WO2004086055A1 - マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 - Google Patents

マイクロチップ、核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 Download PDF

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Michihiro Ohnishi
Keisuke Morishima
Takehiko Kitamori
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Definitions

  • the present invention relates to a microchip, a kit for extracting nucleic acids, and a method for extracting nucleic acids.
  • the present application relates to a method for extracting nucleic acids in Japan in 2003.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2000-2016 filed on May 24, which is incorporated herein by reference. . 2.
  • a groove having a depth of about 100 ⁇ irn and a width of about 500iLim is formed on a surface of a substrate such as glass by a fine processing technique such as lithography.
  • a microchip technology that uses a gas microchannel to enable chemical reaction, biochemical reaction, solvent extraction, gas-liquid separation, and chemical analysis or non-contact optical analysis of trace components based on these.
  • the inventors of the present application have also proposed a method of inserting microbeads as a reaction carrier into a fine channel and providing a dam-shaped damming portion in the microchannel. It has been proposed (Reference 1).
  • the present invention The purpose of this method is to produce and prepare a low-cost microchip technology using a microphone mouth bead that is not only effective for extracting nucleic acids but also useful as various reaction carriers.
  • New technology microchips that can suppress the generation of stagnation, facilitate smooth and easy injection, filling, and transportation of microbeads, and also reduce the generation of dust. Is to provide a way.
  • a fine channel is formed by a groove provided on a joint surface between upper and lower substrates, and the fine channel has upper, lower, right and left sides of its cross section.
  • a gap with a reduced flow channel cross section is provided Have been.
  • the gap may be formed by a protrusion in the groove. Further, the gap may be formed by opposing the protrusions in the grooves provided in each of the upper and lower substrates. Further, the gap may be formed by inserting a protrusion of the other substrate into a groove of one substrate. Further, the size of the cross section of the gap may be variable by at least one of the movable protrusions of the upper and lower substrates.
  • the size of the cross section of the gap portion is a size for blocking the micro peas inserted into the fine channel.
  • the inner wall surface of the fine channel may be modified with a surface treatment agent.
  • a kit for nucleic acid extraction according to the present invention includes the above-described microchip and microbeads having a surface hydroxyl group.
  • the microbeads having surface hydroxyl groups may be at least one of silica microbeads having a diameter of 10 m or less, hollow silica microbeads, and resin microbeads.
  • the surface hydroxyl group may be coated with a surface treating agent.
  • This surface treatment agent is a silane coupling agent containing a trialkylhalogenosilane as a main component.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view schematically illustrating a microchip.
  • FIG. 2A and 2B are cross-sectional views of the gap 31 from the directions A and B in FIG. 3A to 3C are cross-sectional views showing other examples of the gap 31.
  • FIG. 4A and 4B are cross-sectional views showing still another example of the gap portion 31.
  • FIG. 4A and 4B are cross-sectional views showing still another example of the gap portion 31.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of an optical microscope photograph illustrating DNA adsorption as an example.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION FIGS. 1 and 2 schematically show a partial structure of a microchip according to the present invention, and FIG. 1 shows a state in which a lower substrate 1 and an upper substrate 2 are separated.
  • FIG. 2 shows a partial cross section of the gap 3 1 provided in the fine flow path 3 in a state where the upper and lower substrates 1 and 2 are joined, as viewed from the directions of arrows A and B in FIG. .
  • the fine channels 3 are formed by the grooves 11 and 21 provided on the joint surface between the upper and lower substrates 1 and 2.
  • the fine flow path 3 is provided with a gap portion 31 having a reduced flow path cross section at the upper and lower central portions of the cross section.
  • the fine channels 3 are formed by opposing the grooves 11, 21 of the upper and lower substrates 1, 2.
  • the gaps 31 are formed by the projections 12 and 22 provided in the grooves 11 and 21 facing each other.
  • the gap 31 may be a central portion of the cross section of the fine flow channel 3, and is not limited to the upper and lower central portions as in the slit-shaped opening illustrated in FIG. It may be the left and right central part as shown, or the upper, lower, left and right central part as shown in FIG. 3B.
  • the cross-sectional shape of the gap 31 may be various, for example, as shown in FIG. 3C, may be various such as a circular cross-section.
  • the formation of the gap 31 may not be based on the protrusions 12 and 22 provided in the grooves 11 and 21 of the upper and lower substrates 1 and 2.
  • the fine channel 3 itself is formed, for example, by a groove 11 provided in the lower substrate 1, and the upper substrate 2 is made to exist as a cover thereof, and the fine channel 3 is formed.
  • the protrusions 23 provided on the upper substrate 2 may be inserted into the grooves 11 and the gaps 31 may be formed by facing the protrusions 12 in the grooves 11. It is possible.
  • the gap 31 may be various other than the configuration of the protrusions 12, 22, and 23.
  • these projections 12, 22, 23 may be formed not only by microfabrication of the substrates 1 and 2 by lithography etching or the like, but also by means such as formation by curing of a polymer. Good.
  • the gap 31 may be formed by an action of a minute member from the outside on the fine flow path 3, or by a means such as deformation of the fine flow path 3 itself.
  • the production and preparation of the microchannel 3 and the gap 31 can be performed easily and at low cost.
  • the gap 31 at the center of the cross-section, when micro-beads are injected into the micro-channel 3, the generation of stagnation in the flow of fluids such as liquids and gases is suppressed, and micro-beads are injected.
  • microbeads can be blocked.
  • the size of the cross section of the microchannel using the microbeads can block the microphone mouthpiece injected into the microchannel 3. Shall be.
  • the above-described protrusion or a member having the same function as the above-described protrusion may be made movable, and the size of the cross section may be made variable.
  • the cross-section is greatly enlarged, and the microbeads can be transferred to the downstream region. .
  • the microbeads must be discharged in a direction opposite to the injection.
  • the microbeads can be discharged in the same forward direction as the injection.
  • the sample substance, impurities, dust, etc. are prevented from adhering to the inside of the fine channel 3.
  • the inner wall surface can be modified with a surface treatment agent.
  • surface treatment agents it is effective to cover and inactivate the surface hydroxyl groups with the above.
  • the micromouth chip according to the present invention becomes extremely useful as a kit for characteristic chemical synthesis or analysis by being combined with micropease.
  • the present invention provides, as such a kit, a kit for nucleic acid extraction comprising the microchip as described above, and micropore beads having a surface hydroxyl group.
  • microbeads having a surface hydroxyl group in this case, silica microbeads having a diameter of lO / m or less, hollow silica microbeads, and resin beads such as polystyrene having a hydroxyl group on the surface are preferable. As shown. In the case of silica mic mouth beads having a diameter of 10 m or more, it is difficult to transport the beads in the microchannel 3 due to the specific gravity.
  • the kit for nucleic acid extraction of the present invention for those having a surface hydroxyl group on the inner wall surface of the fine channel, it is preferable to coat the surface hydroxyl group with a silane coupling agent.
  • a trialkylhalogenosilane having one halogen atom that is, the general formula is
  • X represents a halogen atom such as a chlorine atom.
  • nucleic acid extraction for example, in the example of the microchip shown in FIGS. 1 and 2, a microbead-containing liquid is injected from the liquid inlet 4 and the gap is formed in the fine channel 3. A dam is interposed at the gap 31 and then a sample is introduced from the liquid inlet 5 to adsorb the nucleic acid to the microbeads. The remaining liquid is discharged from the discharge port 6. The nucleic acid is extracted by this adsorption. The adsorbed nucleic acid can be desorbed from the microbead by introducing a desorbing solution. It is also preferable that the nucleic acid extraction is performed in the presence of chaotropic ions.
  • a glass microchip having a fine channel with a diameter of 50 ⁇ and a length of 60 mm having a dam structure in the center was prepared (FIG. 1). Gaps in a dam-shaped damming structure with protrusions were formed on both the upper and lower sides of the microchannel.
  • the gap at the center of the microchannel had a slit shape of 2 mm at the top and bottom and 50 ⁇ um at the left and right.
  • One inlet of the microchannel was used as an inlet, and the other was used as an outlet.
  • a liquid reservoir was provided at the inlet, and a microtube was connected to the outlet.
  • a syringe pump was connected to the microtube at the outlet, and an experimental system was constructed in which the liquid injected into the liquid reservoir was sucked by the operation of the syringe pump and could be injected into the microchannel.
  • the microbeads suspended in pure water were injected into a liquid reservoir, and the transport of the microbeads in the microchannel was observed using an optical microscope.
  • microbeads silica microbeads (10 m or less in diameter) were used.
  • Silica microphone mouth beads (diameter 10; m or more), hollow silica microphone mouth beads (diameter 2 to 20 m), and polystyrene microbeads with a hydroxyl group added to the surface (diameter 20 m) were prepared. Suction was performed at a flow rate of 101 per minute. All microbeads other than silica microbeads (with a diameter of 10 ⁇ m or more) were successfully transported in the microchannel, and a bead column could be formed immediately before the gap in the dam structure. On the other hand, when a similar experiment was performed using silica mic mouth beads larger than 10 microns in diameter, transport stopped halfway through the microchannel and column formation was insufficient.
  • hollow silica microbeads and polystyrene microbeads with hydroxyl groups added to the surface were as good in transport as silica nanobeads (beads less than 1 m in diameter).
  • Pure water is injected into the syringe pump and injected into the microchannel.
  • Microbeads other than silica micropipes are transported through the microchannel and discharged into the liquid reservoir.
  • Example 2 Surface modification treatment of the inner wall of a microchannel
  • a surface modification treatment using a silane coupling agent having an alkyl group and a reactive group is widely used. Therefore, the inner surface of the microchannel may be subjected to surface modification using a silane coupling agent.
  • oc decyltrichlorosilane which is commonly used, has three chlorine groups, which are reactive groups for surface modification, and not only reacts with the hydroxyl groups on the inner wall of the microchannel, but also polymerizes due to the polymerization of molecules.
  • the molecules of octadecyltrichlorosilane react with each other and become polymerized, generating garbage.
  • the dust generated in the surface modification treatment of a flat substrate such as a slide glass instead of a fine channel can be washed away with a solvent, and there is no problem.
  • dust generated in the treatment of the inner wall of the fine channel cannot be easily washed away. It is particularly difficult to remove when a damming structure is provided in the fine channel.
  • the dust remaining in the microchannel not only hinders the transport of liquids and beads in the microchannel, but also hinders the nucleic acid adsorption process.
  • the chlorine group which is the reactive group is 2 ⁇ (10!
  • trietylchlorosilane has only one chlorine group, which is the reactive site, and does not in principle polymerize.
  • it since it has a boiling point of 145 ° C and a melting point of 150 ° C, it has low volatility at room temperature and is liquid, so it can be easily diluted in a solvent such as toluene and handled.
  • tdethylclilorosi lane or octadecyltrichlorosilane for the inner wall of the microchannel was subjected to a surface modification treatment.
  • dehydrated toluene as a solvent
  • 5% solutions of each were prepared. The two were compared using the experimental system described in Example 1.
  • the prepared solution was injected into the liquid reservoir, and the solution was injected into the fine channel by sucking with a syringe pump.
  • the flow rate was set at 101 per minute, and a 50 X 1 solution was injected to perform surface modification.
  • 50 ⁇ l or more of dehydrated toluene was injected, and the fine channel after the surface treatment was washed.
  • Example 1 Adsorption of nucleic acids was tested using the experimental system described in 1.
  • the inner wall surface of the microchannel was formed as described in Example 2 using 10% triethylchlorosilane.
  • Co1E1 DNA was used as the nucleic acid.
  • An aqueous saturated sodium iodide solution was used as the chaotropic ion solution.
  • 0.2 g of the microbeads described in Example 1 was suspended in a sodium iodide solution at a ratio of 11 and 25 1 was injected into the microchannel from the liquid reservoir to form a column.
  • sodium iodide as a solvent, a 1% DNA solution was prepared and injected into the microchannel from the solution reservoir.
  • a SYBRGreen I solution which is a fluorescent dye for DNA, was injected into the microchannel from the reservoir. Observation of the microchannel with an optical microscope confirmed that only the column 42 of the silica microbeads 41 emitted fluorescence as shown in FIG. It was confirmed that DNA was adsorbed to the silica microbeads 41 used in Example 1. No fluorescence was observed from the microchannels other than the column section 42, and it was confirmed that DNA was not adsorbed to the inner wall surface of the microchannel.
  • Example 2 Using the experimental system described in Example 1, adsorption and desorption of nucleic acids were tested. The experimental system was the same as above. The microbeads described in Example 1 were injected into the microchannel to form a column, and then the nucleic acid was injected. Lambda DNA was used as the nucleic acid. The adsorption of lambda DNA to the microbeads was confirmed using an optical microscope. Hot pure water at 60 ° C or higher was prepared and injected into the fine channel from the liquid reservoir. Desorption of lambda DNA from microbeads was confirmed. From the above, it was confirmed that the adsorption and desorption of nucleic acids to and from the microbeads was confirmed, and that the extraction of nucleic acids could be realized in the microchannel.
  • the present invention enables low-cost production as a microchip technology using microbeads that is not only effective for nucleic acid extraction but also useful as various reaction carriers.
  • New technology means that can suppress the formation of stagnation in the flow of fluid samples, facilitate the injection, filling, and transportation of microbeads, and reduce the generation of dust. And a new method for extracting nucleic acid using the same.

Abstract

低コストに作製、調製することができ、液体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、マイクロビーズの注入、充填、輸送を円滑に簡便に行うことができ、更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術手段とこれを用いる新しい核酸抽出方法を提供する。上下基板（１、２）の接合面に設けられた溝部（１１、２１）によって微細流路（３）が形成されるマイクロチップであって、微細流路（３）には、その断面の上下、左右又は上下左右の中央部に流路断面が縮小された隙間部（３１）が設けられており、マイクロビーズが堰止めされる。

Description

明細書 マイクロチップ、 核酸抽出用のキッ ト及び核酸の抽出方法 技術分野 本発明は、 マイクロチップ、 核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法に関する, 本出願は、 日本国において 2 0 0 3年 3月 2 4日に出願された日本特許出願番 号 2 0 0 3— 0 8 1 6 0 5を基礎として優先権を主張するものであり、 この出願 は参照することにより、 本出願に援用される。 背景技術 従来、 ガラス等の基板表面にリソグラフィ一等の微細加工技術によって深さ 1 0 0 ^i rn , 幅 5 0 0 iLi m程度までの大きさの溝を形成して、 この溝を液体や気体 の微細流路とし、 化学反応、 生化学反応、 溶媒抽出、 気液分離、 更にはこれらに 基づく微量成分の化学分析や非接触光学分析等を可能としたマイクロチップ技術 が知られている。
このマイクロチップ技術については、 本出願の発明者らによって、 微細流路内 に反応担体としてのマイクロビーズを挿入し、 かつ微細流路内にダム形状の堰止 め部を設けるようにした方策も提案されている （文献 1 ) 。
近年の分子遺伝子や分子生物学の進展とその医療等への応用の拡大に伴って、 液体試料中からの核酸の抽出が大変に重要な課題になっていることから、 マイク ロチップ技術を核酸の抽出に利用することが検討されてきており、 これまでにも、 シリ力ビーズを用いる方法ゃシリカマイクロピラーを用いる方法、 シリカフィル 夕を用いる方法等が提案されている （文献 2— 4 ) 。
しかしながら、 これまでのマイクロチップ技術においては、 例えばシリカマイ ク口ピラーやシリカフィルタを用いた核酸抽出の方法では高いコス卜で、 汚れた 場合に交換できないという基本的な問題があり、 また、 これまでのシリカ等のマ イク口ビーズを用いる方法においては、 微細流路内への注入のために大きな圧力 が必要であってビーズの充填が容易ではなかった。
そして、 マイクロビーズをダム形状の堰止め部により堰止める従来の方法にお いては、 液体試料の流れに澱みが発生しやすく、 シリカ等のマイクロビーズの輸 送を円滑に行うことが難しくなることがあるという問題があつた。
また、 従来では、 ガラス、 石英等をマイクロチップ基板として、 微細流路を形 成した場合には、 流路内にゴミが生じやすく、 しかもその除去が難しい場合があ るという問題もあった。
以下、 関連文献を示す。 これらの文献は参照することにより、 本出願に援用さ れる。
1 ： K. Sato et al. , Anal. Chem.72, 1144-1147 (2000)
2 ： L. Ceriot t i et al. , (2002) Proceedings of the micro TAS 2002 symposiu m, Nara, pp.175-177
3 ： J. Kim et al. , (2002) Proceedings of the micro TAS 2002 symposium, Na ra, pp.224-226
4 ： Q. Wu et al.,, (2002) Proceedings of the micro TAS 2002 symposium, Na ra, pp.198-200 発明の開示 そこで、 上述のような従来技術の問題を解消するために、 本発明の目的は、 核 酸の抽出に有効であるだけでなく、 各種の反応担体としても有用なマイク口ビー ズを用いるマイクロチップ技術として、 低コストに作製、 調製することができ、 流体試料の流れの澱みの発生が抑えられ、 マイクロビーズの注入、 充填、 輸送を 円滑に簡便に行うことができ、 更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技 術のマイクロチップと、 これを用いる新しい核酸抽出方法を提供することである。 上述の目的を達成するために、 本発明に係るマイクロチップは、 上下基板の接 合面に設けられた溝部によって微細流路が形成されており、 微細流路には、 その 断面の上下、 左右又は上下左右の中央部に流路断面が縮小された隙間部が設けら れている。 この隙間部は、 溝部内の突起部により形成されてもよい。 また、 隙間 部は、 上下基板の各々に設けた溝部内の突起部の対向により形成されてもよい。 また、 隙間部は、 一方の基板の溝部内への他方の基板の突起部の挿入により形成 されてもよい。 また、 隙間部は、 上下基板の少なくとも一方の可動突起部により その断面の大きさが可変とされてもよい。
また、 隙間部の断面の大きさは、 微細流路内に挿入したマイクロピーズを堰止 めする大きさである。 微細流路の内壁面は、 表面処理剤で修飾されてもよい。 また、 本発明に係る核酸抽出用のキットは、 上述のマイクロチップと、 表面水 酸基を持つマイクロビーズとを備える。 この表面水酸基を持つマイクロビーズは， 直径 1 0 m以下のシリカマイクロビーズ、 中空のシリカマイクロビーズ及び樹 脂マイクロビーズのうちの少なくとも 1種であってもよい。 内壁面に表面水酸基 を持つマイクロチップ微細流路は、 その表面水酸基が表面処理剤により被覆処理 されてもよい。 この表面処理剤は、 トリアルキルハロゲノシランを主成分とする シランカツプリング剤である。
更に、 本発明に係る核酸の抽出方法は、 上述の核酸抽出用のキットを用い、 マ イク口チップの微細流路内のマイクロビーズの表面に被処理液中の核酸を吸着さ せる。 更に、 核酸の吸着は、 カオトロピックイオンの存在下に行ってもよい。 図面の簡単な説明 図 1は、 マイクロチップを模式的に例示した分解斜視図である。
図 2 A及び図 2 Bは、 図 1の A及び B方向からの隙間部 3 1の断面図である。 図 3 A〜 3 Cは、 隙間部 3 1の他の例を示した断面図である。
図 4 A及び図 4 Bは、 更に、 別の隙間部 3 1の例を示した断面図である。
図 5は、 実施例としての D N Aの吸着について例示した光学顕微鏡写真の模式図 である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明に係るマイクロチップ、 核酸抽出用のキット及び核酸の抽出方法 の実施の形態について、 図面を参照して説明する。 ' 図 1及び 2は、 本発明に係るマイクロチップの部分的な構造を模式的に示すも のであり、 .図 1は、 下の基板 1と上の基板 2が分離された状態を ¾しており、 図 2は、 上下の基板 1、 2が接合した状態での微細流路 3に設けられた隙間部 3 1 について、 図 1の矢印 A及び Bの方向から見た部分断面を示している。
例えば、 図 1及び図 2に示すマイクロチップにおいては、 上下基板 1、 2の接 合面に設けられた溝部 1 1、 2 1によって微細流路 3が形成されている。 そして、 微細流路 3には、 その断面の上下の中央部に流路断面が縮小された隙間部 3 1が 設けられている。
より具体的には、 この図 1及び図 2の例の場合には、 上下の基板 1、 2の各溝 部 1 1、 2 1が対向することで微細流路 3が形成されるとともに、 各溝部 1 1、 2 1内に設けた突起部 1 2、 2 2が対向することによって隙間部 3 1が形成され るようにしている。
隙間部 3 1については、 微細流路 3の断面の中央部であればよく、 図 2に例示 したスリット状の開口のように、 上下の中央部だけでなく、 例えば図 3 Aに模式 的に示すように、 左右の中央部でも、 あるいは図 3 Bに示すように、 上下左右の 中央部でもよい。 もちろん、 この隙間部 3 1の断面形状も各種であってよく、 例 えば図 3 Cに示すように、 断面円形等の各種のものであってよい。 これらの形状 については、 マイクロチップの溝部 1 1、 2 1及び突起部 1 2、 2 2を形成する ための微細加工の手段やその条件、 更には、 微細流路内に注入するマイクロビー ズの種類や大きさ等を考慮して決めることができる。
そして、 隙間部 3 1の形成については、 上下の基板 1、 2の各々の溝部 1 1、 2 1内に設けた突起部 1 2、 2 2によるものでなくてもよい。 例えば図 4に示す ように、 微細流路 3そのものは、 例えば下側の基板 1に設けた溝部 1 1によって 形成し、 上側の基板 2は、 そのカバ一板として存在させ、 この微細流路 3の構造 において、 上側の基板 2に設けた突起部 2 3を溝部 1 1に挿入し、 このものを溝 部 1 1内の突起部 1 2と対向させることによって隙間部 3 1を形成することも可 能である。 もちろん、 隙間部 3 1については、 以上の突起部 1 2、 2 2、 2 3による構成 以外に様々であってよい。
また、 これらの突起部 1 2、 2 2、 2 3は、 基板 1、 2のリソグラフィーエツ チング等による微細加工によって形成するだけでなく、 例えばポリマの硬化によ る形成等の手段によるものとしてもよい。 更に微細流路 3に対しての外部からの 微小部材の作用、 更には、 微細流路 3そのものの変形等の手段によって隙間部 3 1を形成してもよい。
いずれの場合であっても、 本発明に'係るマイクロチップにおいては、 微細流路 3や隙間部 3 1の作製、 調製を簡便に、 低コストで行うことができ、 しかも、 微 細流路 3の断面の中央部に隙間部 3 1を設けることによって、 微細流路 3内にマ イク口ビーズを注入する場合に、 液体や気体等の流体の流れの澱みの発生を抑え, マイクロビーズの注入を円滑に、 しかも簡便に行うことを可能とするとともに、 マイクロビーズの堰止めも可能とする。
微細流路 3に設けられる隙間部 3 1については、 このようにマイクロビーズを 用いるものとしては、 その断面の大きさが微細流路 3内に注入したマイク口ピー ズを堰止めすることのできるものとする。 また、 この隙間部 3 1については、 例 えば上述の突起部、 あるいはこれと同様の機能を有する部材等を可動とし、 その 断面の大きさを可変とすることも考慮される。 断面の大きさを可変とした隙間部 3 1においては、 微細流路 3内のマイクロビーズを堰止めした後に、 その断面を 大きく拡大して、 マイクロビーズを下流域に移流させることを可能とする。 通常、 マイクロビーズの排出のためには、 注入とは逆方向に排出しなければならないが、 この断面可変の隙間部 3 1によれば、 注入と同じ順方向に排出することが可能に なる。
例えば、 上述のような本発明に係るマイクロチップにおいては、 その利用目的 や対象物の種類、 性質に応じて、 微細流路 3内に試料物質や不純物、 ゴミ等が付 着しないように、 その内壁面を表面処理剤で修飾することができる。 例えば、 ガ ラスや石英等から作製されたマイクロチップの場合には、 通常、 微細流路 3の内 壁表面には表面水酸基が存在し、 この表面水酸基が核酸等と結合して、 核酸等の 物質の抽出、 分離等を難しくすることがある。 このような場合には、 表面処理剤 によって表面水酸基を被覆して不活化させることが有効である。 本発明に係るマ イク口チップは、 マイクロピーズと組み合わせることによって特徴のある化学合 成、 あるいは分析用のキットとして極めて有用なものとなる。 特に、 本発明では、 このようなキットとして、 以上のようなマイクロチップと、 表面水酸基を持つマ イク口ビーズとを備える核酸抽出用のキットを提供する。
そして、 この場合の表面水酸基を持つマイクロビーズとしては、 直径 l O / m 以下のシリカマイクロビーズ、 中空のシリカマイクロビーズ、 及び表面に水酸基 が付与されたポリスチレン等の樹脂製のビーズが好適なものとして示される。 直 径が 1 0； m以上のシリカマイク口ビーズの場合には、 その比重の大きさによつ て微細流路 3での輸送が困難である。
また、 本発明の核酸抽出用のキットでは、 微細流路内壁面に表面水酸基を持つ ものに対しては、 この表面水酸基をシラン力ップリング剤で被覆処理することが 好ましい。
なかでも、 ハロゲン原子を一個有するトリアルキルハロゲノシラン、 すなわち 一般式が、
R i
Si X
で表わされる化合物を用いたシランカップリング剤が好ましい。 ここで、 式中の R i , R 2及び R 3は、 同一又は別異なアルキル基を示し、 Xは、 塩素原子等のハロ ゲン原子を示す。 塩素原子等のハロゲン原子を 2個以上有するシラン化合物の場 合には、 反応基であるハロゲン原子が内壁表面の水酸基と反応するだけでなく、 分子相互の重合反応等によってゴミを生成させることがあるため、 その使用には 制約がある。
核酸抽出の方法としては、 例えば図 1及び図 2のマイクロチップの例において、 液導入口部 4からマイクロビーズ含有液を注入して、 微細流路 3においてその隙 間部 3 1で堰止め、 次いで液導入口部 5より試料を導入してマイクロビーズに核 酸を吸着させる。 残余の液は排出口部 6より排出する。 この吸着によって核酸が 抽出されることになる。 吸着された核酸は、 脱着液の導入によってマイクロビー ズより脱着させることができる。 そして、 この核酸抽出は、 カオトロピックィォ ンの存在下に行うことが好適でもある。
本発明によって、 簡便に、 そして高効率で、 核酸の抽出が可能とされる。 以下に実施例を示し、 更に詳しく説明する。 もちろん、 以下の実施例によって 発明が限定されるものではない。
実施例 1 . マイクロビーズの輸送
中央部に堰止め構造を有する直径 5 0 μ πι、 長さ 6 0 mmの微細流路を有する ガラス製マイクロチップを用意した （図 1 ) 。 微細流路の上方と下方の両側に突 起部によるダム形状の堰止め構造の隙間部を形成した。 微細流路の中央の隙間部 は上下に 2 ΠΙ、 左右に 5 0 <u mのスリット状であった。 微細流路の片方の口を 注入口、 他方を排出口とし、 注入口に液貯めを設け、 排出口にマイクロチューブ を接続した。 排出口のマイクロチューブにはシリンジポンプを接続し、 シリンジ ポンプの動作によって液貯めに注入した液体が吸引され、 微小流路中に注入でき る実験システムを組み立てた。 ここで、 純水に懸濁したマイクロビーズを液貯め に注入し、 マイクロビーズの微小流路中での輸送を光学顕微鏡を用いて観察した マイクロビーズとして、 シリカマイクロビーズ （直径 1 0 m以下） 、 シリカマ イク口ビーズ （直径 1 0； m以上） 、 中空のシリカマイク口ビーズ （直径 2〜 2 0 m) 、 表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビーズ （直径 2 0 m) を用意した。 毎分 1 0 1の流速で吸引した。 シリカマイクロビーズ （直径 1 0 ^ m以上） 以外のマイクロビーズはすべて微細流路内を良好に輸送され、 堰 止め構造の隙間部の直前部分にビーズのカラムを形成することができた。 他方.、 直径 1 0ミクロンよりも大きなシリカマイク口ビーズで、 同様な実験を行ったと ころ、 微小流路の途中で輸送が止まり、 カラムの形成が不十分であった。 特に、 中空のシリカマイクロビーズと表面に水酸基を付加したポリスチレンマイクロビ —ズは、 シリカナノビーズ （直径が 1 m以下のビーズ） 並みに輸送が良好であ つた。 シリンジポンプに純水を入れ、 微細流路に注入したところ、 シリカマイクロピ ーズ （直径 1 0 μπι以上）'以外のマイクロビーズは、 微細流路中を輸送され、 液 貯めに排出されることができた。
実施例 2. 微小流路の内壁の表面修飾処理
ガラスや石英等から作製したマイクロチップの場合には、 微細流路の内壁表面 への核酸の付着を防ぐため、 微細流路の内壁の表面水酸基を被覆する必要がある。 表面水酸基の被覆には、 アルキル基と反応基を持つシラン力ップリング剤等によ る表面修飾処理が広く利用されている。 したがって、 微小流路の内壁処理もシラ ンカップリング剤を用いて表面修飾処理を施せばよい。 しかしながら、 通常用い られている oc decyltrichlorosilaneは、 表面修飾のための反応基である塩素基 を 3つ持ち、 微細流路の内壁の表面水酸基と反応するだけでなく、 分子同士の重 合により高分子を形成する。 したがって、 octadecyltrichlorosilaneの分子同士 が反応し、 高分子化することによってゴミを生じる。 微細流路でなく、 スライド ガラスのような平板な基板の表面修飾処理では生じたゴミは溶媒で洗い流すこと ができ、 問題は生じない。 しかしながら、 微細流路の内壁の処理では生じたゴミ を容易には洗い流すことができない。 微細流路内に堰止め構造が設けられている 場合は特に取り除くのが難しい。 微細流路中に残ったゴミは、 微細流路中での液 体やビーズの輸送の障害となるばかりでなく、 核酸の吸着過程にも支障となる。 また、 反応基である塩素基が 2っでぁる^( 10!"0(^1^11^1311&1^も広く用ぃられ ているが、 沸点が低く （70° C) 、 揮発性が高いために安全性が低い上に、 反 応基が 2つであるため、 分子同士の重合による高分子化を完全には防ぐことがで さない。
そこで、 反応基が単数で原理的に高分子化せず、 沸点が高く揮発性が低いこと により安全性が高く、 常温で液体の扱いやすい表面修飾処理剤を検討した。 例え ば trietylchlorosilaneは、 反応基部位である塩素基が 1つであり、 原理的に高分 子化をしない。 加えて、 沸点が 145 ° C、 融点が一 50 ° Cであるため、 常温 で揮発性が低く、 液体であるため、 toluene等の溶媒への希釈が容易であり、 扱い やすい。
tdethylclilorosi lane又は octadecyltrichlorosilaneを用いて微細流路の内壁 の表面修飾処理を行った。 脱水 tolueneを溶媒として用い、 各々の 5 %溶液を調製 した。 実施例 1. で述べた実験システムを用いて、 両者を比較した。 調製された 溶液を液貯めに注入し、 シリンジポンプで吸引することにより、 微細流路中に溶 液を注入した。 流量は毎分 1 0 1 とし、 5 0 X 1の溶液を注入し、 表面修飾を 行った。 そして、 脱水 tolueneを 5 0 μ 1以上注入し、 表面処理後の微細流路を洗 浄した。 その洗浄中の微細流路を光学顕微鏡で観察した。 octadecyltrichlorosi laneでは微細流路内にゴミを生じたが、 triethylchlorosi laneでは生じなかった。 triethylchlorosilaneでは更に濃度を 1 0 %に上げ、 同様の処理を試した。 ゴミ は生じなかった。
実施例 3. 微細流路内での核酸の抽出
実施例 1. で述べた実験システムを用いて核酸の吸着を試した。 微細流路の内 壁表面は 10 % triethylchlorosilaneを用いて実施例 2. で述べたとおりに行つ た。 核酸として C o 1 E 1 DNAを用いた。 カオトロピックイオン溶液として飽 和ヨウ化ナトリウム水溶液を用いた。 実施例 1. で述べたマイクロビーズ 0. 2 gを 1 1の割合で、 ヨウ化ナトリウム溶液中に懸濁し、 2 5 1を液貯めから微 細流路中に注入し、 カラムを形成させた。 溶媒としてヨウ化ナトリウムを用い、 1 %DNA溶液を調製し、 液貯めから微細流路内に注入した。 次に、 DNAの蛍 光染色色素である SYBRGreen I溶液を液貯めから微細流路内に注入した。 微細流路 を光学顕微鏡にて観察したところ、 図 5に示すように、 シリカマイクロビーズ 4 1のカラム部 42のみが蛍光を発していることが確認された。 実施例 1. で用い たシリカマイクロビーズ 41に DN Aが吸着することが確かめられた。 カラム部 42以外の微細流路からは蛍光は見られず、 微細流路の内壁表面への D N Aの吸 着が生じないことも確認された。
実施例 1. で述べた実験システムを用いて核酸の吸着と脱着を試した。 実験シ ステムは上述と同様とした。 微細流路中に実施例 1. で述べたマイクロビーズを 注入し、 カラムを形成した後、 核酸を注入した。 核酸としてはラムダ DNAを用 いた。 マイクロビーズへのラムダ D N Aの吸着を光学顕微鏡を用いて確認した。 60 ° C以上の温純水を用意し、 液貯めより微細流路に注入した。 マイクロビー ズからラムダ D N Aの脱着を確認した。 以上より、 核酸のマイクロビーズへの吸着と脱着が確認されたことにより、 核 酸の抽出を微細流路中で実現できることがわかった。
なお、 本発明は、 図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものでは なく、 添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、 様々な変更、 置換又 はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。 産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 本発明によって、 核酸の抽出に有効であるだけで なく、 各種の反応担体としても有用なマイクロビ一ズを用いるマイクロチップ技 術として、 低コストに作製、 調製することができ、 流体試料の流れの澱みの発生 が抑えられ、 マイクロビーズの注入、 充填、 輸送を円滑に簡便に行うことができ、 更にはゴミの発生も抑えることのできる新しい技術手段とこれを用いる新しい核 酸抽出方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 上下基 の接合面に設けられた溝部によって微細流路が形成されるマイクロ チップであって、
上記微細流路には、 その断面の上下、 左右又は上下左右の中央部に流路断面が 縮小された隙間部が設けられていることを特徴とするマイク口チップ。
2 . 上記隙間部は、 上記溝部内の突起部により形成されていることを特徴とする 請求の範囲第 1項記載のマイクロチップ。
3 . 上記上下基板の各々に設けた溝部内の突起部の対向により隙間部が形成され ていることを特徴とする請求の範囲第 2項記載のマイクロチップ。
4 . 上記隙間部は、 一方の基板の溝部内への他方の基板の突起部の挿入により形 成されていることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか 1項記載 のマイクロチップ。
5 . 上記隙間部は、 上記上下基板の少なくとも一方の可動突起部によりその断 面の大きさが可変とされていることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項の いずれか 1項記載のマイクロチップ。
6 . 上記隙間部の断面の大きさは、 上記微細流路内に挿入したマイクロビーズを 堰止めする大きさであることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれ か 1項記載のマイクロチップ。
7 . 上記微細流路の内壁面は、 表面処理剤で修飾されていることを特徴とする請 求の範囲第 1項乃至第 6項のいずれか 1項記載のマイクロチップ。
8 . 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか 1項記載のマイクロチップと、 表面水酸基を持つマイクロビーズとを備えている核酸抽出用のキット。
9 . 上記表面水酸基を持つマイクロビーズは、 直径 1 0 i m以下のシリカマイク 口ビーズ、 中空のシリカマイクロビ一ズ及ぴ樹脂マイク口ビーズのうちの少なく とも 1種であることを特徴とする請求の範囲第 8項記載の核酸抽出用のキット。
1 0 . 上記内壁面に表面水酸基を持つマイクロチップ微細流路は、 その表面水酸 基が表面処理剤により被覆処理されていることを特徴とする請求の範囲第 8又は 第 9項記載の核酸抽出用のキット。
1 1 . 上記表面処理剤は、 トリアルキルハロゲノシランを主成分とするシラン力 ップリング剤であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項記載の核酸抽出用のキ ッ卜。
1 2 . 請求の範囲第 8項乃至第 1 1項のいずれか 1項記載の核酸抽出用のキット を用いる核酸の抽出方法であって、
マイクロチップの微細流路内のマイク口ビーズの表面に被処理液中の核酸を吸 着させることを特徴とする核酸の抽出方法。
1 3 . カオトロピックイオンの存在下に行うことを特徴とする請求の範囲第 1 2 項記載の核酸の抽出方法。
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