WO2000075644A1 - Sensorplatform und verfahren zur multianalytbestimmung - Google Patents

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WO2000075644A1
WO2000075644A1 PCT/EP2000/004869 EP0004869W WO0075644A1 WO 2000075644 A1 WO2000075644 A1 WO 2000075644A1 EP 0004869 W EP0004869 W EP 0004869W WO 0075644 A1 WO0075644 A1 WO 0075644A1
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Andreas P. Abel
Wolfgang Budach
Gert L. Duveneck
Markus Ehrat
Gerhard M. Kresbach
Dieter NEUSCHÄFER
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Zeptosens Ag
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Definitions

  • the invention relates to a variable embodiment of a sensor platform based on a planar thin-film waveguide for determining one or more luminescences from one or more measurement areas on this sensor platform, comprising an optical layer waveguide with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b ) with a lower refractive index than layer (a) and at least one grating structure for coupling excitation light to the measuring ranges.
  • the invention also relates to an optical system for determining luminescence with an excitation light source, an embodiment of a sensor platform according to the invention and at least one detector for detecting the light emanating from the measuring areas on the sensor platform, and an analytical system which comprises a sensor platform according to the invention, an optical system according to the invention and supply means, to bring one or more samples into contact with the measurement areas on the sensor platform.
  • an analytical system which comprises a sensor platform according to the invention, an optical system according to the invention and supply means, to bring one or more samples into contact with the measurement areas on the sensor platform.
  • the objectives of the present invention are to provide sensor platforms and optical and analytical measurement arrangements for highly sensitive detection of one or more analytes.
  • a planar thin-film waveguide consists of a three-layer system: carrier material, waveguiding layer, superstrate (or sample to be examined), the waveguiding layer having the highest refractive index. Additional intermediate layers can improve the effect of the planar waveguide.
  • the strength of the evanescent field is very much dependent on the thickness of the waveguiding layer itself, and the ratio of the refractive indices of the waveguiding layer and the media surrounding it.
  • thin waveguides that is to say layer thicknesses of the same or a lower thickness than the wavelength to be guided, discrete modes of the guided light can be distinguished.
  • Different methods for the detection of analytes in the evanescent field of guided light waves in optical layer waveguides can be differentiated.
  • a distinction can be made, for example, between fluorescence or general luminescence methods on the one hand and refractive methods on the other.
  • methods for generating a surface plasmon resonance in a thin metal layer on a dielectric layer with a lower refractive index can be included in the group of refractive methods, provided that the resonance angle of the irradiated excitation light for generating the surface plasmon resonance serves as the basis for determining the measurement variable.
  • the surface plasmon resonance can also be used to enhance luminescence or to improve the signal-to-background ratio in a luminescence measurement.
  • luminescence denotes the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range after optical or non-optical, such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term "luminescence”.
  • the change in the so-called effective refractive index due to molecular adsorption or desorption on the waveguide is used to detect the analyte.
  • This change in the effective refractive index in the case of grating coupler sensors, is determined from the change in the coupling angle for the coupling or decoupling of light into or out of the grating coupler sensor, and in the case of interf erometric sensors from the change in the phase difference between the measurement light guided in a sensor arm and a reference arm of the interface.
  • the refractive methods mentioned have the advantage that they can be used without the use of additional labeling molecules, so-called molecular labels.
  • the disadvantage of these label-free methods is, however, that the detection limits that can be achieved with them are limited to pico- to nanomolar concentration ranges due to the low selectivity of the measuring principle, depending on the molecular weight of the analyte, which is not the case for many applications of modern trace analysis, for example for diagnostic applications is sufficient.
  • luminescence-based methods appear more suitable due to the greater selectivity of the signal generation.
  • the luminescence excitation is based on the penetration depth of the evanescent field into the optically thinner medium, i.e. on the immediate vicinity of the wave-guiding region with a penetration depth of the order of a few hundred nanometers ins Medium limited. This principle is called evanescent luminescence excitation.
  • the evanescent luminescence excitation is of great interest for analysis, since the excitation is limited to the immediate vicinity of the wave-guiding layer and disruptive influences from the depth of the medium can be minimized.
  • Photometric instruments for determining the luminescence of biosensors under evanescent excitation conditions with planar optical waveguides are also known and are described, for example, in WO 90/06503.
  • the waveguiding layers used there are 160 nm to 1000 nm thick, the excitation wave is coupled in without a grating coupler.
  • a major disadvantage of this method is that only small differences in refractive index can be achieved between the waveguiding layer and the substrate layer, which results in a relatively low sensitivity.
  • the sensitivity is given as 20 nM fluorescein-labeled protein A. In order to be able to determine the slightest trace, this is still unsatisfactory and a further increase in sensitivity is therefore necessary. In addition, the reproducibility and practical feasibility of coupling light through prisms appears difficult due to the large dependence of the coupling efficiency on the quality and size of the contact surface between the prism and the waveguide.
  • Another principle is proposed in US-A-5 081 012.
  • the planar wave-guiding layer is 200 nm to 1000 nm thick and contains two gratings, one of which is designed as a reflection grating, so that the injected light wave has to pass through the sensor region lying between the gratings at least twice. In this way, increased sensitivity is to be achieved.
  • a disadvantage is that the reflected radiation can lead to an undesirable increase in the background radiation intensity.
  • WO 91/10122 describes a thin-layer spectroscopic sensor, which is characterized in that it has a coupling-in grating and a spatially distant coupling-out grating. It is particularly suitable for absorption measurement if a highly refractive inorganic metal oxide is used as the wave-guiding layer.
  • Various embodiments are described which are suitable for coupling in and out multichromatic light sources.
  • the preferred thickness of the waveguiding layer is greater than 200 nm and the grating depth should be approximately 100 nm. These conditions are not suitable for luminescence measurements in affinity sensors because only a low sensitivity is obtained. This is described in Appl. Optics Vol. 29, No. 31, (1990), 4583-4589 confirmed by the data of the total efficiency at 633 nm of 0.3% and at 514 nm of 0.01% for these systems.
  • a plurality of polymeric planar waveguiding layers are applied to a substrate, which can be used as a gas mixture analyzer. You make yourself the change in the effective refractive index or the change in layer thickness of the polymeric waveguide when in contact with z. B. Use solvent vapors. The wave-guiding structure is physically changed. However, such changes are completely unsuitable for luminescence measurements in affinity sensor technology, since this changes the coupling, increases the scatter and the sensitivity can decrease significantly.
  • WO 95/33197 describes a method in which the excitation light is coupled into the waveguiding film as a diffractive optical element via a relief grating.
  • the surface of the sensor platform is brought into contact with a sample containing the analyte, and the isotropically emitted luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices such as, for example, photodiodes, photomultipliers or CCD cameras.
  • WO 95/03538 it is proposed to mount a plurality of sample cells over a continuous wave-guiding layer, which are formed in the form of depressions in a sample plate above the wave-guiding layer. There is a grating under each sample cell, which couples out part of the light guided in the wave-guiding layer.
  • the detection of the analyte is based on the change in the coupling-out angle depending on the analyte concentration.
  • WO 94/27137 proposes a device and a method for carrying out immunoassays by means of evanescently excited fluorescence.
  • the device consists of a continuous optical waveguide with two plane-parallel surfaces and a side edge, which acts as a coupling element in connection with a lens.
  • a large number of specific binding partners are immobilized on at least one surface.
  • these specific binding partners are arranged spatially separated on the continuous waveguide. In the exemplary embodiment, they are distributed in spots over the waveguide surface.
  • planar glass-based optical components which contain waveguides in channel form, the waveguiding channels of which are produced by exchanging individual ions on the surface with the aid of masks (Glastechnischeberichte Vol. 62, page 285, 1989 ).
  • the result is a physically continuous layer which has a slightly increased refractive index in the channels doped with ions. The increase is usually less than 5%.
  • the manufacture of such components is complex and expensive.
  • WO 99/13320 claims an optical sensor for the detection of at least two different light components. This The application mainly relates to refractive measurement methods, however fluorescence or phosphorescence methods are also used to generate the measurement signal.
  • WO 99/13320 which also refers to multi-analyte determinations, a number of different definitions for the generation of a plurality of “sensing pads” are used, also in the same physical area (waveguide grating structure according to the nomenclature used in WO 99/13320) of the claimed sensor, given.
  • devices for the simultaneous or successive execution of exclusively luminescence-based multiple measurements with essentially monomodal, planar inorganic waveguides, e.g. B. WO 96/35940, devices (arrays) are known in which at least two separate waveguiding areas are arranged on a Senso ⁇ latform, which are acted upon separately with excitation light.
  • the division of the sensor platform into separate wave-guiding areas has the disadvantage, however, that the space required for discrete measurement areas, in discrete wave-guiding areas on the common sensor platform, is relatively large and therefore only achieves a relatively low density of different measurement fields (or so-called "features”) can be.
  • Arrays with a very high feature density are known based on simple glass or microscope plates, without additional waveguiding layers.
  • US 5445934 Affymax Technologies
  • Arrays of oligonucleotides with a density of more than 1000 features per square centimeter are described and claimed.
  • the excitation and layout of such arrays is based on classic optical arrangements and methods.
  • the entire array can be illuminated simultaneously with an expanded excitation light bundle, which, however, leads to a relatively low sensitivity, since the scattered light component is relatively large and scattered light or background fluorescent light is also generated from the glass substrate in the areas in which there is no binding of the analyte immobilized oligonucleotides.
  • spatially separated measuring areas (d) are to be defined by the areas which biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized there for the recognition of one or more analytes from a liquid sample.
  • These surfaces can have any geometry, for example the shape of points, circles, rectangles, triangles, ellipses or lines.
  • Different measurement areas can be separated from one another by lattice structures (c) and (c ') if a disturbing crosstalk of luminescent light generated in adjacent measurement areas and fed back into layer (a) is to be prevented.
  • she can also be located on a common, continuous lattice structure, which, depending on the coupling efficiency of the lattice, leads to a partial or complete prevention of interfering crosstalk from luminescence.
  • the present invention relates to a sensor platform for determining one or more luminescence from an array of at least two or more spatially separated measuring areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), into which several measuring areas are combined, on this Platform comprising an optical layer waveguide with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a), with one or more grating structures (c) for coupling excitation light to the measurement areas (d ) at least two or more spatially separated measuring areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), in which several measuring areas are combined, and the same or different biological or biochemical or synthetic recognition elements (e) immobilized on these measuring areas qualitative or quantitative detection of one or more analytes in a sample brought into contact with the measuring ranges, characterized in that crosstalk of luminescence generated in the measuring ranges or in the segments comprising several measuring ranges and fed back into the optically transparent layer (a) of the layer
  • a lattice structure (c) or (c ') can therefore be used both as a coupling-in and a coupling-out grating. Furthermore, the function of the lattice structures (c) and (c ') can also be interchanged, i.e. that is, the lattice structures (c) and (c ') can be used alternately as coupling-in and / or coupling-out gratings.
  • the grating structures (c) and (c ') enclose spatially separated measuring ranges (d)) or spatially separated segments (d'), in which several measuring ranges are combined.
  • a circular, rectangular or polygonal arrangement of the lattice structures (c) and (c ') around the measurement areas or segments is preferred.
  • the grating structures (c) and (c ') limit a measuring range or a segment only in the direction of propagation of the coupled excitation light. Then they are advantageously aligned parallel to each other.
  • the lattice structures (c) and (c ') can also form a common continuous lattice structure on which there are several measurement areas or segments.
  • both the excitation light and the feedback luminescent light with a suitable grating structure (c) are decoupled again at the point of coupling, it is possible to have a very high density of To create measurement areas on a common grid structure.
  • the density that can be achieved is essentially determined by the minimum size of the spots, which are associated with the immobilization of the biological or biochemical or synthetic Detection elements can be achieved.
  • the Senso ⁇ lattformen used can have clearances of several centimeters side length. It is therefore possible that up to 100,000 measuring ranges are arranged on a sensor platform in a 2-dimensional arrangement. A single measuring range can have an area of 0.001 - 6 mm.
  • Another object of the invention is therefore a sensor platform for the simultaneous determination of one or more luminescences of at least two or more spatially separated measuring areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), into which several measuring areas are combined, on this platform comprising an optical layer waveguide with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a), with one in the region of the at least two or more measuring ranges or at least two or more spatially separated segments (d '), in which several measuring ranges are combined, continuously modulated grating structure (c) for coupling excitation light to the measuring ranges (d)
  • Identical or different biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized on these measurement areas for the qualitative or quantitative detection of one or more analytes in a sample brought into contact with the measurement areas, characterized in that the density of the measurement areas on the sensor platform is at least 16
  • This arrangement of the sensor platform according to the invention is additionally distinguished by the advantage that the intensity of the interfering transmission light has a minimum when the coupling angle is reached, ie it disappears almost completely, which occurs when the excitation light is irradiated from the rear of the sensor platform, that is to say through the optically transparent layer (b) in the direction of the grating structure, which minimizes excitation light not serving for luminescence excitation in an optical system.
  • the physical conditions for the disappearance of the transmission light and the simultaneous occurrence of an extraordinary "reflection" (as the sum of the regular portion of the reflection, in accordance with the radiation laws, and the light coupled out via the lattice structure) are described, for example, in D. Rosenblatt et al., “ Resonant Grating Waveguide Structures ", IEEE Journal of Quantum Electronics, Vol. 33 (1997) 2038-2059.
  • the excitation light is irradiated to the measurement areas not under coupling conditions, but in a simple incident light or transmission light arrangement. Even then there will be an intensification of the luminescence in the near field of the optical layer waveguide, and a high feature density without optical crosstalk of signals from neighboring measurement areas can in turn be achieved by decoupling the signals by means of the grating structure.
  • the invention therefore also relates to a sensor platform on this platform for the simultaneous determination of one or more luminescences of at least two or more spatially separated measurement areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), into which several measurement areas are combined comprising an optical layer waveguide with a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a), with one in the region of the at least two or more measuring ranges or at least two or more spatially separated segments (d '), in which several measuring ranges are combined, continuously modulated lattice structure (c) - at least two or more spatially separated measuring ranges (d) or at least two or more spatially separated segments (d '), in which several measuring ranges are combined, and
  • Identical or different biological or biochemical or synthetic recognition elements immobilized on these measurement areas for the qualitative or quantitative detection of one or more analytes in a sample brought into contact with the measurement areas, characterized in that the density of the measurement areas on the sensor platform is at least 16
  • the grating structure continuously modulated in the area of the one or more measuring areas or segments is a superimposition of 2 or more grating structures of different periodicity with parallel or non-parallel, preferably non-parallel, alignment of the grating lines, which differentiates the coupling of excitation light Wavelength is used, and in the case of two superimposed grating structures, their grating lines are preferably aligned perpendicular to one another.
  • the extent of the propagation losses of a mode guided in an optically wave-guiding layer (a) is determined to a large extent by the surface roughness of an underlying carrier layer and by absorption due to possibly present in this carrier layer Chromophores determine what additionally harbors the risk of excitation of undesired luminescence in this carrier layer by penetration of the evanescent field of the mode carried out in layer (a). Furthermore, thermal stresses may occur as a result of different coefficients of thermal expansion of the optically transparent layers (a) and (b). In the case of a chemically sensitive, optically transparent layer (b), provided that it consists, for example, of a transparent thermoplastic, it is desirable to prevent solvents, which could attack the layer (b), from penetrating through the optically transparent layer (a). to prevent existing micropores.
  • optically transparent layer (b ') with a lower refractive index than that of layer (a) and a thickness between the optically transparent layers (a) and (b) and in contact with layer (a) from 5 nm to 10,000 nm, preferably from 10 nm to 1000 nm.
  • the function of the intermediate layer is to reduce the surface roughness under layer (a) or to reduce the penetration of the evanescent field of light guided in layer (a) into the one or more layers below or to improve the adhesion of layer (a) the one or more layers below or the reduction of thermally induced voltages within the optical sensor platform or the chemical isolation of the optically transparent layer (a) from layers below by sealing micropores in layer (a) against layers below.
  • an adhesion-promoting layer (f) is applied to the optically transparent layer (a) for the immobilization of biological or biochemical or synthetic recognition elements (e).
  • This adhesive layer should also be optically transparent.
  • the adhesive layer should not be over the penetration depth of the evanescent field protrudes from the wave-guiding layer (a) into the medium above. Therefore, the adhesion promoting layer (f) should have a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.
  • it can include chemical compounds from the group consisting of silanes, epoxides, "self-organized functionalized monolayers".
  • the measuring ranges it is possible to generate spatially separated measuring ranges (d) by spatially selective application of biological or biochemical or synthetic recognition elements on the sensor platform.
  • a luminescent analyte or a luminescent-labeled analogue of the analyte competing with the analyte for binding to the immobilized recognition elements or another luminescent-labeled binding partner in a multi-stage assay these luminescent molecules will only selectively bind to the surface of the sensor platform in the measuring areas, which through the avenues are defined that are taken up by the immobilized recognition elements.
  • one or more methods from the group of methods can be used, from inkjet spotting, mechanical spotting, micro contact printing, fluidic contacting of the measurement areas with the biological or biochemical or synthetic recognition elements by their supply in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials ".
  • nucleic acids DNA, RNA, ...), nucleic acid analogs (PNA ..), antibodies, aptamers, membrane-bound and isolated receptors, their ligands, antigens can be applied as biological or biochemical or synthetic recognition elements for antibodies, "histidine tag components", cavities generated by chemical synthesis to accommodate molecular imprints, etc. is formed.
  • the latter type of recognition elements are understood to mean cavities which are produced in a process which has been described in the literature as "molecular imprinting". To do this, mostly encapsulated in organic solution, the analyte or an analogue of the analyte, in a polymer structure. It is then called the “imprint”. Then the analyte or its analogue is removed from the polymer structure with the addition of suitable reagents, so that it leaves an empty cavity there. This empty cavity can then be used as a binding site with high steric selectivity in a later detection method.
  • “Chemically neutral” compounds are substances which do not themselves have any specific binding sites for the detection and binding of the analyte or an analogue of the analyte or another binding partner in a multi-stage assay and which, due to their presence, give access to the analyte or its analogue or block another binding partner to the surface of the sensor platform.
  • substances from the groups formed by bovine serum albumin or polyethylene glycol can be used as "chemically neutral” compounds.
  • the lattice structure (c) is a diffractive lattice with a uniform period.
  • the resonance angle for coupling the excitation light via the grating structure (c) to the measuring areas is then uniform in the entire area of the grating structure.
  • the corresponding resonance angles for the coupling can be used make a clear distinction as to what the use of additional adjusting elements in an optical system for receiving the sensor platform may require or which may lead to spatially very unfavorable coupling angles.
  • the lattice structure (c) is a multidiffractive lattice.
  • the grating structure (c) has a periodicity which varies spatially perpendicular or parallel to the direction of propagation of the excitation light coupled into the optically transparent layer (a). Then, from a large-area irradiated, convergent or divergent beam, coupling will take place at the location on the lattice structure where the resonance condition is fulfilled.
  • such a grating structure with a periodicity varying spatially or perpendicular to the direction of propagation of the excitation light coupled into the optically transparent layer (a) enables a method in which, in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined. It can be advantageous if the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength.
  • the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
  • the material of the second optically transparent layer (b) can consist of glass, quartz or a transparent thermoplastic, for example from the group formed by polycarbonate, polyimide or polymethyl methacrylate.
  • the refractive index of the wave-guiding, optically transparent layer (a) is significantly larger than the refractive index of the adjacent layers. It is particularly advantageous if the refractive index of the first optically transparent layer (a) is greater than 2.
  • the first optically transparent layer (a) can consist of Ti0 2 , ZnO, Nb 2 ⁇ 5 , Ta 2 0 5 , Hf0 2 , or Zr0 2 . It is particularly preferred if the first transparent optical layer (a) consists of Ti0 2 or Ta 2 Os.
  • the thickness of the wave-guiding optically transparent layer (a) is the second relevant parameter for generating the strongest possible evanescent field at its interfaces with neighboring layers with a lower refractive index.
  • the strength of the evanescent field increases with decreasing thickness of the waveguiding layer (a), as long as the layer thickness is sufficient to lead at least one mode of the excitation wavelength.
  • the minimum “cut-off" layer thickness for guiding a mode depends on the wavelength of this mode. It is larger for longer-wave light than for short-wave light. However, as the "cut-off" layer thickness is approached, undesired propagation losses also increase sharply to what further limits the choice of preferred layer thickness.
  • layer thicknesses of the optically transparent layer (a) which only allow the guidance of 1 to 3 modes of a predetermined excitation wavelength; layer thicknesses which lead in monomodal waveguides for this excitation wavelength are very particularly preferred. It is clear that the discrete mode character of the guided light only refers to the transverse modes.
  • the thickness of the first optically transparent layer (a) is advantageously 40 to 300 nm.
  • the thickness of the first optically transparent layer (a) is very particularly advantageously 70 to 160 nm.
  • the resonance angle for the coupling of the excitation light in accordance with the above-mentioned resonance condition depends on the diffraction order to be coupled in, the excitation wavelength and the Gitte ⁇ eriode.
  • the first diffraction order is advantageous.
  • the grating depth is decisive for the level of the coupling efficiency. In principle, the coupling efficiency increases with increasing grid depth.
  • the grating (c) has a period of 200 nm - 1000 nm and the modulation depth of the grating (c) is 3 to 100 nm, preferably 10 to 30 nm.
  • the available total excitation intensity increases under these conditions up to the end of the illuminated area on the continuous lattice structure, in the direction of propagation of the guided light.
  • This gradient of the intensity of available excitation light has the advantage that it can be used to expand the dynamic range.
  • the coupling-in and coupling-out efficiency of a diffractive grating is essentially determined by the grating depth under other specified parameters. Therefore, said gradient of the intensity of the guided excitation and / or excited luminescent light can be additionally influenced and controlled if the grating (c) has a spatially varying grating depth in the direction of propagation of the coupled excitation light.
  • propagation losses of the coupled excitation light in an optically transparent, wave-guiding layer lead to a negative gradient of the guided excitation light in its direction of propagation. Accordingly, through a targeted definition of the Amount of this propagation loss, for example through a targeted doping of the waveguiding layer with absorbing molecules but not interfering with the luminescence to be generated or by applying such absorbing molecules on the waveguiding layer, a controllable negative gradient of the intensity of the excitation and / or excited luminescent light within of a single and / or over several measuring ranges.
  • the ratio of the modulation depth to the thickness of the first optically transparent layer (a) is equal to or less than 0.2.
  • the grating structure (c) can be a relief grating with a rectangular, triangular or semicircular profile or a phase or volume grating with a periodic modulation of the refractive index in the essentially planar optically transparent layer (a).
  • a thin metal layer preferably made of gold or silver
  • optically or mechanically recognizable markings are applied to the sensor platform to facilitate adjustment in an optical system and / or for connection to sample containers as part of an analytical system.
  • the present invention also relates to an optical system for determining one or more luminescences, with at least one excitation light source of a sensor platform according to at least one of the named
  • Executions at least one detector for detecting the light emanating from the at least one or more measuring ranges (d) on the sensor platform.
  • the excitation light is irradiated to the measurement areas in a simple incident light or transmission light arrangement.
  • This results in significantly reduced requirements for the positioning of the sensor platform according to the invention in an optical system.
  • this also enables the use of the sensor platform in a large number of luminescence excitation and detection systems already on the market, such as, for example, scanner systems.
  • the detection of the luminescent light takes place in such a way that the luminescent light coupled out from a grating structure (c) or (c ') is also detected by the detector.
  • the excitation light is irradiated onto the grating structure (c) or (c ') under coupling conditions.
  • the excitation light emitted by the at least one light source is coherent and is irradiated onto the one or more measurement areas at the resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a).
  • the excitation light is expanded by at least one light source with an expansion lens to form a substantially parallel beam and is irradiated onto the one or more measurement areas, wherein this preferably takes place at the resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a).
  • a plurality of diffractive optical elements preferably Dammann gratings, or refractive optical elements, preferably microlens Arrays
  • At least one spatially resolving detector is used for the detection.
  • At least one detector from the group formed by CCD cameras, CCD chips, photodiode arrays, avalanche diode arrays, multichannel plates and multichannel photomultipliers can be used as the at least one spatially resolving detector.
  • optical components from the group that are used by lenses or lens systems can be used between the one or more excitation light sources and the sensor platform according to one of the embodiments mentioned and / or between said sensor platform and the one or more detectors for shaping the transmitted light bundles, planar or curved mirrors for deflection and, if necessary, additionally for shaping light bundles, prisms for deflecting and possibly for spectrally dividing light bundles, dichroic mirrors for spectrally selective deflection of parts of light bundles, neutral filters for regulating the transmitted light intensity, optical Filters or monochromators for spectrally selective transmission of parts of light beams or polarization-selective elements for the selection of discrete polarization directions of the excitation or L be formed by fluorescent light.
  • the excitation light is irradiated in pulses with a duration of between 1 fsec and 10 minutes.
  • the emission light from the measurement areas is measured in a temporally resolved manner.
  • the optical system according to the invention comprises components with which light signals from the group are measured for referencing, which are from excitation light at the location of the light sources or after their expansion or after their subdivision into partial beams, scattered light at the excitation wavelength from the range of one or more spatially separated measuring areas, and via the grating structure (c) in addition to the measuring areas, coupled light of the excitation wavelength is formed. It is particularly advantageous if the measuring ranges for determining the emission light and the reference signal are identical.
  • the excitation light can be radiated onto and detection of the emission light from one or more measurement areas sequentially for individual or more measurement areas, in which case the sequential excitation and detection can be carried out using movable optical components, which consist of the group of mirrors, deflection prisms and dichroic mirrors is formed.
  • movable optical components consist of the group of mirrors, deflection prisms and dichroic mirrors is formed.
  • scanners are usually used for sequential excitation and detection in bioanalytical array systems, with which an excitation light beam is guided sequentially over the areas to be examined, usually by means of movable mirrors. Most scanner systems change the angle between the illuminated area and the excitation light beam.
  • this angle must remain essentially constant, ie a scanner to be used in the optical system according to the invention must work at the correct angle. This requirement is met by some commercially available scanners. At the same time, however, the size of the stimulated areas on the sensor platform must not change. Therefore is a Another object of this invention is an optical system, which is characterized in that sequential excitation and detection is carried out using a scanner that is essentially true to the angle and focus.
  • the sensor platform is moved between steps of sequential excitation and detection.
  • the one or more excitation light sources and the components used for detection can be spatially fixed.
  • the invention relates to a derived complete analytical system for luminescence detection of one or more analytes in at least one sample on one or more measurement areas on a sensor platform, comprising an optical layer waveguide, with a sensor platform according to one of the aforementioned
  • Feeding means to mix the one or more samples with the
  • the analytical system additionally comprises one or more sample containers which are opened towards the sensor platform at least in the area of the one or more measurement areas or the measurement areas combined into segments.
  • the sample containers can each define a volume of 0.1 nl - 100 ⁇ l.
  • the Senso ⁇ lattform can be operated in a closed giant system as well as in an open system.
  • the analytical system is designed in such a way that the sample containers on the side facing away from the optically transparent layer (a) are closed, with the exception of inlet and / or outlet openings for the supply or outlet of the samples and, if appropriate, additional reagents and the supply or discharge of samples and, if appropriate, additional reagents take place in a closed flow-through system, wherein in the case of liquid supply to several measurement areas or segments with common inlet and outlet openings, these are preferably addressed in columns or rows.
  • the analytical system according to the invention is designed in such a way that the sample containers have openings on the side facing away from the optically transparent layer (a) for the locally addressed addition or removal of the samples or other reagents.
  • containers for reagents can be provided, which are wetted during the method for the detection of the one or more analytes and brought into contact with the measuring areas
  • Another object of the invention is a method for the luminescence detection of one or more analytes in one or more samples on at least two or more, spatially separated measurement areas on a sensor platform for determining one or more luminescence from an array of at least two or more, spatially separated measurement areas (i.e. ) or at least two or more spatially separated segments (d '), in which several measuring ranges are combined, on this platform, comprising an optical layer waveguide
  • the present invention in particular relates to a method for the simultaneous detection of luminescence of one or more analytes in one or several samples on at least two or more spatially separated measuring areas on a sensor platform for the simultaneous determination of one or more luminescence from at least two or more spatially separated measuring areas (d) or at least two or more spatially separated segments (d ') into which Several measuring ranges are combined on this platform, including an optical layer waveguide
  • the density of the measuring areas on the sensor platform is at least 16 measuring areas per square centimeter and
  • the excitation light is coupled to the measurement areas via the grating structure (c) in the optically transparent layer (a).
  • This invention also relates to a method for luminescence detection of one or more analytes according to the above statements, using an analytical system according to one of the aforementioned embodiments, which comprises an optical system according to at least one of the aforementioned embodiments with a sensor platform according to at least one of the aforementioned embodiments, characterized in that one or more liquid samples, which are to be examined for the one or more analytes, are brought into contact with one or more measuring areas on the sensor platform, excitation light is directed into the measuring areas, luminescent substances in the samples or on the measuring areas are stimulated to luminescence and the emitted luminescence is measured.
  • a method is claimed, which is characterized in that, by means of a controllable gradient of the guided excitation and / or excited luminescent light within a single and / or over several measuring ranges, parallel to the direction of propagation of the coupled excitation light, the dynamic range for the signal detection and / or quantitative analyte determination can be expanded or limited.
  • a luminescence or ruorescence label can be used to generate the luminescence or ruorescence, which label can be excited and emitted at a wavelength between 300 nm and 1100 nm.
  • the luminescence or ruorescence labels can be conventional luminescence or ruorescence dyes or so-called luminescent or fluorescent nanoparticles based on semiconductors (WCW Chan and S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) act.
  • the luminescence label can be on the analyte or in a competitive assay on an analog of the analyte or in a multistage assay on one of the binding partners of the immobilized biological or biochemical or synthetic recognition elements or on the biological or biochemical or synthetic recognition elements.
  • a second or even more luminescence label with the same or different excitation wavelength as the first luminescence label and the same or different emission wavelength can be used. It can be advantageous here if the second or even more luminescence label can be excited at the same wavelength as the first luminescence label, but can emit at other wavelengths.
  • the one or more luminescences and / or determinations of light signals at the excitation wavelength are carried out in a polarization-selective manner. Furthermore, the method allows the possibility that the one or more luminescences are measured at a different polarization than that of the excitation light.
  • the inventive method according to one of the preceding embodiments enables simultaneous or sequential, quantitative or qualitative determination of one or more analytes from the group of antibodies or antigens, receptors or ligands, chelators or "histidine tag components", oligonucleotides, DNA or RNA Strands, DNA or RNA analogs, enzymes, enzyme factors or inhibitors, lectins and carbohydrates.
  • the samples to be examined can be naturally occurring body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or egg yolk.
  • a sample to be examined can also be an optically cloudy liquid, surface water, a soil or plant extract, a bio- or synthesis process broth.
  • the samples to be examined can also be taken from biological tissue parts.
  • the present invention furthermore relates to the use of a method according to at least one of the preceding embodiments for determining chemical, biochemical or biological analytes in screening methods in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for determining kinetic parameters in affinity screen mg and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis, for the preparation of toxicity studies as well as for the determination of expression profiles and for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product development and research, human and veterinary diagnostics, agrochemical product development and research, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and nd for the therapeutic selection of medication, for the detection of pathogens, pollutants and pathogens, in particular salmonella, prions and bacteria, in food and environmental analysis.
  • a sensor platform with the outer dimensions 16 mm wide x 48 mm long x 0.5 mm thick was used.
  • the grids were 5 mm long x 12 mm wide (grid structure I) or 1 mm long x 12 mm wide (grid structure II), with the grid lines oriented parallel to the specified width.
  • the lattice structures were arranged centrally symmetrically with respect to their inner sides for the excitation light to be coupled in and to be guided in the wave-guiding layer (a), at an inner distance of 20 mm on the sensor platform.
  • the wave-guiding, optically transparent layer (a) on the optically transparent layer (b) was produced by "ion plating” and subsequent annealing at 300 degrees (see RE Kunz, J. Edlinger et al., "Grating Couplers in tapered waveguides for integrated optical sensing ", in Proc. SPIE vol.
  • the grating structures (I) serve as continuous grating structures for coupling the excitation light to the measuring areas located thereon or to the measuring areas located between the grating structures (I) and (II), which, summarized as Segment, by coupling out, fed back luminescent light and guided excitation light through grating structure (II), from crosstalk into potential further measuring areas or segments located in this direction of propagation, according to which the grating structure (II) serving as coupling-out grating is separated.
  • a sensor platform with the outer dimensions of 16 mm wide x 48 mm long x 0.7 mm thick was used.
  • a continuous structure of a surface relief grating was formed in the substrate by means of holographic exposure of the waveguiding layer (a) covered with spun-on photoresist and subsequent wet chemical etching
  • the wave-guiding, optically transparent layer (a) on the optically transparent layer (b) made of Ta 2 0 5 with a period of 364 nm and a depth of 25 +/- 5 nm, with orientation of the grating lines parallel to the specified width of the sensor platform was generated by reactive, magnetic field-assisted DC sputtering (see DE 4410258) and had a refractive index of 2.15 at 633 nm (layer thickness 150 nm).
  • the sensor platforms were cleaned and silanized with epoxy silane in the liquid phase, as described above. Afterwards, solutions of 16-mer oligonucleotides (concentration of the deposited solution: 0.34 mM, 3 nl per spot) were applied with a commercial spotter and thus approximately circular measuring areas with a diameter of 140-150 ⁇ m at a distance (center to center) of 600 ⁇ m created in a 6 x 6 array on the continuous grid structure.
  • concentration of the deposited solution 0.34 mM, 3 nl per spot
  • the Senso ⁇ lattform is mounted on a computer-controlled adjustment unit, which allows the translation parallel and perpendicular to the grid lines as well as a rotation with a pivot point in the axis of the excitation light spot hitting the grid structure (I) for coupling into the Senso ⁇ lattform mentioned in example la.
  • a shutter in the light path to block the light path if no measurement data are to be recorded.
  • neutral filters or polarizers can be placed at this point or at other positions in the further path of the excitation light to the sensor platform in the light path in order to vary the excitation intensity step by step or continuously.
  • the excitation light beam of a helium-neon laser (2 mW) is directed onto the right edge of the lattice structure I without the use of further beam-shaping components.
  • the size of the excitation light spot corresponds to the diameter of the exciting laser beam.
  • the sensor platform is adjusted for maximum coupling, which can be recognized from the maximum intensity of the scattered light which is emitted by scattering along the coupled-in excitation light. This maximum can be determined both visually and by imaging the scattered light detected with an imaging system along the excitation mode onto an optoelectronic detector, e.g. B. on the pixels of a CCD camera as an example of a spatially resolving detector or a photodiode as an example of a non-spatially resolving detector.
  • a maximum signal is also measured with a second optoelectronic detector at the coupling angle for the guided excitation light on the second grating structure II.
  • An angle of -3.8 ° is determined as the resonance angle for the coupling.
  • Excitation unit a.ii) / sensor platform la The excitation light beam of a helium-neon laser (2 mW) is expanded with a lens combination, using a cylindrical lens, to form a slit-shaped light beam (parallel to the grating lines of the sensor platform).
  • the upper and lower marginal areas of the excitation light which is slightly divergent parallel to the grid lines, but parallel in the perpendicular projection, are hidden by a slit.
  • the resulting light beam with a slit-shaped cross section on the lattice structure is directed onto the right edge of the lattice structure I.
  • the excitation light spot has a size of 1 mm length x 12 mm width.
  • the sensor platform is adjusted for maximum coupling, which can be recognized from the maximum intensity of the scattered light which is emitted by scattering along the coupled-in excitation light.
  • This maximum can be determined both visually and by imaging the scattered light detected with an imaging system along the excitation mode onto an optoelectronic detector, e.g. B. on the pixels of a CCD camera as an example of a spatially resolving detector or a photodiode as an example of a non-spatially resolving detector.
  • a maximum signal is also measured with a second optoelectronic detector at the coupling angle for the guided excitation light on the second grating structure II. An angle of -3.9 ° is determined as the resonance angle for the coupling.
  • the excitation light of a helium-neon laser is broken down with a Dammann grating into 16 partial beams arranged linearly parallel to the grating lines.
  • the manufacturer optimized the non-uniform sequence of grooves and ridges of the Dammann grating in such a way that all even-numbered diffraction orders, in particular the zero order, were suppressed and the same intensity (with a variation of less than 5%) was achieved in the odd-numbered diffraction orders .
  • An aspherical lens after the Dammann grating in the direction of the sensor platform, in the focal point of which is the Dammann grating, is used to generate a bundle of parallel partial beams from the partial beams divergent after the Dammann grating.
  • the divergence of the partial beams emerging after the Dammann grating and the focal length of the lens located behind them can be coordinated with one another in such a way that a desired beam distance on the Senso ⁇ lattform is generated.
  • 16 partial beams were generated with the Dammann grating used, of which, after passing through a slit-shaped diaphragm, 8 partial beams were directed via a deflection prism onto the right edge of the grating structure I serving as a coupling grating.
  • the coupling condition could be fulfilled for all 8 partial beams at the same time, which was evident from the simultaneous maximum intensity of the scattered light generated along the coupled partial beams and guided in the wave-guiding layer (a).
  • the coupling angle was -3.8 °.
  • the excitation light beam of a helium-neon laser at 632.8 nm is widened to a parallel beam with a circular cross section of 2 cm in diameter using a 25-fold expansion optics.
  • An area of 1 mm length x 9 mm width (corresponding to the designations for the lattice structures) is selected from the central part of the excitation light bundle and guided via a deflection prism to the right edge of the lattice structure I (in the direction of the excitation light to be coupled in and guided).
  • the sensor platform is adjusted for maximum coupling, which can be recognized from the maximum intensity of the scattered light which is emitted by scattering along the coupled-in excitation light.
  • This maximum can be determined both visually and by imaging the scattered light detected with an imaging system along the excitation mode onto an optoelectronic detector, e.g. B. on the pixels of a CCD camera as an example of a spatially resolving detector or a photodiode as an example of a non-spatially resolving detector. Under the same coupling conditions, a maximum signal is also measured with a second optoelectronic detector at the coupling angle for the guided excitation light on the second grating structure II.
  • an optoelectronic detector e.g. B. on the pixels of a CCD camera as an example of a spatially resolving detector or a photodiode as an example of a non-spatially resolving detector.
  • An angle of -3.8 ° is determined as the resonance angle for the coupling.
  • the amount of light that passes through is measured with a laser power meter behind the position of the sensor platform.
  • a value of 88 ⁇ W is determined as the available excitation intensity (without the sensor platform in the beam path). With the sensor platform in between, but without coupling into the wave-guiding layer, the transmission is 79 ⁇ W. When the coupling is fulfilled this value decreases to 21 ⁇ W, ie 24% of the total available excitation light.
  • the excitation light beam of a helium-neon laser at 632.8 nm is widened to a parallel beam with a circular cross section of 2 cm in diameter using a 25-fold expansion optics.
  • An area of 4 mm length x 9 mm width (corresponding to the designations for the lattice structures) is selected from the central part of the excitation light bundle and then directed via a deflection prism to the right edge of the lattice structure I (in the direction of the excitation light to be coupled in and guided) .
  • the Senso ⁇ lattform is adjusted to maximum coupling, which is recognizable by the excitation light guided along the coupled mode by scattered light.
  • An angle of -4 ° is determined as the resonance angle for the coupling.
  • the sensor platform is laterally shifted without changing the angle so that the 4 mm long excitation light surface is in the middle of the 5 mm long grid structure.
  • the amount of light that passes through is measured with a laser power meter behind the position of the sensor platform.
  • a value of 250 ⁇ W is determined as the available excitation intensity (without a sensor platform in the beam path).
  • the transmission is 240 ⁇ W. If the coupling is fulfilled, this value decreases to 51 ⁇ W, i.e. H. 20% of the total available excitation light.
  • the signal was captured and focused on the CCD chip using a Heligon tandem lens (Rodenstock, two XR Heligon 1.1 / 50 mm). Mounted on a filter wheel, between the two halves of the Heligon tandem objective were 2 interference filters (Omega, Brattleborough, Vermont) with a central wavelength of 679 nm and 25 nm bandwidth, as well as either a neutral filter (for transmission of the attenuated, scattered excitation and much weaker luminescent light from the measuring ranges) or a neutral filter in combination with an interference filter (for the transmission of the attenuated excitation light scattered from the measuring ranges). The signals at the excitation and the luminescence wavelength were measured alternately.
  • the signal acquisition and focusing on the CCD chip was carried out with a Heligon tandem lens as in the previous example. Between the two halves of the Heligon tandem lens, in the direction of propagation of the emission beam path in the direction of the detector, there was initially a beam part plate at 45 ° for right-angled reflection of the light component reflected by Fresnel reflection (predominantly consisting of light at the excitation wavelength) and then 2 interference filters (Omega, Brattleborough, Vermont) with a central wavelength of 679 nm and 25 nm bandwidth for the selective transmission of luminescent light.
  • the light reflected from the emission beam path via the beam part plate was passed either directly or after passing through an interference filter for the excitation wavelength to a spatially resolving detector or a non-spatially resolving detector.
  • the reference signals which, as in the above examples for the detection unit, each capture the same areas on the sensor platform, were recorded simultaneously with the luminescence signals from the measurement areas. (ii). Detection system for sequential measurement of measuring ranges
  • the measuring range to be imaged on the Senso ⁇ latform is in the focus of a lens system, which depicts the measuring range on a diaphragm in a 1: 1 image, with which areas outside the relevant measuring range can be masked out.
  • the diaphragm is in turn in the focal point of the first of a system consisting of at least 2 lenses, so that a parallel beam path is then generated again in the direction of the detector.
  • the parallel beam path there is initially a beam partial plate at 45 ° to the parallel beam path, with which part of the detected light, which mainly comprises scattered light at the excitation wavelength, is used in the direction of the reference detector, for example by means of Fresnel reflections.
  • a phodiode mt downstream amplifier reflected, possibly after passing through an interference filter at the excitation wavelength.
  • the luminescent light that spreads further after the beam part plate is selected by means of two interference filters (Omega Optical, 679 DF25) and focused on the detector, which serves as a selected photomultiplier in conjunction with a photon counting unit (Hamamatsu H6240-02 select).
  • the sensor platform is shifted in the x and y directions by means of the adjusting elements described under example 2.a).
  • a combination of simultaneous excitation of several measuring ranges and signal detection by means of spatially resolving detectors and translation steps for detecting larger parts of the sensor platform than can be excited and detected in a single step can also be carried out.
  • a sensor platform according to example la) is used with an excitation unit according to example 2 a.iv).
  • the detection unit is designed according to Example 2.b.i.I).
  • a closed sample container with a sample chamber open to the sensor platform is used, which encloses the entire area including the lattice structures I and II with a width of 8 mm.
  • the material of the sample container advantageously consists of a self-adhesive, flexible and fluid-sealing, fluorescence-free and low-reflection plastic, in the exemplary embodiment of blackened polydimethylsiloxane.
  • the depth of the sample chamber is 0.1 mm, so that the total volume of the sample chamber is approximately 25 ⁇ L.
  • the continuous sample chamber is used for the simultaneous application of one and the same sample or reagents to all measuring ranges.
  • the sample and reagents are supplied with syringe pumps (Cavro XL 3000, Cavro, Sunnyvale, CA, USA) with a dosing accuracy of 1 ⁇ l - 10 ⁇ l, depending on the size of the syringe.
  • the syringe pumps are part of a Ruidik system, which also includes a commercial autosampler (Gilson 231 XL), one or more multi-way valves and a sample loop. By switching one or more valves and transporting them through the pumps, different reagents or samples can be directed to the measuring ranges.
  • a sensor platform according to example la) is used with an excitation unit according to example 2 a.ii).
  • the detection unit is designed according to Example 2.biI).
  • a closed flow cell with 5 parallel sample chambers open to the sensor platform, each 1 mm wide, at a distance of 1 mm, is used, which extends up to the lattice structures I and II extend out.
  • the depth of the sample chamber is 0.1 mm, so that the total volume of the sample chambers comprises approximately 2.5 ⁇ L each.
  • the 5th Sample chambers are used to apply the same or different samples or reagents to the measuring ranges addressed from above.
  • the sample and reagents are supplied with syringe pumps (Cavro XL 3000, Cavro, Sunnyvale, CA, USA) with small syringe sizes 50 ⁇ l - 250 ⁇ l, with which a dosing accuracy of approximately 0.5 ⁇ l can be achieved.
  • the syringe pumps are part of a fluidic system that also includes a commercial autosampler (Gilson 231 XL), one or more multi-way valves, and one or more sample loops. By switching one or more valves and transporting them through the pumps, various reagents or samples can be directed to the measuring ranges.
  • a sensor platform according to example lb) is used with a monodiffractive lattice structure formed over the entire sensor platform, and an excitation unit according to example 2 a.v).
  • the detection unit is designed according to Example 2.b.i.I).
  • the sensor platform is arranged horizontally.
  • the structure for the sample containers is formed from a 1 to 3 mm thick, self-adhesive and fluid-sealing, flexible plate made of blackened polydimethylsiloxane, into which a multitude of continuous recesses (with typical diameters of 1 mm - 3 mm) have been made, which geometrically correspond to the correspond to measurement areas that are individually fluidically addressed or measurement areas combined into segments.
  • the PDMS plate structured in this way which can be molded in high piece steel from a corresponding master (just like the sample containers mentioned above as an example), is brought into contact with the surface of the sensor platform and adheres to one another on this sub-fluidic seal of the cutouts.
  • the same or different samples and reagents, individually addressed, are added to or drawn from the sample containers with a single or multiple parallel dispenser.
  • the Ruidik application steps are carried out under a saturated water vapor atmosphere.
  • the dispenser is part of a Ruidik system, which also includes a commercial autosampler (Gilson 231 XL), one or more multi-way valves and a sample loop. By switching one or more valves and transporting them through the pumps, different reagents or samples can be directed to the measuring ranges.
  • a commercial autosampler Gilson 231 XL
  • a sensor platform according to example lb) is used with a monodiffractive lattice structure formed over the entire sensor platform, and an excitation unit according to example 2.a.v).
  • the detection unit is designed according to Example 2.b.i.I).
  • the sensor platform In order to allow the addition or removal of samples and reagents to the individually addressable measuring areas or segments, the sensor platform is arranged horizontally.
  • the same or different samples and reagents, individually addressed, are applied to the measuring areas or segments with a single or multiple parallel dispenser or are extracted from them.
  • the Ruidik application steps are carried out under a saturated water vapor atmosphere.
  • the dispenser is part of a Ruidik system, which also includes a commercial autosampler (Gilson 231 XL), one or more multi-way valves and a sample loop. By switching one or more valves and transporting them through the pumps, different reagents or samples can be directed to the measuring ranges.
  • Ruidik system also includes a commercial autosampler (Gilson 231 XL), one or more multi-way valves and a sample loop.
  • Hybridization buffer consisting of 326 mL 0.070 M phosphate buffer (pH 7), 29.5 g KCL, 0.09 g EDTA x 2 H 2 0, 2.25 g poly (acrylic acid) 5100 sodium salt, 2.25 g Tween 20, 1.13 g of sodium azide, made up to 4.5 l with distilled water and adjusted to pH 7.7 with 1 molar sodium hydroxide solution.
  • Regeneration solution 0.22 g sodium chloride, 0.11 g sodium citrate, 2.5 g Tween 20, 142 g formamide and 0.13 g sodium azide, dissolved in 250 mL deionized water.
  • a sensor platform according to example la) is used with a
  • the measuring procedure consists of the following individual steps:
  • a sensor platform according to example lb) is used with a
  • the measuring procedure consists of the following individual steps:
  • the sensor platform was shifted so far in the longitudinal direction without changing the angle that part of the excitation light, which was coupled in near the right edge of the lattice structure 1, could spread further in the optically transparent layer a) in the direction of the lattice structure II, where it was then was decoupled.
  • the second 6 x 6 array of measurement areas lying between these lattice structures was excited, as an example for a segment of measurement areas.
  • the top two rows of the array were at the top of the sample container. The signals from the relevant measuring ranges were not taken into account in the evaluation.
  • a sensor platform with the outer dimensions 16 mm wide x 48 mm long x 0.7 mm thick was used.
  • the optically transparent layer (a) on the optically transparent layer (b) made of Ta 2 0 5 was produced by reactive, magnetic field-assisted DC sputtering and had a refractive index of 2.15 at 633 nm (layer thickness 150 nm).
  • the sensor platform contained 2 discrete lattice structures, each with a period of 360 nm, with the same arrangement as in example la) (dimensions of 5 mm length x 12 mm width or 1 mm length x 12 mm width, with depths of 12 + / - 3 nm).
  • the lattice structures were not used in the measuring method described below, neither for luminescence excitation nor for luminescence detection.
  • a sensor platform with the outer dimensions 16 mm wide x 48 mm long x 0.7 mm thick was used, with similar physical parameters as example b).
  • a continuous structure of a surface relief grating with a period of 360 nm and a depth of again 25 +/- 5 nm was produced in the substrate by means of holographic exposure of the waveguiding layer (a) covered with spun-on photoresist and subsequent wet chemical etching, with the grating lines being oriented in parallel to the declared width of the sensor platform.
  • the wave-guiding, optically transparent layer (a) on the optically transparent layer (b) made of Ta 2 ⁇ 5 was generated by reactive, magnetic field-assisted DC sputtering (see DE 4410258) and had a refractive index of 2.15 at 633 nm (layer thickness 150 nm ).
  • excitation light of 633 nm can be coupled into the structure at an angle of approximately + 3 °; Coupling or coupling out of light with a wavelength of 670 nm (corresponding to the maximum of the ruorescence of Cy5) takes place at an angle of approximately -6 °.
  • CCGTAACCTCATGATATT-3'-NH2 (18 * Cy5-NH2) two arrays of 16 x 8 spots (8 rows x 16 columns) each applied (50 pl per spot).
  • the concentration of the applied solutions was alternately 10 " per row or 10 " M 18 * Cy5-NH2, so that the spots produced (approx. 125 ⁇ m diameter in a center-to-center distance of 375 ⁇ m) had ruorophore concentrations of approx. 100 or 10 ruorophores per ⁇ m 2 .
  • the spot arrays each about 3.2 mm wide x 5.8 mm long, were arranged one behind the other at a distance of 3.3 mm on the Senso l platforms, so that in the case of the Senso o platform (i), both arrays were a few millimeters apart from the next coupling grids.
  • the intensity of the fluorescence intensity in the spot arrays on the sensor platforms (i) and (ii) was measured with a commercial scanner (Genetic Microsystems 418 Array Scanner), while the excitation light was irradiated in a reflected light arrangement with a convergent excitation light bundle.
  • the optical axis of the excitation light beam was oriented perpendicular to the sensor platform.
  • the excitation light intensity was about 5 mW.
  • the numerical aperture of the objective lens of the laser scanner is what corresponds to a half opening angle of approximately 53 °.
  • the scan speed corresponded to the information in the product catalog (18 mm / min with a scan width of 22 mm).
  • the significant increase in the observed ruorescence intensity can be explained by the fact that a considerable proportion of the non-vescent excited ruorescence is coupled into the ruorophores located in the near field of the optically transparent layer (a). Via the continuously modulated lattice structure, however, it is coupled out again after a very short run length, which is dependent on the depth of the lattice structure. Since the decoupling takes place at an angle of approximately -6 ° due to the given parameters of the sensor platform, the decoupled portion is also detected by the detector due to the high numerical aperture of the objective. A certain portion of the observed increase in luminescence may additionally be attributed to a small portion of the coupled excitation light. The high efficiency of the decoupling is shown by the fact that there are no significant differences in the background signals, so that crosstalk of feedback Ruorescence light in neighboring measurement areas can be effectively prevented according to the invention.
  • the intensity of the fluorescence intensity in the spot arrays on the sensor platforms (i) and (ii) was measured with a commercial scanner (Genetic Microsystems 418 Array Scanner), while the excitation light was irradiated in a reflected light arrangement with a convergent excitation light bundle.
  • the optical axis of the excitation light beam was oriented perpendicular to the sensor platform.
  • the excitation light intensity was about 5 mW.
  • the numerical aperture of the objective lens of the laser scanner is what corresponds to a half opening angle of approximately 53 °.
  • the scan speed corresponded to the information in the product catalog (18 mm / min with a scan width of 22 mm).
  • the significant increase in the observed fluorescence intensity can be explained by the fact that a significant proportion of the non-vanescent excited ruorescence couples into the ruorophores located in the near field of the optically transparent layer (a). Via the continuously modulated lattice structure, however, it is coupled out again after a very short run length, which is dependent on the depth of the lattice structure. Since the decoupling takes place at an angle of approximately -6 ° due to the given parameters of the sensor platform, the decoupled portion is also detected by the detector due to the high numerical aperture of the objective. A certain portion of the observed increase in luminescence may additionally be attributed to a small portion of the coupled excitation light. The high efficiency of the coupling-out can be seen in the fact that there are no significant differences in the background signals, so that crosstalk from the feedback fluorescent light into neighboring measuring ranges can be effectively prevented according to the invention.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine variable Ausführungsform einer Sensorplattform basierend auf einem planaren Dünnschichtwellenleiter zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem oder mehreren Messbereichen auf dieser Sensorplattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer Gitterstruktur zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen oder Auskopplung von Lumineszenzlicht aus den Messbereichen. Ferner betrifft die Erfindung auch ein optisches System zur Lumineszenzbestimmung, sowie ein analytisches System, welches eine erfindungsgemässe Sensorplattform, ein erfindungsgemässes optisches System sowie Zuführungsmittel, um eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt zu bringen, umfasst. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Lumineszenznachweisverfahren, sowie die Verwendung dieser Verfahren.

Description

Sensorplattform und Verfahren zur Multianalytbestimmung
Die Erfindung betrifft eine variable Ausführungsform einer Sensorplattform basierend auf einem planaren Dünnschichtwellenleiter zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem oder mehreren Messbereichen auf dieser Sensorplattform, umfassend einen optischen Schicht Wellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und mindestens einer Gitterstruktur zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen. Die Erfindung betrifft auch ein optisches System zur Lumineszenzbestimmung mit einer Anregungslichtquelle, einer erfindungsgemässen Ausführung einer Sensorplattform und mindestens einem Detektor zur Erfassung des von den Messbereichen auf der Sensorplattform ausgehenden Lichts sowie ein analytisches System, welches eine erfindungsgemässe Sensorplattform, ein erfindungsgemasses optisches System sowie Zuführungsmittel, um eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt zu bringen, umfasst. Weitere Gegenstände der Erfindung sind Lumineszenznachweisverfahren mit erfindungsgemässen Sensoφlattformen, optische Systeme und analytische Systeme sowie die Verwendung dieser Verfahren für die quantitative Affmitätssensorik sowie für verschiedene weitere Anwendungen.
Ziele der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung von Sensorplattformen sowie von optischen und analytischen Messanordungen für einen hochempfindlichen Nachweis eines oder mehrerer Analyten.
Koppelt man eine Lichtwelle in einen planaren Dünnschichtwellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem: Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat ( bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt. Zusätzliche Zwischenschichten können die Wirkung des planaren Wellenleiters noch verbessern.
In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil der elektromagnetischen Energie ein. Diesen Anteil bezeichnet man als ein evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst, sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden.
Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächenkopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.
Es können verschiedene Methoden zum Analytnachweis im evaneszenten Feld geführter Lichwellen in optischen Schichtwellenleitern unterschieden werden. Aufgrund des eingesetzten Messprinzips kann man beispielsweise zwischen Fluoreszenz- oder allgemeiner Lumineszenzmethoden auf der einen Seite und refraktiven Methoden andererseits unterscheiden. Hierbei können Verfahren zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz in einer dünnen Metallschicht auf einer dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex in die Gruppe der refraktiven Methoden mit einbezogen werden, sofern als Basis zur Bestimmung der Messgrösse der Resonanzwinkel des eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung des Oberflächenplasmonenresonanz dient. Die Oberflächenplasmonenresonanz kann aber auch zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zu-Hintergrund- Verhältnissen in einer Lumineszenzmessung verwendet werden. Die Bedingungen zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz, sowie zur Kombination mit Lumineszenzmessungen, sowie mit wellenleitenden Strukturen sind vielfach in der Literatur beschrieben, beispielsweise in den US-Patenten US 5478755, US 5841143, US 5006716 und US 4649280.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen.
Bei den refraktiven Messmethoden wird die Änderung des sogenannten effektiven Brechungsindex aufgrund molekularer Adsoφtion oder Desoφtion auf dem Wellenleiter zum Nachweis des Analyten benutzt. Diese Änderung des effektiven Brechungsindex wird, im Falle von Gitterkoppler- Sensoren, bestimmt aus der Änderung des Koppelwinkels für die Ein- oder Auskopplung von Licht in oder aus dem Gitterkoppler-Sensor, und im Falle von interf erometrischen Sensoren aus der Änderung der Phasendifferenz zwischen dem in einem Sensorarm und einem Referenzarm des Interf erometers geführten Messlichts.
Der Stand der Technik zum Einsatz von einem oder mehreren Koppelgittern zum Ein- und/oder Auskoppeln geführter Wellen mittels eines oder mehrerer Koppelgitter ist beispielsweise in K. Tiefenthaler, W. Lukosz,"Sensitivity of grating couplers as integrated-optical chemical sensors", J. Opt. Soc. Am. B6, 209 (1989); W. Lukosz, Ph.M. Nellen, Ch. Stamm, P. Weiss, "Output Grating Couplers on Planar Waveguides as Integrated, Optical Chemical Sensors", Sensors and Actuators Bl, 585 (1990), und in T. Tamir, S.T. Peng, „Analysis and Design of Grating Couplers", Appl. Phys. 14, 235-254 (1977), beschrieben.
Die genannten refraktiven Methoden haben den Vorteil, dass sie ohne Verwendung zusätzlicher Markierungsmoleküle, sogenannter molekularer Labels, eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser labelfreien Methoden ist jedoch, dass die damit erzielbaren Nachweisgrenzen aufgrund der geringen Selektivität des Messprinzips, in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des Analyten auf pico- bis nanomolare Konzentrationsbereiche beschränkt sind, was für viele Anwendungen der modernen Spurenanalytik, beispielsweise für diagnostische Applikationen, nicht ausreichend ist.
Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenzbasierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet. Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt.
Für die Analytik ist die evaneszente Lumineszenzanregung von grossem Interesse, da die Anregung auf die direkte Umgebung der wellenleitenden Schicht beschränkt ist und störende Einflüsse aus der Tiefe des Mediums minimiert werden können.
Photometrische Instrumente zur Bestimmung der Lumineszenz von Biosensoren unter evaneszenten Anregungsbedingungen mit planaren optischen Wellenleitern sind ebenfalls bekannt und zum Beispiel in der WO 90/06503 beschrieben. Die dort verwendeten wellenleitenden Schichten sind 160 nm bis 1000 nm dick, die Einkopplung der Anregungs welle erfolgt ohne Gitterkoppler.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, die Empfindlichkeit evaneszent angeregter Lumineszenz zu steigern und integrierte optische Sensoren herzustellen. So wird zum Beispiel in Biosensors & Bioelectronics 6 (1991), 595-607 über planare mono- oder nieder-modale Wellenleiter berichtet, die in einem zweistufigen Ionenaustauschverfahren hergestellt werden, und bei denen die Einkopplung der Anregungswelle mit Prismen erfolgt. Als Affinitätssystem wird humanes Immunoglobulin G / fluorescein- markiertes Protein A verwendet, wobei der Antiköφer auf dem Wellenleiter immobilisiert und das nachzuweisende fluoresceinmarkierte Protein A in Phosphatpuffer einem Film aus Polyvinylalkohol zugesetzt wird, mit dem die Messregion des Wellenleiters überzogen wird.
Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass nur geringe Brechungsindexunterschiede zwischen wellenleitender Schicht und Substratschicht erreichbar sind, was eine verhältnismässig geringe Empfindlichkeit zur Folge hat.
Die Empfindlichkeit wird mit 20 nM fluoresceinmarkiertem Protein A angegeben. Um geringste Spuren bestimmen zu können, ist dies noch unbefriedigend und daher eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit notwendig. Darüberhinaus erscheint die Reproduzierbarkeit und praktische Durchführbarkeit der Lichteinkopplung durch Prismen aufgrund der grossen Abhängigkeit der Einkoppeleffizienz von Qualität und Grosse der Kontaktfläche zwischen Prisma und Wellenleiter schwierig. In der US-A-5 081 012 wird ein anderes Prinzip vorgeschlagen. Die planare wellenleitende Schicht ist 200 nm bis 1000 nm dick und enthält zwei Gitter, von denen eines als Reflexionsgitter ausgebildet ist, so dass die eingekoppelte Lichtwelle den zwischen den Gittern liegenden Sensorbereich mindestens zweimal durchlaufen muss. Auf diese Weise soll eine erhöhte Empfindlichkeit erreicht werden. Ein Nachteil ist, dass die reflektierte Strahlung zu einer unerwünschten Erhöhung der Untergrund- Strahlungsintensität führen kann.
In der WO 91/10122 wird ein dünnschichtiger spektroskopischer Sensor beschrieben, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Einkoppelgitter und ein räumlich entferntes Auskoppelgitter aufweist. Er eignet sich insbesondere zur Absoφtionsmessung, wenn als wellenleitende Schicht ein hochbrechendes anorganisches Metalloxid verwendet wird. Es werden verschiedene Ausführungsformen beschrieben, welche zum Ein- und Auskoppeln von multichromatischen Lichtquellen geeignet sind. Die bevorzugte Dicke der wellenleitenden Schicht ist grösser als 200 nm und die Gittertiefe soll ca. 100 nm betragen. Diese Bedingungen sind für Lumineszenzmessungen in der Affinitätssensorik nicht geeignet, da nur eine geringe Empfindlichkeit erhalten wird. Dies wird in Appl. Optics Vol. 29, No. 31, (1990), 4583-4589 durch die Angaben der Gesamteffizienz bei 633 nm von 0,3% und bei 514 nm von 0,01% für diese Systeme bestätigt.
In einer anderen Ausführungsform desselben Sensors werden mehrere polymere planare wellenleitende Schichten auf einem Substrat aufgebracht, die als Gasgemischanalysator verwendet werden können. Man macht sich dabei die Änderung des effektiven Brechungsindex oder die Schichtdickenänderung des polymeren Wellenleiters beim Kontakt mit z. B. Lösungsmitteldämpfen zunutze. Die wellenleitende Struktur wird dabei physikalisch verändert. Derartige Änderungen sind jedoch für Lumineszenzmessungen in der Affinitätssensorik vollständig ungeeignet, da sich dadurch die Einkopplung ändert, zunehmende Streuung auftritt und die Empfindlichkeit deutlich abnehmen kann.
Es sind andere Anordnungen bekannt geworden, bei denen eine Lumineszenzverstärkung ohne direkte Einkopplung von Anregungslicht, aber vermittelt über Nahfeldeffekte durch Anregung lumineszenter Moleküle an oder nahe (d.h. im Abstand von bis zu einigen hundert Nanometern) der Oberfläche eines Wellenleiters erfolgen soll. So wird in der US 4649280 ein Mehrschichtsystem aus einem leitfähigen und reflektierenden Material (zum Beispiel Silber) auf einem Substrat, einem dielektrischen optischen Wellenleiter (zum Beispiel aus Lithiumfluorid mit Brechnungsindex von nur 1.39) und einem darauf abgeschiedenen Film fluoreszenzfähiger Moleküle beschrieben. In einer Weiterbildung wird in der US 5006716 zusätzlich vorgeschlagen, den leitfähigen Film in Form eines Oberflächen-Reliefgitters auszubilden, dessen Form sich im Laufe der Abscheideprozesse zur Erzeugung der Gesamtstruktur bis zur Oberfläche abbildet. Als Vorteil dieser Modifikation wird beschrieben, dass mittels des Gitters in die wellenleitende Schicht eingekoppeltes Lumineszenzlicht in diskrete Raumrichtungen, entsprechend den ausgekoppelten Beugungsordnungen und den im Wellenleiter geführten Moden, ausgekoppelt werden kann, so dass ein grösserer Anteil der Lumineszenz von einem Detektor erfasst werden kann, wenn er in Richtung des ausgekoppelten Lumineszenzlichts positioniert ist. Essentieller Bestandteil dieser Anordnungen mit einer wellenleitenden Schicht relativ niedrigen Brechungsindexes ist jedoch die Existenz der darunter befindlichen, reflektierenden Metallschicht.
Für eine reproduzierbare Herstellung erscheint ein einfacheres Zweischichtensystem, wie beispielsweise ein Dünnschichtwellenleiter, jedoch besser geeignet. Auch ist es wünschenswert, einen wellenleitenden Film mit möglichst hohem Brechungsindex zu verwenden, um damit die Intensität des evaneszenten Feldes zu steigern.
Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Beispielsweise wird in der WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film eingekoppelt wird. Die Oberfläche der Sensoφlattform wird mit einer den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, und die isotrop abgestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben. Ein Nachteil aller oben im Stand der Technik, insbesondere in der WO 95/33197 und WO 95/33198 beschriebenen Verfahren zur Detektion evaneszent angeregter Lumineszenz liegt darin, dass auf der als homogener Film ausgebildeten wellenleitenden Schicht der Sensoφlattform jeweils nur eine Probe analysiert werden kann. Um weitere Messungen auf derselben Sensoφlattform durchführen zu können, sind fortlaufend aufwendige Wasch- bzw. Reinigungsschritte notwendig. Dies gilt insbesonders, wenn ein von der ersten Messung verschiedener Analyt detektiert werden soll. Im Falle eines Immunoassays bedeutet dies im allgemeinen, dass die gesamte immobilisierte Schicht auf der Sensoφlattform ausgetauscht oder gleich eine neue Sensoφlattform als Ganzes verwendet werden muss.
Es besteht daher das Bedürfnis ein Verfahren zu entwickeln, welches es erlaubt, parallel, das heisst gleichzeitig oder direkt hintereinander ohne zusätzliche Reinigungsschritte, mehrere Proben zu analysieren.
In der WO 95/03538 wird zum Beispiel vorgeschlagen, über einer durchgehenden wellenleitenden Schicht mehrere Probenzellen anzubringen, die in Form von Vertiefungen in einer Probenplatte über der wellenleitenden Schicht ausgebildet sind. Unter jeder Probenzelle befindet sich ein Gitter, welches einen Teil des in der wellenleitenden Schicht geführten Lichtes auskoppelt. Der Nachweis des Analyten beruht auf der Änderung des Auskoppelwinkels in Abhängigkeit von der Analytkonzentration. Diese auf der Änderung des Brechungsindex basierenden Verfahren sind in der Regel deutlich weniger empfindlich als Lumineszenzverfahren.
In der WO 94/27137 wird beispielsweise eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Durchführung von Immunoassays mittels evaneszent angeregter Fluoreszenz vorgeschlagen. Die Vorrichtung besteht aus einem durchgehenden optischen Wellenleiter mit zwei planparallelen Oberflächen und einer Seitenkante, die in Verbindung mit einer Linse als Einkoppelelement wirkt. Auf mindestens einer Oberfläche sind eine Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern immobilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese spezifischen Bindungspartner räumlich getrennt auf dem durchgehenden Wellenleiter angeordnet. Im Ausführungsbeispiel sind sie fleckenartig über die Wellenleiteroberfläche verteilt.
Anhand der offenbarten Ausführungsformen muss davon ausgegangen werden, dass die Einkoppeleffizienz über die Seitenkante niedriger ist als im Falle einer Gittereinkopplung, weiterhin ist wegen der grossen Schichtdicke (selbsttragender Wellenleiter) die evaneszente Feldstärke und damit auch die Anregungseffizienz wesentlich niedriger als bei monomodalen Wellenleitern niedrigerer Schichtdicke. Insgesamt wird die Empfindlichkeit der Anordnung dadurch limitiert.
Diese Anordnungen, bei denen verschiedene spezifische Bindungspartner auf einer durchgehenden wellenleitenden Schicht aufgebracht sind, weisen auch den Nachteil auf, dass das Anregungslicht die Gesamtheit der fluorophormarkierten Moleküle anregt. Eine räumliche Auswahl von Messstellen ist so nicht möglich. Darüberhinaus können evaneszent rückgekoppelte Fluoreszenzphotonen zum Signal des Nachbarflecks beitragen und so zu Messfehlern führen.
In der integrierten Optik für Anwendungen in der Telekommunikation sind planare optische Bauelemente auf Glasbasis bekannt, die Wellenleiter in Kanalform enthalten, deren wellenleitende Kanäle durch Austausch einzelner Ionen an der Oberfläche unter Zuhilfenahme von Masken hergestellt werden (Glastechnische Berichte Vol. 62, Seite 285, 1989). Es resultiert eine physikalisch durchgängige Schicht, die in den mit Ionen dotierten Kanälen einen geringfügig erhöhten Brechungsindex aufweist. Die Erhöhung liegt in der Regel unter 5%. Die Herstellung derartiger Bauelemente ist aufwendig und teuer.
R. E. Kunz beschreibt in SPIE Vol 1587 Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors III (1991), Seiten 98 - 113 sich verzweigende und wieder zusammengeführte optische Wellenleiter, die vor allem für integrierte optische Geräte wie zum Beispiel Interferometer geeignet sind. Derartige Strukturen sind für die evaneszent angeregte Lumineszenzmessung ungeeignet, da man die Elemente nicht einzeln ansprechen kann, und durch die Anordnung mehrerer Verzweigungen hintereinander rasch hohe Intensitätsverluste der am ersten Zweig eingekoppelten Lichtwelle entstehen. Da der Öffnungswinkel solcher Verzweigungen klein ist, typisch sind 3°, sind die Abstände zwischen den zwei Ästen der Verzweigung bei kleinen Bauteilen gering oder die Bauteile müssen entsprechend grösser dimensioniert werden, was im allgemeinen unerwünscht ist. Darüberhinaus ist die feste Phasenbeziehung der verzweigten Wellen untereinander für Lumineszenzmessungen unnötig.
In der WO 99/13320 wird ein optischer Sensor zur Detektion von mindestens zwei unterschiedlichen Lichtanteilen beansprucht. Diese Anmeldung bezieht sich vorwiegend auf refraktive Messmethoden, jedoch werden auch Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzmethoden zur Erzeugung des Messsignals beansprucht. In der WO 99/13320, welche sich auch auf Multianalytbestimmungen bezieht, werden eine Reihe unterschiedlicher Definitionen für die Erzeugung mehrerer "sensing pads", auch auf demselben physikalischen Bereich (Wellenleitergitterstruktur entsprechend der in der WO 99/13320 benutzten Nomenklatur) des beanspruchten Sensors, gegeben. Es wird jedoch kein Hinweis gegeben auf eine Anordnung mehrerer Messbereiche, nach der in unserer Anmeldung nachfolgenden Definition, auf einer durchgehend modulierten Gitterstruktur entsprechend der ebenfalls nachfolgenden Definition unserer Anmeldung. Weiterhin findet sich kein Hinweis darauf, wie ein störendes Übersprechen von Messlicht auf benachbarte Messbereiche, insbesondere von in die wellenleitende Schicht rückgekoppeltem Lumineszenzlicht, bei einer hohen Dichte von Messbereichen auf der Sensoφlattform, verhindert werden kann.
Die Lösung dieses Problems ist von zentraler Bedeutung, um eine weitestmögliche Miniaturisierung der Sensoφlattform zur Bereitstellung einer grösstmöglichen Anzahl verschiedener Messbereiche auf einer gemeinsamen Plattform zu erreichen.
Zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Durchführung von ausschliesslich lumineszenzbasierenden Mehrfachmessungen mit im wesentlichen monomodalen, planaren anorganischen Wellenleitern sind, z. B. in der WO 96/35940, Vorrichtungen (Arrays) bekannt geworden, in denen auf einer Sensoφlattform wenigstens zwei getrennte wellenleitende Bereiche angeordnet sind, die getrennt mit Anregungslicht beaufschlagt werden. Die Aufteilung der Sensoφlattform in getrennte wellenleitende Bereiche hat allerdings nachteilig zur Folge, dass der Platzbedarf für diskrete Messbereiche, in diskreten wellenleitenden Bereichen auf der gemeinsamen Sensoφlattform relativ gross ist und daher wieder nur eine verhältnismässige geringe Dichte unterschiedlicher Messfelder (oder sogenannter "features") erreicht werden kann.
Es besteht daher der Bedarf nach einer Vergrösserung der Feature-Dichte bzw. nach einer Verkleinerung der erforderlichen Fläche pro Messbereich.
Basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, ohne zusätzliche wellenleitende Schichten, sind Arrays mit einer sehr hohen Feature-Dichte bekannt. Beispielsweise werden in der US 5445934 (Affymax Technologies) Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht. Die Anregung und das Auslegen solcher Arrays beruht auf klassischen optischen Anordnungen und Methoden. Es kann das ganze Array gleichzeitig mit einem aufgeweiteten Anregungslichtbündel beleuchtet werden, was jedoch zu einer relativ geringen Empfindlichkeit führt, da der Streulichtanteil relativ gross ist und Streulicht oder Untergrundfluoreszenzlicht aus dem Glassubstrat auch in den Bereichen erzeugt wird, in denen sich keine zur Bindung des Analyten immobilisierten Oligonukleotide befinden. Um die Anregung und Detektion auf die Bereiche der immobilisierten Features zu beschränken und Lichterzeugung in den Nachbarbereichen zu unterdrücken, werden vielfach konfokale Messanordnungen eingesetzt und die verschiedenen Features sequentiell mittels "Scannen" ausgelesen. Dieses hat jedoch einen grösseren Zeitaufwand zum Auslesen eines grossen Arrays und einen relativ komplexen optischen Aufbau zur Folge.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einer Ausgestaltung der Sensoφlattform und nach einer optischen Messanordnung, womit eine ebenso hohe Empfindlichkeit erzielt werden kann, wie diese mit Sensoφlattformen basierend auf Dünnschichtwellenleitern ereicht wurde, und mit der zugleich die Messfläche pro Feature minimiert werden kann.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass bei geeigneter Wahl der Parameter, insbesondere der Gittertiefe, einer an einen Messbereich angrenzenden Gitterstruktur (c') auf einer Sensoφlattform mit wellenleitender Schicht (a), in welche Anregungslicht über eine Gitterstruktur (c) eingekoppelt wurde, das in die Schicht (a) rückgekoppelte Lumineszenzlicht über kürzeste Strecken, d.h. wenige hundert Mikrometer vollständig ausgekoppelt und damit an einer weiteren Ausbreitung in der wellenleitenden Schicht (a) gehindert wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen räumlich getrennte Messbereiche (d) durch die Räche definiert werden, die dort immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselementen zur Erkennung eines oder mehrerer Analyten aus einer flüssigen Probe einnehmen. Diese Flächen können dabei eine beliebige Geometrie, beispielsweise die Form von Punkten, Kreisen, Rechtecken, Dreiecken, Ellipsen oder Linien, haben. Verschiedene Messbereiche können durch Gitterstrukturen (c) und (c') voneinander getrennt sein, wenn ein störendes Übersprechen von in benachbarten Messbereichen erzeugtem und in die Schicht (a) rückgekoppeltem Lumineszenzlicht verhindert werden soll. Sie können sich auch auf einer gemeinsamen, durchgehenden Gitterstruktur befinden, was, in Abhängigkeit von der Koppeleffizienz des Gitters, zu einer teilweisen oder vollständigen Verhinderung eines störenden Übersprechens von Lumineszenz führt.
Um gleichzeitig mehrere Analyten in einer Probe nachzuweisen, kann es von Vorteil sein, zwei oder mehrere räumlich getrennte Messbereiche jeweils zu Segmenten auf der Sensoφlattform zusammenzufassen. Verschiedene Segmente können durch Gitterstrukturen (c) und (c') voneinander getrennt sein, wenn ein Übersprechen von in benachbarten Segmenten erzeugtem und die Schicht (a) rückgekoppeltem Lumineszenzlicht verhindert werden soll. Zusätzlich können verschiedene Segmente durch eine aufgebrachte Berandung, welche zur fluidischen Abdichtung gegen Nachbarbereiche und / oder zu einer weiteren Verminderung optischen Übersprechens zwischen benachbarten Segmenten beiträgt, gegeneinander abgegrenzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Sensoφlattform zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d) mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Übersprechen von in den Messbereichen oder in den mehrere Messbereiche umfassenden Segmenten erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder benachbarte Segmente mittels an die Messbereiche oder an die Segmente angrenzender Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Periode wie die Gitterstrukturen (c) zur Auskopplung des Lumineszenzlichts verhindert wird.
Da sich das in die optisch transparente, wellenleitende Schicht (a) rückgekoppelte Lumineszenzlicht isotrop in dieser ausbreitet, ist es möglich, über ein- und dieselbe Gitterstruktur sowohl Anregungslicht in die wellenleitende Schicht einzukuppeln und rückgekoppeltes Lumineszenzlicht aus dieser auszukoppeln. Eine Gitterstruktur (c) oder (c') kann also sowohl als Einkoppel- als auch als Auskoppelgitter verwendet werden. Weiterhin können auch die Gitterstrukturen (c) und (c') in ihrer Funktion vertauscht werden, d. h., die Gitterstrukturen (c) und (c') können wechselseitig als Ein- und / oder Auskoppelgitter verwendet werden.
Um ein Übersprechen rückgekoppelten und sich in der optisch transparenten Schicht (a) isotrop ausbreitenden Lumineszenzlichts zwischen benachbarten Messbereichen oder benachbarten Segmenten nicht nur in Ausbreitungsrichtung des geführten Anregungslichts, sondern auch senkrecht dazu zu verhindern, ist es von Vorteil, wenn die Gitterstrukturen (c) und (c') räumlich getrennte Messbereiche (d) ) oder räumlich getrennte Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, umschliessen.
Bevorzugt wird dabei eine kreis-, rechteck- oder polygonförmige Anordnung der Gitterstrukturen (c) und (c'), um die Messbereiche oder Segmente.
In der einfachsten Ausführungsform begrenzen die Gitterstrukturen (c) und (c') einen Messbereich oder ein Segment nur in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts. Dann sind sie vorteilhaft parallel zueinander ausgerichtet. Insbesondere können die Gitterstrukturen (c) und (c') auch eine gemeinsame durchgehende Gitterstruktur bilden, auf der sich mehrere Messbereiche oder Segmente befinden.
Da sowohl das Anregungslicht als auch rückgekoppeltes Lumineszenzlicht mit einer geeigneten Gitterstruktur (c), deren Ein- und Auskoppeleffizienz im wesentlichen durch die geeignete Wahl der Gittertiefe bestimmt wird, bereits am Ort der Einkopplung wieder ausgekoppelt werden, ist es möglich, eine sehr hohe Dichte von Messbereichen auf einer gemeinsamen Gitterstruktur zu schaffen. Die erreichbare Dichte wird dabei im wesentlichen von der minimalen Grosse der Spots bestimmt, welche bei der Immobilisierung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen erzielt werden kann. Die eingesetzten Sensoφlattformen können dabei Rächen von mehreren Zentimetern Seitenlänge haben. Es ist daher möglich, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 100 000 Messbereiche auf einer Sensoφlattform angeordnet sind. Ein einzelner Messbereich kann dabei eine Räche von 0.001 - 6 mm einnehmen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einer im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereiche oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16
Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird. Diese Anordnung der erfindungsgemässen Sensoφlattform zeichnet sich zusätzlich durch den Vorteil aus, dass die Intensität des störenden Transmissionslichts beim Erreichen des Einkoppelwinkels ein Minimum hat, d.h. nahezu vollständig verschwindet, was bei Einstrahlung des Anregungslichts von der Rückseite der Sensoφlattform, d.h. eintretend durch die optisch transparente Schicht (b) in Richtung der Gitterstruktur, das nicht zur Lumineszenzanregung dienende Anregungslicht in einem optischen System minimiert. Die physikalischen Bedingungen für das Verschwinden des Transmissionslichts und das gleichzeitige Auftreten einer aussergewöhnlichen "Reflektion" (als Summe aus dem regulären Anteil der Reflektion, entsprechend den Strahlungsgesetzen, und dem über die Gitterstruktur ausgekoppelten Licht) werden beispielsweise in D. Rosenblatt et al., "Resonant Grating Waveguide Structures", IEEE Journal of Quantum Electronics, Vol. 33 (1997) 2038 - 2059 beschrieben und erklärt.
Für Anwendungen, in denen die Anforderungen an die Empfindlichkeit verringert sind, kann es von Vorteil sein, wenn das Anregungslicht nicht unter Einkoppelbedingungen, sondern in einer einfachen Auflicht- oder Transmissionslichtanordnung zu den Messbereichen eingestrahlt wird. Auch dann wird es zu einer Verstärkung der Lumineszenz im Nahfeld des optischen Schichtwellenleiters kommen, und eine hohe Featuredichte ohne ein optisches Übersprechen von Signalen aus benachbarten Messbereichen kann wiederum durch Auskopplung der Signale mittels der Gitterstruktur erzielt werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einer im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereiche oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c) - mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16
Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schicht Wellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird.
In vielen Anwendungen, insbesondere aus dem Bereich der Biologie, ist es erwünscht, zu Zwecken der Referenzierung mit einer Kontrollsubstanz oder der Kalibration, Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge und Luminophore unterschiedlicher Anregungswellenlänge und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge, oder Anregungslicht gleicher Wellenlänge und Luminophore unterschiedlicher Emissionswellenlänge zu verwenden.
Dazu ist es von Vorteil, wenn die im Bereich der einen oder mehreren Messbereiche oder Segmente durchgehend modulierte Gitterstruktur eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstrukturen unterschiedlicher Periodizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien ist, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstrukturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
Die Höhe der Ausbreitungsverluste eines in einer optisch wellenleitenden Schicht (a) geführten Modes wird in hohem Masse von der Oberflächenrauhigkeit einer darunter liegenden Trägerschicht sowie von Absoφtion durch möglicherweise in dieser Trägerschicht vorhandene Chromophoren bestimmt, was zusätzlich das Risiko der Anregung unerwünschter Lumineszenz in dieser Trägerschicht, durch Eindringen des evaneszenten Feldes des in der Schicht (a) geführten Modes, in sich birgt. Weiterhin kann es zum Auftreten thermischer Spannungen infolge unterschiedlicher thermischer Ausdehnungskoeffizienten der optisch transparenten Schichten (a) und (b) kommen. Im Falle einer chemisch empfindlichen optisch transparenten Schicht (b), sofern sie beispielsweise aus einem transparenten thermoplastischen Kunststoff besteht, ist es wünschenswert, ein Eindringen von Lösungsmitteln, welche die Schicht (b) angreifen könnten, durch eventuell in der optisch transparenten Schicht (a) vorhandene Mikroporen zu verhindern.
Daher ist es von Vorteil, wenn sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10 000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet. Die Zwischenschicht hat die Aufgabe einer Verringerung der Oberflächenrauhigkeit unter der Schicht (a) oder der Verminderung des Eindringens des evaneszenten Feldes von in Schicht (a) geführtem Licht in die eine oder mehrere darunter liegende Schichten oder einer Verbesserung der Haftung der Schicht (a) auf der einen oder mehreren darunter liegenden Schichten oder der Verminderung von thermisch hervorgerufenen Spannungen innerhalb der optischen Sensoφlattform oder der chemischen Isolation der optisch transparenten Schicht (a) von darunter liegenden Schichten mittels Abdichten von Mikroporen in der Schicht (a) gegen darunter liegende Schichten.
Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf die optisch transparente Schicht (a). Beispielsweise kann dieses durch physikalische Adsoφtion oder durch elektrostatische Wechselwirkung erfolgen. Die Orientierung der Erkennungselemente ist dann im allgemeinen statistisch. Ausserdem besteht die Gefahr, dass bei unterschiedlicher Zusammensetzung der den Analyten enthaltenden Probe oder der im Nachweisverfahren eingesetzten Reagentien ein Teil der immobilisierten Erkennungselemente fortgespült wird. Daher kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselemente (e) auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) aufgebracht ist. Diese Haftvermittlungsschicht sollte ebenfalls optisch transparent sein. Insbesondere sollte die Haftvermittlungsschicht nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes aus der wellenleitenden Schicht (a) in das darüber liegende Medium hinausragen. Daher sollte die Haftvermittlungsschicht (f) eine Stärke von weniger als 200 nm, vorzugsweise von weniger als 20 nm, haben. Sie kann beispielsweise chemische Verbindungen aus der Gruppe Silane, Epoxide, "selbstorganisierte funktionalisierte Monoschichten" umfassen.
Wie in der Definition der Messbereiche festgestellt, ist es möglich, durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf der Sensoφlattform räumlich getrennte Messbereiche (d) zu erzeugen. Im Kontakt mit einem lumineszenzfähigen Analyten oder eines mit dem Analyten um die Bindung an die immobilisierten Erkennungselemente konkurrierenden lumineszenzmarkierten Analogen des Analyten oder eines weiteren lumineszenzmarkierten Bindungspartners in einem mehrstufigen Assay werden diese lumineszenzfähigen Moleküle nur selektiv in den Messbereichen an die Oberfläche der Sensoφlattform binden, welche durch die Rächen definiert werden, die von den immobilisierten Erkennungselementen eingenommen werden.
Zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen können eines oder mehrere Verfahren verwendet werden aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting, mechanischem Spotting, micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen" , gebildet werden.
Als biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselementen können Komponenten aus der Gruppe aufgebracht werden, die von Nukleinsäuren (DNA, RNA, ...), Nukleinsäureanalogen (PNA ..), Antiköφern, Aptameren, membran-gebundenen und isolierten Rezeptoren, deren Liganden, Antigene für Antiköφer, "Histidin-Tag-Komponenten", durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, etc. gebildet wird.
Unter der letztgenannten Art von Erkennungselementen sind Kavitäten zu verstehen, die in einem Verfahren hergestellt werden, welches als "molecular imprinting" in der Literatur beschrieben wurde. Dazu wird, meistens in organischer Lösung, der Analyt oder ein Analogon des Analyten, in einer Polymerenstruktur eingekapselt. Man bezeichnet ihn dann als "Imprint". Dann wird der Analyt oder sein Analogon unter Zugabe geeigneter Reagentien aus der Polymerenstruktur wieder herausgelöst, so dass er dort eine leere Kavität zurücklässt. Diese leere Kavität kann dann als eine Bindungsstelle mit hoher sterischer Selektivität in einem späteren Nachweisverfahren eingesetzt werden.
Es ist auch möglich, dass als biochemische oder biologische Erkennungselemente ganze Zellen oder Zellfragmente aufgebracht werden. In vielen Fällen wird die Nachweisgrenze eines analytischen Verfahrens limitiert durch Signale sogenannter unspezifischer Bindung, d. h. durch Signale, welche durch Bindung des Analyten oder anderer zum Nachweis des Analyten eingesetzter Verbindungen erzeugt werden, welche nicht nur im Bereich der eingesetzten immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen, sondern auch in davon unbedeckten Bereichen einer Sensoφlattform gebunden werden, beispielsweise durch hydrophobe Adsoφtion oder durch elektrostatische Wechselwirkungen. Daher ist es von Vorteil, wenn zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen zur Verminderung unspezifischer Bindung oder Adsoφtion aufgebracht sind. Als "chemisch neutrale" Verbindungen werden dabei solche Stoffe bezeichnet, welche selbst keine spezifischen Bindungsstellen zur Erkennung und Bindung des Analyten oder eines Analogen des Analyten oder eines weiteren Bindungspartners in einem mehrstufigen Assay aufweisen und durch ihre Anwesenheit den Zugang des Analyten oder seines Analogen oder der weiteren Bindungspartner zur Oberfläche der Sensoφlattform blockieren.
Als "chemisch neutrale" Verbindungen können beispielsweise Stoffe aus den Gruppen eingesetzt werden, die von Rinderserumalbumin bzw. Polyethylenglycol gebildet wird.
Für viele Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Gitterstruktur (c) ein diffraktives Gitter mit einer einheitlichen Periode ist. Der Resonanzwinkel zur Einkopplung des Anregungslichts über die Gitterstruktur (c) zu den Messbereichen ist dann im gesamten Bereich der Gitterstruktur einheitlich. Will man jedoch beispielsweise das Anregungslicht verschiedener Lichtquellen mit deutlich unterschiedlicher Wellenlänge einkoppeln, so können sich die entsprechenden Resonanzwinkel für die Einkopplung deutlich unterscheiden, was die Verwendung zusätzlicher Justierelemente in einem optischen System zur Aufnahme der Sensoφlattform erforderlich machen kann oder zu räumlich sehr ungünstigen Koppelwinkeln führen kann. Beispielsweise zur Verringerung stark unterschiedlicher Koppel winkel kann es daher von Vorteil sein, wenn die Gitterstruktur (c) ein multidiffraktives Gitter ist.
Zur Relaxierung der Anforderungen an die Parallelität des Anregungslichtbündels und die genaue Einstellung des Resonanzwinkels kann es von Vorteil sein, wenn die Gitterstruktur (c) eine senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierende Periodiziät aufweist. Dann wird aus einem grossflächig eingestrahlten, konvergenten oder divergenten Strahlenbündel eine Einkopplung an dem Ort auf der Gitterstruktur erfolgen, an dem die Resonanzbedingung erfüllt ist.
Insbesondere ermöglicht eine solche Gitterstruktur mit senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierender Periodiziät ein Verfahren, in dem neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden. Dabei kann es von Vorteil sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.
Zur Verbesserung des Signal-zu-Hintergrund- Verhältnisses kann es weiterhin von Vorteil sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Das Material der zweiten optisch transparenten Schicht (b) kann aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen Kunststoff, beispielsweise aus der Gruppe bestehen, die von Polycarbonat, Polyimid oder Polymethyl-methacrylat gebildet wird.
Zur Erzeugung eines möglichst starken evaneszenten Feldes an der Oberfläche der optisch transparenten Sicht (a) ist es wünschenswert, dass der Brechungsindex der wellenleitenden, optisch transparenten Schicht (a) wesentlich grösser als der Brechungsindex der benachbarten Schichten ist. Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Brechungsindex der ersten optisch transparenten Schicht (a) grösser als 2 ist. Beispielsweise kann die erste optisch transparente Schicht (a) aus Ti02, ZnO, Nb2θ5, Ta205, Hf02, oder Zr02 bestehen. Besonders bevorzugt wird, wenn die erste transparente optische Schicht (a) aus Ti02, oder Ta2Os besteht.
Neben dem Brechungsindex der wellenleitenden optisch transparenten Schicht (a) ist deren Dicke der zweite massgebliche Parameter zur Erzeugung eines möglichst starken evaneszenten Feldes an deren Grenzflächen zu benachbarten Schichten mit niedrigerem Brechungsindex. Dabei nimmt die Stärke des evaneszenten Feldes mit abnehmender Dicke der wellenleitenden Schicht (a) zu, solange die Schichtdicke ausreicht, um mindestens einen Mode der Anregungswellenlänge zu führen. Dabei ist die minimale "Cut-off '-Schichtdicke zur Führung eines Modes abhängig von der Wellenlänge dieses Modes. Sie ist für längerwelliges Licht grösser als für kurzwelliges Licht. Mit Annäherung an die "Cut-off '-Schichtdicke nehmen allerdings auch ungewünschte Ausbreitungsverluste stark zu, was die Auswahl der bevorzugten Schichtdicke zusätzlich nach unten begrenzt. Bevorzugt sind solche Schichtdicken der optisch transparenten Schicht (a), welche nur die Führung von 1 bis 3 Moden einer vorgegebenen Anregungswellenlänge ermöglichen, ganz besonders bevorzugt sind Schichtdicken, welche in monomodalen Wellenleitern für diese Anregungswellenlänge führen. Dabei ist klar, dass sich der diskrete Modencharakter des geführten Lichts nur auf die transversalen Moden bezieht.
Diese Anforderungen führen dazu, dass vorteilhaft die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 40 bis 300 nm beträgt. Ganz besonders vorteilhaft beträgt die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 70 bis 160 nm.
Bei vorgegebenen Brechungsindices der wellenleitenden, optisch transparenten Schicht (a) und der benachbarten Schichten ist der Resonanzwinkel für die Einkopplung des Anregungslichts entsprechend der oben genannten Resonanzbedingung abhängig von der einzukoppelnden Beugungsordnung, der Anregungs Wellenlänge sowie der Gitteφeriode. Zur Erhöhung der Einkoppeleffizienz ist die Einkopplung der ersten Beugungsordnung vorteilhaft. Neben der Höhe der Beugungsordnung ist für die Höhe der Einkoppeleffizienz die Gittertiefe massgeblich. Prinzipiell vergrössert sich die Koppeleffizienz mit steigender Gittertiefe. Da der Prozess der Auskopplung völlig reziprok zur Einkopplung erfolgt, erhöht sich jedoch zugleich auch die Auskoppeleffizienz, so dass es zur Anregung von Lumineszenz in einem auf der Gitterstruktur (c) angeordneten oder an diese angrenzenden Messbereich (d), in Abhängigkeit von der Geometrie der Messbereiche und der eingestrahlten Anregungslichtbündel ein Optimum gibt. Aufgrund dieser Randbedingungen ist es von Vorteil, wenn das Gitter (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweist und die Modulationstiefe des Gitters (c) 3 bis 100 nm, bevorzugt 10 bis 30 nm beträgt.
Wie in dem weiter unten aufgeführten Ausführungsbeispiel zu dieser Erfindung gezeigt wird, ist es möglich, auf einer durchgehenden Gitterstruktur durch unvollständige Ein- und Auskopplung von Anregungsund / oder rückgekoppeltem Lumineszenzlicht parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts einen über die Gittertiefe kontrollierbaren positiven Gradienten der Intensität des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche zu erzeugen. Dieser Gradient entsteht dadurch, dass über den betreffenden gleichzeitig unter Einkoppelbedingungen mit einem aufgeweiteten, weitgehend parallelen Anregungsbündel bestrahlten Bereich der Gitterstruktur ein geringerer Anteil von Anregungslicht ausgekoppelt wird, als in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts zusätzlich eingekoppelt wird. Als Folge erhöht sich unter diesen Bedingungen die bis zum Ende des beleuchteten Bereich auf der durchgehenden Gitterstruktur, in Ausbreitungsrichtung des geführten Lichts, die verfügbare Gesamtanregungsintensität. Dieser Gradient der Intensität verfügbaren Anregungslichts hat den Vorteil, dass er zu einer Erweiterung des dynamischen Bereichs ausgenutzt werden kann.
Die Ein- und Auskoppeleffizienz eines diffraktiven Gitters ist unter festgelegten übrigen Parametern im wesentlichen bestimmt durch die Gittertiefe. Daher kann der besagte Gradient der Intensität des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts zusätzlich beeinflusst und kontrolliert werden, wenn das Gitter (c) in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts eine räumlich variierende Gittertiefe aufweist.
Ausbreitungsverluste des eingekoppelten Anregungslichts in einer optisch transparenten, wellenleitenden Schicht führen demgegenüber zu einem negativen Gradienten des geführten Anregungslichts in dessen Ausbreitungsrichtung. Entsprechend kann durch eine gezielte Festlegung der Höhe dieser Ausbreitungsverluste, beispielsweise durch eine gezielte Dotierung der wellenleitenden Schicht mit absorbierenden, aber mit der zu erzeugenden Lumineszenz nicht interferierenden Molekülen oder mittels Aufbringung solcher absorbierender Moleküle auf der wellenleitenden Schicht ein kontrollierbarer negativer Gradient der Intensität des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche erzeugt werden.
Weiterhin wird bevorzugt, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
Dabei kann die Gitterstruktur (c) ein Relief gitter mit Rechteck-, Dreieckoder halbkreisförmigem Profil oder ein Phasen- oder Volumengitter mit einer periodischen Modulation des Brechungsindex in der im wesentlichen planaren optisch transparenten Schicht (a) sein.
Zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zuHintergrund-Verhältnisses kann es weiterhin von Vorteil sein, wenn zwischen der optisch transparenten Schicht (a) und den immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen eine dünne Metallschicht, vorzugsweise aus Gold oder Silber, gegebenenfalls auf einer zusätzlichen dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex als der Schicht (a), beispielsweise aus Silica oder Magnesiumfluorid, aufgebracht ist, wobei die Dicke der Metallschicht und der eventuellen weiteren Zwischenschicht so ausgewählt ist, dass ein Oberflächenplasmon bei der Anregungswellenlänge und / oder der Lumineszenzwellenlänge angeregt werden kann.
Weiterhin kann es von Vorteil sein, wenn auf der Sensoφlattform optisch oder mechanisch erkennbare Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems aufgebracht sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein optisches System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen, mit mindestens einer Anregungslichtquelle einer Sensoφlattform nach mindestens einer der genannten
Ausführungen mindestens einem Detektor zur Erfassung des von dem mindestens einem oder mehreren Messbereichen (d) auf der Sensoφlattform ausgehenden Lichts.
Für Anwendungen, in denen nicht höchste Ansprüche an die Empfindlichkeit gestellt werden, kann es vorteilhaft sein, wenn das Anregungslicht in einer einfachen Auflicht- oder Transmissionslichtanordnung zu den Messbereichen eingestrahlt wird. Dieses hat deutlich verminderte Anforderungen an die Positionierung der erfindungsgemässen Sensoφlattform in einem optischen System zur Folge. Insbesondere ermöglicht dieses auch den Einsatz der Sensoφlattform in einer Vielzahl bereits auf dem Markt befindlicher Lumineszenzanregungsund -detektionssysteme, wie beispielsweise Scannersystemen. Dabei wird bevorzugt, dass die Detektion des Lumineszenzlichts derart erfolgt, dass das von einer Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenzlicht vom Detektor mit erfasst wird.
Zur Erreichung tiefster Nachweisgrenzen ist es jedoch von Vorteil, wenn das Anregungslicht unter Einkoppelbedingungen auf die Gitterstruktur (c) oder (c') eingestrahlt wird.
Dabei ist es von Vorteil, wenn das von der mindestens einen Lichtquelle ausgesandte Anregungslicht kohärent ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird.
Um eine Vielzahl von Messbereichen oder alle Messbereiche gleichzeitig anzuregen und deren Lumineszenz gleichzeitig zu bestimmen, wird es bevorzugt, dass das Anregungslicht von mindestens einer Lichtquelle mit einer Aufweitungsoptik zu einem im wesentlichen parallelen Strahlenbündel aufgeweitet wird und auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird, wobei dieses bevorzugt unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) erfolgt.
Zur Verminderung von Lumineszenzsignalen ausserhalb der Messbereiche kann es jedoch auch vorteilhaft sein, wenn das Anregungslicht von der mindestens einen Lichtquelle durch ein oder, im Falle mehrerer Lichtquellen, gegebenenfalls mehrere diffraktive optische Elemente, vorzugsweise Dammann-Gitter, oder refraktive optische Elemente, vorzugsweise Mikrolinsen- Arrays, in eine Vielzahl von Einzelstrahlen möglichst gleicher Intensität der von einer gemeinsamen Lichtquelle stammenden Teilstrahlen zerlegt wird, welche jeweils im wesentlichen parallel zueinander auf räumlich getrennte Messbereiche eingestrahlt werden.
Im Falle unzureichender Intensität einer einzigen Lichtquelle oder des Bedarfs nach Lichtquellen unterschiedlicher Emissionswellenlängen, beispielsweise für biologische Applikationen ist es vorteilhaft, wenn als Anregungs-lichtquellen zwei oder mehrere kohärente Lichtquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden. Im Falle von Lichtquellen unterschiedlicher Emissionswellenlänge ist es dabei von Vorteil, wenn das Anregungslicht von 2 oder mehr kohärenten Lichtquellen gleichzeitig oder sequentiell aus verschiedenen Richtungen auf eine Gitterstruktur (c) eingestrahlt wird, welche eine Überlagerung von Gitterstrukturen mit unterschiedlicher Periodizität umfasst.
Um die Signale von einer Vielzahl von Messbereichen getrennt aufzunehmen, wird bevorzugt, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird.
Dabei kann als der mindestens eine ortsauflösende Detektor mindestens ein Detektor aus der Gruppe verwendet werden, die von CCD-Kameras, CCD- Chips, Photodioden- Arrays, Avalanche-Dioden-Arrays, Multichannelplates und Vielkanal-Photomultipliern gebildet wird.
In dem erfindungsgemässen optischen System nach einer der genannten Ausführungen können zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der Sensoφlattform nach einer der vorgenannten Ausführungen und /oder zwischen besagter Sensoφlattform und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- oder Lumineszenzlichts gebildet werden. Für eine Reihe von Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt.
Für kinetische Messungen oder für die Diskriminierung rasch abklingender Ruoreszenz von fluoreszenten Verunreinigungen in der Probe oder in Materialien von Komponenten des optischen Systems oder der Sensoφlattform selbst kann es von Vorteil sein, wenn das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.
Weiterhin wird es bevorzugt, dass das erfindungsgemässe optische System Komponenten umfasst, mit denen zur Referenzierung Lichtsignale aus der Gruppe gemessen werden, die von Anregungslicht am Ort der Lichtquellen oder nach ihrer Aufweitung oder nach ihrer Unterteilung in Teilstrahlen, Streulicht bei der Anregungswellenlänge aus dem Bereich der einen oder mehreren räumlich getrennten Messbereiche, und über die Gitterstruktur (c) neben den Messbereichen ausgekoppeltem Licht der Anregungswellenlänge gebildet werden. Besonders von Vorteil ist dabei, wenn die Messbereiche zur Bestimmung des Emissionslichts und des Referenzsignals identisch sind.
Es ist auch möglich, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt.Dabei kann die sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgen, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird. Üblicherweise werden für sequentielle Anregung und Detektion in bioanalytischen Array- Systemen kommerziell erhältliche sogenannte Scanner eingesetzt, mit denen, meistens mittels beweglicher Spiegel, ein Anregungslichtstrahl sequentiell über die zu untersuchende Räche geführt wird. Bei den meisten Scannersystemen ändert sich dabei der Winkel zwischen der beleuchteten Räche und dem Anregungslichtstrahl. Zur Erfüllung der Resonanzbedingung für die Einkopplung des Anregungslichts in die wellenleitende Schicht der erfindungsgemässen Sensoφlattform muss dieser Winkel jedoch im wesentlichen konstant bleiben, d. h. ein in dem erfindungsgemässen optischen System zu verwendender Scanner muss winkelgetreu arbeiten. Diese Forderung wird von einigen kommerziell erhältlichen Scannern erfüllt. Zugleich darf sich jedoch auch nicht die Grosse der angeregten Räche auf der Sensoφlattform ändern. Daher ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ein optisches System, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung eines im wesentlichen winkel- und fokusgetreuen Scanners erfolgt.
Eine andere mögliche Ausführungsform ist, dass die Sensoφlattform zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird. In diesem Fall können die eine oder mehreren Anregungslichtquellen und die zur Detektion verwendeten Komponenten räumlich fixiert sein.
Gegenstand der Erfindung ist ein sich ableitendes vollständiges analytisches System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer Sensoφlattform , umfassend einen optischen Schichtwellenleiter, mit einer Sensoφlattform nach einer der vorgenannten
Ausführungsformen, einem optischen System nach einer der vorgenannten
Ausführungsformen, sowie
Zuführungsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den
Messbereichen auf der Sensoφlattform in Kontakt zu bringen.
Vorteilhaft umfasst das analytische Systen zusätzlich eine oder mehrere Probenbehältnisse, welche mindestens im Bereich der einen oder mehreren Messbereiche oder der zu Segmenten zusammengefassten Messbereiche zur Sensoφlattform hin geöffnet sind. Dabei können die Probenbehältnisse jeweils ein Volumen von 0.1 nl - 100 μl definieren.
Die Sensoφlattform kann sowohl in einem geschlossenen Riesssystem als auch in einem offenen System betrieben werden. Im ersten Fall ist das analytische System so gestaltet, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite, mit Ausnahme von Ein- und / oder Auslassöffnungen für die Zufuhr oder den Auslass der Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien, geschlossen sind und die Zufuhr oder der Auslass von Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien in einem geschlossenen Durchflusssystem erfolgen, wobei im Falle der Rüssigkeitszufuhr zu mehreren Messbereichen oder Segmenten mit gemeinsamen Einlass- und Auslassöffnungen diese bevorzugt spalten- oder zeilenweise addressiert werden. Im Falle eines offenen Systems ist das erfindungsgemässe analytische System so gestaltet, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite Öffnungen zur lokal addressierten Zugabe oder Entfernung der Proben oder anderer Reagentien besitzen. Zusätzlich können Behältnisse für Reagentien vorgesehen sein, welche während des Verfahrens zum Nachweis des einen oder mehrerer Analyten benetzt und mit den Messbereichen in Kontakt gebracht werden
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf einer Sensoφlattform zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter
- mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Übersprechen von in den Messbereichen oder in den mehrere Messbereiche umfassenden Segmenten erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder benachbarte Segmente mittels an die Messbereiche oder an die Segmente angrenzender Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Periode wie die Gitterstrukturen (c) zur Auskopplung des Lumineszenzlichts verhindert wird.
Insbesondere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum gleichzeitigen Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf einem mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf einer Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter
- mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einem im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereichen oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und
- ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche oder Segmente durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird.
Dabei wird bevorzugt, dass das Anregungslicht zu den Messbereichen über die Gitterstruktur (c) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt wird.
Bei den vorgenannten Verfahren ist es möglich, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über die Gitterstruktur (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten entsprechend den voranstehenden Ausführungen, unter Verwendung eines analytischen Systems nach einer der vorgenannten Ausführungsformen, welches ein optisches System nach mindestens einer der vorgenannten Ausführungsformen mit einer Sensoφlattform nach mindestens einer der vorgenannten Ausführungsformen umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere flüssige Proben, welche auf den einen oder die mehreren Analyten untersucht werden sollen, mit einem oder mehreren Messbereichen auf der Sensoφlattform in Kontakt gebracht werden, Anregungslicht in die Messbereiche geleitet wird, hierbei lumineszenzfähige Stoffe in den Proben oder auf den Messbereichen zur Lumineszenz angeregt und die abgestrahlte Lumineszenz gemessen wird.
Als eine Weiterbildung wird ein Verfahren beansprucht, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass mittels eines kontrollierbaren Gradienten des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche, parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts, der dynamische Bereich für die Signalerfassung und / oder quantitative Analytbestimmung erweitert oder beschränkt werden kann.
In dem erfindungsgemässen Verfahren kann zur Erzeugung der Lumineszenz oder Ruoreszenz ein Lumineszenz- oder Ruoreszenzlabel verwendet werden, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert. Bei den Lumineszenz- oder Ruoreszenzlabeln kann es sich um herkömmliche Lumineszenz- oder Ruoreszenzfarbstoffe oder auch um sogenannte lumineszente oder fluoreszente Nanopartikel, basierend auf Halbleitern (W. C. W. Chan und S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) handeln.
Das Lumineszenzlabel kann an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen gebunden sein.
Zusätzlich können ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden. Hierbei kann es vorteilhaft sein, wenn das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel angeregt werden können, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
Für andere Applikationen ist es vorteilhaft, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzlabel nur wenig oder gar nicht überlappen.
In dem erfindungsgemässen Verfahren kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn zum Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzlabel zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzlabel verwendet wird.
Zusätzlich kann es von Vorteil sein, wenn neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden. Von weiterem Vorteil kann dabei sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.Weiterhin erlaubt das Verfahren die Möglichkeit, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren nach einer der voranstehenden Ausführungsformen ermöglicht eine gleichzeitige oder sequentielle, quantitative oder qualitative Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Antiköφern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-Tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA-Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
Die zu untersuchenden Proben können natürlich vorkommende Köφerflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb sein. Eine zu untersuchende Probe kann aber auch eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, ein Boden- oder Pflanzenextrakt, eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe sein.
Die zu untersuchenden Proben können auch aus biologischen Gewebeteilen entnommen sein.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Verfahrens nach mindestens einer der voranstehenden Ausführungsformen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screening verfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreenmg und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und Forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und Forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Mit den nachfolgenden Ausführungsbeispielen soll die Erfindung genauer erläutert und demonstriert werden.
Beispiel 1;
a)
Sensorplattform mit 2 getrennten Gitterstrukturen und mehreren
Messbereichen und einem Segment von Messbereichen
Es wurde eine Sensoφlattform mit den äusseren Abmessungen 16 mm Breite x 48 mm Länge x 0.5 mm Dicke verwendet. Das Substratmaterial (optisch transparente Schicht (b)) bestand aus Corning Glas 7059 (Brechungsindex n = 1.538 bei 488 nm). Im Substrat wurden mittels holographischer Belichtung der mit auf geschleudertem Photolack bedeckten wellenleitenden Schicht (a) und anschliessendes nasschemisches Ätzen unter Abdeckung der nicht zu strukturierenden Bereiche der Sensoφlattform 2 Strukturen von Oberflächenreliefgittern einer Periode von 320 nm und einer Tiefe von 12 +/- 3 nm erzeugt. Die Gitter hatten eine Abmessung von 5 mm Länge x 12 mm Breite (Gitterstruktur I) bzw. 1 mm Länge x 12 mm Breite (Gitterstruktur II), mit Orientierung der Gitterlinien parallel zur ausgewiesenen Breite. Die Gitterstrukturen waren, zentralsymmetrisch bezüglich deren Innenseiten für das einzukoppelnde und in der wellenleitenden Schicht (a) zu führenden Anregungslichts, in einem Innenabstand von 20 mm auf der Sensoφlattform angeordnet. Die wellenleitende, optisch transparente Schicht (a) auf der optisch transparenten Schicht (b) wurde durch "Ion Plating" und anschliessendes Tempern bei 300 Grad erzeugt (siehe R. E. Kunz, J. Edlinger et al., "Grating Couplers in tapered waveguides for integrated optical sensing", in Proc. SPIE vol. 2068 (1994), S. 321), und hatte einen Brechungsindex von 2.317 bei 488 nm (Schichtdicke 150 nm). Die Gittertiefen auf der wellenleitenden Schicht, in die sich die Gitterstruktur infolge des Abscheidungsprozesses nahezu masstäblich im Verhältnis 1:1 überträgt, wurden später mittels AFM kontrolliert. In dem späteren Ausführungsbeipiel (4.b) Messverfahren) dienen die Gitterstrukturen (I) als durchgehende Gitterstrukturen zur Einkopplung des Anregungslichts zu den darauf befindlichen Messbereichen bzw. zu den zwischen den Gitterstrukturen (I) und (II) befindlichen Messbereichen, welche, zusammengefasst als Segment, durch Auskoppeln geführten, rückgekoppelten Lumineszenzlichts und geführten Anregungslichts durch Gitterstruktur (II), von Übersprechen in potentielle weitere in dieser Ausbreitungsrichtung befindliche Messbereiche oder Segmente, anzuordnen nach der hier als Auskopplungsgitter dienenden Gitterstruktur (II) abgetrennt sind.
Zur Vorbereitung auf die Immobilisierung der biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselemente wurden die Sensoφlattformen gereinigt und mit Epoxysilan in Rüssigphase (10 ml (2 % v/v ) 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und 1 ml (0.2 % v/v) N- Ethyldiisopropylamin in 500 ml Ortho-Xylene (d = 0.881 g/cm3; m = 440.5 g)) silanisiert. Danach wurden mit einem kommerziellen Spotter (GESIM) Lösungen von 16-mer Oligonukleotiden (NH2- 3'CAACACACCTTAACAC-5', Konzentration der abgeschiedenenen Lösung: 0.34 mM , 3 nl pro Spot) aufgebracht und damit anähernd kreisförmige Messbereiche eines Durchmessers von 140 - 150 μm in einem Abstand von 600 μm (Zentrum-zu-Zentrum) in einem 6 x 6-Array sowohl auf der Gitterstruktur (I) als auch im Bereich zwischen den Gitterstrukturen (I) und (II) erzeugt.
b)
Sensorplattform mit mehreren Messbereichen auf einer durchgehenden
Gitterstruktur
Es wurde eine Sensoφlattform mit den äusseren Abmessungen 16 mm Breite x 48 mm Länge x 0.7 mm Dicke verwendet. Das Substratmaterial (optisch transparente Schicht (b) bestand aus AF 45 Glas (Brechungsindex n = 1.52 bei 633 nm). Im Substrat wurde mittels holographischer Belichtung der mit aufgeschleudertem Photolack bedeckten wellenleitenden Schicht (a) und anschliessendes nasschemisches Ätzen eine durchgehende Struktur eines Oberflächenrelief gitters einer Periode von 364 nm und einer Tiefe von 25 +/- 5 nm erzeugt, mit Orientierung der Gitterlinien parallel zur ausgewiesenen Breite der Sensoφlattform. Die wellenleitende, optisch transparente Schicht (a) auf der optisch transparenten Schicht (b) aus Ta205 wurde durch reaktives, magnetfeldunterstütztes DC-Sputtern (siehe DE 4410258) erzeugt und hatte einen Brechungsindex von 2.15 bei 633 nm (Schichtdicke 150 nm). Die Gittertiefen auf der wellenleitenden Schicht, in die sich die Gitterstruktur infolge des Abscheidungsprozesses nahezu masstäblich im Verhältnis 1 : 1 überträgt, wurden später mittels AFM kontrolliert.
Zur Vorbereitung auf die Immobilisierung der biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselemente wurden die Sensoφlattformen gereinigt und mit Epoxysilan in Rüssigphase silanisiert, wie oben beschrieben. Danach wurden mit einem kommerziellen Spotter Lösungen von 16-mer Oligonukleotiden (Konzentration der abgeschiedenenen Lösung: 0.34 mM , 3 nl pro Spot) aufgebracht und damit anähernd kreisförmige Messbereiche eines Durchmessers von 140 - 150 μm in einem Abstand (Zentrum zu Zentrum) von 600 μm in einem 6 x 6- Array auf der durchgehenden Gitterstruktur erzeugt. Beispiel 2
Optisches System a) Anregungseinheiten
Die Sensoφlattform ist auf einer computergesteuerten Justiereinheit montiert, welche die Translation parallel und senkrecht zu den Gitterlinien sowie eine Rotation mit Drehpunkt in der Achse des auf die Gitterstruktur (I) auftreffenden Anregungslichtflecks zur Einkopplung in die in Beispiel la genannte Sensoφlattform erlaubt. Unmittelbar nach dem als Anregungslichtquelle benutzten Laser befindet sich im Lichtweg ein Shutter, um den Lichtweg zu blockieren, wenn keine Messdaten aufgenommen werden sollen. Zusätzlich können Neutralfilter oder Polarisatoren an dieser Stelle oder auch anderen Positionen im weiteren Weg des Anregungslichts zur Sensoφlattform in den Lichtweg gestellt werden, um die Anregungsintensität stufenweise oder kontinuierlich zu variieren.
Anregungseinheit a.i) / Sensorplattform l.a)
Der Anregungslichtstrahl eines Helium-Neon-Lasers (2 mW) wird ohne Verwendung weiterer strahlformender Komponenten auf die rechte Kante der Gitterstruktur I geleitet. Der Anregungslichtfleck entspricht in seiner Grosse dem Durchmesser des anregenden Laserstrahls. Die Sensoφlattform wird auf maximale Einkopplung justiert, was an maximaler Intensität des Streulichts erkennbar ist, welches längs des eingekoppelten Modes geführten Anregungslichts durch Streuung abgestrahlt wird. Dieses Maximum kann sowohl durch visuelle Bestimmung als auch durch Abbildung des mit einem Abbildungssystem erfassten Streulichts längs des Anregungsmodes auf einen optoelektronischen Detektor, z. B. auf die Pixels einer CCD-Kamera als Beispiel eines ortsauflösenden Detektors oder einer Photodiode als Beispiel eines nicht ortsaulösenden Detektors, bestimmt werden. Unter denselben Einkoppelbedingungen misst man mit einem zweiten optoelektronischen Detektor unter dem Auskoppelwinkel für das geführte Anregungslicht an der zweiten Gitterstruktur II ebenfalls ein maximales Signal. Als Resonanzwinkel für die Einkopplung wird ein Winkel von -3.8° bestimmt.
Anregungseinheit a.ii) / Sensorplattform l.a) Der Anregungslichtstrahl eines Helium-Neon-Lasers (2 mW) wird mit einer Linsenkombination, unter Verwendung einer Zylinderlinse, zu einem spaltförmigem Lichtstrahl (parallel zu den Gitterlinien der Sensoφlattform) aufgeweitet. Die oberen und unteren Randgebiete des parallel zu den Gitterlinien leicht divergenten, in der dazu senkrechten Projektion jedoch parallelen Anregungslichts werden durch einen Spalt ausgeblendet. Das resultierende Lichtbündel mit spaltförmigem Querschnitt auf der Gitterstuktur wird auf die rechte Kante der Gitterstruktur I geleitet. Der Anregungslichtfleck hat eine Grosse von 1 mm Länge x 12 mm Breite. Die Sensoφlattform wird auf maximale Einkopplung justiert, was an maximaler Intensität des Streulichts erkennbar ist, welches längs des eingekoppelten Modes geführten Anregungslichts durch Streuung abgestrahlt wird. Dieses Maximum kann man sowohl durch visuelle Bestimmung als auch durch Abbildung des mit einem Abbildungssystem erfassten Streulichts längs des Anregungsmodes auf einen optoelektronischen Detektor, z. B. auf die Pixels einer CCD-Kamera als Beispiel eines ortsauflösenden Detektors oder einer Photodiode als Beispiel eines nicht ortsaulösenden Detektors, bestimmen. Unter denselben Einkoppelbedingungen misst man mit einem zweiten optoelektronischen Detektor unter dem Auskoppelwinkel für das geführte Anregungslicht an der zweiten Gitterstruktur II ebenfalls ein maximales Signal. Als Resonanzwinkel für die Einkopplung wird ein Winkel von -3.9° bestimmt.
Anregungseinheit a.üi ) / Sensorplattform l.a)
Das Anregungslicht eines Helium-Neon-Lasers wird mit einem Dammann- Gitter in parallel zu den Gitterlinien linear angeordnete 16 Teilstrahlen zerlegt. Die ungleichförmige Abfolge von Nuten und Stegen des Dammann- Gitters war vom Hersteller so optimiert worden, dass alle geradzahligen Beugungsordnungen, insbesonder die nullte Ordnung, unterdrückt wurden und in den ungeradzahligen Beugungsordnungen möglichst gleiche Intensität (mit einer Variation von weniger als 5 %) erzielt wurde. Eine asphärische Linse nach dem Dammann-Gitter in Richtung der Sensoφlattform, in deren Brennpunkt sich das Dammann-Gitter befindet, wird benutzt, um aus den nach dem Dammann-Gitter divergenten Teilstrahlen ein Bündel von parallelen Teilstrahlen zu erzeugen. Die Divergenz der nach dem Dammann-Gitter austretenden Teilstrahlen und die Brennweite der dahinter befindlichen Linse können so aufeinander abgestimmt werden, dass ein gewünschter Strahlabstand auf der Sensoφlattform erzeugt wird. Im vorliegenden Beispiel wurden mit dem verwendeten Dammann-Gitter 16 Teilstrahlen erzeugt, von denen, nach Passieren einer spaltförmigen Blende, 8 Teilstrahlen über ein Umlenkprisma auf die rechte Kante der als Einkoppelgitter diendenden Gitterstruktur I geleitet wurden. Die Einkoppelbedingung konnte für alle 8 Teilstrahlen gleichzeitig erfüllt werden, was an gleichzeitiger maximaler Intensität des längs der eingekoppelten und in der wellenleitenden Schicht (a) geführten Teilstrahlen erzeugten Streulichts zu erkennen war. Der Koppelwinkel betrug -3.8°.
Anregungseinheit a.iv ) / Sensorplattform l.a)
Der Anregungslichtstrahl eines Helium-Neon-Lasers bei 632.8 nm wird mit einer 25 -fachen Aufweitungsoptik auf ein paralleles Strahlenbündel mit kreisförmigem Querschnitt von 2 cm Durchmesser aufgeweitet. Hiervon wird eine Räche von 1 mm Länge x 9 mm Breite (entsprechend den Bezeichnungen für die Gitterstrukturen) aus dem zentralen Teil des Anregungslichtbündels ausgewählt und über ein Umlenkprisma auf die rechte Kante der Gitterstruktur I (in Richtung des einzukoppelnden und zu führenden Anregungslichts) geleitet. Die Sensoφlattform wird auf maximale Einkopplung justiert, was an maximaler Intensität des Streulichts erkennbar ist, welches längs des eingekoppelten Modes geführten Anregungslichts durch Streuung abgestrahlt wird. Dieses Maximum kann man sowohl durch visuelle Bestimmung als auch durch Abbildung des mit einem Abbildungssystem erfassten Streulichts längs des Anregungsmodes auf einen optoelektronischen Detektor, z. B. auf die Pixels einer CCD-Kamera als Beispiel eines ortsauflösenden Detektors oder einer Photodiode als Beispiel eines nicht ortsauflösenden Detektors, bestimmen. Unter denselben Einkoppelbedingungen misst man mit einem zweiten optoelektronischen Detektor unter dem Auskoppelwinkel für das geführte Anregungslicht an der zweiten Gitterstruktur II ebenfalls ein maximales Signal.
Als Resonanz winkel für die Einkopplung wird ein Winkel von -3.8° bestimmt. Die ungebeugt durchtretende Lichtmenge wird mit einem Laser- Powermeter hinter der Position der Sensoφlattform gemessen. Als verfügbare Anregungsintensität wird (ohne im Strahlengang befindliche Sensoφlattform) ein Wert von 88 μW bestimmt. Mit dazwischen befindlicher Sensoφlattform, aber ohne Einkopplung in die wellenleitende Schicht, beträgt die Transmission 79 μW. Bei Erfüllung der Einkopplung verringert sich dieser Wert auf 21 μW, d. h. 24 % des insgesamt verfügbaren Anregungslichts.
Anregungseinheit a.v ) / Sensorplattform l.a)
Der Anregungslichtstrahl eines Helium-Neon-Lasers bei 632.8 nm wird mit einer 25 -fachen Aufweitungsoptik auf ein paralleles Strahlenbündel mit kreisförmigem Querschnitt von 2 cm Durchmesser aufgeweitet. Hiervon wird eine Räche von 4 mm Länge x 9 mm Breite (entsprechend den Bezeichnungen für die Gitterstrukturen) aus dem zentralen Teil des Anregungslichtbündels ausgewählt und über ein Umlenkprisma zunächst auf die rechte Kante der Gitterstruktur I (in Richtung des einzukoppelnden und zu führenden Anregungslichts) geleitet. Die Sensoφlattform wird auf maximale Einkopplung justiert, welche an dem längs des eingekoppelten Modes geführten Anregungslichts durch Streuung abgestrahltem Licht erkennbar ist. Als Resonanzwinkel für die Einkopplung wird ein Winkel von -4° bestimmt. Dann wird die Sensoφlattform, ohne Änderung des Winkels, lateral so verschoben, dass das die 4 mm lange Anregungslichtfläche sich in der Mitte der 5 mm langen Gitterstruktur befindet. Die ungebeugt durchtretende Lichtmenge wird mit einem Laser-Powermeter hinter der Position der Sensoφlattform gemessen. Als verfügbare Anregungsintensität wird (ohne im Strahlengang befindliche Sensoφlattform) ein Wert von 250 μW bestimmt. Mit dazwischen befindlicher Sensoφlattform, aber ohne Erfüllung der Koppelbedingung,, beträgt die Transmission 240 μW. Bei Erfüllung der Einkopplung verringert sich dieser Wert auf 51 μ W, d. h. 20 % des insgesamt verfügbaren Anregungslichts.
b) Detektionseinheiten
(i) Detektionssysteme für die gleichzeitige Ausmessung mehrerer
Messbereiche
(I) Als ortsauflösender Detektor diente eine CCD-Kamera (TE3/A Astrocam, Cambridge, UK) mit Peltier-Kühlung (Betriebstemperatur - 30°C). Die Signalerfassung und Fokussierung auf den CCD-Chip erfolgte mit einem 35 mm Nikon-Objektiv (Nikkor 35 mm). Zwischen dem Objektiv und dem CCD-Chip, in einem Strahlengang nur geringer Konvergenz, die die Wirkungsweise der Interferenzfilter nicht wesentlich beeinträchtigte, befanden sich 2 Interferenzfilter (Omega Optical, Brattleborough, Vermont) mit Zentral weilenlänge von 679 nm und 25 nm Bandbreite. Die unter Zufuhr des Hybridisierungspuffers, ohne lumineszente Tracer-Probe erfassten, zeitversetzt zum Lumineszenzsignal bei der Hybridisierung mit komplementären, lumineszenzmarkierten Tracermolekülen aufgenommenen, ortsaufgelösten Signale dienten sowohl zur Festlegung des Hintergrundsignals als auch zur Referenzierung.
(II) Als ortsauflösender Detektor diente eine CCD-Kamera (TE3/A Astrocam, Cambridge, UK) mit Peltier-Kühlung (Betriebstemperatur
-30 °C). Die Signalerfassung und Fokussierung auf den CCD-Chip erfolgte mit einem Heligon-Tandem-Objektiv (Rodenstock, zweimal XR Heligon 1.1/50 mm) . Zwischen den beiden Hälften des Heligon-Tandem-Objektivs befanden sich, auf einem Filterrad montiert, 2 Interferenzfilter (Omega, Brattleborough, Vermont) mit Zentralwellenlänge von 679 nm und 25 nm Bandbreite, sowie entweder ein Neutralfilter (zur Transmission des abgeschwächten, gestreuten Anregungs- und sehr viel schwächeren Lumineszenzlichts von den Messbereichen) oder ein Neutralfilter in Kombination mit einem Interferenzfilter (zur Transmission des abgeschwächten , von den Messbereichen gestreuten Anregungslichts) . Die Signale bei der Anregungs- und der Lumineszenzwellenlänge wurden alternierend gemessen.
(III) Als ortsauflösender Detektor diente eine CCD-Kamera (TE3/A Astrocam, Cambridge, UK) mit Peltier-Kühlung (Betriebstemperatur
- 30°C). Die Signalerfassung und Fokussierung auf den CCD-Chip erfolgte mit einem Heligon-Tandem-Objektiv wie im vorigen Beispiel. Zwischen den beiden Hälften des Heligon-Tandem-Objektivs befanden sich, in Ausbreitungsrichtung des Emissionsstrahlenganges in Richtung Detektor, zunächst eine Strahlteileφlatte unter 45° zur rechtwinkligen Reflektion des mittels Fresnel-Reflektion reflektierten Lichtanteils (vorwiegend bestehend aus Licht bei der Anregungswellenlänge) und nachfolgend 2 Interferenzfilter (Omega, Brattleborough, Vermont) mit Zentralwellenlänge von 679 nm und 25 nm Bandbreite zur selektiven Transmission von Lumineszenzlicht. Das über die Strahlteileφlatte aus dem Emissionsstrahlengang ausgespiegelte Licht wurde entweder direkt oder nach Durchgang durch einen Interferenzfilter für die Anregungswellenlänge auf einen ortsauflösenden Detektor oder einen nicht ortsauflösenden Detektor geleitet. Die Referenzsignale, welche wie in den obigen Beispielen zur Detektionseinheit jeweils die gleichen Bereiche auf der Sensoφlattform erfassen, wurden gleichzeitig mit den Lumineszenzsignalen aus den Messbereichen erfasst. (ii). Detektionssystem für sequentielle Ausmessung von Messbereichen
Der abzubildende Messbereich der Sensoφlattform befindet sich im Fokus eines Linsensystems, welches in einer 1:1 Abbildung den Messbereich auf eine Blende abbildet, mit der Bereiche ausserhalb des betreffenden Messbereichs ausgeblendet werden können. Die Blende befindet sich ihrerseits im Brennpunkt der ersten eines aus mindestens 2 Linsen bestehenden Systems, so dass danach, in Richtung des Detektors, wieder ein paralleler Strahlengang erzeugt wird. Im parallelen Strahlengang befindet sich zunächst eine Strahlteileφlatte unter 45° zum parallelen Strahlengang, mit der mittels Fresnel-Reflektionen ein Teil des erfassten Lichts, welches vorwiegend gestreutes Licht bei der Anregungswellenlänge umfasst, in Richtung des Referenzdetektors, z. B. einer Phodiode mt nachgeschaltetem Verstärker, reflektiert, gegebenenfalls nach Durchgang durch einen Interferenzfilter bei der Anregungswellenlänge. Das nach der Strahlteileφlatte sich weiter ausbreitende Lumineszenzlicht wird mittels zweier Interferenzfilter (Omega Optical, 679 DF25) selektiert und auf den Detektor fokussiert, als welcher ein selektierter Photomultiplier, in Verbindung mit einer Photon Counting Einheit dient (Hamamatsu H6240-02 select).
Zur sequentiellen Aufnahme von Signalen von verschiedenen Messbereichen wird die Sensoφlattform mittels der unter Beispiel 2.a) beschriebenen Justierelemente in x- und y-Richtung verschoben.
Es kann auch eine Kombination von gleichzeitiger Anregung mehrerer Messbereiche und Signaldetektion mittels ortsauflösender Detektoren und Translationsschritten zur Erfassung grösserer Teile der Sensoφlattform, als in einem einzigen Schritt anregbar und detektierbar, vorgenommen werden.
Beispiel 3
Analytisches System
Alle nachfolgend aufgeführten Beispiele sind so konzipiert, dass die Sensoφlattformen mit den zugeordneten Probenbehältnissen als ganzes oder teilweise und das fluidische Zuführungssystem ganz oder teilweise thermostatisiert werden können. (a) Eine einzelne durchgehende, geschlossene Flusszelle + Fluidiksystem
Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel la) verwendet mit einer Anregungseinheit gemäss Beispiel 2 a.iv). Die Detektionseinheit ist gemäss Beispiel 2.b.i.I) ausgebildet. Für die sequentielle Zugabe verschiedener Reagentien und der Proben in einem geschlossenen Riesssystem wird ein geschlossenes Probenbehältnis mit einer zur Sensoφlattform offenen Probenkammer verwendet, welche den gesamten Bereich einschliesslich der Gitterstrukturen I und II, mit einer Breite von 8 mm, einschliesst. Das Material des Probenbehältnisses besteht vorteilhaft aus einem selbsthaftenden, formflexiblen und fluidisch dichtenden, fluoreszenzfreien und reflexionsarmen Kunststoff, im Ausführungsbeispiel aus geschwärztem Polydimethylsiloxan. Die Tiefe der Probenkammer beträgt 0.1 mm, so dass das Gesamtvolumen der Probenkammer etwa 25 μL umfasst. Die durchgehende Probenkammer dient der gleichzeitigen Applikation ein- und derselben Probe oder Reagentien zu allen Messbereichen. Am linken und rechten Rand der Probenkammer, auf der Sensoφlattform gegenüberliegenden Seite, befinden sich 2 Öffnungen, die wechselseitig als Ein- oder Auslass benutzt werden können. Die Zufuhr der Probe und Reagentien erfolgt mit Spritzenpumpen (Cavro XL 3000, Cavro, Sunnyvale, CA, USA) mit einer Dosiergenauigkeit von 1 μl - 10 μl, in Abhängigkeit von der Spritzengrösse. Die Spritzenpumpen sind Teil eines Ruidiksystems, welches weiterhin einen kommerziellen Autosampier (Gilson 231 XL), ein oder mehrere Mehrwege- Ventile und eine Sample-Loop umfasst. Durch Schalten des einen oder mehrerer Ventile und Transport durch die Pumpen können verschiedene Reagentien oder Proben zu den Messbereichen geleitet werden.
(b) Flusszelle mit 5 parallelen, geschlossenen Fliesskanälen + Fluidiksystem
Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel la) verwendet mit einer Anregungseinheit gemäss Beispiel 2 a.ii). Die Detektionseinheit ist gemäss Beispiel 2.b.i.I) ausgebildet. Für die sequentielle Zugabe verschiedener Reagentien und der Proben in einem geschlossenen Riesssystem wird eine geschlossene Flusszelle mit 5 parallelen, zur Sensoφlattform offenen Probenkammern von jeweils 1 mm Breite, in einem Abstand von je 1 mm, verwendet, welche sich bis über die Gitterstrukturen I und II hinaus erstrecken. Die Tiefe der Probenkammer beträgt 0.1 mm, so dass das Gesamtvolumen der Probenkammern jeweils etwa 2.5 μL umfasst. Die 5 Probenkammern dienen der Applikation gleicher oder unterschiedlicher Proben oder Reagentien zu den von oben addressierten Messbereichen. Am linken und rechten Rand der Probenkammern, auf der der Sensoφlattform gegenüberliegenden Seite, befinden sich jeweils 2 Öffnungen, die wechselseitig als Ein- oder Auslass benutzt werden können. Die Zufuhr der Probe und Reagentien erfolgt mit Spritzenpumpen (Cavro XL 3000, Cavro, Sunnyvale, CA, USA) mit kleinen Spritzengrössen 50 μl - 250 μl, mit denen eine Dosiergenauigkeit von etwa 0.5 μl erreicht werden kann. Die Spritzenpumpen sind Teil eines Fluidiksystems, welches weiterhin einen kommerziellen Autosampier (Gilson 231 XL), ein oder mehrere Mehrwege- Ventile und ein oder mehrere Sample-Loop umfasst. Durch Schalten des einen oder mehrerer Ventile und Transport durch die Pumpen können verschiedene Reagentien oder Proben zuden Messbereichen geleitet werden.
c) Nach aussen offene Probengefässe zur individuell adressierbaren Zugabe von Reagentien
Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel lb) verwendet mit einer über die ganze Sensoφlattform ausgebildeten monodiffraktiven Gitterstuktur, und einer Anregungseinheit gemäss Beispiel 2 a.v). Die Detektionseinheit ist gemäss Beispiel 2.b.i.I) ausgebildet.
Um die Zugabe oder Entnahme von Proben und Reagentien in individuell addressierbare, offene Probenbehältnisse zu ermöglichen, ist die Sensoφlattform waagerecht angeordnet. Die Struktur für die Probenbehältnisse wird gebildet aus einer 1 bis 3 mm starken, selbsthaftenden und fluidisch dichtenden, flexiblen Platte aus geschwärztem Polydimethylsiloxan, in welche eine Vielzahl von durchgehenden Aussparungen (mit typischen Durchmessern von 1 mm - 3 mm) eingebracht wurden, welche geometrisch den fluidisch individuell zu adressierenden Messbereichen oder zu Segmenten zusammengefassten Messbereichen entsprechen. Die so strukturierte PDMS-Platte, welch in hoher Stücktahl von einem entsprechenden Master abgeformt werden kann (ebenso wie die zuvor beispielhaft genannten Probenbehältnisse) wird mit der Oberfläche der Sensoφlattform in Kontakt gebracht und haftet auf dieser unterfluidischer Abdichtung der Aussparungen gegeneinander. Gleiche oder unterschiedliche Proben und Reagentien werden, individuell adressiert, mit einem Einzeloder Mehrfach-Parallel-Dispenser in die Probenbehältnisse hineingegeben oder aus diesen abgesogen. Zur Vermeidung von Verdunstung werden, insbesondere im Falle von leichtflüchtigen Proben oder Reagentien, die Ruidik- Applikationsschritte unter einer gesättigten Wasserdampfatmosphäre durchgeführt.
Der Dispenser ist Teil eines Ruidiksystems, welches weiterhin einen kommerziellen Autosampier (Gilson 231 XL), ein oder mehrere Mehrwege- Ventile und eine Sample-Loop umfasst. Durch Schalten des einen oder mehrerer Ventile und Transport durch die Pumpen können verschiedene Reagentien oder Proben zu den Messbereichen geleitet werden.
d) Proben- und Reagentienzugabe mittels eines Dispensers, ohne weitere Probenbehältnisse
Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel lb) verwendet mit einer über die ganze Sensoφlattform ausgebildeten monodiffraktiven Gitterstuktur, und einer Anregungseinheit gemäss Beispiel 2.a.v). Die Detektionseinheit ist gemäss Beispiel 2.b.i.I) ausgebildet.
Um die Zugabe oder Entnahme von Proben und Reagentien zu den individuell zu addressierenden Messbereichen oder Segmenten zu ermöglichen, ist die Sensoφlattform waagerecht angeordnet. Gleiche oder unterschiedliche Proben und Reagentien werden, individuell adressiert, mit einem Einzel- oder Mehrfach-Parallel-Dispenser auf die Messbereiche oder Segmente appliziert oder von diesen abgesogen. Zur Vermeidung von Verdunstung werden, insbesondere im Falle von leichtflüchtigen Proben oder Reagentien, die Ruidik- Applikationsschritte unter einer gesättigten Wasserdampfatmosphäre durchgeführt.
Der Dispenser ist Teil eines Ruidiksystems, welches weiterhin einen kommerziellen Autosampier (Gilson 231 XL), ein oder mehrere Mehrwege- Ventile und eine Sample-Loop umfasst. Durch Schalten des einen oder mehrerer Ventile und Transport durch die Pumpen können verschiedene Reagentien oder Proben zu den Messbereichen geleitet werden. Beispiel 4
Verfahren zum Lumineszenznachweis
4.a Verwendete Lösungen:
1) Hybridisierungspuffer (pH 7.7), bestehend aus 326 mL 0.070 M Phosphatpuffer (pH 7), 29.5 g KCL, 0.09 g EDTA x 2 H20, 2.25 g Poly(acrylic acid) 5100 sodium salt, 2.25 g Tween 20, 1.13 g Natriumazid, aufgefüllt auf 4.5 1 mit destilliertem Wasser und auf pH 7.7 eingestellt mit 1- molarer Natronlauge.
2) Probenlösung (16*c-Cy5): Cy 5 -markiertes, zu dem in den Messbereichen immobilisierten Oligomeren komplementäres, aus 16 Basenpaaren bestehendes Oligomer (Cy5-5'-GTTGTGTGGAATTGTG-3' (10"9 M) in Hybridisierungspuffer 1)
3) Regenerierungslösung: 0.22 g Natriumchlorid, 0,11 g Natriumeitrat (sodium citrate), 2.5 g Tween 20, 142 g Formamid und 0.13 g Natriumazid, gelöst in 250 mL deionisiertem Wasser.
4.b) Messverfahren:
(i) Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel la) verwendet mit einer
Anregungseinheit gemäss Beispiel 2.a.v) sowie einer Detektionseinheit gemäss Beispiel 2.b.i.I) und einer geschlossenen Russzelle gemäss Beispiel
3.a).
Das Messverfahren besteht aus folgenden Einzelschritten:
-5 Minuten Waschen mit Hybridisierungspuffer 1) (0.5 ml/min), Aufnahme des Untergrundsignals;
-5 Minuten Zuführung der Probenlösung (1 nM 16*c-Cy5; 0.5 ml/min);
-5 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer
-5 Minuten Zufuhr der Regenerierungslösung (0.5ml/min)
-5 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer (Re-Equilibrierung)
Während des Verfahrens werden in einem Zeitabstand von jeweils einer Minute Kamerabilder der Sensoφlattform mit den darauf befindlichen Messbereichen bei der Luminezenzwellenlänge aufgenommen. (ii) Es wird eine Sensoφlattform gemäss Beispiel lb) verwendet mit einer
Anregungseinheit gemäss Beispiel 2.a.v) sowie einer Detektionseinheit gemäss Beispiel 2.b.i.I) und einer geschlossenen Russzelle gemäss Beispiel
3.a).
Das Messverfahren besteht aus folgenden Einzelschritten:
-5 Minuten Waschen mit Hybridisierungspuffer 1) (0.5 ml/min), Aufnahme des Untergrundsignals;
-5 Minuten Zuführung der Probenlösung (1 nM (16*c-Cy5; 0.5 ml/min);
-5 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer (1 nM
-5 Minuten Zufuhr der Regenerierungslösung (0.5ml/min)
-5 Minuten Spülen mit Hybridisierungspuffer (Re-Equilibrierung)
Während des Verfahrens werden in einem Zeitabstand von jeweils einer Minute Kamerabilder der Sensoφlattform mit den darauf befindlichen Messbereichen bei der Luminezenzwellenlänge aufgenommen.
4.c) Ergebnisse
(i) Nachfolgend werden beispielhaft Ergebnisse nach dem Messverfahren 4.b.i) diskutiert. Zunächst war der aufgeweitete Anregungslichtstrahl, unter Einkoppelbedingungen, auf die Mitte der Gitterstruktur I gerichtet, und erzeugte dort eine direkt beleuchtete Räche von 4 mm Länge x 9 mm Breite. Von den 6 x 6 Messbereichen (Spalten x Zeilen) wurde die unterste Zeile nicht in der Auswertung berücksichtigt, da sie am Rande der Russzelle lag und daher die Analytzufuhr nicht unter gleichen Bedingungen wir für die übrigen Messbereiche erfolgte. Es ergaben sich nach der Hybridisierungsphase folgende durchschnittliche Netto-Lumineszenzsignale, als Differenz zwischen dem Absolutsignalen und den Background-Signalen in diesen Messbereichen (Tabelle 1, Einheit: "counts per second, cps"):
Tabelle 1:
Figure imgf000046_0001
Im Falle der in diesem Beispiel benutzten Sensoφlattform l.a) mit einer Gittertiefe von 12 +/- 3 nm war die Effizienz von Ein- und Auskopplung des Anregungslichts unvollständig, was zu einem positiven Gradienten der Intensität des verfügbaren Anregungslichts, in Richtung des geführten Modes, führte. Dieses führt mit einem Anstieg der beobachteten Lumineszenzsignale mit steigender Spaltenzahl in Tabelle 1. Zur graphischen Visualisierung ist in Abbildung 1 beispielhaft der Verlauf der Brutto-Lumineszenzsignale, also vor Abzug der Background-Signale, längs der Zeile 5 der Messbereiche, entsprechend obiger Tabelle, dargestellt.
Im weiteren Verlauf des Messverfahrens 4.b.i. wurde die Sensoφlattform ohne Veränderung des Winkels so weit in Längsrichtung verschoben, dass ein Teil des Anregungslichtes, welches nahe der rechten Kante der Gitterstruktur 1 eingekoppelt wurde, sich weiter in der optisch transparenten Schicht a) in Richtung der Gitterstruktur II ausbreiten konnte, wo es dann ausgekoppelt wurde. Beim Durchlaufen des Bereiches zwischen den beiden Gitterstrukturn I und II wurde das zweite, zwischen diesen Gitterstrukturen liegende 6 x 6 Array von Messbereichen, als Beispiel für ein Segment von Messbereichen, angeregt. Die obersten zwei Zeilen des Arrays befanden sich am oberen Rand des Probenbehältnisses. Die Signale aus den betreffenden Messbereichen wurden in der Auswertung nicht berücksichtigt.
Es ergaben sich nach der Hybridisierungsphase folgende durchschnittliche Netto-Lumineszenzsignale, als Differenz zwischen dem Absolutsignalen und den Background-Signalen in diesen Messbereichen (Tabelle 2, Einheit: "counts per second, cps"):
Tabelle 2:
Figure imgf000047_0001
Die Ausbreitungsverluste in der optisch transparenten Schicht (a) zwischen den Gitterstrukturen (I) und (II), entsprechend einem negativen Gradienten der Intensität verfügbaren geführten Anregungslichts, waren in diesem Beispiel recht gross und führten zu einer deutlichen Verringerung der Netto- Lumineszenzsignale mit steigender Ausbreitungslänge des geführten Anregungslichts bzw. steigender Spaltenzahl der Messbereiche (siehe Tabelle 2). Zur graphischen Visualisierung ist in Abbildung 2 beispielhaft der Verlauf der Brutto-Lumineszenzsignale, also vor Abzug der Background-Signale, längs der Zeile 5 der Messbereiche, entsprechend obiger Tabelle, dargestellt.
Im weiteren Verlauf dieses Messverfahrens wurde der Einstellwinkel der Sensoφlattform bezüglich der Normalen von -4°, was zu einem bezüglich obiger Abbildungen sich nach rechts ausbreitenden Mode geführten Anregungslichts in der optisch transparenten Schicht (a) führt, auf +4° umgestellt. Damit ist die Einkoppelbedingung zur Erzeugung eines sich nach links ausbreitenden Modes erfüllt.
Unter den Versuchsbedingungen konnten damit 4 Spalten des 6 x 6 Arrays von Messbereichen auf der Gitterstruktur I unter Einkoppellbedingungen angeregt werden. Aufgrund der unvollständigen Effizienz der Ein- und Auskopplung stellt sich damit ein nach links ansteigender Gradient der Intensität geführten verfügbaren Anregungslichts ein, wie beispielhaft aus dem Verlauf der Brutto-Lumineszenzsignale, also vor Abzug der Background-Signale, längs der Zeile 5 der Messbereiche in Abbildung 3 zu entnehmen ist.
(ii) Nachfolgend werden beispielhaft Ergebnisse nach dem Messverfahren 4.b.ii) diskutiert. Der aufgeweitete Anregungslichtstrahl wurde, unter Einkoppelbedingungen, auf ein Array von Messbereichen gerichtet, das auf der vollständig mit einer einheitlichen Gitterstruktur durchmodulierten Sensoφlattform aufgebracht worden war.
Aufgrund der grösseren Gittertiefe von 25 +/- 5 nm war die Effizienz von Ein- und Auskopplung des Anregungslichts wesentlich grösser, was zu einem nur sehr geringen positiven Gradienten der Intensität des verfügbaren Anregungslichts, in Richtung des geführten Modes, führte, dessen Effekt kaum die statistische Schwankung der Messergebnisse übersteigt. Zur graphischen Visualisierung ist in Abbildung 4 beispielhaft der Verlauf der Brutto-Lumineszenzsignale, also vor Abzug der Background-Signale, längs der Zeile 5 der Messbereiche, dargestellt.
Beispiel 5
a) Sensorplattformen
(i) Es wurde eine Sensoφlattform mit den äusseren Abmessungen 16 mm Breite x 48 mm Länge x 0.7 mm Dicke verwendet. Das Substratmaterial (optisch transparente Schicht (b)) bestand aus AF 45 Glas (Brechungsindex n = 1.52 bei 633 nm). Die optisch transparente Schicht (a) auf der optisch transparenten Schicht (b) aus Ta205 wurde durch reaktives, magnetfeldunterstütztes DC-Sputtern erzeugt und hatte einen Brechungsindex von 2.15 bei 633 nm (Schichtdicke 150 nm). Zusätzlich enthielt die Sensoφlattform 2 diskrete Gitterstrukturen, von jeweils einer Periode von 360 nm, mit gleicher Anordnung wie in Beispiel la) (Abmessungen von 5 mm Länge x 12 mm Breite bzw. 1 mm Länge x 12 mm Breite, mit Tiefen von 12+/- 3 nm). Die Gitterstrukturen wurden im nachfolgend beschriebenen Messverfahren allerdings nicht verwendet, weder zu einer Luminenzanregung noch zu einer Lumineszenzdetektion. (ii) Es wurde eine Sensoφlattform mit den äusseren Abmessungen 16 mm Breite x 48 mm Länge x 0.7 mm Dicke verwendet, mit ähnlichen physikalischen Paremetern wie Beispiel b). Das Substratmaterial (optisch transparente Schicht (b)) bestand aus AF 45 Glas (Brechungsindex n = 1.52 bei 633 nm). Im Substrat war mittels holographischer Belichtung der mit aufgeschleudertem Photolack bedeckten wellenleitenden Schicht (a) und anschliessendes nasschemisches Ätzen eine durchgehende Struktur eines Oberflächenrelief gitters einer Periode von 360 nm und einer Tiefe von wiederum 25 +/-5 nm erzeugt worden, mit Orientierung der Gitterlinien parallel zur ausgewiesenen Breite der Sensoφlattform. Die wellenleitende, optisch transparente Schicht (a) auf der optisch transparenten Schicht (b) aus Ta2θ5 war durch reaktives, magnetfeldunterstütztes DC-Sputtern (siehe DE 4410258) erzeugt worden und hatte einen Brechungsindex von 2.15 bei 633 nm (Schichtdicke 150 nm). Unter Einkoppelbedingungen kann Anregungslicht von 633 nm unter einem Winkel von etwa +3° in die Struktur eingekoppelt werden; Einkopplung oder Auskopplung von Licht mit einer Wellenlänge von 670 nm (entsprechend dem Maximum der Ruoreszenz von Cy5) erfolgt unter einem Winkel von etwa -6°.
Zur Vorbereitung auf die Immobilisierung der biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselemente wurden die Sensoφlattformen 5.a) (i) und (ii) gereinigt und mit Epoxysilan in Rüssigphase (10 ml (2 % v/v ) 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und 1 ml (0.2 % v/v) N-Ethyldiisopropylamin in 500 ml ortho-Xylol silanisiert (7 Stunden bei 70°C). Danach wurden mit einem kommerziellen Spotter (Genetic Microsystems 417 Array er) Lösungen von fluoreszenzmarkierten 18-mer Oligonukleotiden (Cy5-5'-CCGTAACCTCATGATATT-3'-NH2) (18*Cy5-NH2) jeweils zwei Arrays von jeweils 16 x 8 Spots (8 Reihen x 16 Spalten) aufgebracht (50 pl pro Spot). Die Konzentration der aufgebrachten Lösungen betrug dabei alternierend pro Reihe 10" bzw. 10" M 18*Cy5- NH2, so dass die erzeugten Spots (ca. 125 μm Durchmesser in einem Zentrum-zu-Zentrum- Ab stand von 375 μm) Ruorophorkonzentrationen von etwa 100 bzw. 10 Ruorophoren pro μm2 aufwiesen.
Die Spot- Arrays von jeweils ca. 3.2 mm Breite x 5.8 mm Länge waren auf den Sensoφlattformen hintereinander in einem Abstand von 3.3 mm angeordnet, so dass im Falle der Sensoφlattform (i) beide Arrays einen Abstand von mehreren Millimetern zu den nächsten Koppelgittern hatten. b) Optisches System
Die Intensität der Ruoreszenzintensität in den Spotarrays auf den Sensoφlattformen (i) und (ii) wurde mit einem kommerziellen Scanner (Genetic Microsystems 418 Array Scanner), unter Einstrahlung des Anregungslichts in einer Auflichtanordnung mit konvergentem Anregungslichtbündel, gemessen. Dabei war die optische Achse des Anregungslichtbündels senkrecht zur Sensoφlattform ausgerichtet. Die Anregungslichtintensität betrug etwa 5 mW. De numerische Apertur der Objektiv-Linse des Laser-Scanners beträgt, was einem halben Öffnungswinkel von etwa 53° entspricht. Die Scan-Geschwindigkeit entsprach der Angabe im Produktkatalog (18 mm/min bei einer Scan-Breite von 22 mm).
Zu einem weiteren Vergleich wurde die Ruoreszenz aus den Messbereichen der Sensoφlattform (i) (mit Gitterstrukturen I und II) unter Einkoppelbedingungen, mit einem parallelen Anregungslichtbündel und Einkopplung am rechten Rand der Gitterstruktur 1 (1 mm Länge x 12 mm Breite; Einkoppelwinkel + 3°) gemessen. Dabei wurde eine Anregungseinheit gemäss Beispiel 2 / Anregungseinheit a.ii (mit Zylinderlinse aufgeweiteter Anregungsstrahl eines Helium-Neon-Lasers, 0.6 mW) in Kombination mit einer Detektionseinheit gemäss Beispiel 2.b)(i)(I) verwendet.
c) Messergebnisse
Eine Auswahl der Messergebnisse ist in Tabelle 3 zusammengestellt. Die Signale (Netto-Ruoreszenzsignale als Differenz von Gesamtsignalen und lokalen Untergrundsignalen), Untergrundsignale und Rauschen wurden aus vier Teilbereichen mit jeweils 10 benachbarten Spots gleicher Ruorophorkonzentration (10 Ruorophore pro μm2) im Falle der Auflichtanregung mit den Sensoφlattformen (i) und (ii) bzw. zwei solchen Teilbereichen im Falle der evaneszenten Anregung, d. h. Einkopplung des Anregungslichts zu den Messbereichen auf dem unstrukturierten Teil der Sensoφlattform (i), bestimmt. Mit der Sensoφlattform (ii), mit Messbereichen auf dem über die gesamte Plattform modulierten, monodiffraktiven Gitter, werden in der Konfiguration der Auflichtanregung deutlich höhere Ruoreszenzsignale beobachtet als mit der Sensoφlattform (i), welche im Gebiet der Messbereiche keine Gitterstruktur aufweist. Unter den Versuchsbedingungen kann eine Einkopplung von Anregungslicht in die optisch transparente, wellenleitende Schicht (a) im Falle der Sensoφlattform (i) vollständig ausgeschlossen, im Falle der Sensoφlattform (ii) weitgehend vernachlässigt werden, da angesichts des stark konvergenten Anregungsstrahlenganges nur ein sehr kleiner Anteil unter einem solchen Winkel auf die Gitterstruktur auftrifft, dass es zu einer Einkopplung koppeln kann. Die deutliche Erhöhung der beobachteten Ruoreszenzintensität ist dadurch zu erklären, dass ein erheblicher Anteil der nichtevaneszent angeregten Ruoreszenz von den im Nahfeld der optisch transparenten Schicht (a) befindlichen Ruorophoren in diese einkoppelt. Über die durchgehend modulierte Gitterstruktur wird er jedoch nach einer sehr kurzen Lauflänge, welche abhängig ist von der Tiefe der Gitterstruktur, wieder ausgekoppelt. Da die Auskopplung aufgrund der gegebenen Parameter der Sensoφlattform unter einem Winkel von etwa -6° erfolgt, wird der ausgekoppelte Anteil aufgrund der hohen numerischen Apertur des Objektivs vom Detektor mit erfasst. Ein gewisser Anteil der beobachteten Lumineszenzerhöhung mag zusätzlich einem kleinen Anteil eingekoppelten Anregungslichts zuzuschreiben sein. Die hohe Effizienz der Auskopplung zeigt sich darin, dass es keine signifikanten Unterschiede in den Untergrundsignalen gibt, so dass ein Übersprechen von rückgekoppeltem Ruoreszenzlicht in benachbarte Messbereiche erfindungsgemäss wirksam verhindert werden kann.
Im Falle der Sensoφlattform (i) wird ein ebenso grösser Anteil von Lumineszenzlicht in die Schicht (a) einkoppeln, da sie die gleichen Parameter aufweist. Jedoch kann hier eingekoppeltes Ruoreszenzlicht nur über die ausserhalb des Gesichtsfeldes des Detektors befindlichen Gitterstrukturen auskoppeln oder an den Stirnflächen der Sensoφlattform austreten.
Die Messungen bei der höheren Ruoφhorkonzentration ergaben mit beiden Sensoφlattformen etwa zehnfach höhere Ruoreszenzsignale und Signal / Rauschen- Verhältnisse. Das Verhältnis von Nettosignal zum Rauschen kann durch mehrfaches Scannen, mit entsprechend verlängerter Messzeit (im Beispiel 10 Minuten statt 1 Minute für 10-faches Scannen) noch verbessert werden, in diesem Beispiel um etwa einen Faktor 3. Die Vergleichsmessung mit der Sensoφlattform (i) unter Einkoppelbedingungen zeigt, dass mit dieser erfindungsgemässen Anordnung die Empfindlichkeit bei wesentlich schwächerem Anregungslicht nochmals erheblich, nämlich unter diesen Bedingungen um einen Faktor 5 bis 12, in Abhängigkeit von der Belichtungszeit, gesteigert werden kann. Zugleich sind, wie aus den beispielhaften Bedingungen ersichtlich, für diese Methode wesentlich kürzere Messzeiten notwendig.
Tabelle 3:
Figure imgf000052_0001
b) Optisches System
Die Intensität der Ruoreszenzintensität in den Spotarrays auf den Sensoφlattformen (i) und (ii) wurde mit einem kommerziellen Scanner (Genetic Microsystems 418 Array Scanner), unter Einstrahlung des Anregungslichts in einer Auflichtanordnung mit konvergentem Anregungslichtbündel, gemessen. Dabei war die optische Achse des Anregungslichtbündels senkrecht zur Sensoφlattform ausgerichtet. Die Anregungslichtintensität betrug etwa 5 mW. De numerische Apertur der Objektiv-Linse des Laser-Scanners beträgt, was einem halben Öffnungswinkel von etwa 53° entspricht. Die Scan-Geschwindigkeit entsprach der Angabe im Produktkatalog (18 mm/min bei einer Scan-Breite von 22 mm).
Zu einem weiteren Vergleich wurde die Fluoreszenz aus den Messbereichen der Sensoφlattform (i) (mit Gitterstrukturen I und II) unter Einkoppelbedingungen, mit einem parallelen Anregungslichtbündel und Einkopplung am rechten Rand der Gitterstruktur 1 (1 mm Länge x 12 mm Breite; Einkoppel winkel + 3°) gemessen. Dabei wurde eine Anregungseinheit gemäss Beispiel 2 / Anregungseinheit a.ii (mit Zylinderlinse aufgeweiteter Anregungsstrahl eines Helium-Neon-Lasers, 0.6 mW) in Kombination mit einer Detektionseinheit gemäss Beispiel 2.b)(i)(I) verwendet.
c) Messergebnisse
Eine Auswahl der Messergebnisse ist in Tabelle 3 zusammengestellt. Die Signale (Netto-Ruoreszenzsignale als Differenz von Gesamtsignalen und lokalen Untergrundsignalen), Untergrundsignale und Rauschen wurden aus vier Teilbereichen mit jeweils 10 benachbarten Spots gleicher Ruorophorkonzentration (10 Ruorophore pro μm2) im Falle der Auflichtanregung mit den Sensoφlattformen (i) und (ii) bzw. zwei solchen Teilbereichen im Falle der evaneszenten Anregung, d. h. Einkopplung des Anregungslichts zu den Messbereichen auf dem unstrukturierten Teil der Sensoφlattform (i), bestimmt.
Mit der Sensoφlattform (ii), mit Messbereichen auf dem über die gesamte Plattform modulierten, monodiffraktiven Gitter, werden in der Konfiguration der Auflichtanregung deutlich höhere Ruoreszenzsignale beobachtet als mit der Sensoφlattform (i), welche im Gebiet der Messbereiche keine Gitterstruktur aufweist. Unter den Versuchsbedingungen kann eine Einkopplung von Anregungslicht in die optisch transparente, wellenleitende Schicht (a) im Falle der Sensoφlattform (i) vollständig ausgeschlossen, im Falle der Sensoφlattform (ii) weitgehend vernachlässigt werden, da angesichts des stark konvergenten Anregungsstrahlenganges nur ein sehr kleiner Anteil unter einem solchen Winkel auf die Gitterstruktur auftrifft, dass es zu einer Einkopplung koppeln kann. Die deutliche Erhöhung der beobachteten Fluoreszenzintensität ist dadurch zu erklären, dass ein erheblicher Anteil der nichtevaneszent angeregten Ruoreszenz von den im Nahfeld der optisch transparenten Schicht (a) befindlichen Ruorophoren in diese einkoppelt. Über die durchgehend modulierte Gitterstruktur wird er jedoch nach einer sehr kurzen Lauflänge, welche abhängig ist von der Tiefe der Gitterstruktur, wieder ausgekoppelt. Da die Auskopplung aufgrund der gegebenen Parameter der Sensoφlattform unter einem Winkel von etwa -6° erfolgt, wird der ausgekoppelte Anteil aufgrund der hohen numerischen Apertur des Objektivs vom Detektor mit erfasst. Ein gewisser Anteil der beobachteten Lumineszenzerhöhung mag zusätzlich einem kleinen Anteil eingekoppelten Anregungslichts zuzuschreiben sein. Die hohe Effizienz der Auskopplung zeigt sich darin, dass es keine signifikanten Unterschiede in den Untergrundsignalen gibt, so dass ein Übersprechen von rückgekoppeltem Ruoreszenzlicht in benachbarte Messbereiche erfmdungsgemäss wirksam verhindert werden kann.
Im Falle der Sensoφlattform (i) wird ein ebenso grösser Anteil von Lumineszenzlicht in die Schicht (a) einkoppeln, da sie die gleichen Parameter aufweist. Jedoch kann hier eingekoppeltes Ruoreszenzlicht nur über die ausserhalb des Gesichtsfeldes des Detektors befindlichen Gitterstrukturen auskoppeln oder an den Stirnflächen der Sensoφlattform austreten.
Die Messungen bei der höheren Ruoφhorkonzentration ergaben mit beiden Sensoφlattformen etwa zehnfach höhere Fluoreszenzsignale und Signal / Rauschen- Verhältnisse. Das Verhältnis von Nettosignal zum Rauschen kann durch mehrfaches Scannen, mit entsprechend verlängerter Messzeit (im Beispiel 10 Minuten statt 1 Minute für 10-faches Scannen) noch verbessert werden, in diesem Beispiel um etwa einen Faktor 3.
Die Vergleichsmessung mit der Sensoφlattform (i) unter Einkoppelbedingungen zeigt, dass mit dieser erfindungsgemässen Anordnung die Empfindlichkeit bei wesentlich schwächerem Anregungslicht nochmals erheblich, nämlich unter diesen Bedingungen um einen Faktor 5 bis 12, in Abhängigkeit von der Belichtungszeit, gesteigert werden kann. Zugleich sind, wie aus den beispielhaften Bedingungen ersichtlich, für diese Methode wesentlich kürzere Messzeiten notwendig.
Tabelle 3:
Figure imgf000055_0001

Claims

Patentansprüche
1. Sensoφlattform zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schicht Wellenleiter
- mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Übersprechen von in den Messbereichen oder in den mehrere Messbereiche umfassenden Segmenten erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder benachbarte Segmente mittels an die Messbereiche oder an die Segmente angrenzender Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Periode wie die Gitterstrukturen (c) zur Auskopplung des Lumineszenzlichts verhindert wird.
2. Sensoφlattform nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstrukturen (c) und (c') wechselseitig als Ein- und oder Auskoppelgitter verwendet werden können.
3. Sensoφlattform nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstrukturen (c) und (c') räumlich getrennte Messbereiche (d) oder räumlich getrennte Segmente (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, umschliessen, bevorzugt in einer kreis-, rechteck- oder polygonförmigen Anordnung um die Messbereiche.
4. Sensoφlattform nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterlinien der Gitterstrukturen (c) und (c') parallel zueinander ausgerichtet sind.
5. Sensoφlattform nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstrukturen (c) und (c') eine gemeinsame durchgehende Gitterstruktur bilden, auf der sich mehrere Messbereiche oder Segmente befinden.
6. Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter
- mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einer im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereiche oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmente (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und
- ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche oder Segmente durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird.
7. Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schicht Wellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einer im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereiche oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmente (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16
Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird.
8. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 5 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass die im Bereich der einen oder mehreren Messbereiche oder Segmente durchgehend modulierte Gitterstruktur eine Überlagerung von 2 oder mehreren Gitterstrukturen unterschiedlicher Periodizität mit zueinander paralleler oder nicht paralleler, vorzugsweise nicht paralleler Ausrichtung der Gitterlinien ist, welche der Einkopplung von Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge dient, wobei im Falle von 2 überlagerten Gitterstrukturen deren Gitterlinien vorzugsweise senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
9. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 10 000 nm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet.
10. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer oder synthetischer Erkennungselementen (e) auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) mit einer Stärke von vorzugsweise weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm aufgebracht ist, und dass die Haftvermittlungsschicht (f) vorzugsweise eine chemische Verbindung aus der Gruppe Silane, Epoxide und "selbstorganisierte funktionalisierte Monoschichten" umfasst.
11. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass räumlich getrennte Messbereiche (d) durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf besagter Sensoφlattform erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting, mechanischem Spotting, micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen" , gebildet wird.
12. Sensoφlattform nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als besagte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente Komponenten aus der Gruppe aufgebracht werden, die von Nukleinsäuren (DNA, RNA, ...) und Nukleinsäureanalogen (PNA ...), Antiköφern, Aptameren, membrangebundenen und isolierten Rezeptoren, deren Liganden, Antigene für Antiköφer, "Histidin-Tag-Komponenten", durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, etc. gebildet wird, oder dass als biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselementen ganze Zellen oder Zellfragmente aufgebracht werden.
13. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 11 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten "chemisch neutrale" Verbindungen, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen von Rinderserumalbumin bzw. Polyethylenglycol, zur Verminderung unspezifischer Bindung oder Adsoφtion aufgebracht sind.
14. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehrere räumlich getrennte Messbereiche jeweils zu Segmenten auf der Sensoφlattform zusammengefasst sind und und dass bevorzugt verschiedene Segmente zusätzlich durch eine aufgebrachte Berandung, welche zur fluidischen Abdichtung gegen Nachbarbereiche und / oder zu einer weiteren Verminderung optischen Übersprechens zwischen benachbarten Segmenmten beiträgt, gegeneinander abgegrenzt sind.
15. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 100 000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Räche von 0.001 - 6 mm2 einnimmt.
16. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) ein diffraktives Gitter mit einer einheitlichen Periode oder ein multidiffraktives Gitter ist.
17. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) eine senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierende Periodiziät aufweist.
18. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der zweiten optisch transparenten Schicht (b) aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen Kunststoff, beispielsweise aus der Gruppe besteht, die von Polycarbonat, Polyimid oder Polymethylmethacrylat gebildet wird.
19. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex der ersten optisch transparenten Schicht (a) grösser als 2 ist.
20. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass die erste optisch transparente Schicht (a) aus Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, oder Zr02, besonders bevorzugt aus Ti02und Ta205 besteht.
21. Sensoφlattform nach einem der Anspruch 1 - 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 40 bis 300 nm, vorzugsweise 70 - 160 nm beträgt.
22. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gitter (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweist und die Modulationstiefe des Gitters (c) 3 bis 100 nm, bevorzugt 10 bis 30 nm beträgt.
23. Sensoφlattform nach Anspruch 5 oder 6 und einem der Ansprüche 9 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass durch unvollständige Ein- und Auskopplung von Anregungs- und / oder rückgekoppeltem Lumineszenzlicht parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts ein über die Gittertiefe kontrollierbarer positiver Gradient der Intensität des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche erzeugt wird.
24. Sensoφlattform nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Gitter (c) in Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts eine räumlich variierende Gittertiefe aufweist.
25. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts ein über dessen Ausbreitungsverluste in der optisch transparenten Schicht (a) kontrollierbarer negativer Gradient der Intensität des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche erzeugt wird.
26. Sensoφlattform nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
27. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) ein Reliefgitter mit Rechteck-, Dreieck- oder halbkreisförmigem Profil oder ein Phasen- oder Volumengitter mit einer periodischen Modulation des Brechungsindex in der im wesentlichen planaren optisch transparenten Schicht (a) ist.
28. Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass auf ihr optisch oder mechanisch erkennbare Markierungen zur Erleichterung der Justierung in einem optischen System und / oder zur Verbindung mit Probenbehältnissen als Teil eines analytischen Systems aufgebracht sind.
29. Optisches System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen, mit
- mindestens einer Anregungslichtquelle
- einer Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 28
- mindestens einem Detektor zur Erfassung des von dem mindestens einem oder mehreren Messbereichen (d) auf der Sensoφlattform ausgehenden Lichts.
30. Optisches System nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einer Auflicht- oder Transmissionslichtanordnung zu den Messbereichen eingestrahlt wird.
31. Optisches System nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion des Lumineszenzlichts derart erfolgt, dass das von einer Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenzlicht vom Detektor mit erfasst wird.
32. Optisches System nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das von der mindestens einen Lichtquelle ausgesandte Anregungslicht kohärent ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird.
33. Optisches System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von mindestens einer Lichtquelle mit einer Aufweitungsoptik zu einem im wesentlichen parallelen Strahlenbündel aufgeweitet wird und auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird, wobei dieses bevorzugt unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) erfolgt.
34. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht von der mindestens einen Lichtquelle durch ein oder, im Falle mehrerer Lichtquellen, gegebenenfalls mehrere diffraktive optische Elemente, vorzugsweise Dammann-Gitter, oder refraktive optische Elemente, vorzugsweise Mikrolinsen-Arrays, in eine Vielzahl von Einzelstrahlen möglichst gleicher Intensität der von einer gemeinsamen Lichtquelle stammenden Teilstrahlen zerlegt wird, welche jeweils im wesentlichen parallel zueinander auf räumlich getrennte Messbereiche eingestrahlt werden.
35. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Anregungslichtquellen zwei oder mehrere kohärente Lichtquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.
36. Optisches System nach Anspruch 35 mit einer Sensoφlattfrom nach Anspruch 8, dadurch gekenzeichnet, dass das Anregungslicht von 2 oder mehr kohärenten Lichtquellen gleichzeitig oder sequentiell aus verschiedenen Richtungen auf eine Gitterstruktur (c) eingestrahlt wird, welche eine Überlagerung von Gitterstrukturen mit unterschiedlicher Periodizität umfasst.
37. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 36, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird, beispielsweise aus der Gruppe, die von CCD-Kameras, CCD-Chips, Photodioden- Arrays, Avalanche-Dioden- Arrays, Multichannelplates und Vielkanal-Photomuliplier gebildet wird.
38. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 28 und /oder zwischen besagter Sensoφlattform und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- oder Lumineszenzlichts gebildet werden.
39. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 38, dadurch gekenzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.
40. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 39, dadurch gekennzeichnet, dass zur Referenzierung Lichtsignale aus der Gruppe gemessen werden, die von Anregungslicht am Ort der Lichtquellen oder nach ihrer Aufweitung oder nach ihrer Unterteilung in Teilstrahlen, Streulicht bei der Anregungs Wellenlänge aus dem Bereich der einen oder mehreren räumlich getrennten Messbereiche, und über die Gitterstruktur (c) neben den Messbereichen ausgekoppeltem Licht der Anregungswellenlänge gebildet werden.
41. Optisches System nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Messbereiche zur Bestimmung des Emissionslichts und des Referenzsignals identisch sind.
42. Optisches System nach einem der Ansprüche 29 - 41, dadurch gekenzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt.
43. Optisches System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgt, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird.
44. Optisches System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung eines im wesentlichen winkel- und fokusgetreuen Scanners erfolgt.
45. Optisches System nach einem der Ansprüche 42 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoφlattform zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird.
46. Analytisches System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer Sensoφlattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter, mit
- einer Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 1 - 28,
- einem optischen System nach einem der Ansprüche 29 - 45,
- Zuführungsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der Sensoφlattform in Kontakt zu bringen.
47. Analytisches System nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass dieses zusätzlich eine oder mehrere Probenbehältnisse umfasst, welche mindestens im Bereich der einen oder mehreren Messbereiche oder der zu Segmenten zusammengefassten Messbereiche zur Sensoφlattform hin geöffnet sind, wobei die Probenbehältnisse vorzugsweise jeweils ein Volumen von 0.1 nl - 100 μl haben.
48. Analytisches System nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite, mit Ausnahme von Ein- und / oder Auslassöffnungen für die Zufuhr oder den Auslass der Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien, geschlossen sind und die Zufuhr oder der Auslass von Proben und gegebenenfalls zusätzlicher Reagentien in einem geschlossenen Durchflusssystem erfolgen, wobei im Falle der Rüssigkeitszufuhr zu mehreren Messbereichen oder Segmenten mit gemeinsamen Einlass- und Auslassöffnungen diese bevorzugt spalten- oder zeilenweise addressiert werden.
49. Analytisches System nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenbehältnisse auf der von der optisch transparenten Schicht (a) abgewandten Seite Öffnungen zur lokal addressierten Zugabe oder Entfernung der Proben oder anderer Reagentien besitzen.
50. Analytisches System nach einem der Ansprüche 47 - 49, dadurch gekennzeichnet, dass Behältnisse für Reagentien vorgesehen sind, welche während des Verfahrens zum Nachweis des einen oder mehrerer Analyten benetzt und mit den Messbereichen in Kontakt gebracht werden
51. Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf einer Sensoφlattform zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von einem Array aus mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter
- mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a),
- mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen (d)
- mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und
- auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Übersprechen von in den Messbereichen oder in den mehrere Messbereiche umfassenden Segmenten erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder benachbarte Segmente mittels an die Messbereiche oder an die Segmente angrenzender Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Periode wie die Gitterstrukturen (c) zur Auskopplung des Lumineszenzlichts verhindert wird.
52. Verfahren zum gleichzeitigen Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben auf einem mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf einer Sensoφlattform zur gleichzeitigen Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen von mindestens zwei oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, auf dieser Plattform, umfassend einen optischen Schichtwellenleiter mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), mit einem im Bereich der mindestens zwei oder mehr Messbereichen oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, durchgängig modulierten Gitterstruktur (c) mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen (d) oder mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Segmenten (d'), in die mehrere Messbereiche zusammengefasst sind, und auf diesen Messbereichen immobilisierten, gleichen oder unterschiedlichen biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen (e) zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Dichte der Messbereiche auf der Sensoφlattform mindestens 16 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und
- ein Übersprechen von in den Messbereichen oder innerhalb eines Segments erzeugter und in die optisch transparente Schicht (a) des Schichtwellenleiters rückgekoppelter Lumineszenz in benachbarte Messbereiche oder Segmente mittels Auskopplung dieses Lumineszenzlichts durch die im Bereich der betreffenden Messbereiche oder Segmente durchgehend modulierte Gitterstruktur (c) verhindert wird.
53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht zu den Messbereichen über die Gitterstruktur (c) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt wird.
54. Verfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen nach einem der Ansprüche 51 - 53, dadurch gekennzeichnet, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über die Gitterstruktur (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
55. Verfahren zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten mit einer Sensoφlattform nach einem der Ansprüche 23 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines kontrollierbaren Gradienten des geführten Anregungs- und / oder angeregten Lumineszenzlichts innerhalb eines einzelnen und / oder über mehrere Messbereiche, parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingekoppelten Anregungslichts, der dynamische Bereich für die Signalerfassung und / oder quantitative Analytbestimmung erweitert oder beschränkt werden kann.
56. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 55, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert.
57. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen gebunden ist.
58. Verfahren nach Anspruch 56 oder 57, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden
59. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie der erste Lumineszenzfarbstoff angeregt werden kann, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.
60. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzfarbstoffe nur wenig oder gar nicht überlappen.
61. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis des Analyten Ladungs- oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzfarbstoff zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzfarbstoff verwendet wird.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 51 - 61, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.
63. Verfahren nach einem der Ansprüche 51 - 62, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden, wobei vorzugsweise die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.
64. Verfahren nach einem der Ansprüche 51 - 63 zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Antiköφern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
65. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 51 - 64, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben natürlich vorkommende Köφerflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb oder optisch trübe Rüssigkeiten oder Oberflächenwasser oder Bodenoder Pflanzenextrakte oder Bio- oder Syntheseprozessbrühen oder aus biologischen Gewebeteilen entnommen sind.
66. Verwendung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 51 - 65 zu quantitativen oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreenmg und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktentwicklung und -forschung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und - forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen und Bakterien, in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
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