WO2000071160A1 - Compositions medicinales contenant un anticorps anti-fas - Google Patents

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WO2000071160A1
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fas
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glutamic acid
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PCT/JP2000/003324
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Nobufusa Serizawa
Kimihisa Ichikawa
Hiroko Yoshida
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Sankyo Company, Limited
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical composition effective for preventing or treating an autoimmune disease or rheumatoid arthritis.
  • apoptosis physiological cell death that occurs due to normal cell replacement is called apoptosis, and is distinguished from necrosis (necrosis), which is a pathological cell death (Kerr, et al. (1972) Br. J. Cancer 26, 239).
  • necrosis a pathological cell death
  • programmed cell death is the death of certain types of cells that are programmed to die in vivo in advance, and apoptosis is one of them.
  • apoptosis phenomena such as cell surface curvature, nuclear chromatin condensation, and chromosomal DNA fragmentation are specifically observed.
  • Apoptosis plays a role in the differentiation of lymphocytes (T cells and B cells) by eliminating cells that recognize self antigens.
  • autoimmune diseases are caused by the generation of autoreactive lymphocytes due to defective apoptosis in lymphocyte differentiation (see Keiichi Nakayama et al. (1995) Mebio 12 (10), 79-86).
  • Examples of molecules involved in such apoptosis include Fas [see Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 1747-1756], and tumor necrosis factor receptor i> 1 umor Necrosis Factor Receptor; [See Loetscher, H. et al. (1990) Cel 161, 351-359], CD40 [Tsubata, T. et al.
  • Fas is a transmembrane protein that exists on the cell surface and is a protein called Fas ligand. Binds to its extracellular region and induces apoptosis in the cell. It has been reported that some anti-Fas monoclonal antibodies have cytotoxic activity that induces cell apoptosis, similar to Fas ligand, and can be used as a therapeutic agent for autoimmune diseases, AIDS and tumors. (Refer to Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-2377935 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-503282).
  • Rheumatoid arthritis is a disease based on synovial cell proliferation with various immunological abnormalities caused by external and external factors. It is thought to be a synovial cell proliferation disorder with invasion and bone erosion. Tissue destruction of the affected joints in rheumatoid arthritis is thought to be caused by abnormal production of cytokines from inflammatory synovial cells. Examination of the condition of the joints of rheumatoid patients reveals that synovial cells are abnormally proliferating and that synovial villi are growing and synovial cells are multi-layered (Daniel J.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredients, an anti-human Fas antibody having an apoptosis-inducing activity and a compound having a folate antagonism or a dihydrofolate reductase inhibitory activity.
  • the anti-human Fas antibody is a monoclonal antibody
  • the compounds having an antifolate activity or dihydrofolate reductase inhibitory activity include methotrexet, edatrexet, epiroprim, iometrexol, pyritrexime, trimetrexate, brodimoprim, MX-68, N-[4- [3- (2,4-Diamino-6,7-dihydro-5H-cyclopentapenta [d] pyrimidin-5-yl) propyl] benzoyl] -L-glutamic acid, N- [[[[3- (2,4-Diamino-6,7-dihydro-5H-cyclopentapenta [d] pyrimidin-5-yl) propyl] benzoyl] -L-glutamic acid, N- [[[[3- (2,4-Diamino-6,7-dihydro-5H-cyclopentapenta [d] pyrimidin-5-yl) propyl] benzoyl] -L-glutamic
  • apoptosis-inducing activity refers to an activity that can induce an apoptosis of a cell by binding to the Fas of a cell that expresses Fas on the cell membrane surface.
  • the anti-human Fas antibody used as the first active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be any as long as it can specifically bind to human Fas and has apoptotic induction activity.
  • an anti-human Fas antibody preferably, an anti-human Fas monoclonal antibody CHI1 and an anti-human Fas produced by mouse-mouse hybridoma HFE7A (FERMBP-58828)
  • monoclonal antibody HFE7A or a humanized antibody thereof European Patent Publication No. 0990916
  • Recombinants of these anti-human Fas monoclonal antibodies also have the same effects as these monoclonal antibodies, and are included in the anti-human Fas monoclonal antibody of the present invention.
  • the anti-Fas monoclonal antibody has been modified by genetic recombination technology so as to reduce immunogenicity in humans without impairing the binding ability to Fas or the apoptosis-inducing activity of the anti-Fas monoclonal antibody.
  • a so-called humanized antibody can also be used.
  • a compound having an antifolate action or an inhibitory action of dihydrofolate reductase refers to a pharmacologically active substance which has an activity of antagonistically inhibiting folate metabolism, which is an essential process in intracellular DNA synthesis. Refers to an acceptable compound.
  • the compounds described below can be mentioned:
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises an anti-Fas monoclonal antibody having an activity of inducing apoptosis in cells expressing Fas, and a compound having an antifolate activity or an inhibitor of dihydrofolate reductase. Can be obtained by formulating a mixture of the above as appropriate.
  • Anti-Fas monoclonal antibodies can be produced by methods well known in the art, for example, using a molecule containing the extracellular region of human Fas as an antigen.
  • a monoclonal antibody HFE7A which is one of the preferred anti-Fas monoclonal antibodies contained in the pharmaceutical composition of the present invention, is used to immunize a Fas knockout mouse with human Fas, It can be obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing spleen cells and mouse myeoma cells. Specifically, the method described below is used. In the production of monoclonal antibodies, at least the following work steps are required. That is,
  • the antigens include the extracellular domain of human Fas and the extracellular domain of mouse interleukin 3 receptor (hereinafter referred to as “IL 3R”) [Nishimura, Y. et al. (1995) J. Immunol. 154, 4395-4403]
  • Recombinant protein obtained by introducing phFas-AIC2 into monkey-derived cell line COS-1 and expressing it, and partially purifying it. (Hereinafter referred to as “recombinant human Fas”) is effective.
  • phFas—AIC2 can be produced by incorporating DNA encoding a fusion protein of human Fas and mouse IL3R into pME18S, an expression vector for animal cells.
  • the DNA, vector, host, etc., encoding Fas are not limited to these.
  • a transformant obtained by transforming COS-1 cells with phFas-AIC2 was cultured, and human Fas and mouse IL3R produced in the culture supernatant were cultured.
  • the recombinant Fas can be partially purified by performing ion-exchange chromatography using a resource Q column (trade name; manufactured by Pharmacia) on the fusion protein of the above.
  • Purified Fas present on the cell membrane of a human cell line can also be used as the antigen.
  • the primary structure of Fas is known [see Itoh, N., et al. (1991) Cell 66, 233-243], and is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by a method well known to those skilled in the art.
  • a peptide comprising an amino acid sequence can be chemically synthesized and used as an antigen.
  • the antigen obtained in the step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or Limyoioban, and the animal is immunized as an immunogen.
  • an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or Limyoioban
  • Fas knockout mice are most preferably used as experimental animals, and such mice are described in Senju, S., et al (1996) International Immunology 8, 423). Can be created.
  • the method of immunogen administration for mouse immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or several times at appropriate intervals (preferably at intervals of 1 to 5 weeks).
  • the antibody titer against the antigen in the serum of the immunized animal is measured, and the effect of the subsequent operations can be enhanced by using the animal having a sufficiently high antibody titer as a source of antibody-producing cells.
  • the antibody titers used here include radioisotope immunoassay (hereinafter referred to as "RIA”), solid-phase enzyme immunoassay (hereinafter referred to as "ELISA”), There are various known techniques such as a fluorescent antibody method and a passive hemagglutination method, but the RIA method or the ELISA method is more preferable from the viewpoints of detection sensitivity, speed, accuracy, and possibility of automation of the operation. .
  • the measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method.
  • the purified or partially purified Fas is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid phase surface on which the antigen is not adsorbed is exposed to a protein unrelated to the antigen, for example, a serum albumin (hereinafter referred to as “serum albumin”).
  • serum albumin a serum albumin
  • the sample is contacted with a serially diluted sample (eg, mouse serum) as the first antibody, and the anti-Fas antibody in the sample is bound to the antigen.
  • an antibody against a mouse antibody labeled with an enzyme is added as a second antibody to bind to the mouse antibody.
  • a substrate of the enzyme is added, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured, thereby obtaining an antibody titer. Is calculated.
  • a cell line generally obtained from a mouse for example, an 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BAL Bc) myeloma strain P3X63Ag8U.1 (P3-Ul) [Yelton, DE et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3 / NSI 1-Ag4_l (NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Imrau nology, 6, 511-519 (1976) )], Sp2 / 0-Agl4 (SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, JF et al.
  • Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any part of an individual, such as spleen, lymph node, peripheral blood, or a combination thereof as appropriate. Splenocytes are most commonly used. After the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is removed from a mouse having a predetermined antibody titer, and spleen cells as antibody-producing cells are prepared.
  • One of the most commonly used methods for spleen cells and the _ myelo obtained in the process ⁇ -fusion-fusion-hand-step- is that the cytotoxicity is relatively low. This is a method that uses polyethylene glycol, which is a small and easy fusion operation.
  • This method includes, for example, the following procedure. Wash the spleen cells and myeloma well with a serum-free medium (for example, RPMI 1640) or phosphate-buffered saline (PBS) to determine the number of spleen cells and myeloma cells. Mix so that the ratio is about 5: 1 to 10: 1, and centrifuge. Remove the supernatant, loosen the sedimented cells, and stir with a serum-free medium containing 1 ml of 50% (w / v) polyethylene glycol (molecular weight 1000-4000). Is dropped. Then, slowly add 10 ml of serum-free medium and centrifuge.
  • a serum-free medium for example, RPMI 1640
  • PBS phosphate-buffered saline
  • IL-12 normal medium
  • HATJ hypoxanthine / aminopterin 'thymidine
  • IL-12 mouse interleukin_2
  • myeoma cells are 8-azaguanine resistant strains, ie, hypoxanthine 'guanine' phosphoribosyltransferase (HG PRT) deficiency
  • HG PRT hypoxanthine 'guanine' phosphoribosyltransferase
  • the unfused myeloma cells and the fused cells of myeloma cells cannot survive in a HAT-containing medium.
  • a fused cell of antibody-producing cells or a hybridoma of an antibody-producing cell and a myeloma cell can survive, but a fused cell of antibody-producing cells has a life span.
  • the hybridomas of the antibody-producing cells and the myeloma cells survive, and as a result, the hybridomas can be selected.
  • the medium is replaced with a medium in which aminopterin has been removed from the HAT medium (hereinafter referred to as “HT medium”). Thereafter, a part of the culture supernatant is collected, and the anti-Fas antibody titer is measured, for example, by ELISA.
  • the above fusion protein when used as an antigen for ELISA, it is necessary to remove the clone so as not to select a clone that produces an antibody that specifically binds to the extracellular region of mouse IL3 receptor. It is. The presence or absence of such a clone can be confirmed, for example, by ELISA using the mouse IL3 receptor or its extracellular region as an antigen.
  • the method using an 8-azaguanine-resistant cell line has been described above, but other cell lines can also be used according to the selection method of the hybridoma, and in that case, the composition of the medium used also changes.
  • the antibody titer is measured in the same manner as described in step (b), and the hybridoma that has been found to produce a specific antibody is transferred to another plate and cloned.
  • the cloning method includes a limiting dilution method in which a plate is diluted to contain one hybridoma per well, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a micromanipulator. A method of removing and culturing individual cells, separating one cell with a cell sorter
  • the limiting dilution method is simple and often used. For a well with an antibody titer, for example, repeat the limiting dilution method 2 to 4 times, and select a stable antibody titer as an anti-Fas monoclonal antibody-producing hybridoma strain. . Furthermore, anti-Fas monoclonal antibody-producing cells are obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody that binds to mouse Fas in the same manner.
  • the mouse Fas used at this time includes, for example, a DNA expression plasmid vector pME1 which encodes a fusion protein of a mouse Fas extracellular region and a mouse IL3 receptor extracellular region. 8 S—mF as—AIC [see Nishimura, Y.
  • mouse-mouse hybridoma HF E7A which is a cell producing an anti-Fas monoclonal antibody suitable as an active ingredient to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention, is 1-3-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan. It has been deposited internationally with the Institute of Biotechnology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 20, 1999, and has the accession number FERM BP-5828. Therefore, for example, when preparing an antibody using mouse-mouse hybridoma HFE7A, the antibody can be prepared from step (g) described below, omitting steps ( ⁇ ).
  • Hybridomas that have been cloned are cultured by replacing the medium with HT medium and normal medium.
  • Large-scale cultivation is performed by rotary culture using large culture bottles or spinner culture.
  • an anti-Fas monoclonal antibody which the preventive or therapeutic agent of the present invention contains as an active ingredient can be obtained.
  • the anti-prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be used as an active ingredient.
  • Fas monoclonal antibody Ascites containing a large amount of the Fas monoclonal antibody can be obtained.
  • a commercially available monoclonal antibody purification kit for example, M Ab Drap GII kit; manufactured by Pharmacia
  • the monoclonal antibody thus obtained has high antigen specificity for human and mouse Fas.
  • the identification method includes the Ouchterlony method, the ELISA method, and the RIA method.
  • the Oktoterloni method is simple but requires concentration if the concentration of monoclonal antibody is low.
  • the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. It is possible to identify the isotype and subclass of the monoclonal antibody.
  • a commercially available identification kit eg, Mouse Typer Kit; manufactured by Bio-Rad
  • a DNA encoding a heavy or light chain of an anti-Fas monoclonal antibody suitable as an active ingredient to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention was prepared using a hybrid that produces the anti-Fas monoclonal antibody.
  • RNA can be obtained by preparing mRNA from doma cells, converting the mRNA into cDNA by reverse transcriptase, and isolating the DNA encoding the heavy chain or light chain of the antibody.
  • the guanidine-thiosineto-cesium chloride method which can employ the guanidine-thiosineto-hot-phenol method or the guanidine-thiosine-to-guanidine-hydrochloric acid method, is preferred.
  • To prepare mRNA from cells first prepare total RNA, and then use oligo (dT) cellulose from the total RNA.
  • RNA + RNA such as oligo (dT) latex beads or a method of directly purifying from a cell lysate using the carrier.
  • the method for preparing total RNA include alkaline sucrose density gradient centrifugation [see Dougherty, WG and Hiebert, E. (1980) Viology 101, 466-474], guanidine thiosinate phenol method, guanidine The thiocyanate trifluoresceinium method, the phenol.SDS method and the like can also be adopted, but the method using guanidine thiocyanate and cesium chloride [Chirgwin, JM, et al. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299] is available.
  • RNA obtained as described above as type III a single-stranded cDNA is synthesized by a reverse transcriptase reaction, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA.
  • this method include the S1 nuclease method [Efstratiadis, A., et al. (1976) Cell 7, 279-288], the Gubler-Hoffman method [Gubler, U. and Hoffman, BJ (1983) Gene 25 , 263-269], Okayama-Berg method
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the double-stranded cDNA obtained in this manner is incorporated into a cloning vector, and the obtained recombinant vector is introduced into a microorganism such as Escherichia coli and transformed, and tetracycline resistance or ampicillin resistance is used as an indicator. As a result, a transformant can be selected. Transformation of Escherichia coli is performed by the Hanahan method [see Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580], that is, by using a recombinant cell prepared in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or rubidium chloride.
  • the method can be carried out by adding the recombinant DNA vector.
  • a plasmid as a vector, it is necessary to have the above-mentioned drug resistance gene. It is also possible to use a cloning vector other than plasmid, for example, a lambda-based phage.
  • a method for selecting a strain having cDNA encoding each subject of the desired anti-human Fas antibody from the transformants obtained as described above for example, the following various methods can be adopted.
  • these operations can be omitted.
  • sense-strand and antisense-strand oligonucleotide primers corresponding to a part of the amino acid sequence are synthesized, and these are combined. Perform a polymerase chain reaction [see Saiki, RK, et al. (1988) Science 239, 487-49] to amplify a DNA fragment encoding the desired anti-human Fas antibody heavy or light chain subunit. You.
  • the type I DNA used here was synthesized by reverse transcriptase reaction from mRNA of a hybridoma (FERM BP-58828) producing anti-human Fas monoclonal antibody HFE7A. cDNA can be used.
  • the DNA fragment prepared in this manner can be directly incorporated into a plasmid vector using a commercially available kit or the like, or the fragment is labeled with 32 P, 35 S, or biotin, and this is used as a probe.
  • the desired clone can also be selected by performing colony hybridization or plaque hybridization using the clone.
  • a monoclonal antibody HFE7A suitable as an active ingredient to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is an immunoglobulin G1 (hereinafter referred to as "IgG1") molecule, and a heavy chain ( y 1 chain) and light chain ( ⁇ chain).
  • each subunit is isolated using a well-known method such as electrophoresis or column chromatography, and then an automated protein sequencer (for example, Shimadzu Corporation) is used. It is preferable to use a method such as PPSQ-10) manufactured by Seisakusho Co., Ltd. to analyze the N-terminal amino acid sequence of each subunit. From the target transformant obtained as described above, a method for collecting cDNA encoding each of the subunits of the anti-human Fas monoclonal antibody protein can be obtained by a known method LManiatis, T., et al. et al.
  • the amino acid sequence of the target protein corresponds to the amino acid sequence.
  • a nucleotide sequence estimated from the codon usage or a plurality of nucleotide sequences combining possible nucleotide sequences can be used. In the latter case, inosine is used.
  • this pro one blanking I2 P, 35 S or as labeling with such Biochin
  • nitrocellulose filters one and Haiburidizu obtained by modifying fix the DNA of transformants And the resulting positive strains are selected.
  • the determination of the sequence of the DNA obtained in this way can be carried out, for example, by the chemical modification method of Maxamuir Gilbert [see Maxam, AM and Gilbert, W. (1980) in “Methods in Enzymology” 65, 499-576]. It can be carried out by a xynucleotide chain termination method [see Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276] and the like.
  • an automatic base sequence determination system using a fluorescent dye has become widespread (for example, a sequence robot "CATALYST 800" manufactured by PerkinElmer Japan Co., Ltd. and a model 373ADNA sequencer).
  • a sequence robot "CATALYST 800" manufactured by PerkinElmer Japan Co., Ltd. and a model 373ADNA sequencer By using such a system, DNA nucleotide sequencing can be performed efficiently and safely.
  • the nucleotide sequences of the DNA of the present invention thus determined, and the N-terminal amino acid sequence data of each of the heavy and light chains
  • the amino acid sequences of the entire heavy and light chains of the monoclonal antibody of the present invention can be determined from the data.
  • the cassette mutation method [Toshimitsu Kishimoto, "Natural Chemistry Laboratory 2 Nucleic Acid III Recombinant DNA Technology” 242 -251].
  • Such various DNAs are produced by chemical synthesis of nucleic acids according to a conventional method such as the phosphite triester method [see Hunkapiller, M., et al. (1984) Nature 310, 105-111].
  • the codon for the desired amino acid is known per se and may be selected arbitrarily. For example, the codon for the desired amino acid may be determined according to a conventional method in consideration of the frequency of codon usage of the host used.
  • Partial modification of these nucleotide sequence codons can be performed by a site-directed mutagenesis method (site-specific mutagenesis) using a primer comprising a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification according to a conventional method. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666], DF, et al. (1984). Whether or not a certain DNA hybridizes with DNA encoding the heavy or light chain of an anti-Fas monoclonal antibody suitable as an active ingredient to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is determined by, for example, The DNA is used for the random primer method [Feinberg, AP and Vogelstein, B. (1983) Anal, biochem.
  • probe DNA labeled with [a-- :, P] dCTP etc. It can be determined by conducting experiments. First, the DNA to be examined is adsorbed on, for example, a nitrocellulose membrane or a Niopen membrane, and if necessary, treated with alkali modification or the like, and then solidified by heating or ultraviolet rays.
  • This membrane is treated with 6 XSSC (1 XSSC is 0.15 M sodium chloride, 0.015 M trisodium citrate solution) and 5% Denhardt's
  • 6 XSSC 1 XSSC is 0.15 M sodium chloride, 0.015 M trisodium citrate solution
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the heavy chain or light chain of an anti-Fas monoclonal antibody suitable as an active ingredient to be included in the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained from any cDNA library or genomic library.
  • DNA that hybridizes with the DNA to be isolated [see Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY.”] 0
  • the obtained DNAs By incorporating each of the obtained DNAs into an expression vector, it is possible to introduce them into prokaryotic or eukaryotic host cells, and to express each gene in those host cells. Examples of the host include Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.
  • a replicator derived from a species compatible with the host is required.
  • the host cell may be transformed with a plasmid, which contains a plasmid, such as a replication origin and a promoter sequence such as lac UV5, etc.
  • the vector imparts selectivity due to the phenotypic trait in the transformed cell.
  • Escherichia coli JM109 strain derived from E. coli K12 strain or the like is often used, and as a vector, pBR322 or a pUC-based plasmid is generally used. It is often used, but is not limited to these, and any of various known strains and vectors can be used ..
  • tryptophan (trp) promoter In Escherichia coli, tryptophan (trp) promoter, lactose (Lac) promoter, tryptophan 'lactose (tac) promoter, lipoprotein (lpp) promoter, bacteriophage-derived ram Da ( ⁇ ) PL promoter, polypeptide chain elongation factor Tu (tufB) promoter And the like, but are not limited to these.
  • the Bacillus subtilis for example, the 207-25 strain is preferable, and as the vector, pTUB228 (see Ohmura, K., et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) or the like is used. But not limited to this.
  • Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates and yeast. Examples of vertebrate cells include COS-1, a monkey-derived cell line [Gluzman, Y. (1981) Cel l 23 , 175-182].
  • yeast baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae), alcohol-assimilating yeast (Pi chia pastori s), fission yeast (Schizos saccharomyces pombe) and the like are used.
  • the cells exemplified here are generally used as host cells.
  • the force is not limited to these.
  • a vertebrate cell expression vector a vector having a promoter, an RNA splicing site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, etc. which is usually located upstream of the gene to be expressed can be used. Further, if necessary, it may have a replication origin.
  • An example of such an expression vector is p SV 2 dhfr having an early promoter of SV 40 [see Subramani, S., et al. (1981) Mol. Cell. Bio. 1, 854-864]. It can be exemplified, but not limited to this.
  • yeast expression vectors include the alcohol dehydrogenase gene promoter [see Bennetzen, J. Shi and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025] and And a promoter of a galactose metabolizing enzyme gene (eg, gal10) [see Ichikawa, K., et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1686-1690] and the like.
  • the expression vector when COS-1 is used as a host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in C ⁇ S-1, and furthermore has a transcription promoter.
  • An expression vector with a transcription termination signal, and an RNA splice site can be used.
  • the expression vector is obtained by the DEAE-dextran method [see Luthman, H. and agnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308], the calcium phosphate-DNA coprecipitation method [Graham, F. And van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457] and electroporation [Neumann, E., et al. (1982) EMBO J.
  • the desired transformed cells can be obtained.
  • co-transforming COS-1 with an expression vector comprising DNA encoding the heavy chain and an expression vector comprising DNA encoding the same light chain these DNAs are obtained.
  • the method for producing a recombinant anti-Fas antibody is not limited to the above.For example, it is possible to retain both DNAs encoding heavy and light chains and express them simultaneously.
  • a method of constructing a single expression vector and transforming COS-1 cells with the vector can also be used.
  • the desired transformant obtained above can be cultured according to a method well known to those skilled in the art, and the culture produces a recombinant anti-Fas antibody inside or outside the transformant cells.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected from various types commonly used depending on the host cell used. For example, in the case of COS-1, the RPMI 1640 medium or the Dulbecco's modified Eagle medium A medium such as (DMEM) to which serum components such as fetal calf serum (FCS) are added as necessary can be used.
  • the culture temperature at the time of culturing the transformant may be any temperature as long as it does not significantly lower the protein synthesis ability in cells, but is preferably 32 to 42 ° C, most preferably 37 to 42 ° C.
  • the fraction containing the anti-Fas antibody protein which is produced intracellularly or extracellularly in the transformant as described above, can be obtained by various known protein separation procedures using the physical properties and chemical properties of the protein. Can be separated and purified. Examples of such a method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high-speed chromatography. Various types of chromatography, such as liquid chromatography (HPLC), dialysis, and combinations thereof can be used.
  • HPLC liquid chromatography
  • a recombinant anti-Fas antibody can be easily produced with high yield and high purity.
  • the same ELISA method as in the case of evaluating the antibody titer at the time of mouse immunization is preferable. It is.
  • compounds having folate antagonism or dihydrofolate reductase inhibitory activity for example, the compounds represented by the above formulas (I) to (XIX) can be obtained according to the description in the literature referred to in the description of each compound. Can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for an autoimmune disease or rheumatoid arthritis patient as an active ingredient.
  • a prophylactic or therapeutic agent can be administered in various forms, such as tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or injections, drops, Parenteral administration by suppositories and the like can be mentioned.
  • the dose of the anti-human Fas antibody and the compound having folate antagonism or dihydrofolate reductase inhibitory activity in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the respective antibody used and the strength of the action specific to the compound.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably prepared as a solution containing 0.1 to 100 ng / m1 of CH11 or HFE7A and 0.05 to 5 nM of methotrexate. Not limited to a range.
  • the dose varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but usually 0.1 mg to 100 mg of anti-human Fas antibody is administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection at a time. can do.
  • the efficacy of the pharmaceutical composition of the present invention prepared as described above in the treatment of an autoimmune disease or rheumatoid arthritis can be measured by using cells (for example, human lymphocyte cells) in a medium supplemented with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Strain HPB— ALL see Morikawa, S., et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166-170
  • Jurkat American Type Culture No.
  • TIB-152 derived from rheumatoid arthritis patients Synovial cells, etc.
  • the survival rate is determined by MTT assay (see Green, M., et al. (1984) J. Immunological Methods 70, 257-268) and XTT described in the Examples below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be confirmed by measuring with an Atzey method or the like: abnormally proliferating in autoreactive lymphocytes, which is one of the main causes of autoimmune diseases, and in the affected area of rheumatoid arthritis.
  • Dose of anti-Fas for synovial cells Since capable of inducing apoptosis in the body, their effective in the treatment of autoimmune diseases or chronic Takashi Seki Riumachi.
  • FIG. 1 is a diagram showing a synergistic effect of an anti-human Fass monoclonal antibody CH11 and methotrexate on the induction of cell apoptosis.
  • FIG. 2 is a diagram showing a synergistic effect of the anti-Hutus Monoclonal monoclonal antibody HFE7A and methotrexate on the induction of cell apoptosis.
  • FIG. 3 is a graph showing cell viability in the presence of turaxate.
  • Example 1 Example 1
  • an anti-human Fas monoclonal antibody HFE7A or CHI1 (manufactured by Institute of Medical Biology, Inc.) described in European Patent Publication No. 0099816 was used.
  • RPM containing the human lymphocyte cell line HPB—ALL (see Morikawa, S., et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166-170) with 10% FCS (manufactured by Gibco BRL) Culture for 3 days at 37 ° C, 5% CO2 in I164 medium.
  • a represents the measured value of the test well
  • b represents the measured value of the cell-free well
  • c represents the measured value of the well containing no antibody.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention comprises an anti-human Fas antibody and a compound having folate antagonism or dihydrofolate reductase inhibitory activity which are pharmacologically acceptable in water or other water. It is ready for use as an ampoule of a sterile solution or suspension dissolved in a possible solution. Specifically, for example, 0.5 mg of anti-human Fas antibody and a final amount of 0.05 nM methotrexate are dissolved in 1 liter of water for injection, and aseptically. Dispense into ampules and seal.
  • a sterile powder preparation (preferably freeze-dried anti-human Fas antibody and a compound having folate antagonism or dihydrofolate reductase inhibitory action) is filled in an ampoule, and pharmacology is used at the time of use. It may be diluted with an acceptable solution.
  • the present invention provides a novel pharmaceutical composition useful as an agent for preventing or treating autoimmune diseases and rheumatoid arthritis.
  • the amount of the anti-Fas antibody used can be reduced by using a compound having a folate-antagonizing action or a dihydrofolate reductase-inhibiting action in combination with the anti-Fast-Fas antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for an excellent autoimmune disease or chronic disease capable of withstanding long-term administration. It is useful as an agent for preventing or treating rheumatoid arthritis.

Description

明 細 書
抗 F a s抗体を含有する医薬組成物
[技術分野]
本発明は、 自己免疫疾患または慢性関節リゥマチの予防または治療に有効な新 規医薬組成物に関する。
[背景技術]
生体内において、 正常な細胞交代のために生じる生理的な細胞死はアポ卜ーシ スと呼ばれ、 病理的な細胞死である壊死 （ネクローシス） とは区別されている （ Kerr, et al. ( 1972) Br. J. Cancer 26, 239 参照） 。 いわゆるプログラム細胞 死は、 生体内において予め死滅するべくプログラム化されている、 ある種の細胞 にみられる細胞死であるが、 アポトーシスもそのひとつである。 アポト一シスに おいては細胞表面の湾曲、 核クロマチンの凝縮、 染色体 D N Aの断片化等の現象 が特徵的に観察される。 アポトーシスは、 リンパ球 （T細胞および B細胞） の分化において、 自己抗原 を認識する細胞を排除する役割を果たしている。 いわゆる自己免疫疾患の発症は、 リンパ球分化におけるアポトーシスの不全によって自己反応性リンパ球が生じる ことによるものと考えられている （中山敬一ら （1995) Mebio 12 (10) , 79- 86参 照） 。 このようなアポト一シスに関与する分子としては F a s [Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 1747-1756 参照] をはじめとして、 腫瘍壊死因子 受谷体 i> 1 umor Necrosi s Factor Receptor; [Loetscher, H. et al. (1990) Cel 1 61, 351-359 参照] 、 C D 4 0 [Tsubata, T. et al. (1993) Nature 364, 64 5-648 参照] ゃパ一フォリン/グランザィム A [Jenne, D. E. et al. (1988) I 隱 unol. Rev. 103, 53-71 参照] など種々の分子が同定されてきた。 F a sは細 胞表面に存在する膜貫通型タンパク質で、 F a s リガンドと呼ばれるタンパク質 がその細胞外領域に結合するとその細胞にアポトーシスを誘導する。 抗 F a sモノクローナル抗体の中には、 F a s リガンド同様に細胞のアポトー シスを誘導する細胞障害活性を有するものが存在することから、 自己免疫疾患、 エイズおよび腫瘍の治療剤となり得ると報告されている （特開平 2— 2 3 7 9 3 5号および特表平 5 - 5 0 3 2 8 1号参照） 。
—方リウマチ、 特に慢性関節リ ウマチは、 內的および外的要因によって引き起 こされる種々の免疫学的異常を伴う、 滑膜細胞の増殖を基礎病変とする疾患であ り、 炎症性細胞浸潤および骨の侵食を伴う滑膜細胞の増殖障害と考えられている。 慢性関節リゥマチにおける罹患関節を中心とする組織破壊は、 炎症性滑膜細胞か らのサイ トカインの産生異常がその成因であると考えられている。 リウマチ患者 の関節の状態を調べると、 滑膜細胞が異常に増殖しており、 滑膜絨毛の増生や滑 膜細胞の多層化などが観察される （Daniel J. McCarty (1985) in "Arthriti s a nd all ied conditions, A textbook of rheumatology" 10th Edi tion, Lea & Fe biger 参照） 。 現在実施されているリウマチの薬物療法には、 専らステロイ ド等 の抗炎症剤または免疫調節剤等が用いられているが、 こう した滑膜細胞の異常増 殖を薬物で抑制することができれば、 その薬物はリゥマチ治療剤として有用であ ると考えられる。 ところで、 リゥマチにおける滑膜細胞の増殖は無制限に生じるものではなく、 自発抑制することが知られている （Dani el J. McCarty (1985) in "Arthritis a nd al l ied conditions, A textbook of rheumatology" 10th Edition, Lea & Fe biger 参照） 。 さらに最近、 リウマチ患者の滑膜細胞にアポト一シスが起こるこ と、 滑膜細胞膜上に F a s抗原が発現していることが明らかとなった。 中島ら （ Nakaj ima, T. , et al. (1995) Arthri ti s Rheum. 38, 485- 491参照） および青野 ら （第 3 8回日本リ ウマチ学会抄録集（1994) 487頁および平成 6年日本癌学会総 会記事（1994) 338頁参照） は、 細胞障害活性を有する抗ヒ ト F a s抗体をリ ウマ チ患者由来の異常増殖した滑膜細胞に加えることにより、 滑膜細胞にアポトーシ スが誘導されるか否かについて検討した結果、 リ ゥマチ患者の異常増殖した滑膜 細胞はリ ゥマチ患者以外の滑膜細胞と比較してアポト一シスが起こる割合が高い ことを見いだしている。 従って、 抗ヒ ト F a s抗体は、 リンパ球のみならず、 異 常増殖している滑膜細胞も選択的にアポトーシスへと導くことができ、 リゥマチ 治療剤として有用であると考えられる。 抗ヒ ト F a sマウスモノクローナル抗体は既に数種得られており （Yonehara, S. , et al (1989) J. Exp. Med. 169, 1747-1756, (1989) ； SCIENCE, 245, 301 - 305, ( 1989) などを参照） 、 また、 前記のように、 該抗体がリウマチ患者の滑 膜細胞にイン · ビトロでアポト一シスを誘導することも報告されている （第 3 8 回日本リゥマチ学会抄録集（1994) 487頁および平成 6年日本癌学会総会記事（199 4) 338頁参照） 。 さらに、 自己免疫疾患モデル動物やリ ウマチ性関節炎モデル動 物でその治療効果および安全性が示された抗 F a s抗体も見出されている （欧州 特許公開 0 9 0 9 8 1 6号公報参照） 。 一方、 腫瘍壊死因子 a ( T N F α ) に対するモノクローナル抗体 c A 2とメ ト トレキセ一トの併用により慢性関節リ ゥマチ患者に対する治療効果が上昇するこ とが知られている （カルデン、 第 7回国際リウマチシンポジウム（1998) 抄録 12 —13頁） 力 抗 F a s抗体とメ ト トレキセ一ト等の相乗作用については全く知ら れていない。 自己免疫疾患や慢性関節リゥマチの予防または治療剤として有用な抗 F a s抗 体の効果を増強させるような化合物があれば、 該化合物と抗 F a s抗体とを併用 することにより、 抗 F a s抗体の使用量を抑えることができる。 これにより、 患 者体内において該抗 F a s抗体に対する抗体の発現等による耐性が表れる可能性 を低減できるため、 そのような抗 F a s抗体の効果を増強させるような化合物と 抗 F a s抗体とを組み合わせた、 長期間の投与に堪える優れた予防または治療剤 の開発が望まれていた。
[発明の開示] 本発明は、 アポトーシス誘導活性を有する抗ヒ ト F a s抗体および葉酸拮抗作 用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物を有効成分として含有す る医薬組成物に関する。 好ましくは、 該抗ヒ ト F a s抗体がモノクローナル抗体
CH 1 1、 マウス一マウスハイブリ ドーマ HF E 7 A (F E RM B P— 5 82
8) が産生する抗ヒ ト F a sモノクローナル抗体 HF E 7 Aまたはそれらのヒ ト 化抗体であることを特徴とするものである。 また、 上記葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物は、 メ ト トレキセ一ト、 エダトレキセ 一卜、 ェピロプリム、 ィオメ トレキソ一ル、 ピリ トレキシム、 トリメ トレキセー ト、 ブロジモプリム、 MX— 6 8、 N - [4-[3- (2， 4-ジァミノ- 6， 7 -ジヒ ドロ- 5H-シ ク口ペンタ [d]ピリ ミジン- 5-ィル）プロピル]ベンゾィル]- L-グルタミン酸、 N - [[
5- [2 -（2 -ァミノ- 1,4, 5, 6， 7, 8 -へキサヒ ドロ- 4 -ォキソピリ ド [2, 3 - d]ピリ ミジン-
6-ィノレ）ェチル -2 -チェ二ノレ]カルボ二ル]- L -グルタミン酸、 （R)-N- [[5 - [2- (2 -ァ ミノ- 1,4, 5, 6, 7,8-へキサヒ ドロ- 4-ォキソピリ ド [2, 3 - d]ピリ ミジン- 6 -ィル）ェ チル- 2-チェニル]カルボニル] -し-ダルタミン酸、 N- ((2, 4-ジアミノ -3, 4, 5, 6, 7,8 -へキサヒ ドロピリ ド [2,3 - d]ピリ ミジン- 6 -ィノレ）ェチル） - 2 -チェニルカルボニル - L-グルタミン酸、 （S)- 2- [[[4-カルボキシ- 4- [[4- [[(2, 4-ジアミノ- 6_プテリジ ニル）メチル]アミノ]ベンゾィル]ァミノ]ブチル]アミノ]カルボニル]ベンゾィル 酸、 N- [4- [3- (2, 4-ジアミノ- 1H-ピロ口 [2, 3- d]ピリ ミジン- 5-ィル）プロピル]ベ ンゾィル]- L-グノレタミン酸、 2, 4-ジァミノ- 6- (N-(4- (フエニルスルホニノレ）ベン ジル）メチルァミノ）キナゾリン、 2， 4-ジァミノ- 5 - [4 - [3_(4 -ァミノフエニル -4- スルホニルフエニルァミノ）プロポキシ ]-3， 5-ジメ トキシベンジル]ピリ ミジン、 N- [4- [4- (2， 4-ジアミノ- 5 -ピリ ミジニノレ）ブチル]ベンゾィル] -L-グルタミン酸、 N- [4- [3- (2， 4-ジァミノ- 5-ピリ ミジニル）プロピル]ベンゾィル]- L -グルタミン酸、 N-[4-[2-(2, 4-ジァミノ- 6-プテリジニル）ェチル]ベンゾィル ]-4-メチレン - DL-グ ノレタミン酸および N -（1 -メチルェチル） - N' [3 -（2, 4, 5-トリク口口フヱノキシ）プロ ポキシ]イミ ドジカルポ二ミジックジアミ ドヒ ドロクロリ ド （ P S 1 5) からな る群より選択されるものであることが好ましく、 中でもメ ト トレキセ一卜が最も 好ましい。 本発明者らは、 アポ卜一シスを誘導活性を有する抗 F a sモノクローナル抗体 の効果が、 葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物を 共存させることにより上昇することを見出し、 本発明を完成させた。 本発明において、 「アポト一シス誘導活性」 とは、 細胞膜表面に F a sを発現 している細胞に対し、 その F a sに結合することによってその細胞のアポト一シ スを導くことができる活性をいう。 本発明の医薬組成物の第一の有効成分として用いられる抗ヒ ト F a s抗体は、 ヒ ト F a sに特異的に結合でき、 かつアポト一シス誘導活性を有するようなもの であればよい。 そのような抗ヒ ト F a s抗体と して、 好ましくは抗ヒ ト F a sモ ノクローナル抗体 CH I 1およびマウス一マウスハイブリ ドーマ HFE 7A (F E RM B P— 5 8 28) が産生する抗ヒ ト F a sモノク口一ナル抗体 HF E 7 Aもしくはそれらのヒ ト化抗体 （欧州特許公開 0909 8 1 6号公報） を挙げる ことができるが、 本発明はこれらに限定されない。 なお、 これら抗ヒ ト F a sモ ノクロ一ナル抗体の遺伝子組換え体も、 これらモノクローナル抗体と同等の効果 を奏するものであり、 本発明の抗ヒ ト F a sモノクローナル抗体に包含される。 また本発明においては、 遺伝子組換え技術により、 上記抗 F a sモノクローナル 抗体の F a sに対する結合能やアポトーシス誘導活性を損なわずに、 ヒ 卜に対す る免疫原性を低減するように改変された、 いわゆるヒ ト化抗体を用いることもで きる。 本発明において 「葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する 化合物」 とは、 細胞内の DN A合成において必須の過程である葉酸の代謝を拮抗 的に阻害する活性を有する、 薬理的に許容可能な化合物をいう。 好適には、 以下 に記載する化合物を挙げることができる ：
メ ト トレキセ一卜 （下記式 （ I ) )
Figure imgf000008_0001
エダトレキセート （英国特許公報 GB 2 058 7 70 B参照、 下記式 （ I I ) )
Figure imgf000008_0002
ェピロプリム （国際特許出願 WO 9 2 846 1号公報参照、 下記式 （ I I I )
Figure imgf000008_0003
ィオメ トレキソ一ル （国際特許出願 WO 8 6 5 1 8 1号公報参照、 下記式 （ I V) )
Figure imgf000009_0001
ピリ トレキシム （欧州特許 2 1 2 9 2号公報参照、 下記式 （V) )
Figure imgf000009_0002
トリメ トレキセ一ト （英国特許公報 G B 1 34 5 502参照、 下記式 （V I )
Figure imgf000009_0003
プロジモプリム （英国特許公報 GB 1 44 9 3 8 7参照、 下記式 （V I I ) )
Figure imgf000010_0001
MX- 6 8 (国際特許出願 WO 9 7/34 6 06号公報参照、 下記式 （V I I I
) )
Figure imgf000010_0002
N- [4 - [3 -（2， 4 -ジァミノ- 6， 7 -ジヒ ドロ- 5H-シクロペンタ [d]ピリ ミジン- 5-ィル） プロピル]ベンゾィル] -L-グルタミン酸 （J, Med. Chem. (1994) 37, 1616-1624、 下記式 （ I X) )
Figure imgf000011_0001
N - [[5- [2 -（2-ァミノ- 1,4, 5， 6， 7， 8 -へキサヒ ドロ- 4 -ォキソピリ ド [2,3 - d]ピリミ ジン- 6-ィノレ）ェチル -2-チェニル]カルボニル] - L -グルタミン酸 （欧州特許 343 801号公報参照、 下記式 （X) )
Figure imgf000011_0002
N- ((2, 4 -ジァミノ- 3， 4, 5, 6, 7, 8 -へキサヒ ドロピリ ド [2,3 - d]ピリ ミジン- 6-ィル） ェチル）-2-チェニルカルボニル -し-グルタミン酸 （米国癌研究学会第 88回年会（ 1997)抄録番号 660参照、 下記式 （X I ) )
Figure imgf000011_0003
(XI) (S) -2- [ [ [4 -力ルボキシ- 4 - [ [4- [[ (2, 4-ジァミノ- 6-プテリジニル）メチル]ァミノ ]ベンゾィル]アミノ]ブチル]アミ ノ]カルボ二ノレ]ベンゾィル酸 （欧州特許 345 308号公報参照、 下記式 （X I I ) )
Figure imgf000012_0001
N- [4- [3- (2, 4-ジァミノ- 1H-ピロ口 [2， 3-d]ピリ ミジン- 5-ィル）プロピル]ベンゾ ィル] -いグルタミン酸 （欧州特許 3 34 6 36号公報参照、 下記式 （X I I I ) )
Figure imgf000012_0002
2， 4 -ジァミノ- 6 -（N- (4 -（フエニルスルホニル）ベンジル）メチルァミノ）キナゾリ ン （米国癌研究学会年会（1992)抄録番号 2458参照、 下記式 （X I V) )
Figure imgf000013_0001
2, 4-ジァミノ- 5 - [4 - [3-（4 -ァミノフエ二ル- 4 -スルホ二ノレフエニルァミノ）プロボ キシ] -3, 5-ジメ 卜キシベンジル]ピリ ミジン （欧州特許 2 3 1 88 8号公報参照、 下記式 （XV) )
Figure imgf000013_0002
Ν- [4- [4- (2,4-ジァミノ- 5-ピリ ミジニル）ブチル]ベンゾィル] -L-グルタミン酸 （ 国際特許出願 WO 9 5/9 84 5号公報参照、 下記式 （XV I ) )
Figure imgf000013_0003
Ν-[4-[3-(2, 4-ジァミノ- 5-ピリ ミジニル）プロピル]ベンゾィル]- L-グルタミン酸 (下記式 （国際特許出願 WO 9 5/ 9 84 5号公報参照、 XV I I )
Figure imgf000014_0001
Ν- [4 - [2-(2, 4-ジァミノ- 6 -プテリジニル）ェチル]ベンゾィル] - 4 -メチレン - Dぃグ ルタミン酸 （国際特許出願 WO 9 1 / 1 06 6 6号公報参照、 下記式 （XV I I I ) )
Figure imgf000014_0002
および
Ν- (1 -メチルェチル） - Ν' [3 -（2， 4， 5-トリクロロフエノキシ）プロポキシ]ィミ ドジ カルボニミジックジアミ ドヒ ドロクロリ ド （P S 1 5) (国際特許出願 W〇 93 / 1 603 7号公報参照、 下記式 （X I X) )
Figure imgf000015_0001
これらの化合物はいずれも、 葉酸拮抗作用乃至はジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作 用を有することが知られている。 上記化合物群のうち、 本発明の医薬組成物に含 有せしめる化合物と して最適なものはメ ト トレキセ一トである。 本発明の医薬組成物は、 F a sを発現している細胞にアポト一シスを誘導する 活性を有するような抗 F a sモノクローナル抗体と、 葉酸拮抗作用またはジヒ ド 口葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物とを適宜混合したものを製剤化すること によって得ることができる。 抗 F a sモノクローナル抗体は、 例えば抗原としてヒ ト F a sの細胞外領域を 含む分子を使用して、 当該技術分野において周知の方法により作製することがで きる。 例えば、 本発明の医薬組成物に含有される抗 F a sモノクローナル抗体と して好適なものの一つであるモノクローナル抗体 H F E 7 Aは、 F a sノックァ ゥトマウスをヒ ト F a sで免疫し、 該マウスの脾臓細胞とマウスミエ口一マ細胞 を融合することにより得られるハイプリ ドーマを培養することにより得ることが できる。 具体的には、 以下に記載の方法に従う。 モノクローナル抗体の製造にあたっては、 少なく とも下記のような作業工程が 必要である。 すなわち、
(a) 抗原と して使用する生体高分子の精製、
(b) 抗原を動物に注射することにより免疫した後、 血液を採取しその抗体価を 検定して脾臓摘出の時期を決定してから、 抗体産生細胞を調製する工程、
(c) 骨髄腫細胞 （以下 「ミエ口一マ」 という） の調製、
(d) 抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e) 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマ群の選別、
( f ) 単一細胞クローンへの分割 （クロ一ニング） 、
(g) 場合によっては、 モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリ ド 一マの培養、 またはハイブリ ド一マを移植した動物の飼育、
(h) このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、 およびその認 識特異性の検討、 あるいは標識試薬としての特性の検定、
等である。 以下、 抗 F a sモノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、 該抗体の作製法はこれに制限されず、 例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミ エローマを使用することもできる。
(a) 抗原の精製
抗原としては、 ヒ ト F a sの細胞外領域とマウスインタ一ロイキン 3受容体 （ 以下 「 I L 3 R」 という） の細胞外領域 [Nishimura, Y. et al. (1995) J. I mm unol. 154， 4395-4403参照] との融合タンパク質の発現べクタ一 p h F a s— A I C 2をサル由来細胞株 CO S— 1に導入し発現させ、 部分精製することによつ て得られる組換えタンパク質 （以下 「組換えヒ ト F a s」 とレ、う） が有効である。 p h F a s— A I C 2は、 ヒ ト F a s とマウス I L 3 Rの融合タンパク質をコ一 ドする DNAを、 動物細胞用発現べクタ一 p ME 1 8 Sに組み込むことにより作 製できる。 ただし、 F a sをコードする DNA、 ベクタ一、 宿主等はこれらに限 定されない。 具体的には、 p h F a s -A I C 2で CO S— 1細胞を形質転換して得られた 形質転換株を培養し、 その培養上清中に産生されるヒ ト F a s とマウス I L 3 R の融合タンパク質を、 リ ソース Qカラム （商標名 ； フアルマシア社製） を用いた イオン交換クロマトグラフィ一を実施することにより、 組換え F a sを部分精製 することができる。 また、 ヒ ト細胞株の細胞膜上に存在する F a sそのものを精製したものも抗原 として使用することができる。 さらに、 F a sの一次構造は公知である [ Itoh, N. , et al. (1991) Cell 66, 233-243 参照] ので、 当業者に周知の方法により、 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を含むことからなるぺプチドを化学 合成し、 これを抗原として使用することもできる。
(b) 抗体産生細胞の調製
工程 （a) で得られた抗原と、 フロイン ドの完全または不完全アジュバント、 または力リ ミ ヨゥバンのような助剤とを混合し、 免疫原として実験動物に免疫す る。 実験動物としては、 F a sノックァゥ トマウスが最も好適に用いられるが、 そのようなマウスは千住らの文献 [Senju, S. , et al (1996) International Im munology 8， 423 参照] に記载する方法により作出することができる。 マウス免疫の際の免疫原投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈內注射、 皮内 注射、 筋肉内注射いずれでもよいが、 皮下注射または腹腔内注射が好ましい。 免疫は、 一回、 または、 適当な間隔で （好ましくは 1週間から 5週間間隔で） 複数回繰返し行なうことができる。 その後、 免疫した動物の血清中の抗原に対す る抗体価を測定し、 抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として 用いれば、 以後の操作の効果を高めることができる。 一般的には、 最終免疫後 3 〜 5日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。 ここで用いられる抗体価の測定法と しては、 放射性同位元素免疫定量法 （以下 「R I A法」 という） 、 固相酵素免疫定量法 （以下 「E L I SA法」 という） 、 蛍光抗体法、 受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、 検出感度、 迅速性、 正確性、 および操作の自動化の可能性などの観点から、 R I A法または E L I S A法がより好適である。 本発明における抗体価の測定は、 例えば E L I S A法によれば、 以下に記載す るような手順により行うことができる。 まず、 精製または部分精製した F a sを E L I S A用 96穴プレー卜等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着してい ない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、 例えばゥシ血清アルブミン （以下 「 B SA」 とレ、う） により覆い、 該表面を洗浄後、 第一抗体として段階希釈した試 料 （例えばマウス血清） に接触させ、 上記抗原に試料中の抗 F a s抗体を結合さ せる。 さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマ ウス抗体に結合させ、 洗浄後該酵素の基質を加え、 基質分解に基づく発色による 吸光度の変化等を測定することにより、 抗体価を算出する。
(c) ミエ口一マの調製工程
ミエローマとしては、 一般的にはマウスから得られた株化細胞、 例えば 8—ァ ザグァニン耐性マウス （BAL B c由来） ミエ口一マ株 P3X63Ag8U.1(P3- Ul) [ Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81， 1 -7(1978)] 、 P3/NSI ノ1- Ag4_l (NS- 1) [Kohler, G. et al. European J. Imrau nology, 6， 511-519 (1976) ] 、 Sp2 /0- Agl4 (SP-2) [Shulman, M. et al. N ature, 276, 269-270 (1978)] 、 P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. F. et al.
J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)] 、 P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. an d Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)] などを用いることが好ましい。 これらの細胞株は、 適当な培地、 例えば 8—ァザグァニン培地 [RPM I— 1 6 40培地にグルタミン、 2—メルカプトエタノール、 ゲンタマイシン、 およびゥ シ胎児血清 （以下 「FC S」 という） を加えた培地に 8—ァザグァニンを加えた 培地] 、 イスコフ改変ダルベッコ培地 (Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium ；以下 「 I MDM」 とレ、う） 、 またはダルベッコ改変イーグル培地 （Dulbecco' s Modified Eagle Medium； 以下 「DMEM」 とレ、う） で継代培養するが、 細胞融 合の 3〜4 日前に正常培地 [例えば、 1 0% F C Sを含む A S F 1 04培地 （ 1フ 味の素 （株） 社製） ] で継代培養し、 融合当日に 2 X I 07以上の細胞数を確保 しておく。
( d ) 細胞融合
抗体産生細胞は、 形質細胞、 およびその前駆細胞であるリンパ球であり、 これ は個体のいずれの部位から得てもよく、 一般には脾、 リンパ節、 末梢血、 または これらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、 脾細胞が最も一般的 に用いられる。 最終免疫後、 所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、 例えば脾臓を摘出し、 抗体産生細胞である脾細胞を調製する。 この脾細胞と工程 丄?上で得 れた _ミェロー -を-融合さ-せ-る-手-段上—して現在最も 般^に行ねれて- いるのは、 細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを 用いる方法である。 この方法は、 例えば以下の手順よりなる。 脾細胞とミエローマとを無血清培地 （例えば R PM I 1 6 4 0) 、 またはリン 酸緩衝生理食塩液 （以下 「P B S」 とレ、う） でよく洗浄し、 脾細胞とミエローマ の細胞数の比が 5 ： 1〜 1 0 ： 1程度になるように混合し、 遠心分離する。 上清 を除去し、 沈澱した細胞群をよくほぐした後、 撹拌しながら 1 m 1 の 5 0% (w /v) ポリエチレングリコール （分子量 1 0 0 0〜 4 0 0 0) を含む無血清培地 を滴下する。 その後、 1 0 m lの無血清培地をゆつく りと加えた後遠心分離する。 再び上清を捨て、 沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン ·アミノプテリン 'チミ ジン （以下 「HATJ という） 液およびマウスインタ一ロイキン _ 2 (以下 「 I L一 2」 という） を含む正常培地 （以下 「HAT培地」 という） 中に懸濁して培 養用プレート （以下 「プレート」 という） の各ゥエルに分注し、 5 % 炭酸ガス 存在下、 3 7 °Cで 2週間程度培養する。 途中適宜 HAT培地を補う。
( e ) ハイブリ ドーマ群の選択
上記ミエ口一マ細胞が、 8—ァザグァニン耐性株である場合、 すなわち、 ヒポ キサンチン ' グァニン ' ホスホリボシルトランスフェラーゼ （HG P R T) 欠損 株である場合、 融合しなかった該ミエロ一マ細胞、 およびミエローマ細胞どうし の融合細胞は、 H A T含有培地中では生存できない。 一方、 抗体産生細胞どうし の融合細胞、 あるいは、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリ ドーマは生 存することができるが、 抗体産生細胞どう しの融合細胞には寿命がある。 従って、 H A T含有培地中での培養を続けることによって、 抗体産生細胞とミエローマ細 胞とのハイプリ ドーマのみが生き残り、 結果的にハイプリ ドーマを選択すること ができる。 コロニー状に生育してきたハイブリ ド一マについて、 H A T培地からアミノプ テリンを除いた培地 （以下 「H T培地」 という） への培地交換を行う。 以後、 培 養上清の一部を採取し、 例えば、 E L I S A法により抗 F a s抗体価を測定する。 ただし、 E L I S A用の抗原として上記融合タンパク質を用いる場合は、 マウス I L 3受容体の細胞外領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択し ないように、 該クローンを除外する操作が必要である。 そのようなクローンの有 無は、 例えばマウス I L 3受容体またはその細胞外領域を抗原とした E L I S A 等により確認することができる。 以上、 8—ァザグァニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、 その他の細 胞株もハイプリ ドーマの選択方法に応じて使用することができ、 その場合使用す る培地組成も変化する。
( f ) クロ一ニング
工程 （b ) の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、 特異的抗体を 産生することが判明したハイプリ ドーマを、 別のプレートに移しクローニングを 行う。 このクローニング法としては、 プレートの 1 ゥエルに 1個のハイプリ ドー マが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、 軟寒天培地中で培養しコロニ 一を回収する軟寒天法、 マイクロマニュピレーターによって 1個づつの細胞を取 り出し培養する方法、 セルソ一ターによって 1個の細胞を分離する 「ソ一タク口
—ン」 などが挙げられるが、 限界希釈法が簡便でありよく用いられる。 抗体価の認められたゥエルについて、 例えば限界希釈法によるクロ一ニングを 2〜4回繰返し、 安定して抗体価の認められたものを抗 F a sモノクローナル抗 体産生ハイプリ ドーマ株と して選択する。 さらに、 マウス F a sに結合する抗体 を産生するハイプリ ドーマを同様の方法で選択することにより、 抗 F a sモノク ローナル抗体産生細胞を得る。 このとき使用されるマウス F a sとしては、 例え ばマウス F a sの細胞外領域とマウス I L 3受容体の細胞外領域との融合タンパ ク質をコ一ドする DN Aの発現プラスミ ドベクタ一 pME 1 8 S— mF a s— A I C [Nishimura, Y. et al. (1995) J. Immunol. 154, 4395- 4403参照] を培 養動物細胞に導入して発現させた融合タンパク質や、 精製マウス F a s、 または マウス F a sを細胞表面に発現している細胞を使用できる。 なお、 本発明の医薬組成物に含有せしめる有効成分として好適な抗 F a sモノ クローナル抗体の産生細胞であるマウス一マウスハイブリ ドーマ HF E 7 Aは日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の工業技術院生命工学工業研究所に 1 99 7年 2月 20日付けで国際寄託され、 受託番号 FERM B P— 5828が付さ れている。 したがって、 例えばマウス一マウスハイプリ ドーマ HFE 7Aを用い て抗体を調製する場合は、 工程 （ί) までを省略して、 以下に記载する工程 （g ) から抗体の調製を行うことができる。
(g) ハイブリ ドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クロ一ニングを完了したハイプリ ドーマは、 培地を HT培地から正常培地に換 えて培養される。 大量培養は、 大型培養瓶を用いた回転培養、 あるいはスピナ一 培養で行われる。 この大量培養における上清を、 ゲル濾過等、 当業者に周知の方 法を用いて精製することにより、 本発明の予防または治療剤が有効成分として含 有する抗 F a sモノクローナル抗体を得ることができる。 また、 同系統のマウス (例えば、 上記の BALBZc) 、 あるいは N u/N uマウスの腹腔内で該ハイ プリ ドーマを増殖させることにより、 本発明の予防または治療剤が有効成分とし て含有する抗 F a sモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。 精製の簡便な方法と しては、 市販のモノクローナル抗体精製キッ ト （例えば、 M Ab丁 r a p G IIキッ ト ； フアルマシア社製） 等を利用することもできる。 かく して得られるモノクローナル抗体は、 ヒ トおよびマウスの F a sに対して 高い抗原特異性を有する。
( h ) モノクローナル抗体の検定
かく して得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定 は以下のように行うことができる。 まず、 同定法としてはォクテルロニー （Ouch terlony ) 法、 E L I S A法、 または R I A法が挙げられる。 ォクテルロニ一法 は簡便ではあるが、 モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要で ある。 一方、 E L I SA法または R I A法を用いた場合は、 培養上清をそのまま 抗原吸着固相と反応させ、 さらに第二次抗体として各種ィムノグロブリンアイソ タイプ、 サブクラスに対応する抗体を用いることにより、 モノクローナル抗体の アイソタイプ、 サブクラスを同定することが可能である。 また、 さらに簡便な方 法として、 市販の同定用のキッ ト （例えば、 マウスタイパーキッ ト ；バイオラッ ド社製） 等を利用することもできる。 さらに、 タンパク質の定量は、 フォーリンロウリー法、 および 280 nmにお ける吸光度 [1. 4 (OD 280) =ィムノグロブリン 1 mgZm 1 ] より算出 する方法により行うことができる。 次に、 本発明の医薬組成物に含有せしめる有効成分として好適な抗 F a sモノ クロ一ナル抗体の重鎖または軽鎖をコードする DN Aは、 上記抗 F a sモノクロ —ナル抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞より mRNAを調製し、 該 mRNAを 逆転写酵素で c DN Aに変換してから、 該抗体の重鎖または軽鎖をコードする D N Aをそれぞれ単離することにより得られる。 mRNAの抽出にあたっては、 グァニジン ·チオシァネ一卜 ·ホッ ト · フエノ —ル法、 グァニジン ·チオシァネ一トーグァニジン ·塩酸法なども採用しうる力 グァニジン ·チオシァネ一ト .塩化セシウム法が好適である。 細胞からの mRN Aの調製は、 まず全 RNAを調製し、 該全 RNAからオリゴ （d T) セルロース やオリゴ （d T) ラテックスビーズ等のポリ （A) +RN A精製用担体を用いて 精製する方法、 または細胞ライセー卜から該担体を用いて直接精製する方法によ り実施できる。 全 RNAの調製方法と しては、 アルカリショ糖密度勾配遠心分離 法 [Dougherty, W. G. and Hiebert, E. (1980) Viology 101, 466- 474参照] 、 グァニジンチオシァネート . フヱノール法、 グァニジンチオシァネ一ト · トリフ ルォロセシウム法、 フエノール . S D S法等も採用し得るが、 グァニジンチオシ ァネートおよび塩化セシウムを用いる方法 [Chirgwin, J. M. , et al. (1979) B iochemistry 18， 5294- 5299参照] が好適である。 上記のごとく して得られたポリ （A) RNAを铸型として、 逆転写酵素反応 により一本鎖 c DN Aを合成した後、 この一本鎖 c DN Aから二本鎖 c DN Aを 合成することができる。 この方法としては S 1ヌクレア一ゼ法 [Efstratiadis, A. , et al. (1976) Cell 7， 279-288 参照] 、 グブラ——ホフマン法 [Gubler, U. and Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照] 、 ォカャマ—バーグ法
[Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 参照] 等を 採用し得るが、 本発明においては、 一本鎖 c DN Aを踌型と してポリメラーゼ連 鎖反応 （以下 「P CR」 とレ、う） [Saiki, R. K. , et al. (1988) Science 239,
487-49 参照] を行なう、 いわゆる RT— PCR法が好適である。 このようにして得られた二本鎖 c DN Aをクローニングベクタ一に組み込み、 得られた組換えべクタ一を大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、 テトラサ イクリン耐性あるいはアンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択するこ とができる。 大腸菌の形質転換は、 ハナハン法 [Hanahan, D. (1983) J. Mol. B iol. 166, 557-580 参照] 、 すなわち塩化カルシウムや塩化マグネシウムまたは 塩化ルビジゥムを共存させて調製したコンビテン ト細胞に、 該組換え D N Aべク ターを加える方法により実施することができる。 なお、 ベクタ一としてブラスミ ドを用いる場合は、 上記の薬剤耐性遺伝子を有することが必要である。 また、 プ ラスミ ド以外のクローニングべクタ一、 例えばラムダ系のファ一ジ等を用いるこ とも可能である。 上記により得られた形質転換株から、 目的の抗ヒ ト F a s抗体の各サブュニッ トをコードする c DN Aを有する株を選択する方法としては、 例えば以下に示す 各種方法を採用できる。 なお、 上記 RT— PCR法により目的の c DNAを特異 的に増幅した場合は、 これらの操作を省略することが可能である。
( 1 ) ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法
目的タンパク質のァミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、 該ァ ミノ酸配列の一部に対応するセンスス トランドとアンチセンスス トランドのオリ ゴヌクレオチドプライマ一を合成し、 これらを組合せてポリメラ一ゼ連鎖反応 [ Saiki, R. K. , et al. (1988) Science 239, 487-49 参照] を行ない、 目的の抗 ヒ ト F a s抗体重鎖あるいは軽鎖サブユニッ トをコードする DNA断片を増幅す る。 ここで用いる铸型 DN Aとしては、 例えば抗ヒ ト F a sモノクローナル抗体 HF E 7 Aを産生するハイブリ ド一マ （F ERM B P— 5 8 2 8) の mRNA より逆転写酵素反応にて合成した c DNAを用いることができる。 このようにして調製した DNA断片は、 市販のキッ ト等を利用して直接プラス ミ ドベクターに組み込むこともできるし、 該断片を32 P、 35Sあるいはピオチン 等で標識し、 これをプローブと して用いてコロニ一ハイブリダィゼーションまた はプラークハイブリダィゼ一ションを行なうことにより 目的のクローンを選択す ることもできる。 例えば、 本発明の医薬組成物に含有せしめる有効成分として好適なモノクロ一 ナル抗体 HF E 7 Aは、 ィムノグロブリン G 1 (以下 「 I gG 1」 とレ、う） 分子 であり、 重鎖 （y 1鎖） 、 軽鎖 （κ鎖） の各サブュニッ 卜からなる複合体である。 これらの各サブュニッ 卜の部分アミノ酸配列を調べる方法と しては、 電気泳動や カラムクロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて各サブュニッ トを単離して から、 自動プロテインシークェンサ一 （例えば、 島津製作所 （株） 製 PPSQ- 10) 等を利用してそれぞれのサブュニッ 卜の N末端ァミノ酸配列を解析する方法が好 適である。 上記のごとく して得られた目的の形質転換株より、 抗ヒ ト F a sモノクローナ ル抗体タンパク質の各サブュニッ トをコードする c DN Aを採取する方法は、 公 知の方法 LManiatis, T. , et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory- Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照] に従い実施できる。 例え ば細胞よりベクター DN Aに相当する画分を分離し、 該プラスミ ド DNAより 目 的とするサブユニッ トをコードする DNA領域を切り出すことにより行うことが 可能である。
(2) 合成オリゴヌク レオチドプローブを用いるスクリーユング法
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合 （該配 列は、 複数個連続した特異的配列であれば、 目的タンパク質のどの領域のもので もよい） 、 該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し （この場合、 コ ドン使用頻度を参考に推測されるヌク レオチド配列、 または考えられるヌクレ . ォチド配列を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、 また 後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる） 、 これをプロ一 ブ （:I2P、 35Sあるいはビォチン等で標識する） として、 形質転換株の DNAを 変性固定した二トロセルロースフィルタ一とハイブリダィズさせ、 得られたポジ ティブ株を選別する。 このようにして得られる DNAの配列の決定は、 例えばマキサムーギルバ一ト の化学修飾法 [Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) in "Methods in Enzymol ogy" 65, 499-576参照] ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法 [Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269- 276参照] 等により実施することができる。
また近年、 蛍光色素を用いた自動塩基配列決定システムが普及している （例え ばパーキンエルマ一ジャパン社製シークェンスロボッ ト" CATALYST 800"およびモ デル 373AD N Aシークェンサ一等） 。 こうしたシステムを利用することで、 DNAヌクレオチド配列決定操作を能率 よく、 かつ安全に行うことも可能である。 このようにして決定された本発明の D NAの各ヌクレオチド配列、 および重鎖および軽鎖の各 N末端ァミノ酸配列デー タから、 本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の全ァミノ酸配列を決定 することができる。 アミノ酸配列中の任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体 を作製するにあたっては、 カセッ ト変異法 [岸本利光、 "新生化学実験講座 2 · 核酸 III 組換え DNA技術" 242-251参照] などに従うことができる。 この様な各種の DN Aは、 例えばフォスフアイ 卜 · トリエステル法 [Hunkapil ler, M. , et al. (1984) Nature 310, 105- 111参照] 等の常法に従い、 核酸の化 学合成により製造することもできる。 なお、 所望アミノ酸に対するコ ドンは、 そ れ自体が公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば使用する宿主のコ ドン使用 頻度を考慮して常法に従い決定することも可能である。 これらヌクレオチド配列 コ ドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ チドからなるプライマーを利用した部位特異的変異導入法 （サイ トスぺシフイツ ク . ミュータジエネシス） [Mark, D. F. , et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 81， 5662-5666参照] 等に従うことができる。 また、 ある DNAが本発明の医薬組成物に含有せしめる有効成分として好適な 抗 F a sモノクロ一ナル抗体の重鎖または軽鎖をコ一ドする DN Aとハイブリダ ィズするか否かは、 例えば、 該 DNAを、 ランダムプライマー法 [Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal, biochem. 132， 6-13 参照] やニック トラ ンスレーシヨン法 [ aniatis, T.， et al. (1982) in "Molecular Cloning A la boratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参'照] 等 ίこ従レヽ [a— :, P] d CT P等で標識したプローブ DNAを用いて、 以下に記载するような実 験を行うことにより調べることができる。 まず調べようとする DN Aを、 例えば二トロセルロース膜やナイ口ン膜等に吸 着させ、 必要に応じてアルカリ変性等の処理を行なってから、 加熱あるいは紫外 線等により固相化させる。 この膜を、 6 X S S C ( 1 X S S Cは 0. 1 5M 塩 化ナトリウム、 0. 0 1 5M クェン酸三ナトリウム溶液） と 5% デンハート 溶液、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウム （S D S) を含むプレハイブリダィゼ ーシヨン溶液に浸し、 5 5°Cで 4時間以上保温してから、 先に調製したプローブ を同様のプレハイプリダイゼーション溶液に最終比活性 1 X 1 06 c p m/m 1 となるように加え、 60°Cでー晚保温する。 その後、 膜を室温下で 6 X S SCで 5分間の洗浄する操作を数回繰り返し、 さらに 2 X S S Cで 20分間洗浄してか ら、 ォ一トラジオグラフィーを行う。 上記のような方法を利用して、 任意の c DN Aライブラリーまたはゲノムライ ブラリーから、 本発明の医薬組成物に含有せしめる有効成分として好適な抗 F a sモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコ一ドする D N Aとハイブリダィズす る DNAを単離することができる [Maniatis, T. , et al. (1982) in "Molecula r Cloning A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照] 0 上記のごとく して得られる各 DNAを、 それぞれ発現べクタ一に組み込むこと により、 原核生物または真核生物の宿主細胞に導入し、 それらの宿主細胞で各遺 伝子を発現させることが可能である。 原核細胞の宿主としては、 例えば大腸菌 （Escherichia coli) 、 や枯草菌 （Ba cillus subtilis ) 等が挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で発現 させるには、 宿主と適合し得る種由来のレプリコン、 すなわち複製起点および la c UV5 等のプロモータ一配列を含んでいるプラスミ ドベクターで宿主細胞を形質 転換すればよい。 またベクターは、 形質転換した細胞での表現形質による選択性 を付与することができる配列を有するものが望ましい。 例えば大腸菌としては、 E. c o l i K 1 2株由来の J M 1 09株等がよく用いられ、 ベクターとして は、 一般に p B R 3 22や p UC系のブラスミ ドがよく用いられるが、 これらに 限定されず、 公知の各種の菌株およびべクタ一をいずれも使用できる。 またプロ モータ一としては、 大腸菌においては、 ト リプトファン （trp ) プロモータ一、 ラク ト一ス （lac ) プロモータ一、 ト リプトフアン ' ラク ト一ス （tac ) プロモ —ター、 リポプロテイン （lpp ) プロモータ一、 バクテリオファージ由来のラム ダ （λ) P Lプロモータ一、 ポリペプチド鎖伸長因子 T u (tufB) プロモーター などが挙げられるが、 これらに限定されない。 枯草菌としては、 例えば 2 0 7 - 2 5株が好ましく、 ベクターとしては p T U B 2 2 8 [Ohmura, K. , et al. ( 1984) J. Biochem. 95, 87-93 参照] 等が用い られるが、 これに限定されない。 またプロモータ一としては、 枯草菌ひァミラ一 ゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、 さらに必要に応じて ctアミラーゼのシグナ ルぺプチド配列をコードする D N A配列を連結することにより、 菌体外への分泌 も可能となる。 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 酵母等の細胞が含まれ、 脊椎動物細胞と しては、 例えばサル由来の細胞株である C O S— 1 [Gluzman, Y. (1981) Cel l 23, 175-182 参照] 等が用いられる。 酵母としては、 パン酵母 （Saccharomyces cerevi siae) やアルコール資化性酵母 (Pi chia pastori s) 、 分裂酵母 (Schizos saccharomyces pombe) 等が用いられる。 ここに例示したような細胞が一般に宿 主細胞としてよく用いられている力 これらに限定されるものではない。 脊椎動物細胞の発現ベクターと しては、 通常は発現させようとする遺伝子の上 流に位置するプロモーター、 R N Aスブライシング部位、 ポリアデニル化部位お よび転写終結配列等を有するものを使用でき、 これにはさらに必要により複製起 点を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 S V 4 0の初期プロモーター を有する p S V 2 d h f r [Subramani , S. , et al. ( 1981) Mol. Cel l. Bio. 1, 854-864 参照] 等を例示できるが、 これに限定されない。 酵母の発現べクタ一と しては、 例えばアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモー タ一 [Bennetzen, J. し and Hal l, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018—3 025 参照] や、 ガラク トース代謝系酵素遺伝子 （g a l 1 0など） のプロモー ター [Ichikawa, K. , et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1686 - 169 0 参照] 等を利用でき、 必要により酵母遺伝子のシグナルペプチド配列をコード する D N A配列を連結することにより、 細胞外への分泌も可能となるが、 これに 限定されるものではない。 宿主細胞と して CO S - 1を用いる場合を例に挙げると、 発現べクタ一として は、 SV40複製起点を有し、 C〇 S— 1 において自立増殖が可能であり、 さら に転写プロモータ一、 転写終結シグナル、 および RN Aスプライス部位を備えた 発現べクタ一を用いることができる。 該発現べクタ一は、 DEAE—デキス トラ ン法 [Luthman, H. and agnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295—1 308 参照] 、 リン酸カルシウム一 D N A共沈法 [Graham, F. し and van der Eb， A. J. (1973) Virology 52， 456 - 457 参照] および電気穿孔法 [Neumann, E.， et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参照] などにより C O S— 1に取り込ませ ることができ、 かく して所望の形質転換細胞を得ることができる。 特に、 重鎖をコードする DNAを含むことからなる発現ベクターおよび同軽鎖 をコ一ドする DN Aを含むことからなる発現ベクターで COS— 1をコ ' トラン スフヱクシヨンすることにより、 これらの DN Aを同時に発現させ、 組換え抗 F a s抗体を産生する形質転換体を得ることができる。 しかしながら、 組換え抗 F a s抗体を生産する方法は上記に限定されず、 例えば、 重鎖および軽鎖のそれぞ れをコ一ドする DN Aを両方とも保持し、 これらを同時に発現させることができ る単一の発現ベクターを構築し、 該ベクターで COS— 1細胞を形質転換する方 法等も用いることができる。 上記で得られる所望の形質転換体は、 当業者に周知の方法に従って培養するこ とができ、 該培養により、 形質転換体細胞内または細胞外に組換え抗 F a s抗体 が産生される。 該培養に用いられる培地と しては、 採用した宿主細胞に応じて慣 用される各種のものを適宜選択でき、 例えば上記 CO S— 1の場合、 RPM I 1 640培地やダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM) などの培地に、 必要に応 じゥシ胎児血清 （F C S) などの血清成分を添加したものを使用できる。 該形質転換体の培養の際の培養温度は、 細胞内のタンパク質合成能を著しく低 下せしめない温度であればいずれでもよいが、 好適には 3 2〜42°C、 最も好適 には 3 7°Cで培養する。 また必要に応じて、 1〜1 0% (v/v) の炭酸ガスを 含む空気中で培養することができる。 上記により形質転換体の細胞内または細胞外に生産される、 抗 F a s抗体タン パク質を含む画分は、 該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種 公知のタンパク質分離操作法により、 分離 '精製することができる。 かかる方法 としては、 具体的には例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、 限外ろ過、 分 子ふるいクロマトグラフィー （ゲルろ過） 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交 換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 高速液体クロマト グラフィ一 （H P L C ) 等の各種クロマトグラフィー、 透析法、 およびこれらの 組み合わせ等を採用できる。 上記方法により、 容易に高収率、 高純度で組換え抗 F a s抗体を製造できる。 このようにして作製される組換え抗 F a s抗体が F a s と特異的に結合するこ とを確認する方法としては、 例えば、 マウス免疫時に抗体価の評価を行う場合と 同様の E L I S A法が好適である。 一方、 葉酸拮抗作用またはジヒ ドコ葉酸還元酵素阻害作用を有する、 例えば上 記式 （ I ) 乃至 （X I X ) で示される化合物は、 それぞれの化合物の説明におい て参照されている文献の記載に従って得ることができる。 その他の化合物が葉酸 拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有するか否かについても、 それ ら文献において用いられている葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作 用の確認方法を利用して調べることができる。 本発明の医薬組成物は、 自己免疫疾患または慢性関節リ ウマチ患者に対し、 こ のものを有効成分とする予防または治療剤として使用することができる。 かかる 予防または治療剤は、 種々の形態で投与することができ、 それらの投与形態とし ては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投与、 または、 注射剤、 点滴剤、 坐薬等による非経口投与を挙げることができる。 本発明の医薬組成物中における、 抗ヒ ト F a s抗体および葉酸拮抗作用または ジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物の用量は、 用いられるそれぞれの 抗体や化合物固有の作用の強さなどによって変化しうる。 例えば、 抗ヒ ト F a s 抗体として CH 1 1または HF E 7 Aを、 葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元 酵素阻害作用を有する化合物としてメ ト トレキセ一トを用いた場合、 本発明の医 薬組成物は、 好ましくは CH 1 1または H F E 7 Aを 0. 1乃至 1 00 n g/m 1、 メ ト トレキセ一トを 0. 0 5乃至 5 nM含有する溶液として調製されるが、 本発明はこの範囲に限定されるものではなレ、。 その投与量は、 症状、 年齢、 体重などによって異なるが、 通常、 抗ヒ ト F a s 抗体の量として、 1回 0. 1 m g乃至 1 0 0 Om gを皮下注射、 筋肉注射または 静脈注射によって投与することができる。 上記のようにして調製される本発明の医薬組成物の、 自己免疫疾患または慢性 関節リゥマチの治療における有効性は、 本発明の医薬組成物を添加した培地中で 細胞 （例えば、 ヒ トリンパ球細胞株 H P B— AL L (Morikawa, S. , et al. (19 78) Int. J. Cancer 21, 166- 170参照） 、 J u r k a t (American Type Cultur e No. TIB-152 ) 、 慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞等） を培養し、 その生 存率を MTTアツセィ (Green, し M.， et al. (1984) J. Immunological Metho ds 70, 257- 268参照） や下記実施例で記載する X T Tアツセィ等の方法で測定す ることにより確認することができる： 本発明の医薬組成物は、 自己免疫疾患の主 な原因の一つである自己反応性リンパ球や、 慢性関節リゥマチ患部において異常 増殖している滑膜細胞に対して、 抗 F a s抗体のみを投与するよりも低用量の抗 F a s抗体でアポトーシスを誘導できるので、 それら自己免疫疾患または慢性関 節リゥマチの治療に有効である。 これら培養細胞を用いた実験において有効と認 められた抗 F a s抗体を含む組成物が、 実際の自己免疫疾患症状や慢性関節リウ マチにおいても有効であることは、 欧州特許公開 0 9 0 9 8 1 6号公報において 動物実験モデルを用いた実験結果により示されている。 [図面の簡単な説明]
図 1は、 抗ヒ ト F a sモノク口一ナル抗体 CH 1 1 とメ ト トレキセ一トとの細 胞アポトーシス誘導における相乗効果を示した図である。
図 2は、 抗ヒ 卜 F a sモノクロ一ナル抗体 H F E 7 Aとメ ト トレキセ一トとの 細胞アポト一シス誘導における相乗効果を示した図である。
図 3は、 メ 卜 トレキセート存在下における細胞生存率を示した図である。
[発明を実施するための最良の形態]
以下に実施例を挙げて、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。 実施例 1
抗 F a s抗体として、 欧州特許公開 0 9 0 9 8 1 6号公報に記載の抗ヒ ト F a sモノクローナル抗体 H F E 7 Aまたは C H I 1 ( (株） 医学生物学研究所製） を使用した。 ヒ トリンパ球細胞株 H P B— A L L (Morikawa, S. , et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166- 170参照） を 1 0 % F C S (ギブコ · ビーァ一ルエル社製） を 含む R PM I 1 6 4 0培地にて、 3 7°C、 5 % 炭酸ガス存在下で 3日間培養し
( 2. 5 X 1 05細胞 / 5 0 M 1 ) を、 9 6穴マイク口プレート （住友べークラ イ ト （株） 社製） の各ゥエルに 5 0 1ずつ分注した。 次に、 メ ト トレキセ一ト
(シグマ社製） および抗 F a s抗体 （CH 1 1または H F E 7 A、 0. 0 0 1 m gZm 1から 3倍づっ段階希釈） を含む R PM I培地 5 0 μ 1 を、 各ゥエルに添 加し、 3 7 °Cで培養した。 抗 F a s抗体として CH 1 1を添加したプレ一トについては、 そのまま 3 7°C で一晚培養した。 一方、 H F E 7 Aを添加したプレートについては、 培養 1時間 後に R PM I培地で細胞を洗浄した後、 R PM I培地で 1 μ g /m 1に調製した 抗マウス I g G抗体 （バイオソース社製） を 1 0 0 μ 1ノウエル加えた。 3 7°C で 1時間培養後、 無血清 R PM I培地で細胞を洗浄後、 0. 0 5 nMのメ ト トレ キセートを含む R PM I培地を 1 0 0 1 ウエル加えてから、 3 7。Cで一晚培 養した。 その後、 1 m g/m 1 の XTT (2， 3—ビス [2—メ トキシ一 4—ニトロ一 5—スルホフエニル] — 2 H—テ トラゾリ ゥムー 5—カルボキサニリ ド イナ一 ソルト ： シグマ社製） を含む 2 5 μ Μの PMS (フエナジンメ トサルフェート ： シグマ社製） 5 0 μ 1ノゥエル （終濃度 2 5 0 μ gZm 1 XTT, 5 μΜ Ρ MS) を添加した。 3 7 °Cで 3時間培養した後、 各ゥヱルの 4 5 0 nmの吸光度 を測定し、 ミ トコンドリアの還元能を指標とし、 細胞の生存率を算定した。 各ゥエルの細胞の生存率を、 下記式により算出した：
生存率 （％) = 1 00 X (a - b) / ( c一 b )
(式中、 aは被検ゥエルの測定値を、 bは無細胞ゥエルの測定値を、 cは抗体無 添加のゥエルの測定値をそれぞれ表わす） 。 その結果、 CH 1 1のアポ卜一シス誘導活性は、 0. 0 5 nM以上のメ ト トレ キセート添加によって顕著に上昇することが明らかとなった （図 1。 なお、 図中 で 「MTX」 はメ ト トレキセ一トを表す。 以下において同じ） 。 また、 HF E 7 Aのアポ卜一シス誘導活性も、 0. 0 5 nMのメ ト トレキセ一ト添加によって上 昇していた （図 2) 。 なお、 抗 F a s抗体を添加しない、 メ ト トレキセ一ト単独 添加の条件では、 細胞の生存率はほとんど変化しなかった （図 3) 。 以上の結果から、 メ ト トレキセ一ト添加により、 抗 F a s抗体によるアポトー シス誘導活性が増強され、 従来より低用量の抗 F a s抗体投与により自己免疫疾 患の原因細胞の数を減らすことができることが示された。
製剤例
本発明の予防または治療剤は、 抗ヒ ト F a s抗体と葉酸拮抗作用またはジヒ ド 口葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物とを水またはそれ以外の薬理学的に許容 し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供される。 具体的には例えば、 抗ヒ ト F a s抗体 0 . 5 m gおよび最終的に 0 . 0 5 n M となる量のメ ト トレキセ一トを 1 リ ツ トルの注射用水に溶解し、 無菌的にアンプ ルに分注、 封入する。 また、 無菌粉末製剤 （抗ヒ ト F a s抗体と葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還 元酵素阻害作用を有する化合物とを凍結乾燥するのが好ましい） をアンプルに充 填しておき、 使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよレ、。
[産業上の利用の可能性]
以上述べたごとく、 本発明により、 自己免疫疾患や慢性関節リ ゥマチの予防ま たは治療剤として有用な新規医薬組成物が提供された。 本発明によれば、 葉酸拮 抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物と抗ヒ ト F a s抗体 とを併用することにより、 抗 F a s抗体の使用量を低減することができる。 これ により、 患者体内において該抗 F a s抗体に対する抗体の発現等による耐性が表 れる可能性を低減できるため、 本発明の医薬組成物は、 長期間の投与に堪える優 れた自己免疫疾患や慢性関節リゥマチの予防または治療剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. アポトーシス誘導活性を有する抗ヒ ト F a s抗体および葉酸拮抗作用ま たはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物を有効成分として含有する医 薬組成物。
2. アポトーシス誘導活性を有する抗ヒ ト F a s抗体がモノクローナル抗体 CH 1 1、 HF E 7 Aまたはそれらのヒ ト化抗体であることを特徴とする、 請求 の範囲第 1項記載の医薬組成物。
3. アポトーシス誘導活性を有する抗ヒ ト F a s抗体がモノクロ一ナル抗体 CH 1 1またはそのヒ ト化抗体であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項また は第 2項記載の医薬組成物。
4. アポトーシス誘導活性を有する抗ヒ ト F a s抗体が、 マウス一マウスハ イブリ ド一マ HF E 7 A (F E R B P— 5 8 28) が産生する抗ヒ ト F a s モノクローナル抗体 HF E 7 Aまたはそのヒ 卜化抗体であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項または第 2項記載の医薬組成物。
5. 葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物が、 メ ト トレキセ一ト、 エダトレキセート、 ェピロプリム、 ィオメ トレキソ一ル、 ピ リ 卜レキシム、 トリメ トレキセ一ト、 ブロジモプリム、 MX— 6 8、 N- [4- [3- (2, 4-ジァミノ- 6， 7-ジヒ ドロ- 5H -シク口ペンタ [d]ピリ ミジン- 5-ィル）プロピル]ベ ンゾィル]- L -グルタミン酸、 N- [[5 - [2 -（2 -ァミノ- 1， 4, 5, 6, 7, 8 -へキサヒ ドロ- 4- ォキソピリ ド [2,3- d]ピリ ミジン- 6-ィル）ェチル -2-チェニル]カルボ二ル]- L-グ ルタミン酸、 （R) - N- [[5-[2-(2-ァミノ- 1，4, 5,6, 7, 8-へキサヒ ドロ- 4-ォキソピリ ド [2,3- d]ピリ ミジン- 6-ィル）ェチル -2-チェニル]カルボニル] -し-グルタミン酸、 N-( (2， 4 -ジァミノ- 3, 4， 5, 6， 7, 8 -へキサヒ ドロピリ ド [2, 3- d]ピリ ミジン - 6_ィル） ェチル）-2-チェニルカルボニル- L-グルタミン酸、 （S)-2- [[[4-カルボキシ- 4- [[4 -[[(2, 4 -ジアミノ- 6 -プテリジニル）メチル]アミノ]ベンゾィル]アミノ]プチル] ァミノ]カルボニル]ベンゾィル酸、 [4- [3- (2, 4 -ジァミノ- 1H-ピロ口 [2, 3-d]ピ リ ミジン - 5-ィル）プロピル]ベンゾィル]-し-グルタミン酸、 2， 4-ジァミノ- 6-(N- ( 4 -（フエニルスルホニル）ベンジル）メチルアミノ）キナゾリン、 2， 4-ジアミノ- 5- [ 4 - [3- (4-アミノフエニル- 4 -スルホニルフエニルアミノ）プロポキシ] - 3, 5 -ジメ ト キシベンジル]ピリ ミジン、 N- [4- [4- (2, 4-ジァミ ノ- 5-ピリ ミジニル）ブチル]ベ ンゾィル] -L-グルタミン酸、 N- [4- [3- (2， 4-ジァミノ- 5-ピリ ミジニル）プロピル] ベンゾィル] - L-グルタミン酸、 N- [4- [2- (2， 4-ジアミノ -6-プテリジニル）ェチル] ベンゾィル ] -4-メチレン - DL -グルタミン酸および N- ( l -メチルェチル） -N' [3- (2, 4, 5 -卜リクロロフエノキシ）プロポキシ]イミ ドジカルボニミジックジアミ ドヒ ドロ クロリ ド （P S 1 5 ) からなる群より選択される 1または 2以上の化合物である ことを特徴とする、 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一つに記載の医薬組 成物。
6 . 葉酸拮抗作用またはジヒ ドロ葉酸還元酵素阻害作用を有する化合物がメ ト トレキセ一トであることを特徴とする、 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれ か一つに記載の医薬組成物。
7 . 自己免疫疾患または慢性関節リウマチの予防または治療剤である、 請求 の範囲第 1項乃至第 6項のいずれか一つに記載の医薬組成物。
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