WO2000066744A1

WO2000066744A1 - Glucose-deshydrogenase

Info

Publication number: WO2000066744A1
Application number: PCT/JP2000/002872
Authority: WO
Inventors: Koji Sode
Original assignee: Koji Sode
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-01
Publication date: 2000-11-09
Also published as: KR20020010624A; US7049114B1; IL146137A0; US20060019328A1; EP1176202A1; EP1176202A4; DE60029775T2; DE60029775D1; CN1353759A; EP1176202B1; TWI224136B; CN100410379C; CA2372741A1

Description

明細書グルコース脱水素酵素技術分野

本発明はピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQ GDH) の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。

背景技術

血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカ一である。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースォキシダーゼ（GOD) あるいはダルコース 6リン酸脱水素酵素（G6PDH) を用いる酵素法により定量されていた。しかし、 GODを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーォキシダーゼをアツセィ系に添加する必要があった。 G 6 PDHは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素である NAD (P) を添加しなければならない。したがって本発明はグルコースに対する改良された親和性を有する改変型水溶性 PQQGDHを提供することを目的とする。本発明はまた、血中グルコース濃度測定の感度を増加させるために、グルコースに対する選択性が高い改変型水溶性 PQQGDHを提供することを目的とする。

発明の開示

本出願人は、これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてグルコースに対する親和性の高 ^PQQGDHが有益であることを見いだした。

PQQGDHは、ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してダルコノラクトンを生成する反応を触媒する。

PQQGDHには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性 PQQGDHは、分子量約 87 kD aのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。例えば、 AM. C 1 e t on— J an s e n e t a 1. , J. Bac t e r i o l. (199 0) 172, 6308— 6315を参照されたい。一方、水溶性 PQQGD H¾ Acinetobacter calcoaceticus のいくつ力の株 iこおレてその存在力確認されており（B i o s c i. B i o t e c h. B i oc hem. (1995) , 59 (8) , 1548— 1555) 、その構造遺伝子がクロ一ニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Mo l. Ge n. Ge ne t. (1989) ， 2 17 : 430— 436) 。 A. c a l c o a c e t i c u s由来水溶性 PQQG DHは、分子量約 50 kD aのホモダイマーである。他の PQQ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロジ一がほとんどない。

最近、本酵素の X線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった。（J. Mol. Biol. , 289, 319- 333(1999), The crystal structure of the apo form of the soulble quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus revelas a novel internal conserved sequence repeat； A . Oubrie et al. , he EMBO Journal , 18(19) 5187-5194 (1999) , Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogenase , A. Oubrie et al. , PNAS, 96(21) , 11787 - 11791 (1999) , Active- site structure of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with methylhydrazine： A covalent cof actor- inhibit or complex, A. Oubrie et al.) 。これらの論文によれば、水溶性 PQQGDHは 6 つの W—モチーフから構成される /3プロペラ蛋白質であることが明かとなった。

本発明者は従来の水溶性 P Q Q G D Hを改良してそのグルコースに対する親和性を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型 PQQGDHを開発すベく鋭意研究を行なった結果、水溶性 PQQGDHの特定の領域においてアミノ酸変異を導入することにより、グルコースに対する親和性が高い酵素を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対して親和性が向上していることを特徵とする改変型グルコース脱水素酵素を提供する。本発明の改変型 P Q Q GD H はグルコースに対する Km値が天然型の P Q Q GDHの Km値より低く、好ましくは 2 O mM未満であり、より好ましくは 1 O mM未満である。

また好ましくは、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、グルコースに対する親和性は増加しているが、他の糖に対する親和性は変化していないかまたは低下しており、このことにより前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対して高い選択性を有する。特に、グルコースに対する反応性と比ベて、ラク 1 ^一スあるいはマルト一スに対する反応性が野生型より低下している。好ましくは、グルコースに対する反応性を 1 0 0 %とした場合、ラクトースあるいはマルトースに対する活性が 6 0 %以下であり、より好ましくは 5 0 %以下であり、さらに好ましくは 4 0 %以下である。

本発明の 1つの態様においては、本発明の P QQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ G D Hの第 2 6 8残基から 2 8 9残基または第 4 4 8残基から第 4 6 8残基に相当する領域において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、すなわち天然に存在する P Q Qグルコース脱水素酵素中の対応するァミノ酸残基とは異なるァミノ酸残基で置換されている。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチォニンを 1として番号付けする。

本明細書においてアミノ酸残基または領域に関して用いる場合、「相当する」との用語は、構造上類似するが同一ではない 2以上の蛋白質において、あるアミノ酸残基または領域が等価の機能を有することを表す。例えば、 Acinetobacter calcoaceticus 以外の生物に由来する水溶性 P Q Q G D H ίこおレて、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶'性 P Q Q GD Hの第 2 6 8残基から 2 8 9残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、かつ蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしていると合理的に考えられる場合、該領域は「Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 PQQGDHの第 268残基から 289残基の領域に相当する」と言われる。さらに、該領域の第 1 0番目のアミノ酸残基は「Acin_etobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ GDHの第 277残基に相当する」と言われる。

好ましくは、本発明の改変型 PQQGDHは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 277番目のグルタミン酸残基、 278番目のイソロイシン残基、 462 番目のァスパラギン残基、 452番目のァスパラギン残基、 455番目のリジン残基、 456番目のァスパラギン酸残基、 457番目のァスパラギン酸残基または 448番目のァスパラギン酸残基に相当するアミノ酸残基の 1またはそれ以上がそれぞれ他のアミノ酸残基で置換されている。

さらに好ましくは、本発明の改変型 PQQGDHは、配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 277番目のグルタミン酸残基が、ァラニン、ァスパラギン、リジン、ァスパラギン酸、ヒスチジン、グルタミン、パリンおよびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されているか、または 278番目のイソ口イシン残基がフエ二ルァラニン残基で置換されている。

また別の観点においては、本発明の改変型 PQQGDHは、配列：

Xaa8 Thr Ala Gly Xaal Val Gin Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Val Thr Xaa5 Thr Leu Glu Asn Pro Gly

(式中、 Xaal、 Xaa2、 Xaa3、 Xaa4、 Xaa5および Xaa8は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、 Xaalが Asnであり、 Xaa2が Lysであり、 Xaa3が Asp であり、 Xaa4が Aspであり、かつ Xaa5 气 Asnであるとき、 Xaa8は Aspではない）を含む。

また別の観点においては、本発明の改変型 PQQGDHは、配列：

Ser Glu Gin Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa6 Xaa7 Asn Leu lie Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp

[式中、 Xa a 6およびは Xa a 7は任意の天然アミノ酸残基であるが、ただし、 Xa a 6が G 1 uであるとき Xa a 7は I 1 eではない] を含む。

本発明はまた、上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアツセィキットおよびグルコースセンサ一を提供する。

本発明の改変型 PQQGDHの酵素蛋白質はグルコースに対して高い親和性を示し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高感度かつ高選択的な測定に応用できる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明において用いたプラスミド PGB2の構造を示す。

図 2は、本発明の改変型酵素をコ一ドする突然変異遺伝子を作成する方法を示す。

図 3は、本発明の改変型 PQQGDHを用いるグルコースのアツセィを示す。発明を実施するための最良の形態

改変型 PQQGDHの構造

本発明者は、水溶性 PQQGDHをコードする遺伝子のコーディング領域中にエラ一ブローン P C R法によりランダムに変異を導入し、アミノ酸残基の変異が導入された水溶性 PQQGDHのライブラリ一を構築した。これを大腸菌に形質転換し、グルコースに対する PQQGDHの活性についてスクリーニングして、 2 OmM濃度のグルコースに対する活性が 10 OmMのグルコースに対する活性と同等であり、低濃度のグルコースに対して野生型酵素より反応性が向上した P QQGDHを発現する多数のクローンを得た。

これらのクローンの一つについて遺伝子配列を解析したところ、第 277番目の G 1 uが G 1 yに置換されていることが判明した。さらにこの残基を種々の別のアミノ酸残基に置換したところ、いずれの残基に置換しても野生型水溶性 PQ Q G D Hよりもグルコースに対する親和性が向上した優れた変異酵素が得られた。次に、第 277番目の残基の近傍の他の残基に関して部位特異的に変異を導入し、グルコースに対する親和性を測定した。第 268残基から 289残基の領域中の、 278番目の I 1 eを Ph eに置換した改変型酵素、および 279番目の As nを H i sに置換した改変型酵素を作成し、その活性を測定したところ、これらの改変型酵素はグルコースに対して高い親和性を有していた。

さらに、上記多数のクローンから、 2 OmM濃度のグルコースに対する活性が野生型 PQQGDHと同等であるが、 2 OmMのラクト一スに対する活性が野生型 PQQGDHより低下した PQQGDHを発現するクローンを選択した。これらのクローンの一つについて遺伝子配列を解析したところ、第 452番目の As nが As pに置換されていることが判明した。次に、この残基をトレオニン、リジン、イソロイシン、ヒスチジンあるいはァスパラギン酸残基に置換したところ、いずれの残基に置換しても野生型水溶性 PQQGDHよりもグルコースに対する選択性が向上した優れた変異酵素が得られた。さらに、第 452番目の残基の近傍の他のアミノ酸残基に対しても同様に変異を導入した。第 455番目のリジン残基をイソロイシン残基に、第 456番目のァスパラギン酸残基をァスパラギン残基に、第 457番目のァスパラギン酸残基をァスパラギン残基に、第 462番目のァスパラギン残基をァスパラギン酸残基に、第 448番目のァスパラギン酸残基をァスパラギン残基にそれぞれ置換した変異酵素を構築した。その結果、表 4に示すように、いずれの変異酵素においてもグルコースに対する選択性が向上したことがわかつた。

本発明の好ましい PQQグルコース脱水素酵素においては、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ GDHの第 448残基から第 468残基に相当する領域において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明の改変型 PQQGDHは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 462番目のァスパラギン残基、 452番目のァスパラギン残基、 455番目のリジン残基、 456番目のァスパラギン酸残基、 457番目のァスパラギン酸残基および第 448番目のァスパラギン酸残基に相当するアミノ酸残基の 1またはそれ以上が他のアミノ酸残基で置換されている。

また別の観点においては、本発明の改変型 PQQGDHは、配列：

(式中、 Xaal、 Xaa2、 Xaa3、 Xaa4、 Xaa5および Xaa8は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、 Xaalが Asnであり、 Xaa2が Lysであり、 Xaa3が Asp であり、 Xaa4が Aspであり、かつ Xaa5が Asnであるとき、 Xaa8は Aspではない）を含む。

本発明の別の好ましい改変型 P Q Q G D Hは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 2 6 8残基から 2 8 9残基の領域において、 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。さらに、本発明の特に好ましい改変型 P Q Q GD Hは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 2 7 7番目のダル夕ミン酸残基が、ァラニン、ァスパラギン、リジン、ァスパラギン酸、ヒスチジン、グルタミン、ノリンおよびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されているか、または 2 7 8番目のイソロイシン残基がフエ二ルァラニン残基で置換されている。

また別の観点においては、本発明の改変型 P Q Q GD Hは、配列：

[式中、 X a a 6およびは X a a 7は任意の天然アミノ酸残基であるが、ただし、 X a a 6が G 1 uであるとき X a a 7は I l eではない] を含む。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素においては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。

さらに、当業者は、他の細菌に由来する水溶性 P Q Q GD Hについても、本発明の教示にしたがってアミノ酸残基を置換することにより、グルコースに対する親和性が向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。特に、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、 Acinetobacter calcoaceticus 由来の水溶性 P Q Q GD Hの 2 7 7番目のグルタミン酸残基および 2 7 8番目のイソロイシン残基、 4 6 2番目のァスパラギン残基、 4 5 2番目のァスパラギン残基、 4 .5 5番目のリジン残基、 4 5 6番目のァスパラギン酸残基、 4 5 7番目のァスパラギン酸残基および第 4 4 8番目のァスパラギン酸残基に相当するアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を容易に認識することができる。本発明にしたがって、そのような置換を行うことにより、基質に対する親和性が改良された改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。

改変型 P Q Q G D Hの製造方法

Acinetobacter calcoaceticus 由来の天然の水溶性 P QQGDHをコードする遺伝子の配列は配列番号 2で規定される。

本発明の改変型 PQQGDHをコードする遺伝子は、天然の水溶性 P Q Q G D Hをコードする遺伝子において、特定のアミノ酸残基をコードする塩基配列を、変異すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野にぉレて知られており、例えば、、 Sambrook ら，" Molecular Cloning; A Laboratory Manual ,第 2 Ik , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press , New Yorkに載されてレる。

このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター ·宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。

ランダム変異を導入する場合には、標的とする領域においてエラーブローン P CR法によりランダムに変異を導入し、その標的領域に変異が導入された変異水溶性 PQQGDH遺伝子ライブラリーを構築する。これを大腸菌に形質転換し、 PQQGDHのグルコースに対する親和性について各クローンをスクリーニングする。水溶性 PQQGDHは大腸菌において発現させたときにペリブラズム空間に分泌されるため、菌体そのものを用いて容易に酵素活性の検定を行うことができる。このライブラリ一に、 2 OmMグルコース存在下で色素として PMS— D C I Pを加え、 PQQGDHの活性を目視により判定して、グルコース 100m Mに対する活性と同等な活性を示すクローンを選択し、遺伝子配列を解析してその変異を確認する。

さらに、グルコースに対する選択性が向上した改変型 PQQGDHを得るためには、このライブラリーに色素として PMS— DC I Pを加え、 PQQGDHの活性を目視により判定して、 2 OmM濃度のグルコースに対する活性が野生型 P QQGDHと同等であるが、 2 OmMのラク I スに対する活性が野生型 P QQ GDHより低下した PQQGDHを発現するクローンを選択し、遺伝子配列を解祈してその変異を確認する。

上述のようにして得られた、改変型 PQQGDHを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはォスモティックショックによりペリブラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、 PQQGDHを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主べクタ一系を用いることにより、発現した PQQ GDHを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、 HPLCなどにより精製することにより、本発明の改変型 PQQGDHを調製する。

酵素活性の測定方法

本発明の PQQGDHは、 PQQを補酵素として、グルコースを酸化してダルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。

酵素活性の測定は、 PQQGDHによるグルコースの酸化にともなって還元される PQQの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、 PMS (フエナジンメトサルフェート） —DC I P (2, 6—ジクロロフエノ一ルインドフエノール）、フェリシアン化カリウム、フエ口センなどを用いることができる。

グルコースに対する親和性

本発明の改変型 P Q Q G D Hはグルコースに対する親和性が野生型の親和性より大幅に向上している。すなわち、改変型 PQQGDHのグルコースに対する K m値は、野生型 PQQGDHのグルコースに対する Km値より大幅に低い。改変型 PQQGDHの中でも Glu277Lysのグルコースに対する Km値は 8. 8mM であり、また最大活性も野生型酵素と遜色ないことから、低い濃度のグルコースに対する反応性が向上している。

したがって、本改変型酵素を用いて作成されたアツセィキットあるいは酵素センサ一はグルコース測定に関して感度が高く、低い濃度のグルコースが検出できるなどの優れた利点を有する。

選択性の評価方法

本発明の PQQGDHのグルコースに対する選択性は、基質として、 2—デォキシ— D—グルコース、マンノース、ァロース、 3— o—メチル—D—ダルコ一ス、ガラク 1 ^一ス、キシロース、ラクト一スおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。

グルコースアツセィキット

本発明はまた、本発明に従う改変型 PQQGDHを含むグルコースアツセィキットを特徴とする。本発明のグルコースアツセィキットは、本発明に従う改変型 PQQGDHを少なくとも 1回のアツセィに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型 PQQGDHに加えて、アツセィに必要な緩衝液、メディエー夕一、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型 PQQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型 PQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。

グルコースセンサー

本発明はまた、本発明に従う改変型 PQQGDHを用いるグルコースセンサーを特徵とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフエ口センあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型 PQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、 PQQを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、ダルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型 PQQ GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してダルタルアルデヒドをブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、 PQQおよび CaC l ₂、およびメデイエ一夕一を加えて一定温度に維持する。メディエー夕一としては、フェリシアン化カリウム、フエナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型 PQ QGDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えば AgZAgC l電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキヤリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て弓 I用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願平成 11一 124285号および 200 0-9137号の明細書に記載の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されることはない。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

変異 P Q Q G D H遺伝子ライブラリの構築およびスクリーニング

プラスミド PGB2は、ベクター pTr c 99A (フアルマシア社製）のマルチクロ一二ング部位に、 Acinetobacter calcoaceticus 由来 PQQGDH をコードする構造遺伝子を挿入したものである（図 1) 。このプラスミドをテンプレートとして、エラープロ一ン PCR法により種々の領域中にランダムに変異を導入した。 PCR反応は、表 1に示す組成の溶液中で、 94 3分間、次に、 94°C3分間、 50132分間、および 72 2分間を 30サイクル、最後に 7 2でで 10分間の条件で行った。表 1

Ta QDNAポリメラ一ゼ（5U/ 1 ) 0. 5 1 テンプレート DNA 1. 0 1 フォヮ一ドプライマ一 ABF 4. 0 1 リバースプライマ一 ABR 4. 0 Ai 1

1 0 XT a qポリメラ一ゼバッファ一 10. 0 1

1M/3—メルカプトエタノール 1. 0 pi 1

DMSO 10. 0 1

5mMMn C 1₂ 10. 0 a 1

1 OmMdGTP 2. 0111

2mMd ATP 2. 0 1

1 OmMd CTP 2. 0 fi 1

1 OmMdTTP 2. 0 II 1

H₂〇 51. 5111

00. 0 .1 得られた変異水溶性 PQQGDHのライブラリ一を大腸菌に形質転換し、形成された各コロニーをマイクロ夕イタ一プレートに移した。コロニーを別のプレートにレプリカし、片方のプレートにはグルコース濃度 1 OmMおよび PMS— D C I Pを加え、他方のプレートには 10 OmMグルコースおよび PMS— DC I Pを加え、双方の PQQGDHの活性を目視で判定した。 2枚のプレートで同等の PQQGDHの活性を示すクローンが多数得られた。

このうち 1つのクローンを任意に選び、遺伝子配列を解析したところ、第 2 7 7番目のダル夕ミン酸がグリシンに変異していたことがわかつた。実施例 2

実施例 1で得られた各コロニーをマイクロタイ夕一プレートに移した。コロニ一を別のプレートにレプリカし、片方のプレートにはグルコース濃度 2 OmMおよび PMS— DC I Pを加え、他方のプレートには 2 OmMラクト一スおよび P MS— DC I Pを加え、双方の PQQGDHの活性を目視で判定した。 2枚のプレートでグルコースの示す活性よりもラクトースに対する活性が大幅に低下したクローンが多数得られた。

このうち 1つのクローンを任意に選び、遺伝子配列を解析したところ、 452 番目のァスパラギンがァスパラギン酸に変異していたことがわかった。実施例 3

改変型酵素 P Q Q G D H遺伝子の構築

配列番号 2に示される Acinetobacter calcoaceticus由来 PQQGDH の構造遺伝子をもとに、常法に従って部位特異的変異法により 277番目のグルタミン酸残基または 278番目のイソロイシン残基をコードする塩基配列を所定のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異はプラスミド PGB2を用いて、図 2に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を表 2に示す。表 2においては、例えば「E 277A」は、 277番目のグルタミン酸がァスパラギン酸に置換されていることを表す。表 2

E277A 5* - GAG GTT AAT TGC ATC GTC AGA G -3'

E277N 5' - C AAT GAG GTT AAT GTT ATC GTC AGA GTT TG -3'

E277K 5" - GAG GTT AAT ATC ATC GTC AGA G -3'

E277D 5' - GAG GTT AAT TTT ATC GTC AGA G -3'

E277H 5'- C AAT GAG GTT AAT GTG ATC GTC AGA GTT TG -3

E277Q 5 GAG GTT AAT TTG ATC GTC AGA G -3"

E277V 5' - C AAT GAG GTT AAT TAC ATC GTC AGA GTT TG -3

E277G 5に GAG GTT AAT TCC ATC GTC AGA G -3 '

I278F 5' - C AAT GAG GTT GAA TTC ATC GTC AGA G -3"

N279H 5 GAC AAT GAG GTG AAT TTC ATC GTC AGA GTT -3' ベクタ一プラスミド pKF l 8 k (宝酒造（株））に Acinetobacter calcoaceticus 由来 P QQGDHをコードする遺伝子の一部を含む Kpn I- Hind III 断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート 5 0 fmo 1と宝酒造（株）製 Mu t an (登録商標） — Exp r e s s Kmキットに付属のセレクションプライマ一 5 pmo 1、リン酸化したターゲットプライマ一 50 pmo 1を全体 (20 1 ) の lZl 0量の同キットのァニーリングノソファーとともに混合し、 _{1 0 0} 、 3分間の熱処理でプラスミドを変性させ、 1本鎖にした。セレクションプライマーは pKF 18 kのカナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを 5分間氷上に置き、プライマ一をアニーリングさせた。これに 3 1の同キットェクステンシヨンバッファー、 1 1の丁4 DNAリガーゼ、 1 1の丁4 DNAポリメラ一ゼおよび 5 a 1の滅菌水を加えて相補鎖を合成した。

これを DNAのミスマッチ修復能欠損株である E.coli BMH71 - 18 mutSに形質転換し、一晩振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。

次に、ここから抽出したプラスミドを E.coli MV1184に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミド pGB 2上の野生型 PQQGDHをコードする遺伝子の Kpn I-Hind III断片と入れ替え、改変型 PQQGDHの遺伝子を構築した。

同様にして、配列：

5' -C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT- 3'

のオリゴヌクレオチド夕ーゲットプライマーを合成し、 452番目のァスパラギンをヒスチジンに置換した。部位特異的変異はプラスミド pGB 2を用いて、図 2に示す方法により行った。さらに、 Asp448Asn、 Asn452Asp、 Asn452His、 Asn452Lys、 Asn452 hr、 Asn452Ile、 Lys455Ile、 Asp456Asn、 Asp457Asn、 Asn462Asp の各変異を有する改変型 P Q Q G D Hの遺伝子を構築した。実施例 4

改変型酵素の調製

野生型または改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を、 E. c o l i用の発現ベクターである pT r c 99 A (フアルマシア社）のマルチクローニングサイトに揷入し、構築されたプラスミドを E.coli DH 5ひ株に形質転換した。これを 450mlの L培地（アンピシリン 50 gZm 1、クロラムフエニコ一ル 30 8ノ1111含有）で坂口フラスコを用いて 37 でー晚振とう培養し、 lm M CaC l ₂、 500 MPQQを含む 71の L培地に植菌した。培養開始後約 3時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度 0. 3mMになるように添加し、その後 1. 5時間培養した。培養液から遠心分離（5000X g、 10分、 4 ）で菌体を回収し、この菌体を 0. 85%NaC 1溶液で 2回洗浄した。集菌した菌体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（10000X g、 1 5分、 4で）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠心分離（160500 X g (40000r.p.m. )、 90分、 4 ）し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以下の実施例において用いた。

さらに、こうして得た水溶性画分を 10 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0で一晩透析した。透析したサンプルを 10 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0で平衡化した陽ィオン交換クロマトグラフィー用充填カラム TSKg e 1 CM-TOYOPEA RL 650M (東ソ一株式会社）に吸着させた。このカラムを 1 OmMリン酸緩衝液 pH7. 0、 750mlで洗浄した後、 0— 0. 2M N a C 1を含む 1 OmMリン酸緩衝液 pH 7. 0を用い、酵素を溶出させた。流速は 5mlZmi nで行った。 GDH活性を有する画分を回収し、 10mM MOP S -NaOH 緩衝液（pH7. 0) で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型 PQQGDH蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例において用いた。実施例 5

酵素活性の測定

酵素活性の測定は、室温において、 10 mM MOPS-Na〇H緩衝液 ( H7. 0) 中において PMS (フエナジンメトサルフェート）一 DC I P (2， 6—ジクロ口フエノールインドフエノール）を用い、 DC I Pの 600 nmの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、 1分間に 1 mo 1の DC I Pが還元される酵素活性を 1ュニットとした。また、 DC I Pの pH 7. 0におけるモル吸光係数は 16. 3 m M—¹とした。実施例 6

粗精製酵素標品ダルコ一スに対する親和性の評価

実施例 4で得られた野生型および各改変型 P Q Q GD Hの粗精製酵素標品をそれぞれ l iMPQQ、 ImM C a C 1₂存在下で 1時間以上ホロ化した。これを 187 1ずつ分注し、 3 1の活性試薬（6mMDC I P 48 1 , 600 mMPMS 8 1, 10 mMリン酸緩衝液 p H 7. 0 16 1 ) および各濃度の D—グルコース溶液 1 Q pi 1を加え、実施例 5に示す方法により室温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、 Kmを求めた。結果を表 3に示す。

表 3

Km (mM)

野生型 26 0

G277 A 5

G277N 1 2

G 277K 8 9

G 277D 7 4

G277H 7 7

G277Q 4 3

G277 V 2 5

G 277 G 0 3

I 278 F 7 0

N279H 15 7

N452T 12, 5

N462D 12 2

N462K 0

N462 Y 20 4 これまで報告されている野生型 P Q Q G D Hのグルコースに対する Km値は約 25mMである。これに対して、今回構築した 277番目のグルタミン酸残基に変異を導入した酵素および 278番目のイソロイシンをフエ二ルァラニンに置換した酵素では、いずれもグルコースに対する Km値は 1 OmM未満であった。この結果から、本発明の改変型 PQQGDHはグルコースに対して高い親和性を有する酵素であることがわかる。実施例 7

精製酵素標品のグ^/コースに対する親和性の評価

実施例 4で得られた野生型酵素および Glu277Lys改変型酵素の精製酵素標品を用いて、実施例 6と同様にそれぞれ 1

、 ImM CaC l ₂存在下で 1時間以上ホロ化した。これを 187^ 1ずつ分注し、 3/_t lの活性試薬（6 mMDC I P48 1 , 60 OmMPMS 8^ 1, l OmMリン酸緩衝液 pH 7. 0 16^ 1) および各濃度の D—グルコース溶液 10 L 1を加え、実施例 5に示す方法により室温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、 Kmおよび Vm a Xを求めた。 Glu277Lys のグルコースに対する Km値は約 8. 8mMであり、 Vmax値は 3668UZmgであった。これまで報告されている野生型 PQQGDHのグルコースに対する Km値は約 25mMであり、 Vma X値は測定条件により 2500— 700 OUZmgである。この結果から、 Glu277Lys 改変型 P Q Q G D Hはグルコースに対する親和性が大幅に向上し、かつ、野生型 PQQGDHに匹敵する高い活性を有する酵素であることがわかる。実施例 8

基質特異性の評価

各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調べた。実施例 4で得られた野生型および各改変型 PQQGDHの粗精製酵素標品をそれぞれ 1 MPQ Q; ImM CaC 1₂存在下で 1時間以上ホロ化した。これを 187 1ずつ分注し、 3 i lの活性試薬（6mM DC I P, 60 OmM PMS, 1 OmM リン酸緩衝液 pH 7. 0を含む）および基質を加えた。基質として、それぞれ終濃度 2 OmMとなるように 40 OmMのグルコース、ラク 1 ^一スおよびマル] ^一スを 10/z l加え、室温で 30分間インキュベートして、実施例 5と同様に酵素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性を 100とし、これれに対する相対活性で表した。表 4に示されるように、本発明の改変型酵素はいずれも野生型酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を示した。

Claims

表 4 グルコースラク卜ースマル卜一ス野生型 100% 61% 61%Asp448Asn 100% 48% 36%Asn452Asp 100% 56% 50%Asn452His 100% 39% 39%Asn452Lys 100% 55% 42%Asn452Thr 100% 42% 30%Asn452Ile 100% 36% 28%Lys455Ile 100% 49% 37%Asp456Asn 100% 59% 41%Asp457Asn 100% 43% 32%Asn462Asp 100% 52% 41% 実施例 9 グルコースのアツセィ改変型 PQQGDHを用いてグルコースをアツセィした。 Glu277Lys 改変型酵素および Asn452Thr改変型酵素をそれぞれ、 l zMPQQ、 1 mM CaC 12存在下で 1時間以上ホロ化し、各種濃度のグルコースおよび 5 wMPQQ、 10 mM CaC 12存在下で酵素活性を測定した。方法は実施例 5に記載の酵素活性の測定法に準じ、 DC I Pの 600 nmの吸光度の変化を指標とした。図 3に示されるように、 Asn452Thr改変型 PQQGDHを用いて、 0. 1— 20 mMの範囲でグルコースの定量を行うことができた。また、 Glu277Lys 改変型 PQQGDHについても同様の結果が得られた。実施例 10 酵素センサ一の作製および評価 5ュニットの Glu277Lys改変型酵素および Asn452Thr改変型酵素にそれぞれカーボンペースト 2 Omgを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペース卜が約 4 Omg充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を 1%のダルタルアルデヒドを含む 10 mM M〇PS緩衝液（pH7. 0) 中で室温で 30分間処理した後、 2 OmM リジンを含む 10 mM MOPS緩衝液（pH 7. 0 ) 中で室温で 20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を 1 OmM MOPS緩衝液（pH7. 0) 中で室温で 1時間以上平衡化させた。電極は 4°Cで保存した。作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型 PQQGDHを固定化した酵素センサ一を用いて、 0. ImM— 5mMの範囲でグルコースの定量を行うことができる。産業上の利用性改変型 P Q Q G D Hはグルコースに対する親和性が高いことから、本酵素を用いてァッセィキットあるいは酵素センサ一を作成すると従来の天然型の P QQG DHを用いた場合に比べ、より低濃度のグルコース測定が可能であり、また大幅な感度の向上といつた利点が期待される。請求の範囲

1. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対する親和性が高いことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。

2. 野生型の PQQGDHと比較してグルコースに対する高い選択性を有する、請求項 1記載の改変型グルコース脱水素酵素。

3. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする P QQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q GD Hの 462番目のァスパラギン残基もしくは該残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

4. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする PQQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ GDHの 452番目のァスパラギン残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

5. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする PQQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ GDHの 455番目のリジン残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

6. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする PQQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQGDHの 456番目のァスパラギン酸残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

7. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする PQQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQ GDHの 457番目のァスパラギン酸残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

8 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とする P QQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q GD Hの 4 4 8番目のァスパラギン酸残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

9 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とする P QQグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q GD Hの第 2 6 8残基から第 2 8 9残基もしくは第 4 4 8残基から第 4 6 8残基の領域またはそれに相当する領域において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。

1 0. ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におレて、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 2 7 7番目のグルタミン酸残基もしくは該残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

1 1 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におレて、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 2 7 8番目のイソ口イシン残基もしくは該残基に相当するァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。

1 2 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の、第 2 6 8残基から 2 8 9残基または第 4 4 8残基から第 4 6 8残基の領域において、 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。

1 3 . 配列

(式中、 Xaal、 Xaa2、 Xaa3, Xaa4、 Xaa5および Xaa8は任意の天然アミノ酸残基である、ただし、 Xaalが Asnであり、 Xaa2が Lysであり、 Xaa3が Asp であり、 Xaa4力 Aspであり、かつ Xaa5が Asnであるとき、 Xaa8は Aspではない）を含む、 P Q Qグルコース脱水素酵素。

1 4. 配列：

[式中、 X a a 6およびは X a a 7は任意の天然アミノ酸残基であるが、ただし、 X a a 6が G 1 uであるとき X a a 7は I 1 eではない] を含む、 P Q Qダルコース脱水素酵素。

1 5. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 2 7 7番目のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項 1 4記載の改変型グルコース脱水素

1 6 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 2 7 8番目のイソ口イシン残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項 1 4記載の改変型グルコース脱水素

1 7 . 請求項 1— 1 6のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。

1 8 . 請求項 1 6に記載の遺伝子を含むベクター。

1 9. 請求項 1 6に記載の遺伝子を含む形質転換体。

2 0 . 請求項 1 6に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている、請求項 2 0 記載の形質転換体。

2 1 . 請求項 1— 1 6のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアツセィキット。

2 2 . 請求項 1一 1 6のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。