the binding amount of the tracer [C8] occurred at a clearly fixed position in the detection zone [C13] on the analysis membrane [C4], that is, the antigen to be tested [ C10]
  • the detection of the conjugate [C6] in the absence of the occupies the entire binding site of the solid phase detection antibody [C15], thereby producing the strongest tracer [C8] signal, and when the antigen [0] is present, Competing with the detection conjugate [C6] for the solid phase detection of the binding site on the
  • the solid phase control antibody [C16] which is clearly fixed in the control region [C14] on the membrane [C4] is the digoxin attached to the rabbit anti-digoxigenin and the quality control conjugate [C7] [CI 1
  • the direct combination between the two shows that the tracer [C8] is bound at a clearly fixed position in the quality control zone [C14] on the analysis membrane [C4], and the presence of the tracer [C8] indicates the normalization of the chromatographic process. get on.

Description

一种多重检测免疫层析芯片
发明领域
本发明属于免疫诊断技术领域， 涉及一种多重检测免疫层析芯片， 将免疫层 析技术与芯片技术有机融合， 可以实现一份样品中多种目标被检物的同时检测。 背景技术
免疫层析技术是一种成熟的现场快速检测技术，其物理结构包括以下几个部 分： 粘性底衬 [a]、 样品垫 [b]、 结合垫 [c]、 分析膜 [d]以及吸水垫 [e]， 其中结 合垫中固定有示踪物 -生物活性分子的结合物 [f]，而分析膜上则固定有不同种类 的生物分子作为检测带 [g]和质控带 [h]。 样品垫 [b]、 结合垫 [c]、 分析膜 [d]以 及吸水垫 [e]按照一定的重叠关系固定于粘性底衬 [a]，从而保证了液体在层析试 纸内部流动的连续性。检测的过程中操作者只需将液体样品滴加于样品垫 [b]上, 样品渗透入结合垫 [c]使其中固定的结合物 [f ]重新溶解游离， 并在吸水垫 [e]以 及毛细作用的带动下，通过检测带 [g]与质控带 [h]向吸水垫的方向移动，在这一 过程中将根据样品中目标被检物的有无，在检测带 [g]与质控带 [h]上发生特异的 免疫反应， 从而产生可检测的信号 [j]。 由于所有检测所需的生物试剂已经全部 固定于成品试纸， 操作者只需完成滴加液体样品的过程， 且整个检测流程只需 10 - 15分钟， 因而免疫层析是最为简便、 快捷的现场检测手段， 但其通常只能对 一种靶标进行分析， 高通量检测未能实现。
芯片技术的产生便是顺应了生物分析对于靶标（核酸或蛋白）高通量检测的 需求， 其通过点样仪将作为检测探针的核酸或蛋白固定于玻璃片基 [k]的不同区 域构成相对分离的检测矩阵，矩阵中的每个区域对应于一种靶标的检测。将样品 直接滴加于芯片的检测矩阵区域， 经过孵育（使核酸杂交或免疫反应得以发生）、 清洗、示踪等步骤，在芯片上将根据靶标的有无从而在特定区域产生可检测的信 号 [j]。 与免疫层析的均相反应（homogeneous )只需的一步加样有所不同， 芯片 技术尤其是蛋白芯片技术属于异相反应（heterogeneous ),其操作过程不可避免 的需要反复的孵育、清洗等过程，且对操作的标准化以及操作的环境有极为严格 的要求，无法实现现场甚至是一线实验室的检测需求。免疫层析技术和芯片技术 的区别特征详见附图 1所示- 若能将免疫层析的快速便捷与芯片技术的高通量有机融合，研制可在现场以 简便的操作实现高通量检测目的的新型技术，则可更好的满足疾控系统等现场检 监测部门对于高通量快速筛査的需求。
发明内容
本发明目的在于公开一种多重检测免疫层析芯片，其可克服在先技术中， 免 疫层析技术无法高通量检测以及芯片技术操作复杂无法现场使用的缺点，通过将 免疫层析反应模式与芯片检测矩阵设置有机融合，最终实现了以现场简便操作为 前提的高通量检测， 即一次加样实现多种目标被检物的同步检测。
本发明的目的是通过如下方案实现的。
本发明免疫层析芯片的结构组成为：
粘性底衬 [1]、 样品垫 [2]、 结合垫 [3]、 分析膜 [4]和吸水垫 [5]。 （如附图 2 所示）
其中， 粘性底衬 [1]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质： PVC板。
其中， 样品垫 [2]是具有较大床体积且微观结构均匀的物质： 吸水纸、纤维 素膜、 玻璃纤维、 无纺布或滤血膜。
其中， 结合垫 [3]是具有较大床体积且微观结构均匀的物质： 玻璃纤维、聚 酯膜或无紡布；结合垫 [3]中固定有若干种检测结合物 [6]与一种质控结合物 [7] ; 检测结合物 [6]由示踪物 [8]和液相检测探针 [9]连接而成， 并与被检靶标 [10]特 异性的一一对应；质控结合物 [7]由示踪物 [8]和液相质控探针 [11]连接而成，可 质控层析过程正常与否。
其中， 分析膜 [4]是微观结构均勾的物质： 硝酸纤维素膜或尼龙膜； 分析膜 [4]上设置有一个检测矩阵单元 [12] ;每个检测矩阵单元 [12]包括一个检测区 [13] 与一个质控区 [14] ; 检测区 [13]由多种固相检测探针 [15]构成，质控区 [14]由一 种固相质控探针 [16]构成；检测区 [13]中的每种固相检测探针 [15]位置明确固定 对应于一种被检靶标 [10]的特异性检测， 而质控区 [14]中的固相质控探针 [16] 位置明确固定用于质控整个层析流程是否正常。
其中， 吸水垫 [5〕是具有较大床体积的物质： 吸水纸或纤维素膜。
其中， 每种被检靶标 [10]对应两个检测探针， 一个作为固相检测探针 [15] 固定于分析膜 [4]上， 一个作为液相检测探针 [9]与示踪物 [8]结合成为固定于结 合垫 [3]内的检测结合物 [6]。
其中， 固相检测探针 [15]在分析膜 [4]上检测区 [13]内的位置明确固定，对 应于每种被检靶标 [10]的特异性检测， 与被检靶标 [10]以及检测结合物 [6]中的 液相检测探针 [9]之间可发生特异的免疫反应， 通过免疫反应改变固相检测探针 [15]所在明确固定位置处结合的示踪物 [8]量，通过示踪物 [8]量的改变揭示被检 靶标 [10]的有无以及浓度。
其中， 固相质控探针 [16]在分析膜 [4]上质控区 [14]内的位置明确固定，可 与质控结合物 [7]内的液相质控探针 [11]直接结合，从而质控层析过程正常与否。
其中， 本发明免疫层析芯片包括夹心模式免疫层析芯片、 间接模式免疫层 析芯片和竞争模式免疫层析芯片；其中夹心模式免疫层析芯片包括双抗体夹心模 式检测抗原和双抗原夹心模式检测抗体两种；间接模式是对血清样品中的特定抗 体进行检测， 结合物为示踪物与被检抗体的二抗连接而成； 竞争模式用于对只有 一个抗原决定簇的半抗原等小分子物质进行检测。
本发明免疫层析芯片的制备方法为：
A. 结合垫 [3〕制备： 将质控结合物 [7]和检测结合物 [6]混合得结合物混合 液， 将结合物混合液加于作为结合垫 [3]的玻璃纤维、 聚酯膜或无纺布上， 烘干 备用；
B.分析膜 [4]制备：将作为固相检测探针 [15]与固相质控探针 [16]的抗原、 抗体以圆形斑点形式点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每种探针位置明确固定可以 准确寻址，分别形成检测区 [13]与质控区 [14]，从而构成一个检测矩阵单元 [12]； 每个检测矩阵单元 [12]中，固相检测探针 [15]及其明确固定位置与被检靶标 [10] 一一对应， 固相质控探针 [16]只需一种且也具有明确固定位置； 在分析膜 [4]上 连续喷点若干个检测矩阵单元 [12]， 烘千备用； （见附图 3)
C. 本发明免疫层析芯片粘帖剪切成型： 将样品垫 [2]、 结合垫 [3]、 分析膜 [4]和吸水垫 [5]依次粘帖于作为粘性底衬 [1]的 PVC板上， 确保相互之间的重叠 关系； 自检测矩阵单元 [12]之间的分割点 [17]将本发明免疫层析芯片剪切为单独 可用的成品，得本发明免疫层析芯片；成型的免疫层析芯片可直接使用或置入塑 料外壳中使用。 （见附图 4 )
一种用本发明免疫层析芯片进行生物靶标检测的方法： A. 添加样品： 将液体样品或经过预处理的液体样品滴加至本发明免疫层析 芯片的样品垫 [2]上；
B.层析反应：静置数分钟待层析反应完成；层析的过程中，检测结合物 [6]、 被检靶标 [10]和固相检测探针 [15]之间发生特异性的免疫反应， 在分析膜 [4]的 明确固定位置发生示踪物 [8]结合量的变化，示踪物 [8]的结合量直接反应了被检 靶标 [10]的有无或多少；
C. 结果判读： 对于带有颜色的示踪物 [8]可直接肉眼观察判定结果， 对于产 生光、电或磁信号的示踪物 [8]需仪器进行结果判读；由于针对特定被检靶标 [10] 的固相检测探针 [15]在分析膜 [4]上的位置明确固定， 因而对明确固定位置上示 踪物 [8]的信号， 包括颜色、 光、 电或磁， 进行判读即可实现某种被检靶标 [10] 的定性定量检测。
本发明免疫层析芯片的检测原理为：如附图 5所示，检测中将液体样品添加 至样品垫 [2]上后， 液体样品自样品垫 [2]渗透入结合垫 [3] ; 在液体样品基质的 作用下， 结合垫 [3]中固定的检测结合物 [6]与质控结合物 [7]将重新溶解游离， 并同样品中的被检靶标 [10]—同离开结合垫 [3]进入分析膜 [4] , 在毛细作用下， 通过检测区 [13]与质控区 [14]向吸水垫 [5]的方向涌动； 在这一过程中， 检测结 合物 [6]与被检靶标 [10]将按照免疫反应模式的不同与检测区 [13]中位置明确固 定的固相检测探针 [15]发生特异的免疫反应， 而质控结合物 [7]将直接与质控区 [14]的固相质控探针 [16]结合； 由此通过分析膜 [4]上检测区 [13]内位置明确固 定的固相检测探针 [15]、 被检靶标 [10]、 检测结合物 [6]上连接的液相检测探针 [9]之间的特异性免疫反应，改变了分析膜 [4]上检测区 [13]内明确固定位置处结 合示踪物 [8]的量，最终明确固定位置处示踪物 [8]信号的有无以及强弱变化则代 表了某种特定被检靶标 [10]的有无以及浓度高低； 而分析膜 [4]上质控区 [14]内 位置明确固定的固相质控探针 [16]与质控结合物 [7]上连接的液相质控探针 [11] 之间的直接结合， 使得分析膜 [4]上质控区 [14]内明确固定位置处有示踪物 [8] 结合， 示踪物 [8]的存在则指示了层析过程的正常进行。
在传统技术中， 免疫层析技术无法高通量检测， 而芯片技术操作复杂无法现 场使用。针对这些问题，在本发明中通过将免疫层析反应模式与芯片检测矩阵设 置有机融合，设计了一种免疫层析芯片，最终实现了以现场简便操作为前提的高 通量检测， 即一次加样实现多种目标被检物的同步检测。
说明书附图 - 附图 1 : 免疫层析技术与芯片技术比较；
a、 粘性底衬， b、 样品垫， c、 结合垫， d、 分析膜， e、 吸水垫， ί、 结合物， g、 检测带， h、 质控带， i、 液体样品流动方向， j、 可检测信号， k、 玻璃片基， 1、 靶标 1检测区， m、 靶标 2检测区， n、 液体样品扩散方向
附图 2: 免疫层析芯片结构组成图；
1、 粘性底衬， 2、 样品垫， 3、 结合垫， 4、 分析膜， 5、 吸水垫， 6、 检测结 合物， 7、 质控结合物， 8、 示踪物， 9、 液相检测探针， 10、 被检靶标， 11、 液 相质控探针， 12、 检测矩阵单元， 13、 检测区， 14、质控区， 15、 固相检测探针， 16、 固相质控探针
0、 特异检测， p、 系统质控
附图 3: 分析膜制备示意图；
4、 分析膜、 12、 检测矩阵单元、 13、 检测区、 14、 质控区
附图 4: 免疫层析芯片粘帖剪切成型示意图；
1、 粘性底衬、 2、 样品垫、 3、 结合垫、 4、 分析膜、 5、 吸水垫、 17、 分割 点
附图 5: 免疫层析芯片检测原理图；
6、 检测结合物， 7、 质控结合物， 8、 示踪物， 9、 液相检测探针， 10、 被检 靶标， 11、 液相质控探针， 15、 固相检测探针， 16、 固相质控探针
o、 特异检测， p、 系统质控， q、 液体样品流动方向， r、 检测信号 附图 6: 双抗原夹心模式免疫层析芯片结构组成图；
Al、 粘性底衬， A2、 样品垫， A3 结合垫， A4、 分析膜， A5、 吸水垫， A6、 检测结合物， A7、 质控结合物， A8、 示踪物， A9、 液相检测抗原， A10、 被检抗 体， All、液相质控抗原， A12、检测矩阵单元， A13、检测区， A14、质控区， A15、 固相检测抗原， M6、 固相质控抗体
A - o、 特异检测、 A- p、 系统质控
附图 7: 双抗原夹心模式免疫层析芯片检测原理图；
A6、 检测结合物， A7、 质控结合物， A8、 示踪物， A9、 液相检测抗原， A10、 被检抗体， All、 液相质控抗原， A15、 固相检测抗原， A16、 固相质控抗体 A-o、 特异检测， A-p、 系统质控， A- q、 液体样品流动方向， A-r、 检测信号 附图 8: 间接模式免疫层析芯片结构组成图；
Bl、 粘性底衬， B2、 样品垫， B3、 结合垫， B4、 分析膜， B5、 吸水垫， B6、 检测结合物， B7、 质控结合物， B8、 示踪物， B9、 羊抗人 IgG， B10、 被检人抗 体， B11 、 羊抗兔 IgG, B12、 检测矩阵单元， B13、 检测区， B14、 质控区， B15、 固相检测抗原， B16、 固相质控抗体
B-o、 特异检测， B- p、 系统质控
附图 9: 间接模式免疫层析芯片检测原理图；
B6、 检测结合物， B7、 质控结合物， B8、 示踪物， B9、 羊抗人 IgG， B10、 被检人抗体， B11 、 羊抗兔 IgG， B15、 固相检测抗原， B16、 固相质控抗体
B-o、 特异检测， B- p、 系统质控， B- q、 液体样品流动方向， B-r、 检测信号 附图 10: 竞争模式免疫层析芯片结构组成图；
Cl、 粘性底衬， C2、 样品垫， C3、 结合垫， C4、 分析膜， C5、 吸水垫， C6、 检测结合物， C7、 质控结合物， C8、 示踪物， C9、 液相检测抗原， C10、 被检抗 原， Cll、 地高辛， C12、 检测矩阵单元， C13、 检测区， C14、 质控区， C15、 固 相检测抗体， C16、 固相质控抗体
C - o、 特异检测， Ορ、 系统质控
附图 11 : 竞争模式免疫层析芯片检测原理图。
C6、 检测结合物， C7、 质控结合物， C8、 示踪物， C9、 液相检测抗原， C10、 被检抗原， Cl l、 地高辛， C15、 固相检测抗体， C16、 固相质控抗体
C-o、 特异检测， C- p、 系统质控， C-q、 液体样品流动方向， C- r、 检测信号 附图 12: 双抗原夹心模式免疫层析芯片实验例结果
A-A、 流感病毒抗体检测， A-B、 副流感病毒抗体检测， A-C、 呼吸道合胞 病毒抗体检测， A-D、 肺炎支原体抗体检测， A-E、 肺炎衣原体抗体检测， A-F、 嗜肺军团菌抗体检测， A-G、 流感嗜血杆菌抗体检测， A-H、 肺炎克雷伯菌抗体 检测， X、 ELISA测定 OD值， y, 免疫层析芯片测定 T/C值
附图 13: 间接模式免疫层析芯片实验例结果
B-A、 流感病毒抗体检测， B-B、 副流感病毒抗体检测， B-C、 呼吸道合胞病 毒抗体检测， B-D、 肺炎支原体抗体检测， B-E、 肺炎衣原体抗体检测， B-F、 嗜 肺军团菌抗体检测， B-G、 流感嗜血杆菌抗体检测， B-H、 肺炎克雷伯菌抗体检 测， x、 ELISA测定 OD值， ；、 免疫层析芯片测定 T/C值
附图 14: 竞争模式免疫层析芯片实验例结果
C-A、 鸦片检测， C-B、 吗啡检测， C-C、 海洛因检测， C-D、可卡因检测， C-E、 可卡叶检测， C-F、 安非他明检测， C-G、 基安非他明检测， C-H、 麦司 卡林检测， χ、 浓度 （ng/ml)， y, 免疫层析芯片测定 T/C值。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例 1: 可对 "发热待査相关病原体对应抗体"进行检测的双抗原夹心模式免 疫层析芯片
利用基于双抗原夹心模式的免疫层析芯片对血液中的流感病毒、 副流感病 毒、 呼吸道合胞病毒、 肺炎支原体、 肺炎衣原体、 嗜肺军团菌、 流感嗜血杆菌、 肺炎克雷伯菌抗体进行检测， 以快速明确发热待查病人的发热原因。
制'备方法：
A. 结合垫 [A3]制备： 将流感病毒表面抗原 A、 副流感病毒表面抗原 A、 呼 吸道合胞病毒表面抗原八、 肺炎支原体表面抗原 A、肺炎衣原体表面抗原 A、 嗜 肺军团菌表面抗原 A、 流感嗜血杆菌表面抗原 A、 肺炎克雷伯菌表面抗原 A分 别与荧光素 Cy5结合， 制备 8种检测结合物 [A6] ; 将地高辛与 Cy5结合， 制备 质控结合物 [A7] ; 将质控结合物 [A7]和检测结合物 [A6]在 PB 缓冲液
(0. 03M, pH=7. 2 )中混合为结合物混合液， 9种标记物每种终浓度为 lmg/ml， 将 结合物混合液滴加于作为结合垫 [A3]的 lcmX 30 cm玻璃纤维上， 37°C5h烘干备 用；
B. 分析膜 [A4]制备： 将流感病毒表面抗原 B、 副流感病毒表面抗原 B、 呼 吸道合胞病毒表面抗原 B、 肺炎支原体表面抗原 B、 肺炎衣原体表面抗原 B、 嗜 肺军团菌表面抗原 B、流感嗜血杆菌表面抗原 B、肺炎克雷伯菌表面抗原 B作为 固相检测抗原 [A15]，将兔抗地高辛 IgG作为固相质控抗体 [A16]，将 9种生物活 性分子以 0. lmg/ml , 15μ1/点的圆形斑点形式点在 2. 5cmX 30cra的硝酸纤维素膜 上形成一个 2. 5cm X 3cm的检测矩阵单元 [A12]， 其中 8种固相检测抗原 [A15]构 成检测区 [A13]， 1种固相质控抗体 [A16]构成质控区 [A14]， 连续喷点 10个检测 矩阵单元 [A12]， 烘干备用； C.免疫层析芯片粘帖剪切成型：将 1. 5cmX 30cm的样品垫 [A2]、 lcmX 30 era 的结合垫 [A3]、 2. 5cm X 30cm分析膜 [A4]和 3cmX 30cm的吸水垫 [A5]依次粘帖于 作为粘性底衬 [A1]的 7. 4cmX 30cm的 PVC板上， 其中样品垫 [A2]与结合垫 [A3] 重叠 3議并位于其上，结合垫 [A3]与分析膜 [A4]重叠 1mm并位于其上，吸水垫 [A5] 与分析膜 [A4]重叠 2mra并位于其上，最后获得 7. 4cmX 30cm的半成品，其中纵向 每 3cm间隔为一个检测矩阵单元 [A12]之间的分割点 [17] ; 自分割点 [17]将本发 明免疫层析芯片剪切为单独可用的成品， 得本发明免疫层析芯片；
样品检测与结果为：
A. 添加样品： 将 Ιθθμΐ血清样品与 900μ1 样品稀释液 （ρΗ=7. 2 0. 03Μ ΡΒ 含 0. 5%PEG20000, 0. 05%SDS， 2%BSA) 混合， 将 ΙΟΟθμΙ混合后的液体样品滴加 至本免疫层析芯片的样品垫 [Α2]上；
Β. 层析反应： 静置 5min待层析反应完成；
C. 结果判读： 用扫描仪对免疫层析芯片上的 Cy5荧光信号进行扫描分析； 由于针对每种被检抗体 [A10]的固相检测抗原 [A15]在分析膜 [A4]上的位置明确 固定， 因而对检测区 [A13]上明确固定位置处示踪物 [A8]的信号进行提取分析， 即可获得每种被检抗体 [A10]对应的信号强度， 并将其赋值为 T; 将质控区 [A14] 的信号强度赋值为 C; 以 T/C作为每种被检抗体 [A10]的检测结果；
D. 检测性能评价： 以临床流感病毒、 副流感病毒、 呼吸道合胞病毒、 肺炎 支原体、肺炎衣原体、 嗜肺军团菌、 流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌抗体阳性或阴 性的样本对免疫层析芯片的检测性能进行评价，对照方法为 ELISA (其中 ELISA 检测结果 OD值小于 0.2为阴性， 大于 0.2为阳性）； 结果 （如图 12) 显示： 以 T/C=0.15 作为判定值， 免疫层析芯片可以准确区分阳性与阴性临床样品， 且敏 感性与 ELISA持平。
实验例 2: 可对 "发热待査相关病原体对应抗体"进行检测的间接模式免疫层析 芯片
利用基于间接模式的免疫层析芯片对血液中的流感病毒、副流感病毒、呼吸 道合胞病毒、 肺炎支原体、 肺炎衣原体、 嗜肺军团菌、 流感嗜血杆菌、 肺炎克雷 伯菌抗体进行检测， 以快速明确发热待查病人的发热原因。
制备方法： A. 结合墊 [B3]制备： 将羊抗人 IgG与荧光素 Cy5结合， 制备检测结合物 [B6] ; 将羊抗兔 IgG与 Cy5结合， 制备质控结合物 [B7] ; 将质控结合物 [B7]和检 测结合物 [B6]在 PB缓冲液 （0. 03M, pH=7. 2) 中混合为结合物混合液， 其中检测 结合物 [B6]终浓度为 8mg/ml， 质控结合物 [B7]终浓度为 lmg/ml， 将结合物混合 液滴加于作为结合垫 [B3]的 lcinX 30 cm玻璃纤维上， 37°C5h烘干备用；
B. 分析膜 [B4]制备： 将流感病毒表面抗原 B、 副流感病毒表面抗原 B、 呼 吸道合胞病毒表面抗原8、 肺炎支原体表面抗原 B、 肺炎衣原体表面抗原 B、 嗜 肺军团菌表面抗原 B、流感嗜血杆菌表面抗原 B、肺炎克雷伯菌表面抗原 B作为 固相检测抗原 [B15]，将兔 IgG作为固相质控抗体 [B16]，将 9种生物活性分子以 0. lmg/ml, 15μ1/点的圆形斑点形式点在 2. 5cmX 30cm的硝酸纤维素膜上形成一 个 2. 5cmX 3cm的检测矩阵单元 [B12]， 其中 8种固相检测抗原 [A15]构成检测区 [B13] , 1种固相质控抗体 [B16]构成质控区 [B14]， 连续喷点 10个检测矩阵单元 [B12] , 烘干备用；
C.免疫层析芯片粘帖剪切成型：将 1. 5cm X 30cm的样品垫 [B2]、 lcmX 30 cm 的结合垫 [B3]、 2. 5cm X 30cm分析膜 [B4]和 3cmX 30cm的吸水垫 [B5]依次粘帖于 作为粘性底衬 [B1]的 7. 4cmX 30cm的 PVC板上， 其中样品垫 [B2]与结合垫 [B3] 重叠 3πιπι并位于其上，结合垫 [B3]与分析膜 [B4]重叠 1醒并位于其上，吸水垫 [B5] 与分析膜 [B4]重叠 2mm并位于其上，最后获得 7. 4CmX 30cm的半成品，其中纵向 每 3cm间隔为一个检测矩阵单元 [B12]之间的分割点 [17] ; 自分割点 [17]将本发 明免疫层析芯片剪切为单独可用的成品， 得本发明免疫层析芯片；
样品检测与结果为：
A. 添加样品： 将 Ιθθμΐ血清样品与 900μ1 样品稀释液 （ΡΗ=7. 2 0. 03Μ PB 含 0. 5%PEG20000, 0. 05%SDS, 2%BSA) 混合， 将 ΙΟΟΟμΙ混合后的液体样品滴加 至本免疫层析芯片的样品垫 [Β2]上；
Β. 层析反应： 静置 5min待层析反应完成；
C. 结果判读： 用扫描仪对免疫层析芯片上的 Cy5荧光信号进行扫描分析； 由于针对每种被检抗体 [B10]的固相检测抗原 [B15]在分析膜 [B4]上的位置明确 固定， 因而对检测区 [B13]上明确固定位置处示踪物 [B8]的信号进行提取分析， 即可获得每种被检抗体 [B10]对应的信号强度， 并将其赋值为 T; 将质控区 [B14] 的信号强度赋值为 C; 以 T/C作为每种被检抗体 [B10]的检测结果；
D. 检测性能评价： 以临床流感病毒、 副流感病毒、 呼吸道合胞病毒、 肺炎 支原体、 肺炎衣原体、 嗜肺军团菌、 流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌抗体阳性或阴 性的样本对免疫层析芯片的检测性能进行评价，对照方法为 ELISA (其中 ELISA 检测结果 OD值小于 0.2为阴性， 大于 0.2为阳性）； 结果 （如图 12) 显示： 以 T/C=0.15 作为判定值， 免疫层析芯片可以准确区分阳性与阴性临床样品， 且敏 感性与 ELISA持平。
实验例 3: 可对 "违禁药品"进行检测的竞争模式免疫层析芯片
利用基于竞争模式的免疫层析芯片对尿液中的违禁药品进行检测， 包括鸦 片、 吗啡、 海洛因、 可卡因、 可卡叶、 安非他明、 甲基安非他明、 麦司卡林。
制备方法：
A. 结合垫 [C3]制备： 将 BSA-鸦片、 BSA-吗啡、 BSA-海洛因、 BSA-可卡因、 BSA-可卡叶、 BSA-安非他明、 BSA-甲基安非他明、 BSA-麦司卡林分别与荧光 素 Cy5结合， 制备 8种检测结合物 [C6] ; 将地高辛与 Cy5结合， 制备质控结合 物 [C7]； 将质控结合物 [C7]和检测结合物 [C6]在 PB缓冲液 （0. 03M, pH=7. 2) 中 混合为结合物混合液， 9种标记物每种终浓度为 lmg/ml，将结合物混合液滴加于 作为结合垫 [C3]的 lcmX 30 cm玻璃纤维上， 37°C5h烘干备用；
B. 分析膜 [C4]制备： 将鸦片鼠单抗、 吗啡鼠单抗、 海洛因鼠单抗、 可 卡因鼠单抗、 可卡叶鼠单抗、 安非他明鼠单抗、 甲基安非他明鼠单抗、 麦司 卡林鼠单抗作为固相检测抗体 [C15]， 将兔抗地高辛 IgG 作为固相质控抗体 [C16] , 将 9种生物活性分子以 0. lmg/ml, 15μ1/点的圆形斑点形式点在 2. 5cm X 30cm的硝酸纤维素膜上形成一个 2. 5cmX 3cm的检测矩阵单元 [C12]， 其中 8 种固相检测抗体 [C15]构成检测区 [C13]， 1 种固相质控抗体 [C16]构成质控区 [C14] , 连续喷点 10个检测矩阵单元 [C12]， 烘干备用；
C.免疫层析芯片粘帖剪切成型：将 1. 5cm X 30cm的样品垫 [C2]、 lcmX 30 cm 的结合垫 [C3]、 2. 5cra X 30cm分析膜 [C4]和 3cm X 30cm的吸水垫 [C5]依次粘帖于 作为粘性底衬 [C1]的 7. 4CmX 30cm的 PVC板上， 其中样品垫 [C2]与结合垫 [C3] 重叠 3mm并位于其上，结合垫 [C3]与分析膜 [C4]重叠 1mm并位于其上，吸水垫 [C5] 与分析膜 [C4]重叠 2mm并位于其上，最后获得 7. 4cmX 30cm的半成品，其中纵向 每 3cm间隔为一个检测矩阵单元 [C12]之间的分割点 [17] ; 自分割点 [17]将本发 明免疫层析芯片剪切为单独可用的成品， 得本发明免疫层析芯片；
样品检测与结果为-
A. 添加样品： 将 Ιθθμΐ尿液样品与 900μ1 样品稀释液 （ΡΗ=7. 2 0. 03Μ ΡΒ 含 0. 5%PEG8000, 0. 1%SDS, 1%BSA) 混合， 将 ΙΟΟΟμΙ混合后的液体样品滴加至 本免疫层析芯片的样品垫 [C2]上；
Β. 层析反应： 静置 5min待层析反应完成；
C. 结果判读： 用扫描仪对免疫层析芯片上的 Cy5荧光信号进行扫描分析； 由于针对每种被检抗原 [C10]的固相检测抗体 [C15]在分析膜 [C4]上的位置明确 固定， 因而对检测区 [C13]上明确固定位置处示踪物 [C8]的信号进行提取分析， 即可获得每种被检抗原 [C10]对应的信号强度， 并将其赋值为 T; 将质控区 [C14] 的信号强度赋值为 C; 以 T/C作为每种被检抗原 [C10]的检测结果；
D. 检测性能评价： 以违禁品阴性尿液对鸦片、 吗啡、 海洛因、 可卡因、 可卡叶、 安非他明、 甲基安非他明、 麦司卡林标准品进行系列稀释， 对免疫 层析芯片的检测性能进行评价； 结果 （如图 12) 显示： 免疫层析芯片可以准确 区分阳性与阴性样品， 且敏感性可达 100pg/ml。 具体实施方式
实施例 1: 双抗原夹心模式免疫层析芯片
双抗原夹心模式免疫层析芯片用于对血清样品中的特定抗体进行检测，检测 结合物为示踪物与被检抗体的特异性抗原连接而成。
双抗原夹心模式免疫层析芯片的结构组成 （附图 6) 为：
双抗原夹心模式免疫层析芯片由粘性底衬 [Al]、 样品垫 [A2]、 结合垫 [A3]、 分析膜 [A4]以及吸水垫 [A5]构成；
粘性底衬 [A1]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质： PVC 板， 其可使样品垫 [A2]、 结合垫 [A3]、 分析膜 [A4]以及吸水垫 [A5]按照适当的重叠关系粘帖固定， 从而保证液体在双抗原夹心模式层析芯片内部流动的连续性；
样品墊 [A2]是吸水纸，其为双抗原夹心模式免疫层析芯片使用过程中添加液 体样品的位置； 结合垫 [A3]是玻璃纤维；结合垫 [A3]中固定有若干种检测结合物 [A6]与一种 质控结合物 [A7]； 检测结合物 [A6]由示踪物 [A8]以及液相检测抗原 [A9]连接而 成， 并与被检抗体 [A10]特异性的一一对应； 质控结合物 [A7]由示踪物 [A8]以及 液相质控抗原 [Al 1]连接而成， 可质控层析过程正常与否；
分析膜 [A4]是硝酸纤维素膜；其中，分析膜 [A4]上设置有一个检测矩阵单元 [A12] ;每个检测矩阵单元 [A12]包括一个检测区 [A13]与一个质控区 [A14] ;检测 区 [A13]由多种固相检测抗原 [A15]构成，质控区 [A14]由一种固相质控抗体 [A16] 构成；检测区 [A13]中的每种固相检测抗原 [A15]位置明确固定对应于一种被检抗 体 [A10]的特异性检测， 而质控区 [A14]中的固相质控抗体 [A16]位置明确固定用 于质控整个层析流程是否正常；
吸水垫 [A5]是吸水纸。
双抗原夹心模式免疫层析芯片的制备方法为：
A.结合垫 [A3]制备：将质控结合物 [A7]和检测结合物 [A6]混合得结合物混 合液， 将结合物混合液加于作为结合垫 [A3]的玻璃纤维上， 烘干备用；
B.分析膜 [A4]制备：将固相检测抗原 [A15]以及固相质控抗体 [A16]以圆形 斑点形式点在硝酸纤维素膜上， 每种抗原和抗体的位置明确固定可以准确寻址， 分别形成检测区 [A13]与质控区 [A14]， 从而构成一个检测矩阵单元 [A12] ; 每个 检测矩阵单元 [A12]中， 固相检测抗原 [A15]及其明确固定位置与被检抗体 [A10] 一一对应， 固相质控抗体 [A16]只需一种且也具有明确固定位置； 在分析膜 [A4] 上连续喷点若千个检测矩阵单元 [A12] , 烘干备用；
C. 本发明免疫层析芯片粘帖剪切成型： 将样品垫 [A2]、 结合垫 [A3]、 分析 膜 [A4]和吸水垫 [A5]依次粘帖于作为粘性底衬 [A1]的 PVC板上，确保相互之间的 重叠关系； 自检测矩阵单元 [A12]之间的分割点 [17]将本发明免疫层析芯片剪切 为单独可用的成品，得本发明免疫层析芯片；成型的免疫层析芯片可直接使用或 置入塑料外壳中使用。
用上述本发明双抗原夹心模式免疫层析芯片进行生物靶标检测的方法：
A. 添加样品： 将液体样品或经过预处理的液体样品滴加至本发明免疫层析 芯片的样品垫 [A2]上；
B.层析反应：静置数分钟待层析反应完成；层析的过程中，检测结合物 [A6]、 被检抗体 [A10]和固相检测抗原 [A15]之间发生特异性的免疫反应，在分析膜 [A4] 的明确固定位置发生示踪物 [A8]结合量的变化，示踪物 [A8]的结合量直接反应了 被检抗体 [A10]的有无或多少；
C 结果判读： 对于带有颜色的示踪物 [A8]可直接肉眼观察判定结果， 对于 产生光、 电或磁信号的示踪物 [A8]需仪器进行结果判读； 由于针对特定被检抗体 [A10]的固相检测抗原 [A15]在分析膜 [A4]上的位置明确固定，因而对明确固定位 置上示踪物 [A8]的信号， 包括颜色、 光、 电或磁， 进行判读即可实现某种被检抗 体 [A10]的定性定量检测。
本发明双抗原夹心模式免疫层析芯片的检测原理 （附图 7) 为：
检测中将液体样品添加至样品垫 [A2]上后，液体样品自样品垫 [A2]渗透入结 合垫 [A3] ;在液体样品基质的作用下，结合垫 [A3]中固定的检测结合物 [A6]与质 控结合物 [A7]将重新溶解游离，并同样品中的被检抗体 [A10]—同离开结合墊 [A3] 进入分析膜 [A4] ,在毛细作用下，通过检测区 [A13]与质控区 [A14]向吸水垫 [A5] 的方向涌动； 在这一过程中， 检测结合物 [A6]与被检抗体 [A10]的一个位点特异 性的结合，同时被检抗体 [A10]的另一个位点则与检测区 [A13]中位置明确固定的 固相检测抗原 [A15]特异性的结合，而质控结合物 [A7]将直接与质控区 [A14]的固 相质控抗体 [A16]结合；由此通过分析膜 [A4]上检测区 [A13]内位置明确固定的固 相检测抗原 [A15]、被检抗体 [A10]、检测结合物 [A6]上连接的液相检测抗原 [A9] 之间的特异性的双抗原夹心模式免疫反应， 使得分析膜 [A4]上检测区 [A13]内明 确固定位置处发生了示踪物 [A8]的结合，最终明确固定位置处示踪物 [A8]信号的 有无以及强弱变化则代表了某种特定被检抗体 [A10]的有无以及浓度高低， 其中 示踪物 [A8]信号强度与被检抗体 [A10]浓度呈正； 而分析膜 [A4]上质控区 [A14] 内位置明确固定的固相质控抗体 [A16]与质控结合物 [A7]上连接的液相质控抗原 [Al l]之间的直接结合，使得分析膜 [A4]上质控区 [A14]内明确固定位置处有示踪 物 [A8]结合， 示踪物 [A8]的存在则指示了层析过程的正常进行。
实施例 2: 间接模式免疫层析芯片
间接模式免疫层析芯片用于对血清样品中的特定抗体进行检测，检测结合物 为示踪物与被检抗体的二抗连接而成。在此以对人血清样品进行检测为例，进行 说明。 间接模式免疫层析芯片的结构组成 （附图 8) 为- 间接模式免疫层析芯片由粘性底衬 [Bl]、样品垫 [B2]、 结合垫 [B3]、分析膜 [B4]以及吸水垫 [B5]构成；
粘性底衬 [B1]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质： PVC板， 其可使样品垫 [B2]、 结合垫 [B3]、 分析膜 [B4]以及吸水垫 [B5]按照适当的重叠关系粘帖固定， 从而保证液体在间接模式层析芯片内部流动的连续性；
样品垫 [B2]是纤维素膜，其为间接模式免疫层析芯片使用过程中添加液体样 品的位置；
结合垫 [B3]是聚酯膜；结合垫 [B3]中固定有一种检测结合物 [B6]与一种质控 结合物 [B7] ; 检测结合物 [B6]由示踪物 [B8]以及羊抗人 IgG[B9]连接而成， 可与 被检人抗体 [B10]特异性反应； 质控结合物 [B7]由示踪物 [B8]以及羊抗兔 IgG [B11]连接而成， 可质控层析过程正常与否；
分析膜 [B4]是尼龙膜；其中，分析膜 [B4]上设置有一个检测矩阵单元 [B12] ; 每个检测矩阵单元 [B12]包括一个检测区 [B13]与一个质控区 [B14] ;检测区 [B13] 由多种固相检测抗原 [B15]构成， 质控区 [B14]由一种固相质控抗体 [B16〕即兔 IgG构成； 检测区 [B13]中的每种固相检测抗原 [B15]位置明确固定对应于一种被 检人抗体 [B10]的特异性检测， 而质控区 [B14]中的固相质控抗体 [B16]位置明确 固定用于质控整个层析流程是否正常；
吸水垫 [B5]是纤维素膜。
间接模式免疫层析芯片的制备方法为：
A.结合垫 [B3]制备：将质控结合物 [B7]和检测结合物 [B6]混合得结合物混 合液， 将结合物混合液加于作为结合垫 [B3]的聚酯膜上， 烘干备用；
B.分析膜 [B4]制备：将固相检测抗原 [B15]以及固相质控抗体 [B16]以圆形 斑点形式点在尼龙膜上，每种抗原和抗体的位置明确固定可以准确寻址， 分别形 成检测区 [B13]与质控区 [B ] ,从而构成一个检测矩阵单元 [B12] ;每个检测矩阵 单元 [B12]中， 固相检测抗原 [B15]及其明确固定位置与被检人抗体 [B10]—一对 应， 固相质控抗体 [B16]只需一种且也具有明确固定位置； 在分析膜 [B4]上连续 喷点若干个检测矩阵单元 [B12]， 烘干备用；
C. 本发明免疫层析芯片粘帖剪切成型： 将样品垫 [B2]、 结合垫 [B3]、 分析 膜 [B4]和吸水垫 [B5]依次粘帖于作为粘性底衬 [Bl]的 PVC板上，确保相互之间的 重叠关系； 自检测矩阵单元 [B12]之间的分割点 [17]将本发明免疫层析芯片剪切 为单独可用的成品，得本发明免疫层析芯片；成型的免疫层析芯片可直接使用或 置入塑料外壳中使用。
用上述本发明间接模式免疫层析芯片进行生物靶标检测的方法-
A. 添加样品： 将液体样品或经过预处理的液体样品滴加至本发明免疫层析 芯片的样品垫 [B2]上；
B.层析反应：静置数分钟待层析反应完成；层析的过程中，检测结合物 [B6]、 被检人抗体 [B10]和固相检测抗原 [B15]之间发生特异性的免疫反应， 在分析膜 [B4]的明确固定位置发生示踪物 [B8]结合量的变化，示踪物 [B8]的结合量直接反 应了被检人抗体 [B10]的有无或多少；
C. 结果判读： 对于带有颜色的示踪物 [B8]可直接肉眼观察判定结果， 对于 产生光、电或磁信号的示踪物 [B8]需仪器进行结果判读； 由于针对特定被检人抗 体 [B10]的固相检测抗原 [B15]在分析膜 [B4]上的位置明确固定，因而对明确固定 位置上示踪物 [B8]的信号， 包括颜色、 光、 电或磁, 进行判读即可实现某种被检 人抗体 [B10]的定性定量检测。
本发明间接模式免疫层析芯片的检测原理 （附图 9) 为：
检测中将液体样品添加至样品垫 [B2]上后，液体样品自样品垫 [B2]渗透入结 合垫 [B3] ;在液体样品基质的作用下，结合垫 [B3]中固定的检测结合物 [B6]与质 控结合物 [B7]将重新溶解游离， 并同样品中的被检人抗体 [B10]—同离开结合垫 [B3]进入分析膜 [B4]，在毛细作用下，通过检测区 [B13]与质控区 [B14]向吸水垫 [B5]的方向涌动； 在这一过程中， 检测结合物 [B6]与被检人抗体 [B10]的一个位 点特异性的结合，同时被检人抗体 [B10]的另一个位点则与检测区 [B13]中位置明 确固定的固相检测抗原 [B15]特异性的结合， 而质控结合物 [B7]将直接与质控区 [B14]的固相质控抗体 [B16]即兔 IgG结合； 由此通过分析膜 [B4]上检测区 [B13] 内位置明确固定的固相检测抗原 [B15]、被检人抗体 [B10]、检测结合物 [B6]上连 接的羊抗人 IgG[B9]之间的特异性的免疫反应， 使得分析膜 [B4]上检测区 [B13] 内明确固定位置处发生示踪物 [B8]的结合，最终明确固定位置处示踪物 [B8]信号 的有无以及强弱变化则代表了某种特定被检人抗体 [B10]的有无以及浓度高低， 其中示踪物 [B8]信号强度与被检人抗体 [B10]浓度呈正比； 而分析膜 [B4]上质控 区 [B14]内位置明确固定的固相质控抗体 [B16]即兔 IgG 与质控结合物 [B7]上连 接的羊抗兔 IgG [Bl 1 ]之间的直接结合， 使得分析膜 [B4]上质控区 [B14]内明确固 定位置处有示踪物 [B8]结合， 示踪物 [B8]的存在则指示了层析过程的正常进行。
实施例 3: 竞争模式免疫层析芯片
竞争模式免疫层析芯片用于对只有一个抗原决定簇的半抗原等小分子物质 进行检测。
竞争模式免疫层析芯片的结构组成 （附图 10) 为：
竞争模式免疫层析芯片由粘性底衬 [Cl]、样品垫 [C2]、结合垫 [C3]、分析膜 [C4]以及吸水垫 [C5]构成；
粘性底衬 [C1]是单面涂有压力敏感 的硬体材质： PVC 板， 其可使样品垫 [C2]、 结合垫 [C3]、 分析膜 [C4]以及吸水垫 [C5]按照适当的重叠关系粘帖固定， 从而保证液体在竞争模式层析芯片内部流动的连续性；
样品垫 [C2]是玻璃纤维，其为竞争模式免疫层析芯片使用过程中添加液体样 品的位置；
结合垫 [C3]是无纺布；结合垫 [C3]中固定有若干种检测结合物 [C6]与一种质 控结合物 [C7] ; 检测结合物 [C6]由示踪物 [C8]以及液相检测抗原 [C9]连接而成， 并与被检抗原 [C10]特异性的一一对应具有完全一致的抗原决定簇； 质控结合物 [C7]由示踪物 [C8]以及地高辛 [C11]连接而成， 可质控层析过程正常与否；
分析膜 [C4]是硝酸纤维素膜；其中，分析膜 [C4]上设置有一个检测矩阵单元 [C12] ; 每个检测矩阵单元 [C12]包括一个检测区 [C13]与一个质控区 [C14] ; 检测 区 [C13]由多种固相检测抗体 [C15]构成，质控区 [C14]由一种固相质控抗体 [C16] 构成；检测区 [C13]中的每种固相检测抗体 [C15]位置明确固定对应于一种被检抗 原 [C10]的特异性检测， 而质控区 [C14]中的固相质控抗体 [C16]即兔抗地高辛位 置明确固定用于质控整个层析流程是否正常；
吸水垫 [C5]是吸水纸。
竞争模式免疫层析芯片的制备方法为：
A.结合垫 [C3]制备：将质控结合物 [C7]和检测结合物 [C6]混合得结合物混 合液， 将结合物混合液加于作为结合垫 [C3]的无紡布上， 烘干备用； B.分析膜 [C4]制备：将固相检测抗体 [C15]以及固相质控抗体 [C16]以圆形 斑点形式点在尼龙膜上，每种抗体的位置明确固定可以准确寻址， 分别形成检测 区 [C13]与质控区 [C14]， 从而构成一个检测矩阵单元 [C12] ; 每个检测矩阵单元 [C12]中， 固相检测抗体 [C15]及其明确固定位置与被检抗原 [C10]—一对应， 固 相质控抗体 [C16]只需一种且也具有明确固定位置； 在分析膜 [C4]上连续喷点若 干个检测矩阵单元 [C12]， 烘干备用；
C. 本发明免疫层析芯片粘帖剪切成型： 将样品垫 [C2]、结合垫 [C3]、分析 膜 [C4]和吸水垫 [C5]依次粘帖于作为粘性底衬 [C1]的 PVC板上，确保相互之间的 重叠关系； 自检测矩阵单元 [C12]之间的分割点 [17]将本发明免疫层析芯片剪切 为单独可用的成品，得本发明免疫层析芯片；成型的免疫层析芯片可直接使用或 置入塑料外壳中使用。
用上述本发明竞争模式免疫层析芯片进行生物靶标检测的方法：
A. 添加样品： 将液体样品或经过预处理的液体样品滴加至^:发明免疫层析 芯片的样品垫 [C2]上；
B.层析反应：静置数分钟待层析反应完成；层析的过程中，检测结合物 [C6]、 被检抗原 [C10]和固相检测抗体 [C15]之间发生特异性的免疫反应，在分析膜 [C4] 的明确固定位置发生示踪物 [C8]结合量的变化，示踪物 [C8]的结合量直接反应了 被检抗原 [C10]的有无或多少；
C. 结果判读： 对于带有颜色的示踪物 [C8]可直接肉眼观察判定结果， 对于 产生光、 电或磁信号的示踪物 [C8]需仪器进行结果判读； 由于针对特定被检抗原 [C10]的固相检测抗体 [C15]在分析膜 [C4]上的位置明确固定，因而对明确固定位 置上示踪物 [C8]的信号， 包括颜色、光、 电或磁， 进行判读即可实现某种被检抗 原 [C10]的定性定量检测。
本发明竞争模式免疫层析芯片的检测原理 （附图 11 ) 为：
检测中将液体样品添加至样品垫 [C2]上后，液体样品自样品垫 [C2]渗透入结 合垫 [C3] ;在液体样品基质的作用下， 结合垫 [C3]中固定的检测结合物 [C6]与质 控结合物 [C7]将重新溶解游离，并同样品中的被检抗原 [C10]—同离幵结合垫 [C3] 进入分析膜 [C4]，在毛细作用下，通过检测区 [C13]与质控区 [C14]向吸水垫 [C5] 的方向涌动； 在这一过程中， 检测结合物 [C6]与被检抗原 [C10]以竞争方式与检 测区 [C13]中位置明确固定的固相检测抗体 [C15]特异性的结合， 而质控结合物 [C7]直接与质控区 [C14]的固相质控抗体 [C16]即兔抗地高辛结合；由此通过被检 抗原 [C10]、 检测结合物 [C6]上连接的液相检测抗原 [C9]对分析膜 [C4]上检测区 [C13]内位置明确固定的固相检测抗体 [C15]之间的特异性的竞争免疫反应，使得 分析膜 [C4]上检测区 [C13]内明确固定位置处发生了示踪物 [C8]结合量的改变， 即被检抗原 [C10]不存在时检测结合物 [C6]占据了固相检测抗体 [C15]全部的结 合位点， 从而产生最强的示踪物 [C8]信号， 而当被检抗原 [ 0]存在时其与检测 结合物 [C6]竞争固相检测抗体 [C15]上的结合位点， 从而导致示踪物 [C8]信号的 降低；最终明确固定位置处示踪物 [C8]信号的有无以及强弱变化代表了某种特定 被检抗原 [C10]的有无以及浓度高低，其中示踪物 [C8]信号强度与被检抗原 [C10] 浓度呈反比；而分析膜 [C4]上质控区 [C14]内位置明确固定的固相质控抗体 [C16] 即兔抗地高辛与质控结合物 [C7]上连接的地高辛 [CI 1]之间的直接结合， 使得分 析膜 [C4]上质控区 [C14]内明确固定位置处有示踪物 [C8]结合， 示踪物 [C8]的存 在则指示了层析过程的正常进行。

Claims

1、一种多重检测免疫层析芯片，其特征在于该免疫层析芯片的结构组成为： 粘性底衬 [1]、 样品垫 [2〕、 结合垫 [3]、 分析膜 [4]和吸水垫 [5]。
2、 如权利要求 1所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的粘性底 衬 [1]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质： PVC板。
3、 如权利要求 1所述权的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的样品垫 [2]是具有较大床体积且微观结构均匀的物质： 吸水纸、 纤维素膜、 玻璃纤维、 禾
无纺布或滤血膜。
4、 如权利要求 1所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的结合垫 [3]是具有较大床体积且微观结构均匀的物质： 玻璃纤维、 聚酯膜或无纺布； 结 合垫 [3]中固定有若干种检测结合物 [6]与一种质控结合物 [7]； 检测结合物 [6] 由示踪物 [8]和液相检测探针 [9]连接而成， 并与被书检靶标 [10]特异性的一一对 应；质控结合物 [7]由示踪物 [8]和液相质控探针 [11]连接而成，可质控层析过程 正常与否。
5、 如权利要求 1所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的分析膜 [4]是微观结构均匀的物质：硝酸纤维素膜或尼龙膜； 分析膜 [4]上设置有一个检 测矩阵单元 [12] ; 每个检测矩阵单元 [12]包括一个检测区 [13]与一个质控区 [14]；检测区 [13]由多种固相检测探针 [15]构成，质控区 [14]由一种固相质控探 针 [16]构成；检测区 [13]中的每种固相检测探针 [15]位置明确固定对应于一种被 检靶标 [10]的特异性检测，而质控区 [14]中的固相质控探针 [16]位置明确固定用 于质控整个层析流程是否正常。
6、 如权利要求 1所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的吸水垫 [5]是具有较大床体积的物质： 吸水纸或纤维素膜。
7、 如权利要求 4或 5所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的每 种被检靶标 [10]对应两个检测探针，一个作为固相检测探针 [15]固定于分析膜 [4] 上， 一个作为液相检测探针 [9]与示踪物 [8]结合成为固定于结合垫 [3]内的检测 结合物 [6]。
8、 如权利要求 5所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的固相检 测探针 [15]在分析膜 [4]上检测区 [13]内的位置明确固定， 对应于每种被检靶标 [10]的特异性检测， 与被检靶标 [10]以及检测结合物 [6]中的液相检测探针 [9] 之间可发生特异的免疫反应，通过免疫反应改变固相检测探针 [15]所在明确固定 位置处结合的示踪物 [8]量，通过示踪物 [8]量的改变揭示被检靶标 [10]的有无以 及浓度。
9、 如权利要求 5所述的多重检测免疫层析芯片， 其特征在于其中的固相质 控探针 [16]在分析膜 [4]上质控区 [14]内的位置明确固定， 可与质控结合物 [7] 内的液相质控探针 [11]直接结合， 从而质控层析过程正常与否。
10、如权利要求 1所述的多重检测免疫层析芯片，其特征在于免疫层析芯片 包括夹心模式免疫层析芯片、间接模式免疫层析芯片和竞争模式免疫层析芯片三 种；其中夹心模式免疫层析芯片包括双抗体夹心模式检测抗原和双抗原夹心模式 检测抗体两种； 间接模式是对血清样品中的特定抗体进行检测， 结合物为示踪物 与被检抗体的二抗连接而成；竞争模式用于对只有一个抗原决定簇的半抗原等小 分子物质进行检测。
11、 如权利要求 1-10任一所述的多重检测免疫层析芯片的制备方法， 其特 征在于该方法包括如下步骤：
A.结合垫 [3]制备:将质控结合物 [7]和检测结合物 [6]混合得结合物混合液， 将结合物混合液加于作为结合垫 [3]的玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，烘干备用；
B. 分析膜 [4]制备： 将作为固相检测探针 [15]与固相质控探针 [16]的抗原、 抗体以圆形斑点形式点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每种探针位置明确固定可以 准确寻址，分别形成检测区 [13]与质控区 [14]，从而构成一个检测矩阵单元 [12]； 每个检测矩阵单元 [12]中，固相检测探针 [15]及其明确固定位置与被检靶标 [10] 一一对应， 固相质控探针 [16]只需一种且也具有明确固定位置； 在分析膜 [4]上 连续喷点若干个检测矩阵单元 [12]， 烘干备用；
C 本发明免疫层析芯片粘帖剪切成型： 将样品垫 [2]、 结合垫 [3]、 分析膜 [4]和吸水垫 [5]依次粘帖于作为粘性底衬 [1]的 PVC板上， 确保相互之间的重叠 关系； 自检测矩阵单元 [12]之间的分割点 [17]将本发明免疫层析芯片剪切为单独 可用的成品，得本发明免疫层析芯片；成型的免疫层析芯片可直接使用或置入塑 料外壳中使用。
12、 一种生物靶标检测的方法， 其特征在于检测过程中采用权利要求 1-10 任一所述的多重检测免疫层析芯片， 检测流程为：
A. 添加样品： 将液体样品或经过预处理的液体样品滴加至权利要求 1 - 10 任一所述的免疫层析芯片的样品垫 [2]上； B. 层析反应： 静置数分钟待层析反应完成； 层析的过程中，检测结合物 [6]、 被检靶标 [10]和固相检测探针 [15]之间发生特异性的免疫反应，在分析膜 [4]的 明确固定位置发生示踪物 [8]结合量的变化，示踪物 [8]的结合量直接反应了被检 靶标 [10]的有无或多少；
C. 结果判读： 对于带有颜色的示踪物 [8]可直接肉眼观察判定结果， 对于产 生光、电或磁信号的示踪物 [8]需仪器进行结果判读；由于针对特定被检靶标 [10] 的固相检测探针 [15]在分析膜 [4]上的位置明确固定， 因而对明确固定位置上示 踪物 [8]的信号， 包括颜色、 光、 电或磁， 进行判读即可实现某种被检靶标 [10] 的定性定量检测。
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