WO2004074827A1

WO2004074827A1 - バイオセンサ用測定装置及びこれを用いた測定方法

Info

Publication number: WO2004074827A1
Application number: PCT/JP2004/001848
Authority: WO
Inventors: Mariko Miyashita; Yuko Taniike; Toshihiko Yoshioka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2004-09-02
Also published as: JPWO2004074827A1; EP1596189A1; CN1697970A; US20050176133A1

Abstract

　試料の物性に影響されることなく試料中の特定成分を簡便に精度良く短時間で測定することができるバイオセンサ用測定装置及び測定法を提供する。本発明に係るバイオセンサ用測定装置は、試料供給口および測定極と対極とを含む電極系、ならびに試料供給路の少なくとも一部に試料へ光を照射可能な部位を備えるバイオセンサを用い、前記試料の電気的変化と光学的変化とを検知し、試料の物理的な因子を判定して測定値を補正することが可能である。

Description

明細書バイオセンサ用測定装置及びこれを用いた測定方法技術分野

本発明は、試料中に含まれる特定物質の濃度を簡便に精度良く短時間で測定することができるバイオセンサ用測定装置及びそれを用いた測定法に関する。背景技術

従来、試料の希釈や攪拌を行うことなく試料中の特定物質を簡易に精度良く測定し得るバイオセンサとして、例えば特開平 3 - 2 0 2 7 6 4 号公報において提案されているものがある。

このバイオセンサは、絶縁性基板上に電極系を形成し、電極系上に親水性高分子、酸化還元酵素および電子受容体の混合物で酵素反応層を形成して得られる。そして前記酸化還元酵素と電子受容体と試料との反応による物質濃度変化を、前記電極系で電気化学的に検知し、試料中の特定成分を測定するものである。

このバイォセンサの測定動作について、グルコースセンサとして用いる場合を例にして説明する。グルコースを含む試料をグルコースセンサへ供給すると、酵素反応層が試料によって溶解する。グルコースは、酵素反応層中の酸化還元酵素であるグルコースォキシダーゼ（G O x ) によって酸化され、この時、酵素反応層中の電子受容体が還元される。所定の時間が経過した後、測定極と対極間に適当な一定電圧を印加すると. 電子受容体の還元体が酸化される。この酸化時の酸化電流値を測定することにより、試料中のグルコース濃度を定量することができる。しかし、特開平 3— 2 0 2 7 6 4号公報記載のバイオセンサの場合、試料中に試料の物性に影響を与える物質の存在により、測定結果が影響を受ける場合があった。例えば、試料が血液の場合、へマトクリット値は検体によつて 2 0〜 3 0 %程度の差があり、同じ量の試料を用いても含まれる固形成分である血球と液体成分の容積比が異なる。したがゥて，へマトクリット値が高くなると血液の粘性が高まることや、血球成分の電極や酵素への吸着の度合いが大きくなることなどが影響し、センサの応答性が低下するといつた問題があった。

これに対し、試料中に測定を妨害する物質が含まれている場合を想定して、特開平 5— 3 4 0 9 1 5号公報には、絶縁性の基板上に主電極系と副電極系を形成し、前記主電極系上に酵素を含有する反応層を形成したバイォセンサが開示されている。前記主電極系における電気特性変化と前記副電極系における電気特性変化を検知した時間的差異をもとに試料の物性を判定することができる。

このバイォセンサの測定動作について、ダルコ一スセンサとして用いる場合を例にして説明する。測定を妨害する物質を含む試料として血液 (全血）をセンサに供給すると、まず副電極系に到達し、副電極系の測定極と対極間のィンピーダンスが低下する。つぎに、血液は主電極系上に到達し、主電極系の反応層が溶解すると、主電極系の測定極と対極間のインピーダンスが低下する。反応層が血液に溶解すると、血液中のグルコースが G O Xによって酸化されると同時に反応層中に共存させておいた電子受容体が還元される。所定の時間が経過した後、測定極と対極間に適当な一定電圧を印加すると、電子受容体の還元体が酸化される。この酸化時の酸化電流値を測定することにより、試料中のグルコース濃度を定量することができる。

このバイオセンサで、 2 0〜 6 0 %のへマトクリツト値（血液中の固体と液体との容積比）を有する血液を用いて酸化電流値を測定したところ、へマトクリット値の増加に伴って酸化電流値が低下した。さらに副電極系と主電極系においてインピーダンス変化を検知した時間の差を t とすると、上記へマトクリツト値の変化に比例して tの増加が認められた。そこで、酸化電流値を前記 t因子によって補正すると、へマトクリット値に依存せずに血液中のグルコースを正確に定量することが可能である。すなわち、このバイオセンサでは主電極系とは別に副電極系を設けることによって、副電極系と主電極系のインピーダンス変化の時間差から試料の粘度を予測し、電流値を補正することが可能である。

しかし、特開平 5 - 3 4 0 9 1 5号公報記載の技術においては、電流値の補正のために時間差 tを利用していたため、測定時間そのものを短縮することに限界があるという問題があった。

また、特開平 9— 1 0 5 7 2 0号公報においては、血液中の特定成分およびへマトクリツ卜値のいずれも光学的に測定するためのバイォセンザが開示されているが、それぞれの光学的測定に用いる別個のサイ卜として毛管室の部分とおよび試薬部の部分とが必要であり，これらの部分を試料で充分に満たすことが必要となることから、測定に必要な試料の量を減らすことが困難であるという問題があった。

そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料の物性に影響を与える物質の存在がある場合でも、前記物質に影響されることなく正確な測定が可能なバイオセンサ用測定装置、及びそれを用いた測定方法を提供することを目的とする。

さらに本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料の物性を判定するための手段とセンサ応答を検出するための手段とを別々にすることによつて、迅速で、かつ試料の物性の影響を受けることなく正確な測定が可能なパイォセンサ用測定装置及びそれを用いた測定方法を提供することを目的とする。発明の開示

本発明は、測定極と対極と含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイオセンサを脱着自在に支持する支持部；前記電極系に電気的に接続される複数の接続端子；前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加しかつ前記接続端子を介して前記電極系の電気信号の変化を計測する電気信号計測回路；前記部位に光を照射し得る位置に設けられた光源；前記部位からの光を受ける受光部；前記受光部を介して前記部位における光学的変化を計測する光学信号計測回路；前記電気信号の変化と前記光学的変化を演算する演算部；ならびに前記演算の結果を表示する表示部を備え、

前記試料供給路に光を照射することにより、試料に含まれる固体と液体との容積比を計測するバイオセンサ用測定装置に関する。

前記バイオセンサ用測定装置においては、前記試料が血液であり、前記容積比がへマトクリツト値であるのが好ましい。

また、本発明は、

( a ) 測定極と対極とを含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイォセンサを固定する工程、

( ) 前記バイォセンサの電極系を測定用の接続端子に接続する工程、

( c ) 前記バイオセンサに試料を供給する工程、

( d ) 光源を点灯して前記部位に光を照射する工程、

( e ) 受光部を介して前記部位の光学的変化を計測する工程、

( f ) 前記工程（ e ) の測定結果を演算する工程、

( g ) 所定時間経過後、前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加する工程、 ( h ) 前記接続端子を介して前記電極系に流れる電流を計測する工程、

( i ) 前記工程（h ) の計測結果を演算する工程、および

( j ) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料における固体と液体との容積比を計測し、前記工程（ i ) の測定結果を補正する工程を含む特定成分の測定方法にも闋する。

前記特定成分の測定方法は、さらに（k ) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料供給路における前記試料の存在を検知する工程を含むのが好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施の形態に係るバイオセンサの上面図である。図 2は本発明の実施の形態に係るパイォセンサの断面図である。図 3は、本発明の実施の形態に係るパイォセンサ用測定装置の概略斜視図である _β

図 4は、図 2に示すバイオセンサ用測定装置にバイオセンサを支持した様子を示す斜視図である _β

図 5は本発明の実施の形饞に係るバイオセンサ用測定 ¾Βの構成を示すプロック図である。

図 6は、本発明の別の実施の形態に係るバイオセンサの断面図である _£ 発明を実施するための最良の形態

上述のような課題を解決すぺく、本発明は、測定極と対極とを含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するパィォセンサを脱着自在に支持する支持部；前記電極系に電気的に接続される複数の接続端子；前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加しかつ前記接続端子を介して前記電極系の電気信号の変化を計測する電気信号計測回路；前記部位に光を照射し得る位置に設けられた光源；前記部位からの光を受ける受光部；前記受光部を介して前記部位における光学的変化を計測する光学信号計測回路；前記電気信号の変化と前記光学的変化を演算する演算部；ならびに前記演算の結果を表示する表示部を備え、前記試料供給路に光を照射することにより、試料に含まれる固体と液体との容積比を計測するバイオセンサ用測定装置を提供する。

すなわち、本発明に係るバイオセンサ用測定装置は、光学式と電極式の組合せを用いることに特徴を有し、具体的には、測定そのものは電極式で行い、血液中のへマトクリツト値の影響を光学式で補正するものである。これにより、電極式の測定サイトと光学式の測定サイトとを近くすることができ、また、反射光を利用すれば、同じサイトを電極式の測定サイトおよび光学式の測定サイ卜として使用することもできる。これは、用いるバイオセンサのコンパク卜化につながり有効である。

本発明において用いることのできるバイオセンサは、絶縁性基板上に試料供給口、前記試料供給口と連通した試料供給路、前記試料供給路内に設けられた測定極と対極とを含む電極系、および酵素を含む試薬部とを備え少なくとも前記電極系の一部と少なくとも前記試薬部の一部とがそれぞれ試料供給路内に露出し、さらに前記試料供給路の少なくとも一部に、前記試料供給路内にある試料に対して光を照射可能な部位（光照射部位) を有する。

前記試薬部は、前記電極系の近傍に設けられていることが好ましい。また、前記試薬部は、測定極または対極を構成する導電性材料と混合した状態で設けられていてもよい。

また、試料供給路内に設けられた電極系は、前記光照射部位よりも前記試料供給口側に位置させる。前記電極系を、前記光照射部位よりも試料供給口側に位置するように配置すると、光学的変化により試料の存在の有無を判断することができ、試料が充分に供給されたことを検知してから、試料中の特定成分の測定することが可能となる。

また、前記光照射部位を電極系の上方に位置するように配置すると、試料供給路を短く設計することが可能となり、測定に必要な試料の量を減らすことも可能である。なお、本明細書では、絶縁性基板の表面と垂直な方向において、試料供給路に面している方向を「上方」とする。前記光照射部位に光を到達させるためには、バイオセンサを構成する部材の少なくとも一部を光透過性材料で構成すればよい。

前記バイォセンサを用いれば、本発明に係るバイオセンサ用測定装置によって試料供給路に光を照射することにより、試料に含まれる固体と液体との容積比を計測することができる。

前記試料としては、物性に影響を与える物質の存在を無視することができない体液、特に血液を用いるのが好ましく、この場合、前記容積比はへマトクリツト値である。

また、本発明に係るバイォセンサ用測定装置を用いた特定成分の測定方法にも関し、当該測定方法は、

( a ) 測定極と対極とを含む電極系およぴ外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイオセンサを固定する工程、

( b ) 前記バイオセンサの電極系を測定用の接続端子に接続する工程、

( c ) 前記バイォセンサに試料を供給する工程、

( d ) 光源を点灯して前記部位に光を照射する工程、

( f ) 前記工程（ e ) の測定結果を演算する工程、

( g ) 所定時間経過後、前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加する工程、

( h ) 前記接続端子を介して前記電極系に流れる電流を計測する工程、 ( i ) 前記工程（h ) の計測結果を演算する工程、および ( j ) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料における固体と液体との容積比を計測し、前記工程（ i ) の測定結果を補正する工程を含む。前記特定成分の測定方法は、さらに、（k) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料供給路における前記試料の存在を検知する工程を含むのが好ましい。

本発明に係る特定成分の測定方法は、前記工程（ j ) の代わりに前記工程（k) のみを有してもよい。この場合の本発明に係る特定成分の測定方法は、

(a) 測定極と対極とを含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイオセンサを固定する工程、

(b) 前記バイオセンサの電極系を測定用の接続端子に接続する工程、 (c ) 前記バイオセンサに試料を供給する工程、

(d) 光源を点灯して前記部位に光を照射する工程、

( e) 受光部を介して前記部位の光学的変化を計測する工程、

( f ) 前記工程（e) の測定結果を演算する工程、

(g) 所定時間経過後、前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加する工程、

(h) 前記接続端子を介して前記電極系に流れる電流を計測する工程、 ( i ) 前記工程（h) の計測結果を演算する工程、および

(k) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料供給路における前記試料の存在を検知する工程を含む。実施の形態 1

図 1は、本発明において用いることのできるバイオセンサ 1の概観を示す上面図である。図 1では、中心線を一点鎖線で示した。また、図 2 は、図 1の一点鎖線におけるバイオセンサの断面を示す図である。図 1 および図 2を参照しながら本発明におけるバイオセンサの作製方法を説明する。

まず、樹脂（ポリエチレンテレフタレート（P E T ) ) 製の絶縁性基板 2にスクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、リード 3を形成する ₍ つぎに、樹脂バインダ一と導電性カーボンとを含むペーストを印刷して測定極 4を形成し、続いて絶縁性ペースト（レジスト）を印刷して絶縁層 5を形成する。最後に、再び樹脂バインダーと導電性カーボンとを含むペーストを印刷して対極 6を形成する。このとき、絶縁層 5は測定極 4の面積を規定している。

続いて測定極 4および対極 6からなる電極系上に、酵素と電子受容体とを含む試薬部 1 3を形成する。さらに、絶縁性基板 2、樹脂製のスぺーサ 7、および空気孔 9を有するカバー 8を順次接着し、バイオセンサ 1を完成する。

このとき、カバ一 8には透明な樹脂、たとえばポリエチレンテレフタレート（P E T ) を用いる。試料は試料供給口 1 0に接触させるだけで，毛細管現象によって、スぺーサ 7およびカバ一 8によって形成される試料供給路 1 1内に導入され試薬部 1 3に到達する。実施の形態 2

図 3は本発明の実施の形態に係るバイオセンサ用測定装置の概観を示す斜視図である。図 3において、バイオセンサ用測定装置 1 0 1には支持部 1 5が設けられており、ここにバイオセンサ 1を挿入することによつて装着、支持される。バイオセンサ 1が装着された様子を図 4に示した。バイオセンサ 1が支持部 1 5に挿入されると、測定装置 1 0 1による計測準備が完了する。測定装置 1 0 1には表示部 1 4が設けられている。次に、ランセットを用い、手指の先端部を先刺し、手指から血液が滲出することを確認した後、血液をバイオセンサ 1の試料供給口 1 0に接触させ、バイオセンサ 1内部に導入する。バイオセンサ 1内部に導入された血液は、試薬部 1 3において酵素と反応する。また、光を照射することにより、血液中の固体と液体との容積比を求めることができる。なお、図示していないが、測定装置 1 0 1には、電極系にそれぞれ電気的に接続される複数の接続端子、接続端子を介して前記電極系に電圧を印加しかつ前記接続端子を介して前記電極系の電気的信号の変化を計測する電気信号計測回路、光源、受光部、前記受光部を介して光学的変化を計測する光学信号計測回路、さらに前記電気信号の変化と前記光学的変化を演算する演算部が備えられている。実施の形態 3

図 5は、バイオセンサ 1を含む本発明に係る測定装置 1 0 1の構成を示す図である。図 5を参照しながら、本発明に係る特定成分の測定方法を説明する。

まず、バイオセンサ 1を測定装置 1 0 1の支持部 1 5に挿入して固定する（工程 ( a ) ) 支持部 1 5の内側にはバイォセンサ 1のリード 3 に接触する位置に接続端子 1 6が設けられており、バイオセンサ 1が装着されることによってこの接続端子 1 6とリード 3とを接続する（工程 ( b ) ) 。

この工程が完了すると、バイオセンサ 1の試料供給口（図 2の 1 0 ) から試料を供給する（工程（ c ) ) 。さらに光源 1 7を点灯する（工程

( d ) ) 。このとき光源 1 7は、図 2に示すように測定装置 1 0 1内に揷入されたバイオセンサ 1の上部、すなわち所定の部位（光照射部位）

1 2を照射することができる位置に設置されている。光照射部位 1 2は、試料供給路 1 1を覆う透明の力パー 8に.設けられ. 試料供給口 1 0から向かって対極 5の奥側の端部でかつ空気孔 9より手前に位置している。

次に、光源 1 7より光照射部位 1 2に照射した光を受光部 1 8で受光し、その光学的変化の計測を開始する（工程（e ) ) 。この計測は、光学信号計測回路 1 9で行い、得られた計測値に基づいて、演算部 2 1で試料の固体と液体との容積比を求める（工程（ f ) ) 。

また、本発明に係る特定成分の測定方法においては、試料供給口 1 0 から試料を試料供給路 1 1に導入し、試料が光照射部位 1 2に到達すると、受光部 1 8で光学的変化を検知することによって、演算部 2 1においてバイオセンサ 1における測定に充分な量の試料が供給されたことを判断する（工程（ j ) ) ことができる。

試料が試料供給路 1 1に導入されると、試薬部 1 3内に含まれる酵素と試料中の特定物質である基質との反応によって、電子受容体の酸化還元状態が変化する。続いて、所定時間経過後、電気信号計測回路 2 0から電極間に電圧を印加すること（工程（g ) ) によって生じる電子受容体の電気化学的な酸化還元反応で得られる電流値を、前出の電気信号計測回路 2 0において測定する（工程（li ) ) 。そのとき、同時に、受光部 1 8での散乱光強度または反射光強度を計測することによって、試料に含まれる固体と液体との容積比を判定し、電流値を補正する。前記判定と電流値補正は演算部 2 1において行う。

工程（h ) で得られた数値は演算部 2 1で試料の数値情報に変換され (工程（ i ) ) 、表示部 1 4を用い表示される。表示部 1 4で表示される数値は、血糖値、血漿量（試料中の液体量）、へマトクリット値である。

なお、本実施の形態では、電極系が光照射部位よりも試料供給口 1 0 側に位置する場合について示したが、図 6のように、光照射部位を電極系の上方に設けてもよい。このようにすると、試料供給路を短くすることができる。なお、図 2における符号が示す構成要素と同じ構成要素については、図 2においても同じ符号で示した。実施例 1

上記実施の形態 1において説明したバイオセンサ 1 と上記実施の形態 3において説明した測定装置 1 0 1を用い、試料である血液中のダルコース濃度を測定した。

バイオセンサ 1の試薬部 1 3は以下のようにして作製した。まず、酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼと電子受容体であるフェリシアン化力リゥムとを含む水溶液を滴下し、乾燥することにより酵素層を作製した。さらに、試料の吸引を容易にするために、レシチンを含んだ溶液を前記酵素層上に滴下し、乾燥することにより酵素層の表面を親水処理した。

ここで、 1 0 0 m g Z d 1 のグルコース濃度を有し、あらかじめ規定した数種類のへマトクリツト値を有するように調整した血液を、測定装置 1 0 1に装着したバイオセンサ 1に点着し、点着直後の波長 ( λ ) が 5 5 0 n mの反射光強度を測定した。その結果、へマトクリツ卜値と反射光強度に相関関係を認め、へマトクリット値の増大に伴い反射光強度が低下した。

ここで、へマトクリツト値の補正に 5 5 0 n mの反射光を用いた理由を説明する。へマトクリツト値は血液中の固体と液体との容積比であるが、その固体成分のほとんどは赤血球である。赤血球中に存在するへモグロビンには、酸素と結合していないデォキシヘモグロビン（吸収極大： 5 5 5 n m) および酸素と結合しているォキシヘモグロビン（吸収極大： 5 7 7、 5 4 0 n m) がある。それぞれ可視領域に吸収極大を有しているが、酸素との結合状態によりその吸収極大波長が異なることから. デォキシへモグロビンとォキシヘモグロビンの吸収スぺクトルの等吸収点（ 5 2 0、 5 5 0、 5 7 0、 5 8 5 n m付近）の波長を用いて血液中のへモグロビン濃度を計測することが望ましい。

このようにすると、酸素との結合状態に依存することなく正確にへモグロビン量を測定することが可能である。本実施例においては、等吸収点の中でも吸光度が大きい 5 5 0 n mを選択したが、これに限定されるものではない。また、反射光強度とへマトクリット値との相関関係は使用するバイォセンサの材料や構成に依存するものである。

また、同じ血液を用いて、所定の時間 t秒後に測定極 4に 5 0 0 m V ( v s . 対極 6 ) の電位を印加し、印加から 5秒後の電流値を計測したところ、あらかじめ規定したへマトクリット値の増大に伴い、電流値が低下した。これらの結果から、反射光強度一へマトクリット値一電流値の相関関係を決定し、補正テーブルを得た。

この補正テーブルを使用した場合と使用しなかつた場合を比較すると- 使用した場合の方がへマトクリツト値による影響が少なくなつた。

上記実施の形態 1においては、透明な P E Tをカバー 8として用いることで、照射部試料供給路 1 1に、試料に光を照射可能な部位を設けたが、試料供給路 1 1を構成する部材の一部あるいは全てに光透過性材料を用いてもよい。光透過性材料としては、ポリエチレンテレフ夕レートなどの樹脂ゃガラスなどが適している。

また、バイオセンサを構成する部材として光透過性材料を用いない場合でも、切り欠き部を設けるなどして試料に光が照射可能な部位を設けることができる。受光部 1 8を散乱光や反射光を検出可能な位置に設置したが、透過光を検出可能な位置に設置してもよい。さらに実施の形態 1で示した測定装置に加えて、光源の光路 L上に分光する手段を設けることによって特定の波長を照射してもよい。

上記バイォセンサおよびバイオセンサ用測定装置によって判定可能な試料の特性としては、試料の色、粘度および浮遊固形物量（不溶物も含む）などがあげられる。この特性を判定することにより試料中の特定成分を測定することができる。例えば、試料の色の違いを検出することができれば、例えば血糖自己測定器の動作評価に用いられる標準液と血液の区別をすることが可能となる。産業上の利用の可能性

以上のように、本発明によると、試料の物性に影響されることなく試料中の特定成分を簡便に精度よくかつ短時間で測定するこができるバイォセンサ用測定装置、および特定成分の測定方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 測定極と対極とを含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイオセンサを脱着自在に支持する支持部；前記電極系に電気的に接続される複数の接続端子；前記接続端子を介して前記電極系に電圧を印加しかつ前記接続端子を介して前記電極系の電気信号の変化を計測する電気信号計測回路；前記部位に光を照射し得る位置に設けられた光源；前記部位からの光を受ける受光部；前記受光部を介して前記部位における光学的変化を計測する光学信号計測回路；前記電気信号の変化と前記光学的変化を演算する演算部；ならびに前記演算の結果を表示する表示部を備え、

前記試料供給路に光を照射することにより、試料に含まれる固体と液体との容積比を計測するバイオセンサ用測定装置。

2 . 前記試料が血液であり、前記容積比がへマトクリット値である請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ用測定装置。

3 . ( a ) 測定極と対極とを含む電極系および外部から光照射可能な部位を有する試料供給路を具備するバイォセンサを固定する工程、

( b ) 前記バイォセンサの電極系を測定用の接続端子に接続する工程、

( c ) 前記バイオセンサに試料を供給する工程、

( d ) 光源を点灯して前記部位に光を照射する工程、

( f ) 前記工程（ e ) の測定結果を演算する工程、

( h ) 前記接続端子を介して前記電極系に流れる電流を計測する工程、 ( i ) 前記工程（h ) の計測結果を演算する工程、および ( j ) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料における固体と液体との容積比を計測し、前記工程（ i ) の測定結果を補正する工程を含む特定成分の測定方法。

4. (k) 前記工程（ f ) の測定結果から前記試料供給路における前記試料の存在を検知する工程を含む請求の範囲第 3項記載の特定成分の測定方法。