WO2000052512A1 - Verfahren und vorrichtung zur objektabbildung - Google Patents

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WO2000052512A1
WO2000052512A1 PCT/EP2000/001806 EP0001806W WO0052512A1 WO 2000052512 A1 WO2000052512 A1 WO 2000052512A1 EP 0001806 W EP0001806 W EP 0001806W WO 0052512 A1 WO0052512 A1 WO 0052512A1
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light
spatial
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PCT/EP2000/001806
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Rainer Heintzmann
Christoph Cremer
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Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenscaften E.V.
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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
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    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/42—Diffraction optics, i.e. systems including a diffractive element being designed for providing a diffractive effect
    • G02B27/46—Systems using spatial filters

Definitions

  • This coupling shifts the spatial frequency components of the object structure with respect to the spatial frequency interval, which is open for image acquisition in accordance with the light-optical transfer function (OTF).
  • OTF light-optical transfer function
  • the setting of predetermined object conditions is the formation of a spatial pattern of at least one object condition, on which the amount of light detected is non-linearly dependent.
  • the setting of predetermined object conditions comprises the generation of a spatial pattern of at least two different object conditions, with a dependency of the detected light quantity on a multiplicative linkage of the object conditions and a linear or a non-linear dependence of the detected light quantity on each of the object conditions consists.
  • there is a multi-linear dependence of the detected light e.g. the detected light intensity or light phase).
  • the number of sub-images depends on the number of spatial frequency components in the pattern of the light emitted by the object that can be measured and reconstructed depending on the application. This number depends in particular on the object condition used to introduce the non-linearity and on the quality of the mapping process implemented. If the number of spatial frequency components mentioned is Z, at least Z partial images are generally to be recorded. However, depending on the case, it may also be sufficient to take fewer partial images if there is sufficient information for the reconstruction of the object image. The number of partial images is fixed or set automatically depending on the quality of the object image obtained and / or manually by the user of the optical system.
  • the method according to the invention comprises in particular the following steps: (a) Adaptation of the conditions prevailing in the object which are able to influence the light emanating from an object point in such a way that a non-linear dependence of the light intensity detected by an object point on the value of at least one a spatial pattern containing an object condition is produced in at least one detected value or a linear dependence of the light intensity detected by this object point on the values of at least two spatial patterns is produced, (b) recording at least one single image under these object conditions, (c) Changing the object conditions in such a way that different spatial frequency components of the object imaged by the recording method change in their amplitude and / or phase relationship to one another, (d) recording at least one further individual image in accordance with ß (c) changed object conditions, and (e) evaluation of the measured images by using the object conditions, which differ in the individual images, in order to recover information about the object, which belong to spatial frequencies of the object, which can be obtained by simple imaging using the recording method would not be accessible.
  • An optical system for object imaging according to the invention is characterized in particular by a pattern generator which is set up for setting and changing predetermined spatial patterns of object conditions, on which the light detected by an object is non-linearly dependent, and an image generator for reconstructing the object image from the detected ones Drawing files.
  • the imaging method according to the invention has a high speed of image acquisition.
  • the imaging can e.g. B. with a CCD camera at all object points in the image plane at the same time and is therefore possible much faster than with scanning methods.
  • the invention can be implemented using a wide variety of nonlinear effects.
  • E.g. can the illumination with such an intensity that fluorescent dyes are saturated in the object.
  • This also makes it possible to discriminate different dyes or dyes in different environments (e.g. in different binding states), which would otherwise be difficult to distinguish, on the basis of different non-linear properties (saturation properties).
  • FIG. 2 shows an illustration of the object lighting in the reciprocal space with a non-linearly distorted excitation pattern
  • FIG. 5 details of an optical system according to a further embodiment of the invention
  • FIG. 8 shows a graph to illustrate the lateral resolution
  • FIG. 9 shows a graph of the effective total OTF of an optical system according to the invention (with reconstruction)
  • the formation of the object conditions with a spatial pattern means that the object conditions can be described with a certain location dependency.
  • the pattern can be characterized by a structure (e.g. a dot or line pattern) or can also have no structure (the same object conditions apply to all object points).
  • Recording partial images under different object conditions means that between the recordings the pattern itself (e.g. with a DMD reflector, see below), the position and / or orientation of the pattern relative to the sample (e.g. with a displaceable one Diffraction grating, see below) and / or an intensity property of the pattern (z. B. with a variation in the intensity of the object lighting, see below) is changed.
  • Non-linear dependency of the light emanating from the object or detected or detected with a detector if its light intensity does not measurably follow a simple linear model from the respective object condition, location of the light emission (or scattering or the like).
  • Taylor development (see below) of the detected light, higher-order terms occur ..
  • a non-linear dependence of the light intensity on one object condition or a linear dependence of the light intensity on several object conditions can be given In the latter case, mixed terms occur in the function development, which allow the expansion of the detectable object spatial frequencies explained below.
  • the “detected light intensity”, which is the light intensity measured by the detector, can deviate from the average light intensity prevailing at the location of the detector if, for example, detection is carried out in a time-modulated manner or a raw detector signal is correlated with other signals (e.g. using lock-in technology).
  • the invention not only permits object imaging with increased resolution, but also the acquisition of "information about the object". This includes in particular the spatial distribution of one or more properties of the object or other parameters, such as the position of one of its Structure known sub-object in space or the composition of the object understood.
  • Fluorescence microscopy shows objects that are marked with fluorescent dyes or that fluoresce independently. Depending on the object structure and / or marking technology, z. B. marking dyes in certain areas (e.g. in the nucleus of a biological cell).
  • the object is irradiated with a suitable excitation wavelength and the emitted fluorescence radiation is detected.
  • Fluorescent dyes emit with an intensity that is, in the first approximation, proportional to the intensity of the light irradiated at the location of the dye. In contrast to absorption microscopy, reflection microscopy or even phase contrast microscopy, the emission is generally incoherent to one another.
  • I m (x) PSF (x) ® (ßel (x) Ob (x)) (1)
  • the Fourier transform of the illumination intensity F (ßel (x)) can be represented as the sum of a large number of individual ⁇ functions.
  • parts of the Fourier-transformed object function F ( ⁇ b (x)) are shifted by the folding with the Fourier-transformed lighting function and added up with the appropriate weight. This is illustrated in FIG. 1.
  • FIG. 1 shows the structure of the excitation distribution in the reciprocal space with a sinusoidally distributed, low illumination intensity corresponding to a conventional, spatially patterned illumination.
  • the arrows pointing upwards indicate the maxima that result from the sinusoidal excitation (Fourier transform of the sine function).
  • the structure of the Fourier transform of the object function F ( ⁇ bj +1 (k)) "coupled" to the maximum k b is shown.
  • the Fourier transforms of the object function coupled to the other maxima are not shown for reasons of clarity. However, in fact, since Obj (k ) is to be folded with the virtual spatial frequency parts in the pattern of the object conditions in the reciprocal space, Obj (k) "coupled” to each virtual maximum. Only the middle part of the emitted spatial frequencies (shown as the carrier of the OTF) is accessible for detection.
  • FIG. 1 illustrates by way of example how the detectable area is determined (“punched out”) from the sum corresponding to the folding mentioned by the optical image (multiplication with the spatial frequency-limited OTF).
  • the area of detectable object spatial frequencies is determined with illumination using a specific one Patterns significantly expanded compared to the case of even lighting, with the ones below lo
  • non-linear terms of higher order in b 1 (x) also contribute to I em such as e.g. B. the terms with the factors c 5 and c 6 .
  • the Fourier transforms of these terms are also contained in F (l em ( ⁇ bj (x), b (x))).
  • Example of the relatively weak excitation intensity (linear case, Figure 1) explained, the object function is coupled to each of the components of the lighting function. All of the information, in particular about the high-frequency spatial frequencies of interest of the object function, are contained in a detector signal recorded as partial image I em . The recovery of this information is described below in connection with image reconstruction.
  • FIG. 2 illustrates the structure of the excitation distribution in the reciprocal space with a non-linearly distorted excitation pattern.
  • Obj (k) is in turn coupled to each maximum (not shown for reasons of clarity) and with shifted, differently intense and phase-rotated versions of itself superimposed, only the middle part of the emitted spatial frequencies (carrier of the OTF) is accessible to the detection.
  • the goal of optical imaging is to obtain an object image, ie the function Obj (x) describing the object.
  • This function must be reconstructed from the measured partial images I m .
  • the reconstruction of the object image is based on the fact that the factors b i (x) are extracted from the partial images I m or independent of the image acquisition. are known.
  • the differentiation according to the invention of the factors b i (x) from the function Obj (x) describing the object takes place in that the factors bi, ie the often spatially patterned object conditions, are varied.
  • the object conditions can be varied in different ways.
  • a first possibility is to form b i (x) as a spatial pattern that is shifted on the object in order to take different partial or individual images.
  • the components shown in the development according to equation (4) can be distinguished.
  • the terms contained in the Taylor development according to equation (4) are determined by solving an equation system and thus separated from one another.
  • the system of equations the determination of which is explained in detail below, can be determined and solved in principle despite the multiplication with the OTF at any point in the area of the carrier of the OTF in reciprocal space.
  • the individual components can then be put together in such a way that a high-resolution image is obtained. This can be processed with further deconvolution techniques, if necessary, in order to further increase the image quality to increase.
  • An example of the formation of a pattern of object conditions is given in the excitation of fluorescence with a location-dependent distribution of intense excitation light.
  • the non-linear dependence of the light detected by the detector can e.g. B. arise from the saturation of the excitation of fluorescent dyes present in the object. If the excitation light has a sufficiently high intensity, a non-linear relationship is obtained between the incident and the emitted light intensity on the object under consideration (see, for example, BDR Sandison et al. In the "Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press, New York and London, 2nd edition, 1995, chapter 3, pages 47 to 50; and RY Tsien et al.
  • the objects n (k) denote those for the n.
  • the calculation is preferably carried out pixel by pixel or in real space.
  • the complex-valued components Obj n (k) can now be shifted by the vector ⁇ k in the Fourier space (or by the corresponding multiplication in real space), so that the respective spatial frequency k comes to lie where it would be measured with pattern-free, uniform lighting .
  • ⁇ k here is -nk b .
  • the components Obj n k) are corrected in their complex phase position depending on the mutual phase position ⁇ n of the frequency space excitation maxima in the picture I 0 provided (multiplication by exp (- i ⁇ n )).
  • the components Obj n (k) are then combined to form a consistent image (of the desired object image), if necessary by means of a weighted addition. This enables the carrier of the total OTF to be expanded to a region that is significantly enlarged relative to the linear image, and thus an increase in the resolving power.
  • the reconstruction of the object mapping is not limited to the described solution of the system of equations using the matrix method.
  • the invention is not limited to the non-linear excitation of fluorescence emission. Accordingly, the procedure can also be implemented with any other factors bi that are suitable for influencing the intensity of the light emanating from the object on their own or in cooperation with one another, in particular in cooperation with the illumination intensity.
  • Embodiments of optical systems according to the invention are not limited to the non-linear excitation of fluorescence emission. Accordingly, the procedure can also be implemented with any other factors bi that are suitable for influencing the intensity of the light emanating from the object on their own or in cooperation with one another, in particular in cooperation with the illumination intensity.
  • FIG. 3 An optical system according to the invention is shown in FIG. 3.
  • the known components of a conventional microscope are shown with dashed frames.
  • the optical system 100 is constructed with an illumination device 10, at least one pattern generator 20, 20 ′, 20 ′′, an illumination optics 30, an imaging optics 50, a detector device 60 and an image generator 70.
  • the reference numeral 40 relates to the sample to be examined with the system 100.
  • the components 10, 30, 50 and 60 can be provided by optical components, such as those used in light microscopy and in optical measurement and analysis technology, e.g. B. the spectroscopy, are known.
  • components 30 and / or 50 can be omitted or formed by a common component. It can also be provided that the components 20 and 30 are formed by a common optical component.
  • the pattern generator 20, 20 'and / or 20 ' ' is generally a device for forming object conditions with a predetermined spatial pattern on the object 40.
  • the pattern generator 20 can be a mask with a specific one- or two-dimensional transmission characteristic in accordance with the desired pattern.
  • the mask can be formed in particular by a diffraction grating (see FIG. 4) (or phase grating) or a matrix arrangement of individually controllable reflector or transmission pixels. In the latter case, DMD devices (“digital mirror devices”) or LCD matrix arrangements are used.
  • the pattern generator can also be a mirror arrangement for generating an interference pattern (see FIG. 5) or a device for direct physical or chemical influencing of the object 40 (e.g. a heating device or an ultrasound transmitter).
  • the pattern generator can also be provided between illumination optics 30 and object 40 (component 20 ′′) or directly on object 40 (component 20 ′).
  • the image generator contains a device for reconstructing the object image in accordance with the principles explained above.
  • a specially designed circuit or an appropriately programmed computer can be used as the image generator.
  • the image generator can additionally contain memory, control and / or display components.
  • the illumination optics 30 have an excitation filter 31, a dichroic mirror 32 for coupling the excitation light into a microscope column and objective lenses 33.
  • an image of the diffraction grating 22 is Illumination for the sample to be examined is formed in the corresponding focal plane.
  • the imaging optics 50 are in turn formed by the object lenses 33, an emission filter 51 and an optionally provided optics 52 for image enlargement.
  • the detector device 60 is a CCD detector, from which data is transmitted to the image generator (not shown).
  • the diffraction grating 22 can be replaced by a DMD device or an LCD matrix arrangement which is arranged in the light path between the lighting device 10 and the object 40.
  • additional reduction optics are provided between components 20 and 40.
  • a DMD device includes e.g. B. approx. 450 "600 reflector elements with a pixel size of around 17 • 17 ⁇ m 2 .
  • the diffraction grating 22 is displaced in small steps relative to the object 40 in order to record several partial images according to the invention with different phase positions.
  • the step size depends on the structural dimension of the mask and the number of partial images to be recorded and is z. B. with 30 ⁇ m structure dimension and 7 partial images 30/7 ⁇ m).
  • a displacement of the object 40 can also be provided in the case of a fixed diffraction grating 22, but this requires additional steps of image correction when reconstructing the object image.
  • the minimum number of recordings of partial images necessary for the reconstruction of the overall image results from the number of unknowns of the associated system of equations (see above).
  • At least two partial image recordings are provided.
  • the object 40 is patterned at different angles in succession or with a mask such as, for example, with the DMD or LCD device with a two-dimensional pattern, which causes diffraction maxima in several directions of the plane, in different ways Illuminated phases in every dimension.
  • the sample (the object) 40 is illuminated with laser light.
  • the light source 10 is preferably a pulse laser (e.g. with an optical parametric oscillator which is pumped with a frequency-tripled NdYAG laser or with a Ti-sapphire laser), but can also be formed by another sufficiently intense light source .
  • the pattern generator 20 is formed by a group of flat mirrors 23-27, which are set up to split the excitation light from the light source 10 into different beam paths that strike the object 40 from different directions.
  • the excitation light is directed to the object 40 from two opposite sides using the partially transparent mirror 23 and the fully reflecting mirrors 25-27.
  • the second partially transparent mirror 24 can be provided in order to form a third excitation light path to the object 40.
  • the mirror 24 can be omitted for two-dimensional applications. The rays interfere over a range of the order of the coherence length of the light source 10.
  • the illumination optics 30 is not shown in FIG. 5 for reasons of clarity, but can, depending on the design, gig left out anyway.
  • the imaging optics 50 comprise the objective lenses 53, the emission filter for absorbing the excitation light 51 and optionally an optics 52 for enlarging the image.
  • a CCD detector 60 is again provided as the detector.
  • the excitation light can at the same time still fall from one or more directions through the lens (not shown) and / or from the side facing away from the lens onto the object 40, which lies in the difference region of the excitation light rays (cross-hatched region) ) is located.
  • the additional increase in resolution that can be achieved by non-linearities can in turn be achieved by using correspondingly strong lasers or pulsed lasers with high instantaneous intensities.
  • the use of other intense light sources e.g. flash light is also possible and advantageous.
  • the exemplary embodiments explained are based on the utilization of the non-linear dependence of the detected light on the intensity of the excitation light by saturating fluorescent dyes.
  • Alternative non-linear effects are due to the saturation of the absorption of excitation light under intensive lighting, the dependence of the phase of the emitted or scattered light on the lighting intensity present in the object, which is in the detector (e.g. via interference) or in front of it in one implements non-linear intensity dependency, SHG or GHG processes, a dependence of the light properties of the Raman scattering on Value of one or more object conditions, temporally coherent effects (e.g.
  • Rabi oscillations on atoms or molecules in the object, CARS processes, multiphoton absorption, stimulated emissions in the object, the occupation of long-lived excitation states or chemically changed states in the fluorophores or given during lighting, radiationless energy transfer processes and / or physical or chemical object conditions.
  • lighting devices with extremely short pulse lengths (e.g. ⁇ 100 fs) are preferably used .
  • the non-linear effect is based on the stimulated emission, this is induced simultaneously or in chronological order.
  • the stimulated emission can be at the same wavelength as that of the excitation light or at other wavelengths, e.g. B. induced at a typical fluorescence wavelength.
  • the physical or chemical changes in the object conditions include, in particular, the exploitation of the non-linear dependence of the light emanating from the object points on a spatially inhomogeneous electrical or magnetic field or on the pressure, shear forces or mechanical stress conditions prevailing at the object point.
  • a temperature gradient formed on the object can also be provided according to a certain pattern, which is the creates the desired multi-linear dependence of the light emanating from the object point on the prevailing temperature.
  • a multi-linear dependency of the light emanating from the object point on the chemical conditions prevailing there e.g. pH value
  • object irradiation with radio waves, microwaves, infrared light, X-rays or even sound waves or ultrasound waves can be used.
  • the pattern generator is adapted accordingly to implement the effects mentioned.
  • the pattern generator can comprise an additional irradiation device, the emission of which is focused on the object.
  • Figure 7 shows the associated reconstruction results.
  • Figure 7a repeats the original image of the simulation.
  • After convolution with the point spread function of a simulated microscope and a Poisson-distributed noise (Max 560 photons) results 7b.
  • FIG. 7c There was no amplification of high spatial frequencies. If the system's own high-frequency amplification is also carried out, the image according to FIG. 7e results from FIG. 7c.
  • FIG. 7b would only result in an image with according to FIG. 7d.
  • the comparison of the images in FIG. 7e and FIG. 7d shows the superiority of the method according to the invention of the reconstruction of high spatial frequencies from the recording of several partial images.
  • Figure 8 illustrates the improvement in resolution with the inventive method.
  • the intensity is shown on a reference line along the second vertical column in the dot matrix (top left in the original image) in FIGS. 7d and 7e.
  • the solid line corresponds to the result of the method according to the invention.
  • the individual points are clearly recognizable as maxima.
  • the conventional method epifluorescence with subsequent high-frequency amplification
  • only the first point (partially) and a maximum between the two lowest points can be seen.
  • the resolution is improved by a factor of more than 3.
  • FIG. 9 shows a lateral section through the simulated effective optical transfer function of the overall system according to FIG. 4.
  • the grating spacing of the diffraction grating was chosen here such that only the diffraction orders 0, +1 and -1 of the diffraction grid can be transmitted through the lens.
  • the partial saturation of the dyes involved results in a non-linear relationship between the excitation intensity and the probability of excitation of a dye molecule at a point in the object space.
  • This spatially varying probability of excitation is also referred to as an excitation pattern. If one assumes that the excitation probability for a certain dye molecule is a function of the excitation intensity, a non-linearity of this function leads to spatially higher harmonics of the excitation pattern also occurring in the emission pattern.

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Gewinnung einer Objektabbildung mindestens eines Objekts (40) beschrieben, wobei mindestens zwei Teilbilder des Objekts (40) unter jeweils verschiedenen Objektbedingungen aufgenommen werden, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektierten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingungen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beträge verschiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfrequenzanteile die gewünschte Objektabbildung ermittelt wird. Es werden auch optische Systeme (100) zur Umsetzung eines derartigen Verfahrens beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Objektabbildung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Objektabbildung mit hohem räumlichen Auflösungsvermögen, insbesondere ein lichtmikroskopisches Abbildungsverfahren, und Vorrichtungen zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
Das Auflösungsvermögen optischer Abbildungssysteme wird oft entscheidend durch die objektseitige Apertur einer Objektivlinse und deren Brechzahl bestimmt. Von einem Objekt ausgehendes Licht kann nur erfasst werden, wenn es innerhalb des Akzeptanzwinkels des Objektivs auf dieses trifft. Je höher das Auflösungsvermögen ist, desto höhere Orts- oder Raumfrequenzen der abzubildenden Objektstruktur können erfasst werden. Die Erfassung der Raumfrequenzen wird durch die lichtoptische Transferfunktion oder Modulationsübertragungsfunktion (im Folgenden: OTF) des optischen Systems beschrieben. Die OTF gibt an, welche Raumfrequenzen, aus denen sich das. Objekt mittels Fouriertransformation zusammengesetzt konstruieren lässt, bei der optischen Abbildung erhalten bleiben, bzw. wie Raumfrequenzanteile geschwächt werden. Das Auflösungsvermögen des optischen Systems (z. B. eines Lichtmikroskops) ist durch den Bereich bestimmt, in dem die OTF des Systems nicht verschwindet. Verschwindet die OTF in Abschnitten des reziproken Raumes vollständig, so ist es unmöglich, ohne zusätzliche Annahmen über die Objektstruktur (z. B. räumliche Beschränktheit, Positivität) die entsprechenden Raumfrequenzen in einer Objektabbildung zu rekonstruieren. Es besteht allgemein ein Interesse an der Ausdehnung der OTF auf einen möglichst großen Bereich im reziproken Raum, um die Auflösung des optischen Systems zu erhöhen. Herkömmliche Verfahren zur Erhöhung des Auflösungsvermögens sind insbesondere auf eine geeignete Wahl der Objektbeleuchtung gerichtet. So wird bspw. beim konfokalen Mikroskop mit einem fokussierten Lichtstrahl das Objekt von einer Seite möglichst punktweise beleuchtet und gleichzeitig abgetastet (gescannt) , wobei oft die Detektion mittels einer Blende auf einen kleinen Bereich des Objekts begrenzt wird (siehe z. B. US-A 4 631 581) .
Bei dem in EP 0 491 289 beschriebenen 4Pi-Mikroskop wird von beiden Objektseiten kohärent beleuchtet und je nach Ausführung auch detektiert. Beim Wellenfeld ikroskop wird üblicherweise mit kohärenten ebenen Lichtwellen von gegenüberliegenden Seiten beleuchtet (siehe z. B. US-A 4 621 911; F. Lanny et al. in „Bioimaging", Band 1, 1993, Seite 187 ff.; US-A 5 801 881) . Beim I5M-Mikroskop wird sowohl kohärent von beiden Seiten beleuchtet, als auch kohärent detektiert, indem die beiden Bilder des Objekts auf einem ortsauflösenden Detektor zur Interferenz gebracht werden (siehe US-A 5 671 085; M.G.L. Gustafsson et al . in „Proceedings of SPIE", Band 2655, 1996, Seite 62 ff.). Von E.H.K. Stelzer et al . in „Opt . Commun" Band 111, 1994, Seite 536 ff. und S. Lindeck et al. in „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Herausgeber J.B. Pawley, Plenum Press, New York 1995, Kapitel 26, Seite 417 ff. wird ein Theta-Mikroskop beschrieben, bei dem Licht von drei Seiten detektiert wird, wobei mit konfokaler oder 4Pi- ähnlicher Beleuchtung gearbeitet wird. Da bei der seitlichen Detektion in der Objektebene die Auflösung entlang der optischen Achse der Beleuchtung besonders groß ist, erhält man insgesamt ein verkleinertes Fokusvolumen.
Es ist auch bekannt, in stereomikroskopischen Oberflächentopographie-Verfahren eine räumlich variierende Beleuchtung (z, B. sinus-förmig variierend) zu verwenden. Durch Verrechnung der gemessenen Bilder kann auf die Oberflächenstruktur des Objekts rückgeschlossen werden (siehe z. B. US-A 4 525 858; R. Windecker et al. in „Optical Engineering", Band 36, 1997, Seite 3372 ff. ) .
Ein Verfahren zur hochauflösenden dreidimensionalen Bildge- bung durch Erfassung optischer Schnitte des Objekts ähnlich zur konfokalen Mikroskopie ist in WO 97/31282 beschrieben. Es basiert auf der Aufnahme mehrerer Bilder mit jeweils unterschiedlichen Mustern aus Beleuchtungslochblenden und zugehörigen Detektionslochblenden. Durch geeignete Rekonstruktionsverfahren lässt sich aus den aufgenommenen Daten ein Bild berechnen, das dem eines konfokalen Mikroskops äquivalent ist. Dieses Verfahren wird auch als „Aperture Correlation Micros- copy" bezeichnet (siehe auch R. Juskaitis et al . in „Nature" Band 383, 1996, Seite 804 ff., T. Wilson et al. in „Procee- dings of the SPIE", Band 2984, 1997, Seite 21 ff.). Aus WO 98/45745 ist ein Verfahren bekannt, das auf der Beleuchtung unter Abbildung eines Beugungsgitters oder mit zwei interfer- rierenden Laserstrahlen beruht (siehe auch T. Wilson et al . in „Cell Vision", Band 4, 1997, Seite 231 ff.). In der Publikation von R. Heintzmann et al . in „Proceedings of SPIE" Band 3568, 1999, Seite 185 ff. wird ein ähnliches Verfahren zur lateralen Erhöhung des Auflösungsvermögens eingesetzt.
Die herkömmlichen Techniken besitzen die folgenden Nachteile. Die Abbildungsverfahren sind mit einem relativ großen technischen Aufwand verbunden. So ist insbesondere bei den 4Pi-, I5M- und Theta-Mikroskopen die Justierung besonders schwierig. Die Verfahren sind außerdem nur schwer zu realisieren, da sie lediglich mit großem Aufwand in vorhandene Mikroskopsysteme integrierbar sind. Beim Wellenfeldmikroskop ist es ein großes Problem, dass die OTF in axialer Richtung Be- reiche aufweist, an denen sie verschwindet. Außerdem liefert das Wellenfeldmikroskop bzw. das 4Pi-Mikroskop in lateraler Richtung, verglichen mit der herkömmlichen Epi-Fluoreszenz- Mikroskopie bzw. der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie, keinen Auflösungsgewinn.
Des Weiteren sind viele Verfahren (insbesondere die konfokale Laserscanning-4Pi- und Theta-Mikroskopie) mit einem punktweisen Abrastern des Objekts verbunden. Dies ist zeitaufwendig und vor allem bei der Bildgebung zeitabhängiger Vorgänge problematisch. Abtastende Verfahren benötigen sehr schnelle Detektoren (z. B. Photomultiplier) , die jedoch gegenüber langsameren Detektoren mit Ortsauflösung (z. B. CCD's) oft eine deutlich niedrigere Detektionseffizienz besitzen. Bei der Fluoreszenz-Mikroskopie kommt noch erschwerend hinzu, dass die sinnvolle Beleuchtungsstärke durch die maximale Anregungsrate der Farbstoffe im Fokus beschränkt ist. Dies begrenzt die maximale Abtastgeschwindigkeit zusätzlich.
Es sind auch mikroskopische Abbildungsverfahren auf der Basis nicht-linearer Effekte bekannt. So wird bspw. in US-A-5 034 613, US-A-5 777 732, US-A-5 828 459 und US-A-5 796 112 die sog. Mehrphotonen-Mikroskopie beschrieben. Der konfokale Effekt wird dabei durch die gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen an bestimmten Objektorten erzielt. Andere Techniken basieren auf der stimulierten Emission (siehe US-A-5 731 588, DE-OS 44 16 558) oder dem Entvölkern des Grundzustandes von Fluoreszenz-Molekülen, indem diese gezielt in den längerlebi- gen Triplettzustand gepumpt werden (siehe S.W. Hell et al. in „Applied Physics B", Band 60, 1995, Seite 495 ff.).
Mit den Verfahren auf der Grundlage nicht-linearer optischer Effekte konnte bisher keine erhebliche Erhöhung des Auflösungsvermögens erreicht werden. Dies hängt insbesondere damit zusammen, dass zur Erzielung von Mehrphotonen-Absorptionen die einzelnen Photonen relativ geringe Energien und somit große Wellenlängen besitzen müssen. Außerdem ist die Übertra- gungseffienz bei hohen Raumfrequenzen im Allgemeinen sehr schlecht, weil typischerweise nur ein sehr kleiner Teil des Beleuchtungsmusters hohe Raumfrequenzen enthält.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Abbildungsverfahren mit einem hohen Auflösungsvermögen anzugeben. Das Verfahren soll insbesondere die o. g. Nachteile herkömmlicher Mikroskopie-Verfahren überwinden, mit einem vereinfachten technischen Aufwand realisierbar sein, eine schnelle Bildaufnahme auch zeitabhängiger Vorgänge erlauben und mit herkömmlichen optischen Systemen kompatibel sein. Das erfindungsgemäße Verfahren soll des Weiteren ermöglichen, bekannte mikroskopische Verfahren unter Beibehaltung ihrer jeweiligen Vorteile so zu erweitern, dass das Auflösungsvermögen zusätzlich gesteigert wird. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein optisches System zur Durchführung derart verbesserter Verfahren anzugeben.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und ein optisches System mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 14 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung ist es, zur Gewinnung einer Objektabbildung (Bild einer Objektstruktur) mindestens zwei Teilbilder eines Objekts unter jeweils verschiedenen Objektbedingungen aufzunehmen, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektier- ten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingungen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beiträge ver- schiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfrequenzanteile die gewünschte Objektabbildung zu gewinnen. Die Einstellung von Objektbedingungen mit verschiedenen räumlichen Mustern zur Erfassung der verschiedenen Teilbilder besitzt den Vorteil, dass virtuell nieder- und höherfrequente Raumfrequenzanteile im Muster der Objektbedingungen erzeugt werden, an die die Raumfrequenzanteile der Objektstruktur gekoppelt sind. Durch diese Kopplung werden die Raumfrequenzanteile der Objektstruktur in Bezug auf das Raumfrequenzintervall verschoben, das entsprechend der lichtoptischen Transferfunktion (OTF) für eine Bilderfassung offen ist. Aus den Teilbildern kann die vollständige Objektabbildung mit einem entsprechend erweiterten Raumfrequenzbereich rekonstruiert werden.
Durch Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen vom Objekt ausgehenden Licht und dem lokalen, objektpunktbe- zogenen Wert einer weiteren räumlichen veränderlichen Größe (z. B. der lokalen Einstrahlungs- oder Beleuchtungsintensität) lässt sich der vom Gesamtsystem effektiv übertragene Raumfrequenzbereich beträchtlich erweitern. Durch lokale Variation der Einflussgröße und die Aufnahme mehrerer Teilbilder lässt sich eine Objektabbildung rekonstruieren, deren Auflösung aufgrund der Nicht-Linearität fundamental höher als die durch das Abbe-Limit gegebene Auflösung ist. Zur Erzeugung nicht-linearer Effekte können verschiedene Möglichkeiten anwendungsabhängig gewählt werden. Ebenfalls ist die Gewinnung der Objektabbildung aus den Teilbildern anwendungsabhängig mit verschiedenen Arten der Datenauswertung möglich.
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen mit verschiedenen räumlichen Mustern. Am Objekt werden entsprechend dem jeweiligen Muster punktweise Objektbedingungen eingestellt, von denen das er- fasste Licht nicht-linear abhangig ist. Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform der Erfindung ist die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen die Bildung eines raumlichen Musters mindestens einer Objektbedingung, von der die erfasste Lichtmenge jeweils nicht-linear abhangig ist. Gemäß einer abgewandelten Ausfuhrungsform der Erfindung umfasst die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen die Erzeugung eines raumlichen Musters von mindestens zwei verschiedenen Objektbedingungen, wobei eine Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von einer multiplikativen Verknüpfung der Objektbedingungen und eine lineare oder eine nicht-lineare Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von jeder der Objektbedingungen besteht. Allgemein wird von einer multi-linearen Abhängigkeit des erfassten Lichtes (z. B. der erfassten Lichtmtensitat oder Lichtphase) gesprochen.
Die Zahl der Teilbilder ist abhangig von der Zahl der bei der Bildrekonstruktion meßbaren und anwendungsabhangig zu berücksichtigenden Raumfrequenzanteile im Muster des vom Objekt ausgesandten Lichtes. Diese Zahl ist insbesondere von der verwendeten Objektbedingung zur Einfuhrung der Nicht- Linearitat und von der Qualität des realisierten Abbildungsverfahrens abhangig. Betragt die Anzahl der genannten Raumfrequenzanteile Z, so sind in der Regel mindestens Z Teilbilder aufzunehmen. Es kann aber fallabhangig auch ausreichend sein, weniger Teilbilder aufzunehmen, wenn genügend Informationen zur Rekonstruktion der Objektabbildung vorliegen. Die Zahl der Teilbilder wird fest eingestellt oder automatisch in Abhängigkeit von der Qualität der gewonnenen Objektabbildung und/oder manuell vom Nutzer des optischen Systems eingestellt . Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt insbesondere die folgenden Schritte: (a) Anpassung der im Objekt herrschenden Bedingungen, die das von einem Objektpunkt ausgehende Licht zu beeinflussen imstande sind derart, daß eine nicht-lineare Abhängigkeit der von einem Objektpunkt detektierten Lichtintensität von dem Wert eines in mindestens einer Objektbedingung enthaltenen räumlichen Musters in mindestens einem detektierten Wert hervorgerufen wird oder eine jeweils zu einem Wert lineare Abhängigkeit der von diesem Objektpunkt detektierten Lichtintensität von den Werten mindestens zweier räumlicher Muster hervorgerufen wird, (b) Aufzeichnung mindestens eines Einzelbildes unter diesen Objektbedingungen, (c) Ändern der Objektbedingungen derart, daß unterschiedliche durch das Aufnahmeverfahren abgebildete Raumfrequenzanteile des Objekts sich in ihrer Amplitude und/oder Phasenbeziehung zueinander verändern, (d) Aufzeichnung wenigstens eines weiteren Einzelbildes unter jeweils gemäß (c) veränderten Objektbedingungen, und (e) Auswertung der gemessenen Bilder, indem die sich in den Einzelbildern unterschiedlich ausprägenden Objektbedingungen genutzt werden, um Informationen über das Objekt zurückzugewinnen, die zu Raumfrequenzen des Objekts gehören, welche durch eine einfache Abbildung mit dem Aufnahmeverfahren nicht zugänglich wären.
Ein erfindungsgemäßes optisches System zur Objektabbildung zeichnet sich insbesondere durch einen Mustergenerator, der zur Einstellung und Veränderung vorbestimmter räumlicher Muster von Objektbedingungen eingerichtet ist, von denen das von einem Objekt detektierte Licht nicht-linear abhängig ist, und einen Bildgenerator zur Rekonstruktion der Objektabbildung aus den erfassten Teilbildern aus.
Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Die Gewinnung von Objektabbildungen ist relativ einfach realisierbar. Die Justierung des optischen Systems beschränkt sich auf einen minimalen Justierungsaufwand. Die Erfindung kann durch Nachrüstung bestehender Abbildungssysteme implementiert werden.
Von besonderem Vorteil ist, dass hohe Raumfrequenzen, die in Abbildungsobjektiven ggf. stark unterdrückt werden, nun durch die Verschiebung im Frequenzraum effizienter detektiert werden können. Zusätzlich zum lateralen Auflösungsgewinn ergibt sich auch ein axialer Auflösungsgewinn und die Möglichkeit, zur optischen Achse senkrecht stehende Ebenen in axialer Richtung zu diskriminieren. Damit liefert die Erfindung vorteilhafte Verwendungen wie die Konfokalmikroskopie. Auch in axialer Richtung ergibt sich bei Ausnutzung der nichtlinearen Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von den Objektbedingungen die Möglichkeit zu einem erheblichen Auflösungsgewinn.
Die Erfindung ist mit Vorteil in Kombination mit herkömmlichen Abbildungsverfahren, insbesondere Mikroskopieverfahren, anwendbar. Dies betrifft insbesondere die o. g. Techniken und die Absorptionsmikroskopie, die Reflektionsmikroskopie, die ortsaufgelöste Abbildung von Fluoreszenzlebensdauern (sog. „Fluorescence Lifetime Imaging"), die Mehrphotonenmikroskopie, Interferenzmikroskopie, Konfokalmikroskopie usw..
Das erfindungsgemäße Abbildungsverfahren besitzt eine hohe Geschwindigkeit der Bildaufnahme. Die Bildgebung kann z. B. mit einer CCD-Kamera an allen Objektpunkten in der Bildebene gleichzeitig erfolgen und ist daher deutlich schneller möglich, als bei abtastenden Verfahren.
Die Erfindung ist unter Verwendung der verschiedenartigsten nicht-linearen Effekte realisierbar. Bspw. kann in einem Fluoreszenzmikroskop die Beleuchtung mit einer derartigen In- tensität erfolgen, dass Fluoreszenzfarbstoffe im Objekt gesättigt werden. Dies ermöglicht auch, verschiedene Farbstoffe oder Farbstoffe in verschiedenen Umgebungen (z. B. in verschiedenen Bindungsgzuständen) , die sonst schlecht zu unterscheiden wären, aufgrund verschiedener nicht-linearer Eigenschaften (Sättigungseigenschaften) zu diskriminieren.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im Folgenden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Figur 1 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei sinusförmiger Beleuchtung mit geringer Intensität,
Figur 2 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei einem nicht-linear verzerrten Anregungsmuster,
Figur 3 eine Blockdarstellung eines erfindungsgemäßen optischen Systems,
Figur 4 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung,
Figur 5 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung,
Figuren 6 und 7 Simulationsergebnisse zur Illustration eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Figur 8 eine Kurvendarstellung zur Illustration des lateralen Auflösungsvermögens, Figur 9 eine Kurvendarstellung der effektiven Ge- samt-OTF eines erfindungsgemäßen optischen Systems (mit Rekonstruktion) , und
Figur 10 Beispiele vom Objektabbildungen.
Die Erfindung wird im Folgenden zunächst anhand der theoretischen Grundlagen und anschließend an verschiedenen Beispielen erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die gegebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Insbesondere im Rahmen der folgenden Begriffsbestimmung sind abgewandelte Ausführungsformen unter entsprechend variierten Objektbedingungen anwendungsabhängig realisierbar.
Der bei einer optischen Abbildung zu erfassende Gegenstand oder Teilabschnitte des Gegenstands werden im Folgenden allgemein als „Objekt" bezeichnet. Objekte sind insbesondere alle Formen von biologischen oder synthetischen Proben, wie sie mit herkömmlichen Abbildungsverfahren und ortsauflösenden Analyseverfahren, insbesondere Mikroskopie und Spektroskopie- Verfahren, untersucht werden. Anwendungen ergeben sich z. B. in der Biologie, Medizin, Chemie, Halbleitertechnik, Einzelmolekülspektroskopie u. dgl .. Das Objekt kann fest, flüssig oder auch gasförmig sein.
Unter „Objektbedingungen" werden allgemein alle Parameter und/oder Bedingungen am Ort des Objektes verstanden, mit denen eine oder mehrere Eigenschaften des vom Objekt ausgehenden Lichtes beeinflussbar sind. Zu diesen Eigenschaften zählen insbesondere die Intensität, der Polarisationszustand, die Phase, die Farbe, die Pulsform, die Pulslänge, der Kohärenzgrad, die Photonenkorrelation und dergleichen. Objektbedingungen können inhärente physikalische oder chemische Ei- genschaften des Objekts, wie z. B. eine bestimmte stoffliche Zusammensetzung, eine Temperaturverteilung oder eine Druckverteilung, oder von außen aufgeprägte Parameter, wie z. B. die Beleuchtungsintensität auf der Objektoberfläche oder im Objekt, umfassen.
Die Ausbildung der Objektbedingungen mit einem räumlichen Muster bedeutet, daß die Objektbedingungen mit einer bestimmten Ortsabhängigkeit beschrieben werden können. Das Muster kann durch eine Struktur (z. B. ein Punkt- oder Strichmuster) charakterisiert sein oder auch strukturlos sein (für alle Objektpunkte gelten die gleichen Objektbedingungen). Die Aufnahme von Teilbilder unter verschiedenen Objektbedingungen bedeutet, daß zwischen den Aufnahmen das Muster an sich (z. B. mit einem DMD-Reflektor, s. u.), die Position und/oder Orientierung des Musters relativ zur Probe (z. B. mit einem verschiebbaren Beugungsgitter, s. u.) und/oder eine Intensitätseigenschaft des Musters (z. B. mit einer Variation der Intensität der Objektbeleuchtung, s. u.) verändert wird.
Eine „nicht-lineare Abhängigkeit" des vom Objekt ausgehenden bzw. mit einem Detektor erfassten oder detektierten Lichtes ist gegeben, wenn dessen Lichtintensität von der jeweiligen Objektbedingung Ort der Lichtaussendung (oder -Streuung oder dergleichen) messbar keinem einfachen linearen Modell folgt. In einer Funktionenentwicklung, z. B. Taylor-Entwicklung (siehe unten), des detektierten Lichts treten Terme höherer Ordnung auf. Gemäß den o. g. Ausführungsformen der Erfindung kann eine nicht-lineare Abhängigkeit der Lichtintensität jeweils von einer Objektbedingung oder eine lineare Abhängigkeit der Lichtintensität von mehreren Objektbedingungen gegeben sein. Im letzteren Fall treten in der Funktionenentwicklung Mischterme auf, die die unten erläuterte Erweiterung der detektierbaren Objekt-Raumfrequenzen erlauben. Die „detektierte Lichtintensität", die die vom Detektor gemessene Lichtintensität ist, kann anwendungsabhängig je nach Funktionalität des Detektors von der am Ort des Detektors herrschenden mittleren Lichtintensität abweichen, wenn z. B. zeitlich moduliert detektiert wird oder ein rohes Detektorsignal mit anderen Signalen korreliert wird (z. B. durch Lock- In-Technik) .
Unter einem „Teilbild" oder „Einzelbild" werden allgemein Bilddaten verstanden, die mit einem in weitesten Sinne abbildenden lichtoptischen Verfahren aufgenommen wurden. Es kann sich dabei um einen einzelnen Datenpunkt, mehrere an ein oder verschiedenen Objektpunkten aufgenommene Datenpunkte oder Da- tenpunktbereiche in ein, zwei, drei oder mehr Dimensionen handeln. Die erfindungsgemäße Änderung von Objektbedingungen bei Aufnahme verschiedener Teilbilder kann sich auf eine Änderung oder Modulierung bei jedem Datenpunkt, für Abschnitte oder Gruppen von Datenpunkten oder für ganze zwei- oder dreidimensionale Bilder oder sogar Zeitserien vorgesehen sein.
Unter „detektierbaren Raumfrequenzanteilen" werden allgemein die Anteile des Frequenzraums der Fouriertransformierten des Objekts verstanden, die mit dem jeweils angewendeten Abbildungsverfahren prinzipiell detektierbar sind.
Die Erfindung erlaubt nicht nur eine Objektabbildung mit erhöhtem Auflösungsvermögen, sondern auch die Gewinnung von „Informationen über das Objekt". Hierunter werden insbesondere die räumliche Verteilung einer oder mehrerer Eigenschaften des Objekts oder auch andere Parameter, wie z. B. die Position eines von seiner Struktur her bekannten Teilobjekts im Raum oder die Zusammensetzung des Objekts, verstanden. Grundlagen der Bilderfassung
Die Bildaufnahme wird im Folgenden am Beispiel der Fluoreszenzmikroskopie erläutert. In der Fluoreszenzmikroskopie werden Objekte abgebildet, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind oder selbststandig fluoreszieren. Je nach Objektstruktur und/oder Markierungstechnik sammeln sich z. B. Markierungsfarbstoffe m bestimmten Teilbereichen (z. B. im Zellkern einer biologischen Zelle) . Zur Bildaufnahme wird das Objekt mit einer geeigneten Anregungswellenlange bestrahlt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung detektiert. Fluoreszenzfarbstoffe emittieren mit einer Intensität, die m ersten Näherung proportional zur Intensität des am Ort des Farbstoffs eingestrahlten Lichtes ist. Die Emission erfolgt im Unterschied zur Absorptionsmikroskopie, Reflektionsmikrosko- pie oder auch Phasenkontrastmikroskopie im allgemeinen inkohärent zueinander. Unter Annahme einer Proportionalität zwischen der an einem Objektpunkt ausgestrahlten Fluoreszenzm- tensitat zur dort eingestrahlten Lichtmtensitat des Anre- gungslichts lasst sich ein detektiertes Bild Im(x) (ruckuber- setzt m Objektraumkoordinaten x) wie folgt beschreiben. Die ortsabhangige Beleuchtungsmtensitat (Bel(x)) wird mit der am jeweiligen Objektpunkt vorhandenen Farbstoffkonzentration Obj (x) (Objektstruktur) multipliziert und das Ergebnis mit der Punktbildfunktion („Point Spread Function", PSF) des abbildenden Systems gefaltet (siehe Gleichung (1) ) .
Im(x) = PSF(x) ® (ßel(x) Ob(x)) ( 1 )
Im reziproken Raum übersetzt sich dies m die Faltung der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion F(Bel(x)) mit der fouriertransformierten Ob ektfunktion F(Obj(x)) und anschließende Multiplikation mit der lichtoptischen Transferfunktion OTF(i) (F bezeichnet hier und im Folgenden die Fourierforma- tion, die Koordinaten im reziproken Raum werden mit k bezeichnet) . Analog zu Gleichung (1) ergibt sich:
F(lm(x)) = OTF(k) • (F(Bel(x)) ® F(θbj(x)))
Verallgemeinert auf andere Mikroskopieverfahren bedeutet Obj (x) den jeweiligen Wert oder die Dichte der Eigenschaften des Objekts, die zu erfassen ist, und PSF(x) die effektive Punktbildfunkion des gesamten Systems (Bildaufnahme und -re- konstruktion) . Auch bei iterativen oder nicht-linearen Rekonstruktionsverfahren gilt dies oft noch näherungsweise.
In herkömmlichen abbildenden Systemen ist der im Wert von Null verschiedene Bereich der OTF, der auch als „Träger" bezeichnet wird, durch die numerische Apertur und die Wellenlänge des abzubildenden Lichts auf einen gewissen Raumfrequenzbereich eingeschränkt (siehe auch US-A-5 671 085). Gleichermaßen ist auch die Fouriertranformierte der Beleuchtungsfunktion F(Bel(x)) in der Ausdehnung ihres Trägers durch die Lichtwellenlänge und ggf. Aperturen des Beleuchtungssystems eingeschränkt .
Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, den effektiven Bereich von detektierbaren Raumfrequenzen des Objekts F(Obj(x)) („Objekt-Raumfrequenzen") auf der Grundlage der folgenden Überlegungen zu erweitern. Bei Einführung einer nicht-linearen Abhängigkeit der erfassten Lichtintensität von den Objektbedingungen ist der rechte Teil von Gleichung (1) verallgemeinert gemäß den Ausdrücken (2) bzw. (3) zu schreiben:
PSF(x) ® Iem(Obj(x), b(x)) ( 2 ) => OTF(k) ' F(lem(θbj(x), b(x))) (3) Entsprechend dem Ausdruck (2) wird kein linearer Zusammenhang zwischen der von einem Objektpunkt ausgehenden Lichtintensität Iem(x) und der dort eingestrahlten Lichtintensität (enthalten in b(x)) vorausgesetzt. Vielmehr ist nun Iem( ) eine allgemeine Funktion des Wertes der zu erfassenden Objektstruktur und anderer Faktoren b(x) , die die nicht-linearen
Bedingungen repräsentieren. Der Vektorpfeil über b soll andeuten, dass es sich um mehrere Bedingungen oder Eigenschaften bi handeln kann. Ein wichtiger Faktor bi ist die am Ort x eingestrahlte Lichtintensität Bel(x). Andere Faktoren werden unten beispielhaft genannt. Gemäß Gleichung (4) wird Iem(x) als Taylor-Reihe mit konstanten Koeffizienten Ci angenähert ausgedrückt :
ϊ-em ≡ A + A • Obj(x) + C2 • b-. (x) + C3 ' Obj(x) • b- (x)
+ c4 ' Obj(x)2 • b- x) + c5 • Obj(x) • b^x)2 + ...
+ c6 • Obj(x) ' b^x)3 + ... (4)
Zur vereinfachten Darstellung wird in Gleichung (4) nur auf eine nicht-lineare Bedingung bι(x) Bezug genommen. Anwendungsabhängig können weitere Bedingungen in den Prozess der Aussendung von Licht vom jeweiligen Objektpunkt involviert sein. In diesem Fall treten entsprechende Terme auch in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) auf, so insbesondere auch
Mischterme wie z. B. c5b ' Obj(x) ' b^x) ' b2(x) . Der Term nach c3 ist gerade der in Gleichung (1) genannte Ausdruck, wenn als nicht-lineare Objektbedingung b.(x) = Bel(x) angenommen wird. Die Fouriertransformierte der ausgesandten Lichtintensität F(lem(θbj(x), b(x)j) enthält demnach analog zu Gleichung (1) den
Term c3 • F(ßel(x)) ® F(θbj(x)) . Die Fouriertranformierte der Beleuchtungsmtensitat F(ßel(x)) ist als Summe einer Vielzahl von einzelnen δ-Funktionen darstellbar. Je nach dem aktuellen Beleuchtungsmuster werden also Teile der fouriertransformierten Ob ektfunktion F(θb(x)) durch die Faltung mit der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion verschoben und mit entsprechendem Gewicht aufaddiert. Dies ist m Figur 1 illustriert.
Figur 1 zeigt die Struktur der Anregungsverteilung im reziproken Raum bei sinusförmig verteilter, geringer Beleuchtungsmtensitat entsprechend einer herkömmlichen, raumlich gemusterten Beleuchtung. Die nach oben gerichteten Pfeile bezeichnen die Maxima, die aus der sinusförmigen Anregung herrühren (Fouriertransformierte der Sinusfunktion) . Zusatzlich ist die an das Maximum kb „gekoppelte" Struktur der Fouriertransformierten der Objektfunktion F(θbj+1(k)) eingezeichnet. Die an die anderen Maxima gekoppelten Fouriertransformierten der Objektfunktion sind aus Ubersichtlichkeitsgrunden nicht eingezeichnet. Tatsächlich ist jedoch, da Obj(k) mit den virtuellen Raumfrequenzteilen im Muster der Objektbedingungen im reziproken Raum zu falten ist, Obj (k) an jedes virtuelle Maximum „gekoppelt". Nur der mittlere Teil an emittierten Raumfrequenzen (als Trager der OTF eingezeichnet) ist der Detektion zugänglich.
In Figur 1 ist beispielhaft illustriert, wie aus der Summe entsprechend der genannten Faltung durch die optische Abbildung (Multiplikation mit der raumfrequenzbegrenzten OTF) der detektierbare Bereich festgelegt („ausgestanzt") wird. Der Bereich detektierbarer Ob ekt-Raumfrequenzen wird bei Beleuchtung mit einem bestimmten Muster deutlich gegenüber dem Fall einer gleichmäßigen Beleuchtung erweitert. Mit den unten lo
erläuterten Rekonstruktionsverfahren lassen sich die verschobenen Objekt-Raumfrequenzen wieder zu einem konsistenten Bild zusammensetzen.
Entsprechend Gleichung (4) liefern im nicht-linearen Fall aber auch Terme höherer Ordnung in b1(x) Beiträge zu Iem wie z. B. die Terme mit den Faktoren c5 bzw. c6. Die Fouriertransformierten dieser Terme sind auch in F(lem(θbj(x), b(x))) enthalten. Mit b1(x) = Bel(x) erhält man im Ausdruck (2) auch den Term c5 ' JF(Bel(x)) ® F(Bel(x))] ® F(θbj(x)) . Mit einem gewissen
Anteil im Bild ist es jetzt möglich, Raumfrequenzen des Objekts zu messen, die vorher noch nicht zugänglich waren, da sie durch die Faltung mit der raumfrequenzbegrenzten Funktion F(ßel(x)) noch nicht in den mittels OTF detektierbaren Bereich geschoben werden konnten. Die Ausdehnung des Trägers von F(ßel(x)) ® F(ßel(x)) kann nun aber entsprechend größer sein, wodurch sich auch höhere Raumfrequenzen in den der OTF entsprechenden Bereich verschieben und so in der Abbildung messbar sind. Weitere höhere Ordnungen wirken sich entsprechend in weiteren Faltungen mit den Fouriertransformierten der bi(x) aus, so dass noch höhere Objekt-Raumfrequenzen detektierbar sind. Im Prinzip ist es möglich, beliebig hohe Raumfrequenzen des Objekts zu detektieren und damit die Auflösung beliebig zu erhöhen, soweit entsprechende Koeffizienten in der Reihenentwicklung gemäß Gleichung (4) vorhanden sind. In der Praxis wird die bei der Rekonstruktion erzielbare Auflösung jedoch oft durch das bei den hohen Objekt-Raumfrequenzen erreichbare Signal-Rausch-Verhältnis begrenzt.
Das effektive Auftreten nieder- und höherfrequenter Komponenten des Beleuchtungsmusters im reziproken Raum ist in Figur 2 am Beispiel der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Wird das Objekt mit einer genügend hohen Beleuchtungsintensität be- strahlt, so ergibt sich eine nicht-lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) und damit ein Muster der Anregbarkeit von Fluoreszenz (im Folgenden: Anregungsmuster) eines bestimmten Farbstoffes, das grundsätzlich aus unendlich vielen (virtuellen) Maxima im reziproken Raum besteht, deren absolute Höhe allerdings mit steigendem k schnell abnimmt. Wie oben am
Beispiel der relativ schwachen Anregungsintensität (linearer Fall, Figur 1) erläutert, ist die Objektfunktion an jede der Komponenten der Beleuchtungsfunktion gekoppelt. In einem als Teilbild Iem aufgenommenem Detektorsignal sind also alle Informationen, insbesondere über die interessierenden hochfrequenten Ortsfrequenzen der Objektfunktion enthalten. Die Rückgewinnung dieser Informationen wird unten in Zusammenhang mit der Bildrekonstruktion beschrieben.
Figur 2 illustriert die Struktur der Anregungsverteilung im reziproken Raum bei einem nicht-linear verzerrten Anregungsmuster. Zu dem virtuellen Maximum n = +2 entsprechend 2kb ist eine gekoppelte Struktur der Fouriertransformierten der Objektfunktion eingezeichnet (θbj+2(k)j. Praktisch ist Obj(k) wiederum an jedes Maximum gekoppelt (aus Übersichtlichkeitsgründen nicht dargestellt) und mit verschobenen, unterschiedlich intensiven und phasengedrehten Versionen von sich selbst überlagert. Nur der mittlere Teil an emittierten Raumfrequenzen (Träger der OTF) ist der Detektion zugänglich.
Das Ziel der optischen Abbildung ist die Gewinnung einer Objektabbildung, d. h. der das Objekt beschreibenden Funktion Obj(x). Diese Funktion muss aus den gemessenen Teilbildern Im rekonstruiert werden. Die Rekonstruktion der Objektabbildung basiert darauf, dass die Faktoren bi(x) aus den Teilbildern Im extrahiert werden oder unabhängig von der Bildaufnahme be- kannt sind. Die erfindungsgemäße Unterscheidung der Faktoren bi(x) von der das Objekt beschreibenden Funktion Obj(x) erfolgt, indem die Faktoren bi, d. h. die oft räumlich gemusterten Objektbedingungen, variiert werden.
Die Variation der Objektbedingungen kann auf verschiedene Arten erfolgen. Eine erste Möglichkeit besteht darin, bi(x) als ein räumliches Muster auszubilden, das am Objekt zur Aufnahme verschiedener Teil- oder Einzelbilder jeweils verschoben wird. Alternativ ist es aber auch möglich, die Stärke des Musters (Kontrast der eingestellten Objektbedingungen am gesamten Objekt) oder die Form des Musters jeweils für die Aufnahme von Teilbildern zu verändern. In jeden Falle werden die in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) gezeigten Komponenten unterscheidbar.
Die Bilderfassung des erfindungsgemäßen Erfahrens basiert auf der Aufnahme von mindestens zwei Teilbildern mit verschiedenen Objektbedingungen, unter denen die Faktoren bi(x), mit denen die erfasste Lichtintensität in nicht-linearem Zusammenhang steht, variiert werden. Die Rekonstruktion der Objektabbildung aus den Teilbildern wird im Folgenden erläutert .
Rekonstruktion der Objektabbildung
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die in der Taylor-Entwicklung gemäß Gleichung (4) enthaltenen Terme, soweit sie einen messbaren Einfluss besitzen, durch das Lösen eines Gleichungssystems ermittelt und so voneinander getrennt. Das Gleichungssystem, dessen Ermittlung unten im Einzelnen erläutert ist, lässt sich trotz der Multiplikation mit der OTF an jedem Punkt im Bereich des Trägers der OTF im reziproken Raum bestimmen und im Prinzip lösen. Durch Verschiebung in Fourierraum (oder durch Multiplikation mit exp(ιΔkxj im Ortsraum, Δk : Frequenzraum-Verschiebevektor) können die individuellen Komponenten dann so zusammengesetzt werden, dass sich ein hochauflosendes Bild ergibt. Dieses kann ggf. mit weiteren Dekonvolutionstechniken verarbeitet werden, um die Bildqualltat weiter zu steigern.
Wie schon aus US-A-5 671 085 bekannt ist, ergibt die Beleuchtung des Objekts mit einem Muster aus möglichst hohen Raumfrequenzen eine Auflosungserhohung gegenüber der herkömmlichen Lichtmikroskopie. Durch die erfmdungsgemaße Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen der Starke eines Musters, z. B. Werten bestimmter Objektbedingungen, an einem Objektpunkt und der von diesem Objektpunkt ausgehenden (emittierten bzw. gestreuten) Lichtintensitat ist es möglich, ein Bild mit einer noch höheren Ortsauflosung zu berechnen.
Ein Beispiel für die Bildung eines Musters von Objektbedingungen ist bei der Anregung von Fluoreszenz mit einer ortsab- hangigen Verteilung intensiven Anregungslichts gegeben. Die nicht-lineare Abhängigkeit des vom Detektor erfassten Lichts kann z. B. durch die Sättigung der Anregung von im Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffen entstehen. Besitzt das An- regungslicht eine genügend hohe Intensität, so erhalt man eine nicht-linearen Zusammenhang zwischen der eingestrahlten und der emittierten Lichtintensitat am betrachteten Objekt (siehe z. B. D.R. Sandison et al. in „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press, New York and London, 2. Auflage, 1995, Kapitel 3, Seiten 47 bis 50; und R.Y. Tsien et al . im genannten „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Kapitel 16). Das detektierte Licht enthalt nun auch Informationen über Raumfrequenzen des Objekts, die sonst nicht zugänglich waren. Allerdings enthalt jedes so aufgenommene Bild eine Mischung von Anteilen hoher Raumfrequenzen, die aber dann durch Aufnahme unter unterschiedlichen Bedingungen und Verrechnung mehrerer Teilbilder getrennt und zu einem konsistenten, hochauflösenden Bild zusammengesetzt werden können.
Das Gleichungssystem zur Trennung der Komponenten der Taylor- Entwicklung gemäß Gleichung (4) wird bspw. im Fall der Fluoreszenzmikroskopie bei Beleuchtung mit einer einem Liniengitter ähnlichen Struktur mit den folgenden Schritten ermittelt.
Die Intensitätsverteilung des Anregungslichts wird bei diesem Beispiel annähernd durch eine in den positiven Bereich verschobene Sinusfunktion beschrieben. Als Fouriertransformierte ergeben sich im Idealfall punktförmige Maxima bei k = 0, k = + kb und k = - kb (siehe Figur 1). Diese Maxima besitzen je nach Modulationsgrad eine bestimmte Energie und einen bestimmten Phasenwinkel in der komplexen Ebene, der von der Position bzw. der Verschiebung (Lage) des Musters des Anregungslichts abhängt. Durch den Einfluss der nicht-linearen Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) ergibt sich das in Figur 2 gezeigte Muster mit nieder- und höherfrequenten Komponenten im reziproken Raum, bspw. als Anregbarkeitsmuster für einen bestimmten Fluorophortyp.
Zur Rekonstruktion der Objektbildung genügt es, dass näherungsweise bei einem endlichen Raumfrequenzwert kmax = + mkb abgebrochen wird und in der Rechnung nur Maxima mit kleineren Raumfrequenzen berücksichtigt werden.
Wird das Anregungslichtmuster gegenüber dem Objekt verschoben, so ändern sich die jeweiligen komplexen Phasenlagen der einzelnen punktför igen Maxima im Fourieraum. Berücksichtigt man ±m Anregungs-Maxima und das Maximum bei k = 0 , so benötigt man Z = 2m + 1 unter verschiedenen Bedingungen aufgenommene Bilder, um die einzelnen durch das Mikroskop abgebildeten Komponenten des Objekts, die mit dem jeweiligen Maximum gefaltet (also verschoben) sind, separieren zu können (in Figur 2 ist nur eine Komponente dargestellt). Es kann z. B. vorgesehen sein, dass Z = 5 Maxima berücksichtigt werden. Der Phasenwinkel der Maxima im Frequenzraum des Anregungsmusters bewegt sich bei Verschiebung des Musters proportional zu n , da eine Verschiebung im Raum um Δx einer Multiplikati-
on im Frequenzraum mit expikΔxj entspricht. Dabei entspricht n der Nu mer des jeweiligen Raumfrequenzanteils (siehe Figur 2). Werden also verschiedene Bilder (Teilbilder) In(k) = F(ln(x)) des Objekts mit jeweils um ein Fünftel des Grundmusters gegeneinander verschobener Phasenlage des Beleuchtungsmusters (also auch des Anregungsmusters) aufgenommen, so ergibt sich das folgende Gleichungssystem:
M •
Figure imgf000025_0001
1 1 1 1 1
1 exp(i2π / 5) exp(- i2π / 5) exp(i4π / 5) exp(- i4π / 5)
M 1 exp(i4π / 5) exp(- i4π / 5) exp(i8π / 5) exp(- i8π / 5)
1 exp(iβπ / 5) exp(- i6π / 5) exp(il2π / 5) exp(- il2π / 5)
1 exp(i8π / 5) exp(- i8π / 5) exp(il 6π / 5) exp(- il 6π / 5)
In diesem Gleichungssystem bezeichnen die Objn (k) die zum n . Maximum des Anregungsmuster gehörenden, verschobenen kom- plexwertigen Komponenten des fouriertransformierten Objekts (Objekt-Raumfrequenz), die dann durch die OTF des abbildenden Systems transmittiert werden.
Die Lösung des Gleichungssystems liefert die individuellen Objektkomponenten, die zum jeweiligen Maximum des Anregungsmusters gehören. Die Lösung kann z. B. durch Invertieren der Matrix M erfolgen. Durch Multiplikation der inversen Matrix (M_1) mit dem rechts stehenden Vektor der gemessenen Intensitäten In(k) werden die individuellen transmittierenden Objektkomponenten ermittelt. Liegen mehr Messdaten vor als zur Lösung der Rekonstruktionsaufgabe nötig sind, so kann z. B. eine analoge, nicht quadratische oder rechteckige Matrix aufgestellt werden. Für die Berechnung der Lösung ist dann z. B. das Verfahren der pseudoinversen Matrix anwendbar, das es erlaubt, eine Lösung im Sinne der kleinsten Fehlerquote zu ermitteln.
Die Rechnung wird aufgrund der Linearität der Fouriertrans- formation vorzugsweise bildpunkt- oder pixelweise im Realraum ausgeführt .
Die komplexwertigen Komponenten Objn(k) können nun um den Vektor Δk im Fourieraum (oder durch die o. g. entsprechende Multiplikation im Realraum) verschoben werden, so dass die jeweilige Raumfrequenz k dort zu liegen kommt, wo sie bei musterfreier, gleichmäßiger Beleuchtung gemessen werden würde. Δk ist hier also -nkb .
In einem weiteren Schritt ist eine Korrektur der Komponenten Objnk) in ihrer komplexen Phasenlage je nach gegenseitiger Phasenlage φn der Frequenzraum-Anregungsmaxima im Bild I0 vorgesehen (Multiplikation mit exp(- iφn)) . Anschließend werden die Komponenten Objn(k), ggf. durch eine gewichtete Addition, zu einem konsistenten Bild (der gewünschten Objektabbildung) vereinigt. Damit wird eine Ausdehnung des Trägers der Gesamt-OTF auf einen relativ zur linearen Abbildung deutlich vergrößerten Bereich und damit eine Erhöhung des Auflösungsvermögens ermöglicht.
Die illustrierte Verschiebung von Raumfrequenzkomponenten kann in verschiedenen Raumrichtungen durchgeführt werden. Dies kann nacheinander durch unterschiedliche Orientierung des Beleuchtungsmusters oder simultan durch Beleuchtung mit einer mehrdimensionalen Struktur erfolgen. Das Auflösungsvermögen ist in ein, zwei oder drei Dimensionen vergrößerbar. Die Gesamttransferfunktion kann im Anschluss daran oder bei Zwischenschritten noch durch entsprechendes Filtern und/oder Anwenden von an sich bekannten Entfaltungstechniken verändert werden.
Die Rekonstruktion der Objektabbildung ist nicht auf die beschriebene Lösung des Gleichungssystems mit der Matrix- Methode beschränkt. Alternativ können z. B. Quadratur- Techniken (analog zu WO 98/45745) oder algebraische bzw. iterative Rekonstruktionsverfahren (Maximum Likelihood/Expecta- tion Maximization, Maximum Entropie, Algebraic Reconstruction und dergleichen) verwendet werden.
Die Erfindung ist nicht auf die nicht-lineare Anregung von Fluoreszenzemission beschränkt. Die Verfahrensweise ist entsprechend auch mit beliebig anderen Faktoren bi implementierbar, die geeignet sind, allein für sich oder im Zusammenwirken untereinander, insbesondere im Zusammenwirken mit der Beleuchtungsintensität, die Intensität des vom Objekt ausgehenden Lichts zu beeinflussen. Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer optischer Systeme
Ein erfindungsgemäßes optisches System ist in Figur 3 dargestellt. Die an sich bekannten Komponenten eines herkömmlichen Mikroskops sind mit gestrichelten Rahmen eingezeichnet. Das optische System 100 ist mit einer Beleuchtungseinrichtung 10, mindestens einem Mustergenerator 20, 20', 20'', einer Beleuchtungsoptik 30, einer Abbildungsoptik 50, einer Detektoreinrichtung 60 und einem Bildgenerator 70 aufgebaut. Das Bezugszeichen 40 bezieht sich auf die mit dem System 100 zu untersuchende Probe. Die Komponenten 10, 30, 50 und 60 können durch optische Bauteile bereitgestellt werden, wie sie aus der Lichtmikroskopie und aus der optischen Mess- und Analysetechnik, z. B. der Spektroskopie, bekannt sind. Anwendungsabhängig können die Komponenten 30 und/oder 50 entfallen oder durch ein gemeinsames Bauteil gebildet werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Komponenten 20 und 30 durch ein gemeinsames optisches Bauteil gebildet werden.
Der Mustergenerator 20, 20' und/oder 20'' ist allgemein eine Einrichtung zur Bildung von Objektbedingungen mit einem vorbestimmten räumlichen Muster am Objekt 40. Anwendungsabhängig kann der Mustergenerator 20 eine Maske mit einer bestimmten ein- oder zweidimensionalen Übertragungscharakteristik entsprechend dem gewünschten Muster sein. Die Maske kann insbesondere durch ein Beugungsgitter (siehe Figur 4) (oder Phasengitter) oder eine Matrixanordnung aus einzeln ansteuerbaren Reflektor- oder Transmissionspixeln gebildet werden. Im letzteren Fall werden DMD-Einrichtungen („Digital Mirror Device") bzw. LCD-Matrixanordnungen verwendet. Der Mustergenerator kann auch eine Spiegelanordnung zur Erzeugung eines Interferenzmusters (siehe Figur 5) oder eine Einrichtung zur unmittelbaren physikalischen oder chemischen Beeinflussung des Objekts 40 (z. B. eine Heizeinrichtung oder einen Ultraschallgeber) umfassen. Abweichend von der Komponente 20 in Figur 3 kann der Mustergenerator auch zwischen der Beleuchtungsoptik 30 und dem Objekt 40 (Komponente 20'') oder unmittelbar am Objekt 40 vorgesehen sein (Komponente 20').
Der Bildgenerator enthält eine Einrichtung zur Rekonstruktion der Objektabbildung entsprechend den oben erläuterten Prinzipien. Als Bildgenerator kann ein speziell ausgelegter Schaltkreis oder auch ein entsprechend programmierter Computer verwendet werden. Der Bildgenerator kann zusätzlich Speicher-, Steuer- und/oder Anzeigekomponenten enthalten.
Figur 4 zeigt Einzelheiten eines erfindungsgemäßen optischen Systems am Beispiel eines Epifluoreszenzmikroskops 100. Die Beleuchtungseinrichtung 10 wird durch eine intensive Lichtquelle gebildet. Da zur Ausnutzung nicht-linearer Effekte hohe Lichtintensitäten benötigt werden, wird vorzugsweise eine gepulste Lichtquelle, wie z. B. ein Pulslaser oder eine Blitzlampe verwendet. Die Beleuchtungseinrichtung kann aber auch durch eine Hochdruckdampflampe (z. B. Quecksilberdampflampe) gebildet werden. Als Mustergenerator 20 (Maske) ist beispielhaft ein verstellbares und ggf. drehbares und/oder verschiebbares Beugungsgitter 22 vorgesehen, das entsprechend der Position 21 der Bildfeldblende in einer konjugierten Objektebene angeordnet ist. Das Beugungsgitter 22 ist ein Transmissionsgitter mit einem Gitterabstand von z. B. 30 μm. Das Beugungsgitter 22 ist an einem (nicht dargestellten) Stellantrieb angeordnet.
Die Beleuchtungsoptik 30 weist einen Anregungsfilter 31, einen dichroitischen Spiegel 32 zum Einkoppeln des Anregungslichts in eine Mikroskopsäule und Objektivlinsen 33. Am Ort des Objekts 40 wird ein Bild des Beugungsgitters 22 als Be- leuchtung für die zu untersuchende Probe in der entsprechenden Fokusebene gebildet. Die Abbildungsoptik 50 wird wiederum durch die Objektvlinsen 33, einen Emissionsfilter 51 und einer optional vorgesehenen Optik 52 zur Bildvergrößerung gebildet. Die Detektoreinrichtung 60 ist ein CCD-Detektor, von dem auf den (nicht dargestellten) Bildgenerator Daten übertragen werden.
Beim Aufbau gemäß Figur 4 kann das Beugungsgitter 22 durch eine DMD-Einrichtung oder eine LCD-Matrixanordnung ersetzt werden, die im Lichtweg zwischen der Beleuchtungseinrichtung 10 und dem Objekt 40 angeordnet ist. In diesem Fall ist zwischen den Komponenten 20 und 40 eine zusätzliche Verkleinerungsoptik vorgesehen. Eine DMD-Einrichtung umfaßt z. B. rd. 450 " 600 Reflektorelemente mit einer Pixelgröße von rd. 17 • 17 μm2.
Für die erfindungsgemäße Aufnahme mehrerer Teilbilder mit unterschiedlichen Phasenlagen wird das Beugungsgitter 22 in kleinen Schritten gegenüber dem Objekt 40 verschoben. Die Schrittweite ist von der Strukturdimension der Maske und der Zahl der aufzunehmenden Teilbilder abhängig und beträgt z. B. bei 30 μm Strukturdimension und 7 Teilbildern 30/7 μm) . Alternativ kann auch bei einem feststehenden Beugungsgitter 22 eine Verschiebung des Objekts 40 vorgesehen sein, wobei dies jedoch zusätzliche Schritte der Bildkorrektur bei der Rekonstruktion der Objektabbildung erfordert. Alternativ ist es auch möglich, die Phase der verschiedenen Beugungsmaxima direkt durch geeignete optische Elemente zu beeinflussen. Die minimale Anzahl der für die Rekonstruktion des Gesamtbildes notwendigen Aufnahmen von Teilbildern ergibt sich durch die Anzahl der Unbekannten des zugehörigen Gleichungssystems (siehe oben). Es sind mindestens zwei Teilbildaufnahmen vorgesehen. Um die Auflösung in allen Raumrichtungen zur erhöhen, wird das Objekt 40 mit Mustern unter verschiedenen Winkeln nacheinander oder mit einer Maske wie bspw. mit der DMD- oder LCD-Einrichtung mit einem zweidimensionalen Muster, das Beugungsmaxima in mehreren Richtungen der Ebene hervorruft, in verschiedenen Phasenlagen in jeder Dimension beleuchtet.
Durch Erstellen von Fokusserien kann man noch zusätzliche Informationen über die axiale Struktur des Objekts gewinnen und damit dreidimensionale Objektabbildungen ableiten. Dies wird einerseits durch die inkohärente Lichtquelle und andererseits durch das Vorhandensein der Nullpunkt-Beugungsordnung des Gitters noch zusätzlich erleichtert. Ein weiterer Auflösungsgewinn kann durch Drehen des Objekts um eine auf der optischen Achse senkrecht stehende Achse unter dem optischen System erreicht werden.
Das Objekt 40 wird mit derart Momentanintensitäten beleuchtet bzw. angeregt, dass die Farbstoffe in der Probe gesättigt werden, so dass sich die gewünschten nicht-linearen Effekte zur Erhöhung des Auflösungsvermögens ergeben. Die gesuchten Anteile der sich überlagernden individuellen Ordnungen können aus den Bildern bei verschiedenen Phasenlagen der Anregungsstruktur errechnet werden. Es ist auch möglich, aus Aufnahmen von Teilbildern mit verschiedener Beleuchtungsintensität hoch auflösende Bilder zu rekonstruieren. Unterdrückt man (z. B. durch Ausblenden) die Nullpunkt-Beugungsordnung des Beugungsgitters 21, so erhöht man damit in vorteilhafter Weise den Modulationsgrad der Beleuchtungsfunktion und damit die relative Intensität in höheren Anregungsordnungen. Außerdem kann die Energie in höhere Raumfrequenzbereiche geschoben werden. Bei dem abgewandelten Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops 100 gemäß Figur 5 wird die Probe (das Objekt) 40 mit Laserlicht beleuchtet. Die Lichtquelle 10 ist vorzugsweise ein Pulslaser (z. B. mit einem optisch-parametrischen Oszillator, der mit einem frequenzverdreifachten NdYAG-Laser gepumpt ist, oder mit einem Ti-Saphir-Laser) , kann aber auch durch eine andere genügend intensive Lichtquelle gebildet werden. Der Mustergenerator 20 wird durch eine Gruppe ebener Spiegel 23 - 27 gebildet, die dazu eingerichtet sind, das Anregungslicht von der Lichtquelle 10 auf verschiedene Strahlengänge zu zerlegen, die aus verschiedenen Richtungen auf das Objekt 40 treffen. Das Anregungslicht wird mit dem teildurchlässigen Spiegel 23 und die voll reflektierenden Spiegel 25 - 27 von zwei entgegengesetzten Seiten auf das Objekt 40 gerichtet. Optional kann der zweite teildurchlässige Spiegel 24 vorgesehen sein, um einen dritten Anregungslichtweg zum Objekt 40 zu bilden. Es ergeben sich drei miteinander interferierende Anregungs-Lichtstrahlen, die eine Verwendung des Mikroskops 100 in der höchstauflösenden 3D-Mikroskopie erlauben. Für zweidi- mensionale Anwendungen kann auf den Spiegel 24 verzichtet werden. Die Strahlen interferieren über einen Bereich der in der Größenordnung der Kohärenzlänge der Lichtquelle 10 liegt.
Zur Veränderung der Objektbedingungen (Interferenzmuster am Objekt 40) zur Aufnahme verschiedener Teilbilder sind mindestens zwei Spiegel verschiebbar angeordnet. Bspw. ist vorgesehen, dass die Spiegel 24 und 25 zur Änderung des Interferenzmusters verschiebbar sind. Alternativ ist zur Veränderung der Objektbedingungen mindestens ein elektrooptisches Element zur Änderung der Phasenlage des Beleuchtungslichts in einem der Teil-Lichtwege vorgesehen.
Die Beleuchtungsoptik 30 ist in Figur 5 aus Übersichtlichkeitsgründen nicht dargestellt, kann aber ggf. bauformabhän- gig ohnehin weggelassen werden. Die Abbildungsoptik 50 um- fasst die Objektivlinsen 53, den Emissionsfilter zur Absorption des Anregungslichts 51 und optional eine Optik 52 zur Bildvergrößerung. Als Detektor ist wiederum ein CCD-Detektor 60 vorgesehen.
Um ein gute axiale Diskriminierung zu erhalten, kann das Anregungslicht zugleich noch aus einer oder mehreren Richtungen durch das (nicht dargestellte) Objektiv und/oder von der dem Objektiv abgewandten Seite auf das Objekt 40 fallen, das sich im Differenzbereich der Anregungslichtstrahlen (kreuz schraffierte Region) befindet. Die durch Nicht-Linearitäten erzielbare zusätzlich Auflösungserhöhung kann wiederum durch Benutzung entsprechend starker Laser bzw. gepulster Laser mit hohen Momentanintensitäten erreicht werden. Auch die Verwendung anderer intensiver Lichtquellen (z. B. Blitzlicht) ist möglich und ggf. vorteilhaft.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mehrere Teilbilder jeweils mit verschiedenen Interferenzmustern am Objekt 40 aufgenommen und nach den oben erläuterten Prinzipien zur Gewinnung der Objektabbildung verarbeitet.
Die erläuterten Ausführungsbeispiele basieren auf der Ausnutzung der nicht-linearen Abhängigkeit des erfassten Lichtes von der Intensität des Anregungslichts durch Sättigung von Fluoreszenzfarbstoffen. Alternative nicht-lineare Effekte sind durch die Sättigung der Absorption von Anregungslicht unter intensiver Beleuchtung, die Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichts von der im Objekt vorhandenen Beleuchtungsintensität, die sich im Detektor (z. B. über Interferenz) oder vor diesem in einer nicht-linearen Intensitätsabhängigkeit umsetzt, SHG- oder THG-Prozesse, eine Abhängigkeit der Lichteigenschaften der Ramanstreuung vom Wert einer oder mehrerer Objektbedingungen, zeitlich kohärente Effekte (z. B. Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Molekülen im Objekt, CARS-Prozesse, Mehrphotonen-Absorptionen, stimulierte Emissionen im Objekt, die Besetzung langlebiger Anregungszustande oder chemisch veränderter Zustande in den Fluorophoren vor oder wahrend der Beleuchtung, strahlungslose Energietranferprozesse und/oder physikalische oder chemische Objektbedingungen gegeben.
Insbesondere zur Ausnutzung zeitlich kohärenter Effekte (Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Molekülen oder Fluorophoren im Objekt (in Losung, in Festkörpern, in Gasen oder auch unter Vakuumbedingungen) werden vorzugsweise Beleuchtungseinrichtungen mit extrem kurzen Pulslangen (z. B. <100 fs) verwendet. Basiert der nicht-lineare Effekt auf der stimulierten Emission so wird diese gleichzeitig oder in zeitlicher Abfolge induziert. Die stimulierte Emission kann bei der selben Wellenlange wie der des Anregungslichts oder auch bei anderen Wellenlangen, z. B. bei einer typischen Fluoreszenzwellenlan- ge, induziert werden. Die Ausnutzung von Energietransferprozessen bedeutet, dass Energie der Anregungsstrahlung stählend oder strahlungslos von Fluorophoren auf benachbarte Fluoro- phor-Molekule übertragen wird und dadurch eine multi-lineare Abhängigkeit der emittierten Lichtintensitat von der am Nachbarort eingestrahlten Intensität entsteht.
Zu den physikalischen oder chemischen Änderungen der Objektbedingungen zahlt insbesondere die Ausnutzung der nichtlinearen Abhängigkeit des von den Objektpunkten ausgehenden Lichts von einem raumlich inhomogenen elektrischen oder magnetischen Feld oder vom am Objektpunkt herrschenden Druck, Scherkräften oder mechanischen Spannungsverhaltnissen. Es kann auch ein am Objekt gebildeter Temperaturgradient entsprechend einem bestimmten Muster vorgesehen sein, der die gewünschte multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von der jeweils herrschenden Temperatur herstellt. Es kann auch eine multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von den dort herrschenden chemischen Bedingungen (z. B. pH-Wert) verwendet werden. Zusätzlich kann eine Objektbestrahlung mit Radiowellen, Mikrowellen, Infrarotlicht, Röntgenstrahlung oder auch Schallwellen oder Ultraschallwellen ausgenutzt werden.
Zur Realisierung der genannten Effekte ist der Mustergenerator entsprechend angepasst. Bspw. kann der Mustergenerator eine zusätzliche Bestrahlungseinrichtung umfassen, deren Emission auf das Objekt fokussiert ist.
Die Figuren 6 und 7 illustrieren Simulationsergebnisse zum Einsatz eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Figur 4. Die Lichtintensität ist hier als Schwärzung dargestellt. Aus drucktechnischen Gründen ist die Bildqualität eingeschränkt. Zur besseren Sichtbarmachung der Beleuchtung wurde im Objekt (Figur 6a, 7a) eine konstante Hintergrundfluoreszenz angenommen. Figur 6a zeigt das simulierte Objekt, dessen Beleuchtung mit dem beschriebenen Verfahren und Abbildung mit einem Epifluo- reszenzmikroskop simuliert wurde. Die Teilbilder b-h repräsentieren Simulationen von jeweils mit verschiedenen Phasen des beleuchtenden Streifenmusters aufgenommenen Teilbildern. Figur 6i zeigt ein Beispiel, bei dem auch die Richtung des beleuchtenden Musters verändert wurde. Die Anregungsintensität war bei diesen Simulationen um den Faktor 5 größer als die Sättigungsintensität. Die maximal erwartete Photonenzahl betrug 560 Photonen/Pixel in den Einzelbildern. Figur 7 zeigt die zugehörigen Rekonstruktionsergebnisse. Figur 7a wiederholt das Originalbild der Simulation. Nach Faltung mit der Punktbildfunktion eines simulierten Mikroskops und einer Poisson-verteilten Verrauschung (Max = 560 Photonen) ergibt sich das Bild Figur 7b. Die erfindungsgemäße Rekonstruktion aus Teilbildern, die analog zu den Figuren 6b bis 6h mit Beleuchtungsmustern unter 3 Drehwinkeln simuliert wurden, ist in Figur 7c gezeigt. Dabei ist keine Verstärkung hoher Raumfrequenzen vorgenommen wurden. Erfolgt zusätzlich die dem System eigene Hochfrequenzverstärkung, so ergibt sich aus Figur 7c das Bild gemäß Figur 7e. Die Anwendung einer entsprechenden Hochfrequenzverstärkung bei dem (konventionellen) Bild gemäß Figur 7b würde lediglich ein Bild mit gemäß Figur 7d ergeben. Der Vergleich der Bilder Figur 7e und Figur 7d zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens der Rekonstruktion hoher Raumfrequenzen aus der Aufnahme mehrerer Teilbilder. Figur 7f illustriert den zugehörigen simulierten Träger der mit dem Verfahren erreichten OTF bei einer berücksichtigten Anzahl von Z = 7 Maxima.
Figur 8 illustriert die Verbesserung des Auflösungsvermögens mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es ist die Intensität auf einer Bezugslinie entlang der zweiten senkrechten Spalte in der Punktmatrix (links oben im Originalbild) in den Figuren 7d und 7e dargestellt. Die durchgezogene Linie entspricht dem Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Einzelpunkte sind deutlich als Maxima erkennbar. Mit dem herkömmlichen Verfahren (Epifluoreszenz mit nachfolgender Hochfrequenzverstärkung) ist nur der erste Punkt (teilweise) und ein Maximum zwischen den beiden untersten Punkten erkennbar. Bei der simulierten Abbildung eines Punktes ergibt sich eine Verbesserung des Auflösungsvermögens um einen Faktor von mehr als 3.
Figur 9 zeigt einen lateralen Schnitt durch die simulierte effektive optische Transferfunktion des Gesamtsystems gemäß Figur 4. Der Gitterabstand des Beugungsgitters wurde hier so gewählt, dass nur die Beugungsordnungen 0, +1 und -1 des Beu- gungsgitters durch das Objektiv übertragen werden können. Durch die teilweise Sättigung der beteiligten Farbstoffe ergibt sich eine nicht-lineare Beziehung zwischen der Anregungsintensität und der Wahrscheinlichkeit der Anregung eines Farbstoffmoleküls an einem Punkt im Objektraum. Diese räumlich variierende Anregungswahrscheinlichkeit wird auch als Anregungsmuster bezeichnet. Wenn man annimmt, dass die Anregungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Farbstoffmolekül eine Funktion der Anregungsintensität ist, so führt eine Nicht-Linearität dieser Funktion dazu, dass im Emissionsmuster auch räumlich höhere Harmonische des Anregungsmusters auftreten. Maxima im reziproken Raum, die jenseits der durch die Abbe-Grenze gegebenen Raumfrequenzbegrenzung liegen, können dann im Anregungsmuster auftreten. Die raumfrequenzbe- grenzte Abbildung der Multiplikation der Farbstoffverteilung mit dem Anregungsmuster enthält nun Komponenten analog zu einer linearen Anregung mit einem Muster, welches höhere Raumfrequenzen enthält.
In Figur 9 ist im Einzelnen zu erkennen, dass die Transferfunktion bei einer herkömmlichen Abbildung mit einem Mikroskopobjektiv (mit nachfolgender Anwendung einer Hochfrequenzverstärkung) entsprechend der durchgezogenen Linie relativ schmal ist, wohingegen die Transferfunktion bei Anwendung der gesättigten Beleuchtung (mit einer Hochfrequenzverstärkung) erheblich erweitert wird (gestrichelt gezeichnet) .
Figur 10 zeigt eine simulierte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein mittels Elektronenmikroskopie aufgenommenes Schnittbild des Zellkerns einer embryonalen Bovin- Zelle. Figur 10a illustriert den invertierten elektronenmikroskopischen Ausschnitt nahe der Kernhülle mit der Kernmatrix („Nuclear Matrix"). Die simulierte epifluoreszenz- mikroskopische Aufnahme mit Entfaltung ergibt das in Figur 10b gezeigt herkömmliche Bild. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich das in Figur 10c gezeigte Bild. Das mit der Methode der gesättigten lateralen Modulation aufgenommene und ausgewertete und anschließend entfaltete Bild (Maximum: 560 Photonen im Einzelbild) ist gegenüber dem herkömmlichen Bild deutlich verbessert und mit dem elektronenmikroskopischen Originalbild vergleichbar.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung einer Objektabbildung mindestens eines Objekts (40) , wobei mindestens zwei Teilbilder des Objekts (40) unter jeweils verschiedenen Objektbedingungen aufgenommen werden, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nichtlineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektierten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingungen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beträge verschiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfrequenzanteile die gewünschte Objektabbildung ermittelt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem räumliche Muster mindestens einer Objektbedingung gebildet werden, für die jeweils die nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden und detektierten Lichtes besteht.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem räumliche Muster von mindestens zwei Objektbedingungen gebildet werden, für die eine Abhängigkeit des detektierten Lichtes von einer multi- plikativen Verknüpfung der Objekteigenschaften und eine lineare oder eine nicht-lineare Abhängigkeit des detektierten Lichtes von jeder der Objektbedingungen besteht.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das räumliche Muster durch ein Muster einer Beleuchtungsintensität am Objekt (40) gegeben ist und das Objekt (40) mit dem Muster der Beleuchtungsintensität so beleuchtet wird, dass eine nicht-lineare Abhängigkeit der an einer Detek- toreinrichtung (60) erfassten, von einem Objektpunkt ausgehenden Lichtintensität zu der an diesem Objektpunkt gegebenen Beleuchtungsintensität besteht.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die nicht-lineare Abhängigkeit des erfassten Lichts durch eine Sättigung von Fluoreszenzlicht von Fluorophoren unter intensiver Beleuchtung, eine Sättigung der Absorption von Beleuchtungslicht unter intensiver Beleuchtung, eine Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichtes von der im Objekt vorhandenen Beleuchtungsintensität, SHG- oder THG-Prozesse, eine Abhängigkeit der Lichteigenschaften der Ramanstreuung vom Wert einer oder mehrerer Objekteigenschaften, zeitlich kohärente Effekte an Atomen oder Molekülen im Objekt ( 0 ) , eine Mehrphotonenabsorption, CARS-Prozesse, eine stimulierte Emission, eine Besetzung langlebiger Zustände oder chemisch veränderter Zustände, strahlende oder strahlungslose Energietransferprozesse von Fluorophoren auf benachbarte Fluorophore, am Objektpunkt gegebene räumlich inhomogene elektrische oder magnetische Felder, am Objektpunkt gegebene Drucke, Scherkräfte oder mechanische Spannungsverhältnisse, am Objektpunkt gegebene Temperaturen, am Objektpunkt gegebene chemische Verhältnisse und/oder zusätzliche Objektbestrahlungen mit elektromagnetischen Strahlen oder Schallwellen gebildet wird.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das räumliche Muster einer Objektbedingung im reziproken Raum durch eine Anzahl von Punkten, die in einer, zwei oder drei Dimensionen verteilt sind, beschrieben oder annähernd beschrieben werden kann bzw. im Ortsraum räumlich periodisch oder näherungsweise periodisch in einen oder mehreren Dimensionen gebildet wird.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zur Einstellung verschiedener Objektbedingungen das Objekt und das räumliche Muster in einer oder mehreren Richtungen relativ zueinander verschoben werden.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das Muster durch eine Maske oder durch Interferenz erzeugt wird und eine Verschiebung des Musters durch Verschiebung der Phase verschiedener Beugungsmaxima erzielt wird.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Objektbedingungen entsprechend einer vorbestimmten zeitlichen Struktur verändert und die Teilbilder zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem zur Erzeugung verschiedener Objektbedingungen die Beleuchtungsintensität variiert wird.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Rekonstruktion der Objektabbildung aus den Teilbildern durch Lösung eines Gleichungssystems unter Berücksichtigung der nicht-linearen Abhängigkeiten oder durch eine iterative Verfahrensweise erfolgt.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Position des Objekts oder eines oder mehrerer Teilobjekte des Objekts (40) ermittelt werden.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Rekonstruktion der Objektabbildung unter Berücksich- tigung einer vorbekannten Struktur des Objekts (40) oder von Teilen des Objekts (40) erfolgt.
14. Optisches Abbildungssystem (100) mit einer Beleuchtungseinrichtung (10) und einer Detektoreinrichtung (60), die dazu eingerichtet sind, ein Objekt (40) zu beleuchten bzw. eine Abbildung des Objekts (40) oder von Teilen des Objekts (40) aufzunehmen, gekennzeichnet, durch mindestens einen Mustergenerator (20, 20', 20'') zur Erzeugung mindestens eines veränderlichen räumlichen Musters von Objektbedingungen am Objekt (40) , wobei die Beleuchtungseinrichtung (10) und/oder der Mustergenerator (20, 20', 20'') dazu eingerichtet sind, Objektbedingungen zu erzeugen, von denen das mit der Detektoreinrichtung (60) detektierbare Licht nicht-linear abhängig ist, und einen Bildgenerator (70) zur Rekonstruktion einer Objektabbildung aus Teilbildern, die mit der Detektoreinrichtung (60) aufgenommen worden sind.
15. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20', 20'') eine Maske umfasst, mit der auf dem Objekt (40) ein räumliches Muster einer Beleuchtungsintensität gebildet werden kann.
16. Optisches System gemäß Anspruch 15, bei dem die Maske ein mehrdimensionales Beugungsgitter (22), ein Phasengitter, eine DMD-Einrichtung oder eine LCD-Matrix umfasst.
17. Vorrichtung gemäß Anspruch 15 oder 16, bei dem die Maske und die Probe (40) relativ zueinander verschiebbar und/oder drehbar angeordnet sind.
18. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20', 20' ') eine Spiegelanordnung (23 - 27) umfasst, die zur Erzeugung eines Interferenzmusters auf dem Objekt (40) eingerichtet ist.
19. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20', 20' ') einen Einrichtung zur Einstellung vorbestimmter physikalischer oder chemischer Bedingungen am Objekt (40) entsprechend dem räumlichen Muster umfasst.
20. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem eine Versteileinrichtung zu Verschiebung des Objekts (40) im räumlichen Muster der Objektbedingungen vorgesehen ist.
21. Optisches System gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem die Beleuchtungseinrichtung (10) eine Blitzlampe, einen Laser oder eine Hochdrucklampe umfasst.
22. Optisches System gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, bei dem eine Beleuchtungsoptik (30) und/oder eine Abbildungsoptik (50) vorgesehen sind.
23. Verwendung eines Verfahrens oder eines optischen Systems gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit herkömmlichen optischen Mikroskopieverfahren, insbesondere in Kombination mit der Standard-Fernfeldmikroskopie, der Epi- fluoreszenzmikroskopie, der Konfokalmikroskopie, der 4Pi- Mikroskopie, der Theta-Mikroskopie, der Nahfeldmikroskopie, mikroskopischen I2M-, I3M- und I5M-Verfahren, STED-Verfahren, Multiphotonenmikroskopie, CARS-Verfahren und SHG- oder THG- Mikroskopie .
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