WO2008001903A1 - Fad-conjugated glucose dehydrogenase gene - Google Patents

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Description

明 細 書
FAD結合型グルコース脱水素酵素遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)結合型グルコース脱水素酵素を コードする新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）、該遺伝子により組換えられた形質転換 細胞を用いる該酵素の製造方法、組換え FAD結合型グルコース脱水素酵素、並び に、該酵素を使用することを特徴とするグノレコースの測定方法、グルコース測定試薬 組成物、及びダルコース測定用のバイオセンサ等に関する。
背景技術
[0002] 血中グノレコース量は糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の検査は、病院検査 室等での臨床検査の他、診療スタッフ等による簡易検査や患者自身による自己検査 といった簡易測定（Point-of-Care Testing:POCT)が実施されている。
[0003] この簡易測定は、グノレコース診断キットやバイオセンサ等の測定装置 (POCT装置 )によって実施されている力 従来、これらの POCT装置にはグルコース酸化酵素が 用レ、られてきた。しかし、グルコース酸化酵素は溶存酸素濃度の影響を受け、計測値 に誤差が生じるため、酸素の影響を受けないグノレコース脱水素酵素の使用が推奨さ れている。
[0004] グルコース脱水素酵素には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD)又はニコ チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADP)を補酵素とする補酵素非結合型グ ルコース脱水素酵素と、ピロ口キノリンキノン (PQQ)、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)等を補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素がある。その中で補 酵素結合型グルコース脱水素酵素は、補酵素非結合型グルコース脱水素酵素に比 べ夾雑成分の影響を受けにくいこと、測定感度が高いこと、更に原理上、 POCT装 置を安価に製造することが可能であるとレ、う利点を有してレ、る。
[0005] し力しながら、従来の PQQ結合型グルコース脱水素酵素は安定性が低ぐしかもマ ノレトースゃガラタトースにも反応してしまうという欠点を有している。マルトースは輸液 に用いられる糖であり、 PQQ結合型グルコース脱水素酵素がマルトースと反応すると 血糖 POCT装置は実際より高い血糖値を表示してしまう。このため、患者が不必要な インシュリン注射を行ってしまう結果、意識障害や昏睡状態に陥る等の低血糖事故が 発生し、大きな問題となっている。
[0006] 特に現在の血糖 POCT装置の用途としては、単に簡易的に血糖を測る目的から、 さらに患者の自己管理及び治療の一手段としての重要性が高まっており、そのため に使用される自己血糖測定装置（Self-Monitoring of Blood Glucose:SMBG)の家庭 への普及は拡大の一途を迪つていることから、測定精度への要求性は非常に高いと 考えられる。
[0007] 現に、 2005年 2月には、 日本において、厚生労働省よりマルトース輸液ゃィコデキ ストリンを含む透析液を投与中の患者に対して、補酵素として PQQを利用している酵 素を用いた血糖測定器の使用に関し、注意を喚起する通達が出されている（2005 年 2月 7日；薬食安発第 0207005号など）。
[0008] 一方、グルコースの脱水素反応を触媒し、 FADを補酵素とする補酵素結合型グノレ コース脱水素酵素としては、 Agrobacterium tumefaciens由来 (J. Biol. Chem. (1967) 2 42： 3665_3t '2)、 Cytophaga marinoflava由来 (Appl. Biochem. Biotechnol. (1996) 56 ： 301-310)、 Halomonas sp. a -15由来 (Enzyme Microb. Technol. (1998) 22： 269-27 4)、 Agaricus bisporus由来 (Arch. Microbiol.(1997) 167: 119-125, Appl. Microbiol. Bio technol. (1999)51 :58- 64)及び Macrol印 iota rhacodes由来 (Arch. Microbiol.(2001)176 : 178-186)の酵素が報告されている力 これらの酵素はグルコースの 2位及び/又は 3位の水酸基を酸化し、いずれもマルトースに対する作用性が高ぐグルコースに対 する選択性が低い。また、同じくマルトースへの作用性が高い、ブルクホルデリア 'セ パシァ（Burkholderia cepacia)由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素も知られ ているが、これは本来の天然型の酵素が α、 β、 γの 3種のサブユニットからなるへ テロオリゴマー酵素で、膜結合性酵素として知られている。したがって、酵素を得るに は可溶化の処理が必要であったり、クローユングで十分な活性を発現させる為には、 必要なサブユニットを同時にクローニングしなければならない等の課題があった。
[0009] これに対して、本発明者らは、 FADを補酵素とする、膜結合型ではなレ、新規な可 溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をァスペルギルス.テレウスから精製して いる（特許文献 1)。この特許文献 1の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、ダル コースの 1位の水酸基を酸化し、グルコースに対する基質認識性に優れ、溶存酸素 の影響を受けず、し力もマルトースに対する作用性が低い（対グノレコース活性を 100 Q/oとした場合の対マルトース活性は 5。/0以下、対ガラクトース活性も 5%以下）というこ れまでに無い優れた特性を有するものである。
[0010] し力、しながら、この特許文献 1の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、野生の微 生物（例えばァスペルギルス属微生物など）の液体培養物から単離、抽出されたもの であり、その生産量には限りがあった。また、酵素生産量が極微量である上に、糖が 多量に酵素に結合し、通常の酵素に結合している N型や〇型糖鎖とは異なる種類の 糖に覆われた「糖包埋型酵素」とでも言うべき形態となっていることにより、その活性を 検出しにくいこと (酵素活性が低い）、糖鎖を酵素的あるいは化学的に除去できない こと、その結果、電気泳動において、通常のタンパク質染色（Coomassie Brilliant Blu e G-250等による）によりほとんど染色されず、遺伝子取得に必要な情報である酵素 のァミノ末端や内部のアミノ酸配列を解読することも通常の精製酵素からでは難しぐ 酵素遺伝子のクローニングに成功し、本酵素活性の発現を確認した事例は公知では ない。
[0011] 一方、ァスペルギルス'ォリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素について は 1967年にその存在が示唆されたことがあったが（非特許文献 1)、部分的に酵素 学的性質が明らかにされたのみで、マルトースに作用しないという特性は示唆されて いたにも関わらず、それ以降はァスペルギルス 'ォリゼ由来の補酵素結合型ダルコ一 ス脱水素酵素に関する詳細な報告はもちろんその他微生物由来の補酵素結合型グ ルコース脱水素酵素についても、グルコースの 1位の水酸基を酸化する酵素につい ては続報が無ぐ補酵素結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列や遺伝子に関 する報告も全く知られていなかった。
[0012] また、グルコースデヒドロゲナーゼ EC 1. 1. 99. 10をグルコース測定に用いるアイ デァは知られていたが（特許文献 2参照）、 FAD結合型グルコース脱水素酵素が実 用的なレベルで生産されたことはなぐ実際にセンサに利用され実用化されるには至 つていなかった。その理由は、本酵素の菌体内での活性は微弱であり、菌体外に分 泌されてもその量は極僅かで、し力も多量の糖に覆われており活性が弱ぐ検出する のさえ困難であったために、遺伝子をクローニングできなかったためと推察される。
[0013] 特許文献 1：国際公開第 2004/058958号パンフレット
特許文献 2：特開昭 59-25700号公報
非特許文献 1： Biochem.Biophys.Acta.，139,277-293,1967
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] PQQ結合型グルコース脱水素酵素の改変に関する遺伝子工学的方法に関しては 既に多くの技術が知られており、これらの従来技術は、主に該酵素の基質特異性の 低さや安定性の低さといつた従来の PQQ結合型グノレコース脱水素酵素の欠点を改 良するための改変型 PQQ結合型グノレコース脱水素酵素と、それを遺伝子工学的に 作成するための改変型遺伝子材料を提供している。
[0015] し力、しながら、改変型遺伝子材料を用いて作成した改変型の PQQ結合型グルコース 脱水素酵素の場合には、依然としてグルコースに対する作用性を 100%とした際の マルトースへの作用性が概ね 10。 /。より高かったり、あるいはマルトースへの反応性を 低くさせた結果として、本来のグノレコースへの反応性 (比活性)までもが落ちてしまい 、基質十分量の条件で電気化学的な測定法で活性を見るとグルコースセンサとして の機能は不充分で、 POCT装置等への使用には至っていないのが実情である。更 に、 PQQ結合型グルコース脱水素酵素の活性発現に必要な補酵素 PQQは、広く一 般的に組換え宿主として用いられる大腸菌では作られず、 PQQを生産する宿主微 生物（シユードモナス等）に限定して組換え体を作らなければならないという問題もあ つに。
[0016] 従って、本発明は、上記課題を解決し、グルコースに対する反応性、熱安定性、基 質認識性に優れ、し力もマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有する FAD結合型グルコース脱水素酵素をコードする新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）、該 遺伝子により組換えられた形質転換細胞を用いる該酵素の製造方法、並びに、得ら れた該酵素を使用することを特徴とするグノレコースの測定方法、グルコース測定試薬 組成物、及びグノレコース測定用のバイオセンサ等を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0017] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、ァスペルギルス *ォリゼ (Aspe rgillus oryzae)菌株において、 FAD結合型グノレコース脱水素酵素が有意に発現する には、その遺伝子がコードするポリペプチドに、アミノ酸配列 (AGVPWV)を含んでい ることが必要であることを見出し、更に、その内の少なくとも 1個のアミノ酸が欠失した 場合には活性が実質的に失われることを確認し、本発明を完成した。即ち、本発明 は以下の各態様に係るものである。
[0018] [態様 1]アミノ酸配列： X1-X2-X3-X4-X5-X6
(XI及び X2は脂肪族アミノ酸、 X3及び X6は分岐アミノ酸、並びに、 X4及び X5は複 素環式アミノ酸又は芳香族アミノ酸を示す）を含むポリペプチドから成る FAD結合型 グノレコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
[態様 2]以下の（a)、 (b)又は（c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(b)アミノ酸配列（a)のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸が置換、欠失又 は付加されたアミノ酸配列から成り、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有する ポリペプチド、又は
(c)アミノ酸配列（a)と 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 成り、かつ、 FAD 結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
[態様 3]以下の（d)、 (e)又は (f )のポリヌクレオチド：
(d)配列番号 2又は配列番号 3に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(e)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオ チドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グルコース脱水 素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
(f)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有する塩基配列を 含み、かつ、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド。
[態様 4]アミノ酸配列: AGVPWVをコードする塩基配列力 成るセンスプライマー及 びァスペルギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素 酵素をコードするポリヌクレオチドの 3'末端側の塩基配列から成るリバースプライマ 一、又は、アミノ酸配列: AGVPWVをコードする塩基配列に対するアンチセンスプライ マー及びァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergillus oryzae;由 5kのト AD結合型グノレコ^ ~ス 脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドの 5'末端側の塩基配列から成るフォワード プライマーの組み合わせを用いる PCRによって増幅可能な DNA断片を有する、 FA D結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ド。
[態様 5]アミノ酸配列: AGVPWVをコードする塩基配列力 成るプローブとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を 有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[態様 6] D_グルコースに対する酵素活性値を 100%とした場合、マルトースに対す る酵素活性値が 10 %以下、 D—ガラクトースに対する酵素活性値が 5 %以下である ことを特徴とする、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)由来の、 FAD結合型グ ルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
[態様 7] 300U/mg以上の酵素活性を有することを特徴とする、ァスペルギルス.ォ リゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリ ヌクレオチド。
[態様 8]上記のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
[態様 9]上記の組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞。
[態様 10]上記の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、グルコースを脱水素 する作用を有する FAD結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする FA
D結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[態様 11]上記の記載のポリヌクレオチドにコードされる、組換え FAD結合型ダルコ一 ス脱水素酵素。
[態様 12]上記の FAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするダル コースの測定方法。
[態様 13]上記の FAD結合型グルコース脱水素酵素を含有することを特徴とするダル コース測定試薬組成物。 [態様 14]上記の FAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするダル コース測定用のバイオセンサ。
発明の効果
[0019] 本発明のポリヌクレオチドを利用することにより、グルコースに対する基質認識性に 優れ、し力、もマルトースに対する作用性が低いとレ、う優れた特性を有する FAD結合型 グノレコース脱水素酵素を、例えば、遺伝子組み換え技術により均質かつ大量に生産 すること力 S可言 となる。
また、このように生産された酵素は、 FAD結合型グルコース脱水素酵素で問題とな つていた糖の量を目的に応じてコントロールできるため、糖含量を減らした酵素を調 製することで、血糖測定などにおいて、試料中の糖 (グルコースなど）に対する作用 性を変えることも可能である。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]酵素固定化電極によるグルコース濃度の検量線を示す。
[図 2]PCRによる目的遺伝子の検出結果を示す。図中の記号は以下の通り。 M : 200b p DNAラダーマーカー（タカラバイオ社製） 1：ァスペルギルス'オリゼ NBRC42682：ァ スペルギルス .ォリゼ NBRC53753：ァスペルギルス 'ォリゼ NBRC62154：ァスペルギル ス'ォリゼ NBRC41815：ァスペルギルス *ォリゼ NBRC42206：ァスペルギルス *ォリゼ N BRC100959
[図 3]サザンハイブリダィゼーシヨンによる目的遺伝子の検出結果を示す。図中の記 号は図 2と同じである。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明の FAD結合型グノレコース脱水素酵素においてはアミノ酸配列： Xト X2-X3-X 4-X5-X6
(XI及び X2は同一又は互いに異なる脂肪族アミノ酸、 X3及び X6は同一又は互い に異なる分岐アミノ酸、並びに、 X4及び X5は同一又は互いに異なる複素環式ァミノ 酸又は芳香族アミノ酸を示す）、即ち、 6個のアミノ酸力 成るポリペプチドが含まれて レ、ることが技術的に重要な点の一つであり、その為に、該酵素が菌体内で有意に発 現される。尚、発現した該酵素は必ずしも菌体外に分泌される必要はなぐ菌体内に 留まる場合もある。対照的に、本明細書の実施例に具体的に示されるように、アミノ酸 配列全体の相同性等から FAD結合型グルコース脱水素酵素と考えられる酵素をコー ドする遺伝子であっても、該アミノ酸配列から成るポリペプチドをコードしてレ、なレ、遺 伝子は FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質を発現しなレ、。
[0022] 上記 6個のアミノ酸配列は、好ましくは、 FAD結合型グルコース脱水素酵素であるポ リペプチドの 202〜207番目に位置し、又は、 X1〜X6の少なくとも一つ力 XIがァラ ニン (A)、 X2がグリシン（G)、 X3がバリン（V)、 X4がプロリン（P)、 X5がトリプトファン (W )、又は、 X6がバリン (V)である。例えば、その好適例として、アミノ酸配列： AGVPWV (配列番号 4)を挙げること力できる。
[0023] 本発明において、「FAD結合型グルコース脱水素酵素」とは、電子受容体存在下で 、グルコースの 1位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒し、グルコースへの作 用性に対してマルトースへの作用性が 10%以下である可溶性の蛋白質を意味し、該 酵素は以下の性質を特徴とする。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、及び
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が 10%以下である。
[0024] 本発明の FAD結合型グルコース脱水素酵素の中で、アミノ酸配列： AGVPWVを有 するものとしては、特に、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)由来のものが好 ましレ、。その代表的な菌株として以下の表 1に示されるような、 NBRC5375株、 NBR C4079株、 NBRC4203株、 NBRC4214株、 NBRC4268株、 NBRC5238株、 N BRC6215株、 NBRC30104株 及び、 NBRC30113株等を挙げることが出来る。 アミノ酸配列： AGVPWVは、該酵素のアミノ酸配列において、シグナル配列部分の開 始アミノ酸 Mを 1番目とした時の第 202〜207番目（NBRC5375株由来）付近（その 他の菌株由来の酵素の場合には、その位置に相当する場所）に含まれている。
[0025] 例えば、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae) NBRC5375株が発現する FAD 結合型グノレコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号 1 (シグナルペプチドを含む
)、それをコードする染色体 DNAの塩基配列は配列番号 2、又、配列番号 1に示され るアミノ酸に対応する cDNAは配列番号 3で夫々示される。尚、配列番号 2又は 3に おいて、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列は GCTGGTGTTCCATGGGT T (配列番号 5)である。
[0026] 従って、本発明のポリヌクレオチドは、ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae)の 菌株由来の上記のものに加えて、以下の（a)、 （b)又は（c)のポリペプチドをコードす るポリヌクレ才チド：
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(b)アミノ酸配列（a)において、 1個〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたァ ミノ酸配列から成り、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、 又は
(c)アミノ酸配列（a)と 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 成り、かつ、 FAD 結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、が含まれる。
[0027] 更に、本発明のポリヌクレオチドには、以下の（d)、（e)又は（f)のポリヌクレオチド：
(d)配列番号 2又は配列番号 3に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(e)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオド とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グルコース脱水素酵 素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
(f)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有する塩基配列を 含み、かつ、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド、が含まれる。
[0028] 特に、上記の（b)又は（c)のポリペプチドが上記アミノ酸配列： X1-X2-X3-X4-X5-X6 を含むもの、又は、（e)又は（f)のポリヌクレオチドが該アミノ酸配列をコードする塩基 配列を含むものが好ましレ、。更に、このアミノ酸配列が AGVPWVであるものが好まし レ、。
[0029] 本明細書において、 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列又は塩基配列とは、夫 々比較対象となる基準配列の全長にわたり、少なくとも 70%の同一性を示し、好まし くは 75%以上、より好ましくは 80%以上、さらにより好ましくは 90%以上、特に好まし くは 95%以上の同一性を有する各配列をいう。このような配列の同一性パーセンテ ージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販され ているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、 BLAST、 FASTA、又 は GENETYX (ソフトウェア開発株式会社製）などを用いることができ、これらはデフ オルトパラメーターで使用することができる。
[0030] 本発明において、ポリヌクレオチド間のハイブリダィズに際しての「ストリンジヱントな 条件下でハイブリダィズ」の具体的な条件とは、例えば、 50。/。ホノレムアミド、 5 X SSC (150mM 塩ィ匕ナトリウム、 15mM クェン酸三ナトリウム、 10mM リン酸ナトリウム 、 ImM エチレンジァミン四酢酸、 ρΗ7. 2)、 5 Χデンハート（Denhardt' s)溶液、 0. 1 % SDS、 10% デキストラン硫酸及び 100 z g/mLの変性サケ精子 DNAで 42 °Cインキュベーションした後、フィルターを 0. 2 X SSC中 42°Cで洗浄することを例示 すること力 Sできる。
[0031] 更に、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列か ら成るセンスプライマー及びァスペルギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD 結合型グノレコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドの 3 '末端側の塩基配列 力 成るリバースプライマー、又は、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列対 するアンチセンスプライマー及びァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドの 5'末端側の塩基 配列力 成るフォワードプライマーの組み合わせを用いる PCRによって増幅可能な D NA断片を有する、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチドを含む。
[0032] 或いは、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列 から成るプローブとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グ ルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
[0033] 好ましくは、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列は（GCTGGTGTTCCATG GGTT)である。又、上記の PCR及びストリンジヱントな条件下でのハイブリダィズに関 する各種の条件は本明細書中の実施例の記載に準じて当業者が適宜選択すること が出来る。
[0034] 更に、本発明のポリヌクレオチドには、 D—グノレコースに対する酵素活性値を 100% とした場合、マルトースに対する酵素活性値が 10%以下、好ましくは 5%以下、より好 ましくは 3%以下であり、 D—ガラクトースに対する酵素活性値が 5%以下、好ましくは
3%以下、より好ましくは 2%以下、更に好ましくは 1 %以下である、 FAD結合型 グノレコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、又はタンパク質当たりの比活性 力 ¾OOU/mg以上、好ましくは 500UZmg以上、より好ましくは 1， OOOUZmg以上 の酵素活性を有する FAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド が含まれる。尚、ここで、「タンパク質当たりの比活性」とは、例えば、本明細書の実施 例 7に記載のような、培養上清を濃縮し SDS— PAGEで単一バンドとして確認された 状態で測定されたものである。
[0035] 尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖に /3 -N-ダリ コシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル (ATP (アデノシン三リン酸）、 GTP (グァ ノシン三リン酸）、 CTP (シチジン三リン酸）、 UTP (ゥリジン三リン酸）；又は dATP (デ ォキシアデノシン三リン酸）、 dGTP (デォキシグアノシン三リン酸）、 dCTP (デォキシ シチジン三リン酸）、 dTTP (デォキシチミジン三リン酸））が 100個以上結合した分子 を言い、具体的には FAD結合型グノレコース脱水素酵素をコードする染色体 DNA、 染色体 DNAから転写された mRNA、 mRNAから合成された cDNA及び、それらを 铸型として PCR増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」とはヌクレオチ ドが 2-99個連結した分子を言う。また「ポリペプチド」とは、アミド結合 (ペプチド結合） 又は非天然の残基連結によって互いに結合した 30個以上のアミノ酸残基から構成さ れた分子を意味し、さらには、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾 がなされたもの等も含む。
[0036] 本発明のポリヌクレオチド (遺伝子）の最も具体的な態様は、配列番号 2又は配列 番号 3の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号 2に代表される染色体 D NAであるポリヌクレオチドは、例えば、ァスペルギルス 'ォリゼ NBRC5375株力、ら染 色体 DNAライブラリーを調製し、特許文献 1に記載のァスペルギルス'テレウス由来 の FAD結合型グルコース脱水素酵素の N末端及び内部配列のアミノ酸をエドマン法 等によって決定して得られるアミノ酸配列、及び、 spergillus oryzaeのゲノム解析 プロジェクト」の成果として、 2006年 1月に DOGAN (Database of the Genomes Analy zed at NITE) (ウェブサイト http://www. bio.nite.go.jp/dogan/Top)で公開されたァス ペルギルス.ォリゼ（NBRC100959株）のゲノム配列情報に基づいて作成した複数 のオリゴヌクレオチドプローブを用いて当業者に公知の方法によって上記染色体 DN Aライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。
[0037] プローブの標識は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ラジオアイソトープ (RI) 法又は非 RI法によって行うことができる力 非 RI法を用いることが好ましい。非 RI法と しては、蛍光標識法、ピオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法 を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合で きるものを適宜に選択して用いることができる力 シァニン色素（例えば、 Cy DyeT Mシリーズの Cy3、 Cy5等）、ローダミン 6G試薬、 N-ァセトキシ -N2 -ァセチルァミノ フルオレン (AAF)、 AAIF (AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
[0038] 或いは、配列番号 3に代表される cDNAであるポリヌクレオチドは、例えば、本明細 書の実施例に具体的に記載されているように、 cDNAライブラリーを铸型とし、上記 で作成したオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）のセットを用いた当業者に公知の 各種 PCR法によって、もしくはァスペルギルス 'ォリゼ NBRC5375株から抽出した全 RNAもしくは mRNAを铸型とする RT-PCR法によっても得ることができる。尚、プラ イマ一を設計する場合には、プライマーのサイズ (塩基数）は铸型 DNAとの間の特異 的なアニーリングを満足させることを考慮し、 15-40塩基、望ましくは 15-30塩基であ る。ただし、 LA (long and accurate) PCRを行う場合には、少なくとも 30塩基が効 率的である。センス鎖（5 '末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる一組あるい は一対（2本）のプライマーが互いにァニールしないよう、両プライマー間の相補的配 歹 IJを避けるようにする。さらに、铸型 DNAとの安定な結合を確保するため GC含量を 約 50%にし、プライマー内において GC- richあるいは AT-richが偏在しないように する。アニーリング温度は Tm (melting temperature)に依存するので、特異性の高い PCR産物を得るため、 Tm値が 55-65°Cで互いに近似したプライマーを選定する。ま た、 PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約 0. 1から約 Ι μ Μになるよう調整 する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、 例えば OligoTM [National Bioscience Inc. (米国）製]、 GENETYX (ソフトウェア 開発株式会社製)等を用レ、ることもできる。 [0039] 尚、このようなオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーセットは、例 えば本発明のポリヌクレオチドである cDNAを適当な制限酵素で切断して作成するこ とちできる。
[0040] 又、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記のァスペルギルス 'ォリゼ NBRC53 75株由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素 cDNAを、公知のミューテーシヨン導 入法や変異導入 PCR法等によって改変して作成することができる。更に、 NBRC53 75株以外のァスペルギルス'オリゼ菌株の染色体 DNAやその cDNAライブラリーか ら、配列番号 1のヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用い るプローブハイブリダィゼーシヨン法によって取得することができる。ハイブリダィゼー シヨンに際して、ストリンジヱント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレ ォチドを取得することができる。ストリンジヱント条件は、ハイブリダィゼーシヨン及び洗 浄工程における塩濃度、有機溶媒 (ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によつ て規定され、例えば、米国特許 No.6, 100,037号明細書等に開示されているような、当 業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
[0041] 更に、文献（例えば Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411- 418;Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3 440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373- 380;Blommers(1994)Bioche mistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90;Brown(1979)Meth. Enzym ol. 68: 109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22: 1859; 米国特許第 4,458, 066号）に記載 されているような周知の化学合成技術により、 in vitroにおいて本発明のポリヌクレオ チドを合成することができる。
[0042] 本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサ ートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用 する。例えば、 cDNA又はその ORF領域をインサートとして FAD結合型グルコース脱 水素酵素を生産する場合には、 in vitro転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌 等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の それぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
[0043] 本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母 、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの 形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラ ン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製する ことができる。組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示し た組換えベクターと、このベクターによる形質転換大腸菌及び形質転換カビが挙げら れる。
[0044] 本発明の FAD結合型グノレコース脱水素酵素を大腸菌などの微生物で DNAを発現 させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソ ーム結合部位、 DNAクローニング部位、ターミネータ一配列等を有する発現べクタ 一に前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで 宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、 FAD結合型グ ルコース脱水素酵素を微生物で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領 域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む FA D結合型グルコース脱水素酵素断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との 融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで 切断することによつても目的とする FAD結合型グルコース脱水素酵素を取得すること ができる。大腸菌用発現ベクターとしては、 pUC系、 pBluescriptll, pET発現シス テム、 pGEX発現システム、 pCold発現システムなどが例示できる。
[0045] 或いは、 FAD結合型グルコース脱水素酵素を真核細胞で発現させて生産させる場 合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A)付加部 位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細 胞内に導入すれば、 FAD結合型グルコース脱水素酵素を真核細胞で生産すること ができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組 みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3 、 pSVL、 pBK-CMV、 pBK— RSV、 EBVベクター、 pRS、 pYE82などが例示できる 。また、 pIND/V5- His、 pFLAG- CMV_2、 pEGFP_Nl、 pEGFP-Clなどを発 現ベクターとして用いれば、 Hisタグ、 FLAGタグ、 GFPなど各種タグを付加した融合 蛋白質として FAD結合型グルコース脱水素酵素ポリペプチドを発現させることもでき る。真核細胞としては、サル腎臓細胞 COS_7、チャイニーズハムスター卵巣細胞 CH Oなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフリカッメガ エル卵細胞などが一般に用いられる力 FAD結合型グルコース脱水素酵素を発現で きるものであれば、レ、かなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入する には、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法など公 知の方法を用いることができる。
[0046] 特に、ァスペルギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の本発明の FAD結合型グル コース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを保有する組換えベクターで、適当な ァスペルギルス'オリゼ株を形質転換するセルフクローユングが好適である。
[0047] FAD結合型グルコース脱水素酵素を原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養 物（菌体、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等）から目的 蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。 例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、 pH処理、超音波処 理、酵素消化、塩析ゃ溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SDS-P AGE,等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法及 び FAD補酵素結合型グルコース脱水素酵素に特異的なポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。
[0048] また、 FAD結合型グルコース脱水素酵素は、本発明のポリヌクレオチド（cDNA又 はその翻訳領域）を用いた組換え DNA技術によって取得できる。例えば前記ポリヌ クレオチドを有するベクターから in vitro転写によって RNAを調製し、これを铸型と して in vitro翻訳を行うことにより in vitroで FAD結合型グルコース脱水素酵素を作 成すること力 Sできる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに 組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細 胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしている FAD結合型グノレコース脱水素 酵素を大量に発現させる事ができる。また宿主に対応して、同一アミノ酸配列である 力 コドンユーセージを最適化したポリブクレオチドを導入しても良レ、。また糖鎖の要
、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができる [0049] FAD結合型グルコース脱水素酵素を in vitro発現させて生産させる場合には、前記 のポリヌクレオチドを、 RNAポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクター に揷入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応する RNA ポリメラーゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などの in vitro翻訳 系に添加すれば、 FAD結合型グルコース脱水素酵素を in vitroで生産することがで きる。 RNAポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、 T3、 T7、 SP6などが例 示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pT3/ Τ718、 ρΤ7/319、 pBluescriptllなどが例示できる。
[0050] 本発明の組換え FAD結合型グノレコース脱水素酵素は以上に記載された方法で製 造すること力 Sできる。このような FAD結合型グノレコース脱水素酵素は、電子受容体存 在下でグノレコースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化 が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中の グルコースの測定及び測定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床 分野への使用が可能であり、補酵素結合型グノレコース脱水素酵素を使用した物質 生産においても使用可能である。
[0051] 本発明のグルコース測定試薬組成物は、全てを混合して単一の試薬としてもよぐ 相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分を適宜な組み合せとなる様に分 割してもよい。また、これらは、溶液状、もしくは粉末状試薬として調製してもよぐさら にこれらを濾紙もしくはフィルムなどの適当な支持体に含有させ試験紙もしくは分析 用フィルムとして調製してもよい。なお、過塩素酸などの除タンパク剤ゃグノレコース定 量を含有する標準試薬を添付してもよい。本組成物中の酵素の量は、 1試料当り 0. 1から 50単位程度が好ましい。グノレコースを定量するための検体は、例えば血漿、血 清、髄液、唾液、尿などが挙げられる。
[0052] 本発明のバイオセンサは、酵素として本発明の FAD結合型グルコース脱水素酵素 を含む反応層に使用し、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサで ある。例えば、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、その対 極及び参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化 還元酵素と電子受容体とを含む酵素反応層を形成することによって作製される。この バイオセンサの酵素反応層上に基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶 解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終 了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このノィォセンサ は得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。また、 この他に、発色強度あるいは pH変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能 である。
[0053] バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた化学物質を用いること ができる。電子の授受能に優れた化学物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メデイエ ータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質であり、これらに該当する化学 物質として、例えば、特表 2002-526759に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介 剤などを利用してもよい。具体的には、オスミウム化合物、キノン化合物、フヱリシアン 化合物等が挙げられる。
[0054] FAD結合型グルコース脱水素酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終 濃度 0.：!〜 1. Ounit/mLになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活 性単位 (unit)は 1分間に 1 μ molのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明 の FAD結合型グノレコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
[0055] [酵素活性測定法]
0. 1M リン酸カリウム緩衝液（ρΗ7. 0) 1. OmL、 1. OM D—グノレコース 1. OmL 、 3mM 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール（以下 DCIPという） 0· 14mL、 3 mM 1—メトキシー 5—メチルフエナジゥムメチルサルフェイト 0. 2mL、水 0. 61mL を 3mL石英セル (光路長 lcm)に添カ卩し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセッ トして 37°Cで 5分間インキュベート後、酵素溶液 0. 05mLを添加後、 DCIPの 600η mにおける吸光度変化（A ABSZmin)を測定する。 DCIPの pH7. 0におけるモル 吸光係数を 16. 3 X 103cm— 1とし、 1分間に 1 μ molの DCIPが還元される酵素活 性が実質的に該酵素活性 limitと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を 次式に従って求めた。
[0056] [数 1] mm it (mti^iiil)= x x 素の #«寧
[0057] 本酵素のタンパク濃度の測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度 0. 2〜0. 9 mg/mL になるように適宜希釈して用いる。本発明におけるタンパク濃度は、 日本 バイオ'ラッド (株）力ら購入できるタンパク濃度測定キットである Bio— Rad Protein Assayを用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン (BSA，和光純薬工業 (株 )製，生化学用）を標準物質として作成した検量線力 換算して求めることができる。
[0058] 尚、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技 術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能 である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in M olecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wil ey & Sons, New York, N.Y， 1995などに記載の方法あるいはそこで引用された文献 記載の方法又はそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さ らに、この発明における用語は基本的には IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語 の意味に基づくものである。
[0059] 以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲は これらの記載によって何等制限されるものではなレ、。又、本明細書中に引用される文 献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するもの である。
実施例 1
[0060] (ァスペルギルス.ォリゼ NBRC5375株由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定 される遺伝子の大腸菌へのクローニング）
(1)菌体培養
グルコースけ力ライ社製） 1 % (W/V)、脱脂大豆（昭和産業社製） 2% (W/V)、 コーンスティープリカ一（サンエイ糖化社製） 0· 5% (W/V)、硫酸マグネシウム七水 和物（ナカライネ土製） 0. 1 % (W/V)及び水からなる液体培地を ρΗ6· 0に調整し、 1 OOmLを 500mL容の坂口フラスコに入れ、 121°C、 20分間オートクレーブした。冷 却したこの液体培地に、ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae) NBRC5375株 を接種し、 28°Cで 48時間振とう培養した後、遠心分離機を用いて、湿菌体 15. 5gを 回収した。
(2)ァスペルギルス 'ォリゼ NBRC 5375株の FAD結合型ダルコース脱水素酵素活 性確認
(1)で得られた菌体を 50mMリン酸カリウム緩衝液 (PH7. 5)に懸濁し、海砂 B (ナ 力ライ社製）を用いて菌体を磨砕後、遠心して上清を回収し、無細胞抽出液とした。 前述の酵素活性測定法に従い、無細胞抽出液の FAD結合型グルコース脱水素酵 素活性を確認したところ、無細胞抽出液当たり、 0. 0043UZmLの FAD結合型グノレ コース脱水素酵素活性を確認した。
(3)全 RNAの単離
(1)で得られた菌体のうち湿菌体 0. 31gを液体窒素により凍結した後、粉碎し、 IS OGEN (二ツボンジーン社製）を用いて全 RN Aを抽出した。
(4) RT— PCR
TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver.l. l (タカラバイオ社製）を使用し、下記条件で RT— PCRを行レ、、約 1. 8kbpの FAD結合型グルコース脱水素酵素と想定される遺 伝子を含む PCR産物を取得した。
テンプレート ：（3)で抽出した全 RNA
プライマー ：
プライマー 1 ： 5 ' -tgggatcctatgctcttctcactggcat-3 ' (酉己歹 lj番号 6)
フフイマ1 ~ 2 ： 5 -gccaagcttctaagcactcttcgcatcctccttaatcaagtc-3 己歹 亏, J 尚、プライマー 1及び 2は、上記の DOGAN (Database of the Genomes Analyzed at N ITE) (ウェブサイト http：〃 www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)で公開されているァスペル ギノレス-ォ];ゼ NBRC100959株の遺伝子角军析結果より A〇090005000449 (「コリ ン脱水素酵素」と推定されている）の塩基配列を元に合成した。
その理由は、本発明者等により見出されたァスペルギルス *テレウスの FAD結合型グ ルコース脱水素酵素遺伝子の塩基配列情報に基づき、上記 AO090005000449力 S コリン脱水素酵素遺伝子ではなく、ァスペルギルス 'ォリゼの FAD結合型グルコース 脱水素酵素遺伝子と推測された為である。
反応条件 ：逆転写反応 42°C、 30分（1サイクル）
変性 99°C、 5分 （1サイクル）
冷却 5°C、 5分（1サイクル）
変性 94°C、 2分（1サイクル）
変性 94。C、 30秒、アニーリング 45°C、 30秒、伸長反応 72。C、 1分 30秒（25サイクノレ )
伸長反応 72°C、 5分（1サイクル）
(5) FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子を含むプラスミドの調製
(4)で得られた PCR増幅断片を制限酵素 BamHIと Hindlllで切断し、同制限酵素 処理した PUC18ベクター（タカラバイオ社製）に、 DNA Ligation Kit Ver.2.1 (タカラバ ィォ社製）を用いてライゲーシヨンし、 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される 遺伝子を含むプラスミドを調製した。
(6)形質転換体の作製
(5)で得られたプラスミドを Ε· coli JM109 Competent Cell (タカラバイオ社製 )に導入して形質転換した。アンピシリンナトリウム（和光純薬社製)含有の LBプレー トで、 37°Cでー晚培養した後、ダイレクト PCRにて、生育したコロニー 1個に、 FAD結 合型グノレコース脱水素酵素と推定される遺伝子を含んだプラスミドが導入されている ことを確認し、アンピシリンナトリウム含有の LBプレートで形質転換体を取得した。 実施例 2
(ァスペルギルス.ォリゼ NBRC5375株由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定 される遺伝子のァスペルギルス'ォリゼへのクローニング）
(1)染色体 DNAの抽出
実施例 1の（1)で得られた湿菌体のうち 0. 25gを液体窒素により凍結した後、粉碎 し、常法により染色体 DNAを抽出した。
(2) FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子のクローニング 使用する宿主としては、ァスペルギルス 'ォリゼ NS4株を使用した。本菌株は、公知 文献 l (Biosci. Biotech. Biochem.,61(8)，1367_1369, 1997)にあるように、 1997年（平成 9年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種など に利用され、分譲されているものが入手可能である。
本菌株に対し、公知文献 2 (Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と 生物、 38、 12、 P831- 838、 2000)に記載してあるァスペルギルス.ォリゼ由来のァミラ ーゼ系の改良プロモーターを使用し、その下流に（1)で得られた染色体 DNAを錡 型として、 DOGAN (Database of the Genomes Analyzed at NITE) (ウェブサイト http:〃而 w.bio.nite.go.jp/dogan/Top)で公開されている AO090005000449の塩 基配列を元に合成した以下のプライマー：
1. genelr :
5 -(acecgtcgac tgaccaattccgcagctcgtcaaaatgctcttctcactggcattcctga-3 (酉己歹 I [番号 8)
2. genelR:
5— ggctgaactaattcctcctacgcttctcacgaat gtg)— 3 (酉己歹1 号 9)
(Fは 5 '側、 Rは 3 '側、括弧内：制限酵素切断部位、下線部： enoA 5 ' _UTR、その他: ORF)
を用いて増幅した FAD結合型グノレコース脱水素酵素と推定される遺伝子を結合させ ることで、本遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
形質転換は、基本的には公知文献 2及び公知文献 3 (清酒用麹菌の遺伝子操作技 術、五味勝也、醸協、 P494-502, 2000)に記載の方法に準じて実施することで形質転 換体を取得した。
比較例
(ァスペルギルス.ォリゼ NBRC100959株由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推 定される遺伝子（AO090005000449)のァスペルギルス'ォリゼへのクローニング） (1)菌体培養
グノレコース 1。/0 (W/V)、脱脂大豆 2% (W/V)、コーンスティープリカ一 0· 5% ( W/V)、硫酸マグネシウム七水和物 0. 1 % (W/V)及び水からなる液体培地を pH 6. 0に調整し、 lOOmLを 500mL容の坂口フラスコに入れ、 121°C、 20分間オートク レーブした。冷却したこの液体培地に、ァスペルギルス'オリゼ NBRC100959株を 接種し、 28°Cで 48時間振とう培養した後、遠心分離機を用いて、菌体 10. 5gを回収 した。
(2)染色体 DNAの抽出
(1)で得られた菌体のうち湿菌体 0. 31gを液体窒素により凍結した後、粉砕し、常 法により染色体 DNAを抽出した。
(3) FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子（AO090005000449遺 伝子）のクローニング
使用する宿主としては、ァスペルギルス 'ォリゼ NS4株を使用した。本菌株は、公知 文献 1にあるように、 1997年（平成 9年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、 各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である
本菌株に対し、公知文献 2に記載してある、ァスペルギルス 'ォリゼ由来のアミラー ゼ系の改良プロモーターを使用し、その下部に（2)で得られた染色体 DNAを铸型と して、実施例 2で使用したプライマー（配列番号 8及び配列番号 9)を用いて増幅した FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子（AO090005000449遺伝 子）を結合させることで、本遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
形質転換は、基本的には公知文献 2及び公知文献 3に記載の方法に準じて実施 することで、形質転換体を取得した。
実施例 3
(遺伝子配列の確認）
( 1 )組換え大腸菌中のァスペルギルス ·オリゼ NBRC 5375株由来 FAD結合型グル コース脱水素酵素と推定される遺伝子の配列
実施例 1で得られた組換え大腸菌中のァスペルギルス ·ォリゼ NBRC5375株由 来 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子の配列決定を行った結果 を配列番号 3に示した。配列番号 3の配列と比較例における FAD結合型グルコース 脱水素酵素と想定される遺伝子（AO090005000449)の塩基配列からイントロンを 除いた cDNA配列を比較したところ、 AO090005000449の開始塩基 Aを 1番目とし た時の 604番目力ら 606番目の ATGとレ、う配列は、ァスペルギルス.ォリゼ NBRC 5375株由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子では配列番号 5 に示した GCTGGTGTTCCATGGGTTという配列であり、その他の配列は完全に一致 していた。
また、翻訳したアミノ酸配列を配列番号 1に示し、同様に比較したところ、 AO09000 5000449の開始アミノ酸 Mを 1番目とした時の 202番目の Mは、ァスペルギルス-ォ リゼ NBRC 5375株由来 FAD結合型ダルコース脱水素酵素と推定される遺伝子が コードするアミノ酸配列では配列番号 4に示した AGVPWVという配列であり、その他 の配列は完全に一致していた。
(2)組換え力ビ中のァスペルギルス 'オリゼ NBRC 5375株由来 FAD結合型ダルコ ース脱水素酵素と推定される遺伝子の配列
実施例 2で得られた組換え力ビ中のァスペルギルス 'ォリゼ NBRC 5375株由来 F AD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子の配列決定を行った結果を配 列番号 2に示した。配列番号 2の配列と比較例における FAD結合型グルコース脱水 素酵素と推定される遺伝子 (AO090005000449)の塩基配列を比較したところ、 A 0090005000449の開台塩基 Aを 1番目とした B寺の 656番目力ら 658番目の ATG とレ、う配列は、ァスペルギルス'ォリゼ NBRC5375株 FAD結合型グルコース脱水素 酵素と推定される遺伝子では配列番号 5に示した GCTGGTGTTCCATGGGTTという 配列だった。
また、翻訳したアミノ酸配列を配列番号 1に示し、同様に比較したところ、 AO09000 5000449 (コリン脱水素酵素と推定）の開始アミノ酸 Mを 1番目とした時の 202番目 の Mは、ァスペルギルス'ォリゼ NBRC5375株由来 FAD結合型グルコース脱水素 酵素と推定される遺伝子がコードするアミノ酸配列では配列番号 4に示した AGVPW Vとレ、う配列であり、その他の配列は一致してレ、た。
(遺伝子配列の比較）
以上の結果より、実施例 1 , 2の菌株と比較例の菌株は、 FAD結合型グルコース脱 水素酵素と推定される遺伝子において、類似の遺伝子配列を有しているが、実施例 1 , 2のァスペルギルス.ォリゼ NBRC5375株に由来する遺伝子配列は、比較例の 菌株に由来する AO090005000449の遺伝子酉己歹 IJと比較して、 656番目力ら 658 番目の ATGという配歹が、配列番号 5に示した GCTGGTGTTCCATGGGTTという配 列になっており、またアミノ酸配列で比較して、 202番目付近のアミノ酸 Mが、配列番 号 4に示した AGVPWVになっていることが判明した。
実施例 4
[0065] (遺伝子レベルでの解析と比較）
(1)サザンブロッテイングによる確認、
実施例 2および比較例で取得した菌株を元に培養した湿菌体から、定法により DNA を抽出し、本 FAD結合型グルコース脱水素酵素と想定される遺伝子の一部をプロ一 ブにしてサザンブロッテイングによる検出をした。
その結果、いずれの菌株においても、ァスペルギルス.ォリゼ由来のアミラーゼ系の 改良プロモーターと結合した FAD結合型グルコース脱水素酵素と想定される遺伝子 を含む DNA断片が、それぞれ同程度のコピー数含まれていることが判明した。
つまり、実施例 2および比較例で取得した菌株には、形質転換によりそれぞれ同程 度のコピー数の遺伝子を含んでいることが判明した。
(2)ノーザンブロッテイングによる確認
実施例 2および比較例で取得した菌株を元に培養した湿菌体から、定法により RNA を抽出し、本 FAD結合型グルコース脱水素酵素と想定される遺伝子の一部をプロ一 ブにしてノーザンブロッテイングによる検出をした。
その結果、いずれの菌株においても、形質転換した菌株においては、それぞれ同程 度、ァスペルギルス'オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターと結合した FAD結 合型グノレコース脱水素酵素遺伝子のものと推定される mRNA断片が検出された。つ まり、実施例 2および比較例で取得した菌株は、本 FAD結合型グルコース脱水素酵 素と想定される遺伝子を同程度 RNAに転写していると判断できた。
実施例 5
[0066] (形質転換された菌株における FAD結合型グルコース脱水素酵素の活性確認） 実施例 1の菌体については、 50 i g/mLアンピシリンナトリウム及び 0. ImMイソプ ロピノレ一 β—D—1—チォガラタトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含む LB液体培地で、 37°Cで 17時間振とう培養し、培養終了後、集菌、 50mMリン酸カリ ゥム緩衝液 (PH7. 0)に懸濁し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して 上清を回収し、無細胞抽出液を取得した。
無細胞抽出液を SDS— PAGEに供したところ、分子量約 63kDaの酵素蛋白を確認 でき、無細胞抽出液当たり、 0. 014UZmLの FAD結合型グルコース脱水素酵素活 性を確認した。なお、宿主である大腸菌には本活性は全く認められなかった。
実施例 2および比較例の菌体については、ペプトン 1。/。、ショ糖 2%、リン酸水素二力 リウム 0.5%、硫酸マグネシウム 0.05。/。を含む培養液で、 28°C、 3日間振盪培養し、培 養終了後、遠心して菌体及び培養上清を回収、菌体を 50mMリン酸カリウム緩衝液（ pH7. 0)に懸濁し、チップ式超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して上清 を回収し、無細胞抽出液とした。
培養上清及び無細胞抽出液を SDS— PAGEに供したところ、実施例 2の菌体にお いては、培養上清に分子量約 86kDaの酵素蛋白を確認できた力 比較例の菌体に おいては培養上清及び無細胞抽出液にも確認ができなかった。
また、前述の酵素活性測定法に従い、培養上清及び無細胞抽出液の FAD結合型グ ルコース脱水素酵素活性を確認したところ、実施例 2の菌体においては、培養上清 に 53U/mLの FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を確認したが、比較例の菌 体にぉレ、ては、培養上清及び無細胞抽出液に全く活性が確認できなかった。
(まとめ）
実施例 3〜5の知見をまとめると、実施例 2と比較例は、形質転換されている遺伝子 のコピー数およびその転写量までは同等である力 S、形質転換されている FAD結合型 グノレコース脱水素酵素の遺伝子と想定される配列が微妙に異なっており、その遺伝 子配列の違レ、が酵素活性の発現に大きな影響を与えてレ、ると結論付けることができ る。
実施例 6
(ァスペルギルス.ォリゼの他の菌株における比較）
ァスペルギルス.ォリゼの他の数種類の菌株について、実施例 1一（2)と同様にそ れらの培養上清及び無細胞抽出液（CFE)における FAD結合型グルコース脱水素酵 素活性を確認した。また、それらの菌株について、実施例 2— (1)と同様に染色体 DN Aを抽出し、配列番号 6及び 7記載のプライマーを使用し増幅した約 1. 9kbpの断片 の配列を決定し、配列番号 2に記載の配列、並びに AO090005000449の染色体 DNA配列と比較した。また、翻訳したアミノ酸配列を、配列番号 1に記載の配列、並 びに AO090005000449のアミノ酸配歹 1Jと比較した。これらの結果を、実施例 1から 3 及び比較例の結果と共に以下の表 1に示した。配列に関しては特に実施例 3— (1) 記載の AGVPWVというアミノ酸配列の有無に関して表 1に示した。
[表 1]
Figure imgf000028_0001
ァスぺノレギノレス *才リゼ NBRC4079, 4214、 4268、 5238、 6215及び 30113由 来の染色体 DNA配列は、いずれも配列番号 2の配列と完全に一致していた。
ァスペルギルス.ォリゼ NBRC4203由来の染色体 DNA配列は、配列番号 2の配 列と 4塩基（135C→A, 437G→A, 532G→A, 1263C→T)が異なっていた。さらに、ァ スペルギルス.ォリゼ NBRC4203由来の染色体 DNA配列を翻訳したアミノ酸配列 は、配列番号 1の配列と 2アミノ酸（129V→I， 386A→V)が異なっていた。
また、ァスペルギルス'オリゼ NBRC30104由来の染色体 DNA配列は、配列番号 2の配歹 1Jと 4塩基（135C→A， 413C→A, 437G→A, 532G→A)が異なっていた。さらに 、ァスペルギルス'ォリゼ NBRC30104由来の染色体 DNA配列を翻訳したアミノ酸 配列は、配列番号 1の配列と 2アミノ酸（121R→S, 129V→I)が異なっていた。これら のアミノ酸配列の違いは、 FAD結合型グルコース脱水素酵素の発現には直接影響し ていないものと推察された。
また、ァスペルギルス'オリゼ NBRC4181及び 4220の染色体 DNA配列は、レヽ ずれも AO090005000449の染色体 DNA酉己歹 IJと完全に一致してレ、た。
実施例:!〜 5及び比較例の結果より、ァスペルギルス'オリゼ NBRC5375株由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子は、活性型の FAD結合型グ ルコース脱水素酵素をコードする遺伝子だったと結論付けられ、また、ァスペルギル ス-ォリゼ NBRC100959株由来 FAD結合型グノレコース脱水素酵素と推定される遺伝 子（AO090005000449遺伝子）は、活性型の FAD結合型グルコース脱水素酵素を コードする遺伝子ではなかった。 AO090005000449遺伝子は、 NBRC5375株由 来の FAD結合型グノレコース脱水素酵素のアミノ酸配列と非常に類似したアミノ酸配 列をコードしているので、当該技術分野における技術常識に鑑みると、同様の酵素 活性を持っていると考えられる。し力しながら、予想外なことに、本発明者によって、 実際に ίま匕較列に示すように AO090005000449遺伝子、 NBRC4181遺伝子及 び 4220遺伝子の配列では該酵素は発現されないことが初めて見出された。同様の 発現系を用いて、前記の配列の違いのみで FAD結合型グルコース脱水素酵素の発 現の有無が生じていることから、あくまで仮説ではある力 ァスペルギルス 'ォリゼ N BRC 5375株等の FAD結合型ダルコース脱水素酵素に含まれるアミノ酸配列： AGVP WVは FAD結合型グルコース脱水素酵素の高次構造を取るのに重要な配列と思わ れ、 AGVPWVが欠けた場合は小胞体ストレス等を引き起こし、発現蛋白の分解及び /または発現の抑制が起こっていると推察される。開始アミノ酸 Mを 1番目とした時に 202番目付近にアミノ酸配列: AGVPWVが存在することは機能発現に重要である。な おこの配列中のどのアミノ酸が活性発現に必須であるかは、現在研究中である力 一 部のアミノ酸を欠失、置換または付加してもある程度の活性は維持できる可能性はあ る。また、アミノ酸配列： AGVPWV以外の部分においては、ァスペルギルス'ォリゼ N BRC4203,ァスペルギルス'オリゼ NBRC 30104の遺伝子解析から判明した数個 のアミノ酸置換は、 FAD結合型グルコース脱水素酵素の発現に影響を与えなかった 実施例 7
[0071] (FAD結合型グルコース脱水素酵素の性質試験）
実施例 5で得られた、実施例 2の菌体の培養上清を、分画分子量 1万のビバセル 2 (ビバサイエンス社製）で濃縮後、蒸留水で置換し、タンパク質当たりの比活性が 323 UZmgの精製酵素を得た。尚、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を示した他 の菌株由来の酵素についても、同様に精製可能であった。これらの精製酵素を SDS — PAGEに供したところ、約 86kDaの単一バンドを確認できた。本酵素について、作 用性、基質特異性及び補酵素を調べた。なお、酵素活性は、前述記載の酵素活性 測定法に従って測定した。
1)作用性
精製酵素を、 8. 66mM DCIP存在下で 500mM D—グルコースと反応させ、反 応産物を D—ダルコン酸/ D—ダルコノー δ—ラタトン定量キットで定量した。その結 果、 D—ダルコン酸の生成が確認され、これより本発明の FAD結合型グルコース脱水 素酵素は D—グノレコースの 1位の水酸基を酸化する反応を触媒する酵素であること が明らかになった。
2)基質特異性
前述の酵素活性測定法における活性測定用反応液の基質を、 D—グルコース、マ ノレトース、及び D—ガラ外ースを使用し、酵素活性測定法に則り精製酵素の酵素活 性を測定した。該酵素の D—グノレコースに対する活性値を 100%とした場合、マルト ースに対する酵素活性値が 2. 1%、 D—ガラクトースに対する酵素活性値が 0. 99% の作用性だった。
3)補酵素
精製酵素に D—グノレコースを添カ卩し、吸光分析を行ったところ、 385nm及び 465η mに認められた吸収極大が該添加により消失したことから、補酵素が FADであること が明らかとなった。
実施例 8
[0072] (酵素固定化電極によるグルコースの測定） 実施例 7記載の精製酵素を使用し、酵素固定化電極による D—グルコースの測定 を行った。本酵素 1. 5Uを固定化したグラッシ一カーボン（GC)電極を用いて、ダル コース濃度に対する応答電流値を測定した。電解セル中に、 50mM リン酸カリウム 緩衝液（PH6. 0) 1. 8ml及び 1M へキサシァノ鉄（III)酸カリウム（フェリシアン化力 リウム）水溶液 0. 2mlを添加した。 GC電極をポテンシヨスタツト BAS100BZW (BA S製）に接続し、 37°Cで溶液を撹拌し、銀塩ィ匕銀参照電極に対して + 500mVを印 カロした。これらの系に 1M D—グルコース溶液を終濃度が 5、 10、 20、 30、 40、 50 mMになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定した。この電流値を既知 のグノレコース濃度（5、 10、 20、 30、 40、 50mM)に対してプロットしたところ、検量線 が作成できた（図 1)。これより本発明の FAD結合型グルコース脱水素酵素を使用した 酵素固定化電極でグノレコースの定量が可能であることが示された。
実施例 9
[0073] (PCRによる FAD結合型グルコース脱水素酵素遺伝子の確認）
(1)菌体培養
グルコース (ナカライ社製） 1 % (W/V)、脱脂大豆 (昭和産業社製) 2% (W/V)、コ ーンスティープリカ一（サンエイ糖化社製） 0. 5% (W/V)、硫酸マグネシウム七水和 物（ナカライネ土製） 0. 1 % (WZV)及び水からなる液体培地を pH6. 0に調整し、 10 mLを太試験管に入れ、 121°C、 20分間オートクレープした。冷却したこの液体培地 に、実施例 4で示しているように、培養液中にグルコース脱水素酵素活性を有するこ とが確認されているァスペルギルス'ォリゼ NBRC4268株、 NBRC5375株、 NBRC6215 株と、培養液中に本酵素活性が認められないァスペルギルス'ォリゼ NBRC4181株、 NBRC4220株、及び NBRC100959株を各試験管に接種し、 30°Cで 43時間振盪培養 した後、遠心分離機を用いて、それぞれ湿菌体を回収した。
[0074] (2)染色体 DNAの抽出
(1)で得られた湿菌体を液体窒素で凍結した後、粉砕し、常法により染色体 DNAを 抽出した。
[0075] (3) FAD結合型グルコース脱水素酵素遺伝子全長の増幅
(2)で抽出した各 DNAをテンプレートに、配列番号 2の配列を元に合成したプライマ 一 3及び 4を用いて、下記条件で PCRを行い、約 1.9kbpの FAD結合型グルコース脱 水素酵素遺伝子を含む PCR産物を取得した。
テンプレート ：（2)で抽出した DNA
プライマー ：
プライマー 3 ： 5 ' -ttatgctcttctcactggcattcctgagtgccctgt-3 ' (酉己歹 lj番号 10)
フフイマ" ~ 4 ： 5 -gctaagcactcttcgcatcctccttaatcaagtcgg-3 (酉己歹 'J番号 11ノ 反応条件 ：変性 94°C、 1分（1サイクル）
変性 94°C、 30秒、アニーリング 45°C、 30秒、伸長反応 72°C、 1分 30秒（30サイクル） 伸長反応 72°C、 10分（1サイクル）
[0076] (4)活性を発現する FAD結合型グルコース脱水素酵素遺伝子の増幅
(1)で得られた各 PCR産物をテンプレートに、プライマー 3とアミノ酸配列： AGVPWV を元に合成したプライマー 5を用いて、下記条件で PCRを行った。
テンプレート ：（3)で得られた PCR産物
プライマー ：
プライマー 3 ： 5' -ttatgctcttctcactggcattcctgagtgccctgt- 3， (酉己歹 IJ番号 10) プフイマ一 5 ： 5 -aacccatggaacaccagc-3 ' (酉己列番 12)
反応条件 ：変性 94°C、 1分（1サイクル）
変性 94°C、 30秒、アニーリング 65°C、 30秒、伸長反応 72°C、 1分（30サイクル） 伸長反応 72°C、 5分（1サイクル)。
[0077] PCRによる目的遺伝子の検出結果を第 2図に示した。培養液中にグルコース脱水素 酵素活性を有するァスペルギルス 'ォリゼ由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素 をコードするポリヌクレオチドのみ力 PCRで予想されるサイズの増幅を確認できた。 尚、（2)で得られた DNAを直接テンプレートに用いて PCRを行っても、同様に、培養 液中にグルコース脱水素酵素活性を有するァスペルギルス ·ォリゼ由来の FAD結合 型グノレコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのみが、 PCRで予想されるサイ ズの増幅を確認できた。
実施例 10
[0078] (サザンハイブリダィゼーシヨンによる FAD結合型グノレコース脱水素酵素遺伝子の確 実施例 10の（1)で得られた各 PCR産物 lOOngをァガロースゲル電気泳動後、ナイ口 ンメンブレン（Hybond-N+、 GEヘルスケア社製）にブロッテイングし、 80°Cで 71時間固 定した。プレハイブリダィゼーシヨンした後、 5 '末端をフルォレセインイソチオシァネー ト（FITC)で蛍光標識した、アミノ酸配列: AGVPWVを元に合成したプローブをカロえ、 37。Cで 24時間インキュベートした。メンブレンを 4。C、 6 X SSC及び 50°C、塩化テトラメ チルアンモニゥム溶液で洗浄後、 25mM TBSで塩ィ匕テトラメチルアンモニゥム溶液由 来の SDSを洗浄し、イメージアナライザー（Typhoon9400、 GEヘルスケア社製）で、蛍 光検出を行った。以下に、使用したバッファーの組成及びプローブの配列について 記載する。
ハイブリダィゼーシヨンバッファー ：
6 X SSC
5 Xデンハルト溶液
0.5%スキムミノレク
20 X SSC ：
3M塩化ナトリウム
0.3Mクェン酸三ナトリウム
塩化テトラメチルアンモニゥム溶液 ：
3M塩化テトラメチルアンモニゥム
50mM Tris-HCl (pH8.0)
2mM EDTA
0.1 % SDS
プローブ ：5， (FITC) -gctggtgttccatgggtt-3 ' (配列番号 5)。
サザンハイブリダィゼーシヨンによる目的遺伝子の検出結果を第 3図に示す。培養液 中にグルコース脱水素酵素を有するァスペルギルス 'オリゼ由来の FAD結合型グノレ コース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのみが、サザンハイブリダィゼーシヨン で検出できることがわかる。尚、サザンハイブリダィゼーシヨンによる確認は、実施例 9 の（3)で得られた PCR産物をナイロンメンブレン（Hybond_N+、 GEヘルスケア社製）上 に固定して行っても同様の結果を得ることができる。
実施例 11
[0080] (FAD結合型グルコース脱水素酵素遺伝子と確認できた遺伝子のクローニング、及 びクローユングした菌株における分泌生産）
実施例 9及び/又は実施例 10に示す方法で、培養液中にグルコース脱水素酵素を 分泌生産するァスペルギルス 'オリゼ由来の FAD結合型グノレコース脱水素酵素をコ ードするポリヌクレオチドと確認できた同遺伝子について、実施例 2に記載の方法従 つてベクターに連結、クローユングした菌株を培養した結果、培養液上清に活性型酵 素を大量に分泌生産させることができた。
実施例 12
[0081] (ァスペルギルス'オリゼ由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素の活性発現に影響 を及ぼしてレ、るアミノ酸の確認）
ァスペルギルス 'ォリゼ NBRC5375株由来 FAD結合型グルコース脱水素酵素の 6アミ ノ酸 (AGVPWV (202〜207番目のアミノ酸））のうち、 1アミノ酸を欠失させた幾つかの 変異酵素遺伝子、 6個すベてのアミノ酸を欠失させた変異酵素遺伝子、及び、それら 6個のアミノ酸に代えて Metをコードする塩基を有する変異酵素遺伝子を作成し、ァ スペルギルス ·オリゼ NS4株に導入して活性発現への影響を確認した。尚、変異遺伝 子の作成は、 STRATAGEN社製 Quik Change Site Directed Muntagenesis Kitsを 用レ、、ァスペルギルス 'ォリゼへの遺伝子導入は実施例 2に記載の方法に順じて行つ た。各々の変異導入組み換え体（単コピーと推定されるもの）にっき培地当たりの平 均活性値（3株）を求めた結果を表 2に示す。これら結果から、ァスペルギルス *ォリゼ の FAD結合型グノレコース脱水素酵素の活性発現には、これらの 6アミノ酸、特に、 205 〜207番目のアミノ酸が重要であることが強く示唆される。
[0082] [表 2] 変異箇所 活性値 Control (No. 1)を 100とした場合の
No. (欠失アミノ酸） (U/ml) 相対活性 （％)
1 なし (Control) 42 100
2 205 (Pro) 0. 04 0. 1以下
3 206 (Trp) 0. 03 0. 1以下
4 207 (Val) 0. 04 0. 1以下
5 202-207 0. 02 0. 1以下
(Ala-Gly-Val-Pro-Trp-Val)
6 No. 8の欠失箇所に、 6アミノ酸 0. 03 0. 1以下
の代わりに Metを付加
(【比較例】 の ΑΟΟΘΟΟΟδΟΟΟ449
遺伝子に相当）
産業上の利用可能性
本発明のポリヌクレオチドにコードされる FAD結合型グノレコース脱水素酵素は、血糖 の測定において実質的にマルトースに作用しないことから、より高精度な自己血糖測 定 (SMBG)装置にも利用することができ、糖尿病患者の自己管理 ·治療に大きく資 する。

Claims

請求の範囲
[1] アミノ酸配列： XI- X2- X3-X4-X5-X6
(XI及び X2は脂肪族アミノ酸、 X3及び X6は分岐アミノ酸、並びに、 X4及び X5は複 素環式アミノ酸又は芳香族アミノ酸を示す）を含むポリペプチドから成る FAD結合型 グノレコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
[2] アミノ酸配列： X1-X2-X3-X4-X5-X6が該ポリペプチドの 202〜207番目に位置する
、請求項 1記載のポリヌクレオチド。
[3] XIがァラニン (A)、 X2がグリシン（G)、 X3がバリン（V)、 X4がプロリン（P)、 X5がトリプト ファン (W)、又は、 X6がバリン (V)である、請求項 1又は 2記載のポリヌクレオチド。
[4] アミノ酸配列： X1-X2-X3-X4-X5-X6が AGVPWVである、請求項 1記載のポリヌクレオ チド。
[5] アミノ酸配列： AGVPWVから成るポリペプチドをコードする塩基配列が（GCTGGTGT
TCCATGGGTT)である、請求項 4記載のポリヌクレオチド。
[6] ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来である、請求項 1ないし 5記載のポリ ヌクレオチド。
[7] ァスペルギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae) NBRC5375株由来の請求項 6記載のポ リヌクレオチド。
[8] 以下の（a)、（b)又は（c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(a)配列番号 1に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(b)アミノ酸配列（a)のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸が置換、欠失又 は付加されたアミノ酸配列から成り、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有する ポリペプチド、又は
(c)アミノ酸配列（a)と 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 成り、かつ、 FAD 結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
[9] (b)又は（c)のポリペプチドがアミノ酸配列： X1-X2-X3-X4-X5-X6を含む、請求項 8 記載のヌクレオチド。
[10] 以下の（d)、（e)又は（f)のポリヌクレオチド：
(d)配列番号 2又は配列番号 3に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、 (e)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオ チドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グルコース脱水 素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
(f)塩基配列（d)から成るポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有する塩基配列を 含み、かつ、 FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド。
[11] (e)又は（f)のポリヌクレオチドがアミノ酸配列：X1_X2-X3-X4-X5_X6をコードする塩 基配列を含む、請求項 10記載のポリヌクレオチド。
[12] アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列力、ら成るセンスプライマー及びァスぺ ノレギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素をコ ードするポリヌクレオチドの 3 '末端側の塩基配列から成るリバースプライマー、又は 、アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列対するアンチセンスプライマー及び ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素酵 素をコードするポリヌクレオチドの 5'末端側の塩基配列から成るフォワードプライマ 一の組み合わせを用いる PCRによって増幅可能な DNA断片を有する、 FAD結合型 グノレコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[13] アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列力 成るプローブとストリンジヱントな条 件下でハイブリダィズし、かつ、 FAD結合型グノレコース脱水素酵素活性を有するポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[14] アミノ酸配列： AGVPWVをコードする塩基配列が（GCTGGTGTTCCATGGGTT)であ る、請求項 12又は 13記載のポリヌクレオチド。
[15] D_グルコースに対する酵素活性値を 100%とした場合、マルトースに対する酵素活 性値が 10%以下、 D _ガラクトースに対する酵素活性値が 5 %以下であることを特徴 とする、ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱 水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
[16] 300U/mg以上の酵素活性を有することを特徴とする、ァスペルギルス 'ォリゼ (Asp ergillus oryzae)由来の FAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチ ド'。
[17] 請求項 1ないし 16記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
[18] 請求項 17記載の組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞。
[19] 大腸菌又はァスペルギルス ·ォリゼである、請求項 18記載の形質転換細胞。
[20] 請求項 18又は 19記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、グルコース を脱水素する作用を有する FAD結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴 とする FAD結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[21] 請求項 1ないし 16記載のポリヌクレオチドにコードされる、組換え FAD結合型ダルコ ース脱水素酵素。
[22] 請求項 21に記載の FAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグ ルコースの測定方法。
[23] 請求項 21に記載の FAD結合型グルコース脱水素酵素を含有することを特徴とするグ ルコース測定試薬組成物。
[24] 請求項 21に記載の FAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグ ルコース測定用のバイオセンサ。
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009084616A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
WO2009119728A1 (ja) * 2008-03-27 2009-10-01 東洋紡績株式会社 糸状菌由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｆａｄｇｄｈ）
JP2009247289A (ja) * 2008-04-08 2009-10-29 Toyobo Co Ltd グルコースの定量方法ならびに定量組成物
WO2010053161A1 (ja) * 2008-11-06 2010-05-14 ユニチカ株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2010126139A1 (ja) 2009-04-30 2010-11-04 池田食研株式会社 蛋白質性電子メディエータ
WO2010140431A1 (ja) * 2009-06-04 2010-12-09 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2011034108A1 (ja) * 2009-09-16 2011-03-24 東洋紡績株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JPWO2009069381A1 (ja) * 2007-11-28 2011-04-07 天野エンザイム株式会社 フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法
JP2011217755A (ja) * 2006-06-29 2011-11-04 Ikeda Shokken Kk グルコース測定用バイオセンサ
JP2012055229A (ja) * 2010-09-09 2012-03-22 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上するための方法
WO2013031664A1 (ja) * 2011-08-26 2013-03-07 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
CN103018292A (zh) * 2011-09-26 2013-04-03 爱科来株式会社 葡萄糖传感器
WO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2016-10-13 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
US10077432B2 (en) 2014-03-21 2018-09-18 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP2019033764A (ja) * 2018-12-06 2019-03-07 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
JP2019071912A (ja) * 2019-02-22 2019-05-16 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
US10961514B2 (en) 2016-01-14 2021-03-30 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
US11725193B2 (en) 2017-06-14 2023-08-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Modified glucose dehydrogenase

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2511656A1 (en) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Coenzyme-binding glucose dehydrogenase
EP2365073A1 (en) 2005-03-25 2011-09-14 Ikeda Food Research Co. Ltd. Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same
BR112014015708A8 (pt) * 2011-12-23 2017-07-04 Prad Res & Development Ltd método para determinar o ph de um líquido aquoso, aparelho para determinar ph de um líquido aquoso, e equipamento para processar um líquido aquoso
WO2013147206A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びこれをコードするポリヌクレオチド
WO2016114334A1 (ja) * 2015-01-16 2016-07-21 東洋紡株式会社 Ｆａｄ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2017146009A1 (ja) * 2016-02-24 2017-08-31 天野エンザイム株式会社 微生物の酵素生産性を制御する方法
WO2018062542A1 (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 有限会社アルティザイム・インターナショナル 電子メディエーター修飾酵素並びにそれを用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙
US10113131B2 (en) 2017-01-11 2018-10-30 The Boeing Company Phosphono paraffins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) * 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) * 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0094161A1 (en) 1982-05-07 1983-11-16 Imperial Chemical Industries Plc Method for determining glucose content of fluid
JPH0758272B2 (ja) * 1986-12-01 1995-06-21 松下電器産業株式会社 グルコ−スセンサ
JPS63139243A (ja) * 1986-12-01 1988-06-11 Matsushita Electric Ind Co Ltd グルコ−スセンサ
JPS63317757A (ja) * 1987-06-19 1988-12-26 Matsushita Electric Ind Co Ltd グルコ−スセンサ
US5286362A (en) 1990-02-03 1994-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Method and sensor electrode system for the electrochemical determination of an analyte or an oxidoreductase as well as the use of suitable compounds therefor
JPH04215055A (ja) * 1990-10-11 1992-08-05 Nok Corp グルコースバイオセンサ
US5593852A (en) * 1993-12-02 1997-01-14 Heller; Adam Subcutaneous glucose electrode
JP2959221B2 (ja) * 1991-08-21 1999-10-06 松下電器産業株式会社 グルコースセンサの製造法
JP3084877B2 (ja) * 1992-01-21 2000-09-04 松下電器産業株式会社 グルコースセンサの製造方法
DE4301904A1 (de) 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh Hypoglycosylierte recombinante Glucoseoxidase
US5879921A (en) 1996-11-07 1999-03-09 Novo Nordisk A/S Recombinant expression of a glucose oxidase from a cladosporium strain
JPH10239273A (ja) 1997-02-26 1998-09-11 Akebono Brake Res & Dev Center Ltd グルコースセンサ
JPH10243786A (ja) 1997-03-03 1998-09-14 Koji Hayade 改変型グルコース脱水素酵素
US6059946A (en) 1997-04-14 2000-05-09 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor
US6656702B1 (en) 1998-07-03 2003-12-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor containing glucose dehydrogenase
JP3694424B2 (ja) 1998-09-29 2005-09-14 松下電器産業株式会社 グルコースセンサ
US6338790B1 (en) 1998-10-08 2002-01-15 Therasense, Inc. Small volume in vitro analyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator
US6100037A (en) 1999-01-07 2000-08-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human cyclic nucleotide PDEs
JP2000262281A (ja) * 1999-03-18 2000-09-26 Koji Hayade 架橋グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2000350588A (ja) 1999-04-08 2000-12-19 Koji Hayade グルコース脱水素酵素
TWI224136B (en) 1999-04-30 2004-11-21 Koji Sode Glucose dehydrogenase
JP2000312588A (ja) 1999-04-30 2000-11-14 Koji Hayade グルコース脱水素酵素
JP2001197888A (ja) 2000-01-18 2001-07-24 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
JP4526638B2 (ja) 1999-06-01 2010-08-18 月桂冠株式会社 タンパク質の高発現システム
JP2001037483A (ja) 1999-07-30 2001-02-13 Koji Hayade 連結型グルコース脱水素酵素
US6616819B1 (en) * 1999-11-04 2003-09-09 Therasense, Inc. Small volume in vitro analyte sensor and methods
JP2000354495A (ja) 2000-01-01 2000-12-26 Koji Hayade グルコース脱水素酵素の製造方法
JP2001346587A (ja) 2000-06-08 2001-12-18 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
CA2427029C (en) 2000-10-27 2010-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
JP2002223772A (ja) 2001-02-01 2002-08-13 Gekkeikan Sake Co Ltd カタラーゼａ遺伝子
IL157829A0 (en) 2001-03-13 2004-03-28 Koji Sode Glucose dehydrogenases
WO2002093151A1 (fr) * 2001-05-15 2002-11-21 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biocapteur
US20030082595A1 (en) 2001-08-03 2003-05-01 Bo Jiang Nucleic acids of aspergillus fumigatus encoding industrial enzymes and methods of use
JP2004344145A (ja) 2002-05-27 2004-12-09 Toyobo Co Ltd 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP2004173538A (ja) 2002-11-25 2004-06-24 Amano Enzyme Inc ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素
JP4332794B2 (ja) 2003-03-24 2009-09-16 東洋紡績株式会社 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP4029346B2 (ja) 2003-03-24 2008-01-09 東洋紡績株式会社 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP5105691B2 (ja) * 2003-05-09 2012-12-26 月桂冠株式会社 アスペルギルス属糸状菌由来の環状ヌクレオチド、アスペルギルス属糸状菌セルフクローニング株の製造方法及びセルフクローニング株
US7479383B2 (en) 2003-09-08 2009-01-20 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity
JP2005089884A (ja) 2003-09-12 2005-04-07 Mitsubishi Rayon Co Ltd 炭素繊維前駆体アクリル繊維束の製造方法
WO2005088288A1 (ja) * 2004-03-10 2005-09-22 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology カーボンナノチューブバイオセンサ
DE602005025104D1 (de) 2004-04-23 2011-01-13 Arkray Inc Mutierte glucosedehydrogenase
JP2008154572A (ja) * 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 糸状菌由来グルコース脱水素酵素の製造方法
US7553649B2 (en) 2006-03-31 2009-06-30 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for producing glucose dehydrogenase from Aspergillus oryzae
JP2007289148A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Toyobo Co Ltd アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
JP4179384B2 (ja) * 2006-03-31 2008-11-12 東洋紡績株式会社 アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
EP2022850B1 (en) 2006-05-29 2011-08-31 Amano Enzyme Inc. Flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase
JP4665235B2 (ja) * 2006-06-29 2011-04-06 池田食研株式会社 Ｆａｄ結合型グルコース脱水素酵素遺伝子
JP2008206433A (ja) 2007-02-26 2008-09-11 Toyobo Co Ltd グルコースデヒドロゲナーゼをコードするｄｎａ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) * 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) * 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド

Cited By (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013138677A (ja) * 2006-06-29 2013-07-18 Ikeda Shokken Kk グルコース測定用バイオセンサ
JP2011217755A (ja) * 2006-06-29 2011-11-04 Ikeda Shokken Kk グルコース測定用バイオセンサ
JPWO2009069381A1 (ja) * 2007-11-28 2011-04-07 天野エンザイム株式会社 フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法
WO2009084616A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
WO2009119728A1 (ja) * 2008-03-27 2009-10-01 東洋紡績株式会社 糸状菌由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｆａｄｇｄｈ）
JP5408125B2 (ja) * 2008-03-27 2014-02-05 東洋紡株式会社 糸状菌由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｆａｄｇｄｈ）
JP2009247289A (ja) * 2008-04-08 2009-10-29 Toyobo Co Ltd グルコースの定量方法ならびに定量組成物
WO2010053161A1 (ja) * 2008-11-06 2010-05-14 ユニチカ株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
US8969025B2 (en) 2009-04-30 2015-03-03 Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. Protein electron mediator
JP5828554B2 (ja) * 2009-04-30 2015-12-09 池田食研株式会社 蛋白質性電子メディエータ
US8716442B2 (en) 2009-04-30 2014-05-06 Ikeda Food Research Co., Ltd. Protein electron mediator
WO2010126139A1 (ja) 2009-04-30 2010-11-04 池田食研株式会社 蛋白質性電子メディエータ
JP2012132926A (ja) * 2009-04-30 2012-07-12 Ikeda Shokken Kk 蛋白質性電子メディエータ
EP2589659A1 (en) 2009-04-30 2013-05-08 Ikeda Food Research Co. Ltd. Protein-type electron mediator
KR101086189B1 (ko) 2009-06-04 2011-11-25 기꼬만 가부시키가이샤 플라빈 결합형 글루코오스 디히드로게나아제
CN102292439B (zh) * 2009-06-04 2014-04-09 龟甲万株式会社 黄素结合型葡萄糖脱氢酶
WO2010140431A1 (ja) * 2009-06-04 2010-12-09 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
US8445246B2 (en) 2009-06-04 2013-05-21 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenases
CN102292439A (zh) * 2009-06-04 2011-12-21 龟甲万株式会社 黄素结合型葡萄糖脱氢酶
US8247189B2 (en) 2009-09-16 2012-08-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
WO2011034108A1 (ja) * 2009-09-16 2011-03-24 東洋紡績株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2012055229A (ja) * 2010-09-09 2012-03-22 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上するための方法
US8945359B2 (en) 2011-08-26 2015-02-03 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-binding glucose dehydrogenase
JPWO2013031664A1 (ja) * 2011-08-26 2015-03-23 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013031664A1 (ja) * 2011-08-26 2013-03-07 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
CN103018292B (zh) * 2011-09-26 2015-08-05 爱科来株式会社 葡萄糖传感器
CN103018292A (zh) * 2011-09-26 2013-04-03 爱科来株式会社 葡萄糖传感器
US10077432B2 (en) 2014-03-21 2018-09-18 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
WO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2016-10-13 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JPWO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2018-02-08 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
US10913971B2 (en) 2015-04-09 2021-02-09 Toyobo Co., Ltd. Enzyme preparation for use in measurement of glucose
JP2021118744A (ja) * 2015-04-09 2021-08-12 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP2022062148A (ja) * 2015-04-09 2022-04-19 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP7156437B2 (ja) 2015-04-09 2022-10-19 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP7276530B2 (ja) 2015-04-09 2023-05-18 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
US10961514B2 (en) 2016-01-14 2021-03-30 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
US11725193B2 (en) 2017-06-14 2023-08-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Modified glucose dehydrogenase
JP2019033764A (ja) * 2018-12-06 2019-03-07 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
JP2019071912A (ja) * 2019-02-22 2019-05-16 東洋紡株式会社 アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法

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