WO2001036954A1 - Biodetecteur - Google Patents

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WO2001036954A1
WO2001036954A1 PCT/JP2000/008029 JP0008029W WO0136954A1 WO 2001036954 A1 WO2001036954 A1 WO 2001036954A1 JP 0008029 W JP0008029 W JP 0008029W WO 0136954 A1 WO0136954 A1 WO 0136954A1
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WO
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fine particles
reagent
electrode
biosensor according
layer
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Application number
PCT/JP2000/008029
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English (en)
French (fr)
Inventor
Koji Katsuki
Katsumi Hamamoto
Yuji Yagi
Takao Fukuoka
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray, Inc. filed Critical Arkray, Inc.
Priority to DE60025751T priority Critical patent/DE60025751T2/de
Priority to EP00974989A priority patent/EP1235068B1/en
Priority to JP2001538791A priority patent/JP4621839B2/ja
Publication of WO2001036954A1 publication Critical patent/WO2001036954A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor for electrochemically measuring a specific component in a sample solution such as blood.
  • a biosensor capable of simply and quickly quantifying the measurement target without diluting or stirring the sample liquid has been widely used.
  • an electrode system having a working electrode (also referred to as a measurement electrode) and a counter electrode is formed on an electrically insulating substrate by a method such as screen printing, and the measurement target is further formed on the electrode system. It can be produced by forming a reaction layer containing an oxidoreductase that reacts with a substance, an electron acceptor, and the like.
  • the object to be measured When a sample liquid containing the object to be measured is brought into contact with the reaction layer, the object to be measured is oxidized by the catalytic action of the oxidoreductase, and the electron acceptor is reduced at the same time.
  • the reduced electron acceptor is reoxidized by an electrochemical method, and the concentration of the measurement target in the sample liquid can be calculated from the oxidation current value obtained by the reoxidation.
  • a biosensor may cause a measurement error due to the physical properties of the sample liquid and the like.
  • a whole blood sample contains impurities such as solid components such as blood cells, soluble components such as lipids, proteins, and carbohydrates and insoluble components. These impurities are adsorbed on the electrode surface to reduce the area of the electrode surface, or the impurities impede the diffusion of the reagent to inhibit the enzymatic reaction, resulting in a decrease in the current value. it is conceivable that .
  • the hematocrit (H et) value which is the volume ratio of red blood cells to whole blood, varies greatly between individuals, and the above-mentioned effects on the biosensor also differed depending on the sample. The influence of such impurities can be mitigated, for example, by diluting the sample solution and then supplying the diluted sample solution to a biosensor. However, this requires time and effort and complicates the operation.
  • a biosensor in which an immobilized enzyme membrane containing a oxidoreductase and chitosan that are mutually charged are disposed on the detection surface of the electrode system (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-8) And a biosensor in which a layer containing microparticles of a water-soluble polymer compound containing an enzyme and conductive fine particles is arranged (Japanese Patent Publication No. 110-1132000) Publication) has been proposed.
  • these biosensors by providing the various layers as filtration membranes, the sample liquid is brought into contact with the electrode surface through the filtration membrane, and the impurities in the sample liquid are prevented from approaching the electrode surface. It is intended to reduce the influence of the impurities.
  • an object of the present invention is to provide a biosensor capable of measuring an object to be measured in a sample quickly, simply, and with high accuracy without being affected by impurities in the sample.
  • a biosensor of the present invention includes a substrate, a reagent layer containing a reagent, and an electrode system including a working electrode and a counter electrode, wherein the electrode system is disposed on the substrate, A biosensor having the reagent layer formed thereon, wherein the reagent layer further contains inorganic fine particles.
  • the present inventors have found that, in order to prevent the impurities from adhering to the electrode, a layer that becomes, for example, a gel or a zole by infiltration of a sample solution is formed on the electrode.
  • a layer that becomes, for example, a gel or a zole by infiltration of a sample solution is formed on the electrode. The following considerations have found what should be formed.
  • the above-mentioned hydrophilic polymer compound usually becomes a gel or a sol when it contains water.
  • a layer containing the hydrophilic polymer compound when a layer containing the hydrophilic polymer compound is formed, a sample liquid permeates into this layer, and water molecules of the sample solution swell the polymer compound to form a gel or the like. It takes a long time. In other words, the water molecules need to penetrate into the polymer structure in which the long main chain is entangled, but this involves the movement of the main chain, and the low molecular weight compound dissolves in water. This is thermodynamically disadvantageous. For this reason, it takes time to form a gel-like layer suitable for measurement by swelling. As a result, measurement time Also tend to be longer.
  • the hydrophilic polymer compound depending on the type of the hydrophilic polymer compound, depending on the type, there is a possibility that the hydrophilic polymer compound is partially dissolved by contact with the liquid, and therefore, the composition of the sample solution is altered and the adsorption of impurities to the electrode is sufficiently prevented. In some cases, it was not possible. Such a phenomenon is a problem that can generally occur regardless of whether the hydrophilic polymer compound is of natural origin or synthetic. Therefore, the present inventors have further studied and found that the inorganic fine particles easily swell due to the permeation of the sample solution, so that the reagent layer contains the inorganic fine particles to prevent the passage of impurities in the sample, It has been found that adhesion to the electrode surface can be prevented.
  • the inorganic fine particles are not affected by the humidity as described above. For this reason, for example, regardless of the physical properties of the sample such as hematocrit value in blood, it has been found that the sensitivity is prevented from deteriorating, and that measurement can be performed easily, quickly, and with high accuracy.
  • the reagent layer may be a single layer or a laminate including a reagent-containing layer containing the reagent and an inorganic fine particle-containing layer containing the inorganic fine particles. Good.
  • the inorganic fine particle-containing layer may be formed on the electrode system via the reagent-containing layer.
  • the reagent layer preferably contains an aggregate of inorganic fine particles.
  • the interaction between the fine particles can more sufficiently prevent the passage of impurities such as red blood cells.
  • the layer containing the inorganic fine particles is formed by applying a dispersion liquid in which the inorganic fine particles are dispersed on an electrode system and drying.
  • the dispersion may be, for example, a gel or a sol.
  • the formed layer has a structure including an aggregate of fine particles, and it is considered that the sample liquid permeates into the layer and the fine particles swell with water molecules, so that the gel-like sol is formed again. Since the inorganic fine particles can be easily dispersed in a solvent such as water, a thin film having a required thickness can be easily formed by appropriately preparing a dispersion having an appropriate concentration, coating the dispersion on an electrode system, and drying.
  • the content of the fine particles in the reagent layer or the fine particle-containing layer is preferably in the range of 0.14 to 14 mg / cm 2 , and the thickness of the layer is preferably It is preferably in the range of 0.05 to 3 im.
  • the inorganic fine particles are preferably swellable for the reasons described above. Further, it is preferable to use fine particles of a clay mineral, for example, a swellable layered gayate, preferably smectite, swellable mica and the like. As smectite, for example, hectrite, savonite, montmorillonite and the like are preferable, and as the swellable mica, for example, sodium fluoride tetra-gay mica, teniolite and the like are preferable.
  • a clay mineral for example, a swellable layered gayate, preferably smectite, swellable mica and the like.
  • smectite for example, hectrite, savonite, montmorillonite and the like are preferable
  • the swellable mica for example, sodium fluoride tetra-gay mica, teniolite and the like are preferable.
  • Smectite is, for example, a commercially available synthetic hectite, trade name Rabolite XLG and trade name Rabolite XLS ( Smect, which is a commercially available synthetic savonite, such as Lab. SA (manufactured by Kunimine Kogyo), Kunipia F (manufactured by Kunimine Kogyo), which is a commercially available purified natural montmorillonite, and the like can be used.
  • swellable mica examples include commercially available sodium fluoride 4 gay mica, trade name Na-TS (manufactured by Topy Industries), and commercially available teniolite. Certain trade names such as Li-i-TN (manufactured by Topy Industries).
  • the reagent layer further contains fine particles comprising a water-insoluble polymer compound (hereinafter, referred to as “water-insoluble fine particles”).
  • water-insoluble fine particles can further prevent impurities in the sample from adhering to the electrode.
  • the reagent layer may be a single layer as described above, or may be a laminate. In the case of a laminate, although not particularly limited, the water-insoluble fine particles are preferably contained in a reagent-containing layer. Further, a water-insoluble fine particle-containing layer containing the water-insoluble fine particles may be further included.
  • a reagent layer may be formed on the electrode via the fine particle-containing layer.
  • adsorption of impurities to the electrode can be further avoided, and the measurement target in the sample easily reacts with the reagent.
  • the water-insoluble fine particle-containing layer is formed on the electrode via the reagent layer.
  • the water-insoluble polymer compound does not contain impurities that cause electrolysis. Preferably, it is electrochemically inert.
  • the styrene derivative monomer include alkylstyrene.
  • urethane compounds such as polyurethane and polyurethane, polyolefin polymer compounds such as polyethylene and polypropylene, polyolefin derivatives such as polyvinyl chloride, and polyamide compounds can also be used.
  • inorganic compounds such as silica gel, alumina, zeolite, apatite, ceramics typified by glass and Elite, etc. It may be formed.
  • acrylic acid, methyl methacrylate, maleic acid, acrylate, methyl acrylate, maleate and styrene derivative monomers are more preferable because they are electrochemically inert.
  • a polymer or a copolymer containing at least one of the above Specifically, polymethacrylate (PMMA), polystyrene (PS), polyamide (PA) and the like are particularly preferable.
  • water-insoluble fine particles examples include commercially available Techpolymer bmx-5 (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., PMMA, spherical, particle size 5 m), and trade name Gantz Pearl GM_600 (Gantz Made in Kaseisha, PMMA, spherical, particle size 6 fim), trade name GANTS PEARLS GS-0800 (Gantz Kasei, crosslinked PS, spherical, particle size 8 m), trade name GANTS PEARL PS—8F (Gamma Chemical, PMMA, spherical, particle size 4 m), trade name Augazol 200 EXD NAT COS Type S (Elfa Tochem, Nylon, oblate, size 10 / xm), product Name Trefil E-506C (manufactured by Dow Corning Toray Silicone Co., Ltd., crosslinked silicone powder, spherical, particle size 10 m) Spherical, particle size l;
  • the average particle size of the water-insoluble fine particles is, for example, in the range of 0.1 to 45 ⁇ , preferably in the range of 0.5 to 30 jm, more preferably in the range of 1 to 20 m, and particularly preferably. Ranges from 3 to 15 m.
  • the average particle diameter can be determined, for example, by directly observing the water-insoluble fine particles using an electron microscope, measuring the particle diameter, and calculating an average value.
  • the number of particles measured is not particularly limited, but is, for example, 100 or more, preferably in the range of 100 to 300.
  • the particle size distribution of the water-insoluble fine particles is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.01 to 100 m, more preferably in the range of 0.05 to 60 m, It is particularly preferably in the range of 0.1 to 40 °.
  • the water-insoluble fine particles for example, a spherical shape, a flat spherical shape, and a fine particle formed by agglomeration of fine particles can be used.
  • a spherical shape is used. It is preferred that Further, the water-insoluble fine particles are electrically inactive, and it is desirable to change the particle size and the characteristics of the surface of the fine particles according to impurities to be removed.
  • fine particles formed from PS are preferable, and when it is desired to set the characteristics to be more hydrophilic than PS, the fine particles formed from ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ are used. Fine particles are preferred.
  • fine particles formed from PS or the like into which a carboxyl group is introduced are preferable, and when it is desired to be set to be positively charged, an amino group is introduced. Fine particles formed from PS or the like are preferred.
  • a surfactant-containing layer containing a surfactant is formed on the reagent layer.
  • a hydrophilic film is formed on the surface of the reagent layer, and the sample and the reagent are quickly and uniformly mixed.
  • the reaction proceeds quickly and reproducibility is improved.
  • the surfactant include a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, and a natural surfactant.
  • the natural surfactant include phospholipids, and preferably, lecithin such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated lecithin, and high-purity lecithin can be used.
  • the nonionic surfactant include polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester such as trade name Tween 20; trade name polyoxyethylene alkyl ether such as Triron X—100; trade name Triton X-405 and the like polyoxyethylene phenyl alkyl ether and the like. Of these, phospholipids are particularly preferred.
  • lecithin such as high-purity lecithin.
  • the electrode only needs to be able to be used for electrochemically detecting the reaction between the measurement object and the sample, and examples thereof include a conductive material.
  • a conductive material for example, a gold electrode, a carbon electrode, a silver electrode, a platinum electrode, a palladium electrode, etc.
  • the gold electrode and the carbon electrode are preferable because of their excellent electrical conductivity and chemical stability. And more preferably a carbon electrode.
  • the reagent is not particularly limited as long as it reacts with an object to be measured and the reaction can be detected electrochemically.
  • the reagent preferably contains an enzyme. Examples of the enzyme include oxidoreductase and the like.
  • the enzyme When the enzyme is an oxidoreductase, the enzyme preferably further contains an electron acceptor in the reaction of the enzyme.
  • the oxidoreductase can be appropriately determined, for example, depending on the type of the above-mentioned measurement target. Peptidase, pyranose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, fructose dehydrogenase, galactose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, pyrilyl oxidase Glucose, 6-phosphate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, acyl-CoA oxidase, choline oxidase, 4-hydroxybenzoate hydroxylase, maleate dehydrogenase,
  • the electron acceptor for example, potassium ferricyanide
  • P-Venzoquinone and its derivatives phenazine methosulfate, indophenol, 2,6-dichlorophenol indophenol and other indophenol derivatives, ⁇ -naphthoquinone-4-potassium sulphonate, fuecsen, huecchi Fe-mouth derivatives such as sencarboxylic acid, osmium complexes, ruthenium complexes, NAD + , NADP +, quinoline quinone quinone (PQQ), methylene butyl, etc. can be used. Among them, preferred are potassium ferricyanide, phlegmene, osmium complex, NAD +, NADP + and the like. The types and combinations of these reagents can be appropriately determined according to the measurement target.
  • the measurement sample is not particularly limited, but is useful for a sample containing impurities such as the soluble component, the insoluble component, and the solid component.
  • impurities include proteins, fats, carbohydrates, and blood cells.
  • the sample include biological samples such as whole blood, plasma, serum, saliva, urine, and cerebrospinal fluid; drinking water such as juice; foods such as soy sauce and sauce; Pool water is used Among them, preferred are whole blood, plasma, serum, saliva, cerebrospinal fluid, etc., and more preferred is whole blood.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor.
  • FIG. 3 is a sectional view showing another example of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing a relative relationship between a glucose concentration and a current value in one example of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing a relative relationship between a hematocrit value and a current value in the embodiment.
  • FIG. 1 is a perspective view schematically showing the biosensor
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line II of FIG.
  • this biosensor 1 has an electrode system including a substrate 11, a working electrode 12 having a lead portion 12a, and two counter electrodes 13 having a lead portion 13a, and a fine particle-containing layer. 21, a reagent-containing layer 22, a spacer 17 and a cover 19.
  • a detection unit 15 On one end (the right side in both figures) of the substrate 11, a detection unit 15 is provided, and the detection unit 15 has two counter electrodes 13 and a working electrode 12.
  • the substrates 11 are alternately arranged in parallel in the width direction.
  • the electrode led out from the detector 15 is the force between the leads 12a and 13a at the ends (left side in both figures). Is placed on top.
  • the lead portion 13 a which is one end of the counter electrode 13, is disposed at both ends in the width direction at the end (left side in both figures) of the substrate 11, and is one end of the working electrode 12.
  • the lead portion 12a is arranged at the center in the width direction.
  • a gap 14 is formed between the working electrode 12 and the counter electrode 13.
  • an insulating layer 16 is formed except for the lead portions 12 a and 13 a and the detecting portion 15, and the detecting portion in which the insulating layer 16 is not formed.
  • the inorganic fine particle-containing layer 21 and the reagent-containing layer 22 are laminated in this order.
  • a U-shaped spacer 17 in which a portion corresponding to the detection unit 15 is an opening 18 is disposed on the insulating layer 16. Further, a cover 19 having a through hole 20 in a part corresponding to the opening 18 is arranged on the spacer 17.
  • the space between the opening 18 and the space between the reagent-containing layer 22 and the cover 19 is a sample supply unit having a cabillary structure.
  • the through holes 20 serve as air holes for sucking the sample by capillary action.
  • the size of the biosensor 1 is not particularly limited and can be appropriately set depending on the amount of the sample to be supplied and the like.
  • the overall length is 15 to 40 mm
  • the overall width is 5 to 15 mm
  • the maximum thickness is 400 to 50. 0 / m
  • minimum thickness 100 to 200 m.
  • the size of the inorganic fine particle layer 21 is, for example, 5 to 10 mm in length, 0.5 to 1.5 mm in width, and 0.05 to 5 ⁇ m in thickness.
  • the size of the reagent-containing layer 22 is, for example, 5 to 10 mm in length, 0.5 to: L.5 mm, and the thickness of the insulating layer 16 is, for example, 10 to 50 zzm.
  • the thickness of the spacer 17 is, for example, 50 to 200 m, and the thickness of the cover 19 is, for example, 10 to 300 / zm.
  • the diameter of the air hole 20 is, for example, 0.5 to 1.5 mm.
  • the “length” of each part is a biosensor "Width" means the length in the width direction.
  • the content of the inorganic fine particles in the inorganic fine particle-containing layer 21 can be appropriately determined according to the type and amount of the sample to be supplied, the area of the detection unit 15 and the like.
  • the content per 1 cm 2 of the area is preferably in the range of 0.14 to 14 mg, and more preferably in the range of 0.28 to 8.4 mg.
  • the content is 0.14 mg or more per 1 cm 2 of area, for example, the passage of impurities such as blood cells and proteins in blood can be further prevented.
  • the response speed of the electrode is further excellent, and the current sensitivity is further improved.
  • the amount of the inorganic fine particles per area is related to the thickness of the inorganic fine particle-containing layer 21.
  • the thickness of the layer is preferably in the range of 0.05 to 5111.
  • the content of the reagent in the reagent-containing layer 22 is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of the reagent, the type of the sample, the amount thereof, and the like. Specifically, when GOD is used as the enzyme and ferricyanide chromium is used as the electron acceptor, the GOD is 0.2 to 1.0 U per area of lcm 2 , and the potassium ferricyanide is 0.4 to 3.6 mg. Is more preferable, and the GO D is more preferably in the range of 0.4 to 30 U and potassium ferricyanide in the range of 0.6 to 2.4 mg.
  • the amount of potassium ferricyanide is 0.4 mg or more per 1 cm 2 of area, the measurable range of glucose concentration can be set wider, and if it is 3.6 mg or less per 1 cm 2 of area, the formed reagent-containing layer Even better measurements are possible without cracking.
  • Such a biosensor 1 can be manufactured, for example, as described below.
  • a substrate 11 for forming the electrodes and the like is prepared.
  • Board 1 The first material is preferably an electrically insulating material, and examples thereof include plastic, glass, paper, and ceramics. Examples of the plastic include polyethylene terephthalate (PET), PS, PMMA, polypropylene (PP), acrylic resin, and glass epoxy.
  • an electrode system including a working electrode 12 and a counter electrode 13 is formed on the substrate 11.
  • the electrode is preferably a gold electrode, a carbon electrode, or the like, and can be formed by a known method such as a coating method, screen printing, or a vapor deposition method according to the type thereof.
  • the gold electrode can be formed by, for example, an evaporation method, a plating method, a gold foil sticking method, or the like.
  • the deposition method is, for example, by an ion plating method, vacuum 1. 3 3 X 1 0- 4 P a, input power 3 0 0 W, rate 5 X 1 0- / sec, under conditions of time 2 minutes,
  • a plastic sheet such as PET
  • a kiss cut device is used to make a cut in the gold foil layer deposited on the sheet.
  • the cut portion becomes the insulating portion 14, and the working electrode 12 and the counter electrode 13 can be formed.
  • a carbon ink can be formed on the substrate 11 by means of screen printing, coating, plating, or the like.
  • the surface of the electrode is subjected to a hydrophilic treatment before a reagent layer 16 described later is formed on the detection section 15.
  • a hydrophilic treatment before a reagent layer 16 described later is formed on the detection section 15.
  • the hydrophilization treatment can be appropriately determined according to the type of the electrode.
  • the electrode is a gold electrode, for example, the electrode may be immersed in a hydrophilizing solution such as a mercaptoethanol solution or a mercaptoethanolamine solution, and then washed and dried.
  • a hydrophilizing solution such as a mercaptoethanol solution or a mercaptoethanolamine solution
  • the solvent for the hydrophilizing solution include organic solvents such as ethanol, ethanol, acetone, and tetrahydrofuran.
  • the concentration of the above-mentioned hydrophilizing solution is, for example, in a range of 100 to 0.01 mmol / L, and preferably in a range of 50 to 0.05 mmo1 ZL.
  • an organic solvent such as ethanol, methanol, butanol, acetone, and tetrahydrofuran
  • a washing liquid such as purified water
  • the electrode is a carbon electrode
  • the electrode can be hydrophilized by, for example, immersing in a surfactant and then washing with purified water.
  • an insulating layer 16 is formed on the substrate 11 on which the electrode system is formed.
  • the insulating layer 16 can be formed, for example, by printing an insulating paste on the electrode and subjecting it to a heat treatment.
  • the insulating paste can be prepared, for example, by dissolving an insulating resin in a solvent.
  • the insulating resin include polyester, butyral resin, and phenol resin.
  • the solvent include carbitol acetate and a dibasic acid ester-based mixed solvent (DBE solvent).
  • the concentration of the insulating resin in the paste is preferably in the range of 65 to 100% by weight, more preferably in the range of 75 to 90% by weight, and particularly preferably in the range of 80 to 85% by weight. .
  • the insulating layer 16 can be formed by a method other than the printing method, for example, a method such as coating, film bonding, and etching.
  • the inorganic fine particle-containing layer 21 is formed on the detection unit 15 where the insulating layer 16 is not formed.
  • This can be formed, for example, by preparing a dispersion liquid in which inorganic fine particles are dispersed, injecting the dispersion liquid onto the detection unit 15 and drying the dispersion liquid. It is preferable to stir for 1 hour or more, more preferably for 5 hours or more, to prevent sedimentation. It is. For the same reason, it is preferable to continue stirring at the time of use.
  • the dispersion medium of the dispersion for example, water, alcohol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO) and the like can be used, and among them, ultrapure water is preferable.
  • the concentration of the inorganic fine particles in the dispersion is not particularly limited.
  • the means for drying is not particularly limited, and for example, methods such as natural drying, air drying, vacuum drying, and freeze vacuum drying can be employed. Further, these means may be combined.
  • the treatment conditions are preferably in a temperature range of 4 to 60 and a relative humidity in a range of 5 to 40%.
  • a reagent-containing layer 22 is formed on the inorganic fine particle-containing layer 21.
  • the reagent-containing layer 22 can be formed by preparing a solution containing the reagent, injecting the solution onto the inorganic fine particle-containing layer 21, and drying the solution.
  • the reagent for example, those described above can be used.
  • the solution can be prepared, for example, by sufficiently dissolving the reagent in a solvent.
  • the solvent is not particularly restricted but includes, for example, water, a buffer, an organic solvent such as ethanol, methanol, butanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and tetrahydrofuran.
  • the buffer include a phosphate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a Tris-HCl buffer, a good buffer, and the like, and the pH thereof is preferably in the range of 4 to 9, and more preferably. Ranges from 5 to 8.
  • the water include purified water, distilled water, and ultrapure water. Of these, ultrapure water is preferable because a highly accurate biosensor can be produced with extremely few impurities.
  • the concentration of the reagent is not particularly limited.
  • the concentration is preferably in the range of 10,000 to 10 KU / L, more preferably 5 KU / L.
  • the range is from 00 to 50 KU / L.
  • the range is preferably from 10 to 0.01 mo1 / L, and more preferably from 5 to 0.05 mo1ZL.
  • the method for injecting the solution onto the inorganic fine particle layer 21 is not particularly limited, and can be performed using, for example, an automatic drive type dispenser.
  • the injection amount of the solution can be appropriately determined depending on the size of the reagent-containing layer to be formed, the content of the reagent, the amount of the sample, and the like.
  • the means for drying the injected solution is not particularly limited, and for example, a method such as natural drying, air drying, reduced-pressure drying, or freeze-drying may be employed. Further, these means may be combined.
  • the conditions include, for example, a temperature range of 10 to 60, a relative humidity RH of 5 to 40%, and a time period of 1 to 30 minutes.
  • a spacer 17 is disposed on the insulating film 16. As shown, the spacer 17 has an opening 18 at a position corresponding to the reagent-containing layer 22.
  • a resin film tape can be used as a material of the spacer 17, for example. Also, with a double-sided tape, a cover to be described later can be easily bonded.
  • a spacer can be formed by, for example, a method such as resist printing.
  • the cover 19 is arranged on the spacer 17.
  • the material of the cover 19 is not particularly limited. For example, various plastics and the like can be used, and a transparent resin such as PET is preferable.
  • the biosensor 1 When the biosensor 1 thus manufactured is stored for a long period of time, it is preferable that the biosensor 1 be sealed and stored together with a desiccant such as molecular sieve, silica gel, calcium oxide or the like in order to prevent the influence of moisture.
  • a desiccant such as molecular sieve, silica gel, calcium oxide or the like in order to prevent the influence of moisture.
  • the biosensor 1 applies, for example, a predetermined voltage for a certain period of time.
  • the method of using the biosensor 1 will be described using an example in which the sample is whole blood, the measurement target is glucose, and the reagents are GOD and potassium ferricyanide.
  • the whole blood sample is brought into contact with one end of the opening 18 of the biosensor 1.
  • the opening 18 has a cavity structure as described above, and the cover 19 corresponding to the other end is provided with an air hole 20 so that the sample is sucked by capillary action. .
  • the sucked sample permeates the reagent-containing layer 22 provided on the detection unit 15.
  • the sample dissolves the GOD and the ferricyanidation rim in the reagent-containing layer 22, and the reagent reacts with the glucose in the sample.
  • Glucose in the sample is oxidized by GOD, and the electrons transferred by the oxidation reaction reduce potassium phyllocyanide to produce potassium pherocyanide.
  • the reaction liquid further reaches the lower inorganic fine particle-containing layer 21 and quickly penetrates between the aggregates of the inorganic fine particles to reach the electrode surface while swelling the inorganic fine particles without difficulty thermodynamically.
  • impurities such as erythrocytes contained in the reaction solution cannot pass between the swollen inorganic fine particles, and are retained in the inorganic fine particle-containing layer 21 to prevent adsorption to the electrode surface. It is.
  • a voltage is applied between the counter electrode 13 and the working electrode 12 by the voltage applying means, and the reduced potassium ferrosyanide in contact with the electrode is applied.
  • (Ferocyan ion) is electrochemically oxidized to potassium ferricyanide, and the oxidation current at that time is The electric signal is detected by means for measuring the electric signal via the lead portion 12a of the working electrode 12. Since the value of the peak of the oxidation current is proportional to the glucose concentration in the sample, the glucose value in the sample can be obtained by calculating the glucose concentration by the calculating means.
  • the reagent-containing layer 22 may further contain water-insoluble fine particles as described above.
  • the content of the water-insoluble fine particles in the reagent-containing layer can be appropriately determined according to the type thereof, the type of the sample, the amount thereof, and the like.
  • reagent-containing layer containing water-insoluble fine particles may be formed in the same manner as described above by preparing a solution containing the reagent and the water-insoluble fine particles.
  • the biosensor for measuring glucose is described, but the present invention is not limited to this.
  • the reagent can be appropriately determined according to the measurement target.
  • lactate oxidase can be used for a biosensor for measuring lactic acid
  • alcohol oxidase can be used for a biosensor for measuring alcohol
  • cholesterol oxidase can be used for a sensor for measuring cholesterol.
  • vilanose oxidase or glucose dehydrogenase can also be used as a reagent.
  • This embodiment is an example of the biosensor of the present invention having a surfactant-containing layer on a reagent-containing layer.
  • This biosensor is shown in the cross-sectional view of FIG. In the figure, the same parts as those in FIG. 2 are denoted by the same reference numerals.
  • the biosensor 3 has the same configuration as that of the first embodiment, except that a surfactant-containing layer 31 is laminated on the reagent-containing layer 22.
  • Providing the surfactant-containing layer 31 in this way not only allows the sample and the reagent to mix quickly and uniformly as described above, but also allows the sample liquid to be sucked in the cabillary structure more quickly and more reliably.
  • the content of the surfactant in the surfactant-containing layer 31 can be appropriately determined according to the type and amount of the sample to be supplied, the type of the surfactant, and the like.
  • the surfactant-containing layer 31 can be formed, for example, by preparing a solution containing various surfactants as described above, injecting the solution onto the formed reagent-containing layer 22 and drying the solution. .
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited, but is, for example, in the range of 0.1 to 1.0% by weight, and preferably in the range of 0.3 to 0.6% by weight.
  • a solvent for the solution for example, 1-butanol, 2-butanol, toluene, ethanol, methanol, DMF, DMSO and the like can be used.
  • 1-butanol lecithin may be used as a solvent, and the surfactant concentration may be in the range of 0.3 to 0.5% by weight. preferable.
  • a PET sheet manufactured by Toray
  • a carbon electrode system comprising a working electrode and a counter electrode each having a lead was formed on the surface of the substrate.
  • the carbon electrode was formed by patterning by screen printing.
  • the insulating resin polyester was dissolved in a solvent carbitol acetate to a concentration of 75% by weight to prepare an insulating paste, which was screen-printed on the electrode system.
  • the printing conditions were a 300 mesh screen, a squeegee pressure of 40 kg, and the amount of printing was 0.002 mL per 1 cm 2 of electrode area. No printing was performed on the detecting section 15 and the lead sections 12a and 13a.
  • an insulating layer 16 was formed by performing a heat treatment.
  • the heat treatment conditions were a temperature of 90 ⁇ and a time of 60 minutes.
  • an inorganic fine particle layer 21 was formed on the detection section 15 where the insulating layer 16 was not formed.
  • a dispersion (concentration: 0.2% by weight) prepared by dispersing smectite (trade name: Rabotite XL G; manufactured by Laport Industries) in purified water was prepared, and the dispersion 41 was detected by the method described above. Dispensed to Part 15 Then, immediately, drying treatment was performed at 5 Ot: for 10 minutes to form an inorganic fine particle-containing layer 21.
  • a reagent-containing layer 22 was formed on the inorganic fine particle-containing layer 21.
  • GOD and potassium ferricyanide were added to purified water and stirred at room temperature to prepare a reagent solution in which these were completely dissolved.
  • the concentration of GOD was 5000 U / mL, and the concentration of ferricyanation rim was 3% by weight. 2 L of this reagent solution was dispensed on the inorganic fine particle-containing layer 21 and dried at 50 at 10 minutes to form a reagent-containing layer 22.
  • a surfactant-containing layer 31 was formed on the reagent-containing layer 22.
  • a lecithin solution is prepared by dissolving egg yolk lecithin in a solvent such that the concentration becomes 0.5% by weight, and 2 L of this lecithin solution is The surfactant-containing layer 31 was formed by being dropped on the reagent-containing layer 22.
  • a PET spacer 17 (manufactured by Sony Chemical Co., Ltd.) having an opening 18 at a portion corresponding to the surfactant-containing layer 31 was disposed on the insulating layer 16.
  • a PET cover 19 manufactured by Toray Industries, Inc.) having a through hole 20 serving as an air hole was arranged on the spacer to produce a biosensor.
  • Example 1 instead of forming the inorganic fine particle-containing layer 21 on the detection unit 15 using smectite, a 0.25% by weight aqueous solution of carboxymethylcellulose 41 was dropped, and dried at 50 for 10 minutes.
  • a biosensor for measuring glucose was produced in the same manner as in Example 1 except that a water-absorbing polymer layer was formed.
  • the biosensors of Example 1 and Comparative Example 1 produced as described above were subjected to various tests described below.
  • aqueous glucose solution having a predetermined concentration 100, 200, 300, 400, 500, 600 mg / mL was prepared and used as a sample solution.
  • About 2 / zL of the sample solution was sucked from the openings of the biosensors by capillary action, and the reaction was performed for 25 seconds.
  • the current value was measured when a voltage of 50 OmV was applied for 5 seconds.
  • Figure 3 shows the results.
  • ⁇ indicates the result of the biosensor of Example 1, and indicates the result of the biosensor of Comparative Example 1.
  • the biosensor of Example 1 provided a current value approximately 1.2 times higher than that of the biosensor of the comparative example, and showed a high correlation with the glucose concentration.
  • Fig. 4 shows the result of expressing each measured value as a relative value (%) with the current value of a sample with a hematocrit (Ht) of 42% obtained by the biosensor of Example 1 being 100%. Show. In the figure, ⁇ indicates the result of the biosensor of Example 1, and the opening indicates the result of the biosensor of Comparative Example 1.
  • an aqueous dispersion (0.2% by weight) of a swellable sodium fluoride 4 gay mica (trade name: Na-TS; manufactured by Toby Industries) was used.
  • a biosensor for measuring glucose was produced in the same manner as in Example 1.
  • Glucose in a whole blood sample was measured using the biosensor of Example 2 and the biosensors of Example 1 and Comparative Example 1.
  • whole blood with a hematocrit value of 48% was used, and the current was measured in the same manner as described above.
  • a plasma obtained by centrifuging the same whole blood was prepared, and the current was measured for this as well.
  • Comparative Example 1 CMC 78.0 As shown in Table 1 above, the biosensors of Examples 1 and 2 had higher relative values than the biosensor of Comparative Example 1 and a current value close to that of the control was obtained. You can see that.
  • the measurement can be performed with high accuracy without being affected by the difference in physical properties between samples such as the hematocrit value.
  • the biosensor of the present invention since the reagent layer contains inorganic fine particles, it is possible to prevent impurities such as red blood cells from adhering to the electrode. For this reason, an object to be measured in a sample can be measured quickly, easily, and with excellent accuracy. Therefore, the biosensor of the present invention is useful, for example, in the field of clinical medicine and the like.

Description

明 細 書 バイオセンサ 技術分野
本発明は、 血液等の試料液中の特定成分を、 電気化学的に測定するバ ィォセンサに関する。 背景技術
従来、 特定の測定対象物を含む試料液について、 例えば、 試料液の希 釈ゃ攪拌等を行わずに、 簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバ ィォセンサが広く使用されている。 このようなバイオセンサは、 例えば 、 電気絶縁性の基板上に、 スクリーン印刷等の方法によって作用極 （測 定極ともいう） と対極とを有する電極系を形成し、 その上に、 前記測定 対象物と反応する酸化還元酵素および電子受容物質等を含む反応層を形 成することにより作製できる。 この反応層に、 前記測定対象物を含む試 料液を接触させると、 前記酸化還元酵素の触媒作用により、 前記測定対 象物が酸化され、 同時に前記電子受容物質が還元される。 前記還元され た電子受容物質を電気化学的手法により再酸化し、 これにより得られた 酸化電流値から前記試料液中の測定対象物の濃度が算出できる。
しかし、 このようなバイオセンサは、 試料液の物性等によって測定誤 差を生じる場合がある。 例えば、 全血試料には、 血球等の固形物、 脂質 、 タンパク質、 糖質等の可溶成分ゃ不溶成分等の不純物が含まれている 。 これらの不純物が電極表面に吸着することにより前記電極表面の面積 が減少したり、 前記不純物が前記試薬の拡散を妨げて酵素反応を阻害す ること等によって、 結果として電流値の減少が生じるためと考えられる 。 また、 全血に対する赤血球の容積比であるへマトクリット （H e t ) 値は、 個人差が大きいため、 検体によって、 バイオセンサに対する前述 のような影響にも差が見られた。 このような不純物による影響は、 例え ば、 前記試料液を希釈してからバイオセンサに供すること等により緩和 できるが、 これでは手間がかかり操作が煩雑になる。
そこで、 このような影響を回避するために、 例えば、 電極系の検出面 に、 互いに電荷結合した酸化還元酵素とキトサンとを含む固定化酵素膜 が配置されているバイオセンサ （特開平 9 - 8 0 0 1 0号公報） や、 酵 素を含有する、 水溶性高分子化合物のマイクロパーティクルと、 導電性 微粒子とを含む層が配置されたバイオセンサ （特公平 1 0— 1 1 3 2 0 0号公報） 等が提案されている。 これらのバイオセンサは、 前記各種層 を濾過膜として設けることにより、 前記濾過膜を介して、 試料液を電極 表面と接触させ、 前記試料液中の不純物が前記電極表面に接近すること を抑制し、 前記不純物による影響を低減しょうとするものである。
しかし、 このようなバイオセンサは、 測定を妨害する赤血球や蛋白質 等の不純物を濾別できるが、 一方では、 前記濾過膜を設けることにより 試料液の浸透が不均一になり、 電極表面が十分に濡れない場合があった 。 このため、 例えば、 電極上に気泡が残留して、 電極の有効な測定面積 が減少するために、 測定誤差が生じるという問題があった。 さらに、 試 料液の浸透に時間を要するため、 応答速度が遅いという問題もあった。 発明の開示
そこで、 このような問題を回避するために、 さらにデンプン系、 カル ボキシメチルセルロース （C M C ) 系、 ゼラチン系等の親水性高分子化 合物からなる層を設けたバイオセンサ （特公平 7 - 1 0 7 5 2 5号公報 ) が提案されている。 しかしながら、 このバイオセンサでは、 前記濾過膜を設けたバイオセ ンサにおける前記問題は解決されるものの、 水溶性高分子化合物を用い るため、 吸水性が高く湿度の影響を受け易くなり、 酵素反応が遅くなる という問題や、 前記層の形態が不安定であるという問題があった。 この ため、 測定精度の向上が困難であり、 測定にも時間がかかっていた。 そこで、 本発明の目的は、 試料中の不純物の影響を受けることなく、 前記試料中の測定対象物を、 迅速かつ簡便に、 高精度で測定できるバイ ォセンサの提供である。
前記課題を解決するため、 本発明のバイオセンサは、 基板、 試薬を含 有する試薬層、 および作用極と対極とを含む電極系を備え、 前記基板上 に電極系が配置され、 前記電極系の上に前記試薬層が形成されているバ ィォセンサであって、 前記試薬層がさらに無機微粒子を含有することを 特徴とする。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、 前記不純物の電極への付着を防 止するには、 試料液が浸透することによって、 例えば、 ゲル状またはゾ ル状になる層を、 電極上に形成すればよいことを、 以下の考察により見 出した。
前述の親水性高分子化合物も、 通常、 水分を含むことによってゲル状 またはゾル状となることは知られている。 しかしながら、 バイオセンサ において、 前記親水性高分子化合物を含む層を形成した場合、 この層に 試料液が浸透し、 前記試料液の水分子が前記高分子化合物を膨潤させて ゲル状等になるには、 長時間を要する。 つまり、 長大な主鎖が絡みあつ た高分子構造の中に、 前記水分子が浸透する必要があるが、 これには前 記主鎖の運動を伴うため、 低分子化合物が水に溶解するのに比べて熱力 学的に不利である。 このため、 膨潤することにより測定に適したゲル状 等の層となるには時間がかかるということである。 この結果、 測定時間 も長くなる傾向にある。 また、 親水性高分子化合物は、 種類によっては 、 液体との接触によって、 部分的に溶解するおそれもあり、 このため、 試料液の組成が変質したり、 不純物の電極への吸着を十分に防止できな い場合もあった。 このような現象は、 前記親水性高分子化合物が、 天然 由来であるか合成物であるかを問わず、 一般的に起り得る問題である。 そこで、 本発明者らは、 さらに検討を行った結果、 前記無機微粒子は 、 試料液の浸透によって容易に膨潤するため、 試薬層が無機微粒子を含 むことにより試料中の不純物の通過を妨げ、 前記電極表面への付着が防 止できることを見出した。 また、 無機微粒子は、 前述のような湿度によ る影響もない。 このため、 例えば、 血液におけるへマトクリット値等の 試料物性に関わらず、 感度低下が防止され、 容易かつ迅速に、 高精度で 測定することが可能になることを見出した。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬層は、 単層であってもよい し、 前記試薬を含有する試薬含有層と前記無機微粒子を含有する無機微 粒子含有層とを含む積層体であってもよい。
前記試薬層が前記積層体の場合、 前記電極系上に前記試薬含有層を介 して前記無機微粒子含有層が形成されてもよいが、 例えば、 より一層不 純物の電極への吸着を排除できることから、 前記電極系上に前記無機微 粒子含有層を介して前記試薬含有層が形成されることが好ましい。 本発明において、 前記試薬層が、 無機微粒子の凝集体を含有すること が好ましい。 このように無機微粒子が凝集体の状態であれば、 微粒子間 の相互作用により、 赤血球等の不純物の通過をより十分に防止できる。 また、 前記無機微粒子を含有する層 （前記試薬層または微粒子含有層 ) は、 電極系上に、 前記無機微粒子が分散された分散液を塗布し、 乾燥 することによって形成されていることが好ましい。 前記分散液は、 例え ば、 ゲル状であっても、 ゾル状であってもよい。 このような方法により 形成された層は、 微粒子の凝集体を含む構造であり、 試料液が前記層に 浸透し、 水分子により前記微粒子が膨潤することによって、 再度、 前記 ゲル状ゃゾル状になると考えられる。 前記無機微粒子は、 容易に水等の 溶媒に分散できるので、 適当な濃度の分散液を適宜調製し、 これを電極 系上に塗布し、 乾燥すれば、 必要な厚みの薄膜を容易に形成できる。 本発明において、 前記試薬層または微粒子含有層における微粒子の含 有量は、 面積 1 c m 2当たり 0 . 1 4〜： 1 4 . O m gの範囲であること が好ましく、 また、 前記層の厚みは 0 . 0 5〜 3 i mの範囲であること が好ましい。
前記無機微粒子としては、 前述のような理由から、 膨潤性であること が好ましい。 また、 粘土鉱物の微粒子であることが好ましく、 例えば、 膨潤性層状ゲイ酸塩があげられ、 好ましくはスメク夕イト、 膨潤性雲母 等である。 スメク夕イトとしては、 例えば、 ヘクトライ ト、 サボナイ ト 、 モンモリロナイ ト等が好ましく、 膨潤性雲母としては、 例えば、 ナト リウムフッ化四ゲイ素雲母、 テニオライ ト等が好ましい。 これらの無機 微粒子は、 いずれか一種類でもよいし、 二種類の混合物であってもよい スメクタイトとしては、 例えば、 市販の合成へクトライ トである、 商 品名ラボナイ ト X L Gおよび商品名ラボナイ 卜 X L S (それぞれラボ一 トインダストリ一社製）、商品名ルーセンタイ ト S W Nおよび商品名ルー センタイト S W F (コープケミカル社製） ならびに商品名チキソピー W (協和化学工業社製） 等、 市販の合成サボナイ トである商品名スメクト ン S A (クニミネ工業社製）、 市販の天然モンモリ口ナイ卜精製物である 商品名クニピア F (クニミネ工業社製） 等が使用できる。
また、 膨潤性雲母としては、 例えば、 市販のナトリウムフッ化 4ゲイ 素雲母である商品名 N a — T S (トピー工業製）、市販のテニォライ トで ある商品名 L i 一 T N (トピー工業製） 等があげられる。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬層が、 さらに非水溶性高分 子化合物からなる微粒子 （以下、 「非水溶性微粒子」という） を含んでい ることが好ましい。 この非水溶性微粒子により、 さらに試料中の不純物 が電極に付着することを回避できる。 この場合も、 前記試薬層は、 前述 と同様に単層でもよいし、 積層体でもよい。 積層体の場合、 特に制限さ れないが、 前記非水溶性微粒子は試薬含有層に含まれることが好ましい また、 前記非水溶性微粒子を含む非水溶性微粒子含有層をさらに含ん でもよい。 この場合、 電極上に前記微粒子含有層を介して試薬層が形成 されてもよいが、 例えば、 電極への不純物の吸着を一層回避でき、 前記 試料中の測定対象物と試薬とが反応し易いことから、 前記電極上に前記 試薬層を介して前記非水溶性微粒子含有層が形成されることが好ましい 本発明のバイオセンサにおいて、 前記非水溶性高分子化合物は、 電解 を起こす不純物を含まず、 電気化学的に不活性であることが好ましい。 具体的には、 例えば、 アクリル酸、 メタクリル酸、 マレイン酸、 ァクリ ル酸エステル、 メ夕クリル酸エステル、 マレイン酸エステル、 スチレン およびスチレン誘導体モノマ一のうち少なくとも一つを含む重合体もし くは共重合体等があげられる。 前記スチレン誘導体モノマーとしては、 例えば、 アルキルスチレン等があげられる。 また、 例えば、 ポリウレ夕 ン、 ポリウレァ等のウレタン化合物、 ポリエチレン、 ポリプロピレン等 のポリオレフィン系高分子化合物、 ポリ塩化ビニル等のポリオレフィン 誘導体、 およびポリアミ ド化合物等も使用できる。 また、 前記高分子化 合物以外に、 例えば、 シリカゲル、 アルミナ、 ゼォライ ト、 アパタイ ト 、 ガラスやエーライ ト等に代表されるセラミックス等の無機化合物から 形成されてもよい。 これらの中でも、 電気化学的に不活性であることか ら、 より好ましくは、 アクリル酸、 メ夕クリル酸、 マレイン酸、 ァクリ ル酸エステル、 メ夕クリル酸エステル、 マレイン酸エステルおよびスチ レン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合 体、 またはポリアミ ド系高分子化合物である。 具体的には、 ポリメタク リレート （PMMA)、 ポリスチレン （P S)、 ポリアミ ド （PA) 等が 特に好ましい。
このような非水溶性微粒子としては、 例えば、 市販の商品名テックポ リマー bmx— 5 (積水化成品工業社製、 PMMA、 球状、 粒径 5 m )、 商品名ガンツパール GM_ 0 6 0 0 (ガンツ化成社製、 PMMA、 球 状、 粒径 6 fim), 商品名ガンツパール G S - 0 8 0 5 (ガンツ化成社製 、 架橋 P S、 球状、 粒径 8 m)、 商品名ガンツパール P S— 8 F (ガン ッ化成社製、 PMMA、 球状、 粒径 4 m)、 商品名オーガゾル 2 0 0 2 EXD NAT COS Ty p e S (エルファ トケム社製、 ナイ ロン、 扁球状、 サイズ 1 0 /xm)、 商品名トレフィル E— 5 0 6 C (東レ ダウコーニングシリコーン社製、 架橋シリコーン末、 球状、 粒径 1 0 m)、 商品名サラミックス末 S N— E— 0 2 (宇部興産社製、 窒化ゲイ素 、 球状、 粒径 l ;um)、 商品名ゴッ トポール （鈴木油脂社製、 シリカ、 球 状、 粒径 1 0 zm)、 商品名ガラスビーズ （ポリサイエンス社製、 ライム ガラス、 球状、 粒径 3〜 1 0 /zm) 等が使用できる。
前記非水溶性微粒子の平均粒径は、 例えば、 0. 1〜4 5 μπιの範囲 であり、 好ましくは 0. 5〜 3 0 j mの範囲、 より好ましくは 1〜 2 0 mの範囲、 特に好ましくは 3〜 1 5 mの範囲である。 前記平均粒子 径が 0. 1 m以上であれば、 前記試薬層に試料が十分に浸透し易くな り、 バイオセンサの感度を向上できる。 また、 平均粒子径が 4 5 im以 下であれば、 前記試料中の不純物の影響を十分に排除することができる 前記平均粒径は、 例えば、 電子顕微鏡を用いて前記非水溶性微粒子を 直接観察し、 その粒径を測定して平均値を算出することにより求めるこ とができる。 微粒子の測定個数は特に制限されないが、 例えば、 1 0 0 個以上、 好ましくは 1 0 0〜 3 0 0個の範囲である。
また、 前記非水溶性微粒子の粒度分布は、 特に限定されないが、 0 . 0 1〜 1 0 0 mの範囲であることが好ましく、 より好ましくは 0 . 0 5〜 6 0 mの範囲であり、 特に好ましくは 0 . 1〜4 0 ΠΊの範囲で ある。
前記非水溶性微粒子は、 例えば、 球状、 扁球状、 微粒子が固まり球状 になったもの等も使用できるが、 前記非水溶性微粒子を含む層が均一か つ適度な疎密性を保持できることから、 球状であることが好ましい。 また、 前記非水溶性微粒子は、 電気的に不活性であり、 除去しようと する不純物に応じて粒径を変化させるとともに、 前記微粒子表面の特性 を変化させることが望ましい。 例えば、 非水溶性微粒子表面の特性を疎 水性に設定したい場合は、 P Sから形成された微粒子が好ましく、 P S よりも親水性に設定したい場合は、 Ρ Μ Μ Αや Ρ Α等から形成された微 粒子が好ましい。 また、 前記特性を負電荷を帯びるように設定したい場 合は、 カルボキシル基を導入した P S等から形成された微粒子が好まし く、 正電荷を帯びるように設定したい場合は、 アミノ基を導入した P S 等から形成された微粒子が好ましい。
本発明のバイオセンサにおいて、 さらに、 前記試薬層の上に界面活性 剤を含む界面活性剤含有層が形成されていることが好ましい。 このよう に前記界面活性剤含有層を設ければ、 前記試薬層表面に親水化膜が形成 され、 試料と試薬とが素早くかつ均一に混和する。 このため、 反応が迅 速に進み、 再現性も向上する。 前記界面活性剤としては、 例えば、 陽イオン性界面活性剤、 陰イオン 性界面活性剤、 両イオン性界面活性剤、 非イオン性界面活性剤、 天然型 界面活性剤等があげられ、 この中でも好ましくは、 陽イオン性界面活性 剤、 非イオン性界面活性剤、 天然型界面活性剤であり、 より好ましくは 非イオン性界面活性剤、 天然型界面活性剤である。 前記天然型界面活性 剤としては、 例えば、 リン脂質があげられ、 好ましくは、 卵黄レシチン 、 大豆レシチン、 水添レシチン、 高純度レシチン等のレシチン等が使用 できる。 また、 非イオン性界面活性剤としては、 例えば、 商品名 T w e e n 2 0等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 商品名 T r i r o n X— 1 0 0等のポリォキシエチレンアルキルエーテル、 商品 名 T r i t o n X - 4 0 5等のポリオキシエチレンフエニルアルキルェ 一テル等があげられる。 これらの中でも特に好ましくはリン脂質であり
、 最も好ましくは、 高純度レシチン等のレシチンである。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記電極としては、 測定対象物と試 料との反応を電気化学的に検出するのに使用できればよく、 例えば、 導 電性材料があげられる。 具体的には、 例えば、 金電極、 カーボン電極、 銀電極、 白金電極、 パラジウム電極等であり、 この中でも、 電気伝導性 および化学的安定性に優れることから、 金電極、 カーボン電極が好まし く、 より好ましくはカーボン電極である。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記試薬は、 測定対象物と反応し、 その反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されないが、 例えば、 酵素を含むことが好ましい。 前記酵素としては、 例えば、 酸化 還元酵素等があげられる。
また、 前記酵素が酸化還元酵素の場合、 さらに前記酵素の反応におけ る電子受容体を含むことが好ましい。 前記酸化還元酵素は、 例えば、 前 記測定対象物の種類により適宜決定でき、 具体的には、 グルコースォキ シダ一ゼ、 ピラノ一スォキシダーゼ、 グルコースデヒドロゲナーゼ、 乳 酸ォキシダーゼ、 乳酸デヒドロゲナーゼ、 フルクトースデヒドロゲナ一 ゼ、 ガラクトースォキシダーゼ、 コレステロールォキシダーゼ、 コレス テロールデヒドロゲナーゼ、 アルコールォキシダーゼ、 アルコールデヒ ドロゲナ一ゼ、 ピリルビン酸ォキシダ一ゼ、 グルコース— 6—リン酸デ ヒドロゲナーゼ、 アミノ酸デヒドロゲナ一ゼ、 ギ酸デヒドロゲナーゼ、 グリセロールデヒドロゲナーゼ、 ァシル— C o Aォキシダーゼ、 コリン ォキシダーゼ、 4—ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、 マレイン酸 デヒドロゲナーゼ、 サルコシンォキシダーゼ、 ゥリカーゼ等があげられ る。
また、 前記電子受容体としては、 例えば、 フェリシアン化カリウム、
P—べンゾキノンおよびその誘導体、 フエナジンメトサルフェート、 ィ ンドフエノール、 2， 6 —ジクロロフェノールインドフエノール等のィ ンドフエノール誘導体、 β —ナフトキノン— 4—スルホン酸力リウム、 フエ口セン、 フエ口センカルボン酸等のフエ口セン誘導体、 ォスニゥム 錯体、 ルテニウム錯体、 N A D +、 N A D P +、 ピロ口キノリンキノン （ P Q Q )、 メチレンブル一等が使用できる。 この中でも好ましくはフェリ シアン化カリウム、 フエ口セン、 ォスニゥム錯体、 N A D +、 N A D P + 等である。 これらの試薬の種類およびその組み合わせは、 測定対象物に 応じて適宜決定できる。
本発明のバイオセンサにおいて、 前記測定試料は特に制限されないが 、 例えば、 前記可溶性成分、 不溶性成分、 固形成分等の不純物を含む試 料に対して有用である。 前記不純物としては、 例えば、 タンパク質、 脂 質、 糖質、 血球等があげられる。 前記試料としては、 具体的に、 例えば 、 全血、 血漿、 血清、 唾液、 尿、 髄液等の生体試料や、 ジュース等の飲 料水、 醤油、 ソース等の食品類等、 排水、 雨水、 プール用水等が使用で き、 この中でも好ましくは全血、 血漿、 血清、 唾液、 髄液等であり、 よ り好ましくは全血である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のバイオセンサの一例を示す斜視図である。
図 2は、 前記バイオセンサの断面図である。
図 3は、 本発明のバイォセンサのその他の例を示す断面図である。 図 4は、 本発明の一実施例における、 グルコース濃度と電流値との相 対関係を示すグラフである。
図 5は、 前記実施例における、 へマトクリット値と電流値との相対関 係を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
(実施形態 1 )
図 1および図 2に本発明のバイオセンサの一例を示す。 図 1は、 前記 バイオセンサを模式的に表した斜視図であり、 図 2は、 図 1の I 一 I方 向断面図である。
図示のように、 このバイオセンサ 1は、 基板 1 1、 リード部 1 2 aを 有する作用極 1 2とリード部 1 3 aを有する二つの対極 1 3とから構成 された電極系、 微粒子含有層 2 1、 試薬含有層 2 2、 スぺ一サー 1 7お よびカバ一 1 9を備えている。 基板 1 1の一方の端部 （両図において右 側） 上には、 検出部 1 5が設けられており、 検出部 1 5には、 二つの対 極 1 3と作用極 1 2とが、 基板 1 1の幅方向に並行な状態で、 交互に配 置されている。 検出部 1 5から導出している電極は、 端部 （両図におい て左側） のリード部 1 2 a、 1 3 aとの間力 屈曲した状態で基板 1 1 上に配置されている。 そして、 対極 1 3の一端であるリード部 1 3 aは 、 基板 1 1の前記端部 （両図において左側） において、 幅方向両端にそ れぞれ配置され、 作用極 1 2の一端であるリード部 1 2 aは、 前記幅方 向中央に配置されている。 また、 作用極 1 2と対極 1 3との間には、 絶 緣部 1 4が形成されている。 このような電極系の上には、 リード部 1 2 a, 1 3 aおよび検出部 1 5を除いて、 絶緣層 1 6が形成されており、 絶緣層 1 6が形成されていない前記検出部 1 5上には、 無機微粒子含有 層 2 1および試薬含有層 22がこの順序で積層されている。 そして、 絶 縁層 1 6の上には、 前記検出部 1 5に対応する箇所が開口部 1 8になつ ているコの字状のスぺーサー 1 7が配置されている。 さらにスぺ一サー 1 7の上には、 開口部 1 8に対応する一部に貫通孔 2 0を有するカバ一 1 9が配置されている。 このバイオセンサ 1において、 開口部 1 8の空 間部分であり、 かつ、 前記試薬含有層 2 2とカバ一 1 9とに挟まれた空 間部分が、 キヤビラリ一構造である試料供給部となる。 そして、 前記貫 通孔 2 0が、 試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
このバイオセンサ 1の大きさは、 特に制限されず、 供給する試料の量 等により適宜設定できるが、 例えば、 全体長さ 1 5〜40mm、 全体幅 5〜 1 5 mm, 最大厚み 400〜5 0 0 / m、 最小厚み 1 0 0〜 2 0 0 mである。
前記無機微粒子層 2 1の大きさは、 例えば、 長さ 5〜1 0mm、 幅 0 . 5〜1. 5mm、 厚み 0. 0 5〜 5 ^ mである。 試薬含有層 2 2の大 きさは、 例えば、 長さ 5〜1 0mm、 幅 0. 5〜： L . 5 mmであり、 絶 縁層 1 6の厚みは、 例えば、 1 0〜 5 0 zzmであり、 スぺ一サー 1 7の 厚みは、 例えば、 50〜 2 00 mであり、 カバ一 1 9の厚みは、 例え ば、 1 0〜 300 /zmである。 また、 空気孔 2 0の直径は、 例えば、 0 . 5 ~ 1. 5mmである。 なお、 各部位の 「長さ」 とは、 バイオセンサ の長手方向の長さをいい、 「幅」とは、 幅方向の長さをいう。
無機微粒子含有層 2 1における無機微粒子の含有量は、 供給する試料 の種類やその量、 検出部 1 5の面積等に応じて適宜決定できる。
例えば、 前記無機微粒子がスメク夕イ トの場合、 面積 l cm2当たり の含有量は、 0. 14〜 1 4mgの範囲が好ましく、 より好ましくは 0 . 2 8〜8. 4mgの範囲である。 前記含有量が面積 1 cm2当たり 0 . 14mg以上であれば、 例えば、 血液中の血球やタンパク質等の不純 物が通過することを、 より一層防止できる。 また、 面積 l cm2当たり 14mg以下であれば、 電極の応答速度がより一層優れ、 電流感度がさ らに向上する。
なお、 前記面積当たりの無機微粒子の量は、 無機微粒子含有層 2 1の 厚みに関係しており、 前述のように、 層の厚みは、 0. 0 5〜5 111の 範囲が好ましい。
前記試薬含有層 2 2における試薬の含有量は、 特に制限されず、 試薬 の種類、 試料の種類やその量等に応じて適宜決定できる。 具体的には、 酵素として GOD、 電子受容体としてフェリシアン化力リゥムを使用す る場合、 面積 l c m2当たり GOD 0. 2〜； 1 0 0 U、 フェリシアン 化カリウム 0. 4〜3. 6mgの範囲が好ましく、 より好ましくは GO D 0. 4〜 3 0 U、 フェリシアン化カリウム 0. 6〜2. 4mgの範 囲である。
フェリシアン化カリウムの量が、 面積 l cm2当たり 0. 4mg以上 であれば、 グルコース濃度の測定可能範囲を広く設定でき、 また、 面積 l cm2当たり 3. 6mg以下であれば、 形成した試薬含有層にひび割 れが生じることもなく、 一層優れた測定が可能である。
このようなバイオセンサ 1は、 例えば、 以下に示すようにして製造で きる。 まず、 前記電極等を形成するための基板 1 1を準備する。 基板 1 1の材料としては、 電気絶縁性材料であることが好ましく、 例えば、 プ ラスチック、 ガラス、 紙、 セラミックス等があげられる。 前記プラスチ ックとしては、 例えば、 ポリエチレンテレフ夕レート （P ET)、 P S、 PMMA、 ポリプロピレン （P P)、 アクリル樹脂、 ガラスエポキシ等が あげられる。
つぎに、 前記基板 1 1上に、 作用極 1 2および対極 1 3からなる電極 系を形成する。 前記電極としては、 前述のように、 金電極やカーボン電 極等が好ましく、 その種類に応じて、 例えば、 コーティング法、 スクリ ーン印刷、 蒸着法等の公知の方法により形成できる。
前記金電極は、 例えば、 蒸着法、 メツキ法、 金箔貼付法等により形成 できる。 前記蒸着法は、 例えば、 イオンプレーティング法により、 真空 度 1. 3 3 X 1 0— 4P a、 入力パワー 3 0 0 W、 レート 5 X 1 0— /秒、 時間 2分の条件で、 例えば、 P E Tなどのプラスチックシート上 に金を蒸着して、 さらにキスカッ ト装置を用いて、 前記シート上に蒸着 された金箔層に切れ目を入れる方法である。 これにより、 切れ目部分が 絶緣部 14となり、 作用極 1 2および対極 1 3が形成できる。
また、 カーボン電極の場合は、 例えば、 カーボンインキを前記基板 1 1上にスクリーン印刷する手段、 コーティングする手段、 メツキ手段等 により形成できる。
前記電極は、 検出部 1 5に後述する試薬層 1 6を形成する前に、 その 表面を親水化処理することが好ましい。 これにより電極表面が疎水性で あっても親水化されるため、 前記試薬層を均一に形成し易くなる。
親水化処理は、 電極の種類に応じて適宜決定できる。 前記電極が金電 極の場合、 例えば、 メルカプトエタノール溶液、 メルカプトエタノール ァミン溶液等の親水化溶液に前記電極を浸漬後、 洗浄 ·乾燥すればよい 前記親水化溶液の溶媒としては、 例えば、 エタノール、 ブ夕ノール、 アセトン、 テトラヒドロフラン等の有機溶剤等があげられる。 また、 前 記親水化溶液の濃度は、 例えば、 1 00〜0. 0 1 mmo l /Lの範囲 であり、 好ましくは 50〜0. 0 5mmo 1 ZLの範囲である。 また、 洗净には、 例えば、 エタノール、 メタノール、 ブタノール、 アセトン、 テトラヒドロフラン等の有機溶剤、 精製水等の洗浄液が使用できる。 また、 電極がカーボン電極の場合は、 例えば、 界面活性剤に浸潰して から精製水で洗浄する方法等により親水化処理できる。
次に、 前記電極系を形成した基板 1 1上に絶縁層 1 6を形成する。 絶 縁層 1 6は、 例えば、 絶縁性ペーストを電極上に印刷し、 これを加熱処 理して形成することができる。
前記絶縁性ペーストは、 例えば、 絶縁性樹脂を溶媒に溶解させて調製 できる。 前記絶縁性樹脂としては、 例えば、 ポリエステル、 プチラール 樹脂、 フエノール樹脂等があげられ、 前記溶媒としては、 例えば、 カル ビトールアセテート、 二塩基酸エステル系混合溶剤 （D B Eソルベント ) 等があげられる。 前記ペーストにおける前記絶縁性樹脂の濃度は、 6 5〜 1 00重量％の範囲が好ましく、 より好ましくは 7 5〜 90重量％ の範囲であり、 特に好ましくは 80〜8 5重量％の範囲である。
また、 前記絶緣層 1 6は、 前記印刷法以外に、 例えば、 コーティング 、 膜はりつけ、 エッチング等の方法によっても形成できる。
つぎに、 絶緣層 1 6を形成していない検出部 1 5に無機微粒子含有層 2 1を形成する。 これは、 例えば、 無機微粒子が分散された分散液を調 製し、 これを検出部 1 5上に注入し、 乾燥させることにより形成できる 前記無機微粒子の分散液は、 分散している無機微粒子の沈降を防ぐた めに、 1時間以上攪拌することが好ましく、 より好ましくは 5時間以上 である。 また、 同様の理由から、 使用時に攪拌を続けることが好ましい
。 前記分散液の分散媒としては、 例えば、 水、 アルコール、 N， N—ジ メチルホルムアミ ド （DMF)、 ジメチルスルホキシド （DMS O) 等が 使用でき、 この中でも好ましくは超純水である。 前記分散液中の無機微 粒子の濃度は、 特に制限されない。
乾燥の手段は、 特に制限されないが、 例えば、 自然乾燥、 風乾、 減圧 乾燥、 凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。 また、 これらの手段を組合 わせてもよい。 その処理条件は、 温度 4〜6 0での範囲が好ましく、 相 対湿度 RH 5〜40 %の範囲が好ましい。
つぎに、 前記無機微粒子含有層 2 1の上に、 試薬含有層 2 2を形成す る。
この試薬含有層 22は、 前記試薬を含有する溶液を調製して、 これを 前記無機微粒子含有層 2 1上に注入し、 乾燥することによって形成でき る。 前記試薬としては、 例えば、 前述のようなものが使用できる。
前記溶液は、 例えば、 試薬を溶媒に十分に溶解させて調製できる。 前 記溶媒としては、 特に制限されないが、 例えば、 水、 緩衝液、 エタノー ル、 メタノール、 ブ夕ノール、 ジメチルスルホキシド （DMSO) およ びテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用できる。 前記緩衝液として は、 例えば、 リン酸緩衝液、 クェン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 トリス塩酸 緩衝液、 グッド緩衝液等があげられ、 その pHは、 4〜 9の範囲が好ま しく、 より好ましくは 5〜 8の範囲である。 また、 水としては、 例えば 、 精製水、 蒸留水、 超純水等があげられ、 この中でも不純物が極めて少 なく高精度のバイオセンサが作製可能であることから超純水が好ましい 前記溶液中の試薬の濃度は、 特に制限されないが、 例えば、 酵素の場 合、 1 0， 000〜 1 0 KU/Lの範囲が好ましく、 より好ましくは 5 0 0 0〜 5 0 K U / Lの範囲である。 さらに、 電子受容体を含む場合、 1 0〜0 . 0 1 m o 1 / Lの範囲が好ましく、 より好ましくは 5〜0 . 0 5 m o 1 Z Lの範囲である。
前記溶液を無機微粒子層 2 1の上に注入する方法は、 特に制限されず 、 例えば、 自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。
前記溶液の注入量は、 形成する試薬含有層の大きさ、 試薬の含有量、 試料の量等により適宜決定できる。
注入した前記溶液の乾燥手段は、 特に制限されないが、 例えば、 自然 乾燥、 風乾、 減圧乾燥、 凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。 また、 こ れらの手段を組合わせてもよい。
温風乾燥の場合、 その条件としては、 例えば、 温度 1 0〜6 0 の範 囲、 相対湿度 R H 5〜4 0 %の範囲、 時間 1〜 3 0分の範囲である。 つぎに、 絶縁膜 1 6上にスぺーサ一 1 7を配置する。 なお、 図示のよ うに、 スぺーサ一 1 7は、 前記試薬含有層 2 2に対応する箇所が開口部 1 8となっている。
前記スぺ一サー 1 7の材料としては、 例えば、 樹脂製フィルムゃテー プ等が使用できる。 また、 両面テープであれば、 後述するカバーを容易 に接着できる。 この他にも、 例えば、 レジスト印刷等の手段によりスぺ 一サーを形成できる。
つぎに、 前記スぺーサ一 1 7上にカバー 1 9を配置する。 前記カバー 1 9の材料としては、 特に制限されないが、 例えば、 各種プラスチック 等が使用でき、 好ましくは、 P E T等の透明樹脂があげられる。
このようにして作製したバイオセンサ 1は、 長期間保存する場合、 湿 気の影響を防ぐため、 例えば、 モレキュラーシ一ブ、 シリカゲル、 酸化 カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。
前記バイオセンサ 1は、 例えば、 ある一定の時間で所定の電圧を加え る手段、 バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、 前記電 気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測 定機器と組み合せて使用できる。
このバイオセンサ 1の使用方法について、 試料が全血、 測定対象物が グルコース、 試薬が G O Dおよびフェリシアン化カリウムである例をあ げて説明する、
まず、 全血試料をバイオセンサ 1の開口部 1 8の一端に接触させる。 この開口部 1 8は、 前述のようにキヤビラリ一構造となっており、 その 他端に対応するカバー 1 9には空気孔 2 0が設けられているため、 毛管 現象により前記試料が吸引される。 吸引された前記試料は、 検出部 1 5 上に設けられた試薬含有層 2 2に浸透する。 そして、 試料は、 試薬含有 層 2 2中の G O Dおよびフェリシアン化力リゥムを溶解し、 これらの試 薬と試料中のグルコースとが反応する。 試料中のグルコースは、 G O D により酸化され、 その酸化反応により移動した電子によって、 フエリシ アン化カリウムが還元され、 フエロシアン化カリウム （フエロシアンィ オン） が生成される。
この反応液は、 さらに下層の無機微粒子含有層 2 1に達し、 無機微粒 子の凝集体の間を速やかに浸透して、 熱力学的に無理なく無機微粒子を 膨潤させながら、 電極表面に到達する。 一方、 反応液中に含まれる赤血 球等の不純物は、 膨潤した無機微粒子の間を通過することができないた め、 この無機微粒子含有層 2 1に保持され、 電極表面への吸着が防止さ れる。
そして、 全血試料の供給から一定時間経過後、 前記電圧を加える手段 により対極 1 3と作用極 1 2との間に電圧を印加して、 電極と接触して いる前記還元型のフエロシアン化カリウム （フエロシアンイオン） を電 気化学的にフェリシアン化カリウムに酸化し、 その際の酸化電流を、 作 用極 1 2のリード部 1 2 aを介して前記電気信号を測定する手段等によ つて検出する。 この酸化電流のピークの値は、 試料中のグルコース濃度 に比例するため、 これを前記演算手段によりグルコース濃度に演算すれ ば、 試料中のグルコース濃度を求めることができる。
このようなバイオセンサによれば、 前述のように、 試料中の不純物が 電極に吸着することがないため、 感度の低下が防止され、 高精度に測定 できる。
このバイオセンサ 1は、 例えば、 前記試薬含有層 2 2が、 さらに前述 のような非水溶性微粒子を含有してもよい。 前記試薬含有層における前 記非水溶性微粒子の含有量は、 その種類、 試料の種類やその量等に応じ て適宜決定できる。
このような非水溶性微粒子を含む試薬含有層の形成は、 前記試薬およ び前記非水溶性微粒子を含む溶液を調製し、 前述と同様にして形成すれ ばよい。
本実施形態においては、 グルコース測定用バイオセンサの一例を示し たが、 これには制限されず、 例えば、 測定対象物に応じて試薬を適宜決 定できる。 具体的には、 例えば、 乳酸測定用バイオセンサの場合はラク テートォキシダ一ゼ、 アルコール測定用バイオセンサの場合はアルコー ルォキシダーゼ、 コレステロール測定用センサの場合はコレステロール ォキシダ一ゼ等が使用できる。 また、 グルコース測定用バイオセンサの 場合、 例えば、 ビラノースォキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼ 等も試薬として使用できる。
(実施形態 2 )
この実施形態は、 試薬含有層上に界面活性剤含有層を有する本発明の バイオセンサの一例である。 このバイオセンサを図 3の断面図に示す。 同図において、 図 2と同一部分には同一符号を付している。 図示のように、 このバイオセンサ 3は、 試薬含有層 22の上に界面活 性剤含有層 3 1が積層されている以外は、 前記実施形態 1と同様の構成 である。 このように前記界面活性剤含有層 3 1を設ければ、 前述のよう に試料と試薬とが素早くかつ均一に混和するだけでなく、 キヤビラリ一 構造内における試料液の吸引をより迅速、 且つ確実に行うことができる この界面活性剤含有層 3 1における界面活性剤の含有量は、 供給する 試料の種類やその量、 界面活性剤の種類等の応じて適宜決定できる。
この界面活性剤含有層 3 1は、 例えば、 前述のような各種界面活性剤 を含む溶液を調製し、 この溶液を、 形成した試薬含有層 2 2の上に注入 し、 乾燥することにより形成できる。 前記界面活性剤の濃度は、 特に制 限されないが、 例えば、 0. 1〜 1. 0重量％の範囲であり、 好ましく は、 0. 3〜0. 6重量％の範囲である。 溶液の溶媒としては、 例えば 、 1—ブ夕ノール、 2—ブ夕ノール、 トルエン、 エタノール、 メタノー ル、 DMF、 DMSO等が使用できる。 具体的には、 例えば、 界面活性 剤として卵黄レシチンを用いる場合は、 溶媒として 1—ブタノールレシ チンを使用し、 界面活性剤濃度を 0. 3〜0. 5重量％の範囲とするこ とが好ましい。 実施例
(実施例 1 )
以下に示すようにして、 前記図 3と同じ構造であるグルコース測定用 バイオセンサを作製した。
まず、 基板 1 1として P ETシート （東レ社製） を準備し、 その一方 の表面に、 リード部をそれぞれ有する作用極および対極からなるカーボ ン電極系を形成した。 前記カーボン電極は、 スクリーン印刷により、 パ ターニングして形成した。
つぎに、 絶縁性樹脂ポリエステルを、 濃度 7 5重量％になるように溶 媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、 これ を前記電極系上にスクリーン印刷した。 印刷条件は、 3 0 0メッシュス クリーン、 スキージ圧 40 k gであり、 印刷する量は、 電極面積 l cm 2当たり 0. 002mLとした。 なお、 検出部 1 5上と、 リード部 1 2 a , 1 3 a上には、 印刷を行わなかった。 そして、 加熱処理することに より絶縁層 1 6を形成した。 加熱処理の条件は、 温度 90^、 時間 60 分とした。
続いて、 前記絶縁層 1 6を形成しなかった前記検出部 1 5上に、 無機 微粒子層 2 1を形成した。 まず、 スメク夕イ ト （商品名ラボナイ ト XL G ； ラポートインダストリ一社製） を精製水に分散させた分散液 （濃度 0. 2重量％) を調製し、 前記分散液 4 1を前記検出部 1 5に分注し た。 そして、 直ちに 5 Ot:で 1 0分間、 乾燥処理を行い、 無機微粒子含 有層 2 1を形成した。
さらに、 前記無機微粒子含有層 2 1の上に試薬含有層 2 2を形成した 。 まず、 精製水に GODおよびフェリシアン化カリウムを添加して室温 で攪拌し、 これらを完全に溶解させた試薬溶液を調製した。 GODの濃 度は 5000 U/mL, フェリシアン化力リゥムの濃度は 3重量％とし た。 この試薬溶液 2 Lを、 前記無機微粒子含有層 2 1上に分注し、 5 0でで 1 0分間乾燥処理を行い、 試薬含有層 2 2を形成した。
つぎに、 前記試薬含有層 2 2の上に界面活性剤含有層 3 1を形成した 。 これは、 卵黄レシチンを濃度が 0. 5重量％になるように、 1ーブ夕 ノールに溶解してレシチン溶液を調製し、 このレシチン溶液 2 Lを、 前記試薬含有層 2 2上に滴下して界面活性剤含有層 3 1を形成した。 前記界面活性剤含有層 3 1に対応する部位が開口部 1 8となっている PET製のスぺーサ一 1 7 (ソニーケミカル社製） を、 絶縁層 1 6上に 配置した。 さらに、 前記スぺーサ一上に空気孔となる貫通孔 2 0を有す る P ET製のカバー 1 9 (東レ社製） を配置してバイオセンサを作製し た。
(比較例 1 )
検出部 1 5上にスメクタイ トを用いて無機微粒子含有層 2 1を形成す る代りに、 0. 2 5重量％のカルボキシメチルセルロース水溶液 4 1 を滴下し、 5 0でで 1 0分間乾燥処理を行い、 吸水性高分子層を形成し た以外は、 前記実施例 1と同様にしてグルコース測定用バイオセンサを 作製した。 前述のようにして作製した前記実施例 1および比較例 1のバイオセン ザについて、 以下に示す各種試験を行った。
(グルコース水溶液の電流測定）
所定濃度 （ 1 00、 2 00、 300、 400、 5 00、 600 m g / mL) のグルコース水溶液を調製し、 これを試料液とした。 前記各バイ ォセンサの開口部から、 毛管現象により試料液約 2 /z Lを吸引させ、 2 5秒間反応を行った。 そして、 商品名ポテンシヨス夕ッ ト CV— 50W (BAS社製） を用いて、 電圧 50 OmVを 5秒間印加した時点におけ る電流値を測定した。 これらの結果を図 3に示す。 同図において、 〇は 実施例 1のバイオセンサの結果を示し、 口は比較例 1のバイオセンサの 結果を示す。 図示のように、 実施例 1のバイオセンサによれば、 比較例のバイオセ ンサに比べて、 約 1. 2倍も高い電流値が得られ、 かつグルコース濃度 と高い相関関係を示した。
(バイオセンサに対するへマトクリツトの影響）
へマトクリツト値 42 %およびグルコース濃度 I S SmgZ l O Om Lである全血を、 遠心分離により血球と血漿とに分け、 これらを所定の へマトクリット値 （H t 2 0 %、 2 5 %、 42 %、 70 %) になるよう に混合して試料液を調製した。 そして、 前記各試料を用いて、 前述と同 様にして電流を測定した。 そして、 実施例 1のバイオセンサにより得ら れたへマトクリット （H t ) 42 %の試料についての電流値を 1 00 % として、 各測定値を相対値 （％) で表した結果を図 4に示す。 同図にお いて、 〇は実施例 1のバイオセンサの結果を示し、 口は比較例 1のバイ ォセンサの結果を示す。
図示のように、 実施例 1のバイオセンサによれば、 試料のへマトクリ ット値が変化しても、 赤血球等による影響を受けないため、 ほぼ一定の 測定値が得られた。 一方、 比較例 1のバイオセンサによれば、 へマトク リット値の増加に伴い電流値が減少し、 測定精度が低下した。
(実施例 2)
スメク夕イトの分散液を用いる代りに、 膨潤性のナトリウムフッ化 4 ゲイ素雲母 （商品名 N a— TS ； トビー工業製） の分散水溶液 （0. 2 重量％) を用いた以外は、 前記実施例 1と同様にしてグルコース測定用 バイオセンサを作製した。 この実施例 2のバイオセンサ、 前記実施例 1および比較例 1のバイオ センサを用いて、 全血試料中のグルコースの測定を行った。 試料としては、 へマトクリット値 48 %の全血を使用し、 前述と同様 にして電流の測定を行った。 なお、 コントロールとして、 同じ全血を遠 心分離して得られた血漿を準備し、 これについても電流の測定を行った 。 なお、 全血試料およびコントロールの血漿試料は、 いずれもダルコ一 ス濃度を 9 3mgZ l O OmLに調製した。 そして、 得られた電流値を 下記式に代入し、 コントロールの電流値を 1 0 0 %とした場合の相対値 (%) を求めた。 相対値 （％) が 1 00 %に近い程、 血球の影響を受け ていないと判断できる。 これらの結果を下記表 1に示す。 相対値 （％) = 1 00 X (Y-X) /Y
X ： 全血試料についての電流値
Y ： コントロールについての電流値
(表 1)
材料 相対値„(%)
実施例 1 膨潤性雲母 8 7. 2
実施例 2 卜 9 1. 8
比較例 1 CMC 7 8. 0 前記表 1に示すように、 比較例 1のバイオセンサに比べて、 実施例 1 および 2のバイオセンサは、 相対値が高く、 コントロールに近い電流値 が得られたことがわかる。
これらの結果から、 前記無機微粒子を含む実施例のバイオセンサによ れば、 へマトクリット値のような試料毎の物性の違いに影響されること なく、 高精度で測定できるといえる。 産業上の利用可能性
本発明のバイオセンサによれば、 試薬層が無機微粒子を含有するため 、 赤血球等の不純物が電極に付着することを防止できる。 このため、 試 料中の測定対象物を、 迅速かつ簡便に、 優れた精度で測定することがで きる。 したがって、 本発明のバイオセンサは、 例えば、 臨床医療等の分 野に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲 1 . 基板、 試薬を含有する試薬層、 および作用極と対極とを含む電極 系を備え、 前記基板上に電極系が配置され、 前記電極系の上に前記試薬 層が形成されているバイオセンサであって、 前記試薬層がさらに無機微 粒子を含有することを特徴とするバイオセンサ。
2 . 試薬層が単層である請求の範囲 1記載のバイオセンサ。
3 . 試薬層が、 前記試薬を含有する試薬含有層と前記無機微粒子を含 有する微粒子含有層とを含む積層体である請求の範囲 1記載のバイオセ ンサ。
4 . 電極系上に無機微粒子含有層を介して試薬含有層が形成されてい る請求の範囲 3記載のバイオセンサ。
5 . 試薬層が無機微粒子の凝集体を含有する請求の範囲 1〜 4のいず れか一項に記載のバイオセンサ。
6 . 無機微粒子を含有する層が、 電極上に無機微粒子が分散された分 散液を塗布し、 乾燥することによって形成されている請求の範囲 1〜4 のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
7 . 無機微粒子が、 膨潤性微粒子である請求の範囲 1〜4のいずれか 一項に記載のバイオセンサ。
8 . 無機微粒子が、 粘土鉱物の微粒子である請求の範囲 1〜 4記載の バイオセンサ。
9 . 粘土鉱物が、 膨潤性層状ゲイ酸塩である請求の範囲 8記載のバイ ォセンサ。
1 0 . 膨潤性層状ケィ酸塩が、 スメク夕イ トおよび膨潤性雲母の少な くともいずれか一方である請求の範囲 9記載のバイオセンサ。
1 1 . スメク夕イ ト力 ヘクトライ ト、 サポナイ トおよびモンモリ口 ナイ 卜からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求の範 囲 1 0記載のバイォセンサ。
1 2. 膨潤性雲母が、 ナトリウムフッ化四ケィ素雲母およびテニオラ ィ 卜の少なくともいずれか一方である請求の範囲 1 0記載のバイオセン サ。
1 3 無機微粒子を含有する層における前記無機微粒子の含有量が、 面 積 l c m2当たり 0. 1 4〜 1 4mgの範囲である請求の範囲 1〜4の いずれか一項に記載のバイオセンサ。
14 無機微粒子を含有する層の厚みが、 0. 0 5〜5 mの範囲であ る請求の範囲 1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
1 5. 試薬層が、 さらに非水溶性高分子化合物からなる微粒子を含ん でいる請求の範囲 1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
1 6. 電極系上に、 試薬層を介して、 非水溶性高分子化合物からなる 微粒子を含む層が形成されている請求の範囲 1〜4のいずれか一項に記 載のバイオセンサ。
1 7. 非水溶性高分子化合物が、 アクリル酸、 メ夕クリル酸、 マレイ ン酸、 アクリル酸エステル、 メタクリル酸エステル、 マレイン酸エステ ル、 スチレンおよびスチレン誘導体モノマ一のうち少なくとも一つを含 む重合体もしくは共重合体、 またはポリアミ ド系高分子化合物である請 求の範囲 1 5または 1 6記載のバイオセンサ。
1 8. 非水溶性高分子化合物からなる微粒子の平均粒径が 0. 1〜4 5 /zmの範囲である請求の範囲 1 5または 1 6記載のバイオセンサ。
1 9. さらに、 試薬層の上に界面活性剤を含む界面活性剤含有層が形 成されている請求の範囲 1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサ。 20. 電極が、 金電極、 カーボン電極および銀電極からなる群から選 択された少なくとも一つの電極である請求の範囲 1〜 4のいずれか一項 に記載のバイオセンサ。
2 1. 試薬が、 酸化還元酵素を含む請求の範囲 1〜4のいずれか一項 に記載のバイオセンサ。
2 2. 試薬が、 酸化還元酵素および前記酵素の反応における電子受容 体を含む請求の範囲 1〜 4のいずれか一項に記載のバイオセンサ。 2 3. 測定試料が、 血液である請求の範囲 1〜 4のいずれか一項に記 載のバイオセンサ。
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