WO2007048379A1 - Optical coupling element for a flow cell - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to an optical coupling element which serves as a connecting piece between a flow cell and a microscopic evaluation device.
- An essential field of application of this optical coupling element is light and fluorescence microscopy for the examination of samples.
- these microorganisms or microbial aggregates are characterized microscopically in situ (Strathmann.M., Wingender.J., Flemming, H.-C, Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in Biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Journal of Microbiological Methods 50, 237-248, 2002).
- the object of the invention is to develop an optical coupling element for the microscopic characterization of samples in flow cells in order to avoid a direct contact of the lens with the flow solution and thereby to keep the losses in the numerical aperture of the lens as low as possible.
- the invention replaceable optical coupling element leads to a protection of the lens. Due to the optical coupling element, an additional image plane is laid at the location of the original object plane so as not to have to accept any aperture deterioration. Another possible use of this coupling element is given in the coupling of cryogenic cells in the microscopic beam path.
- the sample carrier 2 is provided with a micrometer screw 10, via which the table can be moved freely in the Z direction.
- the optical coupling element is not designed to be interchangeable.
- an additional opening 12 is provided in the cell 1, via which the desired gas atmosphere is introduced into the cell 1.
- the gas is pressed through a filter 13 into the cell 1.
- An advantageous embodiment of the invention is to separate the second converging lens 8 by a transmitter liquid 14 from the nutrient liquid or the markers 15 in order to avoid contamination of the surface of the second converging lens 8.
- This transmitter liquid 14 is introduced if necessary via a channel 9 in the lid 5.
- a transmitter fluid 14 are suitable polar liquids that do not dissolve in water and form a meniscus 16 with water-like solutions due to the resulting surface tension.
- Fig. 2 shows the optical path between the objective 11 and the sample 3.
- a total of 3 (or 4 when using a transmitter liquid 14, [s Fig. 3]) additional optical active surfaces are inserted to the object (the sample 3) in to image the image plane 18 of the microscope. These are the two lenses and the spaces between them. Between the lens 7 and the lens 11, an additional image plane 19 is generated by the optical coupling element 7,8.
- Other optically active surfaces can be introduced if color correction is necessary.
- FIG. 3 shows the formation of a meniscus 16 between the polar transmitter liquid 14 and the bipolar nutrient medium 15.
Abstract
The aim of the invention is to develop an optical coupling element for microscopically characterizing samples in flow cells in order to prevent the lens from entering in direct contact with the flow solution while keeping losses in the numerical aperture of the lens as low as possible. Said aim is achieved by a cell (1), one or several sample supports (2) located inside the cell (1), inlets and outlets (4) for ensuring a continuous flow of different solutions through the cell (1), and ports (12) for introducing an inert gas atmosphere. The invention is characterized in that a recess is provided in the cover part (5) to microscopically examine the samples (3) in situ, an additional optical coupling element (7, 8) is introduced into the recess of the cover part (5), and the optical system is composed of two optically active media which are disposed in optically opposite directions.
Description
Optisches Koppelelement für eine Durchflusszelle Optical coupling element for a flow cell
Die Erfindung betrifft ein optisches Koppelelement, welches als Verbindungsstück zwischen einer Durchflusszelle und einer mikroskopischen Auswerteeinrichtung dient. Ein wesentliches Einsatzgebiet dieses optischen Koppelelements ist die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Proben.The invention relates to an optical coupling element which serves as a connecting piece between a flow cell and a microscopic evaluation device. An essential field of application of this optical coupling element is light and fluorescence microscopy for the examination of samples.
Es ist bekannt, dass Mikroorganismen und mikrobielle Aggregate im Labor in speziellen Reaktoren, so genannten Durchflussreaktoren oder Durchflusszellen kultiviert werden (Lawrence.J.R., Swerhone.G.D.W., Neu,T.R., A simple rotating annular reactor for replicated biofilm studies. Journal of Microbiological Methode 42, 215-224, 2000; Beyenal,H., Sani.R.K., Peyton.B.M., Dohnalkova,A.C, Amonette,J.E., Lewandowski.Z., Uranium Immobilization by Sulfate-Reducing Biofilms. Environ. Sei. Technol. 38, 2067- 2074, 2004). Mit Hilfe von fluoreszierenden Markerfarbstoffen werden diese Mikroorganismen oder mikrobielle Aggregate in situ mikroskopisch charakterisiert (Strathmann.M., Wingender.J., Flemming,H.-C, Application of fluorescently labelled lectins for the visualization and biochemical characterization of Polysaccharides in Biofilms of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods 50, 237-248, 2002).It is known that microorganisms and microbial aggregates are cultivated in the laboratory in special reactors, so-called flow-through reactors or flow-through cells (Lawrence.JR, Swerhone.GDW, New, TR, A simple rotating reactor for replicated biofilm studies.) Journal of Microbiological Method 42 , 215-224, 2000, Beyenal, H., Sani.RK, Peyton.BM, Dohnalkova, AC, Amonette, JE, Lewandowski, Z., Uranium Immobilization by Sulfate Reducing Biofilms, Environ., See, Technol., 38, 2067 - 2074, 2004). With the aid of fluorescent marker dyes, these microorganisms or microbial aggregates are characterized microscopically in situ (Strathmann.M., Wingender.J., Flemming, H.-C, Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in Biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Journal of Microbiological Methods 50, 237-248, 2002).
Die Probenbestandteile werden dabei spezifisch mit den Fluoreszenzfarbstoffen markiert und emittieren bei optimaler Anregung Fluoreszenzlicht. Die Untersuchung dieser Proben ist mit kommerziellen Fluoreszenzmikroskopen durchführbar. Eine besondere Schwierigkeit des Messverfahrens in einer Durchflusszelle besteht darin, dass nacheinander verschiedene Flüssigkeiten in den Raum zwischen Objektiv des Mikroskops und dem Träger der Mikroorganismen eingebracht werden. Dabei kommt es, vor allem bei Eintauchobjektiven zwangsläufig zu einer Benetzung des Objektivs. Diese Benetzung ist insbesondere bei Flüssigkeiten mit gelösten radioaktiven Metallen durch deren schnelle Adsorption und schlechte Desorption am Objektiv unerwünscht.The sample components are labeled specifically with the fluorescent dyes and emit fluorescent light with optimal excitation. The examination of these samples is feasible with commercial fluorescence microscopes. A particular difficulty of the measuring method in a flow cell is that successive different liquids are introduced into the space between the objective of the microscope and the carrier of the microorganisms. It comes, especially with immersion lenses inevitably to a wetting of the lens. This wetting is particularly undesirable in liquids with dissolved radioactive metals by their rapid adsorption and poor desorption on the lens.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein optisches Koppelelement zur mikroskopischen Charakterisierung von Proben in Durchflusszellen zu entwickeln, um einen direkten Kontakt des Objektivs mit der Durchflusslösung zu vermeiden und dabei
die Verluste in der numerischen Apertur des Objektivs so gering als möglich zu halten.The object of the invention is to develop an optical coupling element for the microscopic characterization of samples in flow cells in order to avoid a direct contact of the lens with the flow solution and thereby to keep the losses in the numerical aperture of the lens as low as possible.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprüchen dargelegten Merkmalen gelöst.According to the invention the object is achieved with the features set out in the claims.
Das erfindungsgemäß austauschbare optische Koppelelement führt zu einer Schonung des Objektivs. Durch das optische Koppelelement wird an der Stelle der ursprünglichen Objektebene eine zusätzliche Bildebene gelegt, um damit keine Aperturverschlechterung hinnehmen zu müssen. Eine weitere Einsatzmöglichkeit dieses Koppelelementes ist bei der Einkopplung von Kryozellen in den mikroskopischen Strahlengang gegeben.The invention replaceable optical coupling element leads to a protection of the lens. Due to the optical coupling element, an additional image plane is laid at the location of the original object plane so as not to have to accept any aperture deterioration. Another possible use of this coupling element is given in the coupling of cryogenic cells in the microscopic beam path.
Bei der Auslegung dieser Koppelelemente ist besonders darauf zu achten, dass in der optischen Koppeleinheit bereits Möglichkeiten eingearbeitet werden um auftretende Fehler, wie z.B. achromatische Fehler korrigieren zu können. Sowohl die Durchflusszelle an sich, als auch der Einkoppelbereich für das optische Koppelelement ist zur Umgebung hin gasdicht (isoliert) zu gestalten, so dass auch Messungen unter Inertgasatmosphäre möglich sind. Über die Linsen im optischen System erfolgt in bekannter Weise die Korrektur von Abbildungsfehlern, wie z.B. achromatische Fehler.When designing these coupling elements, special care must be taken to ensure that possibilities are already incorporated in the optical coupling unit for errors that occur, such as errors. to be able to correct achromatic errors. Both the flow cell per se, and the coupling region for the optical coupling element is to make gas-tight (isolated) to the environment, so that measurements under inert gas atmosphere are possible. Via the lenses in the optical system, correction of aberrations, such as e.g. achromatic errors.
Kommerzielle Durchflusszellen, welche in den mikroskopischen Strahlengang eingekoppelt werden können sind im Allgemeinen dadurch charakterisiert, dass sie nach oben hin offen oder vom Fassungsvolumen so minimal dimensioniert sind, dass durch den Durchfluss von Nährflüssigkeiten oder Markerflüssigkeiten keine kritischen Drücke für Deckgläschen entstehen. Das Pumpvolumen muss bei diesen Durchflusszellen an die Bruchstabilität des Deckgläschens angepasst werden. Eine In-situ-Messung der Proben im Durchfluss, bei höheren Pump- und Druckverhältnissen ist somit nicht oder nur in sehr geringen Grenzen gewährleistet. Bei hochaperturigen Objektiven beispielsweise ist der Arbeitsabstand zur Probe sehr gering. Somit darf das Deckglas auf der Probe nur eine geringe Schichtdicke aufweisen, welche wiederum eine geringe Pumpleistung oder geringe Drücke bedingt. Für Objektive mit größerem Arbeitsabstand, können zwar Deckgläser mit größerer Schichtdicke eingesetzt werden, es ist aber mit einer erheblichen Verschlechterung der numerischen Apertur zu rechnen. Ein einfaches Eintauchen der Objektive in die Durchflusslösung führt nur bei nicht aggressiven, schlecht sorbierenden
Lösungen mehrfach zum Ziel. Aggressive gut sorbierende Lösungen führen zu einer Beschädigung des Objektivs, welche bei mehreren Anwendungen das Objektiv unbrauchbar werden lassen.Commercial flow cells which can be coupled into the microscopic beam path are generally characterized by being open at the top or minimized by the volume of the volume so that the flow of nutrient fluids or marker fluids does not create critical pressures for coverslips. The pump volume must be adapted to the breakage stability of the coverslip in these flow cells. An in-situ measurement of the samples in the flow, at higher pumping and pressure conditions is thus not guaranteed or only within very narrow limits. For example, with high-aperture objectives, the working distance to the sample is very small. Thus, the cover glass on the sample may only have a small layer thickness, which in turn requires a low pumping power or low pressures. For lenses with a longer working distance, coverslips with a larger layer thickness can be used, but a considerable deterioration in the numerical aperture is to be expected. A simple dipping of the lenses in the flow-through solution only leads to non-aggressive, poorly sorbent Solutions several times to the goal. Aggressive well-sorbed solutions lead to damage to the lens, which in several applications make the lens unusable.
Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigenThe invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment. In the accompanying drawings show
Fig. 1 den Gesamtaufbau der Messzelle mit optischem Koppelelement, Fig. 2 den Strahlengang der Messzelle und Fig. 3 den Meniskus der Transmitterflüssigkeit.1 shows the overall structure of the measuring cell with optical coupling element, Fig. 2 shows the beam path of the measuring cell and Fig. 3 shows the meniscus of the transmitter liquid.
In einer geschlossenen Zelle 1 befinden sich der Probenträger 2 mit den darauf immobilisierten Mikroorganismen, Zellen bzw. Gewebeproben 3. Die Proben 3 werden in der Zelle 1 über Zu - und Abläufe 4 wahlweise durch Nährsuspensionen zur Förderung des Wachstums und der Vermehrung durch Markerflüssigkeiten mit gelösten Fluoreszenzfarbstoffen oder mit umweltrelevanten fluoreszierenden Schwermetallen 15 benetzt. Im Deckelteil 5 der Zelle 1 befindet sich eine Öffnung 6, in welche zwei zueinander entgegengesetzt liegende Sammellinsen 7,8 eingepasst werden. Das optische Koppelelement (Sammellinsen) 7,8 stellt ein Bauteil für sich dar und kann in der Gesamtzelle 1 jederzeit gegen ein anderes Linsensystem ausgetauscht werden. Das gewünschte Dichtekriterium der Zelle 1 gegenüber der Umgebung wird beim Austausch des optischen Koppelelements 7,8 über mehrere Gummidichtungen 17 erfüllt. Um die gewünschte Objektebene während der Messung zu fokusieren, ist der Probenträger 2 mit einer Mikrometerschraube 10 versehen, über welche der Tisch in Z-Richtung frei bewegt werden kann. In einer weiteren Ausführungsvariante mit Inertgasatmosphäre wird das optische Koppelelement nicht austauschbar gestaltet. Für diese Messungen ist eine zusätzliche Öffnung 12 in der Zelle 1 vorgesehen, über welche die gewünschte Gasatmosphäre in die Zelle 1 eingebracht wird. Das Gas wird dabei über einen Filter 13 in die Zelle 1 gepresst. Eine vorteilhafte Ausführung der Erfindung besteht darin, die zweite Sammellinse 8 durch eine Transmitterflüssigkeit 14 von der Nährflüssigkeit oder den Markierungsstoffen 15 zu trennen, um eine Verunreinigung der Oberfläche der zweiten Sammellinse 8 zu vermeiden. Diese Transmitterflüssigkeit 14 wird bei Bedarf über einen Kanal 9 im Deckel 5 eingeleitet. Als Transmitterflüssigkeit 14 eignen sich
polare Flüssigkeiten, die sich in Wasser nicht lösen und durch die entstehende Oberflächenspannung einen Meniskus 16 mit wasserähnlichen Lösungen bilden.In a closed cell 1 are the sample carrier 2 with the microorganisms, cells or tissue samples 3 immobilized thereon. The samples 3 are dissolved in cell 1 via feeds and drains 4 optionally by nutrient suspensions to promote growth and multiplication by marker fluids Fluorescent dyes or wetted with environmentally relevant fluorescent heavy metals 15. In the cover part 5 of the cell 1 is an opening 6, in which two mutually opposite collecting lenses 7,8 are fitted. The optical coupling element (converging lenses) 7, 8 represents a component per se and can be exchanged in the overall cell 1 at any time for another lens system. The desired density criterion of the cell 1 with respect to the environment is met when replacing the optical coupling element 7,8 over a plurality of rubber seals 17. In order to focus the desired object plane during the measurement, the sample carrier 2 is provided with a micrometer screw 10, via which the table can be moved freely in the Z direction. In a further embodiment variant with an inert gas atmosphere, the optical coupling element is not designed to be interchangeable. For these measurements, an additional opening 12 is provided in the cell 1, via which the desired gas atmosphere is introduced into the cell 1. The gas is pressed through a filter 13 into the cell 1. An advantageous embodiment of the invention is to separate the second converging lens 8 by a transmitter liquid 14 from the nutrient liquid or the markers 15 in order to avoid contamination of the surface of the second converging lens 8. This transmitter liquid 14 is introduced if necessary via a channel 9 in the lid 5. As a transmitter fluid 14 are suitable polar liquids that do not dissolve in water and form a meniscus 16 with water-like solutions due to the resulting surface tension.
Fig. 2 zeigt den Strahlengang zwischen Objektiv 11 und Probe 3. Es werden insgesamt 3 (bzw. 4 bei Verwendung einer Transmitterflüssigkeit 14, [s. Fig. 3]) zusätzliche optisch aktive Flächen eingefügt, um das Objekt (die Probe 3) in die Bildebene 18 des Mikroskopes abzubilden. Dabei handelt es sich um die beiden Linsen und die Zwischenräume. Zwischen Linse 7 und dem Objektiv 11 wird durch das optische Koppelelement 7,8 eine zusätzliche Bildebene 19 erzeugt. Weitere optisch aktive Flächen können eingeführt werden, wenn eine Farbkorrektur notwendig ist.Fig. 2 shows the optical path between the objective 11 and the sample 3. A total of 3 (or 4 when using a transmitter liquid 14, [s Fig. 3]) additional optical active surfaces are inserted to the object (the sample 3) in to image the image plane 18 of the microscope. These are the two lenses and the spaces between them. Between the lens 7 and the lens 11, an additional image plane 19 is generated by the optical coupling element 7,8. Other optically active surfaces can be introduced if color correction is necessary.
Fig. 3 zeigt die Ausbildung eines Meniskus 16 zwischen der polaren Transmitterflüssigkeit 14 und der bipolaren Nährflüssigkeit 15.
FIG. 3 shows the formation of a meniscus 16 between the polar transmitter liquid 14 and the bipolar nutrient medium 15.
Claims
1. Optisches Koppelelement für eine Durchflusszelle im wesentlichen bestehend aus: einer Zelle (1), einem oder mehreren Probenträgern (2), welche sich innerhalb der Zelle (1) befinden,1. An optical coupling element for a flow cell essentially consisting of: a cell (1), one or more sample carriers (2) which are located inside the cell (1),
Zu - und Abläufen (4) zur Gewährleistung eines kontinuierlichen Flusses von verschiedenen Lösungen durch die Zelle (1) hindurch,Inlets and outlets (4) for ensuring a continuous flow of different solutions through the cell (1),
Öffnungen (12) für das Einbringen einer Inertgasatmosphäre, dadurch gekennzeichnet, dass eine Aussparung im Deckelteil (5) zur mikroskopischen Untersuchung der ProbenOpenings (12) for introducing an inert gas atmosphere, characterized in that a recess in the cover part (5) for microscopic examination of the samples
(3) in situ vorgesehen ist, in die Aussparung des Deckelteils (5) ein zusätzliches optisches Koppelelement(3) is provided in situ, in the recess of the cover part (5) an additional optical coupling element
(7,8) eingebracht ist und das optische System aus zwei optisch aktiven Medien besteht, die optisch entgegengesetzt angeordnet sind.(7,8) is introduced and the optical system consists of two optically active media, which are arranged optically opposite.
2. Optisches Koppelelement nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass bei aggressiven Proben (3) und Lösungen (15) die zur Probe (3) hingewandte Linse (8) mit einem Film einer Transmitterflüssigkeit (14) überzogen ist.2. An optical coupling element according to claim 1, characterized in that in aggressive samples (3) and solutions (15) to the sample (3) evocative lens (8) with a film of a transmitter liquid (14) is coated.
3. Optisches Koppelelement nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das optische Koppelelement (7,8) mit Dichtungen versehen und im System der Durchflusszelle (1) austauschbar ist. 3. Optical coupling element according to claim 1, characterized in that the optical coupling element (7,8) provided with seals and in the system of the flow cell (1) is interchangeable.
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