WO2002076504A1 - Remedes contre les affections intestinales inflammatoires - Google Patents

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Mamoru Watanabe
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Definitions

  • the present invention relates to a medicament comprising a substance having a biological activity of AILIM (activation inducible lymphocyte immunomodulatory mole cule; also referred to as “IC0S (inducible co-stimulator) j), particularly an activity of controlling AILIM-mediated signal transduction.
  • AILIM activation inducible lymphocyte immunomodulatory mole cule
  • IC0S inducible co-stimulator
  • the present invention controls (eg, suppresses) the proliferation, cell death (apoptosis), or immune cytolysis of AILIM-expressing cells, or cytokines induced by AILIM-expressing cells.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a substance having an activity of controlling (for example, suppressing) the production of (for example, Inuichiferon r or Inuichi Leukin 4).
  • the present invention comprises a substance having an activity of controlling AILIM-mediated signal transduction, particularly preferably a substance that induces cell death (cell death; apoptosis or depletion) of AILIM-expressing cells,
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for suppressing, treating or preventing diseases associated with abnormal intestinal immunity (eg, colitis (ulcerative colitis, etc.), inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, and dietary allergy).
  • diseases associated with abnormal intestinal immunity eg, colitis (ulcerative colitis, etc.), inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, and dietary allergy.
  • the gastrointestinal mucosa is constantly exposed not only to food-derived antigens and intestinal flora, but also to various antigens that are harmful to the living organism, such as pathogenic microorganisms.
  • the gastrointestinal mucosa exerts its cytotoxic activity against antigens that are harmful to such organisms, and maintains the ability to secrete antibodies to neutralize toxins, while maintaining food and other Suppresses excessive immune response against various antigens and intestinal flora It has a secondary immune system (referred to as gastrointestinal mucosal immune system or intestinal immunity system).
  • gastrointestinal mucosal immune system or intestinal immunity system a secondary immune system
  • normal mucosal immunity balances a positive immune response to pathogens with a negative immune response to non-pathogenic antigens.
  • IBD Inflammatory Bowel Disease
  • the most common inflammatory bowel diseases are Crohn's disease (CD) and colitis (colitis; in particular, ulcerative colitis (UC)), both of which are pathogens.
  • Symptoms include chronic recurrent abdominal pain attacks and diarrhea that cannot be identified, which can significantly affect the daily lives of children and young people over a long period of time.
  • colitis especially ulcerative colitis
  • a variety of possibilities have been discussed for the pathogenesis of inflammatory bowel disease, including genetic and environmental factors, but recently, abnormalities in intestinal immunity (gastrointestinal mucosal immunity) may be the cause. Is getting bigger. In other words, for some reason, the intestinal mucosa induces an excessive immune response to antigens in the intestinal tract that is normally non-pathogenic and has low immunogenicity, resulting in inflammation and allergy, resulting in inflammatory The mechanism is that intestinal disease occurs.
  • intestinal inflammation and allergy caused by this abnormality of intestinal immunity is supported by analysis of the T cell function and differentiation of patients and analysis of cytokine production patterns in lesions and serum. Furthermore, analysis of various animal models of inflammatory bowel disease recently developed (Gastroenterology, Vol. 109, D. 1344-1367, 1995) shows that It has been shown that abnormal mucosal immunity causes chronic inflammation in the intestinal tract.
  • TCR T-cell receptor chain knockout mice
  • T cells become as observed in the digestive tract and lymph nodes (Gastroenterology, Vol.112, p.1876-1886, 1997 ).
  • TCR yS T cell deficiency is thought to result in an abnormal T cell fraction, resulting in dysregulation of cytokine production, resulting in a mediation of inflammation.
  • T cells recognizing antigens presented by antigen-presenting cells (APC) such as macrophages, B cells or dendritic cells.
  • APC antigen-presenting cells
  • MHC major histocompatibility complex
  • T cells activate cells by recognizing the processed antigen presented by antigen presenting cells through a complex of T cell receptor (TCR) and antigen (TCR / CD3 complex) on the cell membrane surface. Receive the first signal for (acquisition of specificity).
  • costimulation In addition to the first signal, costimulation It requires a second signal called the costimulatory signal. After receiving the first signal, the T cell is antigen-specifically activated by receiving the costimulation signal.
  • This second signal transduction involves CD28 (also known as Tp44, ⁇ 44, or 9.3 antigen), a cell surface molecule expressed mainly on T cells and thymocytes, and antigen presenting cells (macrophage, monocytes, CD80 (also known as B7-l, ⁇ 7, ⁇ 1, or B7 / BB1), which is expressed on dendritic cells, etc .; and CD86 (also known as ⁇ 7-2 or ⁇ 70), which is also a cell surface molecule similar to an antigen-presenting cell. ) (Ie, cell-cell adhesion through bonding between their molecules) is extremely important.
  • CD28 also known as Tp44, ⁇ 44, or 9.3 antigen
  • CD80 also known as B7-l, ⁇ 7, ⁇ 1, or B7 / BB1
  • CD86 also known as ⁇ 7-2 or ⁇ 70
  • control of cell activation by the second signal includes the expression of CTLA-4 (Cytolytic T lymphocyte associated antigen 4), which is considered to be enhanced in expression depending on the second signal. )
  • CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) also play an important role (ie, cell-cell adhesion through binding between their molecules).
  • the control of T cell activation by the transmission of the second signal includes at least the interaction between CD28 and CD80 / CD86, the enhancement of CTLA-4 expression which is considered to depend on the interaction, and It has been shown that the interaction between CTLA-4 and CD80 / CD86 is involved.
  • a second signal essential for activation of lymphocytes such as the T cell, and activation in conjunction with the signal AIL IM (activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule; human, mouse, and rat; Int. Immunol., Vol. 3), which controls the function of activated lymphocytes such as activated T cells. 12, No. 1, p. 51-55, 2000; Another name is IC0S (Inducible co-stimulator; human; Nature, Vol. 397, No. 6716, p. 263-266, 1999); J. Immunol. 166 (1), p.l, 2001; J.
  • B7h and B7RP-1 are considered to be ligands that interact with the costimulatory molecule AILIM.
  • GL50 or LIC0S have also been identified (Nature, Vol. 402, No. 6763, p. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, No. 12, p. 136 5- 1369, 1999; Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vo 1.10, No.6, p.333-336, 2000).
  • the present invention relates to the transmission of a second signal (costimulatory signal) essential for activation of lymphocytes such as T cells, and the activation of activated lymphocytes such as activated T cells in conjunction with the signal.
  • a second signal costimulatory signal
  • AILIM which is considered to be a molecule that regulates functions
  • medical and pharmaceutical techniques for example, drugs such as low molecular weight compounds and antibodies
  • clone inflammatory bowel disease
  • a method and a drug for suppressing, treating or preventing diseases associated with intestinal immunity abnormalities abnormal T cell activation, abnormal CD4 + cell elevation, etc.
  • diseases and colitis ulcerative colitis, etc.
  • agents that regulate the biological function of such AILIM eg, small molecules
  • AILIM eg, small molecules
  • drugs corticosteroids, salazosulfapyridine, etc.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have proposed that the biological function of AILIM (IC0S) in mammals and the inflammatory bowel disease having a possibility that abnormality of intestinal immunity may be deeply involved (in particular, Crohn's disease and colitis (ulcerative colitis) )) and studies on ways to control dietary allergies have shown that drugs that control the function of AILIM significantly affect inflammatory bowel disease (especially Crohn's disease and colitis (ulcerative colitis, etc.))
  • the present inventors have found findings to suppress the above, and have completed the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for various biological reactions involving the transmission of costimulatory signals (costimulatory signals) via AILIM to cells expressing AILIM (for example, cell proliferation of cells expressing AILIM, AILIM Production of cytokines by cells expressing AILIM, immunocytolysis or cell death; apoptosis; depletion of AILIM-expressing cells, and antibody-dependent cellular damage to AILIM-expressing cells And / or inhibits or prevents the onset and / or progression of various diseases involving AILIM-mediated signal transduction, and treats or prevents the diseases. It is useful as a drug for
  • the pharmaceutical composition of the present invention controls (suppresses or promotes) the growth, apoptosis (cell death; apoptosis; depletion) or immune cell lysis (. Immune cytolysis) of AILIM-expressing cells, or the AILIM-expressing cells.
  • Cytokines eg
  • a particularly preferred embodiment of such a pharmaceutical composition of the present invention is a cell of an AILIM-expressing cell.
  • a pharmaceutical composition comprising a substance that induces death (cell death; apoptosis; depletion).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also enhance the therapeutic effect of inflammatory bowel disease by using in combination with an existing drug prescribed for the treatment of such inflammatory bowel disease. .
  • the present invention is as described in the following (1) to (10).
  • a pharmaceutical composition comprising a substance having an activity of controlling AILIM-mediated signal transduction and a pharmaceutically acceptable carrier, for suppressing, treating or preventing a disease associated with abnormal intestinal immunity.
  • composition according to any one of (1) to (6), wherein the substance is a proteinaceous substance.
  • the proteinaceous substance is one selected from the following group:
  • a fusion polypeptide consisting of all or part of the extracellular region of AILIM and all or part of the constant region of the heavy chain of immunoglobulin;
  • composition according to any one of (1) to (6), wherein the substance is a non-protein substance.
  • mammal in the present invention means humans, magpies, goats, rabbits, mice, rats, hams, guinea pigs, and the like, and preferably humans, magpies, rats, and the like. It is a mouse or a hams, particularly preferably a human.
  • AIUM is an abbreviation for Activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule and means a mammalian cell surface molecule having the structure and function reported in the previous report as described above (J Immunol., 166 (1), p.l, 2001; J. Immunol., 165 (9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res.Commun., 276 (1), p.335, 2000 ; Immunity, 13 (1), p.95, 2000; J. Exp.Med., 192 (1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30 (4), p.1040, 2000; Int.
  • AILIM of human origin (for example, International Immunology, Vol. 12, No. 1, p. 51-55; GenBank Accession Number: BAA82129).
  • This AILIM can be obtained from ICOS (Nature, Vol. 397, No. 6716, p. 63-266, 1999) or JTT-1 antigen / JTT-2 antigen (Japanese Patent Application Publication No. International Patent Application Publication No. W098 / 38216), but these molecules mean the same molecule as each other.
  • the “AILIM” referred to in the present invention includes the amino acid sequence of each mammalian AILIM described in the above-mentioned literature, particularly preferably a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of human AILIM. Peptides are also included. Furthermore, a human AILIM mutant similar to the already-identified rat-derived AILIM mutant (GenBank Accession Number: BAA82127) is also included in the “AILIM” of the present invention.
  • “having substantially the same amino acid sequence” refers to a plurality of amino acids in the amino acid sequence as long as they have substantially the same biological properties as the polypeptide containing the reported amino acid sequence.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to 5 amino acids are substituted, deleted and / or modified, and a plurality of amino acids in the amino acid sequence Preferably, a polypeptide having an amino acid sequence to which 1 to 10 amino acids are added, particularly preferably 1 to 5 amino acids, is also included in the scope of "AILIM" of the present invention. I do.
  • Such amino acid substitutions, deletions, or insertions can be carried out according to a conventional method (eg, Experimental Medical Supplement, “Genetic Engineering Handbook” (1992)).
  • a synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis method for example, a synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis method (gapped duplex method), a method of randomly introducing point mutations by nitrite or sulfite treatment, a method of producing a deletion mutant using Bal31 enzyme, a cassette mutation method, Examples thereof include a linker scanning method, a mis-incorporation method, a mismatch primer method, and a DNA segment synthesis method.
  • the synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis (gapped duplex) method can be performed, for example, as described below. Mutation to M13 phage vector with amber mutation Clone the region to be induced and prepare single-stranded phage DNA. Amber-The RFIDNA of the M13 vector without mutation is linearized by treatment with a restriction enzyme, mixed with the above single-stranded phage DNA, denatured, and annealed to form “gapped duplex DNA”. A synthetic oligo nucleotide having a mutation introduced therein is hybridized, and a closed circular double-stranded DNA is obtained by a reaction between DNA polymerase and DNA ligase.
  • This DNA is transfected into Escherichia coli mutS strain deficient in mischid-modifying ability, and the grown phage is infected with Escherichia coli having no sublesser function, and only phages having no amber mutation are selected.
  • a method for introducing a point mutation by nitrous acid uses, for example, the following principle.
  • nitrite is applied to MA
  • the base is deaminated, adenine becomes hypoxanthin, cytosine becomes peracyl, and guanine becomes xanthine.
  • deaminated MA is introduced into cells, hypoxanthine and cytosine form hypoxanthine and adenine and xanthine form thymine at the time of MA replication, so that "A: T" becomes "G: C”. Replace “G: C” with “A: T”.
  • a single-stranded DNA fragment treated with nitrite is hybridized to “gapped duplex DNAj”, and the mutant may be isolated by the same procedure as in the synthetic oligonucleotide-directed mutagenesis (gapped duplex) method.
  • cytokine in the “production of cytokines by AILIM-expressing cells” constituting the present invention means any cytokine produced by cells (particularly, T cells) that express AILIM.
  • T cells examples include TM type T cells and Th2 type T cells.
  • the cytokines according to the present invention are, in particular, cytokines produced by these Thl type T cells and / or 3 ⁇ 42 type T cells. Means any cytokine produced by
  • cytokines produced by Thl-type T cells include IFN-r, IL-2, TNF, and IL-3, and those that are produced by Th2-type T cells include 11-3 , IL-4, IL-5 ⁇ IL-10, TNF, etc. (Cells, Vol. 30, No. 9, p. 343- 346, 1998) o
  • Substance means a natural substance existing in the natural world or an artificially prepared substance.
  • a particularly preferred embodiment of the “substance” in the present invention is a substance having an activity of inducing cell death (apoptosis; depletion) of AILIM-expressing cells.
  • “signaling via AILIM” refers to any phenotypic change (cell proliferation, cell activation, cell inactivation, etc.) in AILIM-expressing cells as described in detail above or in the Examples below. , Cell death, and / or a change in the ability to produce any cytokines from AILIM-expressing cells).
  • the “substance” can be broadly classified into “proteinaceous substance” and “non-proteinaceous substance”.
  • the “proteinaceous substance” include a polypeptide and an antibody described below (a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a part of the monoclonal antibody).
  • an antibody it is preferably a monoclonal antibody.
  • the substance is a monoclonal antibody, not only a monoclonal antibody derived from a non-human mammal but also a recombinant chimeric monoclonal antibody, a recombinant human monoclonal antibody, and a human monoclonal antibody described below. Included.
  • the substance when it is a polypeptide, it includes a polypeptide described below, a fragment (oligopeptide) of the polypeptide, a fusion polypeptide, and a chemically modified product of any of them.
  • Oligopeptides include peptides consisting of 5 to 30 amino acids, preferably 5 to 20 amino acids.
  • the chemical modification is designed for various purposes such as an increase in blood half-life when administered to a living body or an increase in resistance or absorption to degradation in the gastrointestinal tract during oral administration. 1 3 can be measured.
  • polypeptide examples include those described below.
  • a fusion polypeptide consisting of all or part of the extracellular region of AIL IM and all or part of the constant region of the heavy chain of immunoglobulin;
  • non-proteinaceous substances include MA, RNA and chemically synthesized compounds.
  • the term “MA” refers to a DNA useful as an antisense DNA drug designed based on the base sequence of DNA (including cDNA and genomic DNA) encoding AILIM (preferably human AILIM). DNA containing a partial base sequence of DNA or chemically modified DNA obtained by chemically modifying them. " That is, the antisense DNA can inhibit transcription of the DNA encoding AILIM to mRNA or translation of the mRNA into protein by hybridizing to DNA or RNA encoding AILIM.
  • the “partial base sequence” means a partial base sequence consisting of an arbitrary number of bases at an arbitrary site.
  • the partial base sequence include a continuous partial base sequence of 5 to 100 bases, preferably a continuous partial base sequence of 5 to 70 bases, and more preferably a continuous partial base sequence of 5 to 50 bases.
  • a continuous partial base sequence of 5 to 30 bases is used.
  • a part of the nucleotide sequence of the DNA can be chemically modified for the purpose of increasing resistance to degradation in the digestive tract or increasing absorption in the case of administration.
  • the chemical modification include a chemical modification of a phosphate bond, ribose, a nucleobase, a sugar moiety, a 3 ′ and / or a 5 ′ end, etc. in the structure of the oligonucleotide.
  • one or more of the bonds may be replaced with a phosphodiester bond (D- Rigo), phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond (S-oligo), methylphosphonate bond (MP-oligo), phosphoramidate bond, non-phosphate bond, and / or methylphosphonothioate bond Changes to these combinations can be mentioned.
  • D- Rigo phosphodiester bond
  • S-oligo phosphorothioate bond
  • S-oligo phosphorodithioate bond
  • MP-oligo methylphosphonate bond
  • phosphoramidate bond non-phosphate bond
  • / or methylphosphonothioate bond Changes to these combinations can be mentioned.
  • Examples of the modification of ribose include a change to 2, -fluororibose or 2'-0-methylribose.
  • Modifications of nucleobases include changes to 5-propynylperacyl or 2-aminoadenine.
  • RNAj refers to “RNA containing a partial base sequence of the RNA or RNA containing the same, which is useful as an antisense RNA drug designed based on the base sequence of RNA encoding AILIM (preferably human AILIM) described above. Chemically modified RNA ”.
  • the antisense RNA is hybridized to DNA encoding AILIM, and thereby hybridized to DNA or RNA encoding AILIM, whereby transcription of DNA encoding AILIM to mRNA or mRNA is performed. It can inhibit the translation of A into protein.
  • the “partial base sequence” means a partial base sequence consisting of an arbitrary number of bases at an arbitrary site.
  • the partial base sequence include a continuous partial base sequence of 5 to 100 bases, preferably a continuous partial base sequence of 5 to 70 bases, and more preferably a continuous partial base sequence of 5 to 50 bases.
  • a continuous partial base sequence of 5 to 30 bases is used.
  • the antisense RNA increases the half-life in blood when the RNA is administered to a patient, increases the permeability of the inner membrane, or increases the resistance to degradation in the digestive tract when administered orally.
  • a part of the base sequence of the RNA can be chemically modified for the purpose of increasing absorption or the like. Examples of the chemical modification include a chemical modification applied to the above-described antisense DNA.
  • “Chemically synthesized compound” refers to any compound described above, excluding DNA, RNA and proteinaceous substances, and having a molecular weight of about 100 to about 1,000 or less, preferably It is a compound having a molecular weight of about 100 to about 800, and more preferably a compound having a molecular weight of about 100 to about 600.
  • polypeptide included in the definition of the “substance” means a part (fragment) of a polypeptide chain constituting AILIM (preferably human AILIM), and preferably a polypeptide constituting AILIM. It means the whole or a part of the extracellular region of the peptide (the region may have 1 to 5 amino acids added to its N-terminal and / or C-terminal if desired).
  • AILIM is a transmembrane molecule that penetrates a cell membrane constituted by one or two polypeptide chains.
  • transmembrane protein refers to a hydrophobic peptide domain that penetrates the lipid bilayer once or several times through the membrane, as seen in many receptors or cell membrane surface molecules. It refers to a protein having a structure composed of three main regions: an extracellular region, a transmembrane region, and a cytoplasmic region as a whole. Further, such transmembrane proteins can be homodimers, heterodimers, or as monomers, or with another chain having the same amino acid sequence or a chain having a different amino acid sequence, respectively. -(Heterodimer) or oligomer (origomer) to form each receptor and cell surface molecule.
  • the “extracellular region” refers to the entire structure (partial region) of the partial structure (partial region) existing on the outer side of the membrane to which the membrane protein is linked, of the entire structure of the cell membrane transmembrane protein as described above. Means a part, in other words, all of the region other than the region taken up in the membrane (transmembrane region) and the region present in the cytoplasm following the region in the membrane (intracellular region). Or partly mean.
  • fusion polypeptide included in the aforementioned “proteinaceous substance” refers to all or part of the extracellular region of the polypeptide constituting AILIM (preferably human AILIM) and “immunoglobulin (Ig, preferably Is all or one of the constant regions of the heavy chain of human Ig).
  • a fusion polypeptide comprising: It is preferably a fusion polypeptide of the extracellular region of AIL IM and a part of the constant region of the heavy chain of human IgG, and particularly preferably the extracellular region of AILIM and the hinge region of the heavy chain of human IgG, and the CH2 domain.
  • IgGl is preferable as IgG.
  • AILIM human, mouse or rat (preferably human) AILIM is preferred.
  • immunoglobulin (Ig) heavy chain is preferably the constant region of the heavy chain (Heavy Chain, H chain) of a human immunoglobulin. , Fc region or portions thereof.
  • the immunoglobulin may be an immunoglobulin belonging to any class and subclass. Specifically, IgG (IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4), IgM ⁇ IgA (IgAl and IgA2), IgD and IgE Can be mentioned. Preferably, IgG (IgGl N IgG2s IgG3 or Ig G4), or IgM.
  • a particularly preferred example in the present invention is an immunoglobulin belonging to human-derived IgG (IgGl, IgG2, IgG3 or Ig (M)).
  • Immunoglobulin is composed of four homologous light chains (Light Chains, L chains) and two homologous heavy chains (Heavy Chains, H chains) linked by disulfide bonds (SS bonds). It has a letter-shaped structural unit.
  • the light chain is composed of the light chain variable region (VJ and the light chain constant region (C L ).
  • the heavy chain is composed of the heavy chain variable region (V H ) and the heavy chain constant region (C H ) .
  • the heavy chain constant region is comprised of class (IgG, IgM, IgAs IgD and IgE) and subclasses (I gGl, IgG2 N IgG3 IgG4 , IgAl and IgA2) each some domains having amino acid sequence inherent in each.
  • the heavy chain of IgG (IgGl-IgG2, IgG3 and IgG4) is composed of VH , CHI domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of IgGl can, in this order from N terminus, V H, C r J domain, hinge region, and a C r, 2 domain and C r, 3 domain.
  • the heavy chain of IgG3 is this order from N terminus, V H, Cr 3 l domain, hinge region, and a Cr 3 2 domain, and Cr 3 3 domain.
  • the heavy chain of IgG4 is
  • the IgA heavy chain is composed of, in order from the N-terminus, VH , C1 domain, hinge region, C2 domain, and C3 domain.
  • the heavy chain of IgAl is composed of VH , Cc ⁇ l domain, hinge region, C domain and Co? Domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of IgA2 is the N-terminal or order from, V H, C 2 1 domain, hinge region, and a C 2 2 domain, and Ca 2 3 Domei down.
  • the heavy chain of IgD is composed of VH , CSI domain, hinge region, CS2 domain and CS3 domain in order from the N-terminus.
  • the heavy chain of IgM is composed of VH , C ⁇ l domain, Ci2 domain, C ⁇ 3 domain, and C ⁇ 4 domain in order from the N-terminus, and includes the hinge region found in IgG, IgA, and IgD. Do not have.
  • the heavy chain of IgE is composed of VH , Csl domain, C2 domain, C3 domain and C4 domain in order from the N-terminus, and has a hinge region as found in IgG, IgA and IgD. do not do.
  • IgG when IgG is treated with papain, it is cleaved slightly at the N-terminal side of the disulfide bond present in the hinge region connecting the two heavy chains, resulting in V H and C H two homologous Fab that heavy chain fragment composed of 1 and one light chain are linked by disulfide bonds, as well as the hinge region, the C H 2 domain and C H 2 two homologous heavy chain fragments composed of 3 domains disulfide bonds (Hereinafter referred to as "Immunological Illustrated", 2nd ed., Pp. 65-75, 1992, published by Nankodo, and "Focus on the latest medical science"'', Pp. 4-7, 1991, South See Edo Publishing etc.)
  • the “part of the constant region of the immunoglobulin heavy chain” described above means a part of the constant region of the immunoglobulin heavy chain having the above-described structural characteristics, and is preferably
  • a constant or Fc region lacking the C1 domain is a constant or Fc region lacking the C1 domain.
  • a region consisting of each hinge region, C2 domain and C3 domain can be mentioned.
  • IgM or IgE each region of C2 domain, C3 domain and C4 domain can be mentioned.
  • a particularly preferred example is the Fc region of human-derived Ig G1.
  • the fusion polypeptide has a part of the constant region (for example, Fc) of immunoglobulin such as IgG as described above as a fusion partner, the fusion polypeptide specifically binds to the immunoglobulin fragment.
  • Fc constant region of immunoglobulin
  • the use of affinity column chromatography based on properties has the advantage that the fusion polypeptide can be very easily purified. Furthermore, since various antibodies against Fc of various immunoglobulins are provided, it is possible to easily perform the immunoassay of the fusion polypeptide using an antibody against the Fc.
  • polypeptide included in the definition of “substance” also includes! ”A polypeptide that binds to AILIM”.
  • polypeptide that binds to AILIM specifically, a molecule known as B7h, B7RP-1, GL50 or LIC0S, which is a ligand that interacts with AILIM (Nature, Vol. 402, No. .6763, p.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, p.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol. , Vol. 10, No. 6, p. 333-336, 2000).
  • the ligand (B7h, B7RP-1 N GL50 , LIC0S) polypeptides comprising all or part of the extracellular region or constant heavy chains of the polypeptide and the immunoglobulin (favored properly human immunoglobulin), Fusion of all or part of the area Is a polypeptide.
  • the terms “extracellular region” and “constant region of immunoglobulin heavy chain” have the same meaning as described above.
  • polypeptide a part (fragment) of the polypeptide, and a fusion polypeptide are known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method, and the like, in addition to a gene recombination technique described later. It can be produced by appropriately using a known method or a modification method thereof.
  • the “antibody” in the present invention means a polyclonal antibody (antiserum) or a monoclonal antibody against the mammalian AILIM (particularly preferably human AILIM) as defined above, and is preferably a monoclonal antibody. is there.
  • an antibody that binds to AILIM and suppresses the growth of AILIM-expressing cells or an antibody that binds to AILIM and inhibits the production of inulin-feron r or inulin-leukin-4 by AILIM-expressing cells It is.
  • the “antibody” of the present invention is prepared by using a gene expressing the AILIM of the present invention (natural cells, cell lines, tumor cells, etc.) or a gene recombination technique so as to highly express AILIM on the cell surface. Using the transformed transformant, the polypeptide constituting AILIM, the AILIM polypeptide, or the fusion polypeptide containing the extracellular region of AILIM as an antigen, and using the antigen as a mouse, rat, or hams 1. Natural antibodies obtained by immunizing mammals such as guinea pigs and egrets, chimeric antibodies and human antibodies (CDR-grafted antibodies) that can be produced using gene recombination techniques, and human antibody-producing transgenes. It also includes human antibodies that can be produced using nik animals and the like.
  • the monoclonal antibodies include monoclonal antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD or IgE. Preferably, it is IgG or IgM.
  • Polyclonal antibodies (antisera) or monoclonal antibodies can be produced by existing general production methods. That is, for example, the above-mentioned antigen may be administered to a mammal together with Freund's adjuvant, if necessary. Animals, preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs, egrets, cats, dogs, horses, goats, dogs or geese, more preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs or egrets Immunize.
  • the polyclonal antibody can be obtained from serum obtained from the immunized animal.
  • monoclonal antibodies can be prepared by preparing hybridomas from the antibody-producing cells obtained from the immunized animal and myeloma cells (myeloma cells) having no autoantibody-producing ability, cloning the hybridomas, and immunizing mammals. It is produced by selecting a clone producing a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity for the antigen used in the above.
  • the monoclonal antibody can be specifically produced as follows. That is, an antigen as described above is used as an immunogen, and the immunogen is used together with Freund's adjuvant, if necessary, together with a non-human mammal, specifically, mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.
  • Subcutaneous animals such as pigs or egrets, preferably mice, rats or hamsters (including transgenic animals created to produce antibodies from other animals, such as the transgenic mice producing human antibodies described below) Immunization is given by one or several injections or transplants, intramuscularly, intravenously, intravenously, in the footpad or intraperitoneally.
  • immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the initial immunization, and antibody-producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the final immunization.
  • the number of immunizations and the time interval can be changed as appropriate depending on the nature of the immunogen to be used.
  • Preparation of a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be performed according to the method of Keraichi and Mirushi Utaine et al. .256, p. 95-497, 1975) and modification methods analogous thereto.
  • antibody producing cells preferably contained in spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably spleen, obtained from a non-human mammal immunized as described above, and preferably mouse, rat, guinea pig, One, ⁇
  • myeloma cells used for cell fusion prepared by cell fusion with a myeloma cell such as a heron or a mammal such as a human, and more preferably a mouse, rat or a human derived autologous myeloma cell having no autoantibody-producing ability include: Mouse-derived myeloma
  • P3 / X63-AG8.653 (653), P3 / NSI / l-Ag4-l (NS-1), P3 / X63-Ag8.Ul (P3U1), SP 2/0-Agl4 (Sp2 / 0, Sp2) , PAI, F0, NSO or BW5147, rat myeloma 210RCY3-Ag.2.3., Human myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-Al-2, UC729-6, CEM-AGR, D1M1 are CEM- T15 can be used.
  • hybridoma clones producing monoclonal antibodies was performed by culturing hybridomas, for example, in a microtiter plate, and using the immunization antigens used in the immunization of the culture supernatant of the wells in which proliferation was observed.
  • the reactivity can be measured by, for example, an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
  • Production of monoclonal antibodies from hybridomas is carried out in vitro or in vivo, for example, in mice, rats, guinea pigs, hamsters, or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice.
  • hybridomas When culturing in vitro, hybridomas are grown, maintained, and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is produced in the culture supernatant.
  • Some nutrient media, such as those used for production, can be performed using any nutrient media derived from known basal media.
  • the basic medium for example, a low calcium medium such as Ham 'F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium, etc.
  • the basic culture The earth may contain, for example, serum, hormones, cytokines and / or various inorganic or organic substances, depending on the purpose.
  • the above culture supernatant or ascites fluid can be obtained by saturating ammonium sulfate, euglobulin precipitation, forceproic acid, forceprillic acid, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.) It can be performed by subjecting it to affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
  • a “recombinant chimeric monoclonal antibody” is a monoclonal antibody produced by genetic engineering. Specifically, the variable region thereof is derived from a non-human mammal (mouse, rat, hamster, etc.) immunoglobulin And a chimeric monoclonal antibody such as a mouse / human chimeric monoclonal antibody, wherein the constant region is a human immunoglobulin-derived constant region.
  • the constant region derived from human immunoglobulin, IgG (IgGl, IgGZ, IgG3 5 IgG4), I gM, has the amino acid sequence inherent in each isotype such as IGAS IgD and IgE, either the constant region of the recombinant chimeric monoclonal antibody It may be the constant region of human immunoglobulin belonging to the following isotype. Preferably, it is a constant region of human IgG.
  • a recombinant chimeric monoclonal antibody can be produced, for example, as follows. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a mouse / human chimeric monoclonal antibody can be prepared with reference to Experimental Medicine (Extra Issue), Vol. 1.6, No. 10, 1988, and Japanese Patent Publication No. 3-73280. That is, human immunoglobulin is downstream of the active VH gene (rearranged VDJ gene encoding the H chain variable region) obtained from the DNA encoding the mouse monoclonal antibody isolated from the hybridoma producing the mouse monoclonal antibody.
  • CH gene H chain constant region obtained from DNA encoding And the active V L gene (rearranged VJ coding for the L chain variable region) obtained from DNA encoding a mouse monoclonal antibody isolated from the hybridoma.
  • the C gene encoding the C L gene (L-chain constant region obtained from DNA encoding human immunoglobulin Guromu phosphorus downstream of gene), and arranged so as to each be expressed in one or separate expression base Kuta one It can be prepared by inserting, transforming a host cell with the expression vector, and culturing the transformed cell.
  • DNA is extracted from a mouse monoclonal antibody-producing hybridoma by a conventional method, and the DNA is digested with an appropriate restriction enzyme (for example, EcoRI, HindIII, etc.) and subjected to electrophoresis.
  • an appropriate restriction enzyme for example, EcoRI, HindIII, etc.
  • electrophoresis For example, use 0.7% agarose gel.
  • the electrophoresed gel is stained with, for example, ethidium mouth, and after photographing, the marker is attached, the gel is washed twice, and immersed in a 0.25 M HC1 solution for 15 minutes. Then, immerse in 0.4N NaOH solution for 10 minutes while gently shaking. Transfer the filter to the filter in the usual manner. After 4 hours, collect the filter and wash it twice with 2 x SSC.
  • Rearranged VDJ and VJ genes encoding the H and L chains of the mouse monoclonal antibody, respectively, are identified by the Southern blot method described above.
  • the region containing the identified DNA fragment was fractionated by sucrose density gradient centrifugation, and phage vector (for example, Charon 4A ⁇ Charon 28, ⁇ EMBL3, AEMBL4, etc.) and transform the E. coli (eg, LE392, NM539, etc.) with the phage to produce a genomic library.
  • the genomic library was plaque-hybridized using appropriate probes (H chain J gene, L chain (J gene, etc.)) according to the Benton Davis method (Science, Vol. 196, p. 180-182, 1977).
  • a positive clone containing each of the rearranged VDJ gene or VJ gene is prepared, a restriction enzyme map of the obtained clone is prepared, the nucleotide sequence is determined, and the desired rearranged V is obtained. it confirms that H (VD J) gene containing a gene or V L (VJ) gene are obtained.
  • H (VD J) gene containing a gene or V L (VJ) gene are obtained.
  • isolated separately, human C H gene and human C L gene used for chimerization example example, when a chimeric antibody with human IgGl is to isolate the C gene is Cyl gene and C L gene is C H gene.
  • mice immunized Gros purine gene and human immune globulin gene By using the mouse Cy1 gene and mouse C ⁇ gene corresponding to the human Cr1 gene and the human C gene as probes by utilizing the high homology of the base sequences, they can be isolated from a human genomic library. Obtainable.
  • the human Cyl gene is obtained, for example, by cutting human fetal hepatocyte DNA with HindIII, fractionating the fragment by agarose gel electrophoresis, and inserting a 5.9 kb band into ⁇ 788. Separate using.
  • a human C H gene and human c L gene such as a promoter region and Enhansa one region of Considering the human C H gene downstream of the mouse V H gene and the human C L gene downstream of the mouse V L gene, using appropriate restriction enzymes and DNA ligase, for example, pSV2gpt or pSV2neo, etc. It is incorporated into an expression vector according to a conventional method.
  • chimeric genes of mouse V H gene / human C H gene and mouse gene / human C t gene may be arranged simultaneously into a single expression Bae click evening one, each separate expression downy click evening They can be arranged in one.
  • the thus prepared chimeric gene insertion / expression vector can be used for protoplast fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate or electroporation in myeloma cells that do not produce antibodies themselves, such as P3X63'Ag8'653 cells or SP210 cells. It is introduced by the air perforation method or the like.
  • the transformed cells are selected by culturing in a drug-containing medium corresponding to the drug resistance gene introduced into the expression vector to obtain a desired chimeric monoclonal antibody-producing cell.
  • the desired chimeric monoclonal antibody is obtained from the culture supernatant of the antibody-producing cells thus selected.
  • Human-type monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by genetic engineering. Specifically, a part or all of the complementarity determining region of the hypervariable region is a non-human mammal.
  • a framework region of the variable region is a framework region of a variable region derived from human immunoglobulin
  • the complementarity-determining regions of the hypervariable region are three regions that are present in the hypervariable region in the variable region of the antibody and that directly bind to the antigen in a complementary manner. 2 CDR3), and the framework region of the variable region refers to four relatively conserved regions (Framework regions; FR1, FR2, FR3 F4) intervening before and after the three complementarity determining regions. Point.
  • it means a monoclonal antibody in which all regions other than part or all of the complementarity determining region of the hypervariable region of a monoclonal antibody derived from a non-human mammal have been replaced with the corresponding region of human immunoglobulin.
  • the constant region derived from human immunoglobulin, IgG (IgGl, lgG2, IgG3 5 IgG4), I gM, IgA, has the amino acid sequence inherent in each isotype such as IgD and IgE, in the present invention, the human monoclonal
  • the constant region of the antibody may be a human immunoglobulin constant region belonging to any of the isotypes. Preferably, it is a human IgG constant region.
  • the framework region of the variable region derived from human immunoglobulin is not limited.
  • a humanized monoclonal antibody can be produced, for example, as follows. However, it goes without saying that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a recombinant humanized monoclonal antibody derived from a mouse monoclonal antibody can be produced genetically with reference to Japanese Patent Application Publication No. 4-506458 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-296890. it can. That is, at least one mouse H chain CDR gene and at least one mouse L chain CDR gene corresponding to the mouse H chain CDR gene are isolated from a hybridoma producing a mouse monoclonal antibody, and the human immunoglobulin gene is isolated from the human immunoglobulin gene.
  • the isolated mouse H chain CDR gene and the human H chain gene are introduced into a suitable expression vector so that they can be expressed, and the mouse L chain CDR gene and the human L chain gene can be similarly expressed so that they can be expressed. Introduce into another expression vector.
  • the mouse H chain CDR gene / human H chain gene and the mouse L chain CDR gene / human L chain gene can be introduced so that they can be expressed in the same expression vector.
  • Human monoclonal antibody is defined as a human immunoglobulin which comprises the variable region of the H chain and the constant region of the H chain, and the variable region of the L chain and the constant region of the L chain which constitute immunoglobulin. It is an immunoglobulin derived from a gene that encodes
  • a human antibody (preferably a human monoclonal antibody) is prepared by transfection of a transgenic animal produced by incorporating at least the human immunoglobulin gene into a non-human mammal such as a mouse, etc., in accordance with a conventional method. By immunizing with an antigen, it can be produced in the same manner as in the method for producing a polyclonal antibody or a monoclonal antibody described above.
  • transgenic mice producing human antibodies are described in Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Gazette; JP-T-Hei 7-509137; Nikkei Science, June, pp. 40-50, 1995; International Application Publication W094 / 25585; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 19 94; and Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-500233, etc.
  • a method of producing a human-derived protein from transgenic pesticide milk which is a technique developed recently. It is also possible to apply (Japanese Science, April 1997, pp. 78-84).
  • part of an antibody in the present invention means a partial region of the monoclonal antibody as described above, and specifically, F (ab 3 ) 2 , Fab ⁇ Fab, Fv (variable fragment of antibody) , SFv, dsFv (disulphide stabilised Fv) or dAb (single domin antibody) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, pp. 441-456, 1996).
  • F (ab,) 2 and “Fa” are immunoglobulin (monoclonal Antibody) produced by treating the antibody with a protease such as pepsin or papain, and digested before and after the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region.
  • a protease such as pepsin or papain
  • IgG When IgG is treated with pepsin, it is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region to produce an antibody fragment slightly larger than the two Fab's linked in the hinge region. be able to. This antibody fragment is called F (ab,) 2 .
  • intestinal immunity As used almost synonymously.
  • preferred examples include inflammatory bowel disease and dietary allergy.
  • colitis colitis; in particular, ulcerative colitis (UC)) and Crohn's disease (CD), Each has, for example, the following features.
  • UC ulcerative colitis
  • CD Crohn's disease
  • IBD Inflammatory bowel syndrome
  • colitis especially ulcerative colitis
  • Crohn's disease which occurs more frequently in young people, and relapses and relapses. It is considered an inflammatory disease.
  • Crohn's disease is a condition that causes chronic granulomatous inflammation and ulceration in the entire gastrointestinal tract from the esophagus to the anus, mainly the small and large intestine, and abnormalities in the anus such as abdominal pain, diarrhea, fever, hemorrhoids, and / or Symptoms such as weight loss appear. Histologically, lymphocytic infiltration and non-caseous epithelioid granuloma were observed, suggesting abnormal responses of T cells and antigen presenting cells. It is.
  • Colitis is a chronic inflammation that occurs locally in the large intestine and mainly affects the mucous membranes, forming erosions and ulcers. Histologically, marked infiltration of lymphocytes, plasma cells, macrophages and mast cells in the mucous membrane and lamina intestinal, and disappearance of goblet cells and crypt ulcers with neutrophil infiltration occur.
  • the existing drugs used for the treatment of “inflammatory bowel disease” in the present invention are any one or more of the drugs prescribed for the treatment of colitis (such as ulcerative colitis) and Crohn's disease at medical treatment sites.
  • Means for example, corticosteroids, salazosulfapyridine, etc.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, thickeners. , A flavoring agent, a solubilizing agent or other additives.
  • pharmaceutical compositions can be prepared.
  • compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances, suppositories for enteral enteral administration, and vessels, etc., formulated in a conventional manner. .
  • the dosage may be the patient's age, gender, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient (such as the “substance” according to the present invention described above) contained in the pharmaceutical composition. Depending on the dose, it can usually be administered in a dose of 10 g to 100 mg (or 10 ig to 500 mg) per adult dose. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required.
  • physiological saline or commercially available distilled water for injection It can be produced by dissolving or suspending in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier at a concentration of (ig antibody / ml carrier to 10 mg antibody Zml carrier).
  • the manufactured injection is administered to a human patient in need of treatment at a rate of 1 mg to 100 mg, preferably 50 g to 50 mg, per day per lkg body weight per day.
  • the form of administration may be a medically appropriate administration form such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection. Is an intravenous injection.
  • Injectables may be prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions and emulsions. it can.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
  • suspensions and emulsions it can.
  • injections can be sterilized by sterile filtration through a bacterial retention filter, blended with a bactericide, or irradiated.
  • Injectables can be manufactured in the form of ready-to-use preparations. That is, it can be used as a sterile solid composition by freeze-drying or the like and dissolved in sterile distilled water for injection or another solvent before use.
  • the pharmaceutical composition of the present invention it is possible to increase the therapeutic effect of existing pharmaceutical agents prescribed for the treatment of such inflammatory diseases.
  • FIG. 1 shows the effect of continuous administration of anti-AILIM antibody (before or after the onset of the disease state), which suppresses the development of inflammatory bowel disease, as an index of weight loss, which is a characteristic of colitis.
  • FIG. 3 shows the therapeutic effect of inflammatory bowel disease by administration of an anti-AILIM antibody.
  • Figure 2 shows normal mice that have not developed inflammatory bowel disease, mice that have inflammatory bowel disease, and mice that have been observed to suppress the development of inflammatory bowel disease by administration of anti-AILIM antibody.
  • 3 is a photograph showing the condition of the large intestine.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of suppressing the onset of inflammatory bowel disease by continuous administration of an anti-AILIM antibody, which is represented by a weight loss characteristic of colitis as an index.
  • FIG. 4 is a graph showing the severity of colitis expressed by histological score.
  • FIG. 5 is a diagram showing the number of CD4 + cells infiltrating the colonic mucosal layer (lumina propria).
  • FIG. 6 is a graph showing the degree of apoptosis of cells in colon tissue.
  • FIG. 7 is a graph showing the therapeutic effect of inflammatory bowel disease by administration of anti-AILIM antibody (administration after progression of disease state), which is represented by an index of weight loss, which is a characteristic of colitis.
  • FIG. 8 is a diagram showing the severity of colitis expressed by histological score.
  • FIG. 9 is a diagram showing the number of CD4 + cells infiltrating the colonic mucosal layer (lumina propria).
  • FIG. 10 is a graph showing the suppressive effect of inflammatory bowel disease onset by continuous administration of an anti-AILIM antibody, which is represented by an index of weight loss, which is characteristic of colitis.
  • FIG. 11 is a diagram showing the severity of colitis represented by histological scores.
  • FIG. 12 is a diagram showing the number of CD4 + cells infiltrating the colonic mucosal layer (lumina propria). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • mice which are severely immunodeficient mice (female, 6-8 weeks old; manufactured by Nippon Clear) and BALB / c mice, normal mice (male, 6-8 weeks old, manufactured by Nippon Clea) Was used.
  • mice AILIM Using the cDNA encoding the full-length amino acid sequence of the previously reported mouse AILIM (Int. Immunol., Vol. 12, No. l, p. 51-55, 2000), using gene recombination technology, follow the usual method. Thus, transformed cells expressing mouse AILIM were prepared.
  • the transformed cells were homogenized and subjected to ultracentrifugation (100,000 ⁇ g), and the centrifugation residue containing the cell membrane fraction was collected and suspended in PBS.
  • the obtained cell membrane fraction was firstly immunized (0) by injecting it into a Wistar rat hood with complete Freund's adjuvant. Further, the cell membrane fraction antigen was administered into the footpad at intervals of 7, 14, and 28 days. Two days after the last immunization, lymph node cells were collected.
  • lymph node cells and mouse myeloma cells PAI JCR NO. B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, p. 155, 1982
  • polyethylene glycol 4000 manufactured by Boehringer Mannheim
  • a clonal antibody-producing hybridoma was prepared. Selection of hybridomas was performed by culturing in ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto) containing HAT containing 10% fetal bovine serum and aminopterin.
  • the reactivity of the monoclonal antibody produced in the culture supernatant of each hybridoma to mouse AIUM was determined by reacting each culture supernatant with the recombinant mouse AILIM-expressing transformed cells.
  • the fluorescence intensity of the cells stained by reacting with IgG was confirmed by measuring with EPICS-ELITE flow cytometer overnight. As a result, multiple hybridomas producing monoclonal antibodies reactive to mouse AILIM were obtained.
  • the High Priestess de - Ma the (each 10 6 to 10 7 cells ⁇ . ⁇ mice) were injected intraperitoneally into ICR nu / nu mice (female, 7 to 8 weeks old). After 10 to 20 days, the mice were laparotomized under anesthesia, and a large amount of rat anti-mouse AILIM monoclonal antibody (IgG2a) was prepared from ascites fluid collected according to a conventional method. Hereinafter, this antibody is simply referred to as an anti-MLIM antibody.
  • IgG2a rat anti-mouse AILIM monoclonal antibody
  • inflammatory bowel disease (colitis) was induced by transferring CD45RB high to BALB / c scid / scid mice according to a previously reported method.
  • this inflammatory bowel disease model it is known that significant weight loss occurs from 3 to 5 weeks after the transfer of CD45RB high T cells with the onset and progression of inflammatory bowel disease.
  • CD4 + T cells were separated from spleen-derived mononuclear cells of healthy BALB / c mice and obtained. Specifically, spleen cells isolated from the mouse were cultured with magnetic beads to which anti-CD4 antibody was adsorbed at 40 ° C for 30 minutes, washed, and then passed through a magnetic flow column to enrich the cells. (Enrich).
  • CD4 + T cells (purity was confirmed to be 96-97% using flow cytometry overnight) were purified from Bicoerythrin (PE) -labeled anti-mouse CD4 antibody (RM4-5; PharMingen) and anti-CD4 antibody (16A; PharMingenM) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), followed by sorting using FACS Vangetage (Becton Dickins on), resulting in high CD45RB expression T cells (CD45RB hi h ) and T cells with weak CD45RB expression (CD45RB I () W ) were fractionated.
  • PE Bicoerythrin
  • RM4-5 anti-mouse CD4 antibody
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • CD45RB 1 T cells (5 ⁇ 10 5 cells / 200 ⁇ 1 PBS) obtained above were intraperitoneally injected into BALB / c scid / scid mice. (I • P.).
  • a negative control antibody (rat IgG ⁇ Sigma, 250 g / 250 ⁇ l PBS) was administered intraperitoneally every week at a frequency of 3 times / week, at the same time as CD45RB.
  • an anti-AILIM antibody 250 g / 250 l PBS was continuously intraperitoneally administered at a similar frequency every week.
  • a negative control antibody (Rat IgG, manufactured by Sigma, 250 g / 2501 PBS) was continuously intraperitoneally administered weekly at a frequency of 3 times / week.
  • the extent of progression of the inflammatory bowel disease and the extent of the onset, suppression of the progression and treatment of the disease by the anti-AIUM antibody were analyzed by measuring the body weight of each group over time immediately before the transfer of T cells.
  • the degree of progression of inflammatory bowel disease and the degree of onset, progression suppression and treatment of the disease by anti-AILIM antibody were determined for 6 weeks after transfer of T cells for some mice in group 1 and group 3. Later, the large intestine was collected and analyzed by visual inspection of its condition. As a normal control, colons collected from BALB / c scid / sc id mice to which neither CD45RB high T cells were transferred nor any antibody was administered were observed in the same manner.
  • a monoclonal antibody against mouse AILIM (IG0S), a monoclonal antibody against mouse B7RP-1, a ligand of mouse AILIM (IC0S), and a negative control antibody were used.
  • the anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody was prepared as follows. SD rats were immunized with recombinant L cells expressing mouse B7RP-1 prepared according to a conventional method. The spleen cells of the immunized rats were obtained, and the cells were fused with myeoma cells by a conventional method to prepare hybridomas. Using the culture supernatant of each hybridoma, the degree of binding of the anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody contained in the culture supernatant to mouse B7RP-1 expressing recombinant cells (NRK cells) was measured by EIA. Hybridomas producing antibodies that bind to mouse B7RP-1 were selected.
  • the anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody used in this test was prepared from the culture supernatant of the selected hybridomas.
  • the anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody also binds mouse AILIM-Ig (fused polypeptide consisting of the soluble region of mouse AILIM / ICOS and immunoglobulin Fc) to mouse B7RP-1 expressing recombinant cells. It was confirmed to have inhibitory activity.
  • rat MgG manufactured by Sigma
  • AILIM / ICOS and B7RP-1 was used as a negative control antibody.
  • inflammatory bowel disease (colitis) was induced in BALB / c scid / scid mice by introducing CD4 + CD45RB high T cells into the donor mice (J. Immunol., Vol. .164, p. 878-4882, 2000).
  • CD4 + T cells were isolated from normal BALB / c mouse spleen using an anti-CD4 (L3T4) MAGS magnetic separation system (anti-CD4 (L3T4) MACS magnetic separation system; manufactured by Miltenyi Biotec) according to the attached instruction manual. Separated from cells.
  • the CD4 + T cells (96-97% purity, FA was analyzed with CS) and labeled with PE-labeled anti-mouse CD4 antibody (RM4-5; PharMingen) and FITC-labeled anti-CD45RB antibody (16A; PharMingen), and CD45HB high T cells and FACSVantage (Becton Dickinson). Sorted into CD45RB IQW T cells.
  • the CD45RB high T cells (510 5 cells / 200 ⁇ 1 PBS) were intraperitoneally administered to BALB / c scid / scid mice to induce inflammatory bowel disease (colitis).
  • mice induced with inflammatory colitis prepared as described above were treated with an anti-mouse AILIM / ICOS monoclonal antibody (250 g / 250 g) three times a week for 7 weeks from the transfer of CD45RB lligh T cells (week 0).
  • ⁇ 1 PBS anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody
  • control antibody 250 ⁇ g / 250 l PBS
  • CD4 + CD45RB high T cells 7 weeks after transfer of CD4 + CD45RB high T cells from the colonic mucosal layer (lamina basement membrane; LP) of BALB / c scid / scid mice to which CD4 + CD45RB high T cells have been transferred (adoptive transfer) using the MACS magnetic beads described above. Later, CD4 + cells (LP CD4 + T cells) were isolated. FACS confirmed that the isolated LP CD4 + T cells were 95% or more pure.
  • the LPCD4 + T cells (1 ⁇ 10 6 cells / 200 ⁇ 1 PBS; ip) were administered to BALB / c scid / scid mice.
  • anti-AILIM / ICOS antibodies 250jug / 250jul PBS
  • negative control antibodies rat IgG; 250 / ig / 2501 PBS
  • colorectal samples obtained by immunohistochemical staining were fixed in OCT compounds, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • the tissue sections were stained with the avidin-viotin complex method.
  • the tissue section (6 / im) was purified using a biotin-labeled anti-mouse AILIM / IC0S monoclonal antibody, a biotin-labeled anti-mouse B7RP-1 monoclonal antibody, a biotin-labeled anti-mouse CD4 monoclonal antibody (RM4-5; rat IgGl; manufactured by PharMingen)
  • the cells were incubated with a biotin-labeled anti-mouse F4 / 80 monoclonal antibody (Rat IgG2; PharMingen) or a biotin-labeled isotype-matched control antibody (PharMingen).
  • biotin-labeled antibody is detected using streptavidin-biotin-labeled horseradish peroxidase-I "complex (streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase com plex; Vectastain ABC Kit; manufactured by Vector), and visible using diamine Plumbingzidine. Then, each section was stained with hematoxylin in a county.
  • Apoptotic cells were detected in frozen tissue sections using ApoTag Kit (manufactured by Intergen) according to the previously reported TUNEL method. By observing under a microscope, the tissue was counted by counting TUNEL-positive cells in 500 mucosal layer mononuclear cells (LPMC) infiltrating within 5 sites of one section. TUNEL-positive cells in the sections were quantified. The percentage of TUNEL-positive cells in 500 LPMC was used as an index of apoptosis.
  • ApoTag Kit manufactured by Intergen
  • mice treated with the anti-AILIM / ICOS antibody showed no signs of colitis, no thickening of the large intestinal wall, and a weight increase over time (FIG. 3), and were in a completely healthy state.
  • the histological score of the colon wall tissue was 0.8 ⁇ 0.7, and no obvious pathological changes were observed (FIG. 4).
  • mice with colitis mucosal layer of the large intestine is inflamed (control mice) (lamina pro pria) CD4 + T cells found in the against though been filed in 44 ⁇ 9 x l0 5 cells / large intestine, In mice treated with the anti-AILIM / ICOS antibody, the size was 21 ⁇ 3 ⁇ 10 5 cells Z colon (p ⁇ 0.01) (FIG. 5).
  • the apoptosis index by quantitative analysis of the cells in the apoptosis state in the large intestine was higher than that of the control antibody-treated mice (control mice).
  • Anti-AIUM / IC0S antibody suppresses colitis induced by transfer of CD4 + T cells from mucosal layer of colitis dona
  • mice that received the negative control antibody Compared with the mice that received the negative control antibody (control mice), the mice that received the anti-AILIM / ICOS antibody significantly improved the weight loss (Figure 10) and showed histology indicating the severity of colitis
  • the statistical score collected from the colon at 4 weeks; FIG. 11) and the infiltration of CD4 + cells into the colonic mucosal layer (4 weeks) were also significantly reduced (FIG. 12).
  • composition of the present invention (particularly preferably comprising a substance having an activity of inducing cell death; apoptosis; depletion) of cells expressing AILIM / ICOS is
  • the pharmaceutical composition of the present invention also enhances the therapeutic effect of inflammatory bowel disease and dietary allergy by using it in combination with existing drugs prescribed for the treatment of such inflammatory disease and dietary allergy. It is possible.
  • the pharmaceutical composition containing a human antibody against AILIM which is included as a part of the pharmaceutical composition of the present invention, does not cause any side effects such as allergy and the like when a mouse-derived antibody is administered to humans. Is extremely useful.

Description

明細 ΐ 炎症性腸疾患治療剤 技術分野
本発明は、 AILIM (activation inducible lymphocyte immunomodulatory mole cule ;別名を 「IC0S (inducible co-stimulator) j という。 ) の生物活性、 特 に AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有する物質を含んでなる医薬組 成物に関する。
具体的には、 本発明は、 AILIM発現細胞の増殖、 細胞死 （cell death若しくは アポトーシス （apoptosis) ) 若しくは免疫細胞溶解 (immune cytolysis) を制 御 （例えば抑制） するか、 または AILIM発現細胞によるサイトカイン （例えば、 イン夕一フエロン rまたはイン夕一ロイキン 4など） の産生を制御 （例えば抑制 ) する活性を有する物質を含んでなる医薬組成物に関する。
さらに具体的には、 本発明は、 AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を 有する物質、 特に好ましくは、 AILIM発現細胞の細胞死 (cell death; apoptosis または depletion) を誘導する物質を含んでなり、 腸管免疫の異常に伴う疾患 （ 例えば、 大腸炎 （潰瘍性大腸炎など） やクローン病等の炎症性腸疾患、 及び食餌 性アレルギー） を抑制、 治療または予防するための医薬組成物に関する。 背景技術
消化管粘膜は、 食物由来の抗原や腸内細菌叢だけでなく、 病原性微生物などの 外界に存在する生体にとって有害な様々な抗原にも常に曝されている。 従って、 消化管粘膜は、 そのような生体にとって有害である抗原に対抗するために細胞障 害活性を発揮し、 また毒素を中和するために抗体を分泌する能力を維持する一方 で、 食物などの抗原や腸内細菌叢に対しては過剰な免疫反応を抑制するといぅュ 二一クな免疫機構 （消化管粘膜免疫機構または腸管免疫機構と呼ぶ。 ） を有して いる。 つまり、 正常な粘膜免疫は、 病原体に対する正の免疫応答と、 非病原性抗 原に対する負の免疫応答のバランスの上に成立している。 の免疫学的恒常性維 持のバランスが破綻すると炎症、 アレルギ一及び感染が起とり、 炎症性腸疾患 （
Inflammatory Bowel Disease : IBD) と総称される腸疾患や食餌性アレルギーを 発症することとなる。
炎症性腸疾患の最も代表的な疾患は、 クロ一ン病 （Crohn' s disease: CD) と 大腸炎 （colitis；特には、 潰瘍性大腸炎 (Ulcerative Colitis : UC) ) であり 、 いずれも病原体を特定できない慢性反復性の腹痛発作及び下痢を症状として呈 し、 小児から若年の層の患者の日常生活に長期間にわたり著しい支障を与えるこ ととなる。 また、 大腸炎 （特には潰瘍性大腸炎） については、 大腸癌の発生の原 因ともなることから病因の解明と効果的な治療方法の開発が急務となっている。 炎症性腸疾患の発症機序については、 遺伝的要因や環境的要因など様々な可能 性が論じられてきたが、 最近になって腸管免疫 （消化管粘膜免疫） の異常が原因 である可能性が大きくなつてきている。 即ち、 何らかの原因により、 腸管粘膜に おいて、 通常であれば非病原性であり免疫原性の低い腸管内の抗原に対して過剰 な免疫応答が誘発されることにより炎症やアレルギーが起こり炎症性腸疾患が発 症するという機序である。
また、 この腸管での炎症やアレルギーに、 外来の病原体、 食物由来の抗原ある いは自己抗原に対する免疫の異常が強く関与していることが示唆されてきている 。 さらには、 最近の研究では、 ある種の常在菌に対する異常な免疫応答が慢性炎 症反応となって現れている可能性も示唆されている。
この腸管免疫の異常による腸管での炎症やアレルギーの発症機序は、 患者の T 細胞の機能及び分化、 並びに病変部や血清中のサイ トカインの産生パターンの解 析により裏付けられている。 さらに、 近年に開発された種々の炎症性腸疾患動物 モデル （Gastroenterology, Vol .109, D.1344-1367, 1995) の解析からも、 この 粘膜免疫の異常が腸管に慢性炎症を引き起こすことが明らかにされている。
例えば、 T細胞受容体 （TCR) の 鎖のノックアウトマウス （TCRor/—) での腸 管の炎症が自然発症することから、 T細胞が慢性腸炎の発症に大きく関与するこ とが明らかである （Cell, Vol.75, p.275-282, 1993; J. Exp. Med. , Vol.183, p.847-856, 1996) 。 この TCRa^—マウスにおける大腸炎では腸管での IFN rの産 生が亢進しており、 また炎症初期では IL- 1 及び IL- 1 の上昇が認められる （La boratory Investigation, Vol.76, p.385-397, 1997) 。 また、 特定の VySサブセ ヅトを持ち IL-4を産生する ( 3 dk) T細胞が消化管やリンパ節に認められる ようになる （Gastroenterology, Vol.112, p.1876-1886, 1997) 。 このモデルで は、 TCR yS T細胞の欠損によって異常 T細胞分画が増加してサイ トカイン産生 の調節異常が生じ炎症のメデイエ一夕一になつているものと考えられる。
CD4+/CD45RBhighT細胞を SCIDマウス （severe combined immunodeficient mouse ) に移入したモデルでは、 腸管における粘膜層の過形成とリンパ球の浸潤を伴つ た激しい腸炎が誘導される。 しかしながら、 この腸炎は、 細胞分画をしていない CD4+T細胞を同時に移入した場合には起こらない （J. Exp. Med. , Vol.178, p.2 37-244, 1993; Int. Immunol. , Vol.5, p.1461-1471, 1993) 。 腸炎を起こした S CIDマウスの CD4+ T細胞は IFN rを産生する。 一方で、 INF rに対する抗体の投与 で腸炎が抑制されることから、 TMタイプの T細胞が炎症を引き起こしていると 考えることができる ( Immunity, Vol.1, p.553-562, 1994) 。
このような事実から、 腸管の CD4+T細胞及びその過剰な活性化が炎症性腸疾患 の重要な因子であることは疑いようがないものとされている。
また、 炎症性腸疾患を罹患するとともに HIVに感染している患者では、 CD4+T 細胞の減少に伴って腸炎が軽症化することからもこの炎症性腸疾患に異常 CD4+T 細胞が大きく関与していることが裏付けられる （J. Clin. Gastroenterology, V 01.23, p.24-28, 1996) 。 この知見に基づき、 抗 CD4抗体による炎症性腸疾患の 治療も試みられており、 抗 CD4抗体の投与により炎症病変が抑制されることが報 告されている (Gut, Vol.40, p.320-327, 1997) 。
—方、 このような T細胞の機能調節異常とは、 即ち調節性サイト力インの産生 のバランスの喪失を意味するものである。
事実、 IL-2のノヅクァゥトマウス及び IL-10のノヅクァゥトマウスにおいても 腸炎は自然発症することが報告されている (Cell, Vol.75, p.235-261, 1993; C ell, Vol.75, p.263-274, 1993) 。 また、 これらのモデルでは IFN rの過剰産生 も観察され、 Thlタイプの T細胞の過剰反応が起こっていることが裏付けられる 。 これらのモデルでの IFN rの過剰産生については、 クローン病の病変部で IFN r の発現の亢進が認められることと共通している。 IL-10欠損マウスについては、 I L - 10を投与することにより腸炎を治療することができ、 またこの方法により CD4+ /CD45RBhighT細胞を移入した SCIDマウスでの腸炎も抑制できることが報告されて いる (Immunity, Vol.1, p.553-562, 1994) 。
上述したように、 消化管粘膜免疫の異常という側面からの炎症性腸疾患の発症 機序の解析が進み、 CD4+T細胞の活性化亢進の抑制や、 過剰産生サイ卜力インの 抑制による炎症性腸疾患の治療の可能性が示唆されてきてはいるものの、 炎症性 腸疾患の真の病因は未だ明らかにされておらず、 その有効な治療方法も提供され ていない。
一方、 T細胞の活性化 （抗原特異性の獲得） は、 T細胞がマクロファージ、 B 細胞あるいは樹状細胞などの抗原提示細胞 （antigen-presenting cells: APC) により提示される抗原を認識することにより開始される。 抗原提示細胞は、 取り 込んだ抗原をプロセッシング （加工） し、 この加工された抗原を主要組織適合性 抗原複合体 (MHC) に結合させて抗原提示する。 T細胞は、 抗原提示細胞により 提示された該加工抗原を、 その細胞膜表面に有する T細胞受容体 （TCR) と抗原 との複合体 （TCR/CD3複合体） を通じて認識することで細胞の活性化 （特異性の 獲得） のための第 1のシグナルを受ける。
T細胞の十分な活性化には、 当該第 1のシグナルに加えて、 コスティミュレィ 卜リーシグナル （副刺激シグナル； costimulatory signal) と呼ばれる第 2のシ グナルを必要とする。 T細胞は、 当該第 1のシグナルを受けた後に、 このコステ ィミュレィ トリーシグナルを受けることにより抗原特異的に活性化する。
この第 2のシグナル伝達には、 主に T細胞及び胸腺細胞で発現する細胞表面分 子である CD28 (別名： Tp44、 Τ44、 又は 9.3抗原） と抗原提示細胞 （マクロファー ジ、 単球、 樹状細胞など） で発現する細胞表面分子である CD80 (別名： B7-l、 Β7 、 ΒΒ1、 または B7/BB1) 及び同じく抗原提示細胞状の細胞表面分子である CD86 ( 別名： Β7- 2または Β70) との間の相互作用 （即ち、 それらの分子間の結合を介し た細胞間接着） が極めて重要である。
また、 この第 2のシグナルによる Τ細胞の活性化の制御には、 該第 2のシグナ ルに依存してその発現が増強されると考えられている CTLA- 4 (Cytolytic T lymp hocyte associated antigen 4) と該 CD80(B7- 1)及び CD86(B7-2)との間の相互作 用 （即ち、 それらの分子間の結合を介した細胞間接着） も重要な役割を担ってい ることが実験的に明らかにされている。 即ち、 この第 2のシグナルの伝達による T細胞の活性化の制御には、 少なくとも CD28と CD80/CD86との間の相互作用、 該 相互作用に依存すると考えられる CTLA- 4の発現の増強、 並びに CTLA- 4と CD80/CD8 6との間の相互作用が包含されることが明らかにされている。
さらに、 最近になって、 上記 CTLA- 4や CD28と同様に、 当該 T細胞等のリンパ球 の活性化に必須な第 2のシグナル （コスティミュレィ トリーシグナル） の伝達、 並びに該シグナルに連動して活性化 T細胞等の活性化リンパ球の機能制御を行う 第 3の副朿 U激伝達分子として AIL IM (activation inducible lymphocyte immunom odulatory molecule； ヒ卜、 マウス及びラヅ卜 ； Int. Immunol. , Vol.12, No. l， p.51-55, 2000；別称を IC0Sという (Inducible co-stimulator； ヒ卜 ； Nature, Vol.397, No.6716, p.263-266, 1999) ； J. Immunol. , 166(1)， p. l, 2001; J . Immunol. , 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Gommun. , 276(1) , p.335， 2000; I腿 unity, 13(1 )， p.95, 2000; J. Exp. Med. , 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol. , 30(4)， p.1040, 2000) と呼ばれる分子が同定された さらにまた、 この副刺激伝達分子 AILIMと相互作用するリガンドと考えられる B 7h、 B7RP- 1、 GL50あるいは LIC0Sと称される新規分子も同定されている （Nature, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, p.136 5-1369, 1999 ; Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol. , Vo 1.10, No.6, p.333-336, 2000) 。
この新しい 2つの分子の各々の生物学的機能、 該分子による第三のコスティミ ュレイトリ一シグナル伝達による T細胞等のリンパ球の機能制御については目下 精力的に研究が進められているところである。
一方、 上述した腸管粘膜免疫の異常並びに炎症性腸疾患 （クローン病や大腸炎 (潰瘍性大腸炎など） ） の発症と、 CD4+T細胞などの T細胞の活性化に必須と考 えられる第 3の副刺激伝達分子である AILIM (IC0S) との関連性はもとより、 並び にこの AILIM分子の機能を制御することによる炎症性腸疾患の治療の試みについ てはその示唆すらされていない。 発明の開示
即ち、 本発明は、 T細胞等のリンパ球の活性化に必須な第 2のシグナル （コス ティミュレィトリ一シグナル） の伝達、 並びに該シグナルに連動して活性化 T細 胞等の活性化リンパ球の機能制御を行う分子であると考えられる新規分子 AILIM の生物学的機能を、 医学及び薬学的手法 （例えば、 低分子化合物及び抗体等の薬 剤） により制御することにより、 炎症性腸疾患 （クローン病及び大腸炎 （潰瘍性 大腸炎など） ） などの腸管免疫の異常 （T細胞の活性化の異常、 異常 CD4+細胞の 亢進など） に伴う疾患を抑制、 治療または予防する方法及び薬剤を提供すること を目的とする。
さらには、 そのような AILIMの生物学的機能を制御する薬剤 （例えば、 低分子 化合物及び抗体等の薬剤） を用いて、 炎症性腸疾患の治療に汎用されている既存 の薬剤 （副腎皮質ホルモン、 サラゾスルファピリジンなど） による炎症性腸疾患 の治療効果を増大させる方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 哺乳動物の AILIM (IC0S) の生物学的機能、 並びに腸管免疫の 異常が深く関与する可能性を有する炎症性腸疾患 （特には、 クローン病及び大腸 炎 （潰瘍性大腸炎など） ） や食餌性アレルギーを抑制する方法に関して鋭意研究 を重ねた結果、 AILIMの機能を制御する薬剤が炎症性腸疾患 (特には、 クローン 病及び大腸炎 （潰瘍性大腸炎など） ） を有意に抑制する知見を見出し本発明を完 成するに到った。
本発明の医薬組成物は、 AILIMを発現する細胞への AILIMを介するコスティミュ レイトリ一シグナル （副刺激シグナル） の伝達が関与する種々の生体反応 （例え ば、 AILIMを発現する細胞の細胞増殖、 AILIMを発現する細胞によるサイ トカイン の産生、 AILIMを発現する細胞の免疫細胞溶解 (immune cytolysis)若しくは細 胞死 (cell death; apoptosis; depletion) 、 及び AILIMを発現する細胞に対す る抗体依存性細胞障害を誘導する活性など） を制御するための医薬品として、 及 び/または該 AILIMを介するシグナル伝達が関与する種々の疾患の発症及び/ま たは進行を抑制、 阻止し、 該疾患を治療または予防するための医薬品として有用 である。
具体的には、 本発明の医薬組成物は、 AILIM発現細胞の増殖、 アポトーシス （c ell death; apoptosis; depletion) 若しくは免疫細胞溶解 (. immune cytolysis ) の制御 （抑制または促進） または AILIM発現細胞によるサイトカイン （例えば
、 インターフェロン rまたはインターロイキン 4など） の産生を制御 （抑制また は促進） することが可能であり、 AILIMを介するシグナル伝達が関与する様々な 生理現象により惹起される種々の病的状態の抑制、 及び種々の疾患の治療または 予防を可能にする。
そのような本発明の医薬組成物の特に好ましい態様は、 AILIM発現細胞の細胞 死 （cell death; apoptosis; depletion) を誘導する物質を含んでなる医薬組成 物である。
本発明の医薬組成物を用いることにより、 腸管免疫の異常に起因する可能性を 有する疾患、 具体的には、 炎症性腸疾患 （特には、 クローン病及び大腸炎 （潰瘍 性大腸炎など） ） や食餌性アレルギーを抑制、 予防及び/または治療することが 可能である。
さらには、 本発明の医薬組成物はまた、 そのような炎症性腸疾患の治療に処方 されている既存の薬剤と併用することにより炎症性腸疾患の治療効果を増大させ ることが可能である。
即ち、 本発明は、 下記 (1 )乃至（10)に記載されるとおりの発明である。
(1 ) AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有する物質及び薬学的に許 容され得る担体を含んでなり、 腸管免疫の異常に伴う疾患を抑制、 治療または予 防するための医薬組成物。
(2) 該物質が、 AILIMを発現している細胞の細胞死を誘導する活性を有する物 質であることを特徴とする前記 ( 1 )に記載の医薬組成物。
(3) 該疾患が、 炎症性腸疾患であることを特徴とする前記（1 )または前記 (2) に記載の医薬組成物。
(4) 該炎症性腸疾患が、 大腸炎であることを特徴とする前記 (3)に記載の医薬 組成物。
(5) 該炎症性腸疾患が、 クローン病であることを特徴とする前記 (3)に記載の 医薬組成物。
(6) 該疾患が、 食餌性アレルギ一であることを特徴とする前記 ( 1 )または前記 (2)に記載の医薬組成物。
(7) 該物質が、 蛋白性物質であることを特徴とする前記 ( 1 )乃至前記 (6)のい ずれかに記載の医薬組成物。
(8) 該蛋白性物質が、 下記群から選ばれるいずれかであることを特徴とする 前記 (7)に記載の医薬組成物：
a ) AILIMに結合する抗体またはその一部；
b ) AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリべプチド；
c ) AILIMの細胞外領域の全部または一部と免疫グロプリンの重鎖の定常領域 の全部または一部とからなる融合ポリペプチド；及び
d ) AILIMに結合するポリペプチド。
(9) 該物質が、 非蛋白性物質であることを特徴とする前記 (1)乃至前記 (6)の いずれかに記載の医薬組成物。
(10) 該非蛋白性物質が、 D NA、 R NAまたは化学的に合成された化合物で あることを特徴とする前記 (9)に記載の医薬組成物。
以下、 本発明で用いられる語句の意味、 並びに物質の製造方法を明らかにする ことにより、 本発明を詳細に説明する。
本発明における 「哺乳動物」 とは、 ヒト、 ゥシ、 ャギ、 ゥサギ、 マウス、 ラヅ ト、 ハムス夕一、 及びモルモッ ト等を意味し、 好ましくは、 ヒト、 ゥシ、 ラヅ ト 、 マウスまたはハムス夕一であり、 特に好ましくは、 ヒトである。
本発明でレヽぅ 「AIUM」 とは、 Activation inducible lymphocyte i顧 unomodul atory moleculeの略称であり前述に記載したとおりの既報に報告される構造及び 機能を有する哺乳動物の細胞表面分子を意味する (J. Immunol. , 166(1), p. l, 2001 ; J. Immunol. , 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med. , 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol. , 30(4), p.1040, 2000; Int. Immunol. , 12(1) , p.51, 2000; Nature, 397(6716), p.263, 1999 ; GenBank Accession Number: BAA82129 (ヒ ト） ； BM82128 (ラヅ ト） ； BM82127 (ラヅト変異体） ； BM82126 (マウス） ） 。
特に好ましくはヒト由来の AILIMを意味する (例えば、 International Immunol ogy, Vol.12, No. l, p.51-55； GenBank Accession Number: BAA82129) 。 なお、 この AILIMは、 ICOS (Nature, Vol.397, No.6716, p. 63-266, 1999) ま たは JTT- 1抗原/ JTT- 2抗原 （曰本国特許出願公開平 Π- 29599号公報； 国際特許 出願公開 W098/38216号公報) 'とも別称されるが、 それらの分子は互いに同一の分 子を意味する。
また、 本発明で言う 「AILIM」 には、 該既報の文献中に記載された各々の哺乳 動物の AILIMのアミノ酸配列、 特に好ましくはヒト AILIMのアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。 さらにまた、 既に同 定されているラット由来の AILIM変異体 (GenBank Accession Number: BAA82127 ) と同様のヒト AILIM変異体も本発明における「AILIM」 に包含される。
ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」 とは、 該既報のアミノ酸配列 を含むポリぺプチドと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、 該アミノ酸配 列中の複数個のアミノ酸、 好ましくは 1乃至 1 0個のアミノ酸、 特に好ましくは 1乃至 5個のアミノ酸が置換、 欠失及び/または修飾されているァミノ酸配列を 有するポリペプチド、 並びに該アミノ酸配列に、 複数個のアミノ酸、 好ましくは 1乃至 1 0個のァミノ酸、 特に好ましくは 1乃至 5個のアミノ酸が付加されたァ ミノ酸配列を有するポリペプチドも本願発明の 「AILIM」 の範囲に包含されるこ とを意味する。
そのようなアミノ酸の置換、 欠失、 または挿入は常法に従って行うことができ る （実験医学別冊 · 「遺伝子工学ハンドブック」 （1992)など） 。
例えば、 合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法 （gapped duplex) 法、 亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、 Bal3 1酵素等により欠失変異体を作製する方法、 カセット変異法、 リンカースキヤ二 ング法、 ミスインコーポレーション法、 ミスマッチプライマ一法、 DNAセグメン ト合成法などを挙げることができる。
合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入 （gapped duplex) 法は、 例えば下 記のように行うことができる。 アンバー変異をもつ M13ファージベクターに変異 誘起を希望する領域をクローニングし、 一本鎖ファージ DNAを調製する。 アンバ —変異をもたない M13ベクターの RFIDNAを制限酵素処理により線状とし、 上記の 一本鎖ファージ DNAと混合して変性後、 ァニールさせ、 「gapped duplex DNA」 を 形成させる。 これに変異を導入した合成ォリゴヌクレオチドをハイプリダイズさ せ、 DNAポリメラ一ゼと DNAリガーゼの反応により閉環状 2本鎖 DNAとする。 この DN Aをミスマツチ修飾能が欠損している大腸菌 mutS株にトランスフエクシヨンし、 増殖したファージをサブレッサ一機能のない大腸菌に感染させ、 アンバー変異を 持たないファージだけを選択する。
また、 亜硝酸による点突然変異を導入する方法は、 例えば下記のような原理を 利用する。 MAを亜硝酸処理すると塩基が脱ァミノ化されて、 アデニンはヒポキ サンチンに、 シトシンはゥラシルに、 グァニンはキサンチンになる。 脱ァミノ化 された MAを細胞に導入すると、 MA複製時にヒポキサンチンはシトシンと、 ゥラ シルはアデニンとキサンチンはチミンと塩基対を形成するため、 「A:T」 が 「G:C 」 へ、 「G:C」 が 「A:T」 へと置換する。 実際には亜硝酸処理した一本鎖 DNA断片 を 「gapped duplex DNAj にハイブリダィズさせ、 以下、 合成オリゴヌクレオチ ド指定突然変異導入 （gapped duplex) 法と同様に操作して変異株を分離すれば よい。
本発明を構成する 「AILIM発現細胞によるサイ トカインの産生」 における 「サ ィ トカイン」 とは、 AILIMを発現する細胞 （特に、 T細胞） が産生する任意のサ ィ トカインを意味する。
該 T細胞は、 TMタイプの T細胞及び Th2タイプの T細胞が挙げられ、 本発明に おける該サイ トカインは、 特にそれら Thlタイプの T細胞が産生するサイ トカイ ン及び/または ¾2タイプの T細胞が産生する任意のサイ トカインを意味する。
Thlタイプの T細胞が産生するサイ トカインとしては、 IFN- r、 IL-2、 TNF、 I L - 3などが挙げられ、 また Th2タイプの T細胞が産生するサイ 卜力インとしては、 11-3, IL- 4、 IL - 5ヽ IL- 10、 TNFなどが挙げられる （細胞、 Vol.30, No.9, p.343- 346, 1998) o
本発明を構成する 「物質」、 「AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を 有する物質」 、 「AILIM発現細胞の増殖を抑制するか、 または AILIM発現細胞によ るサイ トカインの産生を抑制する活性を有する物質」 、 「AILIMを発現する細胞 の細胞死を誘導する活性を有する物質」 には、 自然界に存在する天然の物質ある いは人工的に調製される任意の物質を意味する。
本発明における該 「物質」 の特に好適な態様は、 AILIMを発現する細胞の細胞 死 (cell death; apoptosis; depletion) を誘導する活性を有する物質である。 ここで、 「AILIMを介するシグナル伝達」 とは、 上述または後述する実施例で 詳述するような AILIMを発現する細胞に任意の表現型の変化 （細胞増殖、 細胞の 活性化、 細胞の不活性化、 細胞死、 及び/または AILIM発現細胞からの任意のサ ィ トカインの産生能の変化） をもたらすような AILIMを通じたシグナル伝達を意 味する。
該 「物質」 は、 「蛋白性物質」 と 「非蛋白性物質」 に大別することができる。 該 「蛋白性物質」 としては、 後述するポリペプチド、 抗体 （ポリクローナル抗 体、 モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の一部） が挙げられる。 該物質が抗体である場合には、 好ましくはモノクローナル抗体である。 該物質 がモノクローナル抗体である場合には、 非ヒト哺乳動物由来のモノクロ一ナル抗 体だけでなく、 後述する組換えキメラモノクロ一ナル抗体、 組換えヒト型モノク 口一ナル抗体及びヒトモノクローナル抗体が包含される。
該物質が、 ポリぺプチドである場合には、 後述するポリぺプチド、 該ポリぺプ チドの断片 （オリゴペプチド） 、 融合ポリペプチド、 及びそれらいずれかの化学 修飾体が包含される。 オリゴペプチドとしては、 5乃至 30個のアミノ酸、 好まし くは 5乃至 20個のァミノ酸からなるべプチドを挙げることができる。 該化学修飾 は、 生体に投与された場合の血中半減期の増大あるいは経口投与時における消化 管での分解に対する耐性若しくは吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じて設 1 3 計することができる。
該ポリぺプチドの具体例としては、 後述する下記が挙げられる。
( l)AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリぺプチド；
( 2 )AIL IMの細胞外領域の全部または一部と免疫グロプリンの重鎖の定常領域の 全部または一部とからなる融合ポリペプチド；または、
(3)AILIMに結合するポリべプチド。
該「非蛋白性物質」 としては、 MA、 RNA及び化学的に合成された化合物が挙げ られる。
ここで、 「MA」 とは、 前述の AILIM (好ましくはヒト AILIM) をコ一ドする DNA (cDNA及びゲノミヅク DNAを含む） の塩基配列を基に設計されるアンチセンス DNA 医薬として有用な 「該 DNAの部分塩基配列を含む DNAあるいはそれらを化学修飾し た化学修飾 DNA」 を意味する。 即ち、 該アンチセンス DNAは、 AILIMをコードする D NAまたは RNAにハイプリダイズすることにより、 該 AILIMをコードする DNAの mRNA への転写あるいは該 mRNAの蛋白への翻訳を阻害することができる。
ここで、 「部分塩基配列」 とは、 任意の部位における任意の数の塩基からなる 部分塩基配列を意味する。 該部分塩基配列としては、 連続した 5乃至 100塩基の 部分塩基配列が挙げられ、 好ましくは、 連続した 5乃至 70塩基の部分塩基配列、 さらに好ましくは連続した 5乃至 50塩基の部分塩基配列、 より好ましくは連続し た 5乃至 30塩基の部分塩基配列が挙げられる。
また、 該 MAをアンチセンス医薬として用いる場合には、 該 MAが患者の体内に 投与された場合の血中半減期の増大 （安定性） 、 細胞内膜の透過性の増大、 ある いは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目 的のために、 該 DNAの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。 化学 修飾としては、 例えば、 オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、 リボース、 核酸塩基、 糖部位、 3'及び/または 5'末端等の化学修飾が挙げられる。
リン酸結合の修飾としては、 1以上の該結合を、 ホスホジエステル結合 （D-ォ リゴ） 、 ホスホロチォェ一ト結合、 ホスホロジチォェ一ト結合 （S-オリゴ） 、 メ チルホスホネ一ト結合 （MP-オリゴ） 、 ホスホロアミデート結合、 非リン酸結合 及びメチルホスホノチォエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変 更を挙げることができる。 リボースの修飾としては、 2，-フルォロリボースある いは 2' - 0-メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修 飾としては、 5-プロピニルゥラシルまたは 2-ァミノアデニンなどへの変更が挙げ られる。
ここで、 「RNAj とは、 前述の AILIM (好ましくはヒト AILIM) をコードする RNA の塩基配列を基に設計されるアンチセンス RNA医薬として有用な 「該 RNAの部分塩 基配列を含む RNAあるいはそれらを化学修飾した化学修飾 RNA」 を意味する。 該ァ ンチセンス RNAは、 AILIMをコードする DNAにハイブリダィズすることにより、 該 A ILIMをコ一ドする DNAまたは RNAにハイブリダィズすることにより、 該 AILIMをコ 一ドする DNAの mRNAへの転写あるいは該 m Aの蛋白への翻訳を阻害することがで ぎる。
ここで、 「部分塩基配列」 とは、 任意の部位における任意の数の塩基からなる 部分塩基配列を意味する。 該部分塩基配列としては、 連続した 5乃至 100塩基の 部分塩基配列が挙げられ、 好ましくは、 連続した 5乃至 70塩基の部分塩基配列、 さらに好ましくは連続した 5乃至 50塩基の部分塩基配列、 より好ましくは連続し た 5乃至 30塩基の部分塩基配列が挙げられる。
該アンチセンス RNAは、 該 RNAが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増 大、 細胞内膜の透過性の増大、 あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性 の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、 該 RNAの塩基配列の一部に化学 修飾を施すことが可能である。 化学修飾としては、 例えば、 前述のアンチセンス DNAに適用されるような化学修飾を挙げることができる。
「化学的に合成された化合物」 とは、 上述の； D N A、 R N A及び蛋白性物質を 除く任意の化合物であって、 分子量約 100乃至約 1， 000以下の化合物、 好ましくは 分子量約 100乃至約 800の化合物であり、 より好ましくは分子量約 100乃至約 600の 化合物を挙げることができる。
前記 「物質」 の定義に包含される 「ポリペプチド」 とは、 AILIM (好ましくは ヒトの AILIM) を構成するポリペプチド鎖の一部 （断片） を意味し、 好ましくは A ILIMを構成するポリべプチドの細胞外領域の全部またはその一部を意味する （該 領域は所望に応じその N末端及び/または C末端に 1乃至 5のァミノ酸が付加さ れていてもよい。 ） 。
本発明で係る AILIMは、 1または 2のポリべプチド鎖により構成される細胞膜 を貫通する細胞膜貫通分子である。
ここで 「細胞膜貫通蛋白」 とは、 多くの受容体あるいは細胞膜表面分子に見ら れるように、 膜の脂質二重層を 1回または数回貫通する疎水性ペプチド領域によ り膜と連結し、 全体として細胞外領域 (extracellular region), 膜貫通領域 (tra nsmembrane region)及び細胞質領域（cytoplasmic region)の 3つの主領域から構 成される構造をとる蛋白を指す。 さらにそのような膜貫通性蛋白は、 モノマー（m onomer) として、 または、 同一のアミノ酸配列を有するもう 1本の鎖あるいは異 なるアミノ酸配列を有する鎖とともにそれぞれホモダイマ一（homodimer) 、 へテ 口ダイマ―（heterodimer )あるいはオリゴマー（ origomer)を形成して存在するこ とにより、 各々の受容体や細胞表面分子を構成する。 ' ここで 「細胞外領域」 とは、 前述のような細胞膜膜貫通蛋白の全体構造のうち 、 該膜蛋白が連結している膜の外界側に存在する部分構造 （部分領域） の全部ま たは一部を意味し、 換言すれば、 膜内に取り込まれている領域 （膜貫通領域） 及 び該膜内の領域に引き続いて細胞質内に存在する領域 （細胞内領域） 以外の領域 の全部または一部を意味する。
前述の 「蛋白性物質」 に包含される 「融合ポリペプチド」 とは、 AILIM (好ま しくはヒトの AILIM) を構成するポリペプチドの細胞外領域の全部または一部と 「免疫グロプリン （Ig、 好ましくはヒトの Ig) の重鎖の定常領域の全部または一 部」 とからなる融合ポリペプチドである。 好ましくは AIL IMの細胞外領域とヒト I gGの重鎖の定常領域の一部との融合ポリぺプチドであり、 特に好ましくは AILIM の細胞外領域とヒト IgGの重鎖のヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH3ドメインから なる領域 （Fc) との融合ポリペプチドである。 なお、 IgGとしては、 IgGlが好ま しい。 また、 AILIMとしては、 ヒト、 マウスまたはラヅト （好ましくはヒト） の A ILIMが好ましい。
ここで 「免疫グロプリン （Ig) の重鎖の定常領域の全部または一部」 とは、 好 ましくはヒト由来の免疫グロブリンの重鎖 （Heavy Chain, H鎖） の定常領域 (C onstant region)、 Fc領域またはそれらの一部を意味する。 該免疫グロブリンは 、 どのようなクラス及びサブクラスに属する免疫グロブリンであってもよく、 具 体的には、 IgG (IgGl, IgG2、 IgG3及び IgG4)、 IgMヽ IgA ( IgAl及び IgA2)、 IgD 及び IgEを挙げることができる。 好ましくは、 IgG (IgGlN IgG2s IgG3若しくは Ig G4) 、 または IgMである。 本発明における特に好ましい例としては、 ヒト由来の I gG (IgGl、 IgG2、 IgG3若しくは Ig(M) に属する免疫グロブリンである。
免疫グロブリンは、 2つの相同な軽鎖 （Light Chain, L鎖） と 2つの相同な 重鎖 （Heavy Chain, H鎖） の 4つの鎖が、 ジスルフィ ド結合 （S- S結合） で結合 した Y字形の構造単位を有する。 軽鎖は、 軽鎖可変領域 （VJ 及び軽鎖定常領 域 （CL) から構成される。 重鎖は、 重鎖可変領域 （VH) と重鎖定常領域 （CH) から構成される。
重鎖定常領域は、 クラス （IgG、 IgM, IgAs IgD及び IgE) 並びにサブクラス （I gGl、 IgG2N IgG3 IgG4、 IgAl及び IgA2) 毎に各々固有のアミノ酸配列を有する いくつかのドメインから構成される。
IgG (IgGlヽ IgG2、 IgG3及び IgG4) の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 CHIドメ イン、 ヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH3ドメインから構成される。
同様に IgGlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C r Jドメイン、 ヒンジ領域、 C r，2ドメイン及び C r，3ドメインから構成される。 IgG2の重鎖は、 N末端か ら順に、 VH、 Cr2lドメイン、 ヒンジ領域、 〇 22ドメィン及び( 23ドメィ ンから構成される。 IgG3の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cr3lドメイン、 ヒ ンジ領域、 Cr32ドメイン及び Cr33ドメインから構成される。 IgG4の重鎖は
、 N末端から順に、 vH、 Cr4iドメイン、 ヒンジ領域、 Cr42ドメイン及び c r43ドメインから構成される。
IgAの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C 1ドメイン、 ヒンジ領域、 Cひ 2ドメ ィン及び C 3ドメインから構成される。
同様に IgAlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cc^lドメイン、 ヒンジ領域、 C ドメイン及び Co? ドメインから構成される。 IgA2の重鎖は、 N末端か ら順に、 VH、 C 21ドメイン、 ヒンジ領域、 C 22ドメイン及び Ca23ドメィ ンから構成される。
IgDの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C SIドメイン、 ヒンジ領域、 CS2ドメ ィン及び C S3ドメインから構成される。
IgMの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C〃lドメイン、 C i2ドメイン、 C〃3 ドメイン及び C〃4ドメインから構成され、 IgG、 IgA及び IgDに見られるようなヒ ンジ領域を有しない。
IgEの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cslドメイン、 Cど 2ドメイン、 Cど 3 ドメイン及び Cど 4ドメインから構成され、 IgG、 IgA及び IgDに見られるようなヒ ンジ領域を有しない。
さらに、 IgGを例に挙げるならば、 IgGをパパインで処理すると、 2つの重鎖を 連結させているヒンジ領域中に存在するジスルフィ ド結合のやや N末端側で切断 されて、 VH及び CH1からなる重鎖断片と 1つの軽鎖がジスルフィ ド結合で連結 した 2つの相同な Fab、 並びにヒンジ領域、 CH2ドメイン及び CH3ドメインから なる 2つの相同な重鎖断片がジスルフィ ド結合で連結した 1つの Fcを生ずる （以 上、 「免疫学イラストレイテツド」 、 原書第 2版、 第 65〜75頁、 1992年、 南江堂 発行、 及び 「最新医科学の焦点 「免疫系の認識機構」 」 、 第 4〜7頁、 1991年、 南 江堂発行など参照） 。
即ち、 上述の 「免疫グロプリンの重鎖の定常領域の一部」 とは、 上述のような 構造的特徴を有する免疫グロプリンの重鎖の定常領域一部を意味し、 好ましくは
、 C1ドメインを欠く定常領域または F c領域である。 具体的には、 IgG、 また は IgDの場合には、 各々のヒンジ領域、 C2ドメイン及び C3ドメインからなる領域 が挙げられ、 IgMまたは IgEの場合には、 各々の C2ドメイン、 C3ドメイン及び C4ド メインからなる領域が挙げられる。 とりわけ好ましい例としては、 ヒト由来の Ig G1の Fc領域を挙げることができる。
上述の融合ポリべプチドは、 前述のような IgG等の免疫グロリンの定常領域の 一部 （例えば、 Fc) を融合パートナーとして有することから、 該免疫グロブリン 断片に特異的に結合するというプロティン Aの性質を用いたァフィニティーカラ ムクロマトグラフィーを用いることにより該融合ポリべプチドを極めて容易に精 製することが可能であるという点で利点を有する。 さらに、 種々の免疫グロプリ ンの Fcに対する種々の抗体が提供されていることから、 該 Fcに対する抗体を用い て、 該融合ポリペプチドのィムノアッセィを簡便に行うことができる。
前記 「物質」 の定義に包含される 「ポリペプチド」 には、 また !" AILIMに結 合するポリペプチド」 が包含される。
「AILIMに結合するポリペプチド」 としては、 具体的には、 AILIMと相互作用す るリガンドである既知の B7h、 B7RP-1, GL50あるいは LIC0Sと称される分子 （Natu re, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, p. 1365-1369, 1999； J. Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol. , Vol.10, No.6, p.333-336, 2000) を構成するポリペプチドの全部または一部を 含むポリぺプチドが挙げられる。
好ましくは、 上記リガンド （B7h、 B7RP-1N GL50, LIC0S) の細胞外領域の全部 または一部を含むポリペプチド、 または該ポリペプチドと免疫グロブリン （好ま しくはヒト免疫グロブリン） の重鎖の定常領域の全部または一部とからなる融合 ポリペプチドである。 ここで、 「細胞外領域」 及び 「免疫グロプリンの重鎖の定 常領域」 なる用語については、 上述と同様の意味を有する。
上述したポリペプチド、 該ポリペプチドの一部 （断片） 及び融合ポリペプチド は、 後述するような遺伝子組換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等の ような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜 用いることにより製造することができる。
本発明における 「抗体」 とは、 前記で定義した哺乳動物の AILIM (特に好まし くはヒト AILIM) に対するポリクローナル抗体 （抗血清） あるいはモノクロ一ナ ル抗体を意味し、 好ましくはモノクロ一ナル抗体である。
具体的には、 AILIMに結合し AILIM発現細胞の増殖を抑制するか、 または AILIM に結合し AILIM発現細胞によるィン夕一フエロン r若しくはィン夕一ロイキン 4 の産生を抑制する活性を有する抗体である。
本発明の 「抗体」 は、 本発明の AILIMを発現する細胞 （天然の細胞、 株化細胞 、 腫瘍細胞など） 、 AILIMをその細胞表面に高発現するように遺伝子組換技術を 用いて作製された形質転換体、 AILIMを構成するポリペプチド、 該 AILIMポリぺプ チド、 または AILIMの細胞外領域を含む前述の融合ポリぺプチドを抗原として用 い、 該抗原をマウス、 ラヅ ト、 ハムス夕一、 モルモッ トあるいはゥサギ等の哺乳 動物に免疫して得られる天然型抗体、 遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメ ラ抗体及びヒト型抗体 （CDR-grafted抗体） 、 並びにヒト抗体産生トランスジェ ニヅク動物等を用いて製造され得るヒト抗体も包含する。
モノクローナル抗体には、 IgG、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgE等のいずれのアイ ソタイプを有するモノクローナル抗体もが包含される。 好ましくは、 IgGまたは I gMである。
ポリクロ一ナル抗体 （抗血清） あるいはモノクローナル抗体は、 既存の一般的 な製造方法によって製造することができる。 即ち、 例えば、 前述のような抗原を 、 必要に応じてフロイントアジュバント （Frernu s Adjuvant) とともに、 哺乳 動物、 好ましくは、 マウス、 ラヅ ト、 ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ブ夕、 ャギ、 ゥマあるいはゥシ、 より好ましくはマウス、 ラヅ ト、 ハムス 夕一、 モルモットまたはゥサギに免疫する。
ポリクローナル抗体は、 該免疫感作動物から得た血清から取得することができ る。 またモノクローナル抗体は、 該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己 抗体産生能のない骨髄腫系細胞 （ミエローマ細胞） からハイプリ ドーマを調製し 、 該ハイブリ ドーマをクローン化し、 哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異 的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって 製造される。
モノクローナル抗体は、 具体的には下記のようにして製造することができる。 即ち、 前述のような抗原を免疫原とし、 該免疫原を、 必要に応じてフロイントァ ジュバント （FreuiKf s Adjuvant) とともに、 非ヒト哺乳動物、 具体的には、 マ ウス、 ラヅ ト、 ハムスター、 モルモヅ トあるいはゥサギ、 好ましくはマウス、 ラ ットあるいはハムスター （後述するヒト抗体産生トランスジエニックマウスのよ うな他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジヱニック動物を 含む） の皮下内、 筋肉内、 静脈内、 フッドパッド内あるいは腹腔内に 1乃至数回 注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。 通常、 初回免疫から約 1乃至 14日毎に 1乃至 4回免疫を行って、 最終免疫より約 1乃至 5日後に免疫感 作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。 免疫を施す回数及び時間的 インターバルは、 使用する免疫原の性質などにより、 適宜変更することができる モノクロ一ナル抗体を分泌するハイプリ ドーマの調製は、 ケーラ一及びミルシ ユタインらの方法 (Nature, Vol.256, p. 95-497, 1975) 及びそれに準じる修飾 方法に従って行うことができる。 即ち、 前述の如く免疫感作された非ヒト哺乳動 物から取得される脾臓、 リンパ節、 骨髄あるいは扁桃等、 好ましくは脾臓に含ま れる抗体産生細胞と、 好ましくはマウス、 ラット、 モルモット、 ハムス夕一、 ゥ サギまたはヒト等の哺乳動物、 より好ましくはマウス、 ラットまたはヒト由来の 自己抗体産生能のないミエ口一マ細胞との細胞融合させることにより調製される 細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、 例えばマウス由来ミエローマ
P3/X63-AG8.653 (653) 、 P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1) 、 P3/X63-Ag8.Ul (P3U1) 、 SP 2/0 - Agl4 (Sp2/0、 Sp2) 、 PAI、 F0、 NSOあるいは BW5147、 ラット由来ミエローマ 210RCY3- Ag.2.3.、 ヒト由来ミエローマ U- 266AR1、 GM1500-6TG- Al- 2、 UC729-6, C EM-AGR, D1M1あるレ、は CEM-T15を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマクローンのスクリ一ニングは、 ハイプリ ドーマを、 例えばマイクロタイ夕一プレート中で培養し、 増殖の見られ たゥエルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、 例え ば RIAや ELISA等の酵素免疫測定法によつて測定することにより行なうことができ る。
ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、 ハイブリ ドーマをインビ トロ、 またはマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスターまたはゥサギ等、 好まし くはマウスまたはラヅト、 より好ましくはマウスの腹水中等でのィンビボで行い
、 得られた培養上清、 または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが できる。
インビトロで培養する場合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び 培養方法等の種々条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養 培地あるレゝは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施 することが可能である。
基本培地としては、 例えば、 Ham' F12培地、 MCDB153培地あるいは低カルシウム MEM培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D-MEM培地、 RPMI1640 培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、 該基本培 地は、 目的に応じて、 例えば血清、 ホルモン、 サイ トカイン及び/または種々無 機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、 精製は、 上述の培養上清あるいは腹水を、 飽和硫 酸アンモニゥム、 ユーグロブリン沈澱法、 力プロイン酸法、 力プリル酸法、 ィォ ン交換クロマトグラフィー （DEAEまたは DE52等） 、 抗ィムノグロブリンカラムあ るいはプロティン Aカラム等のァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーに供す ること等により行うことができる。
「組換えキメラモノクローナル抗体」 は、 遺伝子工学的に作製されるモノクロ ーナル抗体であって、 具体的には、 その可変領域が、 非ヒト哺乳動物 （マウス、 ラヅト、 ハムスターなど） のィムノグロブリン由来の可変領域であり、 かつその 定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス /ヒ トキメラモノク口一ナル抗体等のキメラモノクロ一ナル抗体を意味する。 ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、 IgG (IgGl, IgGZ, IgG35 IgG4) 、 I gM、 IgAs IgD及び IgE等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有する が、 組換えキメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソ夕ィプに属す るヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。 好ましくは、 ヒト IgGの定 常領域である。
組換えキメラモノク口一ナル抗体は、 例えば以下のようにして製造することが できる。 しかしながら、 そのような製造方法に限定されるものでないことは言う までもない。
例えば、 マウス/ヒトキメラモノクローナル抗体は、 実験医学 （臨時増刊号） 、 第 1.6卷、 第 10号、 1988年及び特公平 3-73280号公報等を参照しながら作製する ことができる。 即ち、 マウスモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマから 単離した該マウスモノクローナル抗体をコードする D N Aから取得した活性な V H遺伝子 （H鎖可変領域をコードする再配列された VDJ遺伝子） の下流に、 ヒトイ ムノグロムリンをコードする D N Aから取得した C H遺伝子 （ H鎖定常領域をコ —ドする c遺伝子） を、 また該ハイプリドーマから単離したマウスモノクローナ ル抗体をコ一ドする D N Aから取得した活性な VL遺伝子 （ L鎖可変領域をコ一 ドする再配列された VJ遺伝子） の下流にヒトイムノグロムリンをコードする D N Aから取得した CL遺伝子 （L鎖定常領域をコードする C遺伝子） を、 各々発現 可能なように配列して 1つ又は別々の発現べクタ一に挿入し、 該発現べクタ一で 宿主細胞を形質転換し、 該形質転換細胞を培養することにより作製することがで きる。
具体的には、 まず、 マウスモノクローナル抗体産生ハイプリドーマから常法に より D N Aを抽出後、 該 D N Aを適切な制限酵素 （例えば EcoRI、 Hind I I I等） を用いて消化し、 電気泳動に付して （例えば 0.7%ァガロースゲル使用） サザン ブロット法を行う。 泳動したゲルを例えばェチジゥムブ口マイド等で染色し、 写 真撮影後、 マ一カーの位置を付し、 ゲルを 2回水洗し、 0.25Mの HC1溶液に； 15分間 浸す。 次いで、 0.4Nの NaOH溶液に 10分間浸し、 その間緩やかに振盪する。 常法に より、 フィル夕一に移し、 4時間後フィルターを回収して 2 x SSCで 2回洗浄する。 フィル夕一を十分乾燥した後、 ペイキング （75°C、 3時間） を行う。 ペイキング 終了後に、 該フィル夕一を 0. 1 x SSC/0.1%SDS溶液に入れ、 65°Cで 30分間処理す る。 次いで、 3 x SSC/0. 1 %SDS溶液に浸す。 得られたフィル夕一をプレハイプリ ダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、 65°Cで 3〜4時間処理する。
次に、 この中に3 2 P標識したプローブ D N A及びハイプリダイゼーション液 を入れ、 65°Cで 12時間程度反応させる。 ハイブリダィゼーシヨン終了後、 適切な 塩濃度、 反応温度および時間 （例えば、 2 x SSC/0. 1 SDS溶液、 室温、 10分間） の もとで、 フィル夕一を洗う。 該フィル夕一をビニール袋に入れ、 2 X SSCを少量加 え、 密封し、 ォ一トラジォグラフィ一を行う。
上記サザンブロット法により、 マウスモノクローナル抗体の H鎖及び L鎖を各 々コ一ドする再配列された VDJ遺伝子及び VJ遺伝子を同定する。 同定した D NA 断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、 ファージぺクタ一 （例えば、 Charon 4Aヽ Charon 28, Λ EMBL3, AEMBL4等） に組み込み、 該ファ- で大腸菌 （例えば、 LE392、 NM539等）を形質転換し、 ゲノムライプラリーを作製 する。 そのゲノムライブラリ一を適当なプローブ （H鎖 J遺伝子、 L鎖 （ J 遺伝子等） を用いて、 例えばベントンデイビス法 （Science, Vol.196, p.180-18 2, 1977) に従って、 プラークハイブリダィゼーシヨンを行い、 再配列された VDJ 遺伝子あるいは VJ遺伝子を各々含むポジテイブクローンを得る。 得られたクロー ンの制限酵素地図を作製し、 塩基配列を決定し、 目的とする再配列された VH(VD J)遺伝子あるいは VL(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。 一方、 キメラ化に用いるヒト CH遺伝子及びヒト CL遺伝子を別に単離する。 例 えば、 ヒト IgGlとのキメラ抗体を作製する場合には、 CH遺伝子である Cyl遺伝 子と CL遺伝子である C 遺伝子を単離する。 これらの遺伝子はマウス免疫グロ プリン遺伝子とヒト免疫グロプリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒ ト C r 1遺伝子及びヒト C 遺伝子に相当するマウス C y 1遺伝子及びマウス C κ 遺伝子をプローブとして用い、 ヒトゲノムライブラリーから単離することによつ て得ることができる。
具体的には、 例えば、 クローン Igl46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.753 p.4709-4713, 1978年) からの 3kbの Hind III—BamHI断片とクロ一ン MEP10 (Pro c. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.78, p. 74-478, 1981) からの 6.8kbの EcoRI断 片をプローブとして用い、 ヒ卜のラムダ Charon 4Aの Hae III— Alulゲノムライ ブラ、）一 (Cell, Vol.15, p.1157-1174, 1978) 中から、 ヒト C c遺伝子を含み 、 ェンハンサ一領域を保持している DNA断片を単離する。 また、 ヒト Cyl遺 伝子は、 例えばヒト胎児肝細胞 DN Aを Hind IIIで切断し、 ァガ口一スゲル電気 泳動で分画した後、 5.9kbのバンドを λ788に揷入し、 前記のプローブを用いて単 離する。
このようにして単離されたマウス VH遺伝子とマウス VL遺伝子、 及びヒト CH遺 伝子とヒト cL遺伝子を用いて、 プロモーター領域及びェンハンサ一領域などを 考慮しながらマウス VH遺伝子の下流にヒト CH遺伝子を、 またマウス VL遺伝子 の下流にヒト CL遺伝子を、 適切な制限酵素及び D NAリガ一ゼを用いて、 例え ば pSV2gptあるいは pSV2neo等の発現ベクターに常法に従って組み込む。 この際、 マウス VH遺伝子/ヒト CH遺伝子とマウス 遺伝子/ヒト Ct遺伝子のキメラ遺 伝子は、 一つの発現ぺク夕一に同時に配置されてもよいし、 各々別個の発現べク 夕一に配置することもできる。
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、 例えば P3X63'Ag8' 653細胞あるいは SP210細胞といった、 自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞に プロトプラスト融合法、 DEAE—デキストラン法、 リン酸カルシウム法あるいは電 気穿孔法等により導入する。 形質転換細胞は、 発現ベクターに導入された薬物耐 性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、 目的とするキメラモ ノクロ一ナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノク ローナル抗体を取得する。
「ヒト型モノクローナル抗体 （CDR- grafted抗体） 」 は、 遺伝子工学的に作製 されるモノクローナル抗体であって、 具体的には、 その超可変領域の相補性決定 領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物 （マウス、 ラット、 ハムスターなど） の モノクロ一ナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、 その可変領 域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、 かつそ の定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト 型モノクローナル抗体を意味する。
ここで、 超可変領域の相補性決定領域とは、 抗体の可変領域中の超可変領域に 存在し、 抗原と相補的に直接結合する部位である 3つの領域 （Complementarity- determining residue； CDR1、 CD 2 CDR3) を指し、 また可変領域の枠組領域と は、 該 3つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された 4つの領域 （Fram ework region； FR1、. FR2、 FR3 F 4) を指す。 換言すれば、 非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域の相補性 決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、 ヒトイムノグロプリンの対応領 域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、 IgG (IgGl, lgG2, IgG35 IgG4)、 I gM、 IgA、 IgD及び IgE等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有する が、 本発明においては、 該ヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイ ソ夕ィプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であつてもよい。 好ましくは 、 ヒト IgGの定常領域である。 また、 ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠 組領域についても限定されるものではない。
ヒト型モノクローナル抗体は、 例えば以下のようにして製造することができる 。 しかしながら、 そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでも ない。
例えば、 マウスモノクロ一ナル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体 は、 特表平 4- 506458号公報及び特開昭 62-296890号公報等を参照して、 遺伝子ェ 学的に作製することができる。 即ち、 マウスモノクローナル抗体を産生するハイ プリ ドーマから、 少なくとも 1つのマウス H鎖 CDR遺伝子と該マウス H鎖 CDR遺伝 子に対応する少なくとも 1つのマウス L鎖 CDR遺伝子を単離し、 またヒトイムノ グロプリン遺伝子から前記マウス H鎖 CDRに対応するヒト H鎖 CDR以外の全領域を コードするヒト H鎖遺伝子と、 前マウス L鎖 CDIUこ対応するヒト L鎖 CDR以外の全 領域をコードするヒト L鎖遺伝子を単離する。
単離した該マゥス H鎖 CDR遺伝子と該ヒト H鎖遺伝子を発現可能なように適当 な発現ベクターに導入し、 同様に該マウス L鎖 CDR遺伝子と該ヒト L鎖遺伝子を 発現可能なように適当なもう 1つの発現ベクターに導入する。 または、 該マウス H鎖 CDR遺伝子/ヒト H鎖遺伝子とマウス L鎖 CDR遺伝子/ヒト L鎖遺伝子を同一 の発現べク夕一に発現可能なように導入することもできる。 このようにして作製 された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノク口一ナル 抗体産生形質転換細胞を得、 該形質転換細胞を培養することにより培養上清中か ら目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。
「ヒトモノクロ一ナル抗体」 とは、 ィムノグロブリンを構成する H鎖の可変領 域及び H鎖の定常領域並びに L鎖の可変領域及び L鎖の定常領域を含む全ての領 域がヒトイムノグロプリンをコ一ドする遺伝子に由来するィムノグロプリンであ る。
ヒト抗体 （好ましくはヒトモノクローナル抗体） は、 常法に従って、 例えば、 少なくともヒトイムノグロプリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遗伝 子座中に組込むことにより作製されたトランスジエニック動物を、 抗原で免疫感 作することにより、 前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の 作製法と同様にして製造することができる。
例えば、 ヒト抗体を産生するトランスジエニックマウスは、 Nature Genetics, Vol.7, p.13-21， 1994； Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平 4- 504365号公報；特表平 7- 509137号公報； 日経サイエンス、 6月号、 第 40〜第 50 頁、 1995年；国際出願公開 W094/25585号公報； Nature, Vol.368, p.856-859, 19 94；及び特表平 6- 500233号公報などに記載の方法に従って作製することができる また、 昨今開発された技術であるトランスジエニックなゥシゃブ夕のミルク中 からヒト由来タンパクを製造方法を適用することも可能である （日系サイエンス 、 1997年 4月号、 第 78頁乃至 84頁） 。
本発明における 「抗体の一部」 とは、 前述のようなモノクローナル抗体の一部 分の領域を意味し、 具体的には F(ab3 )2、 Fab\ Fab, Fv (variable fragment o f antibody)、 sFv、 dsFv (disulphide stabilised Fv) あるいは dAb (single d omain antibody) などを意味する （Exp. Opin. Ther. Patents, 第 6卷， 第 5号 , 第 441〜456頁， 1996年) 。
ここで、 「F(ab，）2」 及び 「Fa 」 とは、 ィムノグロブリン （モノクローナル 抗体） を、 蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することによ り製造され、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の前後で 消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。 例えば、 IgGをパパインで 処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の上流で 切断されて VL ( L鎖可変領域） と （L鎖定常領域） からなる L鎖、 及び VH ( H鎖可変領域） と CH r l (H鎖定常領域中の: l領域） とからなる H鎖フラグメ ントが C末端領域でジスルフィ ド結合により結合した相同な 2つの抗体フラグメ ントを製造することができる。 これら 2つの相同な抗体フラグメントを各々 Fab' という。 また IgGをペプシンで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在 するジスルフィ ド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつなが つたものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。 この抗体フ ラグメントを F(ab， ) 2という。
本発明における 「腸管免疫」 、 「消化管免疫」 及び「粘膜免疫」 は、 ほぼ同義 を以つて使用される。
本発明における 「腸管免疫の異常に伴う疾患」 とは、 好適な例としては、 炎症 性腸疾患及び食餌性ァレルギ一が挙げられる。
本発明における 「炎症性腸疾患」 の代表的な一例は、 大腸炎 （colitis ;特に は、 潰瘍性大腸炎 (Ulcerative Colitis； UC) ) とクローン病 （Crohn' s diseas e； CD) であり、 各々は、 例えば、 下記のような特徴を有する。
炎症性腸疾患 (Inflammatory bowel syndrome； IBD) は、 大腸炎 （特には潰瘍 性大腸炎） とクローン病に大別され、 若年層に好発し、 緩解と再燃を繰り返す未 だ原因不明の難治性慢性炎症性疾患とされている。
クローン病は、 食道から肛門に至る全ての消化管、 主に小腸や大腸に慢性肉芽 腫性炎症や潰瘍が生じる疾患であり、 腹痛、 下痢、 発熱、 痔のような肛門の異常 、 及び/または体重減少などの症状が現れる。 組織学的には、 リンパ球の強い浸 潤と非乾酪性類上皮肉芽腫が見られ、 T細胞や抗原提示細胞の異常反応が示唆さ れる。
大腸炎 （特には、 潰瘍性大腸炎） は、 大腸に限局して発症し、 主として粘膜を 侵し、 びらんや潰瘍を形成する慢性炎症である。 組織学的には粘膜及び粘膜固有 層にリンパ球、 形質細胞、 マクロファージ及びマスト細胞の著明な浸潤が見られ 、 また杯細胞の消失や好中球の浸潤を伴う陰窩潰瘍が生じる。
本発明における 「炎症性腸疾患」 の治療に用いられている既存に薬剤とは、 医 療現場において大腸炎 （潰瘍性大腸炎など） やクローン病の治療に処方されてい る任意の 1または複数の薬剤を意味し、 例えば、 副腎皮質ホルモン、 サラゾスル ファピリジンなどを挙げることができる
ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤 、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤 、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以 上を用いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセル剤 、 トローチ剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬 組成物を調製することができる。
これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に投与することができる。 非経 口投与のためのその他の形態としては、 一つまたはそれ以上の活性物質を含み、 常法により処方される外用液剤、 腸溶内投与のための坐剤およびべッサリ一など が含まれる。
投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間 、 あるいは該医薬組成物に含有される活性成分 （前記の本発明に係る 「物質」 な ど） の種類などにより異なるが、 通常成人一人当たり、 一回につき 10 gから 1, 0 OOmg (あるいは 10 i gから 500mg) の範囲で投与することができる。 しかしながら 、 投与量は種々の条件により変動するため、 上記投与量より少ない量で十分な場 合もあり、 また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とりわけ注射剤の場合には、 例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等 の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に ( i g抗体/ /ml担体〜 10mg抗体 Zml 担体の濃度となるように溶角军または懸濁することにより製造することができる。 このようにして製造された注射剤は、 処置を必要とするヒト患者に対し、 1回の 投与において l kg体重あたり、 1〃 g〜100mgの割合で、 好ましくは 50 g〜50m gの割合で、 1日あたり 1回〜数回投与することができる。 投与の形態としては 、 静脈内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医 療上適当な投与形態が例示できる。 好ましくは静脈内注射である。
また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈剤 （例えばプロピレングリコール 、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールのようなァ ルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、 バクテリア保留フィル夕一を通す濾過滅菌、 殺 菌剤の配合または照射により行うことができる。 注射剤は、 用時調製の形態とし て製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし 、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる o
本発明の医薬組成物を用いることにより、 腸管免疫の異常に起因する可能性を 有する疾患、 具体的には、 炎症性腸疾患 （特には、 クローン病及び大腸炎 （特に は潰瘍性大腸炎） ） や食餌性アレルギーを抑制、 予防及び/または治療すること が可能である。
さらには、 本発明の医薬組成物を用いることにより、 そのような炎症性疾患の 治療に処方されている既存の藥剤による治療効果を増大させることが可能である
図面の簡単な説明
図 1は、 大腸炎の特徴である体重減少を指標として表した抗 AILIM抗体の継続 投与 （病状の発症前または進行後） による炎症性腸疾患の発症の抑制効果、 並び に抗 AILIM抗体の投与による炎症性腸疾患の治療効果を示す図である。
図 2は、 炎症性腸疾患を発症していない正常マウス、 炎症性腸疾患に罹患して いるマウス、 及び抗 AILIM抗体の投与により炎症性腸疾患の発症の抑制が観察さ れたマウスの各々の大腸の状態を示す写真である。
図 3は、 大腸炎の特徴である体重減少を指標として表した抗 AILIM抗体の継続 投与による炎症性腸疾患の発症の抑制効果を示す図である。
•：陰性対照抗体 (n-20)
O：抗 AILIM COS抗体 （n=20)
□：抗 B7RP- 1抗体 （n=7)
画 ： CD4+CD45RBllighT細胞の代わりに 004 045 。 細胞を移入した BALB/c sci d/scidマウスに陰性対照抗体を投与 （n=7)
図 4は、 組織学的スコァで表した大腸炎の重篤性の程度を示す図である。 図 5は、 大腸粘膜層 (lumina propria) に浸潤した CD4+細胞の数を示す図であ る。
図 6は、 大腸組織における細胞のアポトーシスの程度を示す図である。
図 7は、 大腸炎の特徴である体重減少を指標として表した抗 AILIM抗体の投与 (病状進行後の投与） による炎症性腸疾患の治療効果を示す図である。
•：陰性対照抗体
〇：抗 AILIM/IC0S抗体
図 8は、 組織学的スコァで表した大腸炎の重篤性の程度を示す図である。 図 9は、 大腸粘膜層 (lumina propria) に浸潤した CD4+細胞の数を示す図であ る。
図 1 0は、 大腸炎の特徴である体重減少を指標として表した抗 AILIM抗体の継 続投与による炎症性腸疾患の発症の抑制効果を示す図である。
秦：陰性対照抗体 （n=7)
〇：抗 AILIM/ICOS抗体 （n=7) 図 1 1は、 組織学的スコアで表した大腸炎の重篤性の程度を示す図である。 図 1 2は、 大腸粘膜層 (lumina propria) に浸潤した CD4+細胞の数を示す図で ある。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明が該実施例に記 載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例 1 マウス大腸炎モデルでの大腸炎の治療効果 <試験 1 >
<1-1> 動物
重症免疫不全症マウスである BALB/c scid/scidマウス （雌、 6- 8週齢； 日本ク レア製） 及び正常マウスである BALB/cマウス （雄、 6- 8週齢； 日本クレア製） を 用いた。
<1-2> 抗マウス AILIMモノクローナル抗体の調製
以下のようにして調製した。
既報のマウス AILIM ( Int. Immunol . , Vol .12, No, l， p.51-55, 2000) の全長 アミノ酸配列をコードする cDNAを用いて、 遺伝子組換え技術を用いて常法に従つ てマウス AILIMを発現する形質転換細胞を調製した。
該形質転換細胞をホモジナイズし、 超遠心分離 （100, 000 x g ) して、 細胞膜 画分を含む遠心残さを回収し、 PBSに懸濁させた。 得られた細胞膜画分を、 完全 フロインドアジュバントとともに Wistarラヅトのフヅドパヅド内に注射すること により初回免疫 （0曰） した。 さらに該細胞膜画分抗原を 7日目、 14日目および 2 8日目という間隔でフットパッド内に投与した。 最後の免疫から 2日後にリンパ 節細胞を採取した。
該リンパ節細胞とマウスミエローマ細胞 PAI (JCR NO.B0113; Res. Disclosure , Vol.217, p.155, 1982) とを 5 ： 1で混合し、 融合剤としてポリエチレングリ コール 4000 (Boehringer Mannheim製） を用いて細胞融合させることによりモノ クローナル抗体産生ハイプリ ドーマを作製した。 ハイプリ ドーマの選択は、 10% ゥシ胎児血清とアミノプテリンを含有する HAT含有 ASF104培地 （味の素製） 中で 培養することにより行った。
各々のハイプリ ドーマの培養上清中に生成されたモノクローナル抗体のマウス AIUMに対する反応性を、 各々の培養上清を、 前記組換えマウス AILIM発現形質転 換細胞に反応させた後、 FITC標識抗ラット IgG (Cappel製） と反応させることに より染色された細胞の蛍光強度を EPICS- ELITEフローサトメ一夕一で測定するこ とにより確認した。 この結果、 マウス AILIMに反応性を有するモノクローナル抗 体を産生する複数のハイプリ ドーマを得た。
それらのハイブリ ドーマの内の 1つを 「Β10· 5」 と命名した。 このハイプリ ド —マ （各々 106乃至 107個 Ζθ.διηΐΖマウス） を、 ICR nu/nuマウス （雌、 7乃至 8 週齢） の腹腔内に注射した。 1 0乃至 2 0日後、 マウスを麻酔下で開腹し、 常法 に従って採取した腹水からラヅト抗マウス AILIMモノクローナル抗体 （IgG2a)を 大量調製した。 以下、 この抗体を単に抗 MLIM抗体と呼ぶ。
く 1 - 3> 炎症性腸疾患の誘発
下記のとおり、 既報の方法に従って、 BALB/c scid/scidマウスに CD45RBhighを 移入することにより炎症性腸疾患 （大腸炎） を誘発した。 この炎症性腸疾患モデ ルでは、 炎症性腸疾患の発症、 進行に伴って、 CD45RBhighT細胞の移入後の 3乃 至 5週後から有意な体重減少が起こることが知られている。
抗 CD4抗体 (L3T4) を用いる MACS磁気分離システム （MACS magnetic separatio n system； Miltenyi Biotec製） を用いて、 健常な BALB/cマウスの脾臓由来単核 細胞から CD4+T細胞を分離、 取得した。 具体的には、 該マウスから単離した脾臓 細胞を抗 CD4抗体を吸着させた磁気ビーズとともに 4 °Cで 3 0分間培養後、 洗浄 し、 次いで、 磁気フローカラムに通して細胞を富沃化 （enrich) させた。
得られた CD4+T細胞 （フローサイトメ一夕一を用いて純度が 96-97%であるこ とを確認した。 ） を、 ビコエリスリン （PE) 標識した抗マウス CD4抗体 (RM4-5； PharMingen ) 及びフルォレヅセインイソチオシァネート （FITC) で標識した抗 CD4抗体 (16A； PharMingenM) で標識した後、 FACS Vangetage (Becton Dickins on製) を用いてソーティングし、 CD45RBの発現が高い T細胞 (CD45RBhi h) 及び C D45RBの発現が弱い T細胞 （CD45RBI()W) に分画した。
次いで、 BALB/c scid/scidマウスに大腸炎を誘発するために、 BALB/c scid/sc idマウスに上記で得た CD45RB1 T細胞 (5 x 105個/ 200〃 1 PBS) を腹腔内投与 (i • P. ) した。
<1-4> 抗 AIL IM抗体の投与
上述の CD45RBhighT細胞を移入した SCIDマウスの各群に、 下記のような処置を 施した。
グループ 1
抗 AILIM抗体 (250 g/250 l PBS) を CD45RBhighT細胞の移入直後 （初回投与
) から 3回/週の頻度で毎週継続的に腹腔内投与した。
グループ 2
陰性対照抗体 （ラット IgGヽ Sigma製、 250 g/250〃l PBS) を CD45RBhighT細胞 の移入直後 （初回投与） から 3回/週の頻度で毎週継続的に腹腔内投与すると同 時に、 CD45RBhighT細胞の移入直後 （初回投与） から 8週目以降は、 該陰性対照抗 体に加え、 抗 AILIM抗体 （250 g/250 l PBS) を同様の頻度で毎週継続的に腹腔 内投与した。
グループ 3
陰性対照抗体 （ラヅト IgG、 Sigma製、 250 g/250 1 PBS) を CD45RBhighT細胞 の移入直後 （初回投与） から 3回/週の頻度で毎週継続的に腹腔内投与した。 炎症性腸疾患の進行の程度、 並びに抗 AIUM抗体による該疾患の発症、 進行の 抑制及び治療の程度は、 各グループの体重を T細胞の移入直前から経時的に計測 することにより解析した。
結果を図 1に示す。 この結果、 予測どおり陰性対照抗体のみを投与した群 （グループ 3 ) では炎症 性腸疾患の進行に伴って顕著な体重減少が起こったが、 CD45RBhighT細胞の移入 直後から抗 AILIM抗体を継続的に投与した群 （グループ 1 ) では、 体重減少が全 く見られず炎症性腸疾患の発症が完全に抑制された。
また、 CD45RBhighT細胞の移入直後から 7週目までは陰性対照抗体のみを投与し 、 8週目からは陰性対照抗体に加え抗 AILIM抗体を投与した群 （グループ 2 ) では 、 8週目以降も陰性対照抗体しか投与していない群 （グループ 3 ) に比べ、 抗 AIL IM抗体を投与し始めた直後から有意な体重の増加 （回復） が観察され、 抗 AILIM 抗体が炎症性腸疾患を治癒することが分かった。
また、 炎症性腸疾患の進行の程度、 並びに抗 AILIM抗体による該疾患の発症、 進行の抑制及び治療の程度を、 グループ 1及びグループ 3の一部のマウスについ て、 T細胞の移入から 6週間後に大腸を採取し、 その状態を肉眼的に検討すること により解析した。 なお、 正常対照として、 CD45RBhighT細胞の移入及びいずれの 抗体の投与も行っていない BALB/c sc id/sc idマウスから採取した大腸を同様にし て観察した。
結果を図 2に示す。
この結果、 陰性対照抗体を投与した群 （グループ 3 ) では炎症性腸疾患の進行 に伴う大腸の退縮 （腸管が厚く短くなる） 及び便の未処理状態が観察されたが、 抗 AILIM抗体を投与した群 （グループ 1 ) の大腸は、 正常対照の大腸と同様の状 態であり、 抗 AILIM抗体が、 炎症性腸疾患の発症及び進行を有意に抑制すること が分かった。 実施例 2 マウス大腸炎モデルでの炎症性腸疾患の治療効果 <試験 2 >
<2-1> 動物
免疫不全症を呈する BALB/c scid/scidマウス、 C57BL/6 scid/scidマウス及び 正常 BALB/cマウス （いずれも雌、 6乃至 8週齢、 日本クレア製） を用いた。 <2-2> モノクローナル抗体
マウス AILIM (IG0S) に対するモノクローナル抗体、 マウス AILIM (IC0S) のリ ガンドであるマウス B7RP-1に対するモノクローナル抗体、 及び陰性対照抗体を用 いた。
抗マゥス AILIM/ICOSモノク口一ナル抗体は、 前記のとおり作製した B10 · 5を用 いた。
抗マウス B7RP- 1モノクローナル抗体は、 以下のようにして作製した。 常法に従 つて作製したマウス B7RP-1を発現する組換え L細胞で SDラヅトを免疫した。 該被 免疫ラットの脾臓細胞を取得し、 常法に従ってミエ口一マ細胞と細胞融合するこ とによりハイプリ ドーマを作製した。 各々のハイプリ ドーマの培養上清を用いて 、 該培養上清に含まれる抗マウス B7RP- 1モノクローナル抗体のマウス B7RP- 1発現 組換え細胞 （NRK細胞） への結合の程度を EIAにより測定してマウス B7RP- 1に結合 する抗体を産生するハイプリ ドーマを選別した。 選別したハイプリ ドーマの培養 上清から本試験に用いる抗マウス B7RP-1モノクローナル抗体を調製した。 また、 該抗マウス B7RP- 1モノクローナル抗体は、 マウス AILIM-Ig (マウス AILIM/ICOSの 可溶性領域と免疫グロプリンの Fcからなる融合ポリぺプチド） のマウス B7RP- 1発 現組換え細胞への結合を阻害する活性を有することを確認した。
陰性対照抗体として、 マウス AILIM/ICOS及び B7RP-1のいずれにも反応しないラ ッ MgG (Sigma製) を用いた。
<2-3> 大腸炎 （炎症性腸疾患） の誘導
既報に従って、 BALB/c scid/scidマウスに CD4+CD45RBhighT細胞を移入 （adoptiv e transfer) することにより該ドナーマウスに炎症性腸疾患 （大腸炎） を誘導し た (J. Immunol. , Vol.164, p. 878-4882, 2000) 。
CD4+T細胞は、 抗 CD4 (L3T4) MAGS磁気分離システム （anti-CD4(L3T4) MACS ma gnetic separation system； Miltenyi Biotec製） を用い添付の取扱説明書に従 い、 正常 BALB/cマウスの脾臓細胞から分離した。 該 CD4+T細胞 （96- 97%純度、 FA CSで解析） を PE標識抗マウス CD4抗体 (RM4-5; PharMingen製） 及び FITC標識抗 CD 45RB抗体 (16A; PharMingen製） で標識し、 FACSVantage (Becton Dickinson製） を用いて CD45HBhighT細胞及び CD45RBlQWT細胞にソ一トした。
該 CD45RBhighT細胞 （5 105細胞/200〃1 PBS) を BALB/c scid/scidマウスに腹腔 内投与して炎症性腸疾患 （大腸炎） を誘導した。
<2-4> 抗 AIL IM抗体による炎症性大腸炎の治療
前記で作製した炎症性大腸炎を誘導したマウスに、 CD45RBllighT細胞の移入時 0週） から 7週に亘つて 1週間に 3回の頻度で抗マウス AILIM/ICOSモノクローナル 抗体 (250 g/250^ 1 PBS) 、 抗マウス B7RP-1モノクローナル抗体 (250 g/250 μ \ PBS) または対照抗体 (250 ^ g/250 l PBS) を腹腔内投与した。
一方、 抗 AILIM/ICOS抗体の、 炎症性大腸炎が進行した状況下での治療効果を調 ベるため、 前記で作製した炎症性大腸炎を誘導したマウスに、 CD45RBllighT細胞の 移入から 3週間後に前記と同様の条件で抗 AILIM/ICOSモノク口一ナル抗体 （250〃 g/bodyの濃度で 3回/週； i .p. ) を投与した。 CD45RBMshT細胞の移入から 7週間後 に該被験動物を断命させ大腸の炎症の状態を解析した。
く 2 - 5> 大腸炎マゥスの病原性 CD4+ T細胞のマゥスへの移入
上述の MACS磁気ビーズを用いて、 CD4+CD45RBhighT細胞を移入 （adoptive transf er) した BALB/c scid/scidマウスの大腸の粘膜層 ( lamina propria； LP) から該 T細胞の移入から 7週間後に CD4+細胞 （LP CD4+T細胞） を単離した。 FACSにより 単離した LP CD4+ T細胞が 95 %以上の純度であることを確認した。
BALB/c scid/scidマウスに該 LP CD4+T細胞 (1 x 106個/ 200〃 1 PBS； i.p. ) を 投与した。 次いで、 該被験マウスに、 抗 AILIM/ICOS抗体 (250ju g/250ju l PBS) または陰性対照抗体 （ラヅト IgG ; 250/i g/250 1 PBS) を 1週間に 3回の頻度で投 与した。 LP CD4+T細胞の投与から 4週間後にマウスを安楽死させ、 大腸を摘出 し、 該大腸を組織学的に解析した。
<2-6> 組織学的検査及び免疫組織化学染色 前記の各被験動物から採取した大腸組織試料を 6%ホルマリンを含む PBS中で固 定した。 パラフィン固定した大腸組織切片 （5〃m) をへマトキシリン （hematoxy lin) とェォシン （eosin) により染色した （HE染色） 。 作製した各組識切片標本 を分析した。 大腸の炎症の程度を、 既報に従ってスコア化法にした （Gastroente rology, Vol .119, p.715-723, 2000) 。
一方、 免疫組織化学染色による分析のだめの大腸試料は、 OCT化合物中で固定 し、 液体窒素中で凍結し- 80°Cで保存した。 該組織切片の染色をアビジン-ビォチ ン複合体、法 (avidin-viotin complex method) で行った。
該組織切片 （6 /i m) を、 ピオチン標識抗マウス AILIM/IC0Sモノクローナル抗 体、 ピオチン標識抗マウス B7RP-1モノクローナル抗体、 ピオチン標識抗マウス CD 4モノクローナル抗体 (RM4-5； ラヅト IgGl ； PharMingen製） 、 ピオチン標識抗マ ウス F4/80モノクローナル抗体 （ラヅ ト IgG2； PharMingen製） またはピオチン標 識した isotype-matched対照抗体 （PharMingen製） とともにインキュペートした 。 ビォチン標識した抗体を、 ストレプトアビジン-ビォチン標識西洋ヮサビパー ォキシダ一" E複合体 (streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase com plex； Vectastain ABC Kit； Vector製） で検出し、 ジァミノべンジジン （diamin obenzidine) で可視ィ匕した。 次いで、 各切片を、 へマトキシリンでカウン夕一染 色した。
<2-7> アポトーシス状態の細胞 （apoptotic cell) の検出
ApoTag Kit ( Intergen製） を用いて、 既報の TUNEL法に従って、 凍結組織切片 におけるアポトーシス状態の細胞を検出した。 顕微鏡下で観察することにより、 1つの切片の 5部位の範囲内に浸潤している粘膜層単核細胞 （lamina propria mo nonuclear cell； LPMC) 500個中の TUNEL陽性細胞を計数することにより該組織切 片中の TUNEL陽性細胞を定量した。 LPMC500個中の TUNEL陽性細胞の百分率を以っ て、 アポトーシスの指標 （index) とした。
<2-8> 結果 結果を図 3乃至図 12に示す。
く 2-8- 1> 抗 AILIM/ICOS抗体の投与による大腸炎の抑制
陰性対照抗体 （ラット IgG) を投与した被験マウス （対照マウス） では、 CD45R BhighT細胞の移入から 4乃至 7週間後に重篤な大腸炎に発展し、 顕著な体重減少が 認められただけでなく （図 3 ) 、 下痢並びに炎症を伴った大腸の腸管壁の有意な 肥厚が認められた。
粘膜層 (lamina propria) 及び粘膜下組織 （submucosa) に大量のリンパ球が 認められる経壁炎症並びに杯状細胞 （goblet cell) の減少伴う隆起性上皮肥厚 (prominent epithelial hyperplasia) により特徴付けられる組織学的スコア （ 大腸炎の重篤性を示す） の該対照マウスでの平均値 （7週目） は、 5.9±1.2であ つた （図 4 ) 。
一方、 抗 AILIM/ICOS抗体で処置したマウスは、 大腸炎の兆候及び大腸壁の肥厚 も認められず、 また経時的な体重増加が認められ （図 3 ) 全くの健康状態であつ た。 また、 これらの抗 AILIM/ICOS抗体処置マウス （IF7) では、 大腸壁組織の組 織学的スコアは 0.8±0.7であり明白な病的変化は認められなかった （図 4 ) 。 大腸炎マウス （対照マウス） の炎症を起こしている大腸の粘膜層 (lamina pro pria) 中に認められる CD4+T細胞の平均は、 44±9 x l05細胞/大腸であつたのに 対し、 抗 AILIM/ICOS抗体で処置したマウスにおいては 21±3 x l05細胞 Z大腸 （pく 0.01) であった （図 5 ) 。
<2-8-2> 抗 AILIM/ICOS抗体による組織浸潤単核細胞のアポト一シスの誘導 陰性対照抗体で処置したマウス （対照マウス） に比べ、 抗 AILIM/ICOS抗体を投 与したマウスの大腸では、 アポト一シス状態の細胞 （そのほとんどは組織浸潤単 核細胞であった） の著しい増加が認められた。
大腸での該アポト一シス状態の細胞の定量的解析によるアポト一シスの指標 （ apoptosis index) は、 対照抗体を投与したマウス （対照マウス） に比べ、 抗 AIL
IM/IC0S抗体を投与したマウス （n=5) で有意に高かった （図 6 ) 。 これらの結果は、 抗 AILIM/ICOS抗体での治療による大腸炎の抑制の効果が、 AI LIM (IC0S) を発現している病原性 T細胞の除去 （depletion) に帰するものであ ることを示すものであった。
<2-8-3> 抗 AILIM/ICOS抗体の病状の進行後の投与による大腸炎の抑制効果 上述の大腸炎モデルマウスにおいては、 病状の一つであるるい痩 （wasting di sease) 、 即ち体重減少及びリンパ球の大腸組織への浸潤が各々、 CD45RBhighT細 胞の移入から 3週間後前後及び 2週間前後から始まることから、 上述したとおり本 試験における抗 AILIM/ICOS抗体の投与は、 該 T細胞の移入から 3週間後から開始 した。
抗 AILIM/ICOS抗体を投与したマウス群では、 体重減少の有意な改善が認められ (図 7 ) 、 下痢は認められなかった。
各群のマウスの大腸の組織片を組織学的に分析した結果、 陰性対照抗体を投与 したマウス （対照マウス） に比べ、 抗 MLIM/IC0S抗体を投与したマウス群の大腸 組織では、 肉芽腫性の炎症 （granulomatous inflammation) 、 リンパ球の浸潤及 び上皮の肥厚が有意に減少していた。 炎症性の変化は、 粘膜層 (lamina propia ) 及び場合により粘膜下組織 (submucosa) へのリンパ球の緩やかな浸潤のみを 伴う病巣で認められたが、 筋肉層では認めちれなかった。 また、 上述した大腸炎 の重篤性を示す組織学的スコア （大腸は 7週目に採取） は、 陰性対照抗体を投与 したマウス群 （対照マウス； 5· 93±1·23) に比べ、 抗 AILIM/ICOS抗体を投与した マウス群 （1.62±0.81) では有意に減少していた （pく 0.05 ;図 8 ) 。 また、 浸潤 CD4+T細胞の数 （7週目） も、 対照マウス （31.3±7.7x l06 cells) に比べ、 抗 A ILIM/IC0S抗体を投与したマウス （5.50±0.7 x l06 cells) では有意に減少して いた (pく 0.05；図 9 ) 。
<2-8-4> 抗 AIUM/IC0S抗体による大腸炎ドナ一由来の粘膜層 CD4+T細胞の移入 により誘導した大腸炎の抑制効果
病原性 T細胞に対する抗 AILIM/ICOS抗体の治療学的効果を調べるため、 上述し たとおり、 大腸炎マウス由来の LP CD4+T細胞を BALB/c scid/scidマウスに投与し て大腸炎を誘導し、 該マウスに抗 AILIM/ICOS抗体を投与した。
陰性対照抗体を投与したマウス （対照マウス） に比べ、 抗 AILIM/ICOS抗体を投 与したマウスでは、 体重減少 （図 1 0 ) が有意に改善させるとともに、 大腸炎の 重篤性を表す組織学的スコア （大腸は 4週目に採取；図 1 1 ) 及び CD4+細胞の大 腸粘膜層への浸潤 （4週目） も有意に減少した （図 1 2 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明の医薬組成物 （特に好ましくは、 AILIM/ICOSを発現する細胞の細胞死 （ cell death; apoptosis; depletion) を誘導する活性を有する物質からなる） は
、 腸管免疫の異常に起因する可能性を有する疾患、 具体的には、 炎症性腸疾患 （ 特には、 クローン病及び大腸炎 （潰瘍性大腸炎など） ） や食餌性アレルギーの抑 制、 予防及び/または治療において極めて有用である。
本発明の医薬組成物はまた、 そのような炎症性疾患や食餌性アレルギーの治療 に処方されている既存の薬剤と併用することにより炎症性腸疾患や食餌性ァレル ギ一の治療効果を増大させることが可能である。
また、 本発明の医薬組成物の一部として包含される AILIMに対するヒト抗体を 含んでなる医薬組成物は、 マウス由来の抗体をヒトに投与する際のアレルギー等 の副作用を全く惹起しないことから医薬品として極めて有用である。

Claims

請求の範囲
1 . AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有する物質及び薬学的に許 容され得る担体を含んでなり、 腸管免疫の異常に伴う疾患を抑制、 治療または予 防するための医薬組成物。
2 . 該物質が、 AILIMを発現している細胞の細胞死を誘導する活性を有する物 質であることを特徴とする請求項 1に記載の医薬組成物。
3 . 該疾患が、 炎症性腸疾患であることを特徴とする請求項 1または請求項 2 に記載の医薬組成物。
4 . 該炎症性腸疾患が、 大腸炎であることを特徴とする請求項 3に記載の医薬 組成物。
5 . 該炎症性腸疾患が、 クローン病であることを特徴とする請求項 3に記載の 医薬組成物。
6 . 該疾患が、 食餌性アレルギーであることを特徴とする請求項 1または請求 項 2に記載の医薬組成物。
7 . 該物質が、 蛋白性物質であることを特徴とする請求項 1乃至請求項 6のい ずれかに記載の医薬,組成物。
8 . 該蛋白性物質が、 下記群から選ばれるいずれかであることを特徴とする請 求項 7に記載の医薬組成物：
a ) AILIMに結合する抗体またはその一部；
b ) AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリペプチド；
c ) AILIMの細胞外領域の全部または一部と免疫グロプリンの重鎖の定常領域 の全部または一部とからなる融合ポリぺプチド ；及び
d ) AILIMに結合するポリペプチド。
9 . 該物質が、 非蛋白性物質であることを特徴とする請求項 1乃至請求項 6の いずれかに記載の医薬組成物。
10. 該非蛋白性物質が、 DNA、 RN Aまたは化学的に合成された化合物で あることを特徴とする請求項 9に記載の医薬組成物。
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