WO2004104589A1 - Method for analyzing the influence of an active substance on biological cells - Google Patents

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WO2004104589A1
WO2004104589A1 PCT/DE2004/000979 DE2004000979W WO2004104589A1 WO 2004104589 A1 WO2004104589 A1 WO 2004104589A1 DE 2004000979 W DE2004000979 W DE 2004000979W WO 2004104589 A1 WO2004104589 A1 WO 2004104589A1
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cells
electrical properties
cell
sample carrier
determined
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PCT/DE2004/000979
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Inventor
Frank Arndt
Hendrik Rönsch
Original Assignee
Siemens Aktiengesellschaft
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a method for examining the influence of an active ingredient on biological cells, in which the cells to be examined are immobilized on a sample carrier, the cells are acted upon with the active ingredient and the cells are examined for a reaction to the active ingredient.
  • a cell is immobilized on a sample carrier by means of a biocompatible adhesive layer.
  • the immobilized cell is loaded with active substance molecules that can be attached to different proteins in the cell membrane.
  • the cell is examined using near-field optical methods, and a change in the optical properties of the cell due to a reaction to the active substance can be determined. For example, an attachment of estrogens to the receptors of a cell can be determined by a shift in the fluorescence wavelength of bound estrogen compared to unbound estrogen.
  • the object of the invention is to provide a method for investigating the influence of an active substance on biological cells, which can be carried out comparatively easily.
  • the sample carrier is electrically conductive and a change in the electrical properties of the cells is determined with the aid of the sample carrier as a measure of a reaction of the cells to the active substance.
  • a change in the electrical properties of the cells which they have due to their cell-typical 'activities, also have a direct effect on the electrical properties of the sample carrier, so that a change in the electrical properties of the cells indirectly through a determination the electrical properties of the sample holder can be determined. Changes in the electrical properties of the sample carrier, which can be read out by means of a suitable electrical contact, thus allow a conclusion to be drawn about a change in the electrical
  • the electrical examination of the cells realized in this way has the advantage that an examination of the influence of the active substance on these cells is particularly simple since the active substances do not have to be prepared for an optical detection method such as fluorescent light excitation before the experiment is carried out, for example.
  • the labeling of the active substances with fluorescent markers can be omitted.
  • the active ingredient can be prepared by preparing for the test. implementation in the properties to be examined is changed.
  • a particularly favorable embodiment of the invention provides that the change in the electrical properties of the cells is determined by measuring the membrane potential of the cells.
  • the membrane potential can be measured capacitively, for example, the electrically conductive sample carrier being used here as a capacitor plate.
  • the fact that living cells build up an electrical potential due to their cell metabolism between the cell interior and their environment separated by the cell membrane is advantageously used in the measurement. Since this membrane potential is dependent metabolic, can be a change 'in the membrane potential as a result of a drug effect on the metabolism of the cell by means of the electrically conductive sample holder in a particularly simple manner determined.
  • toxic active substances e.g. B. a reduction in membrane potential due to a loss of vitality of the cells.
  • the membrane potential can, for. B. can be determined with a phase-sensitive electronics.
  • a multiplicity of electrically conductive regions which are electrically insulated from one another are provided on the sample carrier and with which a change in the electrical properties of the cells is determined independently of one another.
  • the large number of areas advantageously enables the electrical properties of the cells to be measured in a site-specific manner. In this way, for example, the cells can be individually examined for their electrical properties.
  • the electrically conductive areas can can also be made so small that several electrically conductive areas can be assigned to a cell. In this way, even a spatially resolved examination of the individual cells can advantageously be carried out.
  • the change in the electrical properties of the cells determined is compared with reference data which characterize specific reactions of the cells.
  • reference data which characterize specific reactions of the cells.
  • An examination method for the toxicity of active substances in which the animals to be examined are confronted with the active substance in order to determine the dose at which 50% of the animals examined die, can be replaced in a particularly simple manner by the method according to the invention.
  • the so-called LD50 test lethal dose 50%
  • the properties of the sample carrier are determined in the event that 50% of the cells immobilized on the sample carrier have died.
  • cell death can be determined, for example, by reducing the capacity of the system acting as a capacitor, consisting of cell membrane and sample carrier as capacitor plates in the broader sense.
  • the detected electrical measurement value for the sample carrier falls below the charac- teristic value for death of 50% of the cells.
  • the corresponding concentration can be determined of the 'toxic active ingredient in the nutrient solution for the cells as the LD 50. This can at least drastically reduce or even completely replace the administration of the toxic active substance to living organisms.
  • a special embodiment of the invention provides that the cells are examined with the electrically conductive areas in such a way that the measurement signals from areas assigned to a particular cell are evaluated together to determine the change in the electrical properties of this cell.
  • this advantageously enables a cell-specific evaluation of the measurement results.
  • the death of each individual cell can be determined, as a result of which a statistical value with a known number of cells can be derived directly.
  • each cell must have at least one electrically conductive area. In the event that several electrically conductive areas are used per cell, the electrical properties of the respective cell can also be locally resolved.
  • the determined change in the electrical properties of the respective cell is compared with reference data which characterize specific reactions of the respective cell.
  • the different reaction states of the individual cells can thus be determined, for example, when toxic agents are applied, since a superimposition of measurement signals from several cells can be avoided. .. ⁇ •
  • the electrical properties of the individual cells that are present when the respective cell has died are determined as reference data. These electrical properties can e.g. B. by lowering the membrane potential of a single cell below a critical value. The determination is carried out, in particular, indirectly by means of a capacitive measurement, as already described.
  • FIG. 1 shows schematically the section through an exemplary embodiment of an analysis device for carrying out the method according to the invention
  • FIG. 2 schematically shows a section of a cell immobilized on a sample carrier for carrying out the method according to the invention and
  • FIG. 3 shows a top view of the sample carrier according to FIG. 2.
  • An examination device for cells 11 has a sample chamber 12 in which the cells 11 are immobilized on a biocompatible layer 13.
  • the biocompatible layer 13 is applied to a sample carrier 14, which in turn carries the cells 11 as samples.
  • the reaction chamber 12 has a housing 15, from which an electrical connection 16 for the sample holder 14 is shown schematically.
  • An electrical signal generator 17 and a measuring device 18 are connected to the connection 16.
  • the signal generator 17 and the measuring device 18 can, for. B. consist of a phase-sensitive electronics. With such electronics, the measuring principle is based on the fact that a time shift .DELTA.t arises through capacitors in the AC circuit: the current maximum leads the voltage maximum. Each metabolically active cell has an electrical potential difference of approx. 50-100 mV on the cell membrane. This
  • Membrane potential allows the cell to act as a capacitor in an AC field. If the alternating current has a sinusoidal shape, this shift is measured in ° (degrees) and referred to as phase angle ⁇ (phi). Metaphorically speaking, vital cells with a stable membrane potential have a high phase angle, while cells with a low membrane potential with a reduced vitality have a correspondingly lower phase angle. The phase angle is most meaningful at a frequency of 50 Hz.
  • a lid 19 of the sample chamber 12 is made transparent, so that an optical examination of the cells 11 by means of a camera 20 in addition to the electrical according to the invention Examination of the cells can be done.
  • the electrical examination of the cells is carried out by the signal generator 17 generating an electrical signal with a known characteristic, the reaction of the sample carrier to this electrical signal being determined with the measuring device.
  • the condition of the cells 11 plays an important role here, because due to their electrical properties they directly influence the electrical properties of the sample carrier 14.
  • FIG. 2 shows a sample carrier 14a as a detail on which electrically conductive areas 21 are applied. These areas 21 are covered by the biocompatible layer 13, which on the one hand is responsible for the immobilization of the cell 11 and on the other hand can advantageously act as a dielectric. ⁇ • ⁇
  • An active ingredient 22, which penetrates into the cell according to FIG. 2, is also shown schematically.
  • the active substance could also accumulate on the cell membrane 23 of the cell 11.
  • An electrical examination of the cell 11 under the influence of the active substance takes place via the areas 21, which can be electrically contacted via a connection, not shown, as shown in FIG. 1.
  • These act as capacitor plates, with the aid of which - reinforced by the biocompatible layer 13 acting as a dielectric - the membrane potential of the membrane 23 can be measured indirectly in the area of immobilization. If the membrane potential, ie the electrical potential formed between the cell interior and the cell environment, is reduced, the capacitance of the capacitors formed from the cell membrane 23 and the regions 21 is also reduced.
  • An embodiment of the areas 21 as a supervision can be seen in FIG. These can be produced on the sample carrier 14a by structuring a conductive layer, the necessary connections 16 likewise being able to be formed from this layer and running in the spaces between the individual regions 21.

Abstract

Disclosed is a method for analyzing the influence of an active substance on cells, according to which the cells are immobilized on s sample carrier (13, 14) that is located inside a reaction chamber (12). Electrical signals that make it possible to draw a conclusion about the electrical properties of the cells (11) can be read out via the electrically conductive sample carrier (14) by impinging the reaction chamber with the active substance (which is contained in the nutrient solution for the cells, for example). Said method allows especially dead cells to be detected, whereby the toxic effect of the active substance can be tested. Said test makes it possible to limit or even dispense with the otherwise necessary tests on animals. (common LD50 toxicity tests).

Description

Beschreibung description
Verfahren zur Untersuchung eines Wirkstoffeinflusses auf biologische ZellenProcedure for the investigation of the influence of active substances on biological cells
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung eines Wirkstoffeinflusses auf biologische Zellen, bei dem die zu untersuchenden Zellen auf einem Probenträger immobilisiert werden, die Zellen mit dem Wirkstoff beaufschlagt werden und die Zellen auf eine Reaktion auf den Wirkstoff hin untersucht werden.The invention relates to a method for examining the influence of an active ingredient on biological cells, in which the cells to be examined are immobilized on a sample carrier, the cells are acted upon with the active ingredient and the cells are examined for a reaction to the active ingredient.
Ein derartiges Verfahren ist in der DE 198 58 490 AI beschrieben. Bei dem Verfahren gemäß diesem Dokument wird eine Zelle mittels einer biokompatiblen Adhäsionsschicht auf einem Probenträger immobilisiert. Im nächsten Schritt wird die immobilisierte Zelle mit Wirkstoffmolekülen beaufschlagt, die an unterschiedliche Proteine in der Zellmembran angelagert werden können. Eine Untersuchung der Zelle wird mit nahfeld- optischen Methoden durchgeführt, wobei eine Veränderung der optischen Eigenschaften der Zelle aufgrund einer Reaktion auf den Wirkstoff hin ermittelt werden kann. Beispielsweise kann eine Anlagerung von Östrogenen an die Rezeptoren einer Zelle durch eine Verschiebung der Fluoreszenzwellenlänge von gebun- denem Östrogen im Vergleich zu ungebundenem Östrogen festgestellt werden. Um eine Fluoreszenz der Östrogene zu bewirken, werden diese mit sogenannten Fluoreszenzmarkern versehen, bevor sie bei der Versuchsdurchführung beispielsweise mittels einer Nährlösung zu den zu untersuchenden Zellen gegeben wer- den. Eine Fluoreszenzlichtanregung erfolgt bei der Versuchs- durchführung dann mittels geeigneter Lichtquellen im Probenträger, mit denen die Zellen bestrahlt werden. Die Aufgabe der Erfindung liegt darin, ein Verfahren zur Untersuchung eines Wirkstoffeinflusses auf biologische Zellen anzugeben, welches vergleichsweise einfach durchgeführt werden kann.Such a method is described in DE 198 58 490 AI. In the method according to this document, a cell is immobilized on a sample carrier by means of a biocompatible adhesive layer. In the next step, the immobilized cell is loaded with active substance molecules that can be attached to different proteins in the cell membrane. The cell is examined using near-field optical methods, and a change in the optical properties of the cell due to a reaction to the active substance can be determined. For example, an attachment of estrogens to the receptors of a cell can be determined by a shift in the fluorescence wavelength of bound estrogen compared to unbound estrogen. In order to cause fluorescence of the estrogens, they are provided with so-called fluorescence markers before they are added to the cells to be examined, for example by means of a nutrient solution, when carrying out the experiment. When carrying out the experiment, fluorescent light is then excited by means of suitable light sources in the sample holder with which the cells are irradiated. The object of the invention is to provide a method for investigating the influence of an active substance on biological cells, which can be carried out comparatively easily.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass der Probenträger elektrisch leitfähig ist und als Maß für eine Reaktion der Zellen auf den Wirkstoff eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen mit Hilfe des Proben- trägers ermittelt wird. Hierbei wird der Umstand genutzt, dass eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen, die diese aufgrund ihrer zelltypischen 'Aktivitäten aufweisen, sich direkt auch auf die elektrischen Eigenschaften des Probenträgers auswirken, so dass eine Veränderung der e- lektrischen Eigenschaften der Zellen indirekt durch eine Ermittlung der elektrischen Eigenschaften des Probenträgers festgestellt werden kann. Veränderungen der elektrischen Eigenschaften des Probenträgers, die durch eine geeignete e- lektrische Kontaktierung ausgelesen werden können, lassen so- mit einen Rückschluss auf eine Veränderung der elektrischenThis object is achieved according to the invention in that the sample carrier is electrically conductive and a change in the electrical properties of the cells is determined with the aid of the sample carrier as a measure of a reaction of the cells to the active substance. The fact is used here that a change in the electrical properties of the cells, which they have due to their cell-typical 'activities, also have a direct effect on the electrical properties of the sample carrier, so that a change in the electrical properties of the cells indirectly through a determination the electrical properties of the sample holder can be determined. Changes in the electrical properties of the sample carrier, which can be read out by means of a suitable electrical contact, thus allow a conclusion to be drawn about a change in the electrical
Eigenschaften der Zellen und somit auf deren Reaktion auf den Wirkstoff hin zu. Die so realisierte, elektrische Untersuchung der Zellen birgt den Vorteil, dass eine Untersuchung des Wirkstoffeinflusses auf diese Zellen besonders einfach möglich ist, da die Wirkstoffe vor der Versuchsdurchführung nicht auf beispielsweise ein optisches Nachweisverfahren wie die Fluoreszenzlichtanregung vorbereitet werden müssen. Damit kann beispielsweise die Markierung der Wirkstoffe mit Fluo- reszenzmarkern entfallen. Hierdurch lassen sich nicht nur vorteilhaft Kosten bei der Durchführung des Nachweisverfahrens einsparen, sondern es kann auch ausgeschlossen werden, dass der Wirkstoff durch eine Vorbereitung auf die Versuchs- durchführung in gerade den zu untersuchenden Eigenschaften verändert wird.Properties of the cells and thus their reaction to the active ingredient. The electrical examination of the cells realized in this way has the advantage that an examination of the influence of the active substance on these cells is particularly simple since the active substances do not have to be prepared for an optical detection method such as fluorescent light excitation before the experiment is carried out, for example. Thus, for example, the labeling of the active substances with fluorescent markers can be omitted. Not only can this advantageously save costs when carrying out the detection method, but it can also be ruled out that the active ingredient can be prepared by preparing for the test. implementation in the properties to be examined is changed.
Eine besonders günstige Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen durch die Messung des Membranpotentials der Zellen ermittelt wird. Dabei kann das Membranpotential beispielsweise kapazitiv gemessen werden, wobei der elektrisch leitfähige Probenträger hierbei als Kondensatorplatte genutzt wird. Bei der Messung wird vorteilhaft der Umstand genutzt, dass lebende Zellen aufgrund ihres Zellstoffwechsels zwischen dem Zellinneren und ihrer durch die Zellmembran abgetrennten Umgebung ein elektrisches Potential aufbauen. Da dieses Membranpotential stoffwechselabhängig ist, lässt sich eine Veränderung ' des Membranpotentials infolge eines Wirkstoffeinflusses auf den Stoffwechsel der Zelle mittels des elektrisch leitfähigen Probenträgers auf besonders einfache Weise ermitteln. Bei toxischen Wirkstoffen ist z. B. eine Verminderung des Membran- potentials aufgrund eines Vitalitätsverlustes der Zellen zu erwarten. Mit dem Probenträger als Kondensatorplatte kann das Mernbranpotential z. B. mit einer phasensensitiven Elektronik ermittelt werden.A particularly favorable embodiment of the invention provides that the change in the electrical properties of the cells is determined by measuring the membrane potential of the cells. The membrane potential can be measured capacitively, for example, the electrically conductive sample carrier being used here as a capacitor plate. The fact that living cells build up an electrical potential due to their cell metabolism between the cell interior and their environment separated by the cell membrane is advantageously used in the measurement. Since this membrane potential is dependent metabolic, can be a change 'in the membrane potential as a result of a drug effect on the metabolism of the cell by means of the electrically conductive sample holder in a particularly simple manner determined. In the case of toxic active substances, e.g. B. a reduction in membrane potential due to a loss of vitality of the cells. With the sample carrier as a capacitor plate, the membrane potential can, for. B. can be determined with a phase-sensitive electronics.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist vorgese- hen, dass auf dem Probenträger eine Vielzahl von elektrisch leitfähigen, voneinander elektrisch isolierten Bereichen vorgesehen ist, mit denen unabhängig voneinander eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen ermittelt wird. Die Vielzahl von Bereichen ermöglicht vorteilhaft, eine Messung der elektrischen Eigenschaften der Zellen ortsspezifisch vorzunehmen. Hierdurch können beispielsweise die Zellen jeweils einzeln auf ihre elektrischen Eigenschaften hin untersucht werden. Die elektrisch leitfähigen Bereiche können auch derart klein hergestellt werden, dass jeweils mehrere elektrisch leitfähige Bereiche jeweils einer Zelle zugeordnet werden können. Hierdurch lässt sich vorteilhaft sogar eine ortsaufgelöste Untersuchung der einzelnen Zellen durchführen.According to another embodiment of the invention, it is provided that a multiplicity of electrically conductive regions which are electrically insulated from one another are provided on the sample carrier and with which a change in the electrical properties of the cells is determined independently of one another. The large number of areas advantageously enables the electrical properties of the cells to be measured in a site-specific manner. In this way, for example, the cells can be individually examined for their electrical properties. The electrically conductive areas can can also be made so small that several electrically conductive areas can be assigned to a cell. In this way, even a spatially resolved examination of the individual cells can advantageously be carried out.
Bei der Durchführung des Verfahrens kann gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung vorgesehen werden, dass die ermittelte Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen mit Referenzdaten verglichen wird, welche bestimmte Reaktionen der Zellen charakterisieren. Hierdurch können vorteilhaft bestimmte Veränderungsmuster der elektrischen Eigenschaften der Zellen erkannt werden, die den gespeicherten Referenzdaten entsprechen.When carrying out the method, it can be provided according to a further aspect of the invention that the change in the electrical properties of the cells determined is compared with reference data which characterize specific reactions of the cells. As a result, certain change patterns in the electrical properties of the cells which correspond to the stored reference data can advantageously be identified.
Es ist vorteilhaft, wenn als Referenzdaten diejenigen elektrischen Eigenschaften der Gesamtheit der Zellen ermittelt werden, die vorliegen, wenn ein bestimmter Prozentsatz, insbesondere die Hälfte der auf dem Probenträger immobilisierten Zellen abgestorben ist. Dies ermöglicht es in vorteilhafter Weise, Toxizitatsuntersuchungen von Wirkstoffen, die bisher an lebenden Organismen wie Fischen, Ratten und Würmern durchgeführt wurden, durch die Untersuchung einzelner lebender Zellen entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens zu ersetzen. Hierbei kann Gesichtspunkten des Tierschutzes Rech- nung getragen werden und die Zahl notwendiger Tierversuche deutlich verringert werden.It is advantageous if those electrical properties of the totality of the cells are determined as reference data that are present when a certain percentage, in particular half, of the cells immobilized on the sample carrier has died. This advantageously makes it possible to replace toxicity studies of active substances which have hitherto been carried out on living organisms such as fish, rats and worms, by examining individual living cells in accordance with the method according to the invention. In this regard, animal welfare aspects can be taken into account and the number of animal experiments required can be significantly reduced.
Ein Untersuchungsverfahren für die Toxizität von Wirkstoffen, bei dem die zu untersuchenden Tiere mit dem Wirkstoff kon- frontiert werden, um die Dosis zu ermitteln, bei der 50 % der untersuchten Tiere sterben, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren in besonders einfacher Weise ersetzt werden. Der sogenannte LD50-Test (Lethal Dosis 50%) wird mit dem Verfall- ren gemäß der Erfindung derart durchgeführt, dass das Membranpotential der untersuchten Zellen in Abhängigkeit des Zellstoffwechsels als Folge der Inkubation mit toxischen Wirkstoffen vermessen wird. Dieses kann sich in einer Größen- Ordnung von 0 bis ca. 200 mV bewegen. Ermittelt werden die Eigenschaften des Probenträgers für den Fall, dass 50 % der auf dem Probenträger immobilisierten Zellen abgestorben sind. Da sie für diese Zellen eine Verringerung des Membranpotentials und schließlich eine Absenkung auf 0 ergibt, kann ein Ab- sterben der Zellen beispielsweise durch eine Verminderung der Kapazität des als Kondensator wirkenden Systems, bestehend aus Zellmembran und Probenträger als Kondensatorplatten im weiteren Sinne, ermittelt werden. Unterschreitet also der ermittelte elektrische Messwert für den Probenträger den cha- rakteristischen Wert für ein Absterben von 50 % der Zellen., so kann die dazugehörige Konzentration des' toxischen Wirkstoffes in der Nährlösung für die Zellen als LD 50 festgestellt werden. Hierdurch kann eine Verabreichung des toxischen Wirkstoffes an lebenden Organismen zumindest drastisch reduziert oder sogar komplett ersetzt werden.An examination method for the toxicity of active substances, in which the animals to be examined are confronted with the active substance in order to determine the dose at which 50% of the animals examined die, can be replaced in a particularly simple manner by the method according to the invention. The so-called LD50 test (lethal dose 50%) is Ren carried out according to the invention such that the membrane potential of the cells examined is measured depending on the cell metabolism as a result of the incubation with toxic agents. This can range in size from 0 to approx. 200 mV. The properties of the sample carrier are determined in the event that 50% of the cells immobilized on the sample carrier have died. Since this results in a reduction in the membrane potential for these cells and ultimately a reduction to 0, cell death can be determined, for example, by reducing the capacity of the system acting as a capacitor, consisting of cell membrane and sample carrier as capacitor plates in the broader sense. Thus, the detected electrical measurement value for the sample carrier falls below the charac- teristic value for death of 50% of the cells., The corresponding concentration can be determined of the 'toxic active ingredient in the nutrient solution for the cells as the LD 50. This can at least drastically reduce or even completely replace the administration of the toxic active substance to living organisms.
Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass mit den elektrisch leitfähigen Bereichen die Zellen derart untersucht werden, dass die Messsignale von jeweils einer be- stimmten Zelle zugeordneten Bereichen zur Ermittlung der Veränderung der elektrischen Eigenschaften dieser Zelle gemeinsam ausgewertet werden. Hierdurch lässt sich, wie bereits erwähnt, vorteilhaft eine zellspezifische Auswertung der Messergebnisse erreichen. Es kann insbesondere das Absterben je- der einzelnen Zelle ermittelt werden, wodurch ein statistischer Wert bei bekannter Anzahl der Zellen direkt abgeleitet werden kann. Für eine zellspezifische Auswertung der Messergebnisse muss jeder Zelle mindestens ein elektrisch leitfähi- ger Bereich zugeordnet sein. Für den Fall, das mehrere elektrisch leitfähige Bereiche pro Zelle Verwendung finden, lassen sich die elektrischen Eigenschaften der jeweiligen Zelle zusätzlich örtlich auflösen.A special embodiment of the invention provides that the cells are examined with the electrically conductive areas in such a way that the measurement signals from areas assigned to a particular cell are evaluated together to determine the change in the electrical properties of this cell. As already mentioned, this advantageously enables a cell-specific evaluation of the measurement results. In particular, the death of each individual cell can be determined, as a result of which a statistical value with a known number of cells can be derived directly. For a cell-specific evaluation of the measurement results, each cell must have at least one electrically conductive area. In the event that several electrically conductive areas are used per cell, the electrical properties of the respective cell can also be locally resolved.
Bei einer zellenweisen Messung der elektrischen Eigenschaften ist es vorteilhaft, wenn die ermittelte Veränderung der elektrischen Eigenschaften der jeweiligen Zelle mit Referenzdaten verglichen wird, welche bestimmte Reaktionen der jewei- ligen Zelle charakterisieren. Somit können die unterschiedlichen Reaktionszustände der einzelnen Zellen beispielsweise bei Beaufschlagung mit toxischen Wirkstoffen ermittelt werden, da eine Überlagerung von Messsignalen mehrerer Zellen vermieden werden kann. .:.<•In the case of a cell-by-cell measurement of the electrical properties, it is advantageous if the determined change in the electrical properties of the respective cell is compared with reference data which characterize specific reactions of the respective cell. The different reaction states of the individual cells can thus be determined, for example, when toxic agents are applied, since a superimposition of measurement signals from several cells can be avoided. .. <•
Weiterhin ist es besonders vorteilhaft, wenn als Referenzda- , ten die elektrischen Eigenschaften der einzelnen Zellen ermittelt werden, die vorliegen, wenn die jeweilige Zelle abgestorben ist. Diese elektrischen Eigenschaften lassen sich z. B. durch das Absinken des Membranpotentials einer einzelnen Zelle unterhalb eines kritischen Wertes feststellen. Die Ermittlung erfolgt insbesondere indirekt durch eine kapazitive Messung, wie bereits beschrieben.Furthermore, it is particularly advantageous if the electrical properties of the individual cells that are present when the respective cell has died are determined as reference data. These electrical properties can e.g. B. by lowering the membrane potential of a single cell below a critical value. The determination is carried out, in particular, indirectly by means of a capacitive measurement, as already described.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden im Folgenden anhand der Zeichnung beschrieben. Hierbei zeigenFurther details of the invention are described below with reference to the drawing. Show here
Figur 1 schematisch den Schnitt durch ein Ausführungsbei- spiel einer Analysevorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,FIG. 1 shows schematically the section through an exemplary embodiment of an analysis device for carrying out the method according to the invention,
Figur 2 schematisch eine auf einem Probenträger zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisierte Zelle im Schnitt und Figur 3 eine Aufsicht auf den Probenträger gemäß Figur 2.FIG. 2 schematically shows a section of a cell immobilized on a sample carrier for carrying out the method according to the invention and FIG. 3 shows a top view of the sample carrier according to FIG. 2.
Eine Untersuchungsvorrichtung für Zellen 11 gemäß Figur 1 weist eine Probenkammer 12 auf, in der die Zellen 11 auf ei- ner biokompatiblen Schicht 13 immobilisiert sind. Die biokompatible Schicht 13 ist auf einem Probenträger 14 aufgebracht, der seinerseits als Proben die Zellen 11 trägt. Die Reaktionskammer 12 weist ein Gehäuse 15 auf, aus dem schematisch dargestellt ein elektrischer Anschluss 16 für den Probenträ- ger 14 herausgeführt ist. An den Anschluss 16 sind ein elektrischer Signalgenerator 17 und ein Messgerät 18 angeschlossen.An examination device for cells 11 according to FIG. 1 has a sample chamber 12 in which the cells 11 are immobilized on a biocompatible layer 13. The biocompatible layer 13 is applied to a sample carrier 14, which in turn carries the cells 11 as samples. The reaction chamber 12 has a housing 15, from which an electrical connection 16 for the sample holder 14 is shown schematically. An electrical signal generator 17 and a measuring device 18 are connected to the connection 16.
Der Signalgenerator 17 und das Messgerät 18 können z. B. aus einer phasensensitiven Elektronik bestehen. Bei einer solchen Elektronik beruht das Messprinzip darauf, dass durch Konden- ' satoren im Wechselstromkreis eine Zeitverschiebung Δt entsteht: das Strommaximum eilt dem Spannungsmaximum voraus. Jede stoffwechselaktive Zelle hat an der Zellmembran eine elektrische Potentialdifferenz von ca. 50-100 mV. DiesesThe signal generator 17 and the measuring device 18 can, for. B. consist of a phase-sensitive electronics. With such electronics, the measuring principle is based on the fact that a time shift .DELTA.t arises through capacitors in the AC circuit: the current maximum leads the voltage maximum. Each metabolically active cell has an electrical potential difference of approx. 50-100 mV on the cell membrane. This
Membranpotential lässt die Zelle in einem Wechselstromfeld als Kondensator wirken. Wenn der Wechselstrom eine Sinusform hat, wird diese Verschiebung in ° (Grad) gemessen und als Phasenwinkel φ (phi) bezeichnet. Bildlich ausgedrückt haben vitale Zellen mit stabilem Membranpotential einen hohen Phasenwinkel, während in Ihrer Vitalität eingeschränkte Zellen mit niedrigem Membranpotential einen entsprechend niedrigeren Phasenwinkel haben. Der Phasenwinkel ist bei einer Frequenz von 50 Hz am aussagekräftigsten.Membrane potential allows the cell to act as a capacitor in an AC field. If the alternating current has a sinusoidal shape, this shift is measured in ° (degrees) and referred to as phase angle φ (phi). Metaphorically speaking, vital cells with a stable membrane potential have a high phase angle, while cells with a low membrane potential with a reduced vitality have a correspondingly lower phase angle. The phase angle is most meaningful at a frequency of 50 Hz.
Ein Deckel 19 der Probenkammer 12 ist transparent ausgeführt, so dass eine optische Untersuchung der Zellen 11 mittels einer Kamera 20 zusätzlich zur erfindungsgemäßen, elektrischen Untersuchung der Zellen erfolgen kann. Die elektrische Untersuchung der Zellen wird dadurch vorgenommen, dass der Signalgenerator 17 ein elektrisches Signal mit bekannter Charakteristik erzeugt, wobei die Reaktion des Probenträgers auf dieses elektrische Signal mit dem Messgerät ermittelt wird. Hierbei spielt die Verfassung der Zellen 11 eine wesentliche Rolle, da diese aufgrund ihrer elektrischen Eigenschaften die elektrischen Eigenschaften des Probenträgers 14 direkt beeinflussen.A lid 19 of the sample chamber 12 is made transparent, so that an optical examination of the cells 11 by means of a camera 20 in addition to the electrical according to the invention Examination of the cells can be done. The electrical examination of the cells is carried out by the signal generator 17 generating an electrical signal with a known characteristic, the reaction of the sample carrier to this electrical signal being determined with the measuring device. The condition of the cells 11 plays an important role here, because due to their electrical properties they directly influence the electrical properties of the sample carrier 14.
In Figur 2 ist ein Probenträger 14a als Ausschnitt dargestellt, auf dem elektrisch leitfähige Bereiche 21 aufgebracht sind. Diese Bereiche 21 werden von der biokompatiblen Schicht 13 bedeckt, welche einerseits für die Immobilisierung der Zelle 11 verantwortlich ist und vorteilhafterweise andererseits als Dielektrikum wirken kann. ■• <FIG. 2 shows a sample carrier 14a as a detail on which electrically conductive areas 21 are applied. These areas 21 are covered by the biocompatible layer 13, which on the one hand is responsible for the immobilization of the cell 11 and on the other hand can advantageously act as a dielectric. ■ • <
Schematisch dargestellt ist weiterhin ein Wirkstoff 22, welcher gemäß Figur 2 in die Zelle eindringt. Alternativ (nicht dargestellt) könnte sich der Wirkstoff auch auf der Zellmembran 23 der Zelle 11 anlagern. Eine elektrische Untersuchung der unter Wirkstoffeinfluss befindlichen Zelle 11 erfolgt über die Bereiche 21, die entsprechend der Darstellung in Figur 1 über einen nicht dargestellten Anschluss elektrisch kontaktierbar sind. Diese wirken als Kondensatorplatten, mit deren Hilfe - verstärkt durch die als Dielektrikum wirkende biokompatible Schicht 13 - das Membranpotential der Membran 23 im Bereich der Immobilisierung indirekt gemessen werden kann. Verringert sich nämlich das Membranpotential, d. h. das zwischen Zellinnerem und Zellumgebung ausgebildete elektrische Potential, so verringert sich dadurch auch die Kapazität der aus der Zellmembran 23 und den Bereichen 21 gebildeten Kondensatore . Der Figur 3 kann eine Ausbildung der Bereiche 21 als Aufsicht entnommen werden. Diese können auf dem Probenträger 14a durch Strukturierung einer leitfähigen Schicht hergestellt werden, wobei die notwendigen Anschlüsse 16 ebenfalls aus dieser Schicht gebildet werden können und in den Zwischenräumen zwischen den einzelnen Bereichen 21 verlaufen. An active ingredient 22, which penetrates into the cell according to FIG. 2, is also shown schematically. Alternatively (not shown), the active substance could also accumulate on the cell membrane 23 of the cell 11. An electrical examination of the cell 11 under the influence of the active substance takes place via the areas 21, which can be electrically contacted via a connection, not shown, as shown in FIG. 1. These act as capacitor plates, with the aid of which - reinforced by the biocompatible layer 13 acting as a dielectric - the membrane potential of the membrane 23 can be measured indirectly in the area of immobilization. If the membrane potential, ie the electrical potential formed between the cell interior and the cell environment, is reduced, the capacitance of the capacitors formed from the cell membrane 23 and the regions 21 is also reduced. An embodiment of the areas 21 as a supervision can be seen in FIG. These can be produced on the sample carrier 14a by structuring a conductive layer, the necessary connections 16 likewise being able to be formed from this layer and running in the spaces between the individual regions 21.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Untersuchung eines Wirkstoffeinflusses auf biologische Zellen (11) , bei dem - die zu untersuchenden Zellen (11) auf einem Probenträger (14, 14a) immobilisiert werden, - die Zellen (11) mit dem Wirkstoff beaufschlagt werden und die Zellen (11) auf eine Reaktion auf den Wirkstoff hin untersucht werden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass der Probenträger (14, 14a) elektrisch leitfähig ist und als Maß für eine Reaktion der Zellen (11) auf den Wirkstoff eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen (11) mit Hilfe des Probenträgers (14, 14a) ermittelt wird.1. A method for investigating the influence of an active ingredient on biological cells (11), in which - the cells (11) to be examined are immobilized on a sample carrier (14, 14a), - the cells (11) are acted upon by the active ingredient and the cells 11) are examined for a reaction to the active substance, characterized in that the sample carrier (14, 14a) is electrically conductive and a measure of a reaction of the cells (11) to the active substance is a change in the electrical properties of the cells (11) With the help of the sample carrier (14, 14a) is determined.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen (11) durch die Messung des Membranpotentials der Zellen (11) ermittelt wird.2. The method of claim 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that the change in the electrical properties of the cells (11) is determined by measuring the membrane potential of the cells (11).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass auf dem Probenträger (14, 14a) eine Vielzahl von elekt- risch leitfähigen, voneinander elektrisch isolierten Bereichen (21) vorgesehen ist, mit denen unabhängig voneinander eine Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen (11) ermittelt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that a plurality of electrically conductive, mutually electrically insulated areas (21) is provided on the sample carrier (14, 14a), with which a change in the electrical properties of the cells ( 11) is determined.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die ermittelte Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zellen (11) mit Referenzdaten verglichen wird, welche bestimmte Reaktionen der Zellen (11) charakterisieren.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determined change in the electrical properties of the cells (11) is compared with reference data which characterize specific reactions of the cells (11).
5. Verfahren nach Anspruch 4 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass als Referenzdaten diejenigen elektrischen Eigenschaften der Gesamtheit der Zellen (11) ermittelt werden, die vorliegen, wenn ein bestimmter Prozentsatz, insbesondere die Hälfte der auf dem Probenträger (14, 14a) immobilisierten Zellen (11) abgestorben ist.5. The method according to claim 4, characterized in that those electrical properties of the totality of cells (11) are determined as reference data that are present when a certain percentage, in particular half, of the cells (11) immobilized on the sample carrier (14, 14a). has died.
6. Verfahren nach Anspruch 3 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass mit den elektrisch leitfähigen Bereichen (21) die Zellen (11) derart untersucht werden, dass die Messsignale von jeweils einer bestimmten Zelle (11) zugeordneten Bereichen zur Ermittlung der Veränderung der elektrischen Eigenschaften dieser Zelle (11) gemeinsam ausgewertet werden.6. The method according to claim 3, characterized in that the cells (11) are examined with the electrically conductive areas (21) in such a way that the measurement signals from areas assigned to a particular cell (11) in order to determine the change in the electrical properties of this cell ( 11) are evaluated together.
7. Verfahren nach Anspruch 6 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die ermittelte Veränderung der elektrischen Eigenschaften der jeweiligen Zelle (11) mit Referenzdaten verglichen wird, welche bestimmte Reaktionen der jeweiligen Zelle (11) charakterisieren.7. The method according to claim 6, so that the change in the electrical properties of the respective cell (11) is compared with reference data which characterize specific reactions of the respective cell (11).
8. Verfahren nach Anspruch 7 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass als Referenzdaten die elektrischen Eigenschaften der einzelnen Zellen (11) ermittelt werden, die vorliegen, wenn die jeweilige Zelle (11) abgestorben ist. 8. The method according to claim 7, so that the electrical properties of the individual cells (11) that are present when the respective cell (11) has died are determined as reference data.
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