WO2000042434A1 - Method and device for determining an analyte - Google Patents

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WO2000042434A1
WO2000042434A1 PCT/EP2000/000076 EP0000076W WO0042434A1 WO 2000042434 A1 WO2000042434 A1 WO 2000042434A1 EP 0000076 W EP0000076 W EP 0000076W WO 0042434 A1 WO0042434 A1 WO 0042434A1
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Bernd Pevec
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Bernd Pevec
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    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for the differential determination of an amount of at least one analyte in a sample using a solid phase and an apparatus for carrying out the method.
  • Test strips are often used in today's analytics. Test strips that meet the requirements of a rapid test are essentially based on the principle that a reagent is fixed on a solid matrix that reacts with the analyte to be detected. Under certain circumstances, a color change, a color change or another detectable property can be measured in a subsequent reaction. For example, staining serves as evidence of the presence of an agent to be identified.
  • WO-A-98/22824 relates to a so-called inhibitor assay.
  • This assay configuration is based on labeled compounds that correspond to or are identical to the analyte.
  • the marked compound is placed on the test strip and competes with the analyte present in a sample.
  • the marked connection leaves the original zone and can be verified.
  • a linear procedure is fundamentally not possible.
  • US-A-5,527,509 relates to an assay which determines the analyte by means of enzyme conversion of a low molecular weight analyte and subsequent color reaction. So-called capture assays, which are the subject of the present invention, are not mentioned there. A linear design of this assay is not possible.
  • US-A-5,252,496 relates to a color formation process. Basically, only qualitative assays are disclosed there. If the assay is carried out with two zones, one zone serves only as a control.
  • US-A-5,229,073 relates to a non-linear competitive immunoassay.
  • WO-A-98/36278 relates to a capture immunoassay which has different detection zones with capture components (capture reagents), each of which differ in the capture concentration, so that a linear execution of the assay described there is not possible.
  • test strips or similar systems What is common to many test strips or similar systems is that often only one type of staining takes place, so that such a test cannot be quantified. It only serves to determine one Yes / No statement. Either the analyte is present in a detectable amount, which is reflected in the formation of a color, or there is no coloring, so that the analyte does not exceed a previously determined limit value, that is to say it is below the detection limit of the respective test strip or test system. In order to be able to switch off systematic errors, a function check must also be provided by introducing a further reaction-independent parameter. This structure of test strips is sufficient for many applications. However, questions such as the severity of a stress or illness or change in the amount of an analyte during a rehabilitation process or a therapy attempt cannot be answered satisfactorily.
  • the technical problem underlying the invention therefore consists in avoiding the above-mentioned disadvantages of the systems already present in the prior art and in providing quantifying rapid tests.
  • the problem on which the invention is based is solved by a method for the differential determination of an amount of at least one analyte in a liquid sample using a test strip.
  • Differential determination is understood to mean an at least semi-quantitative determination, that is to say an analysis going beyond a purely qualitative determination.
  • This test strip must have at least two zones and ensure a lateral flow of the liquid sample or a portion of the sample through the test strip and the at least two zones.
  • At least two zones are designed in such a way that they are able to make a statement about the amount of the at least one analyte, in that a first zone has a predefined capacity for binding the at least one analyte and if this capacity is exceeded, by the amount of the at least one analyte which is too large for this capacity, the at least one analyte is bound in at least one second zone, the capacity of the at least two zones being essentially the same in each case and the binding of the at least one analyte in the at least first and at least one second zone is measured by a detectable property.
  • the amount of the at least one analyte is preferably determined by an activity of the at least one analyte.
  • the analyte can be bound specifically and / or non-specifically on the test strip.
  • the specific binding of the at least one analyte preferably takes place via an affinity for another ligand or affinity for the material used for the test strip.
  • binding via immunoaffinity by binding partners bound specifically or unspecifically to the surface of the test strip is possible.
  • An example of the non-specific binding of the at least one analyte on the Test strip is the precipitation of the at least one analyte on the test strip used.
  • the specific binding between the at least one analyte and an affinity binding partner comes, for example, through receptor / ligand interaction, enzyme / substrate interaction, antigen / antibody interaction and other affinity binding, such as avidin, streptavidin, protein A, IgG and others known to the person skilled in the art Systems, established.
  • the defined capacity for binding the at least one analyte on the test strip is determined as a function of the amount of the at least one analyte to be expected in a sample to be analyzed, in order to at least exceed the capacity of the at least first zone to be able to detect an analyte in the second zone.
  • the difference in capacity of the capture component applied in the capture and assay according to the invention in the first and second zones is preferably not more than + 10%, in particular + 5%. It should generally be noted that the more precisely the capacity of the catcher can be set in the at least two zones, the more precisely the linearity of the assay according to the invention is. If more than two zones are used, it can be advantageous to provide the zone beyond that with a higher amount of catcher, that is to say to increase the capacity of this zone in order to achieve better detection. When using several zones, the last zone is preferably provided with a higher capacity of the catcher.
  • the advantage of the present invention is to be seen in the fact that essentially equal amounts of binding agent (scavenger) are applied.
  • FIG. 1 explains the method of operation of the method according to the invention by way of example.
  • FIG. 2 shows a result of the method according to the invention if three zones, each with a defined capacity, are provided.
  • FIG. 3 relates to a device with the test strip according to FIG. 4.
  • FIG. 4 relates to the test strip according to the invention.
  • FIG. 1 shows schematically the fixation of an antibody on a solid matrix, for example nitrocellulose.
  • the phase coated in lb) is then treated with the analyte.
  • the analyte binds to the corresponding antibody via immunoaffinity.
  • This is then added to the detection in 1 c, for example with a further antibody which binds to the antigen and is in turn labeled, in particular by a gold colloid. This indicates the presence of the analyte.
  • Enough capacity of the first If the zone is not sufficient to bind all analytes in the sample, these diffuse further with other sample components on the solid porous support in the direction of the at least second zone, in which the analytes are then bound by the antibodies immobilized there.
  • an analyte it is therefore possible to differentiate whether amounts of an analyte are present in a sample below the detection limit, above the detection limit or significantly above the detection limit.
  • the maximum bindable amount of analyte is thus bound in the first zone and if the amount of analyte present is exceeded, further binding will take place in the at least second zone or further zones.
  • an analysis target can be processed in a variety of ways.
  • the number of zones By increasing the number of zones, a fine division of the measuring range to be recorded can be achieved. For practical reasons, however, the number of zones will regularly be between three and ten. The upper limit will be determined regularly by the readability or interpretability of the results.
  • Figure 2 shows the example of a medical immunoassay.
  • the amount of C-reactive proteins bound in plasma is approximately between 0.2 and 200 mg / 1, values up to approximately 10 mg / 1 being considered normal. Concentrations above this value indicate different forms of bacterial infections.
  • the plasma concentration of C-reactive proteins reacts very quickly to positive treatment, in practice all concentrations actually occur in the range mentioned.
  • the situation shown schematically in FIG. 2 now shows three different zones which can interact immunologically with C-reactive proteins.
  • the following three are regular Read conditions visually: - no coloring, (+) weak and + intensive coloring. If the situation shown in FIG. 2 as situation 1, namely weak coloring in the first zone and no coloring in the second and third zones, is shown in a test strip, the amount of C-reactive protein is in the range from 0.2 to 5 mg /1. The capacity of the respective zones was matched to these quantities.
  • Situation 2 now shows an increased plasma concentration of C-reactive protein in that the staining is correspondingly more intense.
  • This situation corresponds to a content of 5 to 10 mg / 1
  • situation 3 the maximum possible coloration is formed in the first zone and a weaker coloration in the second zone, whereas zone 3 is not colored at all, which indicates an amount of 11 to 15 mg / 1 indicates
  • situation 4 shows strong coloring in the first and second zones
  • the third zone is not colored, which corresponds to a plasma level of 16 to 25 mg / 1
  • situation 5 shows maximum coloring in and in the first two zones
  • Zone 3 weak staining corresponding to a plasma level of 25 to 50 mg / 1
  • situation 6 shows strong staining in all three areas, from which it can then be concluded that> 50 mg / 1 is present.
  • This three-zone model given by way of example therefore allows a six-stage differentiation by simply combining the number of colored zones and the intensity of dyeing.
  • the first zone With a capacity between 0.2 and 5 mg / 1, a functional control is also inherently available, since the first zone must be weakly positive in practically every patient (basal level).
  • analyte C-reactive protein CRP
  • rheumatoid factors CRP
  • troponin I troponin I
  • creatinine kinase CK-MB
  • myoglobin antigens of the organisms Samonella, Legionella, E. coli (EHEC), Aspergillus flavus and fumigatus, glucose, Dioxin, PCB, cocaine (ecgonine), heroin, amphetamine and other pathologically indicative or environmentally relevant substances
  • ECP C-reactive protein
  • CK-MB creatinine kinase
  • myoglobin antigens of the organisms Samonella, Legionella, E. coli (EHEC), Aspergillus flavus and fumigatus
  • glucose, Dioxin PCB
  • cocaine ecgonine
  • heroin amphetamine and other pathologically indicative or environmentally relevant substances
  • two or more analytes can advantageously also be determined in parallel.
  • the following pairs come into consideration as analytes that can be determined in pairs with clinical or environmental analytical relevance: CRP and antistreptolysin, troponin I and CK-MB, myoglobin and CK-MB, CK-MB, myoglobin and troponin I, cocaine, heroin and amphetamine , Samonella and E. coli.
  • a material that has a certain porosity is in principle possible, such as porous supports comprising nitrocellulose, nylon, PTFE, polystyrene, latex, glass fibers, silica gel, aluminum oxide, cellulose, dextran, agarose , Polyvinyl alcohol, also as microspheres or "magnetobeads", optionally preactivated with BrCN, NPCF, NHS chloroformate, tresyl chloride, squaric acid esters and / or corresponding chlorosilanes.
  • porous supports comprising nitrocellulose, nylon, PTFE, polystyrene, latex, glass fibers, silica gel, aluminum oxide, cellulose, dextran, agarose , Polyvinyl alcohol, also as microspheres or "magnetobeads", optionally preactivated with BrCN, NPCF, NHS chloroformate, tresyl chloride, squaric acid esters and / or corresponding chlorosilanes.
  • the method according to the invention is therefore particularly user-friendly since individual analytical problems can be solved by selecting the concentrations which are to be detected in the individual zones. For example, the user himself, e.g. B. by covering the zones with one with the analyte in Interacting agent to tackle individual analysis problems.
  • the test strip according to the invention which is suitable for carrying out the method according to the invention has an essentially porous carrier 2 which can be penetrated by liquids and at least two zones 3, 4 with at least one catcher for at least one analyte, the at least one analyte directly or indirectly to the Captor is bound and the zones 3, 4 each have a previously defined binding capacity for the at least one analyte, which is essentially the same and the catchers are the same for the respective analytes.
  • a typical test strip is shown in Figure 4.
  • the device according to the invention for carrying out the method according to the invention receives the test strip according to the invention.
  • the device has a housing in which the test strip is arranged.
  • the housing consists of an upper side which has at least one opening at the locations of the at least two zones of the test strip, which extends over the region of the at least two zones of the test strip and at least one further opening for application of at least one sample and / or auxiliary substances to be examined for performing an assay that allows contact of a liquid with the test strip.
  • the device preferably has a further opening for receiving auxiliary reagents.
  • the device instead of the one opening 12 which extends over the entire area of zones 3, 4 of the test strip, it has as many openings as corresponds to the number of zones of the test strip. To read the result in the zones of the test strip, it is necessary that the openings in the housing are essentially congruent with the zones of the test strip.
  • FIG. 3 shows a preferred embodiment of the device according to the invention.
  • an opening 12 is provided which extends over the area of the at least two zones 3, 4 of the test strip 1.
  • an opening 14 is provided, with the aid of which the sample to be examined is applied. If necessary, auxiliaries for carrying out the method according to the invention can also be added through the opening 14.
  • the opening 14 has a wall and is connected to the test strip 1. After application of the sample, this pulls into the test strip due to the porosity of the test strip and, due to capillary forces, migrates in a lateral direction through the test strip and therefore through zones 3, 4.
  • the size of the opening 14 determines the volume that the opening can accommodate. The sample volume is precisely determined by the exact diameter and the height of the opening.
  • the sample receiving volume is increased by means of a tube which can be inserted into the opening. It is in particular possible to provide a defined volume by inserting a tube with a defined volume (defined wall thickness and length), which is matched to the quantitative or semi-quantitative assay that can be carried out with the device according to the invention.
  • the further opening 15 is suitable for receiving auxiliary reagents.
  • the opening 14 can be adapted to the respective needs by further additions. Is z. B. directly under the opening 14 in contact with the test strip, a commercially available membrane that is able to separate blood cells from plasma through its defined pore opening, an analysis of plasma parameters can be carried out directly in the test strip.
  • This membrane can be, for example, a glass fiber filter with a suitable density or a plastic membrane with narrow channels, advantageously with asymmetrical channels that allow blood to penetrate. This fulfills the requirements for a quick test for on-site analysis.
  • interference parameters can be selectively filtered out using suitable media. If the opening 14 z. B. filled with aluminum oxide, a sample can be degreased directly, which is of great importance in food analysis. Similarly, particles can be removed by using a filter membrane or soil samples can be examined directly by using a filter together with an absorbent medium (e.g. activated carbon).
  • an absorbent medium e.g. activated carbon
  • test strip according to the invention can be produced in a manner known per se (WO-A-95/13542).
  • test strips can be produced which can be used by the customer himself.
  • the zones on the test strip that are to be used for the detection of the analyte are only preactivated, for example by chemical activation or coating using immunoreactive substances, for example protein A, protein G, streptavidin, etc.
  • the user then only needs to modify his analyte with complementary structures or to bind antibodies against the analyte in the zones in order to use the test strip for his purposes.
  • the quantitative determination of C-reactive protein is carried out in the following way: the reactive zones 3, 4 and a corresponding third zone are loaded with 2.3 ⁇ g each of an anti-human CRP antibody from rabbits on a 4 cm wide nitrocellu strip. The excess reactive groups of the nitrocellulose are then saturated with skimmed milk. Then a test strip consisting of the nitrocellulose, a porous glass fiber strip for receiving the anti-CRP-gold conjugate and a blood piasma-separating glass fiber membrane are mounted on a self-adhesive plastic film. After the application of thick paper strips to hold the necessary washing liquids, 5 mm wide strips are placed in a housing as shown in Figure 3.
  • the opening 14 is filled with 20 ⁇ l of blood (this corresponds reproducibly to an amount of plasma which is suitable for carrying out the test and which reaches the test strip). After 2 minutes, the opening 15 is filled with buffer.
  • the plasma is guided over the three reactive zones.
  • the buffer first passes through the glass fiber filter with the lyophilized gold-antibody conjugate and from there across the zones to which the CRP has already bound. At the points where CRP is present, the gold conjugate also binds and thus produces a color.
  • troponin I and CK-MB can also be measured in parallel in an analogous manner. Both parameters are important indicators of a myocardial infarction, but depending on the cause of the myocardial damage, the amount increases in time, so that their parallel determination provides important diagnostic information.
  • two zones are applied with a monoclonal mouse anti-human troponin I or CK-MB antibody.
  • the difference to the test according to Example 1 is that lyophilized antibody-enzyme conjugates are used instead of the antibody-gold conjugate. These antibodies are directed against a second domain of the analyte.
  • anti-troponin I is conjugated with peroxidase, anti-CK-MB with alkaline phosphatase.
  • BCIP / INT a phosphatase reagent which leaves an orange precipitate in the place of the phosphatase
  • TMB a peroxidase reagent, blue dye

Abstract

The invention relates to a method and a device for the differential determination of a quantity of at least one analyte in a liquid sample. A test strip which has at least two areas is used, these areas being composed in such a way that they can provide information about the quantity of the at least one analyte. The test strip also ensures that the sample or the portion of the sample flows laterally through the strip and the at least two areas by having a predetermined capacity for binding the at least one analyte in the first area. When this capacity is exceeded by a too great quantity of the at least one analyte, the at least one analyte is bound in at least one second area, the capacity of the second area being essentially equal to the capacity of the first area and the binding of the at least one analyte in the at least one first area and the at least one second area being measured by a detectable property.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR BESTIMMUNG EINES ANALYTEN METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING AN ANALYT
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur differentiellen Bestimmung einer Menge mindestens eines Analyten in einer Probe unter Verwendung einer festen Phase sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.The present invention relates to a method for the differential determination of an amount of at least one analyte in a sample using a solid phase and an apparatus for carrying out the method.
Teststreifen werden in der heutigen Analytik häufig eingesetzt. Teststreifen, die den Anforderungen eines Schnelltests genügen, beruhen im wesentlichen auf dem Prinzip, dass auf einer festen Matrix ein Reagenz fixiert ist, das mit dem nachzuweisenden Analyten reagiert. Dabei kann unter Umständen in einer nachgeschalteten Reaktion eine Farbänderung, ein Farbumschlag oder eine andere detektierbare Eigenschaft gemessen werden. So dient beispielsweise eine Färbung als Nachweis für die Anwesenheit eines zu identifizierenden Agens.Test strips are often used in today's analytics. Test strips that meet the requirements of a rapid test are essentially based on the principle that a reagent is fixed on a solid matrix that reacts with the analyte to be detected. Under certain circumstances, a color change, a color change or another detectable property can be measured in a subsequent reaction. For example, staining serves as evidence of the presence of an agent to be identified.
Als Beispiel seien hier für einen sehr umfangreichen Stand der Technik lediglich die WO-A-95/13542, WO-A-96/09546, EP-A-0 492 326 genannt.As examples of a very extensive state of the art, only WO-A-95/13542, WO-A-96/09546, EP-A-0 492 326 are mentioned here.
Die WO-A-98/22824 betrifft einen sogenannten Inhibitor-Assay. Diese Assay-Konfiguration geht von markierten Verbindungen, die dem Analyten entsprechen oder mit ihm identisch sind, aus. Die markierte Verbindung wird auf den Teststreifen vorgelegt und kompetiert mit dem in einer Probe vorhandenen Analyten. Die markierte Verbindung veriässt die ursprüngliche Zone und kann nachgewiesen werden. Dabei ist eine lineare Verfahrensweise grundsätzlich nicht möglich.WO-A-98/22824 relates to a so-called inhibitor assay. This assay configuration is based on labeled compounds that correspond to or are identical to the analyte. The marked compound is placed on the test strip and competes with the analyte present in a sample. The marked connection leaves the original zone and can be verified. A linear procedure is fundamentally not possible.
US-A-5,527,509 betrifft einen Assay, der mittels Enzymumsetzung eines niedermolekularen Analyten und nachfolgender Farbreaktion den Analyten bestimmt. Sogenannte Capture Assays, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden dort nicht erwähnt. Eine lineare Ausgestaltung dieses Assays ist nicht möglich.US-A-5,527,509 relates to an assay which determines the analyte by means of enzyme conversion of a low molecular weight analyte and subsequent color reaction. So-called capture assays, which are the subject of the present invention, are not mentioned there. A linear design of this assay is not possible.
Die US-A-5,252,496 betrifft ein Farbbildungsverfahren. Es werden dort grundsätzlich nur qualitative Assays offenbart. Ist der Assay mit zwei Zonen durchgeführt, dient eine Zone lediglich als Kontrolle.US-A-5,252,496 relates to a color formation process. Basically, only qualitative assays are disclosed there. If the assay is carried out with two zones, one zone serves only as a control.
US-A-5,229,073 betrifft einen nicht linearen kompetitiven Immunoassay.US-A-5,229,073 relates to a non-linear competitive immunoassay.
Die WO-A-98/36278 betrifft einen Capture Immunoassay, der verschiedene Detektionszonen mit Fängerkomponenten (Capture- Reagenzien) aufweist, die sich jeweils in der Capture-Konzentration unterscheiden, so dass eine lineare Durchführung des dort beschriebenen Assays nicht möglicht ist.WO-A-98/36278 relates to a capture immunoassay which has different detection zones with capture components (capture reagents), each of which differ in the capture concentration, so that a linear execution of the assay described there is not possible.
Ähnlich liegen die Verhältnisse bei in WO-A-96/34287, WO-A-96/34271, US-A-4,059,407, US-A-4,042,329 und EP-A-0 833 159 beschriebenen Verfahren, die entweder keine Capture Assays darstellen, oder nicht linear ausführbar gestaltet sind.The situation is similar for the methods described in WO-A-96/34287, WO-A-96/34271, US-A-4,059,407, US-A-4,042,329 and EP-A-0 833 159, which are either not capture assays , or are not designed to be linearly executable.
Gemeinsam ist vielen Teststreifen oder ähnlichen Systemen, dass oft nur eine einzige Art der Anfärbung erfolgt, so dass sich ein solcher Test nicht quantifizieren lässt. Er dient lediglich zur Feststellung einer Ja/Nein-Aussage. Entweder ist der Analyt in einer nachweisbaren Menge vorhanden, was sich in einer Farbbildung zeigt oder es entsteht keine Färbung, so dass der Analyt einen vorher bestimmten Grenzwert nicht überschreitet, also unter der Erfassungsgrenze des jeweiligen Teststreifens oder Testsystems liegt. Um systematische Fehler ausschalten zu können, muss darüber hinaus noch eine Funktionskontrolle vorgesehen werden, indem ein weiterer reaktionsunabhängiger Parameter eingeführt wird. Zwar ist dieser Aufbau von Teststreifen für viele Anwendungsfälle hinreichend. Jedoch können Fragestellungen, wie Schweregrad einer Belastung oder einer Erkrankung oder Veränderung der Menge eines Analyten während eines Sanierungsvorganges oder eines Therapieversuches, nicht zufriedenstellend beantwortet werden.What is common to many test strips or similar systems is that often only one type of staining takes place, so that such a test cannot be quantified. It only serves to determine one Yes / No statement. Either the analyte is present in a detectable amount, which is reflected in the formation of a color, or there is no coloring, so that the analyte does not exceed a previously determined limit value, that is to say it is below the detection limit of the respective test strip or test system. In order to be able to switch off systematic errors, a function check must also be provided by introducing a further reaction-independent parameter. This structure of test strips is sufficient for many applications. However, questions such as the severity of a stress or illness or change in the amount of an analyte during a rehabilitation process or a therapy attempt cannot be answered satisfactorily.
Ein weiterer Nachteil der verbreiteten Teststreifen oder Assay- Vorrichtungen liegt in der Notwendigkeit, Grenzwertüberschreitungen sicher anzuzeigen. Das bedeutet, dass oft nur ein sehr kleines Konzentrationsintervall zwischen einem Basiswert, bei dem die Färbung bereits einsetzt, und einer Maximalfärbung liegt. Tatsächlich liegen aber unter Umständen große Konzentrationsunterschiede zwischen dem Grenzwert der Erfassung eines Analyten als Empfindlichkeit des Testsystems und dem zu messenden Ist-Wert. So sind beispielsweise in der Umweltanalytik Verhältnisse von 1/105 häufig anzutreffen und selbst im medizinischen Bereich sind Verhältnisse von 1/103 zwischen den Mengen, in denen der Analyt vorliegen kann, keine Seltenheit.Another disadvantage of the popular test strips or assay devices lies in the need to reliably indicate that limit values have been exceeded. This means that there is often only a very small concentration interval between a base value, at which the coloring already begins, and a maximum coloring. In fact, there may be large differences in concentration between the limit value of the detection of an analyte as sensitivity of the test system and the actual value to be measured. For example, ratios of 1/10 5 are common in environmental analysis and even in the medical field, ratios of 1/10 3 between the amounts in which the analyte can be present are not uncommon.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht mithin darin, die oben genannten Nachteile der im Stand der Technik bereits vorhandenen Systeme zu vermeiden und quantifizierende Schnelltests bereitzustellen. Gelöst wird das der Erfindung zugrundeliegende Problem durch ein Verfahren zur differentiellen Bestimmung einer Menge mindestens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Teststreifens. Unter differentieller Bestimmung wird eine zumindest semiquantitative Bestimmung, also über eine reine qualitative Bestimmung hinausgehende Analyse verstanden. Dieser Teststreifen muss mindestens zwei Zonen aufweisen und einen lateralen Fluss der flüssigen Probe oder eines Probenanteils durch den Teststreifen und die mindestens zwei Zonen gewährleisten. Mindestens zwei Zonen sind so beschaffen sind, dass sie in der Lage sind, über die Menge des mindestens einen Analyten eine Aussage zu treffen, indem eine erste Zone, eine vorher definierte Kapazität zur Bindung des mindestens einen Analyten besitzt und bei Überschreiten dieser Kapazität, durch die für diese Kapazität zu große Menge des mindestens einen Analyten, eine Bindung des mindestens einen Analyten in mindestens einer zweiten Zone erfolgt, wobei die Kapazität der mindestens zwei Zonen jeweils im wesentlichen gleich ist und die Bindung des mindestens einen Analyten in der mindestens ersten und mindestens zweiten Zone durch eine detektierbare Eigenschaft gemessen wird. Vorzugsweise wird die Menge des mindestens einen Analyten durch eine Aktivität des mindestens einen Analyten bestimmt.The technical problem underlying the invention therefore consists in avoiding the above-mentioned disadvantages of the systems already present in the prior art and in providing quantifying rapid tests. The problem on which the invention is based is solved by a method for the differential determination of an amount of at least one analyte in a liquid sample using a test strip. Differential determination is understood to mean an at least semi-quantitative determination, that is to say an analysis going beyond a purely qualitative determination. This test strip must have at least two zones and ensure a lateral flow of the liquid sample or a portion of the sample through the test strip and the at least two zones. At least two zones are designed in such a way that they are able to make a statement about the amount of the at least one analyte, in that a first zone has a predefined capacity for binding the at least one analyte and if this capacity is exceeded, by the amount of the at least one analyte which is too large for this capacity, the at least one analyte is bound in at least one second zone, the capacity of the at least two zones being essentially the same in each case and the binding of the at least one analyte in the at least first and at least one second zone is measured by a detectable property. The amount of the at least one analyte is preferably determined by an activity of the at least one analyte.
Der Analyt kann dabei auf dem Teststreifen spezifisch und/oder unspezifisch gebunden werden. Vorzugsweise erfolgt die spezifische Bindung des mindestens einen Analyten über eine Affinität zu einem anderen Liganden oder Affinität zu dem für den Teststreifen verwendeten Material. Dabei kommt insbesondere eine Bindung über Immunaffinität durch an der Oberfläche des Teststreifens spezifisch oder unspezifisch gebundene Bindungspartner in Frage. Ein Beispiel für die unspezifische Bindung des mindestens einen Analyten auf dem Teststreifen ist die Präzipitation des mindestens einen Analyten auf dem verwendeten Teststreifen. Die spezifische Bindung zwischen dem mindestens einen Analyten und einem Affinitätsbindungs-partner kommt beispielsweise durch Rezeptor-/Ligandwechselwirkung, Enzym- /Substratwechsel Wirkung, Antigen-/Antikörperwechselwirkung sowie andere Affinitätsbindungen, wie Avidin, Streptavidin, Protein A, IgG und andere, dem Fachmann bekannte Systeme, zustande.The analyte can be bound specifically and / or non-specifically on the test strip. The specific binding of the at least one analyte preferably takes place via an affinity for another ligand or affinity for the material used for the test strip. In particular, binding via immunoaffinity by binding partners bound specifically or unspecifically to the surface of the test strip is possible. An example of the non-specific binding of the at least one analyte on the Test strip is the precipitation of the at least one analyte on the test strip used. The specific binding between the at least one analyte and an affinity binding partner comes, for example, through receptor / ligand interaction, enzyme / substrate interaction, antigen / antibody interaction and other affinity binding, such as avidin, streptavidin, protein A, IgG and others known to the person skilled in the art Systems, established.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die definierte Kapazität zur Bindung des mindestens einen Analyten auf dem Teststreifen in Abhängigkeit von der in einer zu analysierenden Probe zu erwartenden Menge des mindestens einen Analyten festzulegen, um bei Überschreiten der Kapazität der mindestens ersten Zone den mindestens einen Analyten dann in der zweiten Zone nachweisen zu können.To carry out the method according to the invention, it is preferred to determine the defined capacity for binding the at least one analyte on the test strip as a function of the amount of the at least one analyte to be expected in a sample to be analyzed, in order to at least exceed the capacity of the at least first zone to be able to detect an analyte in the second zone.
Vorzugsweise beträgt der Kapazitätsunterschied der im erfindungsgemäßen Capture Assay in der ersten und zweiten Zone applizierten Fängerkomponente nicht mehr als + 10%, insbesondere + 5%. Generell ist zu bemerken, dass je genauer die Kapazität des Fängers in den mindestens zwei Zonen eingestellt werden kann, desto präziser die Linearität des erfindungsgemäßen Assays ist. Es kann von Fall zu Fall vorteilhaft sein, bei Verwendung von mehr als zwei Zonen, die darüber hinausgehende Zone mit einer höheren Menge an Fänger zu versehen, also die Kapazität dieser Zone zu erhöhen, um eine bessere Detektion zu erreichen. Vorzugsweise ist bei Verwendung von mehreren Zonen jeweils die letzte Zone mit einer höheren Kapazität des Fängers versehen. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, dass im wesentlichen gleiche Mengen an bindendem Agens (Fänger) aufgebracht werden. Dadurch wird die Linearität erzielt, die es ermöglicht, auch Zwischenfärbungen sicher zu bewerten. Man ist mithin nicht, wie bei den anderen bekannten Mehrzonen-Assays, auf eine Titration (also de facto eine logarithmische Darstellung) eines Antikörpers angewiesen, siehe zum Beispiel die WO-A-98/36278. Auch bei Verdrängungsreaktionen, die grundsätzlich wegen des vorzulegenden markierten Analyten nicht linear sind, kann durch Aufbringen des markierten Analyten außerhalb der Bindungszone an dieser Linearität festgehalten werden. Dies ist zum Beispiel nach US-A-5,229,073 nicht möglich ist.The difference in capacity of the capture component applied in the capture and assay according to the invention in the first and second zones is preferably not more than + 10%, in particular + 5%. It should generally be noted that the more precisely the capacity of the catcher can be set in the at least two zones, the more precisely the linearity of the assay according to the invention is. If more than two zones are used, it can be advantageous to provide the zone beyond that with a higher amount of catcher, that is to say to increase the capacity of this zone in order to achieve better detection. When using several zones, the last zone is preferably provided with a higher capacity of the catcher. The advantage of the present invention is to be seen in the fact that essentially equal amounts of binding agent (scavenger) are applied. This achieves the linearity that also enables intermediate stains to be reliably assessed. Thus, unlike the other known multi-zone assays, one is not dependent on titration (ie de facto a logarithmic representation) of an antibody, see for example WO-A-98/36278. In the case of displacement reactions which are fundamentally non-linear because of the labeled analyte to be presented, this linearity can be maintained by applying the labeled analyte outside the binding zone. For example, this is not possible according to US-A-5,229,073.
Die Figur 1 erläutert beispielhaft die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens.FIG. 1 explains the method of operation of the method according to the invention by way of example.
Die Figur 2 zeigt ein Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn drei Zonen mit jeweils definierter Kapazität vorgesehen sind.FIG. 2 shows a result of the method according to the invention if three zones, each with a defined capacity, are provided.
Die Figur 3 betrifft eine Vorrichtung mit dem Teststreifen nach Fig. 4.FIG. 3 relates to a device with the test strip according to FIG. 4.
Die Figur 4 betrifft den erfindungsgemäßen Teststreifen.FIG. 4 relates to the test strip according to the invention.
Die Figur 1 zeigt schematisiert die Fixierung eines Antikörpers an einer festen Matrix, beispielsweise Nitrocellulose. Dann wird die so beschichtete Phase in lb) mit dem Analyten behandelt. Der Analyt bindet über Immunoaffinität an den entsprechenden Antikörper. Dieser wird dann zur Detektion in 1 c, beispielsweise mit einem weiteren Antikörper versetzt, der sich an das Antigen bindet und seinerseits markiert ist, insbesondere durch ein Goldkolloid. Dadurch wird die Anwesenheit des Analyten angezeigt. Reicht die Kapazität der ersten Zone nicht aus, um alle in der Probe befindlichen Analyten zu binden, so diffundieren diese mit anderen Probenbestandteilen auf dem festen porösen Träger weiter in Richtung der mindestens zweiten Zone, in der die Analyten dann von dem dort immobilisierten Antikörpern gebunden werden.FIG. 1 shows schematically the fixation of an antibody on a solid matrix, for example nitrocellulose. The phase coated in lb) is then treated with the analyte. The analyte binds to the corresponding antibody via immunoaffinity. This is then added to the detection in 1 c, for example with a further antibody which binds to the antigen and is in turn labeled, in particular by a gold colloid. This indicates the presence of the analyte. Enough capacity of the first If the zone is not sufficient to bind all analytes in the sample, these diffuse further with other sample components on the solid porous support in the direction of the at least second zone, in which the analytes are then bound by the antibodies immobilized there.
Erfindungsgemäß lässt sich also differenzieren, ob von einem Analyten in einer Probe Mengen unterhalb der Erfassungsgrenze, oberhalb der Erfassungsgrenze oder deutlich oberhalb der Erfassungsgrenze vorhanden sind. In der ersten Zone wird also die maximal bindbare Menge Analyt gebunden und beim Überschreiten der anwesenden Analytmenge wird eine weitere Bindung in der mindestens zweiten Zone oder weiteren Zonen erfolgen.According to the invention, it is therefore possible to differentiate whether amounts of an analyte are present in a sample below the detection limit, above the detection limit or significantly above the detection limit. The maximum bindable amount of analyte is thus bound in the first zone and if the amount of analyte present is exceeded, further binding will take place in the at least second zone or further zones.
Wichtig in diesem Zusammenhang ist die vorherige Bestimmung der Kapazität der Bindung des Analyten in der jeweiligen Zone. Dem Fachmann ist klar, dass diese durch die entsprechende Fragestellung bestimmt wird. Soll beispielsweise in der Umweltanalytik ein Schadstoff bestimmt werden, so kann es sich empfehlen in der mindestens ersten Zone die Kapazität so zu wählen, dass die Grenzwertüberschreitung eine schwache Färbung der mindestens ersten Zone ergibt. Ist in der Probe dann deutlich mehr Schadstoff enthalten, werden sich bei entsprechender Konzentration auch die mindestens zweite Zone und gegebenenfalls weiteren Zonen auf den verwendeten Teststreifen anfärben. Im medizinischen Bereich kann in analoger Weise vorgegangen werden, indem man die Kapazität der jeweiligen Zonen so wählt, dass Informationen über einen bestimmten Titer eines Analyten erfassbar werden. Auch hier kann sich, wenn ein bestimmter Wert (Schwellenwert) eines Analyten indikativ für einen pathologischen Zustand ist und dieser erkannt werden soll, anbieten, die Kapazität der mindestens ersten Zone im Konzentrationsbereich dieses Schwellenwertes zu wählen. Ist aber z.B. eine Funktionskontrolle durch Bestimmung eines Analyten erwünscht, so kann anstelle einer Grenzwertüberschreitung, die in der ersten Zone detektiert werden konnte, überhaupt die Anwesenheit des Analyten angezeigt werden, so z.B. im Fall der Bestimmung des C-reaktiven Proteins. Hier wird dann in der ersten Zone vorzugsweise anti-CRP-Antikörper in einer solchen Menge immobilisiert, die dafür Sorge trägt, dass ein Normalwert an CRP detektiert werden kann. Durch die Wahl der Kapazität der einzelnen Zonen kann in vielfältiger Weise ein Analyseziel abgearbeitet werden.In this context, it is important to determine the capacity of the analyte binding in the respective zone beforehand. It is clear to the person skilled in the art that this is determined by the corresponding question. If, for example, a pollutant is to be determined in environmental analysis, it may be advisable to select the capacity in the at least first zone so that the limit value violation results in a weak coloring of the at least first zone. If the sample contains significantly more pollutant, the at least second zone and possibly further zones will also stain on the test strips used if the concentration is appropriate. An analogous procedure can be used in the medical field by selecting the capacity of the respective zones in such a way that information about a specific titer of an analyte can be recorded. Here, too, if a certain value (threshold value) of an analyte is indicative of a pathological condition and this is to be recognized, the capacity of the to select at least the first zone in the concentration range of this threshold. However, if, for example, a functional check by determining an analyte is desired, the presence of the analyte can be displayed instead of a limit being exceeded, which could be detected in the first zone, for example in the case of the determination of the C-reactive protein. Anti-CRP antibodies are then preferably immobilized in the first zone in such an amount that ensures that a normal value of CRP can be detected. By selecting the capacity of the individual zones, an analysis target can be processed in a variety of ways.
Durch die Erhöhung der Zahl der Zonen kann eine feine Unterteilung des zu erfassenden Meßbereichs erreicht werden. Aus praktischen Gründen wird jedoch die Zahl der Zonen regelmäßig zwischen drei bis zehn liegen. Dabei wird die obere Grenze regelmäßig durch Ablesbarkeit oder Interpretierbarkeit der Ergebnisse festgelegt werden.By increasing the number of zones, a fine division of the measuring range to be recorded can be achieved. For practical reasons, however, the number of zones will regularly be between three and ten. The upper limit will be determined regularly by the readability or interpretability of the results.
Die Figur 2 zeigt das Beispiel eines medizinischen Immuntests. So liegt beispielsweise bei Menschen die in Plasma gebundene Menge an C- reaktiven Proteinen, einem allgemeinen Marker für bakterielle Entzündungen, etwa zwischen 0,2 und 200 mg/1, wobei Werte bis etwa 10 mg/1 als normal angesehen werden. Über diesem Wert liegende Konzentrationen deuten auf unterschiedliche Formen bakterieller Infektionen hin. Da zudem die Plasmakonzentration an C-reaktiven Proteinen sehr schnell auf positive Behandlung reagiert, kommen in der Praxis tatsächlich alle Konzentrationen im genannten Bereich vor.Figure 2 shows the example of a medical immunoassay. In humans, for example, the amount of C-reactive proteins bound in plasma, a general marker for bacterial inflammation, is approximately between 0.2 and 200 mg / 1, values up to approximately 10 mg / 1 being considered normal. Concentrations above this value indicate different forms of bacterial infections. In addition, since the plasma concentration of C-reactive proteins reacts very quickly to positive treatment, in practice all concentrations actually occur in the range mentioned.
Die in Figur 2 schematisch dargestellte Situation zeigt nun drei verschiedene Zonen, die mit C-reaktiven Proteinen immunologisch in Wechselwirkung treten können. Regelmäßig lassen sich folgende drei Zustände visuell ablesen: - keine Färbung, (+) schwach und + intensive Färbung. Zeigt sich nun bei einem Teststreifen die in Figur 2 als Situation 1 angegebene Situation, nämlich schwache Färbung in der ersten Zone und in der zweiten und dritten Zone keine Färbung, liegt die Menge an C-reaktivem Protein im Bereich von 0,2 bis 5 mg/1. Dabei wurde die Kapazität der jeweiligen Zonen auf diese Mengen abgestimmt. Die Situation 2 zeigt nun eine erhöhte Plasmakonzentration von C-reaktivem Protein, indem die Färbung entsprechend intensiver ausfällt. Diese Situation entspricht einem Gehalt von 5 bis 10 mg/1 , in Situation 3 bildet sich in der ersten Zone die maximal mögliche Färbung und eine schwächere Färbung in der zweiten Zone, wohingegen die Zone 3 gar nicht gefärbt ist, was auf eine Menge von 11 bis 15 mg/1 hindeutet, Situation 4 zeigt starke Färbung in der ersten und zweiten Zone, die dritte Zone ist nicht gefärbt, was einem Plasmaspiegel von 16 bis 25 mg/1 entspricht, die Situation 5 zeigt in den beiden ersten Zonen Maximalfärbung und in Zone 3 schwache Färbung entsprechend einem Plasmaspiegel von 25 bis 50 mg/1 und Situation 6 zeigt starke Färbung in allen drei Bereichen, woraus dann geschlossen werden kann, dass > 50 mg/1 vorhanden ist. Dieses beispielhaft angegebene Drei-Zonen- Modell lässt also durch einfache Kombination der Zahl der gefärbten Zonen und Färbeintensität insgesamt eine sechsstufige Differenzierung zu. Durch Wahl der ersten Zone mit einer Kapazität zwischen 0,2 und 5 mg/1 ist darüber hinaus auch eine Funktionskontrolle inhärent vorhanden, da die erste Zone praktisch bei jedem Patienten schwach positiv sein muss (Basalniveau). Grundsätzlich kann man daher bei N- Zonen doppelt so viele, also zwei N-Zustände sicher unterscheiden, wobei durch die unterschiedliche Menge an Reagenz, die pro Zone aufgebracht wird, sehr verschiedene Abstufungen möglich sind, wie bereits oben beispielhaft erläutert. Erfindungsgemäß werden beispielsweise als Analyt C-reaktives Protein (CRP), Rheumafaktoren, Troponin I, Creatinin-Kinase (CK-MB), Myoglobin, Antigene der Organismen Samonella, Legionella, E. coli (EHEC), Aspergillus flavus und fumigatus, Glucose, Dioxin, PCB, Cocain (Ecgonin), Heroin, Amphetamin und andere pathologisch indikative oder umweltanalytisch relevante Substanzen messbar.The situation shown schematically in FIG. 2 now shows three different zones which can interact immunologically with C-reactive proteins. The following three are regular Read conditions visually: - no coloring, (+) weak and + intensive coloring. If the situation shown in FIG. 2 as situation 1, namely weak coloring in the first zone and no coloring in the second and third zones, is shown in a test strip, the amount of C-reactive protein is in the range from 0.2 to 5 mg /1. The capacity of the respective zones was matched to these quantities. Situation 2 now shows an increased plasma concentration of C-reactive protein in that the staining is correspondingly more intense. This situation corresponds to a content of 5 to 10 mg / 1, in situation 3 the maximum possible coloration is formed in the first zone and a weaker coloration in the second zone, whereas zone 3 is not colored at all, which indicates an amount of 11 to 15 mg / 1 indicates, situation 4 shows strong coloring in the first and second zones, the third zone is not colored, which corresponds to a plasma level of 16 to 25 mg / 1, situation 5 shows maximum coloring in and in the first two zones Zone 3 weak staining corresponding to a plasma level of 25 to 50 mg / 1 and situation 6 shows strong staining in all three areas, from which it can then be concluded that> 50 mg / 1 is present. This three-zone model given by way of example therefore allows a six-stage differentiation by simply combining the number of colored zones and the intensity of dyeing. By choosing the first zone with a capacity between 0.2 and 5 mg / 1, a functional control is also inherently available, since the first zone must be weakly positive in practically every patient (basal level). In principle, therefore, it is possible to differentiate twice as many, ie two N states, in the case of N zones, the different amounts of reagent applied per zone making it possible to use very different levels, as already explained above by way of example. According to the invention, for example, analyte C-reactive protein (CRP), rheumatoid factors, troponin I, creatinine kinase (CK-MB), myoglobin, antigens of the organisms Samonella, Legionella, E. coli (EHEC), Aspergillus flavus and fumigatus, glucose, Dioxin, PCB, cocaine (ecgonine), heroin, amphetamine and other pathologically indicative or environmentally relevant substances can be measured.
Vorteilhafterweise können durch entsprechende Belegung der mindestens zwei Zonen auch zwei oder mehr Analyten parallel bestimmt werden. Beispielsweise kommen als paarweise bestimmbare Analyten mit klinischer oder umweit-analytischer Relevanz die folgenden Paare in Betracht: CRP und Antistreptolysin, Troponin I und CK-MB, Myoglobin und CK-MB, CK-MB, Myoglobin und Troponin I, Cocain, Heroin und Amphetamin, Samonella und E. coli.By appropriately covering the at least two zones, two or more analytes can advantageously also be determined in parallel. For example, the following pairs come into consideration as analytes that can be determined in pairs with clinical or environmental analytical relevance: CRP and antistreptolysin, troponin I and CK-MB, myoglobin and CK-MB, CK-MB, myoglobin and troponin I, cocaine, heroin and amphetamine , Samonella and E. coli.
Für den Teststreifen, der im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise eingesetzt wird, kommt grundsätzlich ein Material in Frage, das eine gewissen Porosität aufweist, wie poröse Träger umfassend Nitrocellulose, Nylon, PTFE, Polystyrol, Latex, Glasfasern, Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose, Dextran, Agarose, Polyvinylalkohol, auch als Mikrokugeln oder "magnetobeads", gegebenenfalls voraktiviert mit BrCN, NPCF, NHS-chloroformiat, Tresylchlorid, Quadratsäure-estern und/oder entsprechende Chlorosilane.For the test strip which is advantageously used in the method according to the invention, a material that has a certain porosity is in principle possible, such as porous supports comprising nitrocellulose, nylon, PTFE, polystyrene, latex, glass fibers, silica gel, aluminum oxide, cellulose, dextran, agarose , Polyvinyl alcohol, also as microspheres or "magnetobeads", optionally preactivated with BrCN, NPCF, NHS chloroformate, tresyl chloride, squaric acid esters and / or corresponding chlorosilanes.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb besonders anwenderfreundlich, da durch Auswahl der Konzentrationen, die in den einzelnen Zonen nachgewiesen werden sollen, individuelle analytische Probleme gelöst werden können. So kann der Anwender beispielsweise selbst, z. B. durch Belegung der Zonen mit einem mit dem Analyten in Wechselwirkung tretenden Agens, individuelle Analyseprobleme angehen.The method according to the invention is therefore particularly user-friendly since individual analytical problems can be solved by selecting the concentrations which are to be detected in the individual zones. For example, the user himself, e.g. B. by covering the zones with one with the analyte in Interacting agent to tackle individual analysis problems.
Der für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete erfindungsgemäße Teststreifen weist einen im wesentlichen porösen Träger 2 auf, welcher für Flüssigkeiten durchdringbar ist sowie mindestens zwei Zonen 3, 4 mit mindestens einem Fänger für mindestens einen Analyten, wobei der mindestens eine Analyt mittelbar oder unmittelbar an den Fänger gebunden wird und die Zonen 3, 4 jeweils eine vorher definierte Bindungskapazität für den mindestens einen Analyten besitzen, die im wesentlichen gleich ist und die Fänger für die jeweiligen Analyten gleich sind. Ein typischer Teststreifen ist in Figur 4 gezeigt.The test strip according to the invention which is suitable for carrying out the method according to the invention has an essentially porous carrier 2 which can be penetrated by liquids and at least two zones 3, 4 with at least one catcher for at least one analyte, the at least one analyte directly or indirectly to the Captor is bound and the zones 3, 4 each have a previously defined binding capacity for the at least one analyte, which is essentially the same and the catchers are the same for the respective analytes. A typical test strip is shown in Figure 4.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nimmt den erfindungsgemäßen Teststreifen auf. Die Vorrichtung weist ein Gehäuse auf, in dem der Teststreifen angeordnet ist. Das Gehäuse besteht aus einer Oberseite, die an den Stellen der mindestens zwei Zonen des Teststreifens mindestens eine Öffnung besitzt, die sich über den Bereich der mindestens zwei Zonen des Teststreifens erstreckt und mindestens eine weitere Öffnung zur Applikation mindestens einer zu untersuchenden Probe und/oder Hilfsstoffe zur Durchführung eines Assays besitzt, die den Kontakt einer Flüssigkeit mit dem Teststreifen ermöglicht. Vorzugsweise weist die Vorrichtung eine weitere Öffnung zur Aufnahme von Hilfsreagenzien auf. In einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist diese anstelle der einen Öffnung 12, die sich über den gesamten Bereich der Zonen 3, 4 des Teststreifens erstreckt, so viele Öffnungen auf, wie der Anzahl der Zonen des Teststreifens entspricht. Dabei ist zur Ablesung des Resultats in den Zonen des Teststreifens es erforderlich, dass die Öffnungen im Gehäuse im wesentlichen kongruent sind mit den Zonen des Teststreifens.The device according to the invention for carrying out the method according to the invention receives the test strip according to the invention. The device has a housing in which the test strip is arranged. The housing consists of an upper side which has at least one opening at the locations of the at least two zones of the test strip, which extends over the region of the at least two zones of the test strip and at least one further opening for application of at least one sample and / or auxiliary substances to be examined for performing an assay that allows contact of a liquid with the test strip. The device preferably has a further opening for receiving auxiliary reagents. In another embodiment of the device according to the invention, instead of the one opening 12 which extends over the entire area of zones 3, 4 of the test strip, it has as many openings as corresponds to the number of zones of the test strip. To read the result in the zones of the test strip, it is necessary that the openings in the housing are essentially congruent with the zones of the test strip.
Die Figur 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Dabei ist die Oberseite 11 des GehäusesFIG. 3 shows a preferred embodiment of the device according to the invention. The top 11 of the housing
10 an mehreren Stellen mit Öffnungen durchbrochen. An den Stellen der mindestens zwei Zonen 3, 4 des Teststreifens 1 ist in der Oberseite10 perforated in several places with openings. At the locations of the at least two zones 3, 4 of the test strip 1 is in the top
11 des Gehäuses 10 eine Öffnung 12 vorgesehen, die sich über den Bereich der mindestens zwei Zonen 3, 4 des Teststreifens 1 erstreckt. Weiterhin ist eine Öffnung 14 vorgesehen, mit deren Hilfe die Applikation der zu untersuchenden Probe erfolgt. Gegebenenfalls können ebenfalls Hilfsstoffe zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die Öffnung 14 zugegeben werden. Die Öffnung 14 weist eine Wandung auf und steht mit dem Teststreifen 1 in Verbindung. Nach Applikation der Probe zieht diese bedingt durch die Porosität des Teststreifens in den Teststreifen und wandert aufgrund von Kapillarkräften in lateraler Richtung durch den Teststreifen und mithin durch die Zonen 3, 4. Die Größe der Öffnung 14 bestimmt das Volumen, welches die Öffnung aufnehmen kann. Durch den exakten Durchmesser und die Höhe der Öffnung ist das Probevolumen genau bestimmt. Ist das Volumen, welches die Öffnung 14 zur Verfügung stellt für eine Probenauftragung zu gering, wird mittels eines in die Öffnung steckbaren Röhrchens das Probeaufnahmevolumen vergrößert. Es ist insbesondere möglich, durch Einstecken eines Röhrchens mit definiertem Volumen (festgelegte Wandstärke und -länge) ein definiertes Volumen bereitzustellen, welches auf den quantitativen oder semiquantitativen Assay der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden kann, abgestimmt ist. Die weitere Öffnung 15 ist zur Aufnahme von Hilfsreagenzien geeignet. Die Öffnung 14 kann durch weitere Ergänzungen den jeweiligen Bedürfnissen angepasst werden. Befindet sich z. B. direkt unter der Öffnung 14 in Kontakt mit dem Teststreifen eine handelsübliche Membran, die in der Lage ist, durch ihre definierte Porenöffnung Blutzellen von Plasma abzutrennen, so kann direkt im Teststreifen eine Analyse von Plasmaparametern durchgeführt werden. Diese Membran kann z.B. ein Glasfaserfilter mit geeigneter Dichte oder eine Kunststoffmembran mit engen Kanälen sein, vorteilhafterweise mit asymmetrischen Kanälen, die ein Eindringen des Blutes ermöglichen. Dadurch werden Forderungen an einen Schnelltest zur vor-Ort-Analytik erfüllt.11 of the housing 10, an opening 12 is provided which extends over the area of the at least two zones 3, 4 of the test strip 1. Furthermore, an opening 14 is provided, with the aid of which the sample to be examined is applied. If necessary, auxiliaries for carrying out the method according to the invention can also be added through the opening 14. The opening 14 has a wall and is connected to the test strip 1. After application of the sample, this pulls into the test strip due to the porosity of the test strip and, due to capillary forces, migrates in a lateral direction through the test strip and therefore through zones 3, 4. The size of the opening 14 determines the volume that the opening can accommodate. The sample volume is precisely determined by the exact diameter and the height of the opening. If the volume which the opening 14 makes available for a sample application is too small, the sample receiving volume is increased by means of a tube which can be inserted into the opening. It is in particular possible to provide a defined volume by inserting a tube with a defined volume (defined wall thickness and length), which is matched to the quantitative or semi-quantitative assay that can be carried out with the device according to the invention. The further opening 15 is suitable for receiving auxiliary reagents. The opening 14 can be adapted to the respective needs by further additions. Is z. B. directly under the opening 14 in contact with the test strip, a commercially available membrane that is able to separate blood cells from plasma through its defined pore opening, an analysis of plasma parameters can be carried out directly in the test strip. This membrane can be, for example, a glass fiber filter with a suitable density or a plastic membrane with narrow channels, advantageously with asymmetrical channels that allow blood to penetrate. This fulfills the requirements for a quick test for on-site analysis.
Auf diese Weise können durch geeignete Medien selektiv Störparameter herausgefiltert werden. Wird die Öffnung 14 z. B. mit Aluminiumoxid gefüllt, so kann eine Probe direkt entfettet werden, was in der Lebensmittelanalytik von großer Bedeutung ist. Auf ähnliche Weise können durch die Verwendung einer Filtermembran Partikel entfernt oder durch die Anwendung eines Filters zusammen mit einem absorbierenden Medium (z. B. Aktivkohle) direkt Bodenproben untersucht werden.In this way, interference parameters can be selectively filtered out using suitable media. If the opening 14 z. B. filled with aluminum oxide, a sample can be degreased directly, which is of great importance in food analysis. Similarly, particles can be removed by using a filter membrane or soil samples can be examined directly by using a filter together with an absorbent medium (e.g. activated carbon).
Der erfindungsgemäße Testsstreifen kann in an sich bekannter Weise (WO-A-95/13542) hergestellt werden. Auch die WO-A-96/09546 und EP-A-0 291 194, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, betrifft die Herstellung der auch erfindungsgemäß einsetzbaren Teststreifen. Vorteilhaft am erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten System ist es, dass Teststreifen hergestellt werden können, welche vom Kunden selbst belegt werden können. Dazu werden die Zonen auf dem Teststreifen, die zur Detektion des Analyten dienen sollen, lediglich voraktiviert, beispielsweise durch chemische Aktivierung oder Belegung mittels immunreaktiver Stoffe, beispielsweise Protein A, Protein G, Streptavidin, etc. Der Anwender braucht dann lediglich seinen Analyten mit komplementären Strukturen zu modifizieren oder Antikörper gegen den Analyten in den Zonen zu binden, um den Teststreifen für seine Zwecke zu verwenden.The test strip according to the invention can be produced in a manner known per se (WO-A-95/13542). WO-A-96/09546 and EP-A-0 291 194, to which express reference is made here, also relates to the production of the test strips which can also be used according to the invention. It is an advantage of the system provided according to the invention that test strips can be produced which can be used by the customer himself. For this purpose, the zones on the test strip that are to be used for the detection of the analyte are only preactivated, for example by chemical activation or coating using immunoreactive substances, for example protein A, protein G, streptavidin, etc. The user then only needs to modify his analyte with complementary structures or to bind antibodies against the analyte in the zones in order to use the test strip for his purposes.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben:The invention is described in more detail using the following examples:
Beispiel 1example 1
Die quantitative Bestimmung von C-reaktivem Protein wird auf folgende Weise durchgeführt: auf einem 4 cm breiten Nitrocellu losestreifen werden die reaktiven Zonen 3,4 und eine entsprechende dritte Zone mit je 2,3 μg eines anti-human CRP-Antikörper aus Kaninchen beladen. Die überschüssigen reaktiven Gruppen der Nitrocellulose werden anschließend mit Magermilch abgesättigt. Anschließend wird ein Teststreifen, bestehend aus der Nitrocellulose, darauf ein poröser Glasfaserstreifen zur Aufnahme des anti-CRP-Gold-Konjugates sowie eine Blut-Piasma-separierende Glasfasermembran auf eine selbstklebende Kunststofffolie montiert. Nach dem Aufbringen von dicken Papierstreifen zur Aufnahme der nötigen Waschflüssigkeiten werden 5 mm breite Streifen in einem Gehäuse der Abbildung 3 untergebracht.The quantitative determination of C-reactive protein is carried out in the following way: the reactive zones 3, 4 and a corresponding third zone are loaded with 2.3 μg each of an anti-human CRP antibody from rabbits on a 4 cm wide nitrocellu strip. The excess reactive groups of the nitrocellulose are then saturated with skimmed milk. Then a test strip consisting of the nitrocellulose, a porous glass fiber strip for receiving the anti-CRP-gold conjugate and a blood piasma-separating glass fiber membrane are mounted on a self-adhesive plastic film. After the application of thick paper strips to hold the necessary washing liquids, 5 mm wide strips are placed in a housing as shown in Figure 3.
Zur Durchführung der Analyse wird die Öffnung 14 mit 20 μl Blut gefüllt (dies entspricht reproduzierbar einer für die Testdurchführung geeigneten Menge Plasma, die auf den Teststreifen gelangt). Nach 2 min wird die Öffnung 15 mit Puffer gefüllt.To carry out the analysis, the opening 14 is filled with 20 μl of blood (this corresponds reproducibly to an amount of plasma which is suitable for carrying out the test and which reaches the test strip). After 2 minutes, the opening 15 is filled with buffer.
Das Plasma wird in dieser Anordnung über die drei reaktiven Zonen geführt. Der Puffer gelangt als erstes durch das Glasfaserfilter mit dem lyophilisierten Gold-Antikörper-Konjugat und von dort über die Zonen, an die bereits das CRP gebunden hat. An den Stellen, an denen CRP vorliegt, bindet auch das Gold-Konjugat und erzeugt so eine Färbung.In this arrangement, the plasma is guided over the three reactive zones. The buffer first passes through the glass fiber filter with the lyophilized gold-antibody conjugate and from there across the zones to which the CRP has already bound. At the points where CRP is present, the gold conjugate also binds and thus produces a color.
Überschüssiges Reagenz und andere Substanzen werden durch den nachfolgenden Puffer ausgewaschen. Nach 5 min kann das Ergebnis abgelesen werden.Excess reagent and other substances are washed out by the subsequent buffer. The result can be read after 5 minutes.
Beispiel 2Example 2
Auf die in Beispiel 1 beschriebene Art können auch Troponin I und CK- MB in analoger Weise parallel gemessen werden. Beide Parameter sind wichtige Indikatoren für einen Herzinfarkt, haben aber je nach Ursache der Herzmuskelschädigung zeitlich unterschiedliche Mengenzunahme, so dass ihre Parallelbestimmung wichtige diagnostische Informationen liefert. Zu ihrer Bestimmung werden je zwei Zonen mit einem monoklonalen Maus-anti human Troponin I bzw. CK-MB-Antikörper aufgebracht. Der Unterschied zum Test gemäß Beispiel 1 besteht darin, daß lyophilisierte Antikörper-Enzymkonjugate statt des Antikörper-Gold- Konjugats verwendet werden. Diese Antikörper sind gegen eine zweite Domäne des Analyten gerichtet. Anti-Troponin I ist in diesem Fall mit Peroxidase, anti-CK-MB mit alkalischer Phosphatase konjugiert.In the manner described in Example 1, troponin I and CK-MB can also be measured in parallel in an analogous manner. Both parameters are important indicators of a myocardial infarction, but depending on the cause of the myocardial damage, the amount increases in time, so that their parallel determination provides important diagnostic information. To determine them, two zones are applied with a monoclonal mouse anti-human troponin I or CK-MB antibody. The difference to the test according to Example 1 is that lyophilized antibody-enzyme conjugates are used instead of the antibody-gold conjugate. These antibodies are directed against a second domain of the analyte. In this case, anti-troponin I is conjugated with peroxidase, anti-CK-MB with alkaline phosphatase.
Nachdem die Reaktion durchgeführt sind, wird nachfolgend in die Öffnung 15 BCIP/INT (ein Phosphatase-Reagenz, das ein orangenes Präzipitat an der Stelle der Phosphatase hinterlässt) und TMB (ein Peroxidase-Reagenz, blauer Farbstoff) gegeben. Anschließend kann der Test wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgewertet werden. After the reaction has been carried out, BCIP / INT (a phosphatase reagent which leaves an orange precipitate in the place of the phosphatase) and TMB (a peroxidase reagent, blue dye) are subsequently introduced into the opening 15. The test can then be evaluated as described in Example 1.

Claims

A n s p r ü c h e Expectations
1. Verfahren zur differentiellen Bestimmung einer Menge mindestens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Teststreifens, der mindestens zwei Zonen aufweist, die so beschaffen sind, dass sie in der Lage sind, über die Menge des mindestens einen Analyten eine Aussage zu treffen und der Teststreifen einen lateralen Fluss der Probe oder eines Probenanteils durch den Streifen sowie die mindestens zwei Zonen gewährleistet, indem eine erste Zone eine vorher definierte Kapazität zur Bindung des mindestens einen Analyten besitzt und bei Überschreiten dieser Kapazität durch die für diese Kapazität zu große Menge des mindestens einen Analyten eine Bindung des mindestens einen Analyten in mindestens einer zweiten Zone erfolgt, wobei die Kapazität der zweiten Zone im wesentlichen gleich der Kapazität der ersten Zone ist und die Bindung des mindestens einen Analyten in der mindestens ersten und mindestens zweiten Zone durch eine detektierbare Eigenschaft gemessen wird.1. A method for the differential determination of an amount of at least one analyte in a liquid sample using a test strip which has at least two zones which are designed in such a way that they are able to make a statement about the amount of the at least one analyte and the test strip ensures a lateral flow of the sample or a portion of the sample through the strip and the at least two zones in that a first zone has a predefined capacity for binding the at least one analyte and, if this capacity is exceeded, by the amount of the at least too large for this capacity the analyte is bound to at least one analyte in at least one second zone, the capacity of the second zone being substantially equal to the capacity of the first zone and the binding of the at least one analyte in the at least first and at least second zones measured by a detectable property w earth
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des mindestens einen Analyten auch durch eine Aktivität des mindestens einen Analyten bestimmbar ist.2. The method according to claim 1, wherein the amount of the at least one analyte can also be determined by an activity of the at least one analyte.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Bindung des mindestens einen Analyten an der festen Phase spezifisch und/oder unspezifisch ist. 3. The method according to claim 1 and / or 2, wherein the binding of the at least one analyte to the solid phase is specific and / or non-specific.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die spezifische Bindung des mindestens einen Analyten über Affinität, insbesondere Immunaffinität und die unspezifische Bindung des mindestens einen Analyten durch Präzipitation des mindestens einen Analyten erfolgt.4. The method according to claim 3, wherein the specific binding of the at least one analyte takes place via affinity, in particular immunoaffinity, and the non-specific binding of the at least one analyte by precipitation of the at least one analyte.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die definierte Kapazität zur Bindung des mindestens einen Analyten an der festen Phase in Abhängigkeit von der in einer zu analysierenden Probe zu erwartenden Menge des mindestens einen Analyten festgelegt wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the defined capacity for binding the at least one analyte to the solid phase is determined as a function of the amount of the at least one analyte to be expected in a sample to be analyzed.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Unterschied zwischen der Kapazität der jeweiligen Fängerkomponenten in der ersten und der zweiten Zone + 10%, insbesondere + 5% nicht überschreitet.6. The method according to claim 5, wherein the difference between the capacity of the respective catcher components in the first and the second zone does not exceed + 10%, in particular + 5%.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei bei Vorhandensein von weniger als zwei Zonen die weiteren, insbesondere jeweils letzten Zonen, eine höhere Fängerkapazität aufweist.7. The method according to claim 5 or 6, wherein in the presence of less than two zones, the further, in particular last zones, has a higher catcher capacity.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der mindestens eine Analyt das C-reaktive Protein (CRP), Rheuma-Faktor, Troponin I, Creatinin-Kinase (CK-MB), Myoglobin, Antigene der Organismen Salmonella Legionella, E. Coli (EHEC, usw.), Aspergillus flavus und fumigatus, Glucose, Dioxin, PCB, Cocain (Ecgonin), Heroin, Amphetamin ist.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the at least one analyte, the C-reactive protein (CRP), rheumatism factor, troponin I, creatinine kinase (CK-MB), myoglobin, antigens of the organisms Salmonella Legionella, E Coli (EHEC, etc.), Aspergillus flavus and fumigatus, glucose, dioxin, PCB, cocaine (ecgonine), heroin, amphetamine.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zwei oder mehr Analyten bestimmt werden. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein two or more analytes are determined.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei als Analyten CRP und anti- Streptolysin, Troponin I und CK-MB, Myoglobin und CK-MB, CK-MB, Myoglobin und Troponin I, Cocain Heroin und Amphetamin, Salmonella und E. coli bestimmt werden.10. The method according to claim 9, wherein the analytes CRP and anti-streptolysin, troponin I and CK-MB, myoglobin and CK-MB, CK-MB, myoglobin and troponin I, cocaine heroin and amphetamine, Salmonella and E. coli are determined .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Festphase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nitrocellulose, Nylon, PTFE, Polystyrol, Latex, Glasfasern, Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose, Dextran, Agarose, Polyvinylalkohol, auch als Mikrokugeln oder "magnetobeads", gegebenenfalls voraktiviert mit BrCN, NPCF, NHS-chloroformiat, Tresylchlorid, Quadratsäureestern und/oder entsprechende Chlorosilane.11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the solid phase is selected from the group comprising nitrocellulose, nylon, PTFE, polystyrene, latex, glass fibers, silica gel, aluminum oxide, cellulose, dextran, agarose, polyvinyl alcohol, also as microspheres or "magnetobeads ", optionally preactivated with BrCN, NPCF, NHS chloroformate, tresyl chloride, squaric acid esters and / or corresponding chlorosilanes.
12. Teststreifen (1) zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11 auf Basis eines im wesentlichen porösen Trägers (2), der für Flüssigkeiten durchdringbar ist, mit mindestens zwei Zonen (3,4) mit mindestens einem Fänger für mindestens einen Analyten, wobei der mindestens eine Analyt mittelbar oder unmittelbar an den Fänger gebunden wird und die Zonen (3,4) jeweils eine vorher definierte Bindungskapazität für den mindestens einen Analyten aufweisen, die im wesentlichen gleich ist, und die Fänger für die jeweiligen Analyten gleich sind.12. Test strips (1) for performing the method according to at least one of claims 1 to 11 based on an essentially porous carrier (2) which can be penetrated by liquids, with at least two zones (3,4) with at least one catcher for at least an analyte, the at least one analyte being bound directly or indirectly to the catcher and the zones (3, 4) each having a previously defined binding capacity for the at least one analyte, which is essentially the same, and the catchers for the respective analytes are the same are.
13. Teststreifen (1) nach Anspruch 12, der als porösen Träger (2) eine Schicht aus Nitrocellulose, Nylon, PTFE, Polystyrol, Latex, Glasfasern, Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose, Dextran, Agarose, Polyvinylalkohol, und Zonen aus Mikrokugeln oder "magnetobeads", und/oder Zonen umfaßt, die gegebenenfalls mit BrCN, NPCF, NHS- chloroformiat, Tresylchlorid, Quadratsäureestern und/oder entsprechenden Chlorosilanen, voraktiviert sind.13. Test strip (1) according to claim 12, which as the porous carrier (2) is a layer of nitrocellulose, nylon, PTFE, polystyrene, latex, glass fibers, silica gel, aluminum oxide, cellulose, dextran, agarose, polyvinyl alcohol, and zones made of microspheres or " magnetobeads ", and / or zones which may be covered with BrCN, NPCF, NHS chloroformate, tresyl chloride, squaric acid esters and / or corresponding chlorosilanes, are preactivated.
14. Vorrichtung mit mindestens einem Teststreifen (1) nach einem der Ansprüche 12 und/oder 13, wobei der Teststreifen (1) in einem Gehäuse (10) angeordnet ist, das Gehäuse (10) eine Oberseite14. The device with at least one test strip (1) according to one of claims 12 and / or 13, wherein the test strip (1) is arranged in a housing (10), the housing (10) an upper side
(11) aufweist, die an den Stellen der mindestens zwei Zonen (3,4) des Teststreifens (1) mindestens eine Öffnung (12) besitzt, die sich über den Bereich der mindestens zwei Zonen (3,4) des Teststreifens (1) erstreckt und mindestens eine weitere Öffnung (14) zur Applikation mindestens einer zu untersuchenden Probe und/oder Hilfsstoffe zur Durchführung eines Assays besitzt, insbesondere mit einer Wandung, die bis auf den Teststreifen reicht und die den Kontakt einer Flüssigkeit mit dem Teststreifen (1) ermöglicht.(11), which has at the locations of the at least two zones (3, 4) of the test strip (1) at least one opening (12) which extends over the area of the at least two zones (3, 4) of the test strip (1) extends and has at least one further opening (14) for application of at least one sample to be examined and / or auxiliary substances for carrying out an assay, in particular with a wall which extends to the test strip and which enables a liquid to come into contact with the test strip (1) .
15. Vorrichtung nach Anspruch 14 mit einer weiteren Öffnung (15) zur Aufnahme von Hilfsreagenzien, wobei die Öffnung (15) entweder zwischen den Öffnungen (12) und (14) oder vor den Öffnungen15. The apparatus of claim 14 with a further opening (15) for receiving auxiliary reagents, wherein the opening (15) either between the openings (12) and (14) or in front of the openings
(12) und (14) angeordnet ist.(12) and (14) is arranged.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei die Öffnung (12) ersetzt ist durch mindestens zwei Öffnungen (16,17), die mit der Lage der mindestens zwei Zonen (3,4) des Teststreifens (1) im wesentlichen kongruent sind. 16. The device according to one of claims 14 or 15, wherein the opening (12) is replaced by at least two openings (16, 17) which are substantially congruent with the position of the at least two zones (3, 4) of the test strip (1) are.
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