WO2002006519A1 - Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee - Google Patents

Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee Download PDF

Info

Publication number
WO2002006519A1
WO2002006519A1 PCT/JP2001/006064 JP0106064W WO0206519A1 WO 2002006519 A1 WO2002006519 A1 WO 2002006519A1 JP 0106064 W JP0106064 W JP 0106064W WO 0206519 A1 WO0206519 A1 WO 0206519A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycated
saccharified
protease
measurement
hemoglobin
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/006064
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Yonehara
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18710319&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2002006519(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Arkray, Inc. filed Critical Arkray, Inc.
Priority to DE60143748T priority Critical patent/DE60143748D1/de
Priority to US14/521,534 priority patent/USRE46105E1/en
Priority to AU2001269513A priority patent/AU2001269513A1/en
Priority to JP2002512410A priority patent/JP3971702B2/ja
Priority to US14/329,019 priority patent/USRE46130E1/en
Priority to US10/332,790 priority patent/US7235378B2/en
Priority to CN018154131A priority patent/CN1620512B/zh
Priority to EP01947995A priority patent/EP1304385B1/en
Priority to US14/521,525 priority patent/USRE46118E1/en
Publication of WO2002006519A1 publication Critical patent/WO2002006519A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/725—Haemoglobin using peroxidative activity

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the amount of glycated hemoglobin present in whole blood.
  • Glycated hemoglobin in blood reflects the past history of in vivo blood glucose levels and is therefore an important index in the diagnosis and treatment of diabetes.
  • Such glycated hemoglobin is measured as a glycated amount or glycation rate of hemoglobin, for example, by a high-performance liquid chromatography (HPLC) method, a mini-column method, an immunoassay, or the like.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • FOD glycated amino acid oxidoreductase
  • glycated hemoglobin is a component in blood cells
  • hemolysis of blood cells is essential for measurement.
  • the hemolyzed whole blood sample contains not only glycated hemoglobin, which is a component in blood cells, but also albumin, which is a component in plasma and has a high content, and glycated albumin, which is a glycated product thereof. Therefore, the saccharified albumin is also FA Under the action of ⁇ D, it is measured together with glycated hemoglobin. Therefore, in order to remove the effects of other glycoproteins such as glycated albumin, it was necessary to separate plasma and blood cells from a whole blood sample, and the operation was complicated.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring the amount of hemoglobin glycated in a whole blood sample that can be accurately and easily measured without separating a whole blood sample and without affecting other glycoproteins.
  • the method for measuring the amount of glycated hemoglobin of the present invention comprises selectively decomposing glycated hemoglobin in whole blood with a protease, reacting the glycated portion of the glycated hemoglobin degradation product with FAOD, This method determines the amount of saccharified hemoglobin by measuring the oxidation-reduction reaction.
  • the “hemoglobin saccharification amount” includes the hemoglobin saccharification rate.
  • the measurement sample may be, for example, a hemolyzed whole blood sample.
  • a protease that selectively degrades glycated hemoglobin may be used as the protease.
  • the method using a protease that selectively degrades glycated hemoglobin is not particularly limited, and glycated hemoglobin may be selectively degraded by other means.
  • a general protease and a protease which selectively degrades glycated hemoglobin may be used in combination.
  • the protease is bromelain, papain, trypsin derived from bush kidney, meta-oral proteinase, or protease derived from Bacillus subtilis.
  • Bacillus subtilis-derived protease include, for example, Protease N (trade name) (manufactured by Sigma-Aldrich), Protease N “Amano” (trade name) (manufactured by Amano Enzym Co., Ltd.), and the like.
  • the meta-mouth proteinase include Bacillus-derived meta-mouth proteinase (EC 3.4.24.4) (for example, Toyobo Co., Ltd., trade name: Toyoteam) and the like.
  • meta-mouth proteinase, bromelain and papain are more preferred, and meta-mouth proteinase is particularly preferred.
  • the FAOD may be a glycated ⁇ -amino group and a glycated amino acid in the glycated amine using at least one glycated amine selected from the group consisting of glycated protein, glycated peptide and glycated amino acid as a substrate. It is preferably an enzyme that acts on at least one of the saccharified moieties of the amino group of the chain to catalyze the reaction of generating hydrogen peroxide.
  • the saccharified portion of the saccharified hemoglobin hydrolyzate to be reacted with FAOD varies depending on the catalytic reaction of the FAOD to be used.
  • the glycated amino group of the amino acid residue side chain is preferable because the FAOD having a catalytic function described later is easy to work, for example, the glycated amino group of the lysine residue side chain and the arginine residue side.
  • saccharified amino groups on the chain is preferable because the FAOD having a catalytic function described later is easy to work, for example, the glycated amino group of the lysine residue side chain and the arginine residue side.
  • the protease is added in a range of 1,000 to 100,000, 000 U per 1 mL of whole blood, and the FAOD is It is preferable to add in the range of 500 to 40,000 U per mL.
  • the measurement of the oxidation-reduction reaction is preferably a measurement of an amount of hydrogen peroxide generated by the reaction or a measurement of an amount of oxygen consumed in the reaction.
  • the measurement of the amount of hydrogen peroxide is preferably a measurement using peroxidase (hereinafter, referred to as “POD”) and a substrate that develops color by oxidation.
  • POD peroxidase
  • the substrate that develops color by the oxidation is not particularly limited, and may be, for example, N- (potoxymethylaminopotassium) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium And orthophenylenediamine (OPD), a substrate obtained by combining a Trinder reagent with 4-aminoanticipine, and the like.
  • the Trinder reagent include phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives and the like.
  • aminoantipyrine derivatives vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH) and the like can also be used.
  • chromogenic substrates particularly preferred is sodium N- (carboxymethylaminopropyl) 14,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine.
  • the amount of HbA1c in the whole blood sample is determined by substituting the amount of glycated hemoglobin in the whole blood sample obtained from the method for measuring the amount of glycated hemoglobin of the present invention into the calibration curve. This is the required measurement method.
  • HbAlc refers to glycated hemoglobin in which the ⁇ -amino group at the N-terminus of the j8-chain of hemoglobin is glycated, and is a particularly important index of glycated hemoglobin in the diagnosis of diabetes and the like.
  • the measurement of HbAlc is based on the fact that FAOD acts specifically on the glycation portion of the amino group at the N-terminal of the 3-chain N-terminal, which is a characteristic structural site of HbAlc, among the glycation portions. It was necessary to measure the redox reaction. In this case, it is required that the FAOD to be used has, for example, a high substrate specificity with respect to the glycation site of the amino group, and a sufficient effect on the glycation site of the amino group. I had to take it.
  • HbAlc which is an important index for diabetes diagnosis
  • HbAlc which is an important index for diabetes diagnosis
  • the calibration curve is created from a correlation between the known amount of HbAlc in a standard sample and the amount of glycated hemoglobin of the standard sample according to the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention. It is preferable that the calibration curve is obtained.
  • the measurement kit of the present invention is a measurement kit used for measuring the amount of glycated hemoglobin, and contains a protease that selectively degrades glycated hemoglobin in distinction from other proteins and peptides.
  • the measurement method of the present invention can be easily performed.
  • the protease is preferably at least one protease selected from the group consisting of bromelain, papain, trypsin derived from pig kidney, meta-oral proteinase, and protease derived from Bacillus suiiiA.
  • the measurement kit of the present invention further, it preferably contains a saccharified amino acid oxidoreductase.
  • the saccharified amino acid oxidoreductase comprises at least one saccharified amine selected from the group consisting of a saccharified protein, a saccharified peptide, and a saccharified amino acid as a substrate; It is preferably an enzyme that acts on at least one of the saccharified moieties and catalyzes a reaction to generate hydrogen peroxide.
  • the measurement kit of the present invention preferably further contains peroxidase and a substrate that develops color by oxidation.
  • the substrate that develops color by the oxidation is preferably N- (potoxymethylaminocarbon) -14,4-bis (dimethylamino) diphenylamine.
  • the measuring reagent of the present invention is a measuring reagent used for measuring the amount of glycated hemoglobin, and contains a protease that selectively degrades glycated hemoglobin in distinction from other proteins and peptides. If this reagent is used, the measurement method of the present invention can be easily performed.
  • the protease is at least one selected from the group consisting of bromelain, papine, trypsin derived from bush kidney, meta-oral proteinase, and protease derived from Bacillus lus subtillis. Preferably it is a protease.
  • the measurement reagent of the present invention preferably further contains a saccharified amino acid oxidoreductase.
  • the glycated amino acid oxidoreductase uses at least one glycated amine selected from the group consisting of glycated protein, glycated peptide and glycated amino acid as a substrate, and comprises a glycated Q!
  • the measurement reagent of the present invention preferably further contains peroxidase and a substrate that develops color by oxidation.
  • the substrate that develops color by the oxidation is N _ (potassium propylamino).
  • N _ potential propylamino
  • it is sodium 4,4-bis (dimethylamino) diphenylamine.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the HbAle concentration and the absorbance in one embodiment of the measurement method of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing a correlation between HbA lc (%) determined from a calibration curve and Hb A 1 c () measured by an automatic measuring device in another example of the measurement method of the present invention. is there.
  • the FAOD that can be used in the measurement method of the present invention is preferably a FAOD that catalyzes the reaction represented by the following formula (1).
  • R 1 -CO_CH 2 -NH-R 2 is, for example, a glycated protein, a glycated peptide, or a glycated amino acid.
  • R 1 represents a hydroxyl group or a residue (sugar residue) derived from sugar before the saccharification reaction.
  • the sugar residue (R 1 ) is an aldose residue when the sugar before the saccharification reaction is aldose, and is a ketose residue when the sugar before the saccharification reaction is ketose.
  • the bran before the saccharification reaction is glucose
  • the structure after the saccharification reaction takes on a fructose structure due to Amadori rearrangement.
  • the sugar residue (R 1 ) is replaced by the glucose residue (aldose residue). Group).
  • n is an integer of 0-6.
  • R 2 is not particularly limited, but differs depending on whether the ⁇ -amino group is saccharified and the other amino groups are saccharified.
  • R 2 is an amino acid residue or a peptide residue represented by the following formula (2).
  • R 3 represents an amino acid side chain group
  • R 4 represents a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, for example, It can be expressed by the following equation (3).
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • R 2 can be represented by the following equation (4).
  • C ⁇ ⁇ R 5 -CH
  • R 5 represents a part of the amino acid side chain group other than the glycated amino group.
  • the glycated amino acid is lysine
  • R 5 is
  • R 6 is hydrogen, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (5), for example.
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • R 7 is a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (6), for example.
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • the catalytic reaction of the FAD used is not particularly limited as long as it is the above-mentioned reaction. It is preferable that the reaction is a catalytic reaction acting on a saccharification site where a sugar is bonded to an amino group other than an amino group (wherein R 2 has the structure represented by the formula (4)).
  • the FAOD is not limited to only such a catalytic function, and furthermore, is a catalytic device which acts on a saccharification site in which a sugar is bound to an amino group (the R 2 has a structure represented by the formula (2)). You may have the ability.
  • Such FAODs include, for example, those derived from Fusarium, Giperella, and Aspergillus.
  • Commercially available fructosyl-amino acid oxidase manufactured by Asahi Kasei Corporation
  • trade name of ketoamine oxidase GABA
  • the hemolysis method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, and a method using a difference in osmotic pressure. Among them, a method using a surfactant is preferred for reasons such as easy operation.
  • the surfactant examples include polyoxyethylene-pt-octylphenyl ether (Triton-based surfactant), polyoxyethylene sorbinone alkyl ester (Tween-based surfactant, etc.), Nonionic surfactants such as oxyethylene alkyl ethers (Brij-based surfactants and the like) can be used, and specifically, for example, trade name Trito nX-100, trade name Tween-20, trade name B rij 35 and the like.
  • the processing conditions with the surfactant are usually When the blood cell concentration in the solution is 1 to 10% by volume, the surfactant is added so that the concentration in the treatment solution is 0.1 to 1% by weight, and the mixture is stirred at room temperature for about 5 seconds to 1 minute. do it.
  • hemolysis is performed by adding purified water in an amount of 2 to 100 times the volume of whole blood.
  • the hemolyzed sample is subjected to protease treatment using the protease to selectively degrade glycated hemoglobin in the sample.
  • protease treatment is usually performed in a buffer solution, and the treatment conditions are appropriately determined depending on, for example, the type of protease used, the amount of glycated hemoglobin, and the like.
  • the protease concentration in the reaction solution is 100 to 30,000 U / L
  • the hemoglobin concentration in the reaction solution is 0.1 to 40 gZL
  • the reaction temperature ranges from 15 to 60
  • the reaction time ranges from 10 minutes to 40 hours
  • the pH ranges from 5 to 9.
  • the type of the buffer is not particularly limited.Examples include Tris-HCl buffer, EPPS buffer, PIPES buffer, phosphate buffer, ADA buffer, citrate buffer, acetate buffer, etc. Can be used.
  • the protease concentration in the reaction solution is 10 to 10,000 KUZL
  • the hemoglobin concentration in the reaction solution is 0.02 to 40 g ZL
  • the temperature ranges from 15 to 60
  • the reaction time ranges from 2 minutes to 40 hours
  • the pH ranges from 6 to 11; preferably, the protease concentration in the reaction solution is 100 to 8,000 KU / L
  • the hemoglobin concentration in the reaction solution is 0.1 to 1 10 gZL, reaction temperature 15-60, reaction time 2min-1h, pH7-10.
  • the same buffer as described above can be used.
  • other proteinases can be used as well.
  • the glycated hemoglobin hydrolyzate obtained by the protease treatment is treated with FAOD.
  • This FAQD treatment catalyzes the reaction represented by the above formula (1).
  • FAOD acts on, for example, the glycated amino groups of the lysine residue side chain and arginine residue side chain of the glycated hemoglobin degradation product. Further, depending on the type of FAOD, it may further act on a saccharified ⁇ -amino group due to its catalytic function.
  • This FAOD treatment is preferably performed in a buffer as in the case of the protease treatment.
  • the buffer is not particularly limited, and the same buffer as in the protease treatment can be used.
  • the processing conditions include, for example, a FAOD concentration of 200 to 30,000 UZL in the reaction solution, a hemoglobin concentration of 0.02 to 30 gZL in the reaction solution, a reaction temperature of 15 to 37, a reaction time of 1 to 20 minutes, and a pH of 7 to 9
  • the FAOD concentration in the reaction solution is 1,000 to 20,000 UZL
  • the hemoglobin concentration in the reaction solution is 0.1 to 5 gZL
  • the reaction temperature is 15 to 37 ° C
  • the reaction time is 1 to 5 minutes. , PH 7-9.
  • the amount of hydrogen peroxide generated by the FAOD treatment is measured by using the POD and the substrate that develops color by oxidation, using a redox reaction.
  • the oxidation-reduction reaction using POD is usually performed in a buffer, and the conditions are appropriately determined, for example, based on the concentration of hydrogen peroxide.
  • P ⁇ D concentration in the reaction solution :! 100100,000 I UZL, substrate concentration 0.0001-1 mmo 1ZL, reaction temperature 20-37 ° C, reaction time 1-5 minutes, pH 6-9, preferably POD concentration 1,000 in the reaction solution ⁇ 50,00. ⁇ ! ⁇
  • the buffer is not particularly limited, and the same buffer and the like as used in the FAOD treatment and the like can be used. You.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by, for example, an electrical method in addition to the enzymatic method using the POD or the like.
  • the color development (absorbance of the reaction solution) can be measured with a spectrophotometer to measure the concentration of hydrogen peroxide. From this, the amount of glycated hemoglobin in the sample can be determined. Can be measured.
  • each processing step may be performed separately as described above.
  • hemoglobin glycation is measured for a whole blood sample in the same manner as described above.
  • a glycated hemoglobin standard solution of which the amount of HbA1c is known among glycated hemoglobin is prepared, and the amount of glycated hemoglobin is measured in the same manner as described above.
  • a calibration curve showing the relationship with the known amount of HbA1c is created.
  • the measured value of the amount of glycated hemoglobin and the amount of HbA1c is correlated, the measured value of the amount of glycated hemoglobin in the whole blood sample according to the measuring method of the present invention is shown in this calibration curve.
  • the amount of HbA lc in the whole blood sample can be obtained.
  • the measured value of the amount of hemoglobin saccharified was calculated using only the finally obtained amount of hemoglobin saccharified.
  • the absorbance value of the reaction solution obtained by the POD treatment in the measurement of the amount of saccharified hemoglobin may be used, or the amount of hydrogen peroxide determined from the absorbance may be used.
  • the HbA1c content in whole blood is increased from the measured value of the amount of glycated hemoglobin by utilizing the correlation newly found by the inventors. It can be measured accurately and easily.
  • a sample containing saccharified hemoglobin and saccharified albumin was treated with papain, and a redox reaction was performed with FAOD, and the generated hydrogen peroxide was measured.
  • the samples, reagents and methods used for the measurement are shown below.
  • This human hemoglobin sample was prepared by the following method, and the saccharification rate was determined by the HPLC method using an ion exchange column.
  • the whole blood of a healthy person is centrifuged (1500 G, 10 minutes) to collect blood cells, which are washed several times with physiological saline. Then, an approximately equivalent amount of purified water is added to lyse the blood cells.
  • the lysed blood was centrifuged to remove the blood cell membrane, and the resultant was subjected to trade name GLYCO GELII (manufactured by Pierce), and a glycated protein-containing fraction was fractionated by a conventional method and used as a human hemoglobin sample. did.
  • Each of the samples (human serum albumin, human hemoglobin) was treated in the same manner as in Example 1 except that 1 mL of 1 g / L bromelain (Amano Enzym Co., Ltd., same hereafter) was used instead of papain. The absorbance was measured. The results are shown in Table 1 below.
  • Protease Human Serum Albumin Hemoglobin-(Abs.) (Abs.)
  • Example 1 Papain 0.014 0. 090
  • Example 2 Bromelain 0.0008 0.003 7 Comparative Example 1 ⁇ ; —Chymotrypsin 0.
  • Table 1 As shown in Table 1 above, according to papain and promelain of Examples 1 and 2, high absorbance was observed for the human hemoglobin sample, and slight absorbance was observed for the human serum albumin sample. From this, it was found that glycated hemoglobin can be selectively degraded without almost decomposing glycated albumin.
  • Whole blood was collected from a healthy individual using a blood collection tube containing sodium heparin, and purified water was added thereto, and the whole blood was diluted 8-fold, and the blood obtained by lysing blood cells in the whole blood was used as a whole blood sample. .
  • Purified water was added to the blood cells obtained by the centrifugation to dilute 16-fold, and the blood cells were lysed to obtain blood cell samples.
  • Promelain, Papain (Roche), Elastase (Wako Pure Chemical Industries), Pakimotrypsin (Wako Pure Chemical Industries), and Proteinase K (Wako Pure Chemical Industries) are dissolved in purified water and the concentration is adjusted.
  • Various protease solutions of 4 g / L were prepared (composition of redox reaction solution B).
  • Example 3 Elas Yuichi 0. 0 1 2 0. 0 1 9 0. 0 1 5 ⁇ -Chymotrypsin 0. 0 1 5 0. 0 1 6 0. 0 1 3 Proteinase K 0. 0 36 1 0. As shown in Table 2, in Example 3, almost no absorption was confirmed for the plasma sample. This indicates that the protease used in Example 3 can selectively degrade glycated hemoglobin, and hardly degrade, for example, glycated albumin derived from plasma. On the other hand, in Comparative Example 2, in a plasma sample in which glycated hemoglobin should not be present, Absorption was also confirmed.
  • glycated hemoglobin and other glycated proteins are decomposed without selecting them.
  • glycated albumin and the like are decomposed in a plasma sample, and as a result, absorption is not observed. It is thought that it was done.
  • Hb A 1c standard reagent (manufactured by SRL) was dissolved in purified water, and the Hb A 1c concentrations were 4.3%, 7.8%, 11.2%, and 14.7%, respectively.
  • a glycated hemoglobin standard solution having a hemoglobin concentration of 10 gZL was prepared.
  • HbA1c standard reagent (manufactured by Kokusai Reagents) is dissolved in purified water, and the HbA1c concentration is 5.5% and 10.8%, respectively, and the hemoglobin concentration is 10 gZL.
  • a glycated hemoglobin standard solution was prepared.
  • 0.5 mL of a glycated hemoglobin standard solution of each concentration, 0.4 mL of a protease solution, and 0.1 mL of 1.0 OmolZL potassium phosphate buffer (pH 8.0) were mixed and reacted at 37 ° C. for 24 hours.
  • the reaction solution was subjected to an ultra-free MC molecular weight of 5000 (Millipore, hereinafter the same), centrifuged, and the filtrate was recovered. 25 iL of the filtrate After two-fold dilution with purified water, 45 L of the redox reaction solution B was added to the diluted solution, and 5 minutes later, 20 L of the redox reaction solution C was further added to start the reaction.
  • Figure 1 is a graph showing the correlation between the absorbance and the HbA1c concentration in a glycated hemoglobin standard solution.
  • the absorbance increased with an increase in the concentration of HbAle in the glycated hemoglobin standard solution.
  • the HbAlc concentration and the absorbance (corresponding to the measured value of glycated hemoglobin by the measurement method of the present invention) )
  • HbA 1 c can be obtained indirectly. (Example 5)
  • the hemolyzed sample was treated with meta-oral proteinase, papain, and protease derived from Bacillus subtillis, and the saccharified amount of hemoglobin was measured by the measurement method of the present invention, and the HbA1c amount was determined from this.
  • the samples, reagents and methods used for the measurement are shown below.
  • the collected whole blood of healthy subjects and diabetic patients (total of 12 specimens) was allowed to stand for about 6 hours to sediment erythrocytes, and 0.05% by weight Triton x-100 was added to 0.1 ml of these blood cell fractions.
  • the hemolyzed sample was obtained by adding 1.4 mL of the aqueous solution to cause hemolysis.
  • HbA1c standard reagent (manufactured by Kokusai Reagents) is dissolved in a 0.05% by weight aqueous solution of Triton X-100, and the HbAlc concentration (%) is 5.5% and 10.5%, respectively. And a glycated hemoglobin standard solution having a hemoglobin concentration of 200 gZL was prepared.
  • Metaguchi proteinase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Protease N "Amano” manufactured by Amano Enzym Co., Ltd.
  • Papain manufactured by Roche
  • the hemoglobin concentration of the sample was measured by the cyanmethemoglobin method using hemoglobin test Co., Ltd. (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the HbAle concentration (%) of each of the standard solutions was measured using an automatic measuring device (trade name: HA-8150: manufactured by ARKRAY Co., Ltd.). Meanwhile, before for each of the standard solutions, the absorbance corresponding to the amount of glycated hemoglobin was measured by the method for measuring the amount of glycated hemoglobin of the present invention, and the hemoglobin concentration was measured by the method for measuring the concentration of hemoglobin. Then, a linear regression equation was created from the percentage (%) of the value obtained by dividing the absorbance corresponding to the amount of glycated hemoglobin by the concentration of hemoglobin, and the value (%) measured by the automatic measuring device, and this was used as a calibration curve. . The percentage is proportional to the glycation rate of hemoglobin (%). The equation of the calibration curve when each of the proteases is used is shown below.
  • Meta-oral proteinase y 1 5 846 x + 3.2
  • Papain y 1 72 58 x + 3.4
  • the absorbance corresponding to the amount of glycated hemoglobin was measured by the method of measuring the saccharification rate of hemoglobin, and the hemoglobin concentration was measured by the method of measuring the concentration of hemoglobin. Then, a percentage obtained by dividing the absorbance corresponding to the saccharification amount by the hemoglobin concentration was defined as a hemoglobin saccharification rate, and this was substituted into the respective calibration curves to determine the amount of HbA1c in the sample. As a control, the amount of HbA1c was measured for each of the samples by the automatic measuring device. Figure 2 shows these results.
  • FIG. 2 is a graph showing the correlation between the amount of HbA1c determined from the calibration curve by the measurement method of the present invention and the amount of HbA1c measured by the automatic measuring device.
  • the correlation coefficient between HbA1c (%) obtained from the calibration curve by the measurement method of the present invention and the measured value of HbA1c (%) by the automatic measuring device is represented by 0.993 for protease, 0.993 for protease N, 0.9941 for papain, which is very high, indicating that the amount of HbA1c can be determined with the same measurement accuracy as the above automatic measuring instrument.
  • the correlation coefficient between HbA1c (%) obtained from the calibration curve by the measurement method of the present invention and the measured value of HbA1c (%) by the automatic measuring device is represented by 0.993 for protease, 0.993 for protease N, 0.9941 for papain, which is very high, indicating that the amount of HbA1c can be determined with the same measurement accuracy as the above automatic measuring instrument.
  • the hemolyzed sample to which the plasma sample was added was treated with meta-oral proteinase to measure the amount of saccharified hemoglobin, and the change in the amount of saccharification due to the addition of the plasma sample was examined.
  • the collected whole blood (1 sample) and diabetic patients were centrifuged (1,000 g, about 15 minutes), and the blood cell fraction and plasma fraction of each sample were centrifuged. Was recovered. Then, for each sample, a predetermined amount (0 mL, 0.005 mL, 0.010 mL, 0.015 mL, 0.002 mL) of the plasma fraction was added to 0.0 LmL of the blood cell fraction.
  • a hemolyzed sample was prepared by adding 0.3 mL of the following hemolytic reagent to the mixture and lysing the mixture.
  • the saccharification rate of glycated hemoglobin in a whole blood sample can be measured simply and with high accuracy without performing blood cell separation. Also, since the measured value of the amount of glycated hemoglobin by the measurement method of the present invention has a high correlation with the amount of HbA1c, if a calibration curve is prepared from this correlation, the amount of glycated glycated hemoglobin in the whole blood sample can be determined. By simply measuring HbAlc, the amount of HbAlc can be determined accurately and easily.
  • the measurement method of the present invention is applied to, for example, the field of clinical examination, a large amount of a sample can be easily measured, and glycated hemoglobin, particularly HbAlc, is used as an indicator substance for diagnosing glycemic disease. As well as its reliability and importance.

Description

糖化ヘモグロビンの選択的測定方法
技術分野
本発明は、 全血中に存在するヘモグロビンの糖化量を測定する方法に 関する。
明 田
背景技術
血液中の糖化ヘモグロビンは、 生体内血糖値の過去の履歴を反映して いるため、 糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。 このような糖化ヘモグロビンは、 例えば、 高速液体クロマトグラフィ ― (H P L C ) 法、 ミニカラム法、 免疫法等により、 ヘモグロビンの糖 化量または糖化率として測定されている。 最近では、 糖化アミノ酸酸化 還元酵素 （F A O D ) を用いた酵素法により、 糖化タンパク質を測定で きる方法が開発されており、 この酵素法を用いたヘモグロビン糖化量 （ 糖化ヘモグロビン） の測定が試みられている。
発明の開示
しかしながら、 この方法には、 次のような問題がある。 糖化へモグロ ビンは血球内成分であるため、 測定に際して血球の溶血処理が不可欠で ある。 しかし、 全血を試料とする場合、 全血の状態で血球を溶血させる と、 血球成分と血漿成分とが混合した状態となる。 このため、 溶血処理 した全血試料には、 血球中成分である糖化ヘモグロビンだけでなく、 特 に、 血漿中成分であり含有率も高いアルブミンも存在し、 その糖化物で ある糖化アルブミンも存在するため、 前記糖化アルブミンも同様に F A 〇Dの作用を受け、 糖化ヘモグロビンと共に測定されてしまう。 したが つて、 前記糖化アルブミン等の他の糖タンパク質による影響を除去する ために、 全血試料から血漿と血球とを分離することが余儀なくされてお り.、 操作も煩雑であった。
そこで、 本発明の目的は、 全血試料の分離を行わずに、 他の糖タンパ ク質が影響することなく、 前記全血試料中のヘモグロビン糖化量を正確 かつ容易に測定できるヘモグロビン糖化量の測定方法の提供である。 前記目的を達成するために、 本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法 は、 全血中の糖化ヘモグロビンを選択的にプロテアーゼで分解し、 この 糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分と F A O Dとを反応させ、 この酸化 還元反応を測定することによりへモグロビン糖化量を決定する方法であ る。 なお、 本発明において、 「ヘモグロビン糖化量」 とは、 へモグロビ ン糖化率も含む。
このように、 他のタンパク質やペプチドと区別して、 糖化へモグロビ ンだけをプロテアーゼで選択的 （特異的） に分解すれば、 F A O Dは夕 ンパク質および長いポリべプチド鎖には作用し難いため、 全血について 血球分離操作を行わなくても、 他の糖化タンパク質、 特に糖化アルブミ ン等の影響を受けることなくヘモグロビン糖化量を測定できる。 このた め、 測定試料は、 例えば、 溶血処理した全血試料でもよい。
本発明の測定方法において、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解するに は、 例えば、 前記プロテアーゼとして、 糖化ヘモグロビンを選択的に分 解するプロテアーゼを用いればよい。 なお、 本発明では、 糖化へモグロ ビンを選択的に分解するプロテアーゼを用いる方法に、 特に限定されず 、 その他の手段により、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解してもよい。 また、 一般のプロテア一ゼと、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプ 口テア一ゼとを併用してもよい。 前記プロテア一ゼは、 ブロメライン、 パパイン、 ブ夕塍臓由来トリプ シン、 メタ口プロティナーゼ、 Bacillus subtil is由来プロテアーゼで あることが好ましい。 前記 Bacillus subtil is由来プロテア一ゼとして は、 例えば、 商品名プロテア一ゼ N (シグマ · アルドリッチ社製） 、 商 品名プロテアーゼ N「ァマノ」 （天野ェンザィム （株） 製） 等があげられ る。 前記メタ口プロティナーゼとしては、 Bacillus属由来メタ口プロテ イナ一ゼ （EC 3. 4. 24. 4) (例えば、 東洋紡績 （株） 製：商品 名トヨチーム） 等があげられる。 これらの中でもより好ましくはメタ口 プロティナーゼ、 ブロメライン、 パパインであり、 特に好ましくはメタ 口プロティナーゼである。
本発明の測定方法において、 前記 FAODは、 糖化タンパク質、 糖化 ぺプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つ の糖化アミンを基質とし、 前記糖化ァミンにおける α—ァミノ基糖化部 分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、 過酸化水 素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。
本発明の測定方法において、 前記 FAODと反応させる糖化へモグロ ビン分解物の糖化部分は、 使用する FAODの触媒反応により異なるが 、 例えば、 アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基ゃ糖化ひーァミノ基である ことが好ましい。 この中でも、 後述する触媒機能を有する FAODが作 用し易いことから、 前記アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基であることが 好ましく、 例えば、 リジン残基側鎖の糖化アミノ基、 アルギニン残基側 鎖の糖化アミノ基等があげられる。
本発明の測定方法において、 前記プロテアーゼは、 全血 lmLに対し て 1, 00 0〜 1 0， 000， 00 0 Uの範囲で添加することが好まし く、 また、 前記 FAODは、 全血 1 mLに対して 5 00〜40， 000 Uの範囲で添加することが好ましい。 本発明の測定方法において、 前記酸化還元反応の測定は、 前記反応に より生じる過酸化水素量の測定もしくは前記反応で消費される酸素量の 測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、 前記過酸化水素量の測定は、 ペルォキシ ダ一ゼ （以下、 「P O D」 という） と酸化により発色する基質とを用い た測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、 前記酸化により発色する基質としては、 特に制限されず、 例えば、 N— (力ルポキシメチルァミノ力ルポニル） - 4 , 4 ' 一ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナトリウム、 ォ ルトフエ二レンジァミン （O P D ) 、 トリンダー試薬と 4ーァミノアン チピリンとを組み合せた基質等があげられる。 前記トリンダー試薬とし ては、 例えば、 フエノール、 フエノール誘導体、 ァニリン誘導体、 ナフ トール、 ナフトール誘導体、 ナフチルァミン、 ナフチルァミン誘導体等 があげられる。 また、 前記 4ーァミノアンチピリンの他に、 アミノアン チピリン誘導体、 バニリンジァミンスルホン酸、 メチルベンズチアゾリ ノンヒドラゾン （M B T H) 、 スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒ ドラゾン （S M B T H) 等も使用できる。 このような発色性基質の中で も、 特に好ましくは、 N— （カルボキシメチルァミノ力ルポニル） 一 4 ， 4 ' 一ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナトリウムである。 つぎに、 本発明の H b A l eの測定方法は、 前記本発明のへモグロビ ン糖化量の測定方法によるヘモグロビン糖化量と H b A 1 cの量との相 関関係から作成された検量線を準備し、 前記本発明のヘモグロビン糖化 量の測定方法から得られた全血試料中のヘモグロビン糖化量を前記検量 線に代入することにより、 前記全血試料中における H b A 1 cの量を求 める測定方法である。
本発明者らは、 さらに銳意研究を行った結果、 前記本発明のへモグロ ビン糖化量の測定方法により求められる全血試料中におけるへモグロビ ン糖化量が、 前記全血試料中の Hb A 1 cの量と高い相関関係にあるこ とを見出した。 HbA l cは、 ヘモグロビンの j8—鎖 N末端の α—アミ ノ基が糖化された糖化ヘモグロビンをいい、 糖化ヘモグロビンの中でも 、 特に重要な糖尿病の診断等における指標とされている。 従来の方法に よると、 HbA l cの測定は、 糖化部分の中でも、 HbA l cの特徴的 構造部位である )3—鎖 N末端の ーァミノ基糖化部分に、 FAODを特 異的に作用させ、 その酸化還元反応を測定する必要があった。 この場合 、 使用する FAODが、 例えば、 ひーァミノ基糖化部位に対して基質特 異性が高いことや、 前記ひ ーァミノ基糖化部位に十分に作用すること等 が要求されているため、 特別な方法をとらざるを得なかった。 しかし、 本発明の HbA l c測定方法によれば、 糖尿病診断の重要な指標となる HbA l cの測定を、 正確かつ簡便に行うことができ、 HbA l cの測 定を臨床検査等において実用化することが可能となる。 ，
本発明の HbAl cの測定方法において、 前記検量線は、 標準試料の 既知 HbA l c量と、 前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法によ る前記標準試料のヘモグロビン糖化量との相関関係から作成された検量 線であることが好ましい。
つぎに、 本発明の測定キットは、 ヘモグロビン糖化量の測定に使用さ れる測定キットであって、 他のタンパク質およびペプチドと区別して糖 化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを含む。 このキットを 使用すれば、 前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定キットにおいて、 プロテアーゼは、 ブロメライン、 パパ イン、 ブタ塍臓由来トリプシン、 メタ口プロティナーゼ、 Bacillus su iiiiA由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つ のプロテアーゼであることが好ましい。 また、 本発明の測定キットは、 さらに、 糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。 前記糖化ァ ミノ酸酸化還元酵素は、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミ ノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし 、 前記糖化ァミンにおけるひーァミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖 化部分の少なくとも一方に作用して、 過酸化水素を生成する反応を触媒 する酵素であることが好ましい。 本発明の測定キットは、 さらに、 ペル ォキシダ一ゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。 前 記酸化により発色する基質は、 N— （力ルポキシメチルァミノカルボ二 ル） 一 4， 4一ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナトリウムで あることが好ましい。
つぎに、 本発明の測定試薬は、 ヘモグロビン糖化量の測定に使用され る測定試薬であって、 他のタンパク質およびペプチドと区別して選択的 に糖化ヘモグロビンを分解するプロテア一ゼを含有する。 この試薬を用 いれば、 前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定試薬において、 プロテア一ゼは、 ブロメライン、 パパイ ン、 ブ夕塍臓由来トリプシン、 メタ口プロティナ一ゼ、 Bac i l lus sub t i l l i s由来のプロテア一ゼからなる群から選択された少なくとも一つの プロテアーゼであることが好ましい。 また、 本発明の測定試薬は、 さら に、 糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。 前記糖化アミノ 酸酸化還元酵素は、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸 からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、 前 記糖化ァミンにおける Q!—アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部 分の少なくとも一方に作用して、 過酸化水素を生成する反応を触媒する 酵素であることが好ましい。 本発明の測定試薬は、 さらに、 ペルォキシ ダ一ゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。 前記酸化 により発色する基質は、 N _ (力ルポキシメチルァミノ力ルポニル） 一 4, 4—ビス （ジメチルァミノ） ジフエ二ルァミンナトリウムであるこ とが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の測定方法の一実施例において、 Hb A l e濃度と吸 光度との相関関係を示したグラフである。
図 2は、 本発明の測定方法のその他の実施例において、 検量線から求 めた HbA l c (%) と自動測定器で測定した Hb A 1 c ( ) との相 関関係を示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の測定方法において使用できる FAODとしては、 下記式 （ 1 ) に示す反応を触媒する FAODであることが好ましい。 R1— CO_CH2-NH— R2 + H2〇 + 〇2
→ R1- CO- CHO + NH2 - R2 + H202
• · · ( 1) 前記式 （1) において、 R1- CO_CH2- NH- R2 は、 例えば、 糖 化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸である。 前記式 （1) において、 R1は、 水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基 （糖 残基） を示す。 前記糖残基 （R1) は、 糖化反応前の糖がアルドースの 場合はアルドース残基であり、 糖化反応前の糖がケトースの場合、 ケト ース残基である。 例えば、 糖化反応前の糠がグルコースの場合は、 アマ ドリ転位により、 糖化反応後の構造はフルクト一ス構造をとるが、 この 場合、 糖残基 （R1) は、 グルコース残基 （アルドース残基） となる。 この糖残基 （R1) は、 例えば、
- [CH (OH) ]n - CH2〇H
で示すことができ、 nは、 0〜6の整数である。
前記式 （ 1 ) において、 R2は、 特に制限されないが、 α—ァミノ基 が糖化されている場合と、 それ以外のァミノ基が糖化されている場合と で異なる。
前記式 （ 1 ) において、 α—ァミノ基が糖化されている場合、 R2は 、 下記式 （2) で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。 - CHR3- CO- R4 · · · (2) 前記式 （？） において、 R3はアミノ酸側鎖基を示し、 また、 R4は 水酸基、 アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、 例えば、 下記式 （3 ) で表わすことができる。 下記式 （3) において、 nは、 0以上の整数 であり、 R3は、 前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
- (NH-CR3H-CO) η-ΟΗ · · · (3) また、 前記式 （1) において、 α—ァミノ基以外のァミノ基が糖化さ れている （アミノ酸側鎖基が糖化されている） 場合、 R 2は下記式 （4 ) で示すことができる。 C=〇 一 R5 - CH
NH
I
R6 · · · (4)
前記式 （4) において、 R5は、 アミノ酸側鎖基のうち、 糖化された アミノ基以外の部分を示す。 例えば、 糖化されたアミノ酸がリジンの場 合、 R5は
H - Ch2—し H2— Cn2- であり、
例えば、 糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、 R5は、
-CH2-CH2-CH,-NH-CH (NH2) —である。
前記式 （4) において、 R6は、 水素、 アミノ酸残基またはペプチド 残基であり、 例えば、 下記式 （5) で表わすことができる。 なお、 下記 式 （ 5) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同様にァ ミノ酸側鎖基を示す。
- (CO-CR3H-NH) -H · · · (5)
また、 前記式 （4) において、 R7は、 水酸基、 アミノ酸残基または ペプチド残基であり、 例えば、 下記式 （6) で表わすことができる。 な お、 下記式 （6) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と 同様にアミノ酸側鎖基を示す。 - (NH- CHR3- CO) n-〇H · · · (6) 使用する F AO Dの触媒反応は、 前述のような反応であれば特に制限 されないが、 前記式 （1) において、 ひーァミノ基以外のァミノ基に糖 が結合した糖化部位 （前記 R2が前記式 （4) に示す構造である） に作 用する触媒反応であることが好ましい。 また、 前記 FAODは、 このよ うな触媒機能のみに制限されず、 さらに —アミノ基に糖が結合した糖 化部位 （前記 R2が前記式 （2) に示す構造である） に作用する触媒機 能を併せ持ってもよい。
このような F AODとしては、 例えば、 フサリウム由来、 ギペレラ由 来、 ァスペルギルス由来のものがあり、 市販の商品名フルクトシル ·ァ ミノ酸ォキシダーゼ （旭化成社製） 、 商品名ケトァミンォキシダ一ゼ （ ジェンザィム社製） 等が使用できる。
つぎに、 本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法の一例について説明 する。
まず、 全血を溶血する。 この溶血方法は、 特に制限されず、 例えば、 界面活性剤を用いる方法、 超音波による方法、 浸透圧の差を利用する方 法等が使用できる。 この中でも、 操作の簡便性等の理由から、 界面活性 剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、 例えば、 ポリオキシエチレン- p-t_ォクチ ルフエ二ル エーテル （T r i t o n系界面活性剤等） 、 ポリオキシェ チレン ソルビ夕ン アルキル エステル （Twe e n系界面活性剤等 ) 、 ポリオキシエチレン アルキル エーテル （B r i j系界面活性剤 等） 等の非イオン性界面活性剤が使用でき、 具体的には、 例えば、 商品 名 T r i t o nX— 1 00、 商品名 Twe e n— 20、 商品名 B r i j 3 5等があげられる。 前記界面活性剤による処理条件は、 通常、 処理溶 液中の血球濃度が 1〜10体積％の場合、. 前記処理溶液中の濃度が 0. 1〜 1重量％になるように前記界面活性剤を添加し、 室温で 5秒〜 1分 程度攪拌すればよい。
また、 前記浸透圧の差を利用する場合は、 例えば、 全血の体積に対し 2〜100倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
つぎに、 前記溶血試料に対し、 前記プロテアーゼを用いてプロテア一 ゼ処理を行い、 前記試料中の糖化ヘモグロビンを選択的に分解する。 前 記プロテアーゼ処理は、 通常、 緩衝液中で行われ、 その処理条件は、 例 えば、 使用するプロテア一ゼの種類、 糖化ヘモグロビンの量等により適 宜決定される。
前記プロテア一ゼとしてパパインを用いて、 前記溶血試料を処理する 場合、 通常、 反応液中のプロテア一ゼ濃度 100〜30, 000 U/L 、 反応液中のヘモグロビン濃度 0. l〜40 gZL、 反応温度 15〜6 0 、 反応時間 10分〜 40時間、 pH5〜9の範囲である。 また、 前 記緩衝液の種類も特に制限されず、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 EP P S緩衝液、 P I PE S緩衝液、 リン酸緩衝液、 ADA緩衝液、 クェン酸 緩衝液、 酢酸緩衝液等が使用できる。
また、 前記プロテアーゼとしてメタ口プロティナーゼを用いて、 前記 溶血試料を処理する場合、 例えば、 反応液中のプロテアーゼ濃度 10〜 10, 000 KUZL、 反応液中のヘモグロビン濃度 0. 02〜40 g ZL、 反応温度 15〜60 、 反応時間 2分〜 40時間、 pH6〜l 1 の範囲であり、 好ましくは、 反応液中のプロテアーゼ濃度 100〜8， 000 KU/L、 反応液中のヘモグロビン濃度 0. l〜10 gZL、 反 応温度 15〜60で、 反応時間 2分〜 1時間、 pH7〜10の範囲であ る。 前記緩衝液は、 前述と同様のものが使用できる。 また、 他のプロテ イナーゼも同様に使用できる。 つぎに、 前記プロテア一ゼ処理により得られた糖化ヘモグロビン分解 物を、 FAODで処理する。 この FAQD処理により、 前記式 （1) に 示す反応が触媒される。 具体的には、 FAODが、 例えば、 前記糖化へ モグロビン分解物のリジン残基側鎖およびアルギニン残基側鎖の糖化ァ ミノ基に作用する。 また、 FAODの種類によっては、 その触媒機能に より、 さらに、 糖化 α—ァミノ基にも作用してもよい。
この FAOD処理は、 前記プロテア一ゼ処理と同様に緩衝液中で行う ことが好ましく、 前記緩衝液としては、 特に制限されず、 前記プロテア ーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
この処理条件は、 例えば、 反応液中の FAOD濃度 200〜 30， 0 00UZL、 反応液中のヘモグロビン濃度 0. 02〜30 gZL、 反応 温度 15〜37で、 反応時間 1〜20分、 pH7〜9の範囲であり、 反 応液中の FAOD濃度 1, 000〜20， 000 UZ L、 反応液中のへ モグロビン濃度 0. 1〜5 gZL、 反応温度 15〜37°C、 反応時間 1 〜5分、 pH7〜9の範囲である。
つぎに、 前記 FAOD処理によって生じた過酸化水素の量を、 前記 P ODおよび酸化により発色する基質を用いて、 酸化還元反応を利用して 測定する。
この PODによる酸化還元反応は、 通常、 緩衝液中で行われ、 その条 件は、 例えば、 過酸化水素濃度等により適宜決定される。 通常、 反応液 中の P〇D濃度:！〜 100 , 000 I UZL、 基質濃度 0. 0001〜 1 mmo 1ZL、 反応温度 20〜37°C、 反応時間 1〜 5分、 pH6〜 9であり、 好ましくは、 反応液中の POD濃度 1， 000〜50， 00 。 ^ ！^ 基質濃度 0002〜0. lmmo 1 ZL、 反応温度 2 0〜37で、 反応時間 1〜 5分、 pH6〜9である。 また、 前記緩衝液 は、 特に制限されず、 前記 FAOD処理等と同様の緩衝液等が使用でき る。
なお、 前記過酸化水素量は、 前記 POD等を用いた酵素的手法の他に 、 例えば、 電気的手法により測定することもできる。
前記酸化により発色する基質を用いた場合は、 その発色 （反応液の吸 光度） を分光光度計で測定することにより、 過酸化水素の濃度を測定で き、 これから前記試料中のヘモグロビン糖化量を測定できる。
この測定において、 各処理工程は、 前述のように別々に行ってもよい が、 例えば、 以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理ェ 程がある。
1 ： 溶血処理 +プロテアーゼ処理
2 ： プロテアーゼ処理 + F AOD処理
3 ： FAOD処理 +POD処理 また、 前記 FAOD、 PODおよび前記基質の添加順序も、 特に制限 されない。
つぎに、 本発明の HbAl cの測定方法の一例について説明する。 まず、 全血試料について、 前述と同様にしてヘモグロビン糖化量の測 定を行う。 他方、 糖化ヘモグロビンのうち Hb A 1 c量が既知である糖 化ヘモグロビン標準液を準備し、 これについて、 前述と同様にしてへモ グロビン糖化量の測定を行い、 この標準液についての測定値と既知の H b A 1 c量との関係を示す検量線を作成する。 前述のように、 前記へモ グロビン糖化量の測定値と Hb A 1 c量とは相関関係にあるため、 この 検量線に、 本発明の測定方法による前記全血試料におけるヘモグロビン 糖化量の測定値を代入することにより、 前記全血試料中の HbA l c量 を求めることができる。 なお、 検量線の作成において、 前記へモグロビ ン糖化量の測定値としては、 最終的に求めたヘモグロビン糖化量だけで なく、 前記ヘモグロビン糖化量の測定において POD処理によって得ら れた反応液の吸光度値でもよいし、 前記吸光度から求めた過酸化水素量 を使用してもよい。 このように、 本発明の Hb A 1 c測定方法によれば 、 発明者らが新たに見出した相関関係を利用して、 ヘモグロビン糖化量 の測定値から全血中の Hb A 1 c量を高精度かつ簡便に測定できる。 実施例
(実施例 1 )
糖化へモグロビンおよび糖化アルブミンを含む試料をパパインで処理 し、 さらに FAODによる酸化還元反応を行い、 発生した過酸化水素の 測定を行った。 測定に用いた試料、 試薬およびその方法を以下に示す。
(試料）
糖化率 22. 5 %のヒト血清アルブミン （シグマ社製）
糖化率 14 %のヒトヘモグロビン
なお、 このヒトヘモグロビン試料は、 以下の方法により調製し、 その 糖化率は、 イオン交換カラムを使用した HP L C法により求めた。
(ヒトヘモグロビンの調製）
健常者の全血を遠心分離 （ 1 500 G、 1 0分） して血球を回収し、 これを生理食塩水で数回洗浄した後.、 ほぼ当量の精製水を添加して血球 を溶血させた。 この溶血液を遠心分離して血球膜を除去したものを、 商 品名 GL YCO · GELII (ピアス社製） に供し、 常法により糖化タン パク質含有画分を分取したものをヒトヘモグロビン試料とした。
(酸化還元反応液 Aの組成）
F AOD (旭化成工業社製、 以下同じ） 2. 09KU/L POD (Ty p e III：東洋紡績社製、 以下同じ） 730 UZL N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） - 4， 4-ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエ：:ルァミンナトリウム (商品名 DA64：和光純薬工業社製、 以下同じ） 1. 46mmo l /L T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) 73mmo 1 /L
(方法）
前記各試料 （ヒト血清アルブミン、 ヒトヘモグロビン） lmLに、 1 KU/Lのパパイン （シグマ ·アルドリッチ社製） lmLを添加し、 4 0°Cで 24時間反応させた。 そして、 これらの溶液 0. 0 1 8mLに前 記酸化還元反応液 A 0. 1 5mLをそれぞれ添加して酸化還元反応を 開始し、 反応開始 5分後の各反応液の主波長 6 94 nm、 副波長 884 nmにおける吸光度を、 生化学自動分析装置 （商品名 J CA— BM8 ： 日本電子社製、 以下同じ） を用いて測定した。 これらの結果を下記表 1に示す。
(実施例 2)
パパインの代わりに 1 g/Lのブロメライン （天野ェンザィム株式会 社、 以下同じ） lmLを用いた以外は、 実施例 1と同様にして前記各試 料 （ヒト血清アルブミン、 ヒトヘモグロビン） を処理して吸光度の測定 を行った。 これらの結果を下記表 1に示す。
(比較例 1 )
パパインの代わりに 1 gZLのひーキモトリプシン 1 mLを用いた以 外は、 前記実施例 1と同様にして前記各試料 （ヒト血清アルブミン、 ヒ トヘモグロビン） を処理して吸光度の測定を行った。 これらの結果を下 記表 1に示す。 (表 1)
プロテアーゼ ヒト血清アルブミン ヒ卜へモグロビン ― (Ab s . ) (Ab s . ) 実施例 1 パパイン 0. 0 14 0. 090 実施例 2 ブロメライン 0. 0008 0. 03 7 比較例 1 ο;—キモトリプシン 0. 0 63 0. 042 前記表 1に示すように、 実施例 1および 2のパパインおよびプロメラ インによれば、 ヒトヘモグロビン試料について高い吸光度が見られ、 か つ、 ヒト血清アルブミン試料についてはわずかな吸光度であることから 、 糖化アルブミンをほとんど分解せずに、 糖化ヘモグロビンを選択的に 分解できることがわかった。 これに対して比較例 1の α—キモトリプシ ンは、 前記両試料について同様に高い吸光度が見られることから、 糖化 ヘモグロビンだけでなく糖化アルブミンにも作用し、 選択的ではないこ とがわかる。
(実施例 3および比較例 2)
試料として全血、 血漿、 血球をそれぞれ用い、 各種プロテア一ゼで処 理し、 糖化ヘモグロビンの測定を行った。
(全血試料の調製）
へパリンナトリウム入り採血管を用いて健常者から全血を採取し、 こ れに精製水を加えて 8倍希釈して、 前記全血中の血球を溶血させたもの を全血試料と.した。
(血漿試料の調製） 前記健常者の全血を遠心分離 （1 500 G、 1 0分） して血球を分離 除去し、 得られた上清に精製水を添加して 8倍希釈したものを血漿試料 とした。 (血球試料の調製）
前記遠心分離により得られた血球に、 精製水を加えて 1 6倍に希釈し 、 前記血球を溶血させたものを血球試料とした。
(プロテアーゼ）
プロメライン、 パパイン （ロッシュ社製） 、 エラスターゼ （和光純薬 工業社製） 、 （¾ーキモトリブシン （和光純薬工業社製） 、 プロテナーゼ K (和光純薬工業社製） を精製水に溶解し、 濃度 4 g/Lの各種プロテ ァーゼ溶液をそれぞれ調製した。 (酸化還元反応液 Bの組成）
POD 20 KU/L 商品名 DA 64 0. 04mm 0 1 /L リン酸カリウム緩衝液 （PH 7 0) 0. 1 mo 1 /L (酸化還元反応液 Cの組成）
F AOD 14. 3 KU/L リン酸カリウム緩衝液 （pH7. 0) 0. 1 m o 1 /L
(測定方法）
前記各試料 0. 2mL、 前記プロテアーゼ溶液 0. lmLおよびリン 酸カリウム緩衝液 （PH7. 0) 0. 7mLを混合し、 37°Cで 24時 間反応させた。 反応後、 各反応液を商品名ウルトラフリー 4ユニット 5 K (ミリポア社製） に供して遠心分離を行い、 ろ液を回収した。 前記各 ろ液 2 5 Lに、 前記酸化還元反応液 B 45 を添加し、 5分後に、 さらに前記酸化還元反応液 C 20 Lを添加して反応を開始し、 反応開 始 5分後の各反応液の主波長 6 94 nm、 副波長 884 nmにおける吸 光度を、 前記生化学自動分析装置を用いて測定した。 この結果を下記表 2に示す。 なお、 プロメラインおよびパパインは実施例 3であり、 エラ スターゼ、 α—キモトリブシン、 プロテナ一ゼ Κは比較例 2である。
(表 2)
ø式料
プロテア一ゼ 血漿 血球 全血
(Abs.) (Abs.) (Abs.) 実施例 3
ブロメライン 0 0 0. 009 0. 002 パパイン 一 0 00 0. 02 1 0. 0 1 5 比較例 2
エラス夕一ゼ 0. 0 1 2 0. 0 1 9 0. 0 1 5 α—キモトリプシン 0. 0 1 5 0. 0 1 6 0. 0 1 3 プロテナーゼ K 0. 0 36 一 0. 027 一 034 前記表 2に示すように、 実施例 3では、 血漿試料について吸収はほと んど確認されなかった。 このことから、 実施例 3で用いたプロテアーゼ によれば糖化ヘモグロビンを選択的に分解でき、 例えば、 血漿由来の糖 化アルブミン等をほとんど分解しないことがわかる。 これに対して、 比 較例 2では、 糖化ヘモグロビンが存在しないはずの血漿試料中において も吸収が確認された。 これは、 比較例に用いたプロテアーゼによると、 糖化ヘモグロビンと他の糖化タンパク質とを選択することなく分解して しまうため、 例えば、 血漿試料においては糖化アルブミン等が分解され 、 その結果、 吸収が見られたと考えられる。
(実施例 4)
(糖化ヘモグロビン標準液の調製）
精製水に Hb A 1 c標準試薬 （S RL社製） を溶解して、 Hb A 1 c 濃度がそれぞれ 4. 3%、 7. 8%、 1 1. 2%、 14. 7%であり、 かつ、 ヘモグロビン濃度が 10 gZLである糖化ヘモグロビン標準液を 調製した。 また、 精製水に Hb A 1 c標準試薬 （国際試薬社製） を溶解 して、 Hb A 1 c濃度がそれぞれ 5. 5%、 10. 8%であり、 かつ、 ヘモグロビン濃度が 10 gZLである糖化ヘモグロビン標準液を調製し た。
(各種プロテアーゼ溶液の調製）
各種プロテアーゼを精製水に溶解して、 濃度 2 g/Lのブロメライン F (天野ェンザィム株式会社製） 溶液および濃度 1 g/Lのパパイン （ ロッシュ社製） 溶液を調製した。
(測定方法）
各濃度の糖化ヘモグロビン標準液 0. 5mL、 プロテアーゼ溶液 0. 4mLおよび 1. Omo lZL リン酸カリウム緩衝液 （ p H 8. 0) 0. 1mlを混合し、 37 °Cで 24時間反応させた。 反応後、 前記反応 液を商品名ウルトラフリー MC 分子量 5000 (ミリポア社製、 以下 同じ） に供して遠心分離を行い、 ろ液を回収した。 前記ろ液 25 iLを 精製水によって 2倍希釈した後、 この希釈液に前記酸化還元反応液 B 4 5 Lを添加し、 5分後、 さらに前記酸化還元反応液 C 20 ^ Lを添加 して反応を開始した。 そして、 反応開始 5分後の各反応液の主波長 6 9 4 nm、 副波長 884 nmにおける吸光度を、 前記生化学自動分析装置 を用いて測定した。 これらの結果を下記表 3および図 1のグラフに示す
(表 3)
H b A 1 c (%)
プロテア一ゼ 4.3 5.5 7.8 10.8 11.2 14.7 パパイン 0.010 0.016 0.026 0.043 0.041 0.059 ブロメライン 0.002 0.004 0.005 0.014 0.008 0.010 図 1.は、 糖化ヘモグロビン標準溶液中の HbA 1 c濃度と吸光度の相 関関係を示すグラフである。 パパインについての相関式は y = 2 1 0 X + 2. 2、 その相関係数は r = 0. 9 9 8であり、 ブロメラインについ ての相関式は y = 1 32 1 x+ 1. 0、 その相関係数は r = 0. 96 8 であった。
前記表 3および図 1に示すように、 糖化ヘモグロビン標準液中の Hb Ale濃度の増加に伴い吸光度が増加したことから、 HbA l c濃度と 吸光度 （本発明の測定方法による糖化ヘモグロビンの測定値に相当） は 高い相関関係にあることがわかる。 したがって、 この HbA l c濃度と 前記吸光度との検量線を予め準備すれば、 全血試料中の糖化へモグロビ ンについて前述のように測定を行い、 この測定値と前記検量線とから全 血試料中の HbA 1 c量を間接的に求めることができる。 (実施例 5)
溶血試料をメタ口プロティナ一ゼ、 パパイン、 Bacillus subtillis 由来のプロテア一ゼで処理して、 本発明の測定方法によりヘモグロビン の糖化量を測定し、 さらに、 これから Hb A 1 c量を求めた。 測定に用 いた試料、 試薬およびその方法を以下に示す。
(試料の調製）
採取した健常者および糖尿病患者の全血 （合計 1 2検体） をそれぞれ 約 6時間静置して赤血球を沈降させ、 これら血球画分 0. lmLに 0. 0 5重量％T r i t o nX— 1 00水溶液を 1. 4mL添加して溶血さ せたものを溶血試料とした。
(標準液の調製）
0. 05重量％T r i t o n X- 1 00水溶液に、 Hb A 1 c標準試 薬 （国際試薬社製） を溶解して、 HbA l c濃度 (%) がそれぞれ 5. 5 %、 1 0. 5 %であり、 かつ、 ヘモグロビン濃度が 2 00 gZLであ る糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
(プロテアーゼ溶液の調製）
メタ口プロティナーゼ （東洋紡績社製） 、 商品名プロテアーゼ N 「ァ マノ」 （天野ェンザィム株式会社製） およびパパイン （ロシュ社製） を 精製水に溶解して、 濃度 1 gZLの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調 製した。 (酸化還元反応液 D)
POD 20 KU/L 商品名 DA— 64 0. 04mmo 1 /L リン酸緩衝液 （pH 8. 0) 0. 8 mo 1 /L
(酸化還元反応液 E)
F AOD 1 4. 3 KU/L リン酸カリウム緩衝液 （pH 8. 0) 0. 1 mm o 1 /L
(ヘモグロビン糖化量の測定方法）
サンプル 0. 2mL、 プロテアーゼ溶液 0. 1 6mLおよび 0. lm o 1 /L リン酸カリウム緩衝液 （pH 8. 0) 0. 0 4mLを混合し 、 3 7°Cで 36時間反応させた。 反応後、 前記反応液を前記商品名ウル トラフリ一 MC分子量 5 0 0 0に供して遠心分離を行い、 ろ液を回収し た。 前記ろ液 2 5 Lを精製水によって 2倍希釈した後、 この希釈液に 酸化還元反応液 D 4 5 Lを添加し、 5分後に酸化還元反応液 E 2 0 Lを添加して反応を開始した。 そして、 反応開始 2分後の反応液の主波 長 7 5 1 nm、 副波長 8 84 nmにおける吸光度測定を行った。 この測 定値は、 ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。
(ヘモグロビン濃度の測定方法）
商品名ヘモグロビンテストヮコー （和光純薬工業社製） を用いてシァ ンメトヘモグロビン法により、 サンプルのヘモグロビン濃度を測定した
(検量線の作成）
前記各標準液について、 自動測定器 （商品名 HA— 8 1 5 0 : アーク レイ株式会社製） を用いて Hb A l e濃度 （％) を測定した。 一方、 前 記各標準液について、 本発明の前記ヘモグロビン糖化量の測定方法によ り、 ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度の測定を行い、 また、 前記 ヘモグロビン濃度測定方法によりヘモグロビン濃度を測定した。 そして 、 前記ヘモグロビン糖化量に相当する吸光度をヘモグロビン濃度で割つ た値の百分率 （％) と、 前記自動測定器による測定値 （％) とから一次 回帰式を作成し、 これを検量線とした。 前記百分率は、 ヘモグロビン糖 化率 （％) に比例する。 以下に、 前記各プロテア一ゼを使用した場合の 検量線の式を示す。
(検量線）
プロテアーゼ -次回帰式
メタ口プロティナーゼ y= 1 5 846 x+ 3. 2
プロテア一' y= 1 66 59 x+ 3. 3
パパイン y= 1 72 58 x+ 3. 4
(Hb A 1 cの測定方法）
前記各溶血試料について、 前記ヘモグロビン糖化率の測定方法により ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度測定を行い、 前記ヘモグロビン 濃度の測定方法によりヘモグロビン濃度の測定を行った。 そして、 前記 糖化量に相当する吸光度を前記ヘモグロビン濃度で割った百分率をへモ グロビン糖化率とし、 これを前記各検量線に代入することにより前記試 料中の Hb A 1 c量を求めた。 また、 対照として、 前記各試料について 前記自動測定器により Hb A 1 c量を測定した。 これらの結果を図 2に 示す。 図 2は、 本発明の測定方法により検量線から求めた Hb A 1 c量 と、 前記自動測定器で測定した Hb A 1 c量との相関関係を示すグラフ である。 図示のように、 本発明の測定方法により検量線から求めた Hb A 1 c (%) と、 前記自動測定器による Hb A 1 c (%) 測定値との相関係数 は、 メタ口プロティナ一ゼの場合 0. 993 7、 プロテアーゼ Nの場合 0. 9 93、 パパインの場合 0. 9 941と非常に高く、 前記自動測定 器と同様の測定精度で Hb A 1 c量を求められることがわかった。
(実施例 6)
血漿試料を添加した溶血試料をメタ口プロティナーゼで処理してへモ グロビンの糖化量を測定し、 前記血漿試料の添加による前記糖化量の変 , 化を調べた。
(試料の調製）
採取した健常者 （ 1検体） および糖尿病患者の全血 （合計検体：患者 検体、 患者検体 2) を遠心分離 （ 1 000 g、 約 1 5分間） し、 各検体 の血球画分および血漿画分を回収した。 そして、 検体毎に、 血球画分 0. 0 lmLに、 血漿画分を所定量 （0mL、 0. 00 5mL、 0. 0 1 0 mL、 0. 0 1 5mL、 0. 020mL) 添加し、 この混合液に下記溶 血試薬 0. 3 mLをそれぞれ加えて溶血させたものを溶血試料とした。 そして、 前記各溶血試料 0. 0 lmLに下記メタ口プロティナーゼ試 薬 0. 06 5mLを加え、 37 °Cで 5分間インキュベーションした。 さ らに、 下記酸化還元反応液 F 0. 045mLを添加して 3 7でで 2分 間インキュベーションした後、 前記反応液の主波長 7 5 l nm、 副波長 8 0 5 nmにおける吸光度測定を行った。 この測定値は、 ヘモグロビン の糖化量に相当する吸光度である。 血漿画分添加量によって反応溶液量 が異なるため、 反応溶液当たりの吸光度を補正した値を下記表 4に示す (溶血試薬）
ポリオキシエチレンラウリルエーテル 9 g
CHE S緩衝液 （pH9. 4) 1 00mmo l /L
(メタ口プロティナ一ゼ試薬： pH 5. 5)
メタ口プロティナーゼ （東洋紡績社製） 4000 KU/L
WS T- 3 (同仁化学社製） 2mmo 1 /L
ME S 5mmo 1 /L
C a C 1 2 5 mm o 1 /L
N a C 1 5 0 mmo 1 /L
※ WST-3 ： 2 -（4 -ョ-ドフエ二ル）- 3- (2， 4 -シ'ニトロフエ二ル）- 5- (2, 4 -シ'スルフ才フエ 二ル）- 2H-テトラリ'リウム モノリ τ ィゥム塩
(酸化還元反応液 F)
F AOD 30 KU/L
POD 90 KU/L
DA- 64 0. 0 6 mm o 1 /L
リン酸緩衝液 （ P H 7. 0) 200 mm o 1 /L
(表 4)
血漿画分添加量 健常者検体 糖尿病 糖尿病
(mL) 患者検体 1 患者検体 2
0 0.0215 0.0283 0.0348
0.005 0.0216 0.0278 0.343
0.010 0.0196 0.0283 0.350
0.015 0.0204 0.0289 0.354
0.020 0.0212 0.0288 0.359 前記表 4に示すように、 血球画分に血漿画分を種々の濃度で添加して も、 得られる吸光度にはほとんど変化が見られなかった。 このことから、 本発明の測定方法によれば、 血漿中の糖化タンパク質により、 糖化へモ グロビンの糖化量の測定に影響が生じてないことがわかる。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明の測定方法によれば、 全血試料中の糖化へモグロ ビンの糖化率を、 血球分離を行うことなく、 簡便かつ高精度で測定でき る。 また、 本発明の測定方法によるヘモグロビン糖化量の測定値と Hb A 1 c量とは高い相関関係にあるため、 この相関関係から検量線を作成 すれば、 全血試料中の糖化ヘモグロビンの糖化量を測定するだけで、 高 精度かつ簡便に HbA l c量を決定することができる。 このため、 本発 明の測定方法を、 例えば、 臨床検査の分野等に適用すれば、 大量の検体 を容易に測定することができ、 糖化ヘモグロビン、 特に HbA l cの糖 尿病診断等の指標物質としての信頼性および重要性がさらに向上する。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 全血中の糖化ヘモグロビンを選択的にプロテアーゼで分解し、 こ の糖化へモグ口ビン分解物の糖化部分と糖化アミノ酸酸化還元酵素 とを反応させ、 この酸化還元反応を測定することによりへモグロビ ンの糖化量を決定するヘモグロビン糖化量の測定方法。
2. プロテア一ゼが、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテア ーゼである請求の範囲 1記載の測定方法。
3. プロテア一ゼが、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ滕臓由来トリプ シン、 メタ口プロティナーゼ、 Bacillus subtillis由来のプロテ ァ一ゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼで ある請求の範囲 2記載の測定方法。
4. 糖化アミノ酸酸化還元酵素と反応させる糖化ヘモグロビン分解物 •の糖化部分が、 アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基である請求の範囲 1記載の測定方法。
5. アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基が、 リジン残基およびアルギニ ン残基の少なくとも一方の側鎖の糖化アミノ基である請求の範囲 4 記載の測定方法。
6. 酸化還元反応の測定は、 前記反応により生じる過酸化水素量の測 定または消費される酵素量の測定である請求の範囲 1記載の測定方 法。
7. 過酸化水素の測定が、 ペルォキシダーゼと酸化により発色する基 質とを用いた測定である請求の範囲 6記載の測定方法。
8. 酸化により発色する基質が、 N— （力ルポキシメチルァミノカル ポニル） — 4， 4一ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナト リゥムである請求の範囲 7記載の測定方法。
9. プロテア一ゼを、 全血 1 mLに対して 1， 000〜 1 0， 000， 000 U範囲で添加する請求の範囲 1記載の測定方法。
1 0. 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、 糖化タンパク質、 糖化ペプチド および糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖 化アミンを基質とし、 前記糖化ァミンにおける α—ァミノ基糖化部 分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、 過酸 化水素を生成する反応を触媒する酵素である請求の範囲 1記載の測 定方法。
1 1. 糖化アミノ酸酸化還元酵素を、 全血 lmLに対して 500〜4 0， 0 00 Uの範囲で添加する請求の範囲 1記載の測定方法。
1 2. 測定試料が、 溶血処理した全血である請求の範囲 1記載の測定 方法。
1 3. 請求の範囲 1〜1 2のいずれか一項に記載の測定方法によるへ モグロビン糖化量と Hb A 1 c量との相関関係から作成された検量 線を準備し、 前記測定方法から得られた全血試料中のヘモグロビン 糖化量を前記検量線に代入することにより、 前記全血試料中におけ る Hb A 1 c量を求める Hb A 1 cの測定方法。
14. 検量線が、 標準試料の既知 Hb A 1 c量と、 請求の範囲 1〜1 2のいずれか一項に記載の測定方法による前記標準試料のへモグロ ビン糖化量との相関関係から作成された検量線である請求の範囲 1 3記載の測定方法。
1 5. ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定キットであって、 他 のタンパク質およびべプチドと区別して糖化ヘモグロビンを選択的 に分解するプロテアーゼを含む測定キット。
1 6. プロテアーゼが、 ブロメライン、 パパイン、 ブ夕塍臓由来トリプ シン、 メタ口プロティナーゼ、 Bacillus subtillis由来のプロテ ァーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテァーゼで ある請求の範囲 1 5記載の測定キット。
1 7. さらに、 糖化アミノ酸酸化還元酵素を含む請求の範囲 1 5記載の 測定キッ卜。
1 8. 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドお よび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化 アミンを基質とし、 前記糖化ァミンにおける 一アミノ基糖化部分 および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、 過酸化 水素を生成する反応を触媒する酵素である請求の範囲 1 7記載の測 定キット。
1 9. さらに、 ペルォキシダ一ゼおよび酸化により発色する基質を含む 請求の範囲 1 8記載の測定キット。
20. 酸化により発色する基質が、 N— （力ルポキシメチルァミノカル ポニル） _4， 4—ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナト リゥムである請求の範囲 1 9記載の測定キット。
2 1. ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定試薬であって、 他の タンパク質およびべプチドと区別して選択的に糖化ヘモグロビンを 分解するプロテア一ゼを含有する測定試薬。
22. プロテア一ゼが、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ塍臓由来トリプ シン、 メタ口プロティナーゼ、 Bacillus subti 11 is由来のプロテ ァ一ゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテア一ゼで ある請求の範囲 2 1記載の測定試薬。
23. さらに、 糖化アミノ酸酸化還元酵素を含む請求の範囲 2 1記載の 測定試薬。
24. 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドお よび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化 アミンを基質とし、 前記糖化ァミンにおける a—ァミノ基糖化部分 および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、 過酸化 水素を生成する反応を触媒する酵素である請求の範囲 2 3記載の測 定試薬。
. さらに、 ペルォキシダ一ゼおよび酸化により発色する基質を含む 請求の範囲 2 4記載の測定試薬。
. 酸化により発色する基質が、 N— (力ルポキシメチルァミノカル ポニル） 一 4， 4—ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナト リウムである請求の範囲 2 5記載の測定試薬。
PCT/JP2001/006064 2000-07-14 2001-07-12 Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee WO2002006519A1 (fr)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE60143748T DE60143748D1 (de) 2000-07-14 2001-07-12 Verfahren zur selektiven bestimmung von glykosyliertem hämoglobin
US14/521,534 USRE46105E1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin
AU2001269513A AU2001269513A1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin
JP2002512410A JP3971702B2 (ja) 2000-07-14 2001-07-12 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法
US14/329,019 USRE46130E1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin
US10/332,790 US7235378B2 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin
CN018154131A CN1620512B (zh) 2000-07-14 2001-07-12 糖基化血红蛋白的选择性测定方法
EP01947995A EP1304385B1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin
US14/521,525 USRE46118E1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000214801 2000-07-14
JP2000-214801 2000-07-14

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP10010191.4A Previously-Filed-Application EP2336351B1 (en) 2000-07-14 2001-07-12 Method of selectively determining glycated hemoglobin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002006519A1 true WO2002006519A1 (fr) 2002-01-24

Family

ID=18710319

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/006064 WO2002006519A1 (fr) 2000-07-14 2001-07-12 Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee

Country Status (7)

Country Link
US (4) USRE46130E1 (ja)
EP (3) EP2944699B1 (ja)
JP (2) JP3971702B2 (ja)
CN (3) CN101363044B (ja)
AU (1) AU2001269513A1 (ja)
DE (1) DE60143748D1 (ja)
WO (1) WO2002006519A1 (ja)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1522593A1 (en) * 2002-07-17 2005-04-13 ARKRAY, Inc. Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
WO2005049857A1 (ja) * 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 糖化蛋白質の測定方法
WO2005049858A1 (ja) * 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
EP1555324A1 (en) * 2002-10-23 2005-07-20 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Defructosylation method
WO2006120976A1 (ja) 2005-05-06 2006-11-16 Arkray, Inc. タンパク質の切断方法およびその用途
WO2008018596A1 (fr) 2006-08-11 2008-02-14 Arkray, Inc. Marqueur d'hyperglycémie postprandiale, procédé de détermination et utilisation correspondants
US7354732B2 (en) 2002-06-14 2008-04-08 Arkray, Inc. Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound
WO2008093723A1 (ja) * 2007-01-30 2008-08-07 Arkray, Inc. ＨｂＡ１ｃ測定方法
WO2008093722A1 (ja) 2007-01-30 2008-08-07 Arkray, Inc. フェノチアジン誘導体色素の検出方法およびそれに用いる発色剤試薬
JP2009544315A (ja) * 2006-07-25 2009-12-17 ジェネラル アトミクス 糖化ヘモグロビンのパーセントを定量するための方法
JP2010011876A (ja) * 2002-01-31 2010-01-21 Arkray Inc 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
EP2639586A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 ARKRAY, Inc. Measurement method using enzymes
US8758648B2 (en) 2008-03-19 2014-06-24 Arkray, Inc. Stabilizer of color former and use thereof
JP2014174057A (ja) * 2013-03-11 2014-09-22 Akira Miike ヘモグロビンの高感度測定法と試薬
WO2015020200A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 キッコーマン株式会社 改変型アマドリアーゼ及びその製造法、並びにアマドリアーゼの界面活性剤耐性向上剤及びこれを用いたＨｂＡ１ｃ測定用組成物
WO2017195838A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 栄研化学株式会社 測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法、プログラム、記憶媒体及び装置
US11198852B2 (en) 2014-11-07 2021-12-14 Kikkoman Corporation Amadoriase having enhanced anionic surfactant tolerance

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6391005B1 (en) 1998-03-30 2002-05-21 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and method for penetration with shaft having a sensor for sensing penetration depth
EP1329721B8 (en) * 2000-09-28 2010-05-26 ARKRAY, Inc. Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin
US8641644B2 (en) 2000-11-21 2014-02-04 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Blood testing apparatus having a rotatable cartridge with multiple lancing elements and testing means
US9427532B2 (en) 2001-06-12 2016-08-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Tissue penetration device
US9226699B2 (en) 2002-04-19 2016-01-05 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Body fluid sampling module with a continuous compression tissue interface surface
DE60238119D1 (de) 2001-06-12 2010-12-09 Pelikan Technologies Inc Elektrisches betätigungselement für eine lanzette
US8337419B2 (en) 2002-04-19 2012-12-25 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Tissue penetration device
US7981056B2 (en) 2002-04-19 2011-07-19 Pelikan Technologies, Inc. Methods and apparatus for lancet actuation
US9795747B2 (en) 2010-06-02 2017-10-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Methods and apparatus for lancet actuation
US7749174B2 (en) 2001-06-12 2010-07-06 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for lancet launching device intergrated onto a blood-sampling cartridge
US7316700B2 (en) 2001-06-12 2008-01-08 Pelikan Technologies, Inc. Self optimizing lancing device with adaptation means to temporal variations in cutaneous properties
US7025774B2 (en) 2001-06-12 2006-04-11 Pelikan Technologies, Inc. Tissue penetration device
US7485436B2 (en) * 2001-10-11 2009-02-03 Arkray, Inc. Method of stabilizing oxidation color former
US8221334B2 (en) 2002-04-19 2012-07-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for penetrating tissue
US7491178B2 (en) 2002-04-19 2009-02-17 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US8579831B2 (en) 2002-04-19 2013-11-12 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for penetrating tissue
US8360992B2 (en) 2002-04-19 2013-01-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for penetrating tissue
US9795334B2 (en) 2002-04-19 2017-10-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for penetrating tissue
US9248267B2 (en) 2002-04-19 2016-02-02 Sanofi-Aventis Deustchland Gmbh Tissue penetration device
US7713214B2 (en) 2002-04-19 2010-05-11 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for a multi-use body fluid sampling device with optical analyte sensing
US7909778B2 (en) 2002-04-19 2011-03-22 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US9314194B2 (en) 2002-04-19 2016-04-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Tissue penetration device
US7175642B2 (en) 2002-04-19 2007-02-13 Pelikan Technologies, Inc. Methods and apparatus for lancet actuation
US7976476B2 (en) 2002-04-19 2011-07-12 Pelikan Technologies, Inc. Device and method for variable speed lancet
US7674232B2 (en) 2002-04-19 2010-03-09 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US8372016B2 (en) 2002-04-19 2013-02-12 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing
US8784335B2 (en) 2002-04-19 2014-07-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Body fluid sampling device with a capacitive sensor
US7229458B2 (en) 2002-04-19 2007-06-12 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US8267870B2 (en) 2002-04-19 2012-09-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for body fluid sampling with hybrid actuation
US8702624B2 (en) 2006-09-29 2014-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Analyte measurement device with a single shot actuator
US7232451B2 (en) 2002-04-19 2007-06-19 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US7547287B2 (en) 2002-04-19 2009-06-16 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US7901362B2 (en) 2002-04-19 2011-03-08 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US7892183B2 (en) 2002-04-19 2011-02-22 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing
US7331931B2 (en) 2002-04-19 2008-02-19 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US7297122B2 (en) 2002-04-19 2007-11-20 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for penetrating tissue
US8574895B2 (en) 2002-12-30 2013-11-05 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus using optical techniques to measure analyte levels
ATE490325T1 (de) 2003-05-21 2010-12-15 Asahi Kasei Pharma Corp Verfahren zur messung von glykoliertem hämoglobin a1c, dafür zu verwendendes enzym und verfahren zur herstellung davon
US8262614B2 (en) 2003-05-30 2012-09-11 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for fluid injection
US7850621B2 (en) 2003-06-06 2010-12-14 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing
WO2006001797A1 (en) 2004-06-14 2006-01-05 Pelikan Technologies, Inc. Low pain penetrating
WO2005033659A2 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for an improved sample capture device
EP1680014A4 (en) 2003-10-14 2009-01-21 Pelikan Technologies Inc METHOD AND APPARATUS PROVIDING A VARIABLE USER INTERFACE
JPWO2005056823A1 (ja) 2003-12-12 2007-07-05 アークレイ株式会社 糖化アミンの測定方法
US8668656B2 (en) 2003-12-31 2014-03-11 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for improving fluidic flow and sample capture
US7822454B1 (en) 2005-01-03 2010-10-26 Pelikan Technologies, Inc. Fluid sampling device with improved analyte detecting member configuration
WO2006011062A2 (en) 2004-05-20 2006-02-02 Albatros Technologies Gmbh & Co. Kg Printable hydrogel for biosensors
EP1765194A4 (en) 2004-06-03 2010-09-29 Pelikan Technologies Inc METHOD AND APPARATUS FOR MANUFACTURING A DEVICE FOR SAMPLING LIQUIDS
US9775553B2 (en) 2004-06-03 2017-10-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for a fluid sampling device
US8652831B2 (en) 2004-12-30 2014-02-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Method and apparatus for analyte measurement test time
US7361513B2 (en) * 2005-04-08 2008-04-22 Streck, Inc. Cellular controls for glycated hemoglobin Hb A1c
US8507223B2 (en) 2005-07-19 2013-08-13 Kikkoman Corporation Method for quantitative determination of glycated protein and kit for quantitative determination of the same
WO2007049762A1 (ja) * 2005-10-27 2007-05-03 Arkray, Inc. アルブミン変性剤
US7943385B2 (en) * 2006-07-25 2011-05-17 General Atomics Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
WO2009067421A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-28 Siemens Heathcare Diagnostics Inc. Methods for the detection of glycated hemoglobin
EP2265324B1 (en) 2008-04-11 2015-01-28 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Integrated analyte measurement system
WO2009140343A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 General Atomics Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin
WO2010041419A1 (ja) 2008-10-10 2010-04-15 東洋紡績株式会社 新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、並びにその利用
US9375169B2 (en) 2009-01-30 2016-06-28 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Cam drive for managing disposable penetrating member actions with a single motor and motor and control system
US8128545B2 (en) * 2009-05-07 2012-03-06 Cmd Corporation Machine for securing a closure system onto a discrete pouch
EP2281900A1 (en) 2009-08-03 2011-02-09 Roche Diagnostics GmbH Fructosyl peptidyl oxidase and sensor for assaying a glycated protein
US8965476B2 (en) 2010-04-16 2015-02-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Tissue penetration device
BR112013001393A2 (pt) * 2010-08-11 2016-05-24 Kyowa Medex Co Ltd métodos para medir hemoglobina glicada em uma amostra, para conservar uma solução aquosa contendo um leuco-cromogênio e para estabilizar um leuco-cromogênio, reagente de medição de hemoglobina glicada em uma amostra e kit para medir hemoglobina glicada em uma amostra
JP2012108062A (ja) * 2010-11-19 2012-06-07 Hitachi High-Technologies Corp 自動分析装置
US10006922B2 (en) 2011-12-22 2018-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Raman spectroscopy for detection of glycated analytes
WO2015005257A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
CN106596209B (zh) * 2015-10-14 2020-05-12 杭州量康科技有限公司 干血样本预处理及检测方法
WO2018160216A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for enzymatic a1c detection and quantification
US11703513B2 (en) 2017-08-07 2023-07-18 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for enzymatic A1C detection and quantification
CN109680036A (zh) * 2017-10-02 2019-04-26 爱科来株式会社 糖化蛋白质的测定
US11353466B2 (en) 2018-01-18 2022-06-07 Cellics Therapeutics, Inc. Methods and compositions for quantifying hemoglobin
CN113009022B (zh) * 2018-12-29 2023-04-28 江山德瑞医疗科技有限公司 一种测定全血中糖化血红蛋白的方法
EP4003169A4 (en) * 2019-07-22 2023-08-02 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. MEASUREMENT OF GLYCOSYLATED HEMOGLOBIN

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997013872A1 (fr) * 1995-10-12 1997-04-17 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Procede pour doser les composes d'amadori
JP2000300294A (ja) * 1999-04-16 2000-10-31 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd ヘモグロビンＡ１ｃの定量法
WO2001025475A1 (fr) * 1999-10-01 2001-04-12 Kikkoman Corporation Procede d'analyse d'une glycoproteine
JP2001204495A (ja) * 2000-01-28 2001-07-31 Asahi Kasei Corp 糖化タンパク質割合測定方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA971031A (en) * 1972-12-11 1975-07-15 Tadanobu Nakadai Process for manufacturing soy sauce using enzymatic preparation(s)
US4465774A (en) * 1981-07-16 1984-08-14 Sherwood Medical Company Standard or control material for glysocylated or total hemoglobin determination
JPH0288568A (ja) 1988-09-27 1990-03-28 Idemitsu Kosan Co Ltd 含フッ素エポキシドおよびその製造法
JPH02195900A (ja) 1989-01-25 1990-08-02 Sanyo Chem Ind Ltd 糖化蛋白の測定法および測定試薬
GB9116315D0 (en) * 1991-07-29 1991-09-11 Genzyme Ltd Assay
EP1239287A3 (en) * 1992-03-04 2006-07-26 Abbott Laboratories Composition for use as an ion capture separation reactant
JP3157622B2 (ja) * 1992-06-05 2001-04-16 株式会社ミツカングループ本社 フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法
AU661207B2 (en) 1992-11-17 1995-07-13 Boehringer Mannheim Gmbh Simultaneous determination of HbA1c and haemoglobin variants with a glycation analogus to HbA1c
JP3118625B2 (ja) 1994-01-11 2000-12-18 長瀬産業株式会社 血球の分離方法
EP0678576B1 (en) 1994-03-03 2001-01-03 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same
DE4425162A1 (de) 1994-07-18 1996-01-25 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur quantitativen Bestimmung von glykierten Proteinen
US5712138A (en) * 1994-10-05 1998-01-27 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Fructosyl amino acid oxidase
WO1997020039A1 (fr) 1995-11-30 1997-06-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Oxydase de fructosylaminoacides, son procede d'obtention, et methode d'essai des composes d'amadori utilisant ladite oxydase
DE69835268T2 (de) 1997-04-24 2006-11-23 Arkray, Inc. Verfahren zum enzymatischen nachweis eines verzuckerungsproteins
JP3987900B2 (ja) 1997-11-26 2007-10-10 アークレイ株式会社 糖化タンパク質の測定方法
US6352835B1 (en) * 1998-11-17 2002-03-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. Method of measuring substance in sample using a redox reaction
AU3677100A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Arkray, Inc. Alpha-glycated amino acid releasing enzyme
KR100369212B1 (ko) 1999-07-07 2003-01-24 한국과학기술연구원 내연 기관의 배기 소음 및/또는 기체 이송 시스템의 덕트내부의 소음을 제어하기 위한 장치 및 방법
JP3734212B2 (ja) 1999-08-18 2006-01-11 旭化成ファーマ株式会社 タンパク質の選択的断片化方法
EP1329721B8 (en) * 2000-09-28 2010-05-26 ARKRAY, Inc. Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997013872A1 (fr) * 1995-10-12 1997-04-17 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Procede pour doser les composes d'amadori
JP2000300294A (ja) * 1999-04-16 2000-10-31 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd ヘモグロビンＡ１ｃの定量法
WO2001025475A1 (fr) * 1999-10-01 2001-04-12 Kikkoman Corporation Procede d'analyse d'une glycoproteine
JP2001204495A (ja) * 2000-01-28 2001-07-31 Asahi Kasei Corp 糖化タンパク質割合測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1304385A4 *

Cited By (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010011876A (ja) * 2002-01-31 2010-01-21 Arkray Inc 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
US7354732B2 (en) 2002-06-14 2008-04-08 Arkray, Inc. Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound
US8021855B2 (en) 2002-07-17 2011-09-20 Arkray Inc. Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
EP1522593A1 (en) * 2002-07-17 2005-04-13 ARKRAY, Inc. Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
EP1522593A4 (en) * 2002-07-17 2008-07-23 Arkray Inc PROCESS FOR DECOMPOSING PROTEIN WITH SULFONIC ACID COMPOUND
EP1555324A1 (en) * 2002-10-23 2005-07-20 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Defructosylation method
EP1555325A1 (en) * 2002-10-23 2005-07-20 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Novel fructosyl peptide oxidase and utilization thereof
EP1555325A4 (en) * 2002-10-23 2006-06-07 Daiichi Pure Chemicals Co Ltd NOVEL PEPTIDE FRUCTOSYL-OXIDASE AND USE THEREOF
EP1555324A4 (en) * 2002-10-23 2006-06-07 Daiichi Pure Chemicals Co Ltd DEFRUCTOSYLATION PROCESS
US7329520B2 (en) 2002-10-23 2008-02-12 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Fructosyl peptide oxidase and utilization thereof
US7393549B2 (en) 2002-10-23 2008-07-01 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Defructosylation method
US7951553B2 (en) 2003-11-19 2011-05-31 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of assaying glycated protein
WO2005049858A1 (ja) * 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
JPWO2005049857A1 (ja) * 2003-11-19 2007-11-29 第一化学薬品株式会社 糖化蛋白質の測定方法
WO2005049857A1 (ja) * 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 糖化蛋白質の測定方法
JP4769579B2 (ja) * 2003-11-19 2011-09-07 積水メディカル株式会社 糖化蛋白質の測定方法
JP2011115179A (ja) * 2003-11-19 2011-06-16 Sekisui Medical Co Ltd 糖化蛋白質の測定方法
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
US7820404B2 (en) 2005-05-06 2010-10-26 Arkray, Inc. Protein cleavage method and use thereof
WO2006120976A1 (ja) 2005-05-06 2006-11-16 Arkray, Inc. タンパク質の切断方法およびその用途
JP2012233922A (ja) * 2006-07-25 2012-11-29 General Atomics 糖化ヘモグロビンのパーセントを定量するための方法
JP2009544315A (ja) * 2006-07-25 2009-12-17 ジェネラル アトミクス 糖化ヘモグロビンのパーセントを定量するための方法
EP2224246A1 (en) 2006-08-11 2010-09-01 Arkray, Inc. Postprandial hyperglycemia marker, method of measuring the same, and usage thereof
EP2224245A1 (en) 2006-08-11 2010-09-01 Arkray, Inc. Postprandial hyperglycemia marker, method of measuring the same, and usage thereof
US8637275B2 (en) 2006-08-11 2014-01-28 Arkray, Inc. Postprandial hyperglycemia marker, method of measuring the same, and usage thereof
WO2008018596A1 (fr) 2006-08-11 2008-02-14 Arkray, Inc. Marqueur d'hyperglycémie postprandiale, procédé de détermination et utilisation correspondants
EP2325652A2 (en) 2006-08-11 2011-05-25 Arkray, Inc. Postprandial hyperglycemia marker, method of measuring the same, and usage thereof
JP5261180B2 (ja) * 2006-08-11 2013-08-14 アークレイ株式会社 食後高血糖マーカー、その測定方法およびその用途
US8008085B2 (en) 2007-01-30 2011-08-30 Arkray, Inc. Method of measuring HbA1c
WO2008093722A1 (ja) 2007-01-30 2008-08-07 Arkray, Inc. フェノチアジン誘導体色素の検出方法およびそれに用いる発色剤試薬
WO2008093723A1 (ja) * 2007-01-30 2008-08-07 Arkray, Inc. ＨｂＡ１ｃ測定方法
US8273577B2 (en) 2007-01-30 2012-09-25 Arkray, Inc. Method for detecting phenothiazine-derivative color and color-developer reagent used therein
EP3001190A1 (en) 2007-01-30 2016-03-30 ARKRAY, Inc. Method for detecting phenothiazine-derivative color and color-developer reagent used therein
JP5324918B2 (ja) * 2007-01-30 2013-10-23 アークレイ株式会社 ＨｂＡ１ｃ測定方法
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
US8758648B2 (en) 2008-03-19 2014-06-24 Arkray, Inc. Stabilizer of color former and use thereof
US8802366B2 (en) 2012-03-15 2014-08-12 Arkray, Inc. Measurement method using enzyme
EP2639586A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 ARKRAY, Inc. Measurement method using enzymes
JP2014174057A (ja) * 2013-03-11 2014-09-22 Akira Miike ヘモグロビンの高感度測定法と試薬
WO2015020200A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 キッコーマン株式会社 改変型アマドリアーゼ及びその製造法、並びにアマドリアーゼの界面活性剤耐性向上剤及びこれを用いたＨｂＡ１ｃ測定用組成物
US10619183B2 (en) 2013-08-09 2020-04-14 Kikkoman Corporation Modified amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring HbA1c using the same
EP3760717A1 (en) 2013-08-09 2021-01-06 Kikkoman Corporation Amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring hba1c using the same
US11549134B2 (en) 2013-08-09 2023-01-10 Kikkoman Corporation Modified amadoriase and method for producing the same, agent for improving surfactant resistance of amadoriase and composition for measuring HbA1c using the same
US11198852B2 (en) 2014-11-07 2021-12-14 Kikkoman Corporation Amadoriase having enhanced anionic surfactant tolerance
WO2017195838A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 栄研化学株式会社 測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法、プログラム、記憶媒体及び装置
JPWO2017195838A1 (ja) * 2016-05-13 2018-05-31 栄研化学株式会社 測定対象物質の比較対象物質に対する割合を求める方法、プログラム、記憶媒体及び装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN101363044B (zh) 2013-01-09
US20030162242A1 (en) 2003-08-28
EP2944699B1 (en) 2017-10-18
CN101875963B (zh) 2013-10-16
CN1620512A (zh) 2005-05-25
EP1304385B1 (en) 2010-12-29
US7235378B2 (en) 2007-06-26
EP2336351A2 (en) 2011-06-22
JP3971702B2 (ja) 2007-09-05
DE60143748D1 (de) 2011-02-10
EP2336351B1 (en) 2016-03-09
AU2001269513A1 (en) 2002-01-30
EP2336351A3 (en) 2011-09-14
JP2008245657A (ja) 2008-10-16
EP1304385A4 (en) 2006-06-07
USRE46105E1 (en) 2016-08-16
CN1620512B (zh) 2010-06-02
CN101363044A (zh) 2009-02-11
CN101875963A (zh) 2010-11-03
EP1304385A1 (en) 2003-04-23
USRE46118E1 (en) 2016-08-23
USRE46130E1 (en) 2016-08-30
EP2944699A1 (en) 2015-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2002006519A1 (fr) Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee
JP5097758B2 (ja) 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
US7951553B2 (en) Method of assaying glycated protein
JP5222331B2 (ja) 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法
JP4861986B2 (ja) タンパク質の切断方法およびその用途
JP2000333696A (ja) 糖化アミンの測定方法
WO2005056823A1 (ja) 糖化アミンの測定方法
JP4756116B2 (ja) 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法
WO2002027012A1 (fr) Procede de production de produits de degradation de proteines
WO2008018596A1 (fr) Marqueur d'hyperglycémie postprandiale, procédé de détermination et utilisation correspondants
JP4352154B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法
USRE45074E1 (en) Method of pre-treating sample for measuring saccharified amine and method of measuring saccharified amine
JP2004354177A (ja) 試料の安定化方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001947995

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 018154131

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10332790

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001947995

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642