WO2001097857A1 - Preparations destinees au transfert d'oligonucleotides - Google Patents

Preparations destinees au transfert d'oligonucleotides Download PDF

Info

Publication number
WO2001097857A1
WO2001097857A1 PCT/JP2001/005195 JP0105195W WO0197857A1 WO 2001097857 A1 WO2001097857 A1 WO 2001097857A1 JP 0105195 W JP0105195 W JP 0105195W WO 0197857 A1 WO0197857 A1 WO 0197857A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
solution
preparation
cells
collagen
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/005195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shunichiro Kubota
Masaaki Terada
Takahiro Ochiya
Hiroshi Itoh
Masayasu Furuse
Akihiko Sano
Shunji Nagahara
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Koken Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited, Koken Co., Ltd. filed Critical Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority to JP2002503340A priority Critical patent/JP5118285B2/ja
Priority to DE60142899T priority patent/DE60142899D1/de
Priority to AU2001264317A priority patent/AU2001264317A1/en
Priority to US10/311,621 priority patent/US20040052840A1/en
Priority to EP01938732A priority patent/EP1295611B1/en
Priority to DK01938732.3T priority patent/DK1295611T3/da
Priority to AT01938732T priority patent/ATE478688T1/de
Publication of WO2001097857A1 publication Critical patent/WO2001097857A1/ja
Priority to US12/486,703 priority patent/US20090258933A1/en
Priority to US12/904,054 priority patent/US20110028535A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2063—Proteins, e.g. gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7007—Drug-containing films, membranes or sheets

Definitions

  • the present invention relates to a preparation for introducing oligonucleotides into target cells containing collagen as an essential component, which is used for antisense treatment. More specifically, the present invention relates to a safe preparation that can efficiently introduce an oligonucleotide into target cells by using collagen as an essential component.
  • genetic information causing disease has been accumulated.
  • the genetic information essential for the growth or survival of bacteria and viruses has been revealed.
  • causal genetic information or excessive expression or mutation of the genetic information has been clarified, and the relationship between the genetic information and the mechanism of manifesting symptoms has been clarified.
  • Antisense therapy is a method for treating or preventing the above diseases by controlling or suppressing the expression of related genetic information.
  • the oligonucleotide forms a double strand with m-RNA or m-RNA precursor
  • oligonucleotides with various modifications based on the structure of DNA or RNA have been developed and used.
  • the most practical of these modified oligonucleotides is the phosphorothioate-type oligonucleotide (hereinafter abbreviated as S-oligonucleotide) in which the diester bond between each nucleoside is replaced with a phosphorothioate bond. ).
  • S-oligonucleotide phosphorothioate-type oligonucleotide
  • Most clinical trials performed to date have used S_oligonucleotides.
  • S-oligonucleotides for example,
  • cytokine release When administered systemically at high concentrations, cytokine release, inhibition of blood coagulation, activation of complement, allergic reactions, etc. occur.
  • JP-A-9-171542 US Pat. No. 5,763,416 discloses a method for introducing a gene by gradually eluting a plasmid DNA or a viral vector from a biocompatible material or a bone-compatible material.
  • biocompatible materials such as collagen or osteophilic materials, which have a plasmid DNA having a molecular weight of 2.65 to 5.3 million (equivalent to 4000 bp to 8000 bp) or larger. It is described that the drug exhibits a good expression efficiency when released slowly.
  • the number of plasmid DNAs or viral vectors to be transferred per target cell to which these plasmid DNAs or viral vectors are required is smaller than the number of oligonucleotides required for antisense therapy. Extremely small. This is because the genetic information encoded by the plasmid DNA or viral vector is introduced into the target cells, and then transcribed into a number of m-RNAs for expression. Therefore, one plasmid DNA or viral vector per target cell is derived. This is sufficient because the expression of the gene can be seen if it is inserted.
  • antisense therapy oligonucleotides are introduced into cells to form a strong duplex with the target mRNA and suppress gene expression. There is a need.
  • JP-A-91-71542 and US Pat. No. 5,763,416 disclose that biocompatible materials such as collagen or bone-compatible materials contain oligonucleotides (single-stranded) that are extremely small compared to plasmid DNA or viral vectors. Therefore, it has a molecular weight of about 3,300 to about 9,900), and has the ability to suppress gene expression. It is also clinically effective in target cells. No specific suggestion is made as to whether the oligonucleotide concentration can be increased to that concentration.
  • oligonucleotide-introduced preparation having the following characteristics that can be used for antisense therapy.
  • the oligonucleotide administered to the living body must be protected from degradation by nuclease.
  • An object of the present invention is to provide an agent capable of efficiently introducing oligonucleotides required for antisense therapy or the like into cells, and to treat various diseases.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, the target m-R
  • a formulation consisting of oligonucleotides with a nucleotide sequence complementary to NA and collagen can effectively target m_RNA expression without inducing side effects in ViVo And found that the effect was maintained for a long period of time, and further studied, and completed the present invention.
  • FIG. 1 is a 3% agarose gel electrophoresis diagram in Test Example 1. 2 shows the effects of nucleases of phosphorothioate-type antisense oligonucleotides in the oligonucleotide preparations of Example 1 and Reference Example 1. Lane 1: Example 1-0 minutes later, Lane 2: Example 1-30 minutes later, Lane 3: Example 1-60 minutes later, Lane 4: Example 1 after 180 minutes, Lane 5: Reference Example 10 After 10 minutes, Lane 6: Reference Example 1 After 30 minutes, Lane 7: Reference example 1-60 minutes, Lane 8: Reference example 1-180 minutes.
  • Figure 2 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 1 was administered to the testes of nude mice transplanted with human testis tumor cells (NEC-18), the proliferation of NEC-8 cells was observed. It is the graph which showed that it controlled for a long time.
  • FIG. 3 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 2 was added to human gastric cancer cells in vitro, the atelocollagen solution of Reference Example 4, the antisense oligonucleotide solution of Reference Example 5, and the scramble of Reference Example 6 were obtained.
  • FIG. 4 is a graph showing that human stomach cancer cells were inhibited from growing and the number of viable cells was reduced, as compared to the case where an oligonucleotide composition was added.
  • Figure 4 shows the effect of the oligonucleotide-introduced preparation of Example 2 on human rhabdomyosarcoma cell growth inhibition in vitro compared with the concentration of the phosphorothioate-type antisense oligonucleotide contained in the oligonucleotide-introduced preparation. It is a graph that did.
  • FIG. 5 is a graph showing that when the oligonucleotide-introduced preparation containing the liposome of Example 3 was added to human rhabdomyosarcoma cells in vitro, the cell killing effect was stronger than that of the ribosome preparation of Reference Example 7. It is.
  • Figure 6 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation containing the liposome of Example 3 was added in vitro to human rhabdomyosarcoma cells, the activity of ordinine decarboxylase was stronger than that of the ribosome preparation of Reference Example 7. It is a graph which shows that it reduced.
  • FIG. 7 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the rhabdomyosarcoma implantation site of a nude mouse transplanted with human rhabdomyosarcoma cells, the administration was longer than that of the atherocollagen solution of Reference Example 4.
  • 3 is a graph showing that the growth of rhabdomyosarcoma cells was suppressed.
  • FIG. 8 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the rhabdomyosarcoma implantation site of a nude mouse transplanted with human rhabdomyosarcoma cells, the rhabdomyosarcoma was longer-term compared to the ribosome preparation of Reference Example 7. It is a graph which shows that cell growth was suppressed.
  • Fig. 9 shows the site of rhabdomyosarcoma implantation in nude mice transplanted with human rhabdomyosarcoma cells and the intramuscularly intraperitoneal back muscle implanted with rhabdomyosarcoma.
  • FIG. 9 is a graph showing that the growth of rhabdomyosarcoma cells was suppressed for all sites for a long period of time in comparison with the case where the ribosome preparation was administered to the site of rhabdomyosarcoma implantation.
  • FIG. 10 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was transferred to human rhabdomyosarcoma cells.
  • FIG. 9 is a graph showing that the survival rate of nude mice was increased when administered to a transplanted site of rhabdomyosarcoma cells of a transplanted nude mouse as compared to the case where the collagen solution of the mouth was administered in Reference Example 4.
  • FIG. 9 is a graph showing that the survival rate of nude mice was increased when administered to a transplanted site of rhabdomyosarcoma cells of a transplanted nude mouse as compared to the case where the collagen solution of the mouth was administered in Reference Example 4.
  • FIG. 11 shows the case where the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to a rhabdomyosarcoma cell transplantation site of a nude mouse transplanted with human rhabdomyosarcoma cells, and the case where the liposome preparation of Reference Example 7 was administered. It is the graph which showed that the survival rate of the nude mouse was increased as compared with.
  • FIG. 12 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the rhabdomyosarcoma cell transplantation site of nude mice transplanted with human rhabdomyosarcoma cells.
  • 6 is a graph showing that the production of ordinine decarboxylase in rhabdomyosarcoma cells was strongly suppressed as compared to the case where was administered.
  • FIG. 13 shows the case where the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to a rhabdomyosarcoma cell transplantation site of a nude mouse transplanted with human rhabdomyosarcoma cells, and the case where the liposome preparation of Reference Example 7 was administered.
  • FIG. 4 is a graph showing that the production of ordinine decarboxylase in rhabdomyosarcoma cells was strongly suppressed as compared with FIG.
  • FIG. 14 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to a human gastric cancer cell transplantation site of a nude mouse into which human gastric cancer cells had been transplanted, the atelocollagen solution of Reference Example 4 and the orutin decarboxylase of Reference Example 6.
  • FIG. 9 is a graph showing that the growth of human gastric cancer cells was suppressed for a long time as compared with the case where a solution composition containing a phosphorothioate-type oligonucleotide having a sequence heterologous to the gene sequence of Example 1 was administered. is there.
  • FIG. 9 is a graph showing that the growth of human gastric cancer cells was suppressed for a long time as compared with the case where a solution composition containing a phosphorothioate-type oligonucleotide having a sequence heterologous to the gene sequence of Example 1 was administered. is there.
  • FIG. 15 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the site of human gastric cancer cell transplantation in nude mice into which human gastric cancer cells had been transplanted, the atelocollagen solution of Reference Example 4 and the orditin removal of Reference Example 6 were obtained.
  • FIG. 9 is a graph showing that the survival rate of nude mice was increased as compared with the case where a solution composition containing a phosphorothioate-type oligonucleotide having a sequence that is non-homologous to the carbonic acid gene sequence was administered. .
  • FIG. 16 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to a gastric cancer cell transplant site of a nude mouse into which human gastric cancer cells had been transplanted, and that the atelocollagen solution of Reference Example 4 and the orditin decarboxylation of Reference Example 6 were used.
  • FIG. 4 is a graph showing that the production of ordinine decarboxylase in gastric cancer cells was more strongly suppressed than in FIG.
  • FIG. 17 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the colon cancer cell transplantation site of a nude mouse transplanted with human colon cancer cells, as compared to the case where the atelocollagen solution of Reference Example 4 was administered.
  • 1 is a graph showing that colon cancer cell proliferation was suppressed for a long period of time.
  • FIG. 18 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the colon cancer cell transplantation site of a nude mouse transplanted with human colon cancer cells, it was compared to the case where the atelocollagen solution of Reference Example 4 was administered.
  • 4 is a graph showing that the survival rate of nude mice was increased.
  • FIG. 19 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the colon cancer cell transplantation site of a nude mouse transplanted with human colon cancer cells, it was compared with the case where the atelocollagen solution of Reference Example 4 was administered.
  • 1 is a graph showing that the production of ordinine decarboxylase in colon cancer cells was strongly suppressed.
  • FIG. 20 shows that the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was treated with mouse leiomyosarcoma cells.
  • FIG. 4 is a graph showing that when added to (LMF S cells) at in Vitro, the proliferation of mouse synovial muscle cells was suppressed as compared to the control.
  • FIG. 21 shows that when the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was added to mouse leiomyosarcoma cells (LMS cells) in vitro, the amount of ornithine in mouse leiomyosarcoma cells was higher than that in the control. This is a daraf showing that the production of tin decarboxylase was suppressed.
  • oligonucleotide-introduced preparation according to any one of (1) to (6), wherein the oligonucleotide is a pentamer or more and a pentamer or less than 30-mer;
  • oligonucleotide-introduced preparation according to any one of (1) to (10);
  • the oligonucleotide has a nucleotide sequence at least a part of which is complementary to a sense or antisense strand of a gene specific to a pathogenic virus or bacterium under physiological conditions (1) to ( The oligonucleotide-introduced preparation according to any of 10);
  • Oncogenes include growth factors, receptor tyrosine kinases, non-receptor tyrosine kinases, GTP-binding proteins, serine-threonine kinases, The oligonucleotide-introduced preparation according to (14), which is selected from the group of transcription regulators;
  • the oligonucleotide has a force contained in a substance that promotes the introduction of the oligonucleotide into the cell or a substance that promotes the translocation to the nucleus, or forms a complex with the substance ( 1) the oligonucleotide-introduced preparation according to any one of (1) to (12);
  • the present invention also relates to an antisense therapy for cancer comprising administering the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention to a living body, and more specifically, to an oligonucleotide-introduced preparation containing a desired oligonucleotide and collagen.
  • an antisense therapy for cancer comprising administering the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention to a living body, and more specifically, to an oligonucleotide-introduced preparation containing a desired oligonucleotide and collagen.
  • transdermal, subcutaneous, intradermal The present invention relates to antisense therapy which is administered to muscle, intraperitoneal cavity, brain, tissue, blood vessel, buccal cavity, rectum, digestive tract, etc., and efficiently introduces the oligonucleotide into cells.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention more specifically, a solution or suspension preparation obtained by mixing an oligonucleotide solution with a collagen solution (further a medically acceptable additive) is
  • the formulation after administration of the formulation in or near the target tissue, the formulation remains at the site of administration; 3) the oligonucleotide is protected from degradation by nucleases;
  • the release rate of the oligonucleotide from the drug product can be controlled according to the purpose.
  • the present invention relates to a method for treating and preventing infectious diseases using the above-mentioned preparation, or a method for treating and preventing various diseases induced by excessive expression of specific genetic information, particularly a method for treating and preventing cancer.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention comprises a force, which is a solution or suspension itself, which is a mixture of an oligonucleotide solution and a collagen solution, or a film, sponge, powder, mini-pellet It is desirable to use soluble collagen or solubilized collagen as the collagen used in the present invention because it is formed into a shape.
  • the “soluble collagen” includes those soluble in acidic or neutral water or water containing salt.
  • examples of the “solubilized collagen” include an enzyme-solubilized collagen solubilized by an enzyme, an alkali-solubilized collagen solubilized by an alkaline solution, and the like.
  • collagens have a 1 micrometer pore size membrane filter. It is desirable to be able to pass one.
  • the solubility of collagen depends on the degree of cross-linking of collagen, and the higher the degree of cross-linking, the more insolubilized.Therefore, the degree of cross-linking of the collagen used in the present invention is preferably, for example, trimer or less, more preferably Dimer or less is desirable.
  • the molecular weight of collagen is, for example, preferably from about 300,000 to 900,000, and more preferably from about 300,000 to about 600,000.
  • Collagen may be extracted from any animal species or a recombinant thereof. Preferably extracted from vertebrates or their genetically modified products, more preferably extracted from mammals, birds and fish or their genetically modified products, more preferably extracted from mammals and birds having a high denaturation temperature It is preferable to use collagens or their recombinants. Any type of collagen may be used, but from the abundance in the animal body, types I to V or their transgenics are desirable.
  • type 1 collagen extracted from the dermis of a mammal with an acid or a recombinant thereof can be mentioned. More preferably, for example, type 1 collagen extracted from calf dermis by acid, type 1 collagen produced by genetic engineering, and the like can be mentioned.
  • the type 1 collagen produced by genetic engineering is preferably derived from calf dermis or human dermis. Collagen derived from tendon with the same type 1 collagen is not suitable because it has a high degree of crosslinking and is insoluble.
  • telocollagen from which enzymatically removed telopeptides with high antigenicity or atherocollagen produced by genetic engineering, and have at least 3 tyrosine residues per molecule.
  • Oral collagen is more preferred.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, plants, or animal cells can be used.
  • the oligonucleotide used in the present invention is specifically, for example, a pentamer to 30-mer oligonucleotide, more specifically, for example, a 15-mer to 25-mer oligonucleotide. .
  • oligonucleotide used in the present invention include DNA, DNA derivatives, RNA, and RNA derivatives, and more specifically, for example,
  • Oligonucleotides having at least one phosphorothioate bond in the molecule are exemplified.
  • the oligonucleotides used in the present invention include, for example, genes encoding proteins having physiological effects that at least partially disrupt the homeostasis of living organisms, pathogenic viruses, bacteria, etc. It has a base sequence that complementarily binds to the sense or antisense strand of a specific gene under physiological conditions, and more specifically, a gene and homeostasis specific to pathogenic viruses, bacteria, etc. It has a nucleotide sequence that complementarily binds to the messenger RNA of a gene that encodes a protein or the like that has a physiological effect that disrupts DNA.
  • the oligonucleotide used in the present invention has, for example, a region complementary to a region including the initiation codon of messenger RNA or a site to which the precursor messenger RNA is spliced.
  • examples of the oligonucleotide used for the treatment or prevention of cancer include, for example, 5'-CTCG TAGGCGTTGTAGTTGT-3 '(SEQ Oligonucleotides having the sequence of ID NO: 1) or protein kinase C are specifically suppressed and are effective for advanced cancers such as non-small cell lung cancer and colon cancer, and are effective for prostate cancer, Application to breast cancer, ovarian cancer, knee cancer, colorectal cancer, small cell lung cancer ISIS 3521, prostate cancer, breast cancer, ovary by specifically suppressing the expression of Cr af kinase ISIS 5132 / CGP 69846 A, which is being applied to cancer, brain tumor, knee cancer, color
  • Oligonucleotides used to treat or prevent infectious diseases include GEM 9.2, GPI-2A, which suppresses the growth of HIV, ISIS 2922 (fomi virsen), which suppresses the growth of cytomegalovirus, Vitravene, and ISIS 13312.
  • N GEM13.2 is like suppressing ISIS 14803 proliferation of hepatitis C virus, as the oligonucleotides used in inflammation therapy, specifically depression won Crohn's disease the expression of I CAM-1, ulcers ISIS 2302, which is being applied to ulcerative colitis, renal transplant rejection inhibition, psoriasis, and asthma; EP I-2000, which is suppressing the expression of adenosine A1 receptor and is being applied to asthma And TNF—a, CD49 d
  • VLA_4 oligonucleotides that suppress the expression of VCAM-1 and PECAM-1 and the like. Oligonucleotides that prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty include Resten_NG that suppresses c-myc expression.
  • genes encoding a protein having a physiological effect that disrupts homeostasis include a group of genes called oncogenes. More specifically, examples include a growth factor group, a receptor tyrosine kinase group, a non-receptor tyrosine kinase group, a GTP-binding protein, a serine'threonine kinase group, a transcription regulatory factor group, and the like. More specifically, for example, genes encoding hst-11 or ornithine decarboxylase and the like can be mentioned.
  • the oligonucleotide of the present invention may be included in a substance that promotes the introduction of the oligonucleotide into cells or a substance that promotes translocation to the nucleus, or may form a complex with the substance.
  • the former include cationic lipids, cationic polymers, hydrophobic polymers and the like.
  • cationic lipid As “cationic lipid”, DOTMA (N— [1— (2,3-Dioleyloxy) propyl] _N—Trimethylammonium chloride), DOS PA (2,3-Dioleyloxy_N— [2- (Sperminecarboxamido) ethyl] —N, N—Dimethyl 1-Propane ammum trifnoroleoloacetate), DDAB (Dimethyldiotacresylum-ammonium bromide), TM-TPS (N, ⁇ , ⁇ ⁇ I, NIII Tetramethyl-N, N ,,
  • a “cationic polymer” is a polymer that interacts electrostatically with an oligonucleotide, such as a lipopolyamine such as DOGS (dioctadecylamidoglycylspermine), a peptide such as A1 k CWK18, or the like.
  • DOGS dioctadecylamidoglycylspermine
  • a peptide such as A1 k CWK18, or the like.
  • hydrophobic polymer is a polymer that has a hydrophobic interaction with a gene, and includes, for example, polyvinyl alcohol and polypyrrolidone.
  • peptides such as AlkCWK18 can also be used.
  • cationic ribosome for example, LIPOFE CTAMINE (registered trademark, Life Technologies, Inc., Kockville, MD, USA) containing DOSPA and DOPE in 1: 1, DOTMA and DOPE in 1: 1 LIPOFECT AC E (Registered trademark, Life Technologies, Inc., Rockville, MD, USA) containing ribosomes, DD AB and DOPE 1: 2.5, TM—TPS and DOPE
  • the mixture of the cationic lipid and the cholesterol is, for example, a mixture of DMR IE and cholesterol in a 1: 1 ratio in terms of DMR IE—C (Life Technologies, Inc., Rockville, MD, USA).
  • the oligonucleotide may be contained in the fusosomal ribosome or may form a complex with the ribosome.
  • Examples of the membrane fusion type ribosome include HVJ-liposome.
  • Substances that promote gene translocation to the nucleus include a mixture of HMG-1 and 2
  • the ratio of the amount of collagen to oligonucleotide in the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention is determined by: 1) protection of the oligonucleotide from nucleases or other proteins by collagen; 2) sustained release of the oligonucleotide; 3) oligonucleotide. Is important for achieving the local retention of the protein and the maintenance of a locally high concentration thereof, and 4) the promotion of the introduction of the oligonucleotide into cells.
  • the ratio of the amount of collagen to the amount of oligonucleotide can be expressed by the number of negative charges of the oligonucleotide with respect to one molecule of collagen, since the chain length of the oligonucleotide can be selected in any manner according to the purpose.
  • the number of negative charges of the oligonucleotide per molecule of collagen is preferably from 10 to 500, preferably from 10 to 250, and more preferably from 10 to 1. 0 0 0.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention can further contain a medically acceptable additive in addition to the oligonucleotide and collagen.
  • these additives are salts or amino acids or phosphoramines used for adjusting the pH of the oligonucleotide-introduced preparation in the form of a solution or suspension, or a high-viscosity solution or suspension. It is an additive that has the effect of controlling the release of oligonucleotides from liquid, sponge, film, columnar, and powdery oligonucleotide-introduced preparations.
  • salts, amino acids, and amines include tris (hydroxymethizole) aminomethane, sodium citrate, sodium dihydrogen citrate, trisodium phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium phosphate anhydrous, and phosphorous anhydride.
  • Examples include sodium dihydrogen acid, lysine, and arginine.
  • Examples of the additive having an effect of controlling the release include, for example, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides of three or more sugars, sugar alcohols thereof, and derivatives thereof, Examples include amino acids, organic acids having two or more carboxyl groups, gelatin, albumin, fipurin, alginic acid, agarose, and gum arabic.
  • Examples of the monosaccharide include glucose, galactose, fructose and the like, and glucose is preferable.
  • Examples of the disaccharide include sucrose, maltose, ratatose, trehalose and the like.
  • sugar alcohol examples include sorbitol, mannitol and the like, and preferred is sonorebitol.
  • Sugar derivatives include, for example, deoxy sugars, amino sugars, phosphoric acid esters, and disaccharides containing these as constituents.
  • amino acids examples include medically acceptable amino acids and salts thereof, and derivatives thereof.
  • amino acids include acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, bases such as lysine, arginine, and histidine1.raw amino acids, glycine, alanine, methionine, proline, cystine, serine, threonine, asparagine, gnoretamine, isoleucine, and the like. Cysteine, tyrosine, tributofan, leucine and the like.
  • the amino acids in the present invention also include amino acids having a basic or neutral side chain.
  • salt of an amino acid include a sodium salt and a potassium salt.
  • Examples of the organic acid having two or more carboxylic acid groups and salts thereof include, for example, organic acids having two or three carboxyl groups and salts thereof, and more preferably saturated or unsaturated aliphatic organic acids. Acids and the like.
  • Examples of the organic acid having 2 or 3 carboxy groups and salts thereof include, for example, citric acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, fumaric acid and salts thereof, preferably, cunic acid, tartaric acid salts and the like. Is mentioned.
  • oligonucleotides in order to suppress the degradation of oligonucleotides by endosomes in cells, for example, inactivated adenovirus capable of releasing endosomal contents, CHEMS (cholesterol to misuccinate morpholine salt), etc. Can also be used.
  • inactivated adenovirus capable of releasing endosomal contents CHEMS (cholesterol to misuccinate morpholine salt), etc.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention contains a preparation containing any of the above-mentioned saccharides, amino acids and organic acids having two or more carboxyl groups, and any two or three of these preparations. Formulations are included.
  • the release is controlled using an additive, it can be adjusted by the content of the additive. For example, to increase the release time, lower the additive content, and to shorten the release time, increase the additive content.
  • the amount of the additive can be specifically selected from the range of 0 to about 1980 Ow / w% based on collagen. Preferred ranges include the range of about 0 to about 189 OwZw 0 /). More preferably, the range is from about 0 to about 90 OwZwO / o.
  • the range is about 0 to 300 w / w%.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention is in the form of a solution or a suspension, or processed into a sponge, a column, or a powder through a solution or a suspension.
  • the pH of the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention in the form of a solution or suspension is in the range of 4 to 8, and collagen is 0.001% to 1%.
  • Sponge, pellet or powdered oligonucleotide-introduced preparations have 5-99% (w / w), preferably 10-70% (w / w) s, more preferably 25-50% ( w / w) Contains one gene.
  • the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention can be administered, for example, transdermally, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, intracerebrally, tissue, or intravascularly.
  • the frequency of administration is once every three days to about two months, preferably once a week to once a month.
  • the dosage of the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention is the liquid volume in the case of a solution or suspension, the size of the preparation in the case of a sponge preparation, and the diameter in the case of a columnar preparation. It can be easily adjusted by length and, in the case of powdered preparations, by powder volume or weight. The dose can also be adjusted by the oligonucleotide content in the preparation.
  • the optimal dose of the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention varies depending on the indication disease, administration site, administration method, type of dosage form, patient's gender, age, symptoms, etc., but the amount of oligonucleotide in the preparation is as follows.
  • the dose is 0.001 mg Z kg to 40 mg / kg, preferably 0.01 mg Zkg to 3 Omg / kg for the treatment subject.
  • the method for producing the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention in the form of a solution or suspension includes, for example,
  • a desired oligonucleotide solution to which an additive is added as required is added to the collagen solution and mixed, the obtained homogeneous solution or suspension is freeze-dried, and the obtained sponge is pulverized.
  • a method for obtaining a powdery oligonucleotide-introduced preparation 9) Dry the collagen solution to which additives have been added as necessary, dissolve the obtained dried product in the desired oligonucleotide solution, freeze-dry the obtained homogeneous solution or suspension, and A method of pulverizing the obtained sponge to obtain a powdery oligonucleotide-introduced preparation;
  • the collagen solution is dried, the obtained dried product is dissolved in a desired oligonucleotide solution to which additives are added as necessary, and the obtained homogeneous solution or suspension is lyophilized to obtain A method of pulverizing the obtained sponge to obtain a powdery oligonucleotide-introduced preparation;
  • the desired oligonucleotide solution is added to the collagen solution to which additives have been added as necessary, and the mixture is mixed.
  • the precipitate obtained by filtering the obtained suspension is directly or pulverized.
  • the collagen solution is dried, the obtained dried product is dissolved in a desired oligonucleotide solution to which additives are added as required, and the obtained suspension is filtered to obtain a precipitate.
  • a desired oligonucleotide solution to which an additive is added as necessary is added to the collagen solution and mixed, and the obtained homogeneous solution or suspension is lyophilized to obtain A method of compressing and molding a powder obtained by pulverizing the obtained sponge into a cylindrical shape;
  • the collagen solution is dried, the obtained dried product is dissolved in a desired oligonucleotide solution to which additives are added as necessary, and the obtained homogeneous solution or suspension is lyophilized to obtain A method of compressing and molding a powder obtained by crushing the obtained sponge into a cylindrical shape;
  • the desired oligonucleotide solution is added to the collagen solution to which additives have been added as required, and the mixture is mixed.
  • the precipitate obtained by filtering the obtained suspension is directly or pulverized.
  • the collagen solution is dried, and the obtained dried product is dissolved in a desired oligonucleotide solution to which additives have been added as necessary.
  • the obtained suspension is filtered, and the obtained precipitate is filtered.
  • a method of compressing the powder obtained as it is or by pulverization into a cylindrical shape;
  • the desired oligonucleotide solution is added to and mixed with the collagen solution to which additives have been added as necessary, and water or the like is added to a sponge obtained by freeze-drying the obtained homogeneous solution or suspension. After adding, kneading, extruding into a cylindrical shape from the nozzle, and drying;
  • the desired oligonucleoside with additives added to the collagen solution as needed A method of adding and mixing a tide solution, adding water and the like to a sponge obtained by freeze-drying the obtained homogeneous solution or suspension, kneading the mixture, extruding the mixture into a cylindrical shape from a nozzle, and drying;
  • the desired oligonucleotide solution was added to and mixed with the collagen solution.Additives were dissolved as necessary, and water and the like were added to the powder obtained by spray-drying the obtained homogeneous solution. Thereafter, kneading, extruding into a cylindrical shape from a nozzle, and drying; 29) a desired oligonucleotide solution is added to the collagen solution to which additives have been added as required, and mixed to obtain a uniform solution. After adding water etc. to the powder obtained by spray drying, kneading, extruding from a nozzle into a cylindrical shape, and drying;
  • a desired oligonucleotide solution to which additives are added as necessary is added and mixed, and water and the like are added to a powder obtained by spray-drying the obtained homogeneous solution, Kneading, extruding into a cylindrical shape from a nozzle, and drying;
  • oligonucleotide (CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3, (SEQ ID NO: 1); molecular weight: about 6500) having a sequence (Saturday Inc.) has a final concentration of 10 micromolar ZL Was mixed with a neutral solution of atelocollagen (Koken Co., Ltd. atelocollagen implant: 2% atelocollagen solution) to prepare a solution of oligonucleotide-introduced preparation with a final atelocollagen concentration of 0.5%. .
  • a phosphorothioate-type antisense oligonucleotide (AS-ODC, 5'-TCATGATTTCTTGATGTTCC-3 ') having a sequence complementary to the sequence from 319b to 338b of the tin decarboxylase gene ID NO: 2)
  • Neutral solution of atelocollagen (Espec Oligo Service Co., Ltd.) to a final concentration of 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 mimol ZL. It was mixed with a laboratory implant collagen implant: 3.5 wZw% atelocollagen solution, final concentration 1.75 w / w%) to prepare a solution-type oligonucleotide-introduced preparation.
  • TAGTTGT-3 (SEQ ID NO: 1); molecular weight: about 6500)
  • the obtained solution is frozen at 140 ° C., dried at room temperature under negative pressure, and kneaded by adding an appropriate amount of distilled water to the freeze-dried product. Thereafter, the kneaded product is extruded into a rod shape through a nozzle and dried to obtain a rod-shaped preparation. That is, a rod-shaped gene preparation containing 1 mg of oligonucleotide per 10 mg is obtained.
  • a phosphorothioate-type antisense oligonucleotide (AS-ODC, 5'-TCATGATTTCTTGATGTTCC-3 ') having a sequence complementary to the sequence from 319b to 338b of the orutin decarboxylase gene (SEQ ID NO: : 2) 50 microliters of saline containing 10 milligrams / ml of (Espec Oligo Service Co., Ltd.) and 50 microliters of atelocollagen solution (3.5%) were mixed at room temperature, and AS-ODC was mixed with 5 microliters.
  • An oligonucleotide-introduced preparation in the form of a solution containing micrograms / microliters and 1.75% of atelocollagen was prepared.
  • a phosphorothioate-type antisense oligonucleotide solution was prepared according to the procedure described in Example 1, except that the neutral solution of atelocollagen was changed to distilled water.
  • Reference example 2
  • Fibroblast growth factor H ST-1 FGF4 gene (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)) instead of a phosphorothioate-type antisense oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence from 4196b to 4216b.
  • a solution-like composition was obtained according to the procedure described in Example 1, except that the phosphorothioate-type sense oligonucleotide K (5'-ACAACTACAACGCCTACGAG-3,) (SEQ ID NO: 3) was used.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3
  • Phosphorothioate antisense oligonucleotide (5, — CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT-3, (SEQ ID NO: 1); molecular weight: about 6500) having a unique rooster sequence was dissolved to a concentration of 20 ⁇ mol / L 500 microliters of phosphate buffer solution mixed with 500 microliters of phosphate buffer in which 25 microliters of lipofectamine (GIBCO BRL) was dissolved, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to give a final concentration of 10 microliters. A mol / L oligonucleotide / ribosome preparation was obtained.
  • atelocollagen solution containing 1.75 w / w% atelocollagen was prepared according to the procedure described in Example 2 except that a phosphate buffer was added instead of AS-ODC.
  • a phosphorothioate-type antisense oligonucleotide solution containing AS-ODC at a concentration of 1.0 mM ZL was prepared according to the procedure described in Example 2, except that the neutral solution of atelocollagen was changed to a phosphate buffer.
  • a phosphorothioate scrambled oligonucleotide having a heterologous sequence 5,1-AGTACTAAAGAACTACAAGG-3,) (SEQ ID NO: 4) (Espec Oligo Service Co., Ltd.)
  • SEQ ID NO: 4 Espec Oligo Service Co., Ltd.
  • a phosphorothioate-type scrambled oligonucleotide composition in the form of a solution was obtained according to the procedure described in Example 2 except that the composition was contained at a concentration of L.
  • the ribosome preparation was prepared by mixing phosphate buffer and 15 microliters of phosphate buffer in which transport (Promega) was dissolved so that the final concentration of AS-ODC was 1.0 mmol / L. Obtained.
  • oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 1 2 ⁇ L was mixed with 100 ⁇ L of a PBS (—) solution containing 20% calf serum, and allowed to stand at 37 ° C. 30 minutes, 60 minutes, and 180 minutes after mixing, aliquots of the mixture were collected and subjected to 3% agarose gel electrophoresis to evaluate the primary structure of the phosphorothioate-type antisense oligonucleotide in the drug product did.
  • Fig. 1 shows the results.
  • the phosphorothioate-type antisense oligonucleotide in the oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 1 was mixed with a PBS (-) solution containing 20% calf serum, and the untreated phospho- In contrast to the band observed at the migration position of the mouth-type antisense oligonucleotide, no band could be confirmed after 30 minutes in the preparation of Reference Example 1. This result indicates that the phosphorothioate-type oligonucleotide is protected from enzymatic degradation in the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention.
  • nude mice 1 0-week-old O scan nude mice testes HST- 1 to produce human testicular germ tumor cells (NEC- 8) and 1 0 X 1 0 5 cells transplanted. Ten days after transplantation, the oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 1 was administered at 50 microliters per testis of nude mice. Nude mice were sacrificed 10 days, 20 days, and 30 days after administration, and the weight of tumor cells in testes was measured. The results are shown in FIG. The growth of testicular embryonic tumor cells in the testes of nude mice was greater than when the gel composition of Reference Example 2 and the liposome composition of Reference Example 3 were each administered at 50 microliters per testis.
  • the ribosome preparation of Reference Example 3 exhibited an inhibitory effect equivalent to that of the oligonucleotide-introduced preparation of Example 1 until 20 days later, but no inhibitory effect on proliferation was observed after 30 days.
  • Human gastric cancer cells (MKN 45 cells) cultured in 500 ⁇ L of DEM medium containing 10% fetal calf serum (MKN 45 cells) (Human Science Promotion Foundation) prepared 5 ⁇ 10 5 cells in Example 2 5 ⁇ L of a solution-containing oligonucleotide-introduced preparation (containing 1.0 mmol / L of AS-ODC) was added (final concentration: 10 ⁇ M ZL), and the cells were cultured at 37 ° C. Twenty-four hours after the addition, the medium containing the oligonucleotide-introduced preparation was replaced with a goat medium, and then the medium was replaced every 24 hours, and the cells were cultured for 6 days.
  • DEM medium containing 10% fetal calf serum (MKN 45 cells) (Human Science Promotion Foundation) prepared 5 ⁇ 10 5 cells in Example 2 5 ⁇ L of a solution-containing oligonucleotide-introduced preparation (containing 1.0 mmol / L of AS-OD
  • the number of cells was measured at intervals of 23 using 3- [4,5-diraethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliura bromide (MT T ATSEY).
  • MT T ATSEY 3- [4,5-diraethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliura bromide
  • the atelocollagen solution prepared in Reference Example 4 the phosphorothioate-type antisense oligonucleotide solution prepared in Reference Example 5
  • the phosphorothioate-type sclampoligonucleotide composition prepared in Reference Example 6 were used. ⁇
  • the number of cells was measured by adding to 45 cells. The results are shown in FIG.
  • oligonucleotide-containing preparation containing 5 x 10 5 human rhabdomyosarcoma cells (RD cells) containing ribosome prepared in Example 3 in 500 ⁇ L of DEM medium containing 10% fetal bovine serum And 37. C. Twenty-four hours after the addition, the medium containing the oligonucleotide-introduced preparation was replaced with a fresh medium, and then the medium was replaced every 24 hours, and the cells were cultured for eight days. Two, four, six and eight days after the addition, cell viability was measured by trypan blue staining. In addition, orditin decarboxylase activity in RD cells was measured after addition 2, 4 and 6.
  • the liposome preparation of Reference Example 7 was added to examine the viability of RD cells and the activity of orditin decarboxylase in the cells. The results are shown in FIGS. 5 and 6.
  • the ribosome-containing preparation of Example 3 and the liposome preparation of Reference Example 7 both reduced the viability of RD cells, but the oligonucleotide-introduced preparation exhibited a stronger cell killing effect.
  • both the oligonucleotide-introduced preparation containing liposomes and the liposomal preparation reduced the ordinine decarboxylase activity in RD cells, but the oligonucleotide-introduced preparation decreased the activity more strongly.
  • Fig. 7 shows the comparison between the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 4 when administered at the RD implantation site.
  • FIG. 8 shows the comparison between the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 7 when administered at the RD implantation site.
  • FIG. 9 shows the results of administration of the preparation of Example 7 at the RD transplant site (local injection), intramuscular administration (muscular injection), and intraperitoneal administration (intraperitoneal injection).
  • the proliferation of RD cells in the back muscles of nude mice was determined by administering the atherocollagen solution of Reference Example 4 ( Figure 7), the liposomal preparation of Reference Example 7 ( Figure 8), and a phosphate buffer.
  • the oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 7 was most suppressed in all nude mice administered to the RD transplantation site, the contralateral back muscle implanted with RD cells, and the intraperitoneal cavity. (Fig. 9).
  • the liposome preparation of Reference Example 7 showed an inhibitory effect equivalent to that of the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 up to 7 days later, but did not show the growth inhibitory effect after 14 days.
  • FIG. 10 and FIG. L1 show the cumulative survival curves of nude mice implanted with RD.
  • Fig. 10 shows a comparison between the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 4 when administered at the RD implantation site, and Fig.
  • Example 11 shows a case where the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 7 were administered at the RD implantation site. The comparison of is shown.
  • the average survival days of mice that received the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 at the RD implantation site were 52.6 days, and the average survival days of nude mice that received phosphate buffer were 20.5 days.
  • Average survival days of nude mice to which the atelocollagen solution of Example 4 was administered was 40.3 days (Fig. 10)
  • average survival of S mice to which the ribosome preparation of Reference Example 7 was administered was 37.8 days. (Fig. 11).
  • FIGS. 12 and 13 show the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7, the verticollagen solution of Reference Example 4, the liposome preparation of Reference Example 7, and the RD cell after administration of the phosphate buffer. Showed orditin decarboxylase activity in the rat.
  • Fig. 12 shows a comparison between the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 4 when administered to the RD implantation site.
  • Example 13 shows a case where the formulation of Example 7 and the formulation of Reference Example 7 were administered to the RD implantation site. The comparison of is shown.
  • the oretin decarboxylase activity in RD cells to which the oligonucleotide-introduced preparation was administered was lower than that of RD cells to which atelocollagen solution, ribosome preparation and phosphate buffer were administered.
  • the growth of MKN 45 cells in the back muscles of nude mice was measured by administering the atelocollagen solution of Reference Example 4, the phosphorothioate-type scrambled oligonucleotide in the solution of Reference Example 6, and a phosphate buffer.
  • the oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 7 was administered to the MKN45 cell transplantation site, the inhibition was most suppressed. This indicates that the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention suppresses the growth of MKN45 cells, and that the effect of suppressing the growth of MKN45 cells is maintained over a long period of time.
  • Example 15 shows the cumulative survival curve of nude mice transplanted with MKN cells.
  • the average survival of 13 nude mice to which the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 was administered to the MKN cell transplantation site was 48.5 days, and the average survival of nude mice to which the atelocollagen solution of Reference Example 4 was administered was 3 9 1 day, the average number of days of survival of the nude mice to which the phosphorothioate-type scrambled oligonucleotide composition of Reference Example 6 was administered 39.1 days, of the nude mice to which the phosphate buffer was administered The average survival time was significantly extended compared to 21.3 days.
  • FIG. 16 shows the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7, the atelocollagen solution of Reference Example 4, the phosphorothioate-type scrambled oligonucleotide composition in Reference Example 6 and the phosphate buffer solution after administration of phosphate buffer. It showed the activity of ortin-carboxylase in MKN45 cells on the day.
  • the onoleetin decarboxylase activity in MKN45 cells to which the oligonucleotide-introduced preparation was administered was measured by using the atelocollagen solution, the phosphorothioate-type scrambled oligonucleotide composition in the form of a solution, and MKN4 to which phosphate buffer was administered. It was significantly lower than that of 5 cells.
  • the growth of COLO 201 cells in the muscles of the back of nude mice was compared with the administration of the atelocollagen solution and the phosphate buffer of Reference Example 4 using the oligonucleotide-introduced preparation prepared in Example 7. It was most suppressed when administered, and the weight of COLO 201 cells was lower than at the time of transplantation.
  • These results show that the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention suppresses the growth of COLO 201 and kills the COLO 201 cells, and that the effect of suppressing the growth of COL O 201 cells is maintained for a long time.
  • FIG. 18 shows the cumulative survival curve of nude mice transplanted with COLO 201 cells.
  • the average survival days of mice that received the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 at the COLO 201 cell implantation site were 39.8 days, and the average survival days of nude mice that received the atelocollagen solution and the phosphate buffer were 31.20 and It was extended compared to 20.6 days.
  • the results show that the growth inhibitory effect of COLO 201 obtained by administering the oligonucleotide-introduced preparation of the present invention increases the survival rate of nude mice transplanted with COL0201.
  • FIG. 19 shows the onorenitine decarboxylase activity in COLO201 cells 35 days after administration of the oligonucleotide-introduced preparation of Example 7 and the atelocollagen solution and phosphate buffer of Reference Example 4.
  • the ortin decarboxylase activity in COLO 201 cells to which the oligonucleotide-transfected preparation was administered was lower than that of COLO 201 cells to which the atelocollagen solution and the phosphate buffer were administered.
  • LMF S cells mouse leiomyosarcoma cells
  • DMEM medium containing 10% fetal bovine serum 10% fetal bovine serum
  • AS-ODC 0.175% AS-ODC
  • the medium containing the oligonucleotide preparation was replaced with another medium, and then the medium was replaced every 24 hours, and the cells were cultured for 6 days. Every two days after the addition, the number of cells and the number of active ortin-carboxylase were measured. The results are shown in FIGS. 20 and 21, respectively.
  • a preparation consisting of an oligonucleotide having a base sequence complementary to the target m-RNA and collagen (and a medically acceptable additive) can effectively express the target m-RNA without inducing side effects in vivo. Suppression and long-term effects have enabled gene therapy.

Description

明 細 書 オリゴヌクレオチド導入製剤 技術分野
本発明はアンチセンス治療に使用される、 コラーゲンを必須成分とする標的細 胞へのオリゴヌクレオチド導入製剤に関する。 さらに詳細には、 本発明はコラー ゲンを必須成分とすることにより、 標的細胞に効率よくオリゴヌクレオチドを導 入できる安全な製剤に関する。
背景技術 '
近年の遺伝子情報解析技術の急速な進歩によって、 疾病の原因となる遺伝子情 報が蓄積されてきている。 例えば、 感染症の分野に於いては、 細菌やウィルスが 増殖あるいは生存するのに必須な遺伝子情報が明らか.になっている。 また、 種々 の疾患において、 原因となる遺伝子情報、 あるいはその遺伝子情報の過剰な発現 や変異などが明らかとなり、 その遺伝子情報と症状を発現するメカニズムの関係 が明らかになってきている。
ァンチセンス療法は上記のような疾患【こ関与する遺伝子情報の発現を制御また は抑制してその疾患の治療や予防を行う方法である。
具体的には例えば、
( 1 )発現を制御または抑制したい遺伝子の m— RN Aまたは m— R N A前駆体と 相補的な塩基配列を有する 1 0量体〜 3 0量体程度のオリゴヌクレオチドを投与 し、
( 2 )細胞内で該オリゴヌクレオチドが m— R N Aまたは m— R N A前駆体と二重 鎖を形成し、
( 3 )リボゾームによる m— R NAの翻訳の阻害、 R Nase Hによる二重鎖の切断、 あるいは m— R N A前駆体のスプラィシングを阻害し、
これにより遺伝子の発現を抑制する。
また、 これ以外に直接標的の遺伝子の二重鎖 D NAに結合して三重鎖を形成し、 m— R N Aへの転写を阻害する方法もある。 アンチセンス療法は 1 9 7 0年代の後半に T s， Oと M i 1 l e rら
(Biochemistry, 16, 1988 - 1996, 1977)および Z a m e c n i kら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75， 280-284, 1978)によって提唱されて以来、 盛んに研究が行 われてきた。 当初、 アンチセンス療法の研究は天然型の D NAあるいは R NAの オリゴヌクレオチドを用いて行われたが、 例えば、
( 1 )天然型のォリゴヌクレオチドは生体内のヌクレアーゼにより短時間に分解さ れ失活すること、
( 2 )また、 負に荷電したォリゴヌクレオチドが同じく負に荷電した細胞膜を通過 して細胞內に入ることは困難であること等
の問題がある。 このことから、 D NAあるいは R NAの構造を基本として様々に 修飾を施したオリゴヌクレオチドが開発され、 用いられている。 これらの修飾を 施したオリゴヌクレオチドのうち最も実用的であるのは、 各ヌクレオシド間のジ エステル結合をホスホロチォエート結合に置換したホスホロチォエート型オリゴ ヌクレオチド (以下、 S—オリゴヌクレオチドと略す。 ）である。 現在までに実施 されたほとんどの臨床試験では、 S _オリゴヌクレオチドが使用されている。 しかしながら S—オリゴヌクレオチドであっても、 例えば
( 1 )天然型ォリゴヌクレオチドほど早くはないが、 生体内のヌクレアーゼによつ て分解され失活する、
( 2 )天然型オリゴヌクレオチドに比べて m—R N Aへの二重鎖形成能力が低い、 ( 3 )二重鎖形成能力が低 、ために高濃度で標的細胞に投与する必要がある、
( 4)高濃度で全身的に投与した場合、 サイトカインの放出や血液凝固の阻止や補 体の活性化、 アレルギー反応などを生じる、
( 5 )生体内のタンパク質と特異的あるいは非特異的に結合するため、 標的 m_ R N Aと二重鎖を形成できないばかりでなく非特異的な作用を生じる、 等の 題があり、 アンチセンス療法の要求を充分に満たせているわけではなく、 実用 化には至っていない。 これらの問題点は第一世代とされる S—オリゴヌクレオチ ドに限らず、 現在までに開発されているいわゆる第二および第三世代のアンチセ ンス療法用オリゴヌクレオチド (横山和尚、 化学と生物， 36, 556-559, 1 8)に 当てはまる。 これらの問題点のため、 オリゴヌクレオチドを用いた標的遺伝子の 発現抑制は i n v i t r oでは良い効果が得られても、 i n v i v o特に臨床 試験では良い効果が得られないというのが一般的な認識となっており、 実際、 ァ ンチセンス医薬品の臨床実験が良い効果が得られないため中止される例は多い。 村上はこれらの臨床試験が打ち切られた理由がアンチセンス医薬品のデリバリ 一にあるとし、 アンチセンス医薬品開発の成否はデリバリー方法の開発が左右す ると述べている "上章、 生体の科学， 49， 309-314, 1998)。 オリゴヌクレオチ ドをデリバリーする方法は、 これまで主としてオリゴヌクレオチドの細胞内への 透過性と移行を改善することを目的として種々の検討が行われてきた。 これらを 解決するために横山の総説 (横山和尚、 細胞工学， 16， 1463-1473, 1997)では、 ( 1 )ポリ一 L—リジンゃポリエチレンイミンなどの多荷電ィ匕合物とオリゴヌクレ ォチドを共役させる、
(2)複製欠損アデノウィルスのカプシドの存在下でトランスフェリンノポリ一 L —リジン一共役 DNAを使用する、
(3)インフルエンザウイルス HA表面タンパク質由来の f u s o g e n i cぺプ チド（Bongartz, J. P.ら， Nucleic Acids Research, 22, 4681-4688， 1994)ゃショ ウジョゥバエの An t e nn a p e d i aタンパク質のホメォドメインの断片を 使用する、
(4)葉酸あるいはァシァ口糖タンパク質受容体、 またはトランスフェリンとオリ ゴヌクレオチドを結合させ、 特異的な細胞表面の受容体にターゲッティングする、 (5)コレステロールと結合する、
( 6 )カチオン性脂質へ封入する、
等の方法が挙げられている。 これらの検討はオリゴヌクレオチドの細胞内への透 過性と移行を改善することを主眼とはしているものの、 細胞に直接オリゴヌクレ ォチドを投与できる i n V i t r oの実験では良い効果が得られても、 i n v i v oでは期待された充分な効果は得られておらず、 実用化には問題があった。 例えば、 カチオン性脂質（リポソーム）にォリゴヌクレオチドを封入して投与す る方法は、 i n v i t r oではオリゴヌクレオチドを細胞内に効率よく導入す るため最も盛んに研究されているが、 i n V i v oでは投与後直ちに全身に拡 散するため高濃度で標的細胞に作用できないこと、 体内のタンパク質がリポソ一 ムに結合して標的細胞への接着を阻害すること、 リポソームを構成しているカチ オン性脂質に細胞毒性があることなどから実用的なレベルでの成果は得られてい ない。 実際、 S—オリゴヌクレオチドを用いた臨床試験でリボソームが使用され たことはなく（生体の科学， 49, 309-314, 1998)、 臨床に実用的なオリゴヌタレ ォチドのデリバリー方法の開発が望まれている。
一方、 プラスミド DNAまたはウィルスベクターを生体親和性材料あるいは骨 親和性材料から徐々に溶出させて、 遺伝子導入を行う方法が特開平 9一 7154 2、 US 5, 763， 416に開示されている。 これらにはコラーゲン等の生体親 和性材料あるいは骨親和性材料が分子量 265万〜 530万のプラスミド DNA (4000 b p〜8000 b pに相当）あるいはそれ以上の分子サイズを有するゥ ィルスべクターを生体內で徐放して良好な発現効率を示すことが記載されている。 しかし、 これらプラスミド DNAまたはウィルスベクターの導入が要求される標 的細胞一つあたりに、 導入されるプラスミド DNAまたはウィルスベクターの個 数は、 アンチセンス療法で要求されるオリゴヌクレオチドの導入個数に比べて極 めて小さい。 これはプラスミド DNAあるいはウィルスベクターにコードされた 遺伝情報は標的細胞に導入された後、 多数の m— R N Aに転写されて発現するた め、 標的細胞一つあたり一個のプラスミド DNAあるいはウィルスベクターが導 入されれば、 遺伝子の発現が見られるためこれで充分であるからである。 一方、 アンチセンス療法においては、 オリゴヌクレオチドが細胞内に導入され、 標的の m— RNAと強固な二重鎖を形成し遺伝子発現を抑制するためには、 細胞内のォ リゴヌクレオチド濃度を極力高める必要がある。 上記特開平 9一 71542およ び US 5， 763， 416には、 コラーゲン等の生体親和性材料あるいは骨親和性 材料が、 プラスミド DNAあるいはウィルスベクターに比して極めて小さいオリ ゴヌクレオチド（一本鎖であつて、 分子量が約 3, 300〜約 9， 900程度）を徐 放し、 力つ遺伝子発現を抑制することができる力否力、、 更に標的細胞内において、 臨床上、 充分に、 有効な濃度にオリゴヌクレオチド濃度を高めることができるか 否かについては、 具体的にはなにも示唆されていない。
更に上記先行技術には、 アンチセンス療法に用いることのできる下記のような 特徴を持つオリゴヌクレオチド導入製剤はなにも示唆されていない。 1)生体に投与したオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる分解から保護され ること。
2 )生体に投与したォリゴヌクレオチドを生体内のタンパク質との特異的あるい は非特異的な結合から保護すること。
3)標的 m— RN Aと強固な二重鎖を形成して発現を抑制できるように細胞内の オリゴヌクレオチドの濃度を高めるために、 標的細胞周囲でのオリゴヌクレオチ ドの濃度を高濃度に維持すること。
4)全身性の副作用を生じないように標的細胞周囲のみでオリゴヌクレオチドの 濃度を高濃度に維持すること。
5)—回の投与あたりの、 m— RN Aの発現を抑制できる期間を長期化すること が求められること。
発明の開示
本発明の課題は、 アンチセンス療法等に必要なオリゴスクレオチドを細胞に効 率よく導入できる剤を提供し、 種々の疾患を治療することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 標的 m— R
N Aと相補的な塩基配列を有するォリゴヌクレオチドとコラ一ゲン (更に医療上 許容される添加剤)からなる製剤が、 i n V i V oで副作用を誘発することなく 標的 m_RN Aの発現を効果的に抑制し、 かつ長期にその効果が維持されること を見出し、 さらに検討を重ね、 本発明を完成するに至った。
図面の簡単な説明
第 1図は試験例 1における 3 %ァガロースゲル電気泳動図である。 実施例 1と 参考例 1のオリゴヌクレオチド製剤中でのホスホロチォエート型アンチセンスォ リゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる影響を示している。 レーン 1 ：実施例 1 - 0分後、 レーン 2 ：実施例 1-30分後、 レーン 3 ：実施例 1-60分後、 レ ーン 4 ：実施例 1一 180分後、 レーン 5 ：参考例 1一 0分後、 レーン 6 :参考 例 1一 30分後、 レーン 7 ：参考例 1-60分後、 レーン 8 ：参考例 1-180 分後。
第 2図は実施例 1のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト精巣腫瘍細胞（NEC 一 8)を移植したヌードマウスの精巣に投与した場合、 NEC— 8細胞の増殖を 長期間抑制したことを示したグラフである。
第 3図は実施例 2のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞に i n V i t r oで添加した場合に、 参考例 4のァテロコラ一ゲン溶液、 参考例 5のアンチ センスオリゴヌクレオチド溶液、 参考例 6のスクランブルォリゴヌクレオチド組 成物を.添加した場合に比べて、 ヒト胃癌細胞の増殖を抑制し、 力つ細胞数を減少 させたことを示したグラフである。
第 4図は実施例 2のオリゴヌクレオチド導入製剤による ί n v i t r oにお けるヒト横紋筋肉腫細胞の増殖抑制効果を、 オリゴヌクレオチド導入製剤に含有 するホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度で比較したグ ラフである。
第 5図は実施例 3のリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト 横紋筋肉腫細胞に i n V i t r oで添加した場合、 参考例 7のリボソーム製剤 に比べて強 、殺細胞効果を示したグラフである。
第 6図は実施例 3のリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト 横紋筋肉腫細胞に i n V i t r oで添加した場合、 参考例 7のリボソーム製剤 に比べて強くオル二チン脱炭酸酵素の活性を低下させたことを示すグラフである。 第 7図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植 したヌードマウスの横紋筋肉腫移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラ 一ゲン溶液に比べて長期間横紋筋肉腫細胞の增殖を抑制したことを示すグラフで ある。
第 8図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植 したヌードマゥスの横紋筋肉腫移植部位に投与した場合、 参考例 7のリボソーム 製剤に比べて長期間横紋筋肉腫細胞の増殖を抑制したことを示すグラフである。 第 9図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植 したヌードマウスの横紋筋肉腫移植部位、 横紋筋肉腫を移植した対側の背部筋肉 内、 腹腔内に投与した場合、 リボソーム製剤を横紋筋肉腫移植部位に投与した場 合に比べてすべての部位で横紋筋肉腫細胞の増殖を長期間抑制したことを示した グラフである。
第 1 0図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移 植したヌードマゥスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテ 口コラーゲン溶液を投与した場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを 示したグラフである。
第 1 1図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移 植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、 参考例 7のリポ ソーム製剤を投与した場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを示した グラフである。
第 1 2図は実施例.7のォリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移 植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテ ロコラーゲン溶液を投与した場合に比べて横紋筋肉腫細胞内でのオル二チン脱炭 酸酵素の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第 1 3図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移 植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、 参考例 7のリポ ソーム製剤を投与した場合に比べて横紋筋肉腫細胞内でのオル二チン脱炭酸酵素 の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第 1 4図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植した ヌードマウスのヒ ト胃癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラー ゲン溶液、 参考例 6のオルュチン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有し たホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した 場合に比べて、 ヒト胃癌細胞の増殖を長期間抑制したことを示したグラフである。 第 1 5図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植した ヌードマウスのヒ ト胃癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラー ゲン溶液、 参考例 6のオル二チン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有し たホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した 場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを示したグラフである。
第 1 6図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植した ヌードマウスの胃癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラ一ゲン 溶液、 参考例 6のオル二チン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有したホ スホロチォエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した場合 に比べて胃癌細胞内でのオル二チン脱炭酸酵素の産生が強く抑制されたことを示 したグラフである。
第 1 7図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植し たヌ一ドマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラー ゲン溶液を投与した場合に比べて、 大腸癌細胞の増殖を長期間抑制したことを示 したグラフである。
第 1 8図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植し たヌ一ドマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラー ゲン溶液を投与した場合に比べて、 ヌードマウスの延命率を高めたことを示した グラフである。
第 1 9図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植し たヌ一ドマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、 参考例 4のァテロコラー ゲン溶液を投与した場合に比べて、 大腸癌細胞内でのオル二チン脱炭酸酵素の産 生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第 2 0図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をマウス平滑筋肉腫細胞
( LMF S細胞）に i n V i t r oで添加した場合に、 対照例に比べてマウス平 • 滑筋肉腫細胞の増殖を抑制されたことを示したグラフである。
第 2 1図は実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤をマゥス平滑筋肉腫細胞 ( LMF S細胞）に i n V i t r oで添加した場合に、 対照例に比べてマウス平 滑筋肉腫細胞内でのオル二チン脱炭酸酵素の産生が抑制されたことを示したダラ フである。
発明を実施するための最良の形態
すなわち本発明は：
( 1 )コラーゲンを必須成分とする標的細胞への所望のオリゴヌクレオチド導入製 剤；
( 2 )標的細胞が動物細胞である（ 1 )記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 3 )標的細胞が対象疾患の治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の 細胞である（ 2 )のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 4 )コラーゲンがァテロコラーゲンである（ 1 )〜（ 3 )のいずれかに記載のォリゴ ヌクレオチド導入製剤；
(5)コラーゲンの分子量が約 30万〜約 90万である（1)〜（4)のいずれかに記 載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 6 )オリゴヌクレオチド導入製剤が持続性製剤である（ 1 )〜（ 5 )のレ、ずれかに記 載のォリゴヌクレオチド導入製剤；
( 7 )オリゴヌクレオチドが 5量体以上 30量体以下の（ 1 )〜（ 6 )のレ、ずれかに記 載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
(8)オリゴヌクレオチドが DNAあるいは DNA誘導体である（6)または（7)記 載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
(9)オリゴヌクレオチドが RNAあるいは RNA誘導体である（6)または（7)記 載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
(10)DN A誘導体あるいは RN A誘導体が分子内に少なくとも 1づ以上のホス ホ口チォエート結合を有する（ 8 )または（ 9 )記載のォリゴヌクレオチド導入製 剤；
( 11 )オリゴヌクレオチドが少なくともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な 効果を有するタンパク質をコードした遺伝子のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖 と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列を有する（ 1 )〜（ 10)のいずれか に記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
(12)オリゴヌクレオチドが少なくともその一部が病原性のウィルスあるいは細 菌に特異的な遺伝子のセンス鎖あるいはァンチセンス鎖と生理的な条件下で相補 的に結合する塩基配列を有する（1)〜（10)のいずれかに記載のオリゴヌクレオ チド導入製剤；
(13)オリゴヌクレオチドがメッセンジャー RNAの開始コドンを含む領域ある いは前駆メッセンジャー RNAがスプライシングを受ける部位に相捕的な配列を 有する（1)〜（10)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 14)恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子ががん 遺伝子である（11)記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
(15)がん遺伝子が、 増殖因子群、 受容体型チロシンキナーゼ群、 非受容体型チ 口シンキナーゼ群、 GTP結合タンパク質、 セリン 'スレオニンキナーゼ群、 転 写調節因子群の中から選ばれる（ 14)記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 16)がん遺伝子が h s t -1あるいはオル二チン脱炭酸酵素をコードする遺伝 子である（ 14)記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
( 1 7 )オリゴヌクレオチドが、 ォリゴヌクレオチドの細胞への導入を促進する物 質または核への移行を促進する物質中に包含されている力、 あるいは該物質と複 合体を形成している（ 1 )〜（ 1 2 )のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド導入製 剤；
(1 8)細胞への導入を促進する物質がカチオン性リボソーム、 膜融合型リポソ一 ムあるいはカチオン 1"生のポリマーである（1 7)記載のオリゴヌクレオチド導入製 剤；
( 1 9)コラーゲンが真皮由来の 1型コラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産され る 1型コラーゲンである（ 1 )に記載のォリゴヌクレオチド導入製剤；
(20)医学上許容される添加剤を更に含む（ 1 )記載のォリゴヌクレオチド導入製 剤；
(21)添加剤が単糖、 二糖、 三糖以上のォリゴ糖またはそれぞれの糖アルコール、 非疎水性ァミノ酸類、 カルボキシル基を 2個以上有する有機酸類である（ 1 )のォ リゴヌクレオチド導入製剤；
(22)溶液状、 懸濁液状、 スポンジ状、 ペレット状または粉末状の形状を有する ( 1 )記載のォリゴヌクレオチド導入製剤；
(23) pH4〜8の溶液状または懸濁液状の（22)記載のオリゴヌクレオチド導 入製剤；
(24)コラーゲンの含量が 0. 00 1 %〜： L 0 % (w/w)の範囲である溶液状ま たは懸濁液状の（ 22 )記載のォリゴヌクレオチド導入製剤；
(25)コラーゲンの含量が 5〜 99% (w/w)の範囲であるスポンジ状、 ペレツ ト状または粉末状である（22)記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
等に関する。
また本発明は、 本発明のォリゴヌクレオチド導入製剤を生体に投与することか らなるがんのアンチセンス療法に、 詳細には、 所望のオリゴヌクレオチドとコラ 一ゲンを含むオリゴヌクレオチド導入製剤を生体に例えば、 経皮、 皮下、 皮内、 筋肉、 腹腔内、 脳内、 組織、 血管内、 口腔内、 直腸内、 消化管等に投与し、 細胞 に効率よく該オリゴヌクレオチドを導入することからなるァンチセンス療法に関 する。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤、 更に具体的には、 オリゴヌクレオチド 溶液をコラーゲン溶液 (更に医療上許容される添加剤）と混合して得られた溶液あ るいは懸濁液製剤は、
1 )フィルム状、 スポンジ状、 粉末状、 ミニペレット状等に目的に応じて成形が 可能であり、
2 )該製剤を標的組織中あるいは近傍に投与後、 製剤が投与部位に滞留し、 3 )オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる分解から保護され、
4 )製剤からオリゴヌクレオチドが徐放され、
5 )製剤からのオリゴヌクレオチドの放出速度を目的に応じて制御することが可 能で
6 )標的組織近傍でオリゴヌクレオチド濃度を高濃度で維持し、
7 ) i n v i v oで副作用を誘発することなく標的 m— R N Aの発現を効果的に 抑制し、 力 長期にその効果が維持されることを特徴とする。
更に本発明は、 上記製剤を用いた感染症の治療および予防方法、 あるいは特定 の遺伝情報の過剰な発現によつて誘起される諸疾患の治療および予防方法、 特に 癌の治療および予防方法に関する。
本発明のォリゴヌクレオチド導入製剤は、 オリゴヌクレオチド溶液とコラーゲ ン溶液を混合した溶液あるいは懸濁液そのものである力 \ あるいはこれらの溶液 あるいは懸濁液をフィルム状、 スポンジ状、 粉末状、 ミニペレット状に成形した ものであることから、 本発明で使用するコラーゲンは、 可溶性コラーゲンまたは 可溶化コラーゲンを用いることが望ましい。
「可溶性コラーゲン」 としては、 酸性あるいは中性の水または塩を含有する水 に可溶であるもの等が挙げられる。 「可溶化コラーゲン」 としては、 例えば、 酵 素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、 アル力リにより可溶化されるアル カリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。
これらのコラーゲンは、 孔サイズが 1マイクロメートルのメンブレンフィルタ 一を通過できることが望ましい。 コラーゲンの可溶性はコラーゲンの架橋度に依 存し、 架橋度が高いほど不溶化することから、 本発明に使用するコラーゲンの架 橋度は、 例えば、 3量体以下であることが望ましく、 より好ましくは 2量体以下 が望ましい。
コラーゲンの分子量は、 例えば、 約 3 0万から 9 0万が好ましく、 約 3 0万か ら約 6 0万がより好ましい。
コラ一ゲンはいかなる動物種から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体 を用いることが出来る。 好ましくは脊椎動物から抽出されたものまたはそれらの 遺伝子組換体、 更に好ましくは哺乳類、 鳥類、 魚類から抽出されたものまたはそ れらの遺伝子組換体、 より好ましくは変性温度が高い哺乳類、 鳥類から抽出され たコラ一ゲンまたはそれらの遺伝子組換体が望ましい。 コラーゲンのタイプもい かなるタイプのコラーゲンでも良いが、 動物体内の存在量から I〜V型またはそ れらの遺伝子糸且換体が望まし 、。
具体的には、 例えば、 哺乳動物の真皮から酸抽出した 1型コラーゲンまたはそ れらの遺伝子組換体が挙げられる。 より望ましくは、 例えば、 仔牛の真皮から酸 抽出した 1型コラーゲン、 遺伝子工学的に生産される 1型コラーゲンなどが挙げ られる。 遺伝子工学的に生産される 1型コラーゲンとしては仔牛の真皮由来また はヒトの真皮由来のものが好ましい。 同じ 1型コラーゲンでも腱由来のコラーゲ ンは架橋度が高く不溶性であるため適さない。
また、 安全 1·生の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したァテロコ ラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるァテロコラーゲンが望ましく、 1分 子あたりチロシン残基が 3以下であるァテ口コラーゲンがより好ましい。
コラーゲンを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、 培養物 (培養上清、 培養細胞)から分離精製して、 得ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法に よりコラーゲンをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、 これを適切な 宿主に揷入して形質転換し、 この形質転換体の培養上清から目的とする組換えコ ラーゲンを得ることができる。 上記宿主細胞は特に限定されず、 従来から遺伝子 工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、 例えば大腸菌、 枯草菌、 酵母、 植 物または動物細胞を用いることができる。 本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは具体的には、 例えば、 5量体以上 3 0量体以下のオリゴヌクレオチドであり、 より具体的には例えば、 15量体以上 25量体以下のオリゴヌクレオチドである。
また、 本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは具体的には、 例えば、 DNA、 DNA誘導体、 RNA、 RNA誘導体等が挙げられ、 より具体的には、 例えば、
DNA誘導体、 RN A誘導体等の分子内に少なくとも 1つ以上のホスホロチォェ 一ト結合を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、 さらに具体的には、 例えば、 少な くともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコード した遺伝子、 病原性のウィルス、 細菌等に特異的な遺伝子のセンス鎖またはアン チセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列等を有し、 より具体的 には、 病原性ウィルス、 細菌等に特異的な遺伝子および恒常性を乱す生理的な効 果を有するタンパク質等をコードした遺伝子のメッセンジャー R N Aと相補的に 結合する塩基配列を有する。
更に具体的には、 本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、 例えば、 メッセ ンジャー RNAの開始コドンを含む領域あるいは前駆体メッセンジャー RNAが スプライシングを受ける部位に相補的な配列等を有する。 本発明に用いられるォ リゴヌクレオチドの例を示せば、 がんの治療あるいは予防に用いるオリゴヌタレ ォチドとしては、 例えば、 h s t - 1の発現を特異的に抑制する 5'— CTCG TAGGCGTTGTAGTTGT- 3' (SEQ ID NO: 1)の配列を有したオリゴ ヌクレオチド、 あるいはプロテインキナーゼ Cひの発現を特異的に抑制して非小 細胞性肺がんや結腸がんなどの進行性がんに有効で、 前立腺がん、 乳がん、 卵巣 がん、 膝臓がん、 大腸がん、 小細胞肺がんへの適用が試みられている I S I S 3 521、 C-r a f キナーゼの発現を特異的に抑制して前立腺がん、 乳がん、 卵 巣がん、 脳腫瘍、 膝臓がん、 大腸がん、 小細胞肺がんへの適用が試みられている I S I S 5132/CGP 69846 A、 Ha— r a sの発現を特異的に阻害し て大腸がん、 乳がん、 脳腫瘍、 膝臓がん、 肺小細胞がんへの適用が試みられてい る I S I S 2503、 プロテインキナーゼ Aタイプ Iの発現を特異的に抑制する GEM231、 DNAメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制する MG 98、 c— my cの発現を抑制する I NXC— 6295、 c— my bの発現を抑 制し白血病への適用が検討されている I NX— 3 Q 01、 b e 1—2の発現を抑 制して非ホジキンリンパ腫、 大腸がん、 小細胞肺がん、 慢性リンパ性白血病、 急 性骨髄性白血病、 乳がん、 リンパ腫、 メラノーマ、 骨髄腫、 非小細胞性肺がん、 前立腺がんへの適用が検討されている G— 3139 (Ge n a s e n s e)、 MD M 2蛋白の発現を抑制するオリゴヌクレオチド、 VEGFの発現を抑制するオリ ゴヌクレオチドなどを挙げることができる。 また、 感染症の治療あるいは予防に 用いるオリゴヌクレオチドとしては、 H I Vの増殖を抑制する GEM 9.2、 GP I— 2A、 サイトメガロウィルスの増殖を抑制する I S I S 2922 (f omi v i r s e n)、 V i t r a v e n e、 I S I S 13312N GEM13.2、 C 型肝炎ウィルスの増殖を抑制する I S I S 14803などが挙げられ、 炎症の治 療に用いられるオリゴヌクレオチドとしては、 I CAM— 1の発現を特異的に抑 制しクローン病、 潰瘍性大腸炎、 腎移植拒絶反応阻害、 乾癬、 喘息への適用が試 みられている I S I S 2302、 アデノシン A 1レセプターの発現を抑制し、 喘 息への適用が試みられている EP I— 2000、 および TNF— a、 CD49 d
(VLA_4)、 VCAM— 1、 P E CAM— 1の発現を抑制するオリゴヌクレオ チドなどが挙げられる。 また、 経皮経管冠動脈形成術後の再狭窄を防止するオリ ゴヌクレオチドとして、 c—my cの発現を抑制する R e s t e n_NGなどが 挙げられる。
恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は具体的に は、 例えば、 がん遺伝子とよばれる一群の遺伝子群が挙げられる。 より具体的に は、 例えば、 増殖因子群、 受容体型チロシンキナーゼ群、 非受容体型チロシンキ ナーゼ群、 G TP結合タンパク質、 セリン 'スレオニンキナーゼ群、 転写調節因 子群などが挙げられる。 更に具体的には、 例えば、 h s t一 1あるいはオルニチ ン脱炭酸酵素等をコードする遺伝子等が挙げられる。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 一般にォリゴヌクレオチドの細胞への導入を 促進する物質または核への移行を促進する物質中に包含させるかあるいは該物質 と複合体を形成させてもよい。 前者の例として、 カチオン性脂質、 カチオン性ポ リマー、 疎水性ポリマー等を挙げることができる。 「カチオン性脂質」 として、 DOTMA(N— [1— (2, 3—ジォレイルォキシ）プロピル] _N—トリメチル アンモニゥムクロライド）、 DOS PA(2, 3—ジォレイルォキシ _N— [2- (スペルミンカルボキサミド）ェチル] —N， N—ジメチルー 1一プロパンアミュ ゥムトリフノレオロアセテート）、 DDAB (ジメチルジオタタクレシルアンモ-ゥ ムプロミド）、 TM-TPS(N, ΝΙ,Ν Ι I，N I I I テトラメチル一 N， N，，
Ν" ,Ν，" ーテトラノヽ0ノレミチルスペルミン）、 DMR I E(l, 2—ジミリスチル ォキシプロピノ ^— 3—ジメチルヒドロキシェチルアンモニゥムブロミド）、 Ν— ( α—トリメチルァンモニゥムァセチル）一ジドデシル一 D -グルタメートクロラ ィト (Biochemical Biophysical Research Communication, 196， 1042 (1994)) % が挙げられ、 これらのカチオン性脂質と DOPE (ジォレイルホスファチジルェ タノールァミン)等の中性脂質からなるカチオン性リボソーム、 あるいはカチォ ン性脂質とコレステロールとの混合物も用いることができる。 「カチオン性ポリ マー」 はォリゴヌクレオチドと静電的な相互作用をするポリマーであり、 例えば DOGS (ジォクタデシルアミ ドグリシルスペルミン）等のリポポリアミン、 A1 k CWK 18等のぺプチド、 ポリリジンやその誘導体（Proceedings of Academy
Sciences of the USA, 89, 6094 (1992) )等のカチオン性ポリアミノ酸およびその 誘導体、 ポリエチレンィミン、 ポリアミンデンドリマー等が挙げられる。 「疎水 性ポリマー」 は遺伝子と疎水的な相互作用をするポリマーであり、 例えばポリビ ュルアルコールやポリビュルピロリ ドン等が挙げられる。 その他、 Al k CWK 18等のペプチドも用いることができる。
上記カチオン性リボソームとしては、 例えば、 DOSPAと DOPEを 1 ： 1 で含む L I POFE CTAM I N E (登録商標、 Life Technologies, Inc. , 口ッ クビル， MD，USA)、 DOTMAと DOPEを 1 ： 1で含むリボソーム、 DD ABと DOPEを 1 ： 2.5で含む L I P O F E C T AC E (登録商標、 Life Technologies, Inc., ロックビル, MD， U S A)、 TM— TPSと DOPEを
1 : 1.5で含む C E LLFECT I N (登録商標、 Life Technologies, Inc.， ロックビル， MD, U S A)等を挙げることができるが、 これらに限定されない。 また、 上記カチオン性脂質とコレステロールの混合物とは、 例えば DMR I Eと コレステロールのモノレ比で 1 ： 1の混合物である DMR I E— C (Life Technologies, Inc. , ロックビル， MD, U S A)を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドは膜融合型リボソーム中に包含されていてもよくあるいは リボソームと複合体を形成してもよい。 膜融合型リボソームとしては例えば HV Jーリポソーム等が挙げられる。
遺伝子の核への移行を促進する物質としては、 HMG— 1および 2の混合物
(high mobility group- 1, 2 mixture：実験医学， 12， 184 (1994) )等を挙げるこ とができる。
本発明のォリゴヌク .レォチド導入製剤中のコラーゲンとオリゴヌクレオチドの 量比は、 コラーゲンによる、 1 )ヌクレアーゼあるいは他のタンパク質からのォ リゴヌクレオチドの保護、 2 )オリゴヌクレオチドの徐放、 3 )オリゴヌクレオチ ドの局所滞留およびそれによる局所での高濃度維持、 4 )オリゴヌクレオチドの 細胞内への導入促進、 を達成する上で重要である。 コラーゲンとオリゴヌクレオ チドの量比は、 オリゴヌクレオチドの鎖長が目的に応じて如何ようにも選択でき ることから、 コラーゲン 1分子に対するオリゴヌクレオチドの負電荷の数により 表すことが出来る。 本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤において望ましいコラ 一ゲン 1分子に対するオリゴヌクレオチドの負電荷の数は 1 0〜5 0 0 0であり、 望ましくは 1 0〜 2 5 0 0、 より望ましくは 1 0〜1 0 0 0である。
本発明のォリゴヌクレオチド導入製剤は、 オリゴヌクレオチドとコラ一ゲンに 加えて医学上許容される添加剤を更に含むことができる。
具体的には、 これらの添加剤は溶液状あるいは懸濁液状のォリゴヌクレオチド 導入製剤の P Hを調整する目的で用いられる塩類、 ァミノ酸類おょぴァミン類、 あるいは高粘度の溶液状、 懸濁液状あるいはスポンジ状、 フィルム状、 円柱状お よび粉末状のォリゴヌクレオチド導入製剤からオリゴヌクレオチドの放出を制御 する効果を有する添加剤である。 塩類、 アミノ酸類、 アミン類としては、 例えば、 トリス（ヒドロキシメチゾレ)ァミノメタン、 クェン酸ナトリウム、 クェン酸二水素 ナトリゥム、 リン酸三ナトリゥム、 リン酸水素ナトリゥム、 無水リン酸ーナトリ ゥム、 無水リン酸二水素ナトリゥム、 リジン、 アルギニンなどが挙げられる。 放出を制御する効果を有する添加剤としては、 具体的には、 例えば、 単糖、 二 糖、 三糖以上のオリゴ糖もしくはこれらの糖アルコールまたはこれらの誘導体、 アミノ酸類、 カルボキシル基を 2個以上有する有機酸類、 ゼラチン、 アルブミン、 フィプリン、 アルギン酸、 ァガロース、 アラビアゴムなどである。
単糖としては、 例えば、 グルコース、 ガラクトース、 フルクトース等が挙げら れ、 好ましくはグルコースである。 二糖としては、 例えば、 シユークロース、 マ ルトース、 ラタトース、 トレハロースなどが挙げられる。
糖アルコールとしては、 例えば、 ソルビトール、 マン-トール等が挙げられ、 好ましくはソノレビトールである。
糖誘導体には、 例えば、 デォキシ糖、 アミノ糖、 リ.ン酸エステル類およびこれ らを構成成分とする二糖などがある。
アミノ酸類としては、 医学的に許容されるアミノ酸およびその塩、 ならびにこ れらの誘導体などが挙げられる。 アミノ酸類としては、 例えば、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸などの酸性アミノ酸、 リジン、 アルギニン、 ヒスチジンなどの塩 基 1·生アミノ酸、 グリシン、 ァラニン、 メチォニン、 プロリン、 シスチン、 セリン、 スレオニン、 ァスパラギン、 グノレタミン、 イソロイシン、 システィン、 チロシン、 トリブトファン、 ロイシンなどが挙げられる。 本発明におけるアミノ酸類とは、 他に塩基性あるいは中性の側鎖が存在しているアミノ酸も包含される。 アミノ酸 の塩としては、 例えば、 ナトリウム塩、 カリウム塩などが挙げられる。
力ルポキシル基を 2個以上有する有機酸およびその塩としては、 好ましくは、 例えばカルボキシル基を 2あるいは 3個含む有機酸およびその塩が挙げられ、 よ り好ましくは飽和または不飽和脂肪族の該有機酸などが挙げられる。 カルボキシ 基を 2あるいは 3個含む有機酸およびその塩として、 例えばクェン酸、 酒石酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 フマル酸およびその塩などが挙げられ、 好ましくは例えば、 クェン酸、 酒石酸塩およびその塩などが挙げられる。 あるいは、 オリゴヌクレオ チドの細胞内におけるェンドソームでの分解を抑えるために、 例えばェンドソー ムの内容物を放出する能力を有する不活化したアデノウイルス、 C H EM S (コ レステロールへミスクシネートモルホリン塩)等を用いることもできる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤には、 上記の糖類、 アミノ酸類おょぴカ ルポキシル基を 2個以上有する有機酸類のいずれかを含有する製剤およびこれら のうち任意の 2者または 3者を含有する製剤が含まれる。 添加剤を用いて放出を制御する場合には、 その添加剤の含有量で調節すること ができる。 例えば放出時間を長くするには添加剤の含有量を下げ、 短くするには 添加剤の含有量を高くする。 添加剤の量は、 具体的にはコラーゲンに対し、 0〜 約 1980 Ow/w%の範囲から選択できる。 好ましい範囲としては約 0〜約 1 89 OwZw0/)の範囲が挙げられる。 より好ましくは約 0〜約 90 OwZwO/oの 範囲が挙げられる。 更に好ましくは約 0〜 300 w/w%の範囲が挙げられる。 本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、 溶液状あるいは懸濁液状であるか、 あるいは溶液状あるいは懸濁液状の形態を経てスポンジ状、 円柱状あるいは粉末 状に加工されたものである。 溶液状あるいは懸濁液状の、 本発明のオリゴヌタレ ォチド導入製剤の p Hは 4〜 8の範囲であり、 コラ一ゲンを 0.001 %〜 1
0%(wZw)含有し、 好ましくは 0. 1%〜5%(W/W)含有する。 スポンジ状、 ペレツト状あるいは粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤は 5〜99%(w/w)、 好ましくは 10〜70%(w/w)s より好ましくは 25〜50%(W/ w)のコラ 一ゲンを含有する。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、 例えば、 経皮、 皮下、 皮内、 筋肉、 脳内、 組織、 血管内投与することができる。 投与回数は 3日から約 2ヶ月に 1回、 好ましくは、 1週間から 1ヶ月に一回である。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の投与量は、 溶液状あるいは懸濁液状の 製剤の場合にはその液量で、 スポンジ状製剤の場合には製剤の大きさで、 円柱状 製剤の場合は径と長さで、 さらに粉末状製剤の場合は粉体体積あるいは重量で容 易に調節することができる。 また、 製剤中のオリゴヌクレオチド含有量によって も投与量を調節できる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の最適な投与量は、 適応疾患、 投与部位、 投与方法、 剤形の種類、 患者の性別、 年齢、 症状などによって異なるが、 製剤中 のォリゴヌクレオチド量としては、 治療対象に対して例えば、 0.001 m g Z k g〜40mg/ k g、 好ましくは 0.01 mgZk g〜 3 Omg/k gである。 溶液状あるいは懸濁液状の、 本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法 としては、 例えば、
1 )コラ一ゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 均一な溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤ある いは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 均一な溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸 濁 ί夜状のォリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁 液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
4 )必要に応じて添加剤を添加したコラ一ゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 均一な溶液状オリゴヌクレオチド導 入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した 所望のォリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 均一な溶液状ォリゴヌクレオチド導 入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
6 )所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添 加剤を添加したコラ一ゲン溶液に溶解させ、 均一な溶液状ォリゴヌクレオチド導 入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
7 )必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得 られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、 均一な溶液状オリゴヌクレオチド導 入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； などが挙げられる。 この時、 溶液状の製剤を得る力、 懸濁液状の製剤を得るかは オリゴヌクレオチド溶液およびコラーゲン溶液の各々の濃度によって調節する。 フィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、 例えば
1 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥 させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させて フィルム状のォリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； 3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させて フィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
4 )必要に応じて添加剤を添加したコラ一ゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を狳々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； 6 )所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添 加剤を添加したコラ一ゲン溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； 7 )必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得 られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；など が挙げられる。
スポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、 例えば、
1 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し てスポンジ状のォリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポ ンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポ ンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
4 )必要に応じて添加剤を添加したコラ一ゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； 5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した 所望のォリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；など が挙げられる。
粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、 例えば、
1 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のォリ ゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のォリゴヌク レオチド導入製剤を得る方法；
3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌク レオチド導入製剤を得る方法；
4 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のォリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して 粉末状のォリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して 粉末状のォリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
6 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
7 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得ら れたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
8 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得ら れたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法； 9 )必要に応じて添加剤を添加したコラ一ゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製 剤を得る方法；
1 0 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁 液を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入 製剤を得る方法；
1 1 )コラ一ゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これ に必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそ のまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
1 2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
1 3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
1 4 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品 を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過して得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を 得る方法；
1 5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過して得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を 得る方法；
1 6 )所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて 添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過して得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を 得る方法； 1 7 )必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過して得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を 得る方法；など
が挙げられる。
円柱状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、 例えば、
1 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末 を円柱状に圧縮成形する方法；
2 )必要に応じて添加剤を添加したコラ一ゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱 状に圧縮成形する方法；
3 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱 状に圧縮成形する方法；
4 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して 得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して 得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
6 )コラーゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これに 必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法； 7 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得ら れたスポンジを粉碎して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
8 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチ ド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、 得ら れたスポンジを粉碎して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
9 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を 所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液 を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形す る方法；
1 0 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁 液を凍結乾燥し、 得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形 する方法；
1 1 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これ に必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそ のまま、 あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
1 2 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリ ヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
1 3 )コラ一ゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
1 4 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品 を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過し、 得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方 法；
1 5 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過し、 得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉碎して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方 法；
1 6 )所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて 添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過し、 得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方 法；
1 7 )必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、 得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、 得られた懸濁液をろ過し、 得られ た沈殿物をそのまま、 あるいは粉碎して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方 法；
.1 8 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これ に必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液ある ヽは懸濁液を凍結乾燥 して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
1 9 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してし て得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
2 0 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のォリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得 たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
2 1 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品 を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁 液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
2 2 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁 液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
2 3 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これ に必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥 して得たスポンジに水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾 燥する方法；
2 4 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得 たスポンジに水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾燥する 方法；
2 5 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得 たスポンジに水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾燥する 方法；
2 6 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品 を所望のォリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、 得られた均一な溶液あるいは懸濁 液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に 押し出し、 乾燥する方法；
2 7 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させて、 得られた均一な溶液あるいは懸 濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状 に押し出し、 乾燥する方法；
2 8 )コラーゲン溶液に、 所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、 これ に必要に応じて添加剤を溶解し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に 水等を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾燥する方法； 2 9 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、 所望のォリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に水等を 加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾燥する方法；
3 0 )コラーゲン溶液に、 必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオ チド溶液を加えて混合し、 得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に水等を 加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し出し、 乾燥する方法；
3 1 )必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品 に所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し 出し、 乾燥する方法；
3 2 )コラーゲン溶液を乾燥し、 得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加し た所望のオリゴヌクレオチド溶液に加えた後、 練合し、 ノズルから円柱状に押し 出し、 乾燥する方法；など
が挙げられる。
実施例
以下に実施例および試験例を挙げて本発明を詳しく説明する力 本発明はこれ ら実施例おょぴ試験例により限定されるものではない。
実施例 1
線維芽細胞増殖因子 H ST-1 (FGF4)の遺伝子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)に記載）の 4196 bから 4216 bまでの配列に相 捕的な配列を有したホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（5， — CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT— 3， (SEQ ID NO: 1) ；分子量： 約 6500 ) (サヮデー株式会社）を最終濃度 10マイクロモル Z Lの濃度となる ようにァテロコラーゲンの中性溶液（(株)高研製ァテロコラーゲンィンプラン ト： 2%ァテロコラーゲン溶液）と混合し、 ァテロコラーゲン最終濃度が 0.5% の溶液状のォリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
実施例 2
オル；チン脱炭酸酵素遺伝子の 319 bから 338 bまでの配列に相補的な配 列を有したホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS— OD C、 5'— TCATGATTTCTTGATGTTCC— 3') (SEQ ID NO: 2) (エスペックオリゴサービス株式会社）を終濃度 0. 5、 1、 1. 5、 2、 2. 5ミ リモル Z Lの濃度となるようにァテロコラーゲンの中性溶液 ( (株)高研製ァテ口 コラーゲンインプラント： 3.5 wZw%ァテロコラーゲン溶液、 終濃度 1. 75 w/w%)と混合し、 溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
実施例 3
八3— 000を終濃度1.0ミリモル/ Lの濃度となるようにァテロコラーゲ ンの中性溶液（(株)高研製ァテロコラーゲンインプラント： 3. 5wZw%ァテロ コラーゲン溶液、 終濃度 1.75 w/w%) 0.5マイクロ Lと トランスファスト (P r ome g a) 1. 5マイクロ Lを混合し、 リボソームを含有したオリゴヌク レオチド導入製剤を調製した。
実施例 4
実施例 1で調製した溶液状のォリゴヌクレオチド導入製剤 3 m Lをポリスチレ ン製のシャーレ一（直径 35 mm)上に流し込み、 これをシリカゲノレを入れたデシ ケーター中で水平に保って 5 °Cで静置して徐々に乾燥し、 コラーゲン 1 m gあた り 32.5マイクログラムのオリゴヌクレオチドを含むフィルム状のォリゴヌク レオチド導入製剤を得る。
実施例 5
実施例 1で調製した溶液状のォリゴヌクレオチド導入製剤 3mLをポリスチレ ンシャーレ（直径 35 mm)上に流し込み、 これを一 40°Cで凍結させた後、 陰圧 下室温でー晚乾燥し、 コラーゲン Imgあたり 32. 5マイクログラムのオリゴ ヌクレオチドを含むスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る。
実施例 6
2 wZw%ァテロコラーゲン溶液（17. 5 g)に水（52. 5 g)、 1 Omg/m Lのグルコース溶液（1 OmL)を加えて混合した後、 SmgZmLのホスホロチ ォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（5， 一CTCGTAGGCGTTG
TAGTTGT— 3， (SEQ ID NO: 1) ；分子量：約 6500)溶液（1 OmL)を加 えて混合する。 得られた溶液を一 40°Cで凍結させた後、 陰圧下室温でー晚乾燥 し、 この凍結乾燥品に適量の蒸留水を加えて練合する。 その後、 練合品をノズル を通して棒状に押し出し成形し、 さらに乾燥させて棒状の製剤を得る。 すなわち 10 m gあたり 1 m gのオリゴヌクレオチドを含有する棒状の遺伝子製剤を得る。 実施例 7
オルュチン脱炭酸酵素遺伝子の 319 bから 338 bまでの配列に相補的な配 列を有したホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS— OD C、 5' - TCATGATTTCTTGATGTTCC - 3') (SEQ ID NO: 2) (ェ スペックオリゴサービス株式会社)を 10ミリグラム/ミリリットル含有する生 理食塩水 50マイクロリットルとァテロコラーゲン液（3. 5%) 50マイクロリ ットルを室温で混合し、 AS— ODCを 5マイクログラム/マイクロリットル、 ァテロコラーゲンを 1.75 %含有する溶液状態のォリゴヌクレオチド導入製剤 を調製した。
参考例 1
ァテロコラーゲンの中性溶液を蒸留水に変えた以外は、 実施例 1に記載の操作 に従い、 ホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を調製した。 参考例 2
線維芽細胞増殖因子 H ST-1 (FGF4)の遺伝子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)に記載）の 4196 bから 4216 bまでの配列に相 補的な配列を有したホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの変 わりに、 その配列と同じ配列を有したホスホロチォエート型センスオリゴヌタレ ォチ K(5'—ACAACTACAACGCCTACGAG—3，） (SEQ ID NO: 3) を用いた以外は、 実施例 1に記載の操作に従い溶液状の組成物を得た。
参考例 3
線維芽細胞増殖因子 H ST- 1 (FGF 4)の遺伝子（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2890-2984 (1987)に記載）の 4196 bから 4216 bまでの配列に相 補的な酉己列を有したホスホロチォエート型ァンチセンスオリゴヌクレオチド（ 5， — CTCGTAGGCGTTGTAGTTGT— 3，（SEQ ID NO: 1) ；分子量： 約 6500)を 20マイクロモル/ Lの濃度になるように溶解したリン酸緩衝液 500マイクロ と、 リポフエクトァミン（G I BCO BRL) 25マイクロ L を溶解したリン酸緩衝液 500マイクロ Lを混合し、 室温で 20分間、 静置反応 することで最終濃度 10マイクロモル/ Lのオリゴヌクレオチド ·リボソーム製 剤を得た。
参考例 4
AS-ODCの変わりにリン酸緩衝液を加えた以外は、 実施例 2に記載の操作 に従いァテロコラーゲンを 1.75 w/w%含有するァテロコラーゲン溶液を調 し 。
参考例 5
ァテロコラーゲンの中性溶液をリン酸緩衝液に変えた以外は、 実施例 2に記載 の操作に従い AS— ODCを 1.0ミリモル ZLの濃度で含有したホスホロチォ エート型アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
参考例 6
AS—ODCの変わりに、 非相同な配列を有したホスホロチォエート型スクラ ンブルオリゴヌクレオチド（5，一 AGTACTAAAGAACTACAAGG— 3， ) (SEQ ID NO: 4) (エスペックオリゴサービス株式会社）を 1.0ミリモル/ L の濃度で含有する以外は、 実施例 2に記載の操作に従い溶液状のホスホロチォェ 一ト型スクランプルォリゴヌクレオチド組成物を得た。 参考例 7
A S— OD Cを終濃度 1 . 0ミリモル/ Lとなるように、 リン酸緩衝液と、 ト ランスファスト（P r o m e g a )を溶解したリン酸緩衝液 1 5マイクロ Lを混合 することでリボソーム製剤を得た。
試験例 1
実施例.1で調製したォリゴヌクレオチド導入製剤 2マイクロ Lを 2 0 %の仔牛 血清を含む P B S (—）液 1 0 0マイクロ Lに混合し 3 7 °Cで静置した。 混合後、 3 0分、 6 0分、 1 8 0分後に混合液を分取して 3 %ァガロースゲル電気泳動に 付し、 製剤中のホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの一次構 造を評価した。 結果を第 1図に示す。 実施例 1で調製したオリゴヌクレオチド導 入製剤中のホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 2 0 %の 仔牛血清を含む P B S (—）溶液と混合した 1 8 0分後でも無処理のホスホ口チォ ト型アンチセンスオリゴヌクレオチドの泳動位置にバンドが認められたのに 比べて、 参考例 1の製剤では 3 0分後にはバンドは確認できなかった。 この結果 は、 本宪明のォリゴヌクレオチド導入製剤中でホスホロチォエート型ォリゴヌク レオチドが酵素による分解から保護されることを示している。
試験例 2
1 0週齢のォスのヌードマウスの精巣に H S T— 1を産生するヒト精巣胚腫瘍 細胞（N E C— 8 )を 1 0 X 1 0 5個移植した。 移植 1 0日後に実施例 1で調製し たォリゴヌクレオチド導入製剤をヌードマウスの精巣あたり 5 0マイクロリット ルを投与した。 投与後、 1 0曰後、 2 0日後、 3 0 後にヌードマウスを屠殺し、 精巣中の腫瘍細胞の重量を測定した。 結果を第 2図に示す。 ヌードマウスの精巣 中での精巣胚腫瘍細胞の増殖は、 参考例 2のゲル状の組成物および参考例 3のリ ポソームの組成物をそれぞれ精巣あたり 5 0マイクロリツトル投与した場合に比 ベて、 実施例 1で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤を投与したヌードマウス で最も抑制された。 特に、 参考例 3のリボソーム製剤では 2 0日後まで実施例 1 のオリゴヌクレオチド導入製剤と同等の抑制効果を示したが、 3 0曰後には增殖 抑制効果は見られなかった。 この結果は、 本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤 が投与後ヌードマウスの精巣に滞留し、 ヌードマウスの体内で H.S T— 1の産生 を抑制するホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドを酵素による 分解から保護し、 このホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドを局所で徐放す ることによって効果的にかつ長期間腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を有すること を示している。
試験例 3
1 0 %牛胎児血清を含む DM EM培地 5 0 0マイクロ L中で培養したヒト胃癌 細胞 (MKN 4 5細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団） 5 X 1 0 5個に 実施例 2で調製した溶液状のォリゴヌクレオチド導入製剤（A S— OD Cを 1 . 0 ミリモル/ L含有する） 5マイクロ Lを添加（終濃度 1 0マイクロモル Z L)し、 3 7 °Cで培養した。 添加 2 4時間後にォリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を 鎌羊な培地と交換し、 その後 2 4時間毎に培地を交換して 6日間培養した。 添加 後 2 3毎に細胞数を 3- [4， 5-diraethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-2H- tetrazoliura bromide (MT Tアツセィ）により測定した。 同様に参考例 4で調製 したァテロコラーゲン溶液、 参考例 5で調製したホスホロチォエート型アンチセ ンスオリゴヌクレオチド溶液、 参考例 6で調製した溶液状のホスホロチォエート 型スクランプルォリゴヌクレオチド組成物を ΜΚΝ 4 5細胞に添加して細胞数を 測定した。 結果を第 3図に示す。 実施例 2の溶液状のオリゴヌクレオチド導入製 剤を添加した場合、 何も添加しなかった対照群に比べて ΜΚΝ 4 5細胞の増殖が 著しく抑制された。 更に 6日後には添加時に比べて ΜΚΝ 4 5細胞数が減少した。 —方、 ァテロコラーゲン溶液である参考例 4、 A S— OD Cのみを含有する参考 例 5、 ホスホロチォエート型スクランブルオリゴヌクレオチドとァテロコラーゲ ンを含む参考例 6の製剤を添加した場合には、 対照群に比べて MKN 4 5細胞の 増殖は抑制されたものの、 実施例 2の製剤を添加した場合に比べて抑制効果は低 かった。 これらの結果はホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド による腫瘍細胞の増殖抑制効果は、 ァテロコラーゲンと混合して本発明のオリゴ ヌクレオチド導入製剤とすることによって増強されること、 また本発明のォリゴ ヌクレオチド導入製剤による腫瘍細胞の増殖抑制機構が単にァテロコラ一ゲンあ るいはホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドが標的細胞と共存することに由 来せず、 ホスホロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的細胞 の増殖抑制効果および殺細胞効果に因ることを示している。
試験例 4
10 %牛胎児血清を含む DMEM培地 500マイクロ L中で培養したヒト横紋 筋肉腫細胞（RD細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団） 5X 105個に 実施例 2で調製した溶液状のォリゴヌクレオチド導入製剤（AS—ODCを 0. 5、 1、 1.5、 2、 2.5ミリモル ZL含有する） 5マイクロ Lを添加 (終濃度 5、 1 0、 15、 20、 25マイクロモル ZL)し、 37°Cで培養した。 添加 24時間 後にオリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、 その後 24 時間毎に培地を交換して 5日間培養した。 添加後 1、 353後に細胞の生存率を トリパンブルー染色法により測定した。 結果を第 4図に示した。 測定したすべて のォリゴヌクレオチド導入製剤で R D細胞の生存率は低下し、 測定した中で最も AS—ODC濃度が低 1/ヽ 5マイクロモル// Lのオリゴヌクレオチド導入製剤でも 殺細胞効果が見られた。
試験例 5
10 %牛胎児血清を含む DM EM培地 500マイクロ L中で培養したヒト横紋 筋肉腫細胞（RD細胞） 5 X 105個に実施例 3で調製したリボソームを含有した オリゴヌクレオチド導入製剤 5マイクロ Lを添加し、 37。Cで培養した。 添加 2 4時間後にオリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、 その 後 24時間毎に培地を交換して 8日間培養した。 添加 2、 4、 6、 8日後に細胞 の生存率をトリパンブルー染色法により測定した。 また、 添加 2、 4、 6曰後に RD細胞内のオル二チン脱炭酸酵素活性を測定した。 同様に参考例 7のリポソ一 ム製剤を添加して R D細胞の生存率および細胞内のオル二チン脱炭酸酵素の活性 を調べた。 結果を第 5図と第 6図に示した。 実施例 3のリボソームを含有したォ リゴヌクレオチド導入製剤、 参考例 7のリポソ一ム製剤共に R D細胞の生存率を 低下させたが、 オリゴヌクレオチド導入製剤の方が強い殺細胞効果を示した。 ま た、 同様にリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤とリポソ一ム製剤 は共に RD細胞内のオル二チン脱炭酸酵素活性を低下させたが、 オリゴヌクレオ チド導入製剤の方が強く活性を低下させた。 これは実施例 3のリポソームを含ん だォリゴヌクレオチド導入製剤が、 参考例 7のリポソーム製剤に比べて強く標的 遺伝子であるオル二チン脱炭酸酵素遺伝子の発現を抑制し、 R D細胞を減少させ たことを示している。 これらの結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤がリ ポソームを含んだ場合でも、 ホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドによる殺 細胞効果を増強し、 その増強効果が従来のリポソーム製剤に比べて優れているこ とを示している。
試験例 6
4週齢のォスのヌ一ドマウスの背部皮下にオル-チン脱炭酸酵素を過剰に産生 する R D細胞を 5 X 1 0 7個移植した。 移植 7 S後に実施例 7で調製したオリゴ ヌクレオチド導入製剤を R D細胞移植部位、 R D細胞を移植した対側の背部筋肉 内、 および腹腔内にそれぞれ投与した。 同様に参考例 4のァテロコラーゲン溶液、 参考例 7のリポソーム製剤おょぴリン酸緩衝液 (対照群）をそれぞれ R D細胞移植 部位に投与した。 投与後、 7日毎にヌードマウスを屠殺し、 R D細胞の重量を測 定した。 結果を第 7図、 第 8図、 および第 9図に示す。 第 7図は実施例 7の製剤 および参考例 4の製剤の R D移植部位投与した場合の比較、 第 8図は実施例 7の 製剤および参考例 7の製剤を R D移植部位投与した場合の比較、 第 9図は実施例 7の製剤の R D移植部位投与 (局注)、 筋肉内投与 (筋注)および腹腔内投与 (腹注） の結果を示す。 ヌードマウス背部筋肉中での R D細胞の増殖は、 参考例 4のァテ ロコラ一ゲン溶液 (第 7図）、 参考例 7のリポソ一ム製剤 (第 8図）およびリン酸緩 衝液を投与した場合に比べて、 実施例 7で調製したォリゴヌクレオチド導入製剤 を R D移植部位内、 R D細胞を移植した対側の背部筋肉内、 および腹腔内に投与 したすベてのヌードマウスで最も抑制された（第 9図）。 特に、 参考例 7のリポソ ーム製剤では 7日後まで実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤と同等の抑制効 果を示したが、 1 4曰後には増殖抑制効果は見られなかった。 これらは本発明の オリゴヌクレオチド導入製剤がリポソーム製剤に比べてより強力に R D細胞の増 殖を抑制すること、 またこの R D細胞の増殖抑制効果が長期に亘つて持続するこ と、 更に増殖抑制効果が投与部位による影響を受けないことを示している。 この 結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤が、 投与後ヌードマウスの体内でホ スホロチォエート型ァンチセンスオリゴヌクレオチドを酵素による分解から保護 し、 このホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドを徐放することによって効果 的にかつ長期間 J®瘍細胞の増殖を抑制する効果を有することを示している。 第 1 0図および第: L 1図に RDを移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。 第 1 0図は、 実施例 7の製剤と参考例 4の製剤を R D移植部位投与した場合の比較、 第 1 1図は実施例 7の製剤と参考例 7の製剤を R D移植部位投与した場合の比較 を示す。 実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤を RD移植部位に投与したマウ スの平均生存日数は 5 2 . 6日で、 リン酸緩衝液を投与したヌ一ドマウスの平均 生存日数 2 0. 5日、 参考例 4のァテロコラーゲン溶液を投与したヌードマウス の平均生存日数 4 0. 3.日（第 1 0図）、 参考例 7のリボソーム製剤を投与したヌ 一ドマウスの平均生存 S数 3 7. 8日（第 1 1図）に比べて大幅に延長された。 こ の結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を投与して得られる R D細胞の増 殖抑制効果が、 R D細胞を移植したヌードマウスの延命率を高めることを示して いる。 また、 第 1 2図および第 1 3図に実施例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤、 参考例 4のァテ口コラーゲン溶液、 参考例 7のリポソーム製剤およびリン酸緩衝 液投与後 4 2曰の R D細胞内でのオル二チン脱炭酸酵素活性を示した。 第 1 2図 は実施例 7の製剤と参考例 4の製剤を R D移植部位に投与した場合の比較、 第 1 3図は実施例 7の製剤と参考例 7の製剤を R D移植部位投与した場合の比較を示 す。 オリゴヌクレオチド導入製剤を投与した R D細胞内のオルェチン脱炭酸酵素 活性は、 ァテロコラーゲン溶液、 リボソーム製剤およびリン酸緩衝液を投与した R D細胞に比べて低かった。 これはォリゴヌクレオチド導入製剤を投与すること によってオル-チン脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、 オリ ゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合にみられた R D細胞の増殖抑制効果が、 オリゴヌクレオチド導入製剤中に含まれるホスホロチォエート型オリゴヌクレオ チドによるオル二チン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるものであることを示し ている。
試験例 7
4週齢のォスのヌードマウスの背部皮下にオル二チン脱炭酸酵素を過剰に産生 する MKN 4 5細胞を 5 X 1 0 7個移植した。 移植 7日後に実施例 7で調製した オリゴヌクレオチド導入製剤を MKN 4 5細胞移植部位に投与した。 同様に参考 例 4のァテ口コラーゲン溶液、 参考例 6の溶液状のホスホロチォエート型スクラ ンブルオリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液 (対照群）をそれぞれ MKN 4 5細胞移植部位に投与した。 投与後、 7日毎にヌ ドマウスを屠殺し、 MKN 4 5細胞の重量を測定した。 結果を第 1 4図に示す。 ヌードマウス背部筋肉中で の MKN 4 5細胞の増殖は、 参考例 4のァテロコラーゲン溶液、 参考例 6の溶液 状のホスホロチォエート型スクランブルォリゴヌクレオチド組成物およびリン酸 緩衝液を投与した場合に比べて、 実施例 7で調製したォリゴヌクレオチド導入製 剤を MKN 4 5細胞移植部位に投与した場合に最も抑制された。 これは本発明の オリゴヌクレオチド導入製剤が MK N 4 5細胞の増殖を抑制すること、 またこの MKN 4 5細胞の増殖抑制効果が長期に亘つて持続することを示している。 第 1 5図に MKN細胞を移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。 実施例 7の オリゴヌクレオチド導入製剤を MKN細胞移植部位に投与したヌードマウスの平 均生存 13数は 4 8 . 5日で、 参考例 4のァテロコラーゲン溶液を投与したヌード マウスの平均生存日数 3 9 . 1日、 参考例 6の溶液状のホスホロチォエート型ス クランブルォリゴヌクレオチド組成物を投与したヌ一ドマウスの平均生存日数 3 9 . 1日、 リン酸緩衝液を投与したヌ一ドマウスの平均生存日数 2 1 . 3日に比べ て大幅に延長された。 この結果は本発明のォリゴヌクレオチド導入製剤を投与し て得られる MKN細胞の増殖抑制効果が、 MKN細胞を移植したヌードマウスの 延命率を高めることを示している。 また、 第 1 6図に実施例 7のオリゴヌクレオ チド導入製剤、 参考例 4のァテロコラーゲン溶液、 参考例 6の溶液状のホスホロ チォエート型スクランブルォリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液投与後 3 5日の MKN 4 5細胞内でのオル-チン脱炭酸酵素活性を示した。 オリゴヌク レオチド導入製剤を投与した MKN 4 5細胞内のオノレエチン脱炭酸酵素活性は、 ァテロコラーゲン溶液、 溶液状のホスホロチォエート型スクランブルオリゴヌク レオチド組成物おょぴリン酸緩衝液を投与した MKN 4 5細胞に比べて顕著に低 かった。 これはオリゴヌクレオチド導入製剤を投与することによってオル二チン 脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、 オリゴヌクレオチド導入 製剤を投与した場合にみられた MKN 4 5細胞の増殖抑制効果が、 オリゴヌクレ ォチド導入製剤中に含まれるホスホロチォエート型オリゴヌクレオチドによるォ ルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるものであることを示している。 試験例 8
4週齢のォスのヌードマウスの背部皮下にオル二チン脱炭酸酵素を過剰に産生 するヒ ト大腸癌細胞（COL0201細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興 財団）を 5 X 107個移植した。 移植 7日後に実施例 7で調製したォリゴヌタレ ォチド導入製剤を COLO201細胞移植部位に投与した。 同様に参考例 4で調 製したァテロコラーゲン溶液おょぴリン酸緩衝液 (対照群）をそれぞれ CO LO 2 01細胞移植部位に投与した。 投与後、 7日毎にヌードマウスを屠殺し、 COL 0201細胞の重量を測定した。 結果を第 17図に示す。.ヌードマウス背部筋肉 中での C O L O 201細胞の増殖は、 参考例 4のァテロコラ一ゲン溶液およびリ ン酸緩衝液を投与した場合に比べて、 実施例 7で調製したォリゴヌクレオチド導 入製剤を投与した場合に最も抑制され、 力、つ C O L O 201細胞の重量は移植時 より減少した。 これらは本発明のォリゴヌクレオチド導入製剤が C O L O 201 の増殖を抑制すると共に COLO 201細胞を死滅させること、 またこの COL O 201細胞の増殖抑制効果が長期に亘つて持続することを示している。 第 18 図に COLO 201細胞を移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。 実施 例 7のオリゴヌクレオチド導入製剤を C O L O 201細胞移植部位に投与したマ ゥスの平均生存日数は 39.8日で、 ァテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液 を投与したヌードマウスのそれぞれの平均生存日数 31.20および 20.6日に 比べて延長された。 この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を投与して 得られる COLO 201の増殖抑制効果が、 COL0201を移植したヌードマ ウスの延命率を高めることを示している。 また、 第 19図に実施例 7のオリゴヌ クレオチド導入製剤、 参考例 4のァテロコラ一ゲン溶液およびリン酸緩衝液投与 後 35日の COLO201細胞内でのオノレニチン脱炭酸酵素活性を示した。 ォリ ゴヌクレオチド導入製剤を投与した C O L O 201細胞内のオル-チン脱炭酸酵 素活性は、 ァテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液を投与した C O L O 201 細胞に比べて低かった。 これはオリゴヌクレオチド導入製剤を投与することによ つてオル二チン脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、 この結果 はォリゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合にみられた C O L O 201細胞の 増殖抑制効果が、 オリゴヌクレオチド導入製剤中に含まれるホスホロチォエート 型ォリゴヌクレオチドによるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるもの であることを示している。
試験例 9
10%牛胎児血清を含む DMEM培地 0. 5 mL中で培養したマウス平滑筋肉 腫細胞（LMF S細胞） 1 X 105個に実施例 7で調製した溶液状のオリゴヌクレ ォチド製剤（100マイクロモノレ/ Lの AS— ODCと 0. 175%の AS— OD Cを含有する） 10マイクロ Lを添加し、 37 °Cで培養した。 添加 24時間後に オリゴヌクレオチド製剤を含む培地を»な培地と交換し、 その後 24時間毎に 培地を交換して 6日間培養した。 添加後 2日毎に細胞数とオル-チン脱炭酸酵素 活个生を測定した。 結果をそれぞれ第 20図、 第 21図に示す。 実施例 7の溶液状 のオリゴヌクレオチド製剤を添加した場合、 何も添加しなかった対照群に比べて LMF S細胞の増殖が著しく抑制され、 オル-チン脱炭酸酵素活性も低下した。 この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤が増殖性、 転移性共に極めて強 い LMF S細胞の増殖を標的塩基配列特異的に抑制できることを示している。 産業上の利用の可能性
標的 m— RNAと相捕的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとコラーゲン (更に医療上許容される添加剤)からなる製剤が、 i n v i v oで副作用を誘発 することなく標的 m— R N Aの発現を効果的に抑制し、 かつ長期にその効果が維 持されることにより、 遺伝子治療が可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . コラーゲンを必須成分とする標的細胞への所望のオリゴヌクレオチド導入 製剤。
2. 標的細胞が動物細胞である請求項 1記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
3. 標的細胞が治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の細胞であ る請求項 2記載のォリゴヌクレオチド導入製剤。
4 . コラーゲンがァテ口コラーゲンである請求項 1〜 3のいずれかに記載のォ リゴヌクレオチド導入製剤。
5 . コラーゲンの分子量が約 3 0万〜約 9 0万である請求項 1〜4のいずれか に記載のォリゴヌクレオチド導入製剤。
6. 持続性製剤である請求項 1〜 5のいずれかに記載のォリゴヌクレオチド導 入製剤。
7 . オリゴヌクレオチドが 5量体以上 3 0量体以下の請求項 1〜 6の 、ずれか に記載のォリゴヌクレオチド導入製剤。
8 . オリゴヌクレオチドが D N Aあるいは D N A誘導体である請求項 6または 7記載のォリゴヌクレオチド導入製剤。
9 . オリゴヌクレオチドが R N Aあるいは R N A誘導体である請求項 6または 7記載のォリゴヌクレオチド導入製剤。
1 0 . D NA誘導体あるいは R NA誘導体が分子内に少なくとも 1つ以上のホ スホロチォエート結合を有する請求項 8または 9記載のオリゴヌクレオチド導入 製剤。
PCT/JP2001/005195 2000-06-20 2001-06-19 Preparations destinees au transfert d'oligonucleotides WO2001097857A1 (fr)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002503340A JP5118285B2 (ja) 2000-06-20 2001-06-19 オリゴヌクレオチド導入製剤
DE60142899T DE60142899D1 (de) 2000-06-20 2001-06-19 Verbindungen für den transfer von oligonukleotiden
AU2001264317A AU2001264317A1 (en) 2000-06-20 2001-06-19 Preparations for oligonucleotide transfer
US10/311,621 US20040052840A1 (en) 2000-06-20 2001-06-19 Preparations for oligonucleotide transfer
EP01938732A EP1295611B1 (en) 2000-06-20 2001-06-19 Oligonucleotide-transferring preparations
DK01938732.3T DK1295611T3 (da) 2000-06-20 2001-06-19 Oligonukleotid-transformerende forbindelser
AT01938732T ATE478688T1 (de) 2000-06-20 2001-06-19 Verbindungen für den transfer von oligonukleotiden
US12/486,703 US20090258933A1 (en) 2000-06-20 2009-06-17 Oligonucleotides-transferring preparations
US12/904,054 US20110028535A1 (en) 2000-06-20 2010-10-13 Oligonucleotides-transferring preparations

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000184502 2000-06-20
JP2000-184502 2000-06-20

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/486,703 Continuation US20090258933A1 (en) 2000-06-20 2009-06-17 Oligonucleotides-transferring preparations
US12/904,054 Continuation US20110028535A1 (en) 2000-06-20 2010-10-13 Oligonucleotides-transferring preparations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001097857A1 true WO2001097857A1 (fr) 2001-12-27

Family

ID=18684937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/005195 WO2001097857A1 (fr) 2000-06-20 2001-06-19 Preparations destinees au transfert d'oligonucleotides

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20040052840A1 (ja)
EP (1) EP1295611B1 (ja)
JP (1) JP5118285B2 (ja)
AT (1) ATE478688T1 (ja)
AU (1) AU2001264317A1 (ja)
DE (1) DE60142899D1 (ja)
DK (1) DK1295611T3 (ja)
ES (1) ES2349137T3 (ja)
PT (1) PT1295611E (ja)
WO (1) WO2001097857A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1550463A1 (en) * 2002-09-20 2005-07-06 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Preparation for facilitating site-specific gene conversion and preparation for gene therapy
WO2005061717A1 (ja) * 2003-12-19 2005-07-07 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 新規な核酸導入法
WO2006101173A1 (ja) * 2005-03-24 2006-09-28 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 核酸分子とコラーゲンの複合体微細粒子製剤
WO2006126600A1 (ja) * 2005-05-25 2006-11-30 National University Corporation Nagoya Universtiy 血管閉塞性疾患用医薬組成物
JP2009526544A (ja) * 2006-02-14 2009-07-23 バイオニア コーポレイション 乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法
US8742091B2 (en) 2001-06-20 2014-06-03 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method of promoting nucleic acid transfer

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW586934B (en) * 1997-05-19 2004-05-11 Sumitomo Pharma Immunopotentiating composition
ES2349137T3 (es) * 2000-06-20 2010-12-28 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Preparación para transferir oligonucleótidos.
US20100104631A1 (en) * 2001-08-13 2010-04-29 Lipella Pharmaceuticals Inc. Method of treatment for bladder dysfunction
US7838502B2 (en) * 2005-05-06 2010-11-23 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods to modulate H. influenzae pathogenesis
US20100166739A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-01 Lipella Paharmaceuticals Inc. Methods and Compositions for Diagnosing Urological Disorders
FR3066115B1 (fr) * 2017-05-10 2019-06-28 Universite de Bordeaux Comprimes de vecteurs d'acides nucleiques

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0412554A2 (en) * 1989-08-10 1991-02-13 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Sustained-release preparation for administration into brain
WO1995022611A2 (en) * 1994-02-18 1995-08-24 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for stimulating bone cells
WO1997002047A1 (fr) * 1995-07-03 1997-01-23 Koken Co., Ltd. Preparations de genes
WO1997015330A1 (en) * 1995-10-23 1997-05-01 Hyal Pharmaceutical Australia Limited Hyaluronic acid as dna carrier for gene therapy and vegf antisense dna to treat abnormal retinal vascularization

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5115094B2 (ja) * 1972-11-01 1976-05-14
US5069936A (en) * 1987-06-25 1991-12-03 Yen Richard C K Manufacturing protein microspheres
US5078997A (en) * 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5614587A (en) * 1988-11-21 1997-03-25 Collagen Corporation Collagen-based bioadhesive compositions
US5936035A (en) * 1988-11-21 1999-08-10 Cohesion Technologies, Inc. Biocompatible adhesive compositions
US5542935A (en) * 1989-12-22 1996-08-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic delivery systems related applications
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
FR2694895B1 (fr) * 1992-08-20 1994-11-10 Coletica Procédé de fabrication de microparticules en émulsion par modification de la composition chimique de la phase dispersée après émulsification.
US5646042A (en) * 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
ATE182336T1 (de) * 1993-05-28 1999-08-15 Chiron Corp Peptidinhibitoren der urokinaserezeptor-aktivität
WO1995007072A2 (de) * 1993-09-09 1995-03-16 Schering Aktiengesellschaft Wirkstoffe und gas enthaltende mikropartikel
CA2140053C (en) * 1994-02-09 2000-04-04 Joel S. Rosenblatt Collagen-based injectable drug delivery system and its use
US5583034A (en) * 1994-02-22 1996-12-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Enhancement of adoptosis using antisense oligonucleotides
US5844107A (en) * 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5563255A (en) * 1994-05-31 1996-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
AU2946295A (en) * 1994-06-27 1996-01-19 Johns Hopkins University, The Targeted gene delivery system
JP3867160B2 (ja) * 1995-07-03 2007-01-10 大日本住友製薬株式会社 遺伝子製剤
US6998268B2 (en) * 1995-07-03 2006-02-14 Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd. Gene preparations
EP1704878B1 (en) * 1995-12-18 2013-04-10 AngioDevice International GmbH Crosslinked polymer compositions and methods for their use
AU728146B2 (en) * 1996-03-14 2001-01-04 Immune Response Corporation, The Targeted delivery of genes encoding interferon
US6133437A (en) * 1997-02-13 2000-10-17 Apoptogen, Inc. Modulation of IAPs for the treatment of proliferative diseases
US5874006A (en) * 1996-10-31 1999-02-23 Matrix Pharmaceutical, Inc. Aseptic collagen concentration process
US6042820A (en) * 1996-12-20 2000-03-28 Connaught Laboratories Limited Biodegradable copolymer containing α-hydroxy acid and α-amino acid units
US6218112B1 (en) * 1996-12-23 2001-04-17 Cobra Therapeutics Limited Optimization of gene delivery and gene delivery system
US6737236B1 (en) * 1997-01-08 2004-05-18 Proligo, Llc Bioconjugation of macromolecules
US6524613B1 (en) * 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
US6537813B1 (en) * 1998-02-13 2003-03-25 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
CA2329129C (en) * 1998-05-22 2009-02-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Stable gene formulations comprising saccharides
EP1274410A2 (en) * 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
ES2349137T3 (es) * 2000-06-20 2010-12-28 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Preparación para transferir oligonucleótidos.
JP2002325572A (ja) * 2000-12-25 2002-11-12 Univ Osaka 外来物質の導入方法
CN1313158C (zh) * 2001-06-20 2007-05-02 大日本住友制药株式会社 促进核酸转移的方法
US7148342B2 (en) * 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
EP1551424B1 (en) * 2002-09-04 2015-07-01 Arrowhead Research Corporation Treatment of chronic neuropathic pain by admistration of dsrna
JPWO2004026343A1 (ja) * 2002-09-20 2006-01-12 住友製薬株式会社 部位特異的遺伝子変換促進剤および遺伝子疾患治療剤
AU2003291678B2 (en) * 2002-11-01 2009-01-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for siRNA inhibition of HIF-1 alpha
ATE477337T1 (de) * 2003-01-16 2010-08-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur sirna-hemmung von icam-1
US8227434B1 (en) * 2003-11-04 2012-07-24 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Materials and methods for treating oncological disorders
EP1720893B1 (en) * 2004-02-26 2014-08-13 Baylor Research Institute Compositions and methods for the systemic treatment of arthritis
ES2594083T3 (es) * 2004-09-28 2016-12-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligorribonucleótidos y métodos de uso de los mismos para tratamiento de la alopecia, insuficiencia renal aguda y otras enfermedades
EP1802350A4 (en) * 2004-10-22 2009-02-18 Univ Laval MODULATION OF NEUROTROPHIC BRAIN DERIVED FACTOR (BDNF) FROM NEVERROGIA IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF PAIN
US7585848B2 (en) * 2005-01-11 2009-09-08 Rush University Medical Center Methods and compositions for treating, inhibiting and reversing disorders of the intervertebral disc
EP1983823A1 (en) * 2006-01-17 2008-10-29 VIB vzw Inhibitors of prolyl-hydroxylase 1 for the treatment of skeletal muscle degeneration
JP5131927B2 (ja) * 2006-06-16 2013-01-30 大正製薬株式会社 Ｒｐｎ２遺伝子発現抑制剤の用途
RU2553561C2 (ru) * 2006-07-21 2015-06-20 Сайленс Терапьютикс Аг Средства ингибирования экспрессии протеинкиназы 3
US7825101B2 (en) * 2006-08-30 2010-11-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Modulation of MLCK-L expression and uses thereof
EP2069501A2 (en) * 2006-10-02 2009-06-17 Aprea Ab Rna interference against wrap53 to treat hyperproliferative diseases
US7812002B2 (en) * 2007-03-21 2010-10-12 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of NRF2 and methods of use thereof for treatment of cancer
RU2012127772A (ru) * 2009-12-04 2014-01-10 ОПКО ОФТЭЛМИКС, ЭлЭлСи Композиции и способы для ингибирования vegf

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0412554A2 (en) * 1989-08-10 1991-02-13 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Sustained-release preparation for administration into brain
WO1995022611A2 (en) * 1994-02-18 1995-08-24 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for stimulating bone cells
WO1997002047A1 (fr) * 1995-07-03 1997-01-23 Koken Co., Ltd. Preparations de genes
WO1997015330A1 (en) * 1995-10-23 1997-05-01 Hyal Pharmaceutical Australia Limited Hyaluronic acid as dna carrier for gene therapy and vegf antisense dna to treat abnormal retinal vascularization

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8742091B2 (en) 2001-06-20 2014-06-03 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method of promoting nucleic acid transfer
EP1550463A1 (en) * 2002-09-20 2005-07-06 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Preparation for facilitating site-specific gene conversion and preparation for gene therapy
EP1550463A4 (en) * 2002-09-20 2006-12-27 Dainippon Sumitomo Pharma Co PREPARATION FOR FACILITATING SITECOUS GENERAL TRANSFORMATION AND PREPARATION FOR GENDER THERAPY
WO2005061717A1 (ja) * 2003-12-19 2005-07-07 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 新規な核酸導入法
JP4954550B2 (ja) * 2003-12-19 2012-06-20 大日本住友製薬株式会社 新規な核酸導入法
WO2006101173A1 (ja) * 2005-03-24 2006-09-28 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 核酸分子とコラーゲンの複合体微細粒子製剤
WO2006126600A1 (ja) * 2005-05-25 2006-11-30 National University Corporation Nagoya Universtiy 血管閉塞性疾患用医薬組成物
JPWO2006126600A1 (ja) * 2005-05-25 2008-12-25 国立大学法人名古屋大学 血管閉塞性疾患用医薬組成物
JP2009526544A (ja) * 2006-02-14 2009-07-23 バイオニア コーポレイション 乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法
US9200027B2 (en) 2006-02-14 2015-12-01 Bioneer Corporation Dried oligonucleotide composition and method of producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1295611B1 (en) 2010-08-25
JP5118285B2 (ja) 2013-01-16
US20040052840A1 (en) 2004-03-18
DE60142899D1 (de) 2010-10-07
DK1295611T3 (da) 2010-10-04
US20110028535A1 (en) 2011-02-03
ATE478688T1 (de) 2010-09-15
AU2001264317A1 (en) 2002-01-02
PT1295611E (pt) 2010-09-14
EP1295611A1 (en) 2003-03-26
US20090258933A1 (en) 2009-10-15
EP1295611A4 (en) 2009-07-08
ES2349137T3 (es) 2010-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20110028535A1 (en) Oligonucleotides-transferring preparations
Xiao et al. Emerging mRNA technologies: delivery strategies and biomedical applications
Ochiya et al. Biomaterials for gene delivery atelocollagen-mediated controlled release of molecular medicines
Bonadio Tissue engineering via local gene delivery:: Update and future prospects for enhancing the technology
Li et al. Nonviral gene therapy
Conley et al. Nanoparticles for retinal gene therapy
US20070219118A1 (en) Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US20140348904A1 (en) Exosomes With Transferrin Peptides
Hosseinkhani et al. Biodegradable polymer-metal complexes for gene and drug delivery
CN110859817A (zh) 一种纳米颗粒载药系统及其制备方法和应用
Steinle et al. Delivery of synthetic mRNAs for tissue regeneration
Karim et al. Scope and challenges of nanoparticle-based mRNA delivery in cancer treatment
Zhou et al. Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules
KR20210009192A (ko) 항암활성을 갖는 면역조절 단백질-siRNA 복합체
KR100600464B1 (ko) 안정한 유전자 제제
Yu et al. Emerging frontiers in drug delivery with special focus on novel techniques for targeted therapies
Lei et al. Dual-RNA controlled delivery system inhibited tumor growth by apoptosis induction and TME activation
KR100718077B1 (ko) 만노스화 키토산 유도체 및 이를 이용한 유전자 전달체
Huang et al. Cellular Trafficking of Nanotechnology‐Mediated mRNA Delivery
Ogris Nucleic acid based therapeutics for tumor therapy
Khorsandi et al. Putting the sting back in STING therapy: novel delivery vehicles for improved STING activation
Shen et al. Efficient nucleus-targeted delivery of gene by nuclear localization signal peptides-mediated nanoparticles
Wong et al. Metal–Drug Coordination Nanoparticles and Hydrogels for Enhanced Delivery
Xin et al. mRNA-Based Cancer Therapy and Challenges
Wagner 2 Nanomedicines for targeted therapy

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2002 503340

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001938732

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001938732

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10311621

Country of ref document: US