WO2005092114A2 - Compositions and methods for destruction of prion infectious proteins - Google Patents

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WO2005092114A2
WO2005092114A2 PCT/FR2005/050158 FR2005050158W WO2005092114A2 WO 2005092114 A2 WO2005092114 A2 WO 2005092114A2 FR 2005050158 W FR2005050158 W FR 2005050158W WO 2005092114 A2 WO2005092114 A2 WO 2005092114A2
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Abstract

The invention relates to a method for reducing a prion infectious protein concentration in a material embodied in a form of a liquid, particles or fibres and contaminated or suspected to be contaminated with prion infectious proteins consisting (a) in bringing into contact and mixing said contaminated material with at least one type of bacterium which secretes one or several types of hydrolytic enzymes, including proteolytic enzymes, with respect to said prion infectious proteins and (b) in incubating the bacterium or bacteria with the contaminated material for a period of time sufficient for obtaining a desired reduction percentage of the prion infectious protein concentration in the contaminated material.

Description

COMPOSITIONS ET METHODES POUR LA DESTRUCTION DE PROTEINES PRION INFECTIEUSES COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DESTRUCTION OF INFECTIOUS PRION PROTEINS
Domaine de l'inventionField of the invention
La présente invention concerne des compositions et des méthodes pour la destruction de protéines prion infectieuses associées avec l'encéphalite spongiforme affectant les espèces animales, notamment bovines et ovines. Plus spécifiquement, l'invention concerne l'utilisation de bactéries pour la destruction de protéines prion infectieuses contenues dans les tissus animaux.The present invention relates to compositions and methods for the destruction of infectious prion proteins associated with spongiform encephalitis affecting animal species, particularly cattle and sheep. More specifically, the invention relates to the use of bacteria for the destruction of infectious prion proteins contained in animal tissues.
Art antérieurPrior art
Les protéines prion sont des protéines anormalement conformées qui sont associées à des maladies neuro-dégénératives infectieuses. Les maladies liées aux prions dans les espèces de mammifères non humaines incluent la scrapie chez le mouton, certaines encéphalopathies comme l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), l'encéphalopathie spongiforme féline, l'encéphalopathie spongiforme simienne. La protéine prion pathogène catalyse la transformation de la protéine normale, physiologique en une forme amyloïde insoluble. Les protéines prion des mammifères comprennent un haut degré d'homologie (85 à 97%). Ces protéines sont donc capables, après introduction dans un autre organisme, de provoquer la transformation des protéines prions normales endogènes (Prusiner 1998). L'infection des bovins a ainsi été associée à la présence, dans la nourriture de ces derniers, de farines de viandes et d'os d'animaux, désignées ci-après sous le terme générique de « farines animales », provenant d'animaux contaminés par une protéine prion pathogène. L'existence de farines animales provenant d'animaux contaminés par l'ESB, du fait de l'accumulation de la forme amyloïde insoluble de la protéine prion, présente de nombreux problèmes d'ordres économique, technique et environnemental. En effet, la forme amyloïde insoluble de la protéine prion (PrPsc), qui est la forme infectieuse et pathogène de la protéine, est très stable. Cette protéine est riche en feuillets β, résistante à la chaleur et aux enzymes protéolytiques les plus actives, comme par exemple la protéinase K (Prusiner, 1998). Par conséquent, aujourd'hui dans beaucoup de pays, les produits d'origine animale qui pourraient servir de base comme supplément nutritionnel pour les animaux, tels que les farines animales, sont incinérés. Puis, les résidus de cendres sont détruits de manière à éviter une transmission de la protéine prion infectieuse à d'autres animaux. En Europe, l'utilisation des farines animales et de leurs sous- produits en tant que nourriture a été interdite. Aux Etats-Unis, plusieurs cas d'encéphalite spongiforme bovine ont été rapportés, et les industriels ont été contraints à des réglementations plus sévères de manière à prévenir le développement des maladies liées au prion. Une grande variété de tests pour déterminer la présence de protéines prion infectieuses dans les tissus animaux a été développée, incluant des tests de type Western blot, des tests d'immunodétection de type sandwich, des tests ELISA, des tests fluoroimmunologiques, des tests d'électrophorèse capillaire, et des tests de liaison aux plasminogènes. Cependant peu de méthodes applicables industriellement pour détruire la protéine prion infectieuse ont été développées. Les protéines prion infectieuses sont résistantes aux méthodes de destruction conventionnelles qui permettent de dénaturer les protéines, incluant par exemple l'autoclavage, la congélation, et l'exposition à des réactifs fortement délétères pour les bactéries, comme le formaldéhyde, l'acide carboxylique et le chloroforme. A titre illustratif, la protéine prion infectieuse résiste à des températures de l'ordre de 200°C. Actuellement seuls l'incinération ou encore le traitement avec des agents de blanchiment sont utilisés en pratique pour détruire l'isoforme pathogène de la protéine prion. Une autre méthode de destruction de la protéine prion est décrite dans la demande de brevet WO 02/083082. Cette méthode consiste à utiliser des enzymes, notamment des kératinases provenant d'une bactérie Bacilus licheniformis pour réduire la quantité de protéine prion infectieuse. Néanmoins, cette méthode comprend des inconvénients d'ordres technique et économique. En effet, la mise en œuvre de cette méthode implique des étapes nombreuses telles que la culture des bactéries, l'extraction des enzymes protéolytiques ou encore le stockage de ces dernières, opérations qui peuvent s'avérer onéreuses à un niveau industriel. Il existe donc dans l'état de la technique, un besoin pour de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse qui sont applicables au traitement de matériaux biologiques, comme les tissus animaux, comprenant une protéine prion infectieuse. Ce besoin est d'autant plus important que plus de 180.000 cas d'ESB et 100 cas de maladie de Creutzfeldt-Jakob ont été rapportés en Europe depuis 1992, et les cas dans l'espèce humaine devraient augmenter de manière significative. L'expansion de ces maladies est difficile à contenir puisque de telles maladies ne bénéficient aujourd'hui d'aucun traitement thérapeutique. Notamment, la protéine prion pathogène n'est pas immunogène. Des efforts importants ont été réalisés pour étudier l'ESB, ainsi que le processus de contamination de la nourriture humaine par la protéine prion. Dans l'espèce humaine, les maladies neuro-dégénératives associées aux protéines prion incluent la maladie de Creutzfeldt- Jakob, le syndrome Gerstmann-Stràussler-Scheinker, l'insomnie fatale, le kuru, et les variants de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Ces pathologies humaines sont associées à la consommation d'une nourriture carnée (bœuf infecté par l'ESB, agent causal du nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob), à l'utilisation de l'hormone de croissance humaine contaminée par les prions infectieux (provoquant la maladie de Creutzfeldt-Jakob) et au cannibalisme rituel (qui entraîne la maladie de Kuru). La recherche de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse est donc d'importance, tant dans le domaine agronomique que dans le domaine de la santé humaine. Avantageusement, ces nouvelles techniques devront de préférence être moins consommatrices d'énergie, techniquement plus simples, et plus économiques que les techniques connues. De plus, ces nouvelles techniques devraient ne pas entraîner la destruction totale de la matière à décontaminer comme cela peut- être le cas avec l'incinération.Prion proteins are abnormally shaped proteins that are associated with infectious neurodegenerative diseases. Prion-related diseases in non-human mammalian species include scrapie in sheep, certain encephalopathies such as bovine spongiform encephalopathy (BSE), feline spongiform encephalopathy, simian spongiform encephalopathy. The pathogenic prion protein catalyzes the transformation of the normal, physiological protein into an insoluble amyloid form. Prion proteins in mammals include a high degree of homology (85 to 97%). These proteins are therefore capable, after introduction into another organism, of causing the transformation of endogenous normal prion proteins (Prusiner 1998). Cattle infection has thus been associated with the presence, in their feed, of meat and bone meal from animals, hereinafter referred to generically as "animal meal", from animals contaminated with a pathogenic prion protein. The existence of animal meal from animals infected with BSE, due to the accumulation of the amyloid form insoluble in the prion protein, presents many economic, technical and environmental problems. Indeed, the insoluble amyloid form of the prion protein (PrPsc), which is the infectious and pathogenic form of the protein, is very stable. This protein is rich in β sheets, resistant to heat and to the most active proteolytic enzymes, such as proteinase K (Prusiner, 1998). Consequently, today in many countries, products of animal origin which could serve as a base as a nutritional supplement for animals, such as animal meal, are incinerated. Then, the ash residue is destroyed in order to avoid transmission of the infectious prion protein to other animals. In Europe, the use of animal meal and its by-products as food has been banned. In the United States, several cases of bovine spongiform encephalitis have been reported, and manufacturers have been forced to impose more stringent regulations in order to prevent the development of prion-related diseases. A wide variety of tests to determine the presence of infectious prion proteins in animal tissues have been developed, including Western blot tests, sandwich immunodetection tests, ELISA tests, fluoroimmunological tests, capillary electrophoresis, and plasminogen binding tests. However, few industrially applicable methods for destroying the infectious prion protein have been developed. Infectious prion proteins are resistant to conventional destruction methods that denature proteins, including for example autoclaving, freezing, and exposure to reagents highly deleterious to bacteria, such as formaldehyde, carboxylic acid and chloroform. By way of illustration, the infectious prion protein withstands temperatures of the order of 200 ° C. Currently only incineration or treatment with bleaching agents are used in practice to destroy the pathogenic isoform of the prion protein. Another method of destroying the prion protein is described in patent application WO 02/083082. This method involves using enzymes, including keratinases from a Bacilus licheniformis bacteria to reduce the amount of infectious prion protein. However, this method has technical and economic disadvantages. Indeed, the implementation of this method involves numerous stages such as the culture of bacteria, the extraction of proteolytic enzymes or the storage of the latter, operations which can prove to be expensive on an industrial level. There therefore exists in the prior art, a need for new compositions and new methods for destroying the infectious prion protein which are applicable to the treatment of biological materials, such as animal tissues, comprising an infectious prion protein. This need is all the more important since more than 180,000 cases of BSE and 100 cases of Creutzfeldt-Jakob disease have been reported in Europe since 1992, and cases in the human species are expected to increase significantly. The spread of these diseases is difficult to contain since such diseases today do not benefit from any therapeutic treatment. In particular, the pathogenic prion protein is not immunogenic. Significant efforts have been made to study BSE, as well as the process of contamination of human food with the prion protein. In the human species, neurodegenerative diseases associated with prion proteins include Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann-Stràussler-Scheinker syndrome, fatal insomnia, kuru, and variants of Creutzfeldt-Jakob disease. These human pathologies are associated with the consumption of meat food (beef infected with BSE, the causative agent of the new variant of Creutzfeldt-Jakob disease), with the use of human growth hormone contaminated by prions. infectious (causing Creutzfeldt-Jakob disease) and ritual cannibalism (which causes Kuru's disease). The search for new compositions and new methods for destroying the infectious prion protein is therefore of importance, both in the agronomic field and in the field of human health. Advantageously, these new techniques should preferably be less energy consuming, technically simpler, and more economical than known techniques. In addition, these new techniques should not lead to the total destruction of the material to be decontaminated, as may be the case with incineration.
Sommaire de l'inventionSummary of the invention
L'invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant :The invention relates to a method for reducing the concentration of infectious prion protein in a material in liquid form, in the form of particles or in the form of fibers, contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein, comprising:
- une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie, qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et,a step (a) consisting in bringing into contact and mixing said contaminated material with at least one bacterium, which secretes one or more hydrolytic enzymes, including proteolytics, with respect to said infectious prion protein and,
- une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. L'invention concerne également des procédés tels que définis ci-dessus, pour lesquels l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. L'invention a également pour objet une composition nettoyante pour réduire la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans le procédé ci-dessus.a step (b) of incubation of the bacteria or bacteria with said contaminated material for a period of time sufficient to obtain a desired reduction percentage of the concentration of infectious prion protein in said contaminated material. The invention also relates to methods as defined above, in which step (a) is preceded by a step of heating the contaminated material at a temperature and for a period of time sufficient to increase the sensitivity of the infectious prion protein for proteolysis. A subject of the invention is also a cleaning composition for reducing the concentration of infectious prion protein in a material contaminated or suspected of being contaminated with the protein. infectious prion comprising at least one bacterium as defined in the above method.
Description des figuresDescription of the figures
Figure 1 Zymogrammes des surnageants provenant des bactéries thermophiles et S290Figure 1 Zymograms of the supernatants from thermophilic bacteria and S290
SDS-PAGE 10%, piste 1 : surnageants de souche AT1243 (incubation à 80°C), piste 2 : surnageants de souche AT1222 (incubation à 80°C). piste 3 : surnageants de souche S290.SDS-PAGE 10%, lane 1: supernatants of strain AT1243 (incubation at 80 ° C), lane 2: supernatants of strain AT1222 (incubation at 80 ° C). lane 3: supernatants of strain S290.
Figure 2 Hydrolyse de la protéine prion recombinante par les surnageants de bactéries thermophiles. (a) Pistes 1 à-6: protéine prion native, protéine prion hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60°C), AT1243 (80°C), AT1222 (80°C), AT1243 (60°C), et AT1222 (60°C) pendant cinq heures, respectivement.Figure 2 Hydrolysis of the recombinant prion protein by the supernatants of thermophilic bacteria. (a) Tracks 1 to 6: native prion protein, prion protein hydrolyzed by the supernatants of strains S290 (60 ° C), AT1243 (80 ° C), AT1222 (80 ° C), AT1243 (60 ° C), and AT1222 (60 ° C) for five hours, respectively.
(b) Pistes 1 à 6: protéine prion dénaturée thermiquement (PrPden), PrPden hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60°C), AT1243 (80°C), AT1222 (80°C), AT1243 (60°C), et AT1222 (60°C) pendant cinq heures, respectivement.(b) Tracks 1 to 6: thermally denatured prion protein (PrP den ), PrP den hydrolyzed by the supernatants of strains S290 (60 ° C), AT1243 (80 ° C), AT1222 (80 ° C), AT1243 (60 ° C), and AT1222 (60 ° C) for five hours, respectively.
(c) Pistes 1 à 6: protéine prion native en présence de Cu2+ (PrPCu), PrPCu hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60°C), AT1243 (80°C), AT1222 (80°C), AT1243 (60°C), et AT1222 (60°C) pendant cinq heures, respectivement.(c) Tracks 1 to 6: native prion protein in the presence of Cu 2+ (PrP Cu ), PrP Cu hydrolyzed by the supernatants of strains S290 (60 ° C), AT1243 (80 ° C), AT1222 (80 ° C) , AT1243 (60 ° C), and AT1222 (60 ° C) for five hours, respectively.
Figure 3 Hydrolyse de farines animales par les surnageants de bactéries thermophiles et par la protéinase K.Figure 3 Hydrolysis of animal meal by the supernatants of thermophilic bacteria and by proteinase K.
(a)Les pistes 1 à 16 représentent respectivement : des farines de laine/poils (1 ), des farines de laine/poils hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 à 80°C (2), AT1222 à 80°C (3), et S290 à 60°C (4) des farines de viande (5), des farines de viande hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (6) et AT1222 (7), et S290 (8) des farines de sang (9), des farines de sang hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (10) et AT1222 (1 1 ), et S290 (12) des farines mixtes (13), des farines mixtes hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (14) et AT1222 (15) et S290 (16). Les temps d'incubation sont de 20 heures. (b)Les pistes 1 à 8 représentent respectivement : des farines de laine/poils (1 ), des farines de laine/poils hydrolysées par la protéinase K (1 μM, 37°C) (2), des farines de viande (3), des farines de viande hydrolysées par la protéinase K 4, des farines de sang (5), des farines de sang hydrolysées par la protéinase K (6), des farines mixtes (7), des farines mixtes hydrolysées par la protéinase K (8). Les temps d'incubation sont de 20 heures. (a) Lanes 1 to 16 represent respectively: woolen flours / hairs (1), woolen flours / hairs hydrolysed by the supernatants of the strains AT1243 at 80 ° C (2), AT1222 at 80 ° C (3) , and S290 at 60 ° C (4) meat meal (5), meat meal hydrolyzed by the supernatants of strains AT1243 (6) and AT1222 (7), and S290 (8) blood meal (9) , blood meals hydrolyzed by the supernatants of the AT1243 strains (10) and AT1222 (1 1), and S290 (12) mixed flours (13), mixed flours hydrolysed by the supernatants of strains AT1243 (14) and AT1222 (15) and S290 (16). The incubation times are 20 hours. (b) Tracks 1 to 8 represent respectively: wool flours / hairs (1), wool flours / hairs hydrolysed by proteinase K (1 μM, 37 ° C) (2), meat flours (3 ), meat meals hydrolyzed by proteinase K 4, blood meals (5), blood meals hydrolyzed by proteinase K (6), mixed meals (7), mixed meals hydrolyzed by proteinase K ( 8). The incubation times are 20 hours.
Description détaillée de l'inventionDetailed description of the invention
Partant du constat que les procédés disponibles dans l'état de la technique pour détruire la protéine prion sont assez complexes et présentent des inconvénients d'ordre technique ou économique, les inventeurs se sont attaché à rechercher des bactéries capables de se multiplier sur les substrats à décontaminer et de produire simultanément in situ des enzymes protéolytiques efficaces contre le prion. En premier lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de microorganismes a requis, de la part des inventeurs, l'étude préalable de l'activité de protéases sécrétées par de tels micro- organismes sur des substrats modèles. Les kératines se sont avéré être un bon substrat modèle car elles présentent de nombreuses similarités structurelles avec la protéine prion infectieuse ce qui confère à ces enzymes une grande résistance à la protéolyse. On peut citer notamment l'insolubilité des kératines due à la présence de nombreux ponts disulfure intra et inter moléculaires, le contenu important en feuillets β, dans le cas des β kératines, et leur degré important d'agrégation (Arai et al., 1996 ; Goddard et Michaelis, 1934). De telles protéines peuvent être détruites seulement par des protéases hautement actives, telles que les subtilisines sécrétées par les bactéries appartenant au genre Bacillus. (Atalo et Gashe, 1993 ; Cheng et al., 1995 ; Lin et al., 1992 , Williams et al., 1990 ; Kristie et al., 2000) ou par des protéases actives en conditions dénaturantes qui déstabilisent les substrats résistant à la protéolyse (Han et Damodaran, 1997). Les inventeurs ont donc utilisé comme substrat modèle la kératine insoluble, formant des structures fibrillaires similaires à la PrPsc. En second lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de microorganismes a nécessité de sélectionner des micro-organismes produisant des enzymes protéolytiques détruisant la protéine prion infectieuse qui soient capables de se multiplier sans apport nutritif exogène, sur la matière substrat à décontaminer. Pour atteindre cet objectif, les inventeurs ont criblé des collections de micro-organismes capables de croître sur la kératine ou sur des farines animales et sécrétant des protéases capables de dégrader la PrPsc contenue dans les farines animales. Les inventeurs ont découvert, selon l'invention, grâce à cette méthode de criblage, des bactéries capables de dégrader la protéine prion infectieuse PrPsc et de croître sur un milieu composé de farines animales. La présente invention est basée sur l'utilisation de bactéries thermophiles et de bactéries appartenant au genre Streptomyces pour la dégradation de la protéine prion infectieuse contenue dans les tissus ou encore les farines animales Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière organique sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant : - une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et, - une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. L'efficacité du procédé de l'invention pour dégrader la protéine prion infectieuse était inattendue puisque l'exposition à des températures élevées et à des enzymes comme la protéinase K, connue pour dégrader les structures amyloïdes ne suffit pas à dégrader la protéine prion. Il est donc très surprenant que l'incubation de bactéries avec la protéine prion infectieuse parvienne à détruire cette dernière, à des températures compatibles avec la survie des bactéries. Par « enzyme hydrolytique », on entend une enzyme habituellement désignée par le terme « hydrolase », appartenant à la classe E.C.3 selon la classification internationale des enzymes. De préférence, l'enzyme hydrolytique est une enzyme protéolytique ou protéase, appartenant à la classe E.C.3.4 selon la classification internationale des enzymes. Par les termes « mise en contact » et « mélange », l'homme du métier comprendra que les bactéries sont par exemple déposées sur la matière contaminée ou susceptible d'être contaminée par laStarting from the observation that the methods available in the state of the art for destroying the prion protein are quite complex and have technical or economic drawbacks, the inventors have endeavored to search for bacteria capable of multiplying on the substrates to be decontaminate and simultaneously produce in situ proteolytic enzymes effective against the prion. First, the resolution of the problem of reducing the pathogenic nature of animal meal using microorganisms required, on the part of the inventors, the prior study of the activity of proteases secreted by such microorganisms on model substrates. Keratins have been shown to be a good model substrate because they have many structural similarities to the infectious prion protein which gives these enzymes great resistance to proteolysis. Mention may in particular be made of the insolubility of keratins due to the presence of numerous intra and inter-molecular disulfide bridges, the significant content of β sheets, in the case of β keratins, and their significant degree of aggregation (Arai et al., 1996 ; Goddard and Michaelis, 1934). Such proteins can be destroyed only by highly active proteases, such as the subtilisins secreted by bacteria belonging to the genus Bacillus. (Atalo and Gashe, 1993; Cheng et al., 1995; Lin et al., 1992, Williams et al., 1990; Kristie et al., 2000) or by proteases active under denaturing conditions which destabilize substrates resistant to proteolysis (Han and Damodaran, 1997). The inventors therefore used insoluble keratin as a model substrate, forming fibrillar structures similar to PrPsc. Second, solving the problem of reducing the pathogenic nature of animal meal using microorganisms required selecting microorganisms producing proteolytic enzymes destroying the prion protein infectious that are able to multiply without exogenous nutrient supply, on the substrate material to be decontaminated. To achieve this objective, the inventors screened collections of microorganisms capable of growing on keratin or on animal meal and secreting proteases capable of degrading the PrPsc contained in animal meal. The inventors have discovered, according to the invention, thanks to this screening method, bacteria capable of degrading the infectious prion protein PrPsc and growing on a medium composed of animal meal. The present invention is based on the use of thermophilic bacteria and bacteria belonging to the genus Streptomyces for the degradation of the infectious prion protein contained in tissues or even animal meal. A first object of the present invention relates to a process for reducing the concentration of infectious prion protein in an organic matter in liquid form, in the form of particles or in the form of fibers, contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein comprising: - a step (a) consisting in bringing into contact and mixing said contaminated material with at least one bacterium which secretes one or more hydrolytic enzymes, including proteolytics, with respect to said infectious prion protein and, - a step (b) of incubation of the bacteria or bacteria with said material contaminated for a period of time sufficient to achieve a desired reduction percentage of l a concentration of infectious prion protein in said contaminated material. The effectiveness of the process of the invention in degrading the infectious prion protein was unexpected since exposure to high temperatures and to enzymes such as proteinase K, known to degrade amyloid structures, is not sufficient to degrade the prion protein. It is therefore very surprising that the incubation of bacteria with the infectious prion protein manages to destroy the latter, at temperatures compatible with the survival of bacteria. By “hydrolytic enzyme” is meant an enzyme usually designated by the term “hydrolase”, belonging to the class EC3 according to the international classification of enzymes. Preferably, the hydrolytic enzyme is a proteolytic enzyme or protease, belonging to the class EC3.4 according to the international classification of enzymes. By the terms "contacting" and "mixing", a person skilled in the art will understand that the bacteria are, for example, deposited on material which is contaminated or liable to be contaminated by
PrPsc, puis mélangées à la matière contaminée, de manière à augmenter la surface de contact entre les bactéries et la matière contaminée. Par le terme « incubation », on doit comprendre que les bactéries sont placées dans des conditions permettant leur survie, de préférence des conditions proches de celles qui leurs sont habituelles dans leur milieu naturel. En particulier, la température à laquelle sont soumises les bactéries pendant leur incubation avec la matière contaminée ne sera pas inférieure à 20°C. Le terme « matière organique sous forme de particules » englobe les matières organiques sous forme de poudre et de farine. Le terme « matière organique contaminée » englobe les tissus animaux, les farines animales, leurs dérivés, et les sols. Le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée désigne la valeur V, exprimée en %, obtenue à l'aide de la formule suivante :PrPsc, then mixed with the contaminated material, so as to increase the contact surface between the bacteria and the contaminated material. By the term "incubation", it should be understood that the bacteria are placed in conditions allowing their survival, preferably conditions close to those which are usual for them in their natural environment. In particular, the temperature to which the bacteria are subjected during their incubation with the contaminated material will not be less than 20 ° C. The term "organic matter in the form of particles" includes organic matter in the form of powder and flour. The term "contaminated organic matter" includes animal tissues, animal meal, their derivatives, and soils. The percentage reduction in the concentration of non-proteolytic infectious prion protein designates the value V, expressed in%, obtained using the following formula:
V=[(X-Y)/X]*100V = [(X-Y) / X] x 100
Dans laquelle : X est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée avant traitement par le procédé selon l'invention et, Y est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée après traitement par le procédé selon l'invention. De préférence, la valeur V est d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 90%, de préférence d'au moins 95%, de manière tout à fait préférée d'au moins 98%, et idéalement de 100%. La valeur V du pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée peut être mesurée aisément par l'homme du métier, par des techniques en soi communes. A titre illustratif l'homme du métier utilise la technique d'électrophorèse comprenant avantageusement les étapes suivantes : (i) déposer un échantillon de matière organique traitée par le procédé de réduction décrit ci-dessus à l'extrémité d'un gel d'électrophorèse, (ii) faire migrer les protéines présentes dans le dépôt de matière organique sur le gel d'électrophorèse, (iii) après migration des protéines, déterminer la quantité Y de protéine prion infectieuse non protéolysée, et (iv) calculer la valeur V à l'aide de la valeur X de quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée dans la matière organique avant traitement. La quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée peut être déterminée par exemple en mettant en contact la surface du gel d'électrophorèse avec une solution contenant des anticorps marqués, spécifiques de cette protéine, puis en quantifiant l'intensité du marquage dans la région du gel d'électrophorèse dans laquelle migrent les protéines ayant une masse moléculaire identique ou proche de celle de la protéine prion infectieuse non hydrolysée. Des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine prion infectieuse seront décrits ci-après plus en détails. La valeur X peut être déterminée en appliquant les étapes (i) à (iii) du procédé ci-dessus à un échantillon de matière organique avant traitement par le procédé selon l'invention. De manière à pouvoir calculer le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse, à l'issue du procédé, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire (c) consistant à mesurer la concentration en protéine prion infectieuse dans la matière contaminée, à l'issue de l'étape (b). De manière avantageuse, l'étape (c) du procédé selon l'invention comprend la réalisation d'un test choisi dans le groupe comprenant : un WesternIn which: X is a value representative of the amount of non-proteolysed prion protein in the contaminated material before treatment by the process according to the invention and, Y is a value representative of the amount of non-proteolysed prion protein in the contaminated material after treatment by the process according to the invention. Preferably, the value V is at least 80%, advantageously at least 90%, preferably at least 95%, very preferably at least 98%, and ideally 100%. The value V of the percentage reduction in the concentration of non-proteolysed infectious prion protein can be easily measured by a person skilled in the art, by techniques which are per se common. By way of illustration, the person skilled in the art uses the electrophoresis technique advantageously comprising the following steps: (i) depositing a sample of organic material treated by the reduction process described above at the end of an electrophoresis gel , (ii) migrate the proteins present in the organic material deposit on the electrophoresis gel, (iii) after migration of the proteins, determine the quantity Y of non-proteolysed infectious prion protein, and (iv) calculate the value V at using the value X of the quantity of non-proteolysed infectious prion protein in the organic material before treatment. The quantity of non-proteolysed infectious prion protein can be determined for example by bringing the surface of the electrophoresis gel into contact with a solution containing labeled antibodies specific for this protein, then by quantifying the intensity of the labeling in the region of the gel. electrophoresis in which proteins with a molecular mass identical or close to that of the non-hydrolysed infectious prion protein migrate. Antibodies specifically recognizing the infectious prion protein will be described below in more detail. The X value can be determined by applying steps (i) to (iii) of the above process to a sample of organic matter before treatment by the process according to the invention. In order to be able to calculate the percentage reduction in the concentration of infectious prion protein, at the end of the method, the method according to the invention comprises an additional step (c) consisting in measuring the concentration of infectious prion protein in the contaminated material. , at the end of step (b). Advantageously, step (c) of the method according to the invention comprises carrying out a test chosen from the group comprising: a Western
Blot, un test immunologique de type « sandwich », un test fluoroimmunologique, une immunoélectrophorèse, un test de liaison au plasminogène. ~ En particulier, l'homme du métier pourra réaliser une immunoélectrophorèse pour détecter la protéine prion infectieuse selon la méthode décrite dans le brevet US 6,514,707. L'homme du métier pourra également mettre en œuvre les méthodes décrites ci- dessus en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine prion infectieuse issus des hybridomes enregistrés sous les références ATCC HB-12403 et ATCC HB-12696 décrits respectivement dans les brevets US 6,165,784 et US 6,261 ,790. L'homme du métier pourra également mesurer la quantité de protéine prion infectieuse dans la matière biologique avant ou après traitement par le procédé selon l'invention grâce au kit de détection de la protéine prion décrit dans le brevet US 2003/009 2090. Avantageusement, le procédé de l'invention est mis en œuvre au sein d'un procédé général de recyclage des matières contaminées, dans lequel ces matières sont placées dans un réservoir, avant d'être traversées par un flux de vapeur d'eau sous pression. Dans un tel cas, l'étape (a) du procédé de mise en contact et de mélange de la matière contaminée avec une bactérie, se fait lorsque la matière contaminée est placée dans le réservoir, et l'étape (b) d'incubation est réalisée lors de la mise en place du flux de vapeur sous pression. Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet, grâce au recours à la vapeur d'eau, d'utiliser une plus grande variété de bactéries. De préférence, les bactéries utilisées pour mettre en œuvre le procédé de l'invention ont subi un criblage au cours duquel les bactéries sont sélectionnées en fonction de leur capacité à croître sur de la kératine, comme cela est illustré dans l'exemple 3. En outre, les bactéries peuvent être soumises à une deuxième étape de criblage au cours de laquelle lesdites bactéries sont sélectionnées pour leur capacité à dégrader des oligomères dérivés du prion. Ce double criblage permet de disposer de bactéries qui sont capables de croître sur un milieu constitué de farines animales, et qui sont aussi capables de dégrader la protéine prion, au sein de ces farines. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les bactéries utilisées pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, sont choisies parmi les bactéries thermophiles anaérobes, et les bactéries appartenant au genre Streptomyces. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite bactérie est une bactérie thermophile anaérobe choisie dans le groupe comprenant la souche AT1243 appartenant à l'espèce d'archaea Thermococcus, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3140, et la souche AT1222 appartenant à l'espèce Thermosipho, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3139. Alternativement, la bactérie choisie est une bactérie de souche S290 appartenant au genre Thermoanaerobacter, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM I- 3177. La disposition de plusieurs genres et espèces de bactéries permet d'appliquer le procédé de l'invention à des substrats de porosité, granulométrie, composition chimique variables. Par exemple, en fonction de la compacité de la matière contaminée à traiter et donc de l'importance des échanges gazeux au sein de la matière à traiter, une bactérie thermophile anaérobe ou une bactérie aérobe appartenant au genre Streptomyces sera choisie pour réaliser le procédé. L'homme du métier pourra également envisager de réaliser des mélanges entre bactéries de différentes espèces pour réaliser le procédé de l'invention. Néanmoins, le procédé selon l'invention ne se limite pas uniquement à l'utilisation des souches bactériennes décrites ci- dessus mais comprend aussi d'autres bactéries, possédant des caractéristiques enzymatiques similaires à celles décrites dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1 pour les bactéries appartenant aux souches AT1243, AT1222 et S290. Pour comparer les caractéristiques enzymatiques de différentes bactéries, l'homme du métier aura recours à des techniques classiques comme des zymogrammes ou des tests de dégradation de peptides tel qu'illustré dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1. Un premier intérêt de l'utilisation de bactéries vivantes directement sur la matière organique à traiter réside dans le fait que les bactéries (i) produisent les enzymes spécifiques de manière continue et (ii) se multiplient dans ladite matière organique, ce qui amplifie encore l'effet destructeur vis-à-vis de la protéine prion infectieuse. Un second intérêt est que les bactéries vivantes produisent simultanément une variété d'enzymes protéolytiques de spécificité de coupure des liaisons peptidiques variée, ce qui accroît encore l'efficacité de destruction de la protéine prion infectieuse. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20°C et 150°C. Cette gamme de température permet de conci lier à la fois les exigences nécessaires à la survie des bactéries, à l'activité des enzymes protéolytiques synthétisées par celles-ci, et à la sensibilité de la protéine prion aux enzymes protéolytiques. La gamme de température décrite ci-dessus étant assez large, les inventeurs se sont attaché à rechercher des optima de température de mise en œuvre du procédé selon l'invention, qui font l'objet de modes de réalisation particuliers, décrits ci-après : Dans un mode de réalisation particulier de l'invention l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche AT1243 ou AT1222 à une température de 80°C. Alternativement l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche S290 à une température de 60°C. Par ailleurs, les tests réalisés par les inventeurs ont permis de mesurer la durée minimale de l'étape (b) compatible avec une disparition totale de la protéine prion. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape (b) d'incubation a une durée de 4 heures. Les modes de réalisation décrits ci-dessus s'appuient sur les exemples 3 et 4, montrant que des extraits enzymatiques des souches AT1243, AT1222 ; et S290 sont capable de croître sur des farines animales et de dégrader totalement la protéine prion native ou dénaturée après 4 à 5 heures d'incubation à une température de 60°C pour la souche S290 ou 80°C pour les souches AT1243 et AT1222. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. La réalisation d'une étape du procédé, préalable à l'étape (a) de mise en contact et de mélange des bactéries avec la matière contaminée permet d'augmenter la sensibilité de la protéine aux enzymes protéolytiques et par conséquent d'abaisser la température nécessaire au déroulement correct de l'étape (b). Cette alternative du procédé selon l'invention présente donc un avantage dans le cas où un chauffage prolongé de la matière contaminée lors de l'étape (b) n'est pas envisageable, pour des raisons d'ordre économique ou technique par exemple. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention ladite étape de chauffage de la matière contaminée est réalisée à une température de 80°C et dans un mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20°C et 80°C. Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée en utilisant une bactérie appartenant au genre Streptomyces, à une température de 20°C, pendant 20 à 40 heures. Les modes de réalisation décrits ci-dessus sont particulièrement avantageux, car il est connu de l'homme du métier que l'utilisation de la protéinase K dans les mêmes conditions aurait conduit à une dégradation partielle de la protéine prion en larges fragments de 14 kDa, ce qui n'est pas le cas avec le procédé de l'invention. De manière à assurer une innocuité totale à la matière organique -traitée par le procédé de l'invention^ il est -possible de prévoir une étape supplémentaire consistant à chauffer la matière contaminée à une température, une pression et pendant une période de temps, suffisantes pour détruire les bactéries introduite au cours de l'étape (a). Par exemple cette température peut être de 120°C, et cette pression peut être de 1 ,5 at. A l'issue de cette étape de chauffage, la matière contaminée est débarrassée de la protéine prion, et les bactéries introduites pour réaliser l'étape (a) du procédé sont détruites. Dans le cas où le procédé est appliqué à des farines animales celles-ci peuvent alors être réutilisées comme complément alimentaire ou engrais par exemple, ce qui constitue une alternative intéressante économiquement à l'incinération. Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, des ions cuivre sont ajoutés au cours de l'étape (a). L'addition d'ions cuivre à la matière contaminée à traiter permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion par les bactéries décrites ci-dessus. Comme l'illustre l'exemple 4, l'addition d'ions cuivre aux souches AT1243 et AT1222 permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion. De préférence, la matière contaminée est choisie dans le groupe comprenant : les tissus animaux, les farines animales, et leurs dérivés Compositions nettoyantesBlot, a sandwich immunoassay, a fluoroimmunoassay, immunoelectrophoresis, a plasminogen binding test. ~ In particular, a person skilled in the art can carry out immunoelectrophoresis to detect the infectious prion protein according to the method described in US patent 6,514,707. Those skilled in the art will also be able to implement the methods described above using antibodies directed against the infectious prion protein originating from the hybridomas registered under the references ATCC HB-12403 and ATCC HB-12696 described respectively in US Patents 6,165,784 and US 6,261,790. A person skilled in the art will also be able to measure the quantity of infectious prion protein in the biological material before or after treatment by the method according to the invention using the prion protein detection kit described in US patent 2003/009 2090. Advantageously, the process of the invention is implemented within a general process for recycling contaminated materials, in which these materials are placed in a tank, before being crossed by a flow of pressurized steam. In such a case, step (a) of the method for bringing the contaminated material into contact and mixing with a bacteria, is done when the contaminated material is placed in the reservoir, and the incubation step (b). is carried out when setting up the pressurized steam flow. Such an embodiment is particularly advantageous because it allows, thanks to the use of water vapor, to use a greater variety of bacteria. Preferably, the bacteria used to implement the method of the invention have undergone a screening during which the bacteria are selected according to their capacity to grow on keratin, as illustrated in example 3. In in addition, the bacteria can be subjected to a second screening step during which said bacteria are selected for their ability to degrade oligomers derived from the prion. This double screening makes it possible to have bacteria which are capable of growing on a medium made up of animal meal, and which are also capable of degrading the prion protein, within these meals. In a particular embodiment of the invention, the bacteria used to implement the method of the invention are chosen from anaerobic thermophilic bacteria, and bacteria belonging to the genus Streptomyces. In a particular embodiment of the invention, said bacterium is an anaerobic thermophilic bacterium chosen from the group comprising the strain AT1243 belonging to the archaea species Thermococcus, deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institute Pasteur (CNCM) under the registration number CNCM 1-3140, and the strain AT1222 belonging to the Thermosipho species, deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) under the registration number CNCM 1-3139. Alternatively, the bacterium chosen is a bacterium of strain S290 belonging to the genus Thermoanaerobacter, deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Pasteur Institute (CNCM) under the registration number CNCM I- 3177. The arrangement of several genera and species of bacteria makes it possible to apply the method of the invention to substrates of variable porosity, particle size and chemical composition. Through example, depending on the compactness of the contaminated material to be treated and therefore the extent of gas exchange within the material to be treated, an anaerobic thermophilic bacterium or an aerobic bacterium belonging to the genus Streptomyces will be chosen to carry out the process. Those skilled in the art may also consider making mixtures between bacteria of different species to carry out the process of the invention. However, the method according to the invention is not limited solely to the use of the bacterial strains described above but also includes other bacteria, having enzymatic characteristics similar to those described in Examples 1 and 2 and in the table. 1 for bacteria belonging to strains AT1243, AT1222 and S290. To compare the enzymatic characteristics of different bacteria, those skilled in the art will use conventional techniques such as zymograms or peptide degradation tests as illustrated in Examples 1 and 2 and in Table 1. A first advantage of the use of live bacteria directly on the organic matter to be treated lies in the fact that the bacteria (i) produce the specific enzymes continuously and (ii) multiply in said organic matter, which further amplifies the destructive effect vis -in respect of the infectious prion protein. A second advantage is that living bacteria simultaneously produce a variety of proteolytic enzymes with different cut-off specificity for peptide bonds, which further increases the destruction efficiency of the infectious prion protein. In a preferred embodiment of the invention, step (a) is carried out at a temperature between 20 ° C and 150 ° C. This temperature range makes it possible to reconcile both the requirements necessary for the survival of bacteria, the activity of the proteolytic enzymes synthesized by them, and the sensitivity of the prion protein to proteolytic enzymes. Since the temperature range described above is quite wide, the inventors have endeavored to seek optimum temperature for implementing the method according to the invention, which are the subject of particular embodiments, described below: In a particular embodiment of the invention, step (a) is carried out using the strain AT1243 or AT1222 at a temperature of 80 ° C. Alternatively step (a) is carried out using the strain S290 at a temperature of 60 ° C. Furthermore, the tests carried out by the inventors made it possible to measure the minimum duration of step (b) compatible with a total disappearance of the prion protein. In a particular embodiment of the invention, the incubation step (b) has a duration of 4 hours. The embodiments described above are based on Examples 3 and 4, showing that enzymatic extracts of the strains AT1243, AT1222; and S290 are capable of growing on animal meal and of completely degrading the native or denatured prion protein after 4 to 5 hours of incubation at a temperature of 60 ° C. for the strain S290 or 80 ° C. for the strains AT1243 and AT1222. In a preferred embodiment of the invention, step (a) is preceded by a step of heating the contaminated material to a temperature and for a period of time sufficient to increase the sensitivity of the infectious prion protein to the proteolysis. Carrying out a step in the process, prior to step (a) of bringing the bacteria into contact and mixing with the contaminated material makes it possible to increase the sensitivity of the protein to proteolytic enzymes and therefore to lower the temperature. necessary for the correct conduct of step (b). This alternative to the method according to the invention therefore has an advantage in the event that prolonged heating of the material contaminated during step (b) is not possible, for economic or technical reasons for example. In a preferred embodiment of the invention, said step of heating the contaminated material is carried out at a temperature of 80 ° C. and in a particular embodiment of the process described above, step (a) is carried out at a temperature between 20 ° C and 80 ° C. In another particular embodiment of the method described above, step (a) is carried out using a bacterium belonging to the genus Streptomyces, at a temperature of 20 ° C, for 20 to 40 hours. The embodiments described above are particularly advantageous, because it is known to those skilled in the art that the use of proteinase K under the same conditions would have led to a partial degradation of the prion protein into large fragments of 14 kDa , which is not the case with the method of the invention. In order to ensure total harmlessness to the organic material treated with the process of the invention, it is possible to provide an additional step consisting in heating the contaminated material to a temperature, pressure and for a sufficient period of time. to destroy the bacteria introduced during step (a). For example, this temperature can be 120 ° C., and this pressure can be 1.5 at. At the end of this heating step, the contaminated material is freed from the prion protein, and the bacteria introduced to carry out step (a) of the process are destroyed. In the case where the process is applied to animal meal, it can then be reused as a food supplement or fertilizer for example, which constitutes an economically attractive alternative to incineration. In a particular embodiment of the method of the invention, copper ions are added during step (a). The addition of copper ions to the contaminated material to be treated makes it possible to increase the efficiency of the degradation of the prion protein by the bacteria described above. As illustrated in Example 4, the addition of copper ions to strains AT1243 and AT1222 makes it possible to increase the efficiency of degradation of the prion protein. Preferably, the contaminated material is chosen from the group comprising: animal tissues, animal meal, and their derivatives Cleaning compositions
Un autre objet de l'invention concerne des compositions nettoyantes réduisant la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans la description ci-dessus, en association avec un support approprié. Dans ce mode de réalisation, la composition nettoyante comprend les cellules de la ou des souche(s) de bactéries telles que définies ci-dessus, de préférence sous la forme de particules. La fabrication d'une composition nettoyante sous forme de particules peut se faire par exemple par lyophilisation des bactéries qui seront associées à un support. Le support dans lequel sont incorporées les bactéries peut être de diverses natures. Par exemple, ledit support peut être constitué exclusivement ou constitué essentiellement, d'amidon, y compris l'amidon de riz ou de maïs qui a été mélangé avec les cellules bactériennes avant sa transformation en particules, par exemple en granulés. Le support dans lequel sont incorporées les cellules bactériennes peut également être constitué exclusivement ou constitué essentiellement de β-cyclodextrine, la β-cyclodextrine étant alors mélangée avec les cellules bactériennes préalablement à une étape de séchage, puis de fabrication de particules, en particulier de granulés. Par exemple, pour la fabrication d'une composition nettoyante selon l'invention, l'homme du métier peut mélanger la β- cyclodextrine avec une quantité appropriée de cellules bactériennes aérobes Streptomyces, de telle manière à obtenir une composition comprenant de 103 à 108 unités formant des colonies (cfu) de ladite ou desdites bactérie(s) par gramme de la composition finale contenant la β-cyclodextrine, puis soumettre la composition ainsi obtenue à une étape de séchage, avant la fabrication de particules, en particulier de granulés, selon des méthodes conventionnelles. Préférentiellement, le support peut être composé de carbonate de calcium, le cas échéant en combinaison avec du lactose. Le support utilisé pour la fabrication d'une composition selon l'invention peut également être exclusivement constitué ou essentiellement constitué de lactose, le cas échéant en combinaison avec du silico-aluminate de sodium, combinaison à laquelle on ajoute le milieu de culture de la souche ou du mélange de souches de bactéries d'intérêt, qui a été préalablement soumis à une étape de séchage. Selon un autre aspect, pour fabriquer une composition prophylactique alimentaire selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser des supports commerciaux, tels que le verre poreux, le Porolon®, les fibres de carbone, l'alginate ou la chitine. Dans un- mode de réalisation. - préféré,, la composition nettoyante selon l'invention peut comprendre des ions cuivre. Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que l'addition d'ions cuivre à une concentration de 1 mM à la composition de l'invention permet d'augmenter l'efficacité de la composition vis-à-vis de la dégradation de la protéine prion.Another subject of the invention relates to cleaning compositions reducing the concentration of infectious prion protein in a material contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein comprising at least one bacterium as defined in the description above, in association with an appropriate support. In this embodiment, the cleaning composition comprises the cells of the bacteria strain (s) as defined above, preferably in the form of particles. The manufacture of a cleaning composition in the form of particles can be done for example by lyophilization of the bacteria which will be associated with a support. The support in which the bacteria are incorporated can be of various natures. For example, said support can consist exclusively or essentially consist of starch, including starch from rice or corn which has been mixed with the bacterial cells before its transformation into particles, for example into granules. The support in which the bacterial cells are incorporated can also be made up exclusively or essentially made up of β-cyclodextrin, the β-cyclodextrin then being mixed with the bacterial cells before a drying step, then in the manufacture of particles, in particular granules . For example, for the manufacture of a cleaning composition according to the invention, a person skilled in the art can mix β-cyclodextrin with an appropriate quantity of aerobic bacterial cells Streptomyces, so as to obtain a composition comprising from 10 3 to 10 8 units forming colonies (cfu) of said bacterium (ies) per gram of the final composition containing β-cyclodextrin, then subjecting the composition thus obtained to a drying stage, before the manufacture of particles, in particular of granules , according to conventional methods. Preferably, the support can be composed of calcium carbonate, if necessary in combination with lactose. The support used for the manufacture of a composition according to the invention can also consist exclusively or essentially consist of lactose, optionally in combination with sodium silico-aluminate, combination to which the culture medium of the strain is added or of the mixture of strains of bacteria of interest, which has been subjected beforehand to a drying step. According to another aspect, to manufacture a food prophylactic composition according to the invention, a person skilled in the art can use commercial supports, such as porous glass, Porolon®, carbon fibers, alginate or chitin. In one embodiment. - Preferred, the cleaning composition according to the invention can comprise copper ions. Without wishing to be bound by a theory, the inventors believe that the addition of copper ions at a concentration of 1 mM to the composition of the invention makes it possible to increase the effectiveness of the composition against degradation. of the prion protein.
Matériel et méthodesMaterial and methods
Les composés suivants, à savoir les sels, les milieux, la chaîne B d'insuline bovine, la gélatine bovine, le MOPS et tous les autres composés chimiques ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Company Saint-Louis MO. Les préparations purifiées de prion ovin recombinant ont été obtenues comme décrits par Rezaei et al, 2000. La kératine de poulet a été obtenue auprès de Yu. Zuev, Kazan Centre of Science, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia. Les poils de porc ont été obtenus auprès de la société SIFDDA, Plouvara, France.The following compounds, namely the salts, the media, the B chain of bovine insulin, bovine gelatin, MOPS and all the other chemical compounds were obtained from Sigma Chemical Company Saint-Louis MO. Purified preparations of recombinant sheep prion were obtained as described by Rezaei et al, 2000. Chicken keratin was obtained from Yu. Zuev, Kazan Center of Science, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia. The pig hair was obtained from the company SIFDDA, Plouvara, France.
Souches bactériennes, milieux et conditions de croissance Les souches bactériennes thermophiles anaérobes ont été isolées de souches collectées au site Rainbow (36°, 14' Nord, 33°, 54' Ouest, 2300 mètres de profondeur). Les souches AT1243 et AT1222 ont été isolées d'un puits de chaleur. La souche AT1222 a été enrichie à 60°C en milieu SP (30 g/l de sel marin 2 g/l de poils de porc). La souche AT1243 a été enrichie à 80°C dans un milieu SPS (SP + 5 g/l de sulfure). Les sous-cultures réalisées pour les dosages de protéases ont été effectuées dans les mêmes conditions. Des amplifications par PCR et un séquençage indiquent que la souche AT1222 appartient à l'espèce Thermosipho sp. (bactérie thermophile) et que la souche AT1243 est une bactérie archaïque qui appartient à l'espèce thermophile Thermococcus genus. La souche S290 a été isolée du point chaud de caldera Uzon, Kamchatka - et a été identifiée comme appartenant -au genre Thermoanaerobacter par des réactions avec des oligonucléotides spécifiques à savoir des oligonucléotides dirigés contre des ARNr- 16S. Les souches S290 ont été cultivées à 60°C pendant 5 jours sur un milieu minéral Th (0,33 g/l de KH2P04, 0,33 g/l de NH CI, 0,33 g/l de MgCI2, 0,33 g/l de CaCI2, 0,33 g/l de KCI, 0,5 g/l de NaHC03, et 0,5 g/l de Na2S), supplémenté avec 2 g/l de laine de porc ou par des plumes. Lorsque les différentes espèces et souches de bactéries sont cultivées sur des farines animales, la kératine de tous les milieux a été remplacée par 2 g/l de farines de viande, d'os, de sang ou de farines comprenant un mélange de ces trois composants.Bacterial strains, media and growing conditions The anaerobic thermophilic bacterial strains were isolated from strains collected at the Rainbow site (36 °, 14 'North, 33 °, 54' West, 2300 meters deep). AT1243 and AT1222 were isolated from a heat sink. The AT1222 strain was enriched at 60 ° C in SP medium (30 g / l of sea salt 2 g / l of pig hair). The AT1243 strain was enriched at 80 ° C. in an SPS medium (SP + 5 g / l of sulfide). The subcultures produced for the protease assays were carried out under the same conditions. PCR amplifications and sequencing indicate that the AT1222 strain belongs to the Thermosipho sp. (thermophilic bacteria) and that the AT1243 strain is an archaic bacterium which belongs to the thermophilic species Thermococcus genus. The S290 strain was isolated from the hot spot of Caldera Uzon, Kamchatka - and was identified as belonging to the genus Thermoanaerobacter by reactions with specific oligonucleotides, namely oligonucleotides directed against 16S rRNA. The S290 strains were cultivated at 60 ° C. for 5 days on a Th mineral medium (0.33 g / l of KH 2 P0 4 , 0.33 g / l of NH CI, 0.33 g / l of MgCl 2 , 0.33 g / l of CaCI 2 , 0.33 g / l of KCI, 0.5 g / l of NaHC0 3 , and 0.5 g / l of Na 2 S), supplemented with 2 g / l of pork wool or feathers. When the different species and strains of bacteria are cultivated on animal meal, keratin from all environments has been replaced by 2 g / l of meat, bone, blood or meal meals comprising a mixture of these three components .
Dosage des protéasesProtease determination
Après culture, les bactéries et les éléments insolubles du milieu de culture ont été précipités par centrifugation durant 15 minutes à 7000 rpm. Les activités protéolytique et peptidasique ont été mesurées dans les surnageants résultants. La présence de protéases dans les surnageants a été déterminée par des zymogrammes. Cette méthode permet de déterminer la présence d'enzymes protéolytiques à faible concentration et consiste à identifier des protéases après séparation de tous les composants protéiques du milieu par electrophorèse. Les protéases ont été séparées par SDS-PAGE comprenant des substrats à base de gélatine hydrolysée. Les produits de faible masse moléculaire issus de l'hydrolyse de la gélatine diffusent du gel et, après coloration, la présence des protéases a été identifiée par la présence de bandes blanches au sein d'un gel coloré. Le gel de polyacrylamide a été polymérisé en présence de 0,01 % de gélatine bovine. 20 μl de tampon de lyse ont été ajoutés à 40 μl de surnageant et des gels de SDS-PAGE à 10, 12 ou 15% ont été réalisés (Laemmli, 1970). Après electrophorèse, les gels ont été rincés avec une solution de Triton X-100 à 2,5% pour éliminer leAfter culture, the bacteria and the insoluble elements of the culture medium were precipitated by centrifugation for 15 minutes at 7000 rpm. The proteolytic and peptidasic activities were measured in the resulting supernatants. The presence of proteases in the supernatants was determined by zymograms. This method determines the presence of low proteolytic enzymes concentration and consists in identifying proteases after separation of all the protein components from the medium by electrophoresis. The proteases were separated by SDS-PAGE comprising substrates based on hydrolyzed gelatin. The low molecular weight products resulting from the hydrolysis of gelatin diffuse from the gel and, after coloring, the presence of the proteases has been identified by the presence of white bands within a colored gel. The polyacrylamide gel was polymerized in the presence of 0.01% bovine gelatin. 20 μl of lysis buffer were added to 40 μl of supernatant and 10, 12 or 15% SDS-PAGE gels were made (Laemmli, 1970). After electrophoresis, the gels were rinsed with a 2.5% Triton X-100 solution to remove the
SDS, et ont été incubés dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2, NaCI100 -mM, -CaC.2 2 mM à différentes températures pendant 3 à .10. heures. Les protéines sur les gels ont été colorées avec du nitrate d'argent (Nesterenko et al. 1994). L'activité des protéases provenant des surnageants des bactéries cultivées dans la kératine hydrolysée, dans les farines animales ou avec le prion recombinant a été déterminée par electrophorèse. 50 μl de surnageants ont été ajoutés à 50 μl de kératine de plumes à 1 mg/ml, ou 2 mg/ml de kératine de poils de porc, ou 2 mg/ml de farines animales ou encore 1 mg/ml de prion recombinant dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 et furent incubés à différentes températures pendant 20 à 40 heures. L'hydrolyse du substrat par la protéinase K [0,02 mg/ml (0,6 μM)] a été réalisée à 37°C. Le tampon de lyse a été ajouté aux fractions aliquotes provenant des différentes réactions protéolytiques. Les fractions aliquotes ont été portées à ébullition durant 10 minutes et ensuite un gel SDS-PAGE à 15% a été réalisé. Les protéines sur les gels ont été colorées au bleu de Coomassie Brilliant R-450.SDS, and were incubated in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2, NaCI100 -mM, -CaC.2 2 mM at different temperatures for 3 to .10. hours. The proteins on the gels were stained with silver nitrate (Nesterenko et al. 1994). The activity of the proteases originating from the supernatants of bacteria cultivated in hydrolyzed keratin, in animal meal or with the recombinant prion was determined by electrophoresis. 50 μl of supernatants were added to 50 μl of feather keratin at 1 mg / ml, or 2 mg / ml of pig hair keratin, or 2 mg / ml of animal meal or alternatively 1 mg / ml of recombinant prion in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 and were incubated at different temperatures for 20 to 40 hours. Hydrolysis of the substrate by proteinase K [0.02 mg / ml (0.6 μM)] was carried out at 37 ° C. The lysis buffer was added to the aliquots from the various proteolytic reactions. The aliquots were brought to the boil for 10 minutes and then a 15% SDS-PAGE gel was made. The proteins on the gels were stained with Coomassie Brilliant R-450 blue.
Spécificité des protéasesSpecificity of proteases
L'activité peptidasique envers les acides aminés ou les peptides N-substitués par des p-nitroanilides a été déterminée en utilisant un spectrophotomètre. 900 μl de substrat à 0,1 mM ont été ajoutés à 100 μl de surnageants dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 DMSO 10%. Le mélange réactionnel est incubé à différentes températures durant 3 et 20 heures, après lesquelles l'absorption à 410 nm a été mesurée (ε4ι0 p-nitroanilides = 8800 M"1 cm"1). La spécificité des protéases provenant des surnageants des bactéries a été déterminée en mesurant la fragmentation de la chaîne B oxydée de l'insuline bovine. 100 μl de surnageant ont été incubés avec 100 μl de chaîne B d'insuline à 2 mg/ml dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 à différentes températures pendant 10 heures. Les produits de l'hydrolyse ont été séparés par HPLC en phase inversée sur une colonne de Nucléosil 300-5 C-ι8 avec un gradient de 0 à 60% de CH3CN, TFA 0,1 %. Les fractions collectéesThe peptidasic activity towards amino acids or N-substituted peptides by p-nitroanilides was determined in using a spectrophotometer. 900 μl of 0.1 mM substrate were added to 100 μl of supernatants in a 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 10% DMSO. The reaction mixture is incubated at different temperatures for 3 and 20 hours, after which the absorption at 410 nm has been measured (ε 4 ι 0 p-nitroanilides = 8800 M "1 cm " 1 ). The specificity of the proteases originating from the supernatants of bacteria was determined by measuring the fragmentation of the oxidized B chain of bovine insulin. 100 μl of supernatant were incubated with 100 μl of B chain of insulin at 2 mg / ml in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 at different temperatures for 10 hours. The hydrolysis products were separated by reverse phase HPLC on a column of Nucleosil 300-5 C-ι 8 with a gradient from 0 to 60% CH 3 CN, TFA 0.1%. The fractions collected
- ont été soumises à des analyses d'acides aminés selon Bidlingmeyer et al. (1984). Le contenu en acides aminés provenant des peptides séparés a été calculé en comparant les chromatogrammes obtenus avec des chromatogrammes standards provenant de dérivés PITC. La séquence en acides aminés des peptides a été établie grâce à la connaissance de la structure primaire de la chaîne B de l'insuline.- have been subjected to amino acid analyzes according to Bidlingmeyer et al. (1984). The amino acid content from the separate peptides was calculated by comparing the chromatograms obtained with standard chromatograms from PITC derivatives. The amino acid sequence of the peptides was established thanks to the knowledge of the primary structure of the insulin B chain.
RésultatsResults
Exemple 1 : Zvmogrammes des protéases provenant des micro- organismes d'intérêtExample 1: Zmograms of Proteases from the Microorganisms of Interest
Dans le but de caractériser les protéases sécrétées par les cultures de bactéries d'intérêt, des zymogrammes ont été réalisés sur les surnageants provenant de telles cultures. La caractéristique principale des protéases des bactéries d'intérêt est la stabilité de leur structure à la dénaturation. En effet, comme le montre la figure 1 , pistes 1 et 2, les protéases soumises à une electrophorèse conservent leur activité protéolytique. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche AT1243 montrent que cette souche possède un ensemble de protéases possédant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 45 à 100 kDa. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants des souches AT1222 montrent une seule bande d'activité protéolytique, correspondant à une masse moléculaire approximative de 100 kDa. Enfin, les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche S290 montrent des bandes d'activité protéolytique, correspondant à des masses moléculaires approximatives de 66, 100, 200 kDa et plus (figure 1 , piste 3).In order to characterize the proteases secreted by the cultures of bacteria of interest, zymograms were carried out on the supernatants originating from such cultures. The main characteristic of the proteases of the bacteria of interest is the stability of their structure to denaturation. Indeed, as shown in FIG. 1, tracks 1 and 2, the proteases subjected to an electrophoresis retain their proteolytic activity. The zymograms produced from the supernatants of the AT1243 strain show that this strain has a set of proteases having a mass apparent molecular of the order of 45 to 100 kDa. The zymograms produced from the supernatants of the AT1222 strains show a single band of proteolytic activity, corresponding to an approximate molecular mass of 100 kDa. Finally, the zymograms produced from the supernatants of the strain S290 show bands of proteolytic activity, corresponding to approximate molecular masses of 66, 100, 200 kDa and more (Figure 1, lane 3).
Exemple 2 : Spécificité des protéasesEXAMPLE 2 Specificity of Proteases
La capacité des protéases sécrétées par les bactéries thermophiles AT1243, AT1222 et S290 à hydrolyser les substrats-de faible masse moléculaire c'est-à-dire les p-nitroanilides de N-benzoylarginine, les dérivés N-succinyl de phénylalanine, le peptide Ala-Ala-Pro-Phe et le peptide Ala-Ala-Pro-Lys a été étudiée. Après trois heures d'incubation, l'activité des surnageants des souches S290 envers le peptide Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA a été observée (tableau 1 ). L'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline oxydée, un substrat standard permettant de tester l'activité des enzymes protéolytiques a été étudiée. La chaîne B de l'insuline est composée d'un grand nombre d'acides aminés hydrophobes, et inclut également un nombre important de résidus branchés chargés. La structure primaire de la chaîne B de l'insuline est la suivante:The capacity of the proteases secreted by the thermophilic bacteria AT1243, AT1222 and S290 to hydrolyze the substrates-of low molecular mass that is to say the p-nitroanilides of N-benzoylarginine, the N-succinyl derivatives of phenylalanine, the peptide Ala -Ala-Pro-Phe and the peptide Ala-Ala-Pro-Lys was studied. After three hours of incubation, the activity of the supernatants of the S290 strains towards the peptide Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA was observed (Table 1). The hydrolysis of the B chain of oxidized insulin, a standard substrate for testing the activity of proteolytic enzymes, has been studied. The insulin B chain is made up of a large number of hydrophobic amino acids, and also includes a large number of charged branched residues. The primary structure of the insulin B chain is as follows:
Phe1-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys*-Gly-Ser9-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu15-Tyr16-Leu-Val-Cys*-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe25-Tyr-Thr-Pro- Lys-Ala.Phe 1 -Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys * -Gly-Ser 9 -His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu 15 -Tyr 16 -Leu-Val-Cys * -Gly-Glu-Arg- Gly-Phe-Phe 25 -Tyr-Thr-Pro- Lys-Ala.
( signifie que le résidu cystéyle est oxydé).(means that the cysteyl residue is oxidized).
Les inventeurs ont montré en utilisant l'HPLC que les produits de l'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline s'accumulent dans les milieux réactionnels après trois heures d'incubation avec les surnageants de la souche AT1243. L'analyse des acides aminés provenant des peptides hydrolyses permet de proposer que les protéases de la souche AT1243 clivent les liaisons peptidiques suivantes: Ser9-His10, Tyr16-Leu17 et Phe25-Tyr26. Un site de clivage additionnel (Leu15-Tyr16) a été observé dans le cas de la souche AT1222. Les protéases de la souche S290 hydrolysent la chaîne B de l'insuline au niveau des liaisons peptidiques Leu15-Tyr16 et Tyr16- Leu17. Donc, la majorité des protéases produites par les microorganismes thermophiles étudiés possède une spécificité de type chymotrypsine. Certaines des bactéries montrent également une capacité inattendue à hydrolyser les liaisons peptidiques après un résidu séryle. De manière surprenante, les protéases sécrétées par les microorganismes thermophiles n'attaquent pas les autres sites hydrophobes situés dans la molécule de la chaîne B de l'insuline. L'analyse du micro-environnement autour des liaisons clivables (les résidus dans les positions P2, P3, P1 ') ne révèle pas de régularité stricte dans l'activité des protéases envers ces sites. Néanmoins, il peut être observé qu'un résidu hydrophobe est fréquemment situé dans la position P2' de la liaison clivable, et qu'un résidu flexible de glycine ou d'alanine est en position P2 ou en position P3. Les protéases des souches sélectionnées pour l'hydrolyse des kératines reconnaissent donc des motifs structuraux particuliers dans la molécule substrat. La protéine prion contient beaucoup de résidus hydrophobes : Tyr (10), Phe (3), Trp (8), et Ile (4) et de nombreux résidus Ser (8). Par conséquent les protéases sont capables de dégrader le prion jusqu'à l'obtention de peptides relativement courts. De plus, l'accès aux sites de clivage va être augmenté pendant le chauffage à la température optimale d'hydrolyse par les protéases, parce que dans de telles conditions, la structure de la protéine sera partiellement ou complètement dénaturée.The inventors have shown using HPLC that the products of the insulin B chain hydrolysis accumulate in the reaction media after three hours of incubation with the supernatants of strain AT1243. Analysis of the amino acids originating from the hydrolyzed peptides makes it possible to propose that the proteases of the AT1243 strain cleave the following peptide bonds: Ser 9 -His 10 , Tyr 16 -Leu 17 and Phe 25 -Tyr 26 . An additional cleavage site (Leu 15 -Tyr 16 ) was observed in the case of the strain AT1222. The proteases of the S290 strain hydrolyze the B chain of insulin at the level of the peptide bonds Leu 15 -Tyr 16 and Tyr 16 - Leu 17 . Therefore, the majority of proteases produced by the thermophilic microorganisms studied have a specificity of the chymotrypsin type. Some of the bacteria also show an unexpected ability to hydrolyze peptide bonds after a seryl residue. Surprisingly, the proteases secreted by thermophilic microorganisms do not attack the other hydrophobic sites located in the insulin B chain molecule. Analysis of the microenvironment around the cleavable bonds (the residues in positions P2, P3, P1 ′) does not reveal any strict regularity in the activity of the proteases towards these sites. However, it can be observed that a hydrophobic residue is frequently located in position P2 ′ of the cleavable bond, and that a flexible residue of glycine or alanine is in position P2 or in position P3. The proteases of the strains selected for the hydrolysis of keratins therefore recognize specific structural patterns in the substrate molecule. The prion protein contains many hydrophobic residues: Tyr (10), Phe (3), Trp (8), and Ile (4) and many Ser residues (8). Consequently, proteases are capable of degrading the prion until relatively short peptides are obtained. In addition, access to cleavage sites will be increased during heating to the optimal protease hydrolysis temperature, because under such conditions, the structure of the protein will be partially or completely denatured.
Exemple 3 : Croissance des microorganismes étudiés sur les milieux contenant de la kératine ou des farines animales. La capacité des bactéries thermophiles, souches S290, souches AT1243 et AT1222 à croître sur des milieux contenant de la kératine de poils de porc ou de plumes a été testée. Les bactéries sélectionnées sont capables d'utiliser des kératines provenant de poils de porc ou β provenant de plumes, comme principale source de nutriment. La croissance sur kératine de laine a été la plus importante dans le cas des souches S290 et AT1222, la souche AT1243 fournissant des caractéristiques de croissance inférieures sur ce milieu. Le temps de culture de la plupart des bactéries fut de trois jours. Les souches de bactéries étudiées ont également prouvé qu'elles- étaient capables de croître sur les farines animales.— De plus, ces bactéries croissent sur les farines animales de manière plus rapide que sur la kératine. La croissance la plus faible a été obtenue lorsque le substrat utilisé était le sang, probablement à cause de la toxicité de certains composants présents. Exemple 4 : Activité des protéases produites par les bactéries thermophiles envers la protéine prion recombinante.Example 3: Growth of microorganisms studied on media containing keratin or animal meal. The ability of thermophilic bacteria, strains S290, strains AT1243 and AT1222 to grow on media containing keratin from pig hair or feathers was tested. The selected bacteria are able to use keratins from pig hair or β from feathers as the main source of nutrients. The growth on wool keratin was most significant in the case of strains S290 and AT1222, the strain AT1243 providing inferior growth characteristics on this medium. The culture time for most bacteria was three days. The strains of bacteria studied have also proved that they are capable of growing on animal meal. In addition, these bacteria grow on animal meal faster than on keratin. The lowest growth was obtained when the substrate used was blood, probably due to the toxicity of certain components present. Example 4: Activity of the proteases produced by thermophilic bacteria towards the recombinant prion protein.
Il a été démontré que la protéine prion recombinante ovine se dénature à 80°C et forme des structures amyloïdes. Cette protéine a donc été utilisée comme modèle de structure amyloïde cellulaire. La capacité des protéases provenant des bactéries thermophiles de l'invention à hydrolyser le prion ovin natif ou dénaturé thermiquement a été étudiée. Les figures 2a et 2b montrent que les protéases produites par la souche S290 hydrolysent le prion natif et complètement dénaturé à 60°C en 4 heures. Les protéases produites par les souches AT1243 et AT1222 hydrolysent la protéine prion native ou dénaturée thermiquement à 80°C, ce qui correspond à leur température de croissance optimale. Cependant à 60°C, la protéine prion n'est pas hydrolysée complètement par ces souches. Dans ce cas, comme on l'observe avec la protéinase K, un fragment hydrolytique large d'une masse moléculaire d'environ 14 kDa s'accumule. Comme cela a été déjà démontré, la résistance de ce fragment à la protéolyse est causée par sa capacité à s'agréger. La formation de ces agrégats est dépendante de la concentration et de l'activité des protéases. Si la concentration et l'activité des protéases sont plus faibles qu'une valeur critique, les produits de cette protéolyse limitée s'agrègent et deviennent totalement résistants à une hydrolyse future. A 80°C, les agrégats sont déstabilisés et/ou dénaturés et l'activité des protéases augmente considérablement, donc l'accumulation du fragment de 14 kDa n'apparaît pas. Les inventeurs ont observé que l'introduction d'ions cuivre peut faciliter la transformation des molécules de prion dans leur forme amyloïde. Utilisant ce modèle de structure -amyloïde^ il a été montré que les protéases des- souches S290 (à 60°C), AT1243 et AT1222 (à 80°C) hydrolysent complètement la protéine prion en 4 heures (figure 2c). Durant l'étude de l'activité protéolytique des protéases des souches AT1243 et AT1222 à 80°C, l'accumulation de larges fragments hydrolytiques de prion n'a pas été observée dans le cas de l'hydrolyse du prion natif et dénaturé contrairement à l'activité de ces souches à 60°C (figure 2c). Donc les structures amyloïdes sont déstabilisées à 80°C facilitant leur destruction par les protéases des thermophiles.The recombinant ovine prion protein has been shown to denature at 80 ° C and form amyloid structures. This protein was therefore used as a model of cellular amyloid structure. The ability of proteases from thermophilic bacteria of the invention to hydrolyze the native or thermally denatured sheep prion has been studied. Figures 2a and 2b show that the proteases produced by the S290 strain hydrolyze the native and completely denatured prion at 60 ° C in 4 hours. The proteases produced by the strains AT1243 and AT1222 hydrolyze the native or thermally denatured prion protein at 80 ° C, which corresponds to their optimal growth temperature. However at 60 ° C, the prion protein is not completely hydrolyzed by these strains. In this case, as we observes it with proteinase K, a large hydrolytic fragment with a molecular mass of approximately 14 kDa accumulates. As has already been demonstrated, the resistance of this fragment to proteolysis is caused by its ability to aggregate. The formation of these aggregates is dependent on the concentration and activity of the proteases. If the concentration and activity of the proteases are lower than a critical value, the products of this limited proteolysis aggregate and become completely resistant to future hydrolysis. At 80 ° C, the aggregates are destabilized and / or denatured and the activity of the proteases increases considerably, therefore the accumulation of the 14 kDa fragment does not appear. The inventors have observed that the introduction of copper ions can facilitate the transformation of prion molecules into their amyloid form. Using this model of amyloid structure, it has been shown that the proteases of strains S290 (at 60 ° C), AT1243 and AT1222 (at 80 ° C) completely hydrolyze the prion protein in 4 hours (Figure 2c). During the study of the proteolytic activity of the proteases of the AT1243 and AT1222 strains at 80 ° C., the accumulation of large hydrolytic fragments of prion was not observed in the case of the hydrolysis of the native and denatured prion, unlike the activity of these strains at 60 ° C (Figure 2c). So the amyloid structures are destabilized at 80 ° C facilitating their destruction by the proteases of thermophiles.
Exemple 5 : Activité protéolytigue des surnageants de culture bactérienne.Example 5 Proteolytic activity of bacterial culture supernatants.
Après 24 heures d'incubation avec des farines de laine/poils, de viande, de sang et de mélange avec les surnageants des souches AT1243, AT1222, et S290 une dissolution partielle du substrat a été observée. La figure 3a montre que les protéases des souches AT1243 et AT1222 hydrolysent efficacement les farines de viande, les farines de laine/poils, les farines de sang et les farines mixtes Les enzymes des souches S290 montrent une activité plus faible mais satisfaisante. Cela pourrait résulter des faibles températures d'incubation à savoir 80°C dans le cas des souches AT1243 et AT1222 et 60°C dans le cas de la souche S290. Par comparaison, les données obtenues pour l'activité de la protéinase K envers les protéines des farines sont également montrées sur la figure 3b. La protéinase K hydrolyse efficacement les farines de laine/poils et avec une plus faible efficacité, les farines de viande et les farines mixtes. La protéinase K est pratiquement inactive envers les farines de sang. Tableau 1 Activité des protéases (pourcentage d'hydrolyse de substrat) des surnageants des bactéries thermophiles envers des substrats chromogènes de faible masse moléculaire. Les conditions de réactions sont données dans la partie matériel et méthode. Les substrats ont- été incubés pendant trois heures à 80°C (AT1243-et AT1222) et à 60°C (S290). Les souches sont représentées dans la colonne de gauche, les substrats sont représentés sur la première ligne.After 24 hours of incubation with flours of wool / hair, meat, blood and mixture with the supernatants of the strains AT1243, AT1222, and S290 a partial dissolution of the substrate was observed. FIG. 3a shows that the proteases of strains AT1243 and AT1222 efficiently hydrolyze meat-and-bone meal, wool / hair flours, blood meal and mixed flour. The enzymes of strains S290 show a weaker but satisfactory activity. This could result from weak incubation temperatures, namely 80 ° C. in the case of the AT1243 and AT1222 strains and 60 ° C. in the case of the S290 strain. By comparison, the data obtained for the activity of proteinase K towards the proteins of the flours are also shown in FIG. 3b. Proteinase K effectively hydrolyzes wool / hair flours and, with lower efficiency, meat and mixed flours. Proteinase K is practically inactive towards blood meal. Table 1 Protease activity (percentage of substrate hydrolysis) of the supernatants of thermophilic bacteria towards chromogenic substrates of low molecular weight. The reaction conditions are given in the material and method part. The substrates were incubated for three hours at 80 ° C (AT1243- and AT1222) and at 60 ° C (S290). The strains are represented in the left column, the substrates are represented on the first line.
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RéférencesReferences
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Claims

REVENDICATIONS Procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière organique sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant :CLAIMS Method for reducing the concentration of infectious prion protein in an organic matter in liquid form, in the form of particles or in the form of fibers, contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein comprising:
- une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et,a step (a) consisting in bringing into contact and mixing said contaminated material with at least one bacterium which secretes one or more hydrolytic enzymes, including proteolytics, with respect to said infectious prion protein and,
- une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée.a step (b) of incubation of the bacteria or bacteria with said contaminated material for a period of time sufficient to obtain a desired reduction percentage of the concentration of infectious prion protein in said contaminated material.
Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite bactérie est une bactérie thermophile anaérobe choisie dans le groupe comprenant la souche AT1243 appartenant à l'espèce d'archaea Thermococcus, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3140, et la souche AT1222 appartenant à l'espèce Thermosipho, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures deMethod according to claim 1, characterized in that said bacterium is an anaerobic thermophilic bacterium chosen from the group comprising the strain AT1243 belonging to the archaea species Thermococcus, deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) under the registration number CNCM 1-3140, and the strain AT1222 belonging to the Thermosipho species, deposited with the National Collection of Cultures of
Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3139.Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) under the registration number CNCM 1-3139.
Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite bactérie est une bactérie de souche S290 appartenant au genreMethod according to claim 1, characterized in that said bacterium is a bacterium of strain S290 belonging to the genus
Thermoanaerobacter, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3177. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20°C et 150°C. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée à une température de 80°C. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée à une température de 60°C. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape (b) a une durée de quatre heures.Thermoanaerobacter, deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Pasteur Institute (CNCM) under the registration number CNCM 1-3177. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that step (a) is carried out at a temperature between 20 ° C and 150 ° C. Method according to claim 2, characterized in that step (a) is carried out at a temperature of 80 ° C. Method according to claim 3, characterized in that step (a) is carried out at a temperature of 60 ° C. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that step (b) has a duration of four hours.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps, suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse.Process according to any one of Claims 1 to 7, characterized in that step (a) is preceded by a step of heating the contaminated material to a temperature and for a period of time, sufficient to increase the sensitivity of the infectious prion protein for proteolysis.
Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape de chauffage de la matière contaminée est réalisée à une température de 80°C.Method according to claim 8, characterized in that said step of heating the contaminated material is carried out at a temperature of 80 ° C.
Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20°C etMethod according to claim 8 or 9, characterized in that step (a) is carried out at a temperature between 20 ° C and
80°C.80 ° C.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire (c) consistant à mesurer la concentration en protéine prion infectieuse dans la matière contaminée, à l'issue de l'étape (b).Method according to any one of Claims 1 to 10, characterized in that it comprises an additional step (c) consisting in measuring the concentration of infectious prion protein in the contaminated material, at the end of step (b) .
Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que l'étape (c) comprend la réalisation d'un test choisi dans le groupe comprenant : un Western Blot, un test immunologique de type « sandwich », un test fluoroimmunologique, une immunoélectrophorèse, un test de liaison au plasminogène.Method according to claim 1 1, characterized in that step (c) comprises carrying out a test chosen from the group comprising: a Western Blot, an immunological test of the type "Sandwich", a fluoroimmunological test, an immunoelectrophoresis, a plasminogen binding test.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire consistant à chauffer la matière contaminée à une température et pendant une période de temps, suffisantes pour détruire les bactéries introduites au cours de l'étape (a).Method according to any one of Claims 1 to 12, characterized in that it comprises an additional step consisting in heating the contaminated material to a temperature and for a period of time, sufficient to destroy the bacteria introduced during the step (at).
Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que des ions cuivre sont ajoutés au cours de l'étape (a).Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that copper ions are added during step (a).
Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que - la matière contaminée est choisie dans le groupe comprenant : les tissus animaux, les farines animales, et leurs dérivés.Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that - the contaminated material is chosen from the group comprising: animal tissues, animal meal, and their derivatives.
Composition nettoyante réduisant la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3, en association avec un support approprié.Cleaning composition reducing the concentration of infectious prion protein in a material contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein comprising at least one bacterium as defined in one of claims 1 to 3, in association with an appropriate carrier.
Composition nettoyante selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend des ions cuivre. Cleaning composition according to claim 16, characterized in that it comprises copper ions.
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