WO1999066958A2 - Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines en therapie du cancer - Google Patents

Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines en therapie du cancer Download PDF

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WO1999066958A2
WO1999066958A2 PCT/FR1999/001383 FR9901383W WO9966958A2 WO 1999066958 A2 WO1999066958 A2 WO 1999066958A2 FR 9901383 W FR9901383 W FR 9901383W WO 9966958 A2 WO9966958 A2 WO 9966958A2
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phenyl
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carbon atoms
apoptosis
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Guido Kroemer
Tamara Hirsch
Didier Decaudin
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines

Definitions

  • the present invention relates in particular to a combination product comprising at least one compound having an affinity for the mitochondrial receptor for bci odiazepincs, cl at least one agent inducing apoptosis for simultaneous, separate or spread over time, intended for treatment cancer.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of said compound and / or said combination product for the manufacture of a medicament intended to facilitate the induction of apoptosis.
  • the methods currently used in the treatment of cancers are mainly radiotherapy and chemotherapy. These techniques consist in eradicating the identified tumor cells by means of localized irradiations or by means of pharmacological inducers of cell death.
  • these therapeutic approaches are not specific only to tumor cells. In fact, the surrounding tissues are also eradicated and a very high toxicity is noted.
  • an approach to treating cancer may lie in restoring these programs.
  • apoptosis is characterized by three phases: An initiation phase where the various death stimuli take so-called “private” pathways to converge on a common functional phase, which ultimately leads to the degradation phase characterized by the biochemical manifestations characteristic of cell death.
  • the cficctricc phase is covered by the transition pig of mitochondrial permeability, true senscur of cell death since its open or closed conformations determine the fate of the cells. These different conformations can be induced by many ligands of the components of this permeability transition pig.
  • the mitochondrial permeability transition pore commonly called 5 mcga-channel or multi-conductance channel, participates in the regulation of the level of calcium in the matrix, of the pH, and of the transmembrane potential ( ⁇ m ) in the mitochondria.
  • This pore therefore functions as a channel dependent on Ca 2 ′, voltage, pH and redox potential with several levels of conductance and little selectivity to ions (Zoratti et al 1995, Kinnally et al 1996, Bernardi et al 1996, and
  • an increase in the volume of the matrix causes either a physical disturbance of the external mitrochondrial membrane then the dissipation of ⁇ m (Kluck et al 1997, Yang et ni 1997, and Vandcr Heiden et al 1997) , that is to say a disturbance of the external membrane and the dissipation of ⁇ M ' perennial, of the internal membrane simultaneously (Zamzami et al 1996 and Susin et al 1996 a).
  • the authors postulated that the increase in the volume of the matrix, which precedes the reduction in ⁇ , could be controlled by the opening of the PT pore.
  • the PT pig can operate at both a low and reversible level of conductance (which would cause an entry of ions and water inside the mitochondrial matrix), as well as at a high level of conductance. and irreversible (this
  • the PT pore is a multiprotein complex formed at the contact site between the internal and external mitochondrial membranes. There is a co-localization of the PT pig and the Bcl-2 oncoprotein (De Jong et al 1994). The exact molecular composition of this pig remains an enigma.
  • PT pore subunits could constitute pharmacological targets used to modulate apoptosis.
  • PKI 1,195 (1- (2-chlorophenyl) -N-methyl-N- (1-methylpropyl) -3- isoquinoline carboxamide) is known to be a prototypical ligand antagonist of the peripheral benzodiazepinc receptor mBzR (Ripond and al 1991 and Joseph-Liauzun et al 1997). More particularly, WO 93/1 1771 relates to the use of molecules such as PK I 1 195 for the treatment of diseases of the central nervous system, in particular trauma.
  • cancer therapy consists of the use of radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof. These two methods have harmful side effects that are very poorly tolerated by patients.
  • pharmacological agents aimed at increasing the susceptibility of tumor cells to the induction of apoptosis, is very advantageous. Indeed, it allows the use of lower doses of chemo or radiotherapy products, which minimizes their side effects.
  • the components having a strong affinity for the PT pore subunits, mentioned above, are the object of the present invention because they make it possible to facilitate apoptosis and therefore to use lower doses of products with strong side effects. It also improves the effectiveness of certain treatments.
  • the present invention relates to a combination product comprising at least one compound having an affinity for the mitochondrial benzodiazepinc receptor, and at least one agent inducing apoptosis for simultaneous, separate or spread over time use, intended for the treatment cancer.
  • cancer is used in a broad sense which includes all neoplasia (for example cancers, sarcomas, lymphomas and leukemias).
  • Said compound is selected from several families of molecules having an affinity for the mitochondrial (peripheral) receptor for benzodiazepincs, preferably from the families of general formula I, II, 111, IV, and V described below. • In the family of isoquinolincs, the molecules of general formula 1 are chosen in particular:
  • RI is a branched or linear C1-C6 lower alkyl group
  • R2 is a branched or linear C1-C6 lower alkyl group
  • R3 is a halogen atom such that Cl, F, Br, I, and R4 is a hydrogen or halogen atom, the groups RI, R2, R3, R4 being chosen independently of each other.
  • said compound is PKI 1195 (commercially available from SIGMA under the reference C 0424) corresponding to the following formula; 1- (2-chlorophenyl) -N-methyl-N- (1-methylpropyl) -3-isoquinolinc carboxamide.
  • A represents a nitrogen atom or a CH group
  • V and W identical or different, represent hydrogen or halogen atoms
  • Z is fixed in the ortho or para position with respect to B and represents a phenylc, thienyl, pyridyl, or phenylc radical substituted pamn or two substituents chosen from halogen atoms, alkyl and alkoxy groups containing 1 to 4 carbon atoms, trifluoromethyl or nitro groups, the chain -X- (CH 2 ) resort- (CHR) transit, - CONR
  • R 2 is fixed in the ortho or para position with respect to D,
  • R represents a hydrogen atom or an alkyl group containing I to 3 carbon atoms
  • Ri and R 2 which are identical or different, represent a linear or branched alkyl group containing 1 to 6 carbon atoms, cycloalkylc comprising 3 to 6 carbon atoms, phenylc, phenylalkyle or cycloalkylalkyle of which the alkyl part contains 1 to 3 carbon atoms and the cycloalkyl part contains 3 to 6 carbon atoms, alkylc comprising 3 to 6 carbon atoms provided that the double bond is not located in position 1, 2 with respect to the nitrogen atom, Ri and R 2 can also form together with the nitrogen atom to which they are attached a pyrrolidine, piperidinc, morpholinc or thiomorpholine ring, X represents a group CH-R 3 , NR ⁇ , SO, SO_ or an oxygen or sulfur atom.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • Ri represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • m is 0 or 1
  • n is 0, 1 or 2
  • X represents a group SO, S0 2 or N-R_ ⁇
  • the sum m + n is at least equal to 1
  • a and B each represent a nitrogen atom and Z is in position para with respect to B
  • X cannot represent the group CH-Rt
  • A represents a group CH
  • B represents a nitrogen atom
  • Z is in position ortho with respect to B
  • X represents an atom d oxygen
  • R represents a hydrogen atom
  • the sum m + n is different from 1 and with the exception of N, N-dimethylcarbamate of phenyl-2 quinolylc-4.
  • the compounds of formula (II) correspond to one of the formulas (IIa) or (11b)
  • Ri cl R / identical or different represent straight or branched chain alkyl groups of C 1-C4, cycloalkyl in which the alkyl part contains 1 to 3 carbon atoms and the cycloalkyl part contains 3 to 6 carbon or phenyl atoms,
  • Ri and R 'can also form with the nitrogen atom to which they are attached a piperidinc cycle.
  • ⁇ r represents a phenylc, thienylc or phenylc radical substituted by one or two substituents chosen from halogen atoms (fiuor, chlorine, bromine), alkyl or alkoxy groups containing 1 to 4 carbon atoms, nitro or trifluorophenylc, ⁇ represents a of the following sequences
  • R is a linear or branched C 1 -C 6 alkyl group, a phenyl group, a cycloalkyl group having C3-C6, a phenylalkyl or cycloalkyl group in which the alkyl radical contains C1-C3, or a group
  • Rj and Rj are hydrogen atoms or alkyl groups and Rj is an alkenyl or alkynyl group, the sum of the carbon atoms in R 3 , Ri, and R5 being between 2 and 5,
  • R 2 is a linear or branched C1-C6 alkyl group, a phenylalkyl or cycloalkyl group in which the alkyl radical contains C1-C3, a group
  • R 3 , j, and R 5 are defined as above, or a group
  • RI and R2 can form, together with the nitrogen atom to which they are attached, a 5, 6 or 7-membered heteroeyel radical which may contain another heteroatom chosen from nitrogen and oxygen and being able to carry one or two substituents chosen from C1-C3 alkyl, hydroxy, oxo, hydroxyalkylc, dimethylaminoalkylc, the alkyl part of which is C 1-C3, Z is a phenylc, pyridyl, thicnyl group, 2- thiazolylc or a phenyl group substituted by one or two substituents chosen from halogen atoms, alkyl, alkoxy, C 1 -C 3 alkylthio groups, trifluoromethyl group, and nitro group, 1 1
  • X and Y are the same or different and are hydrogen or halogen atoms, C1-C3 alkyl or alkoxy groups, nitro or trifluoromethyl groups,
  • a and B are independently nitrogen atoms or CM groups, or any stereoisomer of formula IV.
  • EP 1 12 776B 1 has a particularly high affinity for the mitochondrial benzodiazepine receptor (EP 1 12 776B 1 page 21).
  • R 1 and R 2 independently represent a linear or branched C1 -C6 alkyl group, a C3-C7 cycloalkyl group, a phenylalkyl or cycloalkyl group, the csi alkyl part of C 1 -C3; Ri and R 2 may also represent an alkenyl or alkynyl group of C2-C6 provided that the double or triple bond is not located in position 1 -2 relative to the nitrogen atom; Ri and R 2 can represent a group of formula -R 3 -Z -RA in which R 3 is a linear or branched alkylene group of C2-C6 provided that at least two carbon atoms separate the nitrogen atom from the group Z; R4 represents a C 1 -C 4 alkyl group and Z represents the oxygen or sulfur atom or the N-Rj group, Rj represents the hydrogen atom or a C 1 -C3 alkyl group; RI cl R2 can form with the nitrogen atom to which they are attached
  • Ar represents a phenyl, pyridyl, or thienyl group or a phenyl group substituted by one or two substituents chosen from halogen atoms, C1-C4 alkyl, alkoxy and alkylthio groups, the trifluoromethyl group and the nitro group;
  • a and B are independently N or CH.
  • X, Y independently represents the hydrogen atom, halogen, an alkyl or alkoxy group comprising of C1 -C3, the nitro or trifluoromethyl group.
  • apoptosis-inducing agent means any substance which directly or indirectly affects the viability of a cell.
  • Said apoptosis inducing agent of the present invention can be selected in particular from agents which damage DNA, iigands of the glucocorticoid receptor, or from second pro-apoptotic messengers. These agents can also be selected from those commonly used in the treatment of cancer.
  • said second pro-apoptotic messenger is selected from glucocorticoid derivatives, from alkylating agents such as nitrogen mustards, for example cyclophosphamide, platinum complexes, for example cisplatinc, ethylene derivatives -imine, dimethanc sulfonoxy- alkancs, piperazine derivatives, among topoisomerase inhibitors such as topoisomerasc-II inhibitors, for example anthracyclines, pipodophyllotoxin such as etoposidc, topoisomerase inhibitors- I, for example the derivatives of camptothecinc, among the antimetabolites such as the antifolates, for example methotrexate, the antipurincs, for example 6-mccaptopurine, the antipyrimides, for example 5-fiuorouracilc, among the antimitotics such as the vinca -alkaloids, taxoids such as taxol, taxotere, and among
  • said agent inducing apoptosis is chosen from gamma radiation, etoposidc, doxorubicinc, dexamelhasonc, ceramide such as ceramide CS, lonidaminc.
  • ceramide such as ceramide CS
  • lonidaminc Some of said anticancer agents are more particularly described in US 5,260,327 which relates to the use of lonidamine to treat metastases, in OJ 5017353 which relates to the use of lonidamine in combination with other anticancer agents, and in EP 291,151 , which describes the use of phlorizin derivatives.
  • the product according to the present invention may also contain a viral vector which has a gene which codes for an enzyme which makes it possible to activate the abovementioned compounds and or agents, for example thymidine kinase.
  • a viral vector which has a gene which codes for an enzyme which makes it possible to activate the abovementioned compounds and or agents, for example thymidine kinase.
  • EP 41573 1 there are numerous patents relating to the use of suicide genes activated in specific tissues. Among these documents, incorporated in the description by reference, there are: EP 494776, EP 690129, EP 657540, and EP 657541 which relate in particular to the manufacture of a medicament comprising a vector which has a gene capable of catalyzing the passage of a pro-drug in active substance. More particularly, EP 657539 relates to the use of the thymidine kinase gene with cellular specificity for the treatment of cancer.
  • the product of the present invention may also comprise one or more pharmaceutically acceptable vehicles.
  • the present invention relates to the use of the product described above for the manufacture of a medicament intended for the treatment of cancer.
  • said medicament is intended to induce the death of ct7 tumor cells or to facilitate apoptosis.
  • the present invention also relates to the use of a compound having an affinity for the milochondrial benzodiazepinc receptor for the manufacture of a medicament intended for the treatment of cancer, in particular for facilitating the induction of apoptosis.
  • a compound of the family corresponding to one of the general formulas 1, II, III, IV, and V described above, preferably a compound selected from the following molecules: l - (2-chlorophenyl) -N-methyl-N- (l-methylpropyl ) -3-isoquinolinc carboxamidc (PK I 1195), N, N-diethylcarbamate of 3-phenyl naphthylc-1,
  • N-methyl N [1-methyl propyl] (2-chloro-phenyl) -l isoquinolineecarboxamide-3 for the manufacture of such a medicament.
  • Bcl-2 is the prototypical representative of the family of oncogenes inhibitors of apoptosis which contributes both to the genesis of cancer and which is responsible for the difficulties in eradicating tumors. Most of the cytoprotective effects of Bcl-2 can be attributed to its ability to protect the integrity of the mitochondrial membranes (Boise et al 1997, Rccd et al 1997). It has been shown that bcl-2 stabilizes the itrochondrial membranes in different models of apoptosc (Zamzami et al 1995, cl Decaudain cl al 1997).
  • Bcl-2 does not succeed in inhibiting apoptosis in certain cases, in particular apoptosis induced by diamide cl by activation of caspase (Yasuhara et al 1997, Strasscr et al 1995, and Huang et al 1997) .
  • Bcl-2 is also overcome by treatment with a taxoid, such as paclitaxel (taxol), an agent which allows hyperphosphorylation of Bcl-2 (Haldar et al 1 95 and 1996), and which promotes the opening of the PT pore (Evtodicnki et al 1 96)
  • a taxoid such as paclitaxel (taxol)
  • Bcl-2 protects the isolated mitochondria against the opening of the PT pore induced by low doses of protoporphyrin IX, a ligand of mBzR, and this inhibition is suppressed by high doses of protoporphyrin IX (Marchetti et al 1996a). This suggests that a functional interaction exists between Bcl-2 and mBzR.
  • the protection against opening of the PT pore, controlled by Bcl-2 is not overcome by increasing doses of the other target agents of the PT pig such as atractyloside, a ligand of the translocatcur of adenine. Since the binding of mBzR does not cause a negative regulation of the expression of Bcl-2 (Carayon et al 1996), it therefore appears likely that changes in conformation resulting from the binding of PKI 1195 in the complex composed by mBzR and the PT pore indirectly affects the stability of the mictochondrial membrane and thus overcomes the anti-apoptotic function of Bcl-2. Consequently, the binding of a compound having an affinity on the mitochondrial benzodiazepine receptor, belonging to families I, II, III, IV, and V, in particular PKI 1195, represents an interesting strategy in particular for overcoming resistance to chemotherapy and radiotherapy.
  • FIG. 1 Sy ⁇ crgisinc between PKI 1195 and In cernmiric for the induction of apoptosis of t ymocytes.
  • the ihymocytes were cultured for 4 hours in the presence of ceramide C "(25 ⁇ M), diazepam (100 ⁇ M), and / or PKI 1195 (100 ⁇ M).
  • the graph ⁇ represents the level of apoptosc with on the abscissa the perturbation of A M ',,, (determined by DiOCc) and on the ordinate the generation of superoxide anion (determined with HE).
  • Graph B represents the level of apoptosc with the exposure of phosphatidylserine on the abscissa on the surface of the plasma membrane (measured with FITC-annexin V) and the cell viability on the ordinate (exclusion of ethydium bromide) (EthBr). .
  • the numbers denote the percentages of cells found in each quadrant.
  • PK1 1195 facilitates the induction of apoptosis in CEM-C7 T cells of acute leukemia.
  • the cells were cultured with 10 ⁇ M of etoposide, 1 ⁇ M of dcxamethasone (DEX), of RU24858, of RU38486, and / or with 75 ⁇ M of PK I 1195 for either 12 hours or 24 hours.
  • This graph represents the determination of the frequency of DiOC 6 (3) low (HE-> Eth) low , of DiOC 6 (3) w (HE-> Eth) , 18h and hypoploid cells as described in the examples.
  • the asterisks indicate a significant and significant improvement (p ⁇ 0.01) in the induction of apoptosis by PKI 1195 compared to the control cultures (cultivated in the absence of PKI 1195).
  • the cell line of hybridomas of T cells 2B4.1 1 stably transfected with an SFFV.neo vector containing the human gene Bcl-2 (graph li) or containing only the gene for resistance to neomycinc (neo) (graph ⁇ ) were grown for 12 hours in the presence of dcxamethasone (1 ⁇ M), PK I 1195 (50 ⁇ M) or diazepam (50 ⁇ M), and the characters associated with apoptosis, mentioned supra, have been determined.
  • the numbers in the black circles indicate the frequency of the subdiploid cells.
  • FIG. 4 PKI 1195 improves the susceptibility to apoptosis in leukemic B WEII I 231 cells which over-express Bcl-2.
  • the WEHI 23 1 cells either transfected with the control neomycin vector (neo, graph A), or transfected with a vector containing the human Bcl-2 gene (graph B) were treated by ⁇ irradiation, with doxorubicin (doxo), cyclosporine A (CsA), alone or in combination with PKI 1195 (40 ⁇ M) or with diazepam (40 ⁇ M). These graphs show the determination by flow cytometry of the parameters of apoptosis indicated. The asterisks show a significant effect (p ⁇ 0.001) dc PK 1 1 195.
  • PKI 1 195 facilitates the induction of apoptosis by a variety of sti uli.
  • PKI 1195 is the prototypical antagonist ligand of the mitochondrial benzodiazepine receptor mBzR (Ripond et al 1991 and Joscph-Liauzun et al 1997). Up to doses of 50 to 100 ⁇ M, PKI 1 195 does not show any toxic effect on various cell types including in particular thymocytes (see FIG. 1), the T cell CEM-C7 of acute leukemia 1 (see FIG. 2) , hybridomas of T cells 2B4. 1 1 (see FIG. 3), and the leukemic WEHI23 B cells 1 (see FIG. 4).
  • PK I 1 195 appears to be the most effective of the co- inducers of apoptosis (relative efficacy: PK I 1195 greater than 4'-chlordiazepam>diazepam> Ro-5-4864), this result correlates with the antagonistic potential of these compounds on the mBzR receptor (Zisterer et al 1997).
  • PK I 1195 (but not diazepam) facilitates the induction of apoptosis by glucocorticoid receptor agonists (which include dcxamethasone and RU24858, (see Figure 2). was highlighted when using RU38486 and PK I 1195 simultaneously.
  • PK I 1 195 facilitates the induction of apoptosis in response to a very wide variety of substances and in many different cell types, in particular in primary and transformed cell lines of human and murinc origin (see Figures 2 to 4 ).
  • PK I 1 195 facilitates the induction of mitocliondrial and post-mitochondrial changes associated with apoptosis
  • PK I 1195 The synergism between PK I 1195 and several pro-apoptotic agents extends to everything that characterizes the phenomenon of apoptosis. These phenomena include the early loss of mitochondrial transmembrane potential (measured using the potential-sensitive DiOC 6 (3) dye), increased generation of reactive oxygen species (measured by conversion of hydroethidine in ethidinc catalyzed by suproxide anions (see FIGS. 1 to 4), the eradication of phosphatidylserine residues on the surface of the plasma membrane measured using anncxinc V conjugated to F1TC (see FIG.
  • PKI 1195 overcomes the inhibition of apoptosis controlled by Bcl-2 in several different cell lines.
  • Bcl-2 has cytoprotective effects thanks to its broad spectrum of action (Kroemer et al 1997b, and Decaudain et al 1997).
  • the overexpression of Bcl-2 very significantly prevents the disturbance of ⁇ m , the production of superoxid anions, and the nuclear apoptosis induced by dcxamethasone in T cell hybridomas (see FIG. 3).
  • Simultaneous treatment with PKI 1195 and an apoptogenic agent shows a hyperadditive effect facilitating apoptosis even in the presence of Bcl-2.
  • PKI 1 195 makes it possible to restore the induction of apoptosis in cells overexpressing Bcl-2 at least partially. This effect was observed in two different cell types called hybridomas of T cells 2B4.1 1 (see Figure 3B) and B cells WEHI231 leukemia (see Figure 4B).
  • PKI 1195 overcomes the protection conferred by Bcl-2 against glucocorticoids (see Figure 3B), against ⁇ irradiation, doxorubicin, cyclosporin A (see Figure 4B), and etoposide. This effect is also observed in the mitochondrion, the cell redox potential, and the nuclei (see Figures 3 and 4).
  • the present invention relates to a new strategy for improving the susceptibility of cells by the induction of apoptosis.
  • the compounds of the isoquinoline carboxamide family in particular a specific antagonist ligand for the mitochondrial benzodiazepine receptor (PKI 1195), facilitates the induction of disturbance of ⁇ ; , involvementBy various apoptotic effectors, in particular DNA damage ( ⁇ irradiation, etoposide, doxorubicin), binding of ligands to the glucocorticoid receptor (dexamethasone, RU24858), and the second pro-apoptotic messengers of the ceramide type, such than ceramide C8.
  • PKI 1195 mitochondrial benzodiazepine receptor
  • the compounds of the isoquinoline carboxamide family improve the induction of signals classics of apoptosis such as exposure of phosphatidylserine to the surface of cells and fragmentation of nuclear DNA.
  • the mitochondrial benzodiazepine receptor has been shown to interact with many proteins involved in the formation and / or regulation of the PT pig (McEnery et al 1992 and Kinnally et al 1993).
  • PKI 1 195 facilitates the opening of the PT pig induced by a tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) in L929 cells (Pastorino et al 1 96).
  • PKI 1 195 makes it possible to facilitate the induction of apoptosis, which correlates with the induction of the dissipation of ⁇ m controlled by the PT pore.
  • results of the experiments, implemented during the present invention demonstrate the strong association between the mitochondria, the redox potential, the plasma membrane and the characteristics of apoptosis, and demonstrate that PKI 1195 acts on a mitochondrial target. to facilitate the induction of apoptosis.
  • This new property of the compounds of the isoquinoline carboxamide family represents an opportunity to overcome resistance to chemotherapy and radiotherapy and in particular to facilitate the induction of cell death.
  • Fxc plc 1 Cells and cell cultures
  • 1 1 were transfected with the SFFV.nco vector containing the human bcl-2 gene or only the neomycin (neo) resistance gene (Green et al 1994).
  • WEHI231 leukemia B cells were transfected with the human bcl-2 gene or with a neo-control vector (Cuendc et al 1993) and the human CEM-C7.H2 T cells of lymphoblastic leukemia (Strasser-Wozak, 1 95) were cultured in RPMI 1640 containing 10 % FCS, antibiotics, and L-glutaminc.
  • the abovementioned cells (5-10 ⁇ lOVml) were cultured in the presence of the indicated amount of PKI 1195, diazepam (Sigma), dexamethazone (1 ⁇ M, Sigma), RU24858 (1 ⁇ M, Roussel Uclaf), of the glucocorticoid receptor antagonist RU38486 (1 ⁇ M, Roussel Uclaf), doxorubicin (1 ⁇ g / ml, Pharmacia), etoposide (10 ⁇ MVml, Sigma), cytosine arabinoside (10 ⁇ g / ml, Upjohn ), cyclosporine A (10 ⁇ M, Sandoz), ceramide C8 (25 ⁇ M, Bio ol, Plymouth Meeting, PA), or treatment with ⁇ irradiation (10 Gy). After the indicated intervals, the cells were recovered, and the characteristics associated with apoptosis were tested.
  • Example 3 Quantification of the parameters associated with apoptosis by flow cvtoinctric.
  • Example 4 Process for the preparation of N, N-diétl ⁇ lcnrba ⁇ nntc of pl ⁇ cnyl-3 napl ⁇ tylc-1.
  • Example 5 Process for the preparation of N, N-dictl ⁇ l ⁇ -methyl-phcnyl-2 ⁇ uinnzolinc-4 propanamide. 3 g of carbonyldiimidazole are added under nitrogen to a suspension of 2.67 g of ⁇ -methylphenyl-2-quinazoline-4-propanoic acid in 30 cm3 of anhydrous tetrahydrofuran. After 2 hours of stirring, 6 cm 3 of diethylamine are added and the mixture is stirred for a further 4 hours. 150 cm3 of water and 100 cm3 of ethyl acetate are added.
  • a mixture of 15 g of 4-methyl-2-phenyl-quinazolinc, of 13.3 g of N-bromosuccinimide and of 1.65 g of benzoyl peroxide in 150 cm 3 of carbon tetrachloride is brought to 90 ° C. for 3 hours. Filtered, the filtrate is evaporated and the residue chromatographed on silica gel with a cyclohexane-ethyl acetate mixture (9-1 by volume) as eluent. 11 g of 4-bromomethyl-2-phenyl quinazoline are obtained, melting at 110 ° C.
  • 4-methyl-2-phenyl quinazolinc can be obtained according to W.L.F. ARM ⁇ REGO, Fuscd pyrimidincs, quinazolines Part. I, p. 39, Intersciences Publishers (1967), incorporated into the description by reference.
  • Example 6 Process for the preparation of N-methyl N-pl ⁇ cn ⁇ l pl ⁇ ényl-2 ⁇ uiua / .oliuc- 4 propanamide.
  • the 2-phenyl-quinazoline-4-propanoic acid is prepared according to the following process;
  • Example 7 Process for the preparation of N, N-dicthyl (4-nitro-phenyl) -2 ⁇ i ⁇ azolinc-4 propanamide.
  • Example 5 The procedure is as in Example 5 from 1.35 g of (4-nitro-phenyl) -2-quinazoline-4 propanoic acid, 0.82 g of carbonyldiimidazole and 0.9 cm3 of diethylamine in 20 cm3 of anhydrous tetrahydrofuran. After chromatography on silica gel with ethyl acetate as eluent and recrystallization from ethyl acetate, 0.35 g of NN-diethyl (4-nitro-phenyl) -2 quinazolinc-4 propanamide is obtained, which is obtained 168 ° C.
  • (4-Nitro-phenyl) -2 quinazolinc-4 propanoic acid is prepared according to the following process (EP 2100S4A1, example 1 1; p.23,1.20-p.24,1.24 together p.20, 1.6-14): A mixture of 3.34 g of para-nitrobenzoic acid and 20 cm 3 of thionyl chloride is brought to reflux for 3 hours. The excess thionyl chloride is removed by evaporation under reduced pressure and to the residual product is added 20 cm3 of chloroform, 5.5 cm3 of triethylamine and 2.21 g of ethyl (2-amino-bcnzoyl) -3 propionate. .
  • Example 8 Process for the preparation of N, N-diélltyl [(pI ⁇ ényI-2 trifIuoro ⁇ néthyl-8 ⁇ i ⁇ oli ⁇ yl-4) oxy] -2 propanamide.
  • Phenyl-2 trifiuoromethyl-8 hydroxy-4 quinoline can be prepared by action at 140 ° C of ethyl acetate (0.12 mole) on trifluoromethyl-2 aniline (0.12 mole) in the presence of polyphosphoric acid ( 86 g). It has a melting point of 136 ° C; (EP 210084 A1, example 84; p.72, 1.28 to p.73, 1.9 together p.55, 1. 1 - 14).
  • Example 9 ⁇ Procedure for the preparation of NN-dietliyl 3-methoxy-3-plynyl) -2 qui ⁇ a / .olinc-4 propanamide.
  • a mixture of 1.2 g of (3-methoxyphenyl) -2 quinazoline-4 ethyl propionate and 30 cm3 of diethylamine is heated at 250 ° C for 40 hours. After cooling, the excess diethylamine is evaporated. The residue is chromatographed on silica gel with a cyclohexane-ethyl acetate mixture (1-1 by volume) as eluent. The recovered product is recrystallized from isopropyl ether. 0.36 g of N, N-diethyl (3-methoxyphenyl) -2 quinazoline-4 propanamide is obtained, which melts at 87 ° C.
  • the ethyl (3-melhoxyphenyl) -2 quinazolinc-4 propionate is prepared according to the following process:
  • (2-Amino-benzoyl) -3-propionic acid can be prepared according to D.E. R1VETT et al., ⁇ ust. J. Chem., 24, 2717 (1971), incorporated into the description by reference.
  • Example 10 Process for the preparation of N, N- ic ⁇ yl pl ⁇ én ⁇ l-3 isoqt ⁇ i ⁇ insuli ⁇ e-1 propanamide.
  • the procedure is as in Example 9 from 6.1 g of 3-phenylisoquinoline-1 ethyl propionate and 30 cm3 of diethylamine.
  • the crude product is purified by means of 4 successive chromatographies on silica gel using a cyclohexane-ethyl acetate mixture (7-3 by volume) as eluent.
  • 1.4 g of N, N-diethyl phenyl-3 isoquinoline-1 propanamide are obtained, melting at 58 ° C.
  • Ethyl phenyl-3 isoquinoline-1 propionate is prepared according to the following process:
  • a mixture of 21 g of 1-methyl-3-phenyl isoquinoline, 30.6 g of N-bromosuccinimide and 1 g of benzoyl peroxide in 730 cm 3 of carbon tetrachloride is brought to the boil for 48 hours. After cooling, the filtrate is filtered and the filtrate is evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is chromatographed on silica gel with a toluene-methanol mixture (98-2 by volume) as eluent. After crystallization from isopropyl ether, 1 1 g of 1-bromomethyl-3-phenyl isoquinoline is obtained, melting at 84 ° C.
  • Example 11 Process for the preparation of N-methyl N- (methyl-1 propyl) phenyl-7 benzol blthiophenecarboxamide-5.
  • the residue is chromatographed on silica gel using a cyclohexane-ethyl acetate mixture (50-50 by volume) as eluent.
  • the fractions containing the product are combined, evaporated under reduced pressure and taken up in a mixture of water and ethyl ether.
  • the organic phase is decanted, washed with water, dried over magnesium sulfate and evaporated under reduced pressure.
  • the residue is stirred for 1 hour 30 minutes with 20 cm 3 of 40-60 ° petroleum ether, filtered and dried.
  • N- (methyl-1 propyl) phenyl-7 benzo [b] thiophenecarboxamide-5 can be prepared as follows: Heated at 90 ° C for 2 hours 3 g of 7-phenyl benzo [b] thiophenecarboxylic acid-5 in 30 cm3 of toluene and 2.6 cm3 of thionyl chloride. It is evaporated under reduced pressure, then 30 cm 3 of toluene and 9.94 cm 3 of triethylamine are added to the residue. The mixture is stirred and 1.2 cm 3 of butanamine are added dropwise.
  • the mixture is stirred for 1 hour at room temperature, the toluene is evaporated off under reduced pressure and the residue is taken up in methylene chloride and an aqueous solution of potassium carbonate. Agitation is carried out for 5 minutes, the organic phase is washed with water, dried over magnesium sulphate and evaporated under reduced pressure.
  • Example 12 Process for the preparation of N, N-diethyl phenyl-3 nnphtalènccnrhoxnmidc-1.
  • Phenyl-3 naphthalenecarboxylic acid-1 can be prepared according to the method described by FC BADDAR et al., J. Chem. Soc, 1959, 1009, incorporated into the description by reference.
  • Example 13 Process for the preparation of N-methyl N [1-methyl propyll (2-chloro-phenvP-1 iso ⁇ uinoleinecflrboxamide-3.
  • B Determination of the inhibition of the anti-apoptotic activity dependent on Bcl2 in a cell line overexpressing Bcl2 in a conditional manner.
  • clones derived for example from the cell line NCI-H1299 obtained from ATCC
  • selection agents such as, for example neomycin, hygromycin, zeocin or puromycin
  • clones derived for example from the cell line NCI-H1299 obtained from ATCC
  • clones derived for example from the cell line NCI-H1299 obtained from ATCC
  • clones derived for example from the cell line NCI-H1299 obtained from ATCC
  • clones which were found to be significantly less sensitive to apoptosis induced by a range of concentrations of agents inducing apoptosis in the absence than in the presence of tetracycline in the culture medium, that is to say when they overexpress the protein Bcl2 rather than when they do not overexpress it.
  • the agents inducing apoptosis tested were for example adriamycin (10-100 ⁇ g / rnl), terbutyl-hydroperoxide (25-100 ⁇ M), vincristine (0.03-0.003 ⁇ g / ml) and camptothecin (0.01- 0.1 ⁇ g / ml).
  • To quantify the induction of apoptosis it is possible, for example, to use the method for assaying apoptosis induced in a cell population described in A.
  • One possible way of assaying the inhibition of anti-apoptotic activity in a cell line overexpressing Bcl2 conditionally by a treatment which may be, for example, the incorporation of a chemical compound, consists in quantifying, using for example the method described.
  • A the percentage of apoptosis induced in a population of cells originating, for example, from one of the clones described above, in the following 4 situations:
  • the chemical compound to be evaluated is incorporated into the cell culture medium at the same time as an apoptosis-inducing agent such as for example those mentioned above and the clone is cultured in the absence of tetracycline or anhydrotetracycline, c that is, it overexpresses the protein Bcl2. In this situation, the percentage of cells in PI apoptosis is determined.
  • the compound is incorporated into the cell culture medium at the same time as the same apoptosis-inducing agent as that used in situation 1 and the clone is grown in the presence of tetracycline (1 ⁇ g / ml) or anhydrotetracycline (0.5 ⁇ g / ml), that is to say that it does not overexpress the protein Bcl2.
  • the percentage of cells in apoptosis P3 is determined.
  • the compound is incorporated into the cell culture medium in the absence of an apoptosis-inducing agent and the clone is cultured in the presence of tetracycline (1 ⁇ g / ml) or anhydrotetracycline (0.5 ⁇ g / ml), that is, it does not overexpress the Bcl2 protein. In this situation, the percentage of cells in apoptosis P4 is determined.
  • R 100 x (P1-P2) / (P3-P4).
  • R 0, the compound is not an inhibitor at the concentration tested.
  • a series of results can be obtained from a range of concentration of compound to be evaluated.
  • An inhibitory concentration of 50% or IC50 can be calculated mathematically from these results.
  • Several compounds can be compared according to their IC50. We will say for example that a product A is twice as active as a product B if the IC50 of A is twice lower than the IC50 of B.
  • the IC50 values can vary depending on the cell clone used , nature and concentration of the apoptosis inducer used.
  • the compounds of families II, 111, IV exhibit activities which can be at least 5 times better than that presented by PKI 1 5.
  • the compounds of Examples 4 to 12 described above exhibit activities greater than those demonstrated by the compound PKI 195.
  • the compounds of general formula (II) the following compounds are preferred
  • Taxol induces bcl-2 phosphorylation and death of prostate cancer cells. Cancer Research 56, 1253-1255.
  • Mitochondria are excitable organelles capable of generating and conveying electric and calcium currents. Cell 89, 1145-1 153.
  • Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 185, 1481 - 1486.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J. Exp. Med 184, 1155-1 160. Marchetti, P., Hirsch, T., Zamzami, N., Castedo, M., Decaudin, D., Susin, SA, Masse, B., and Kroemer, G. (1996b). Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis. J. Immunol. 157, 4830-4836.
  • Nicotera, P., and Leist, M. (1997). Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells. Cell Death Diff: 4, 435-442.
  • Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. J. Exp. Med. 184, 1331-1342.

Abstract

La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament notamment destiné à faciliter l'induction de l'apoptose.

Description

UTILISATION D'UN COMPOSE POSSEDANT UNE AFFINITE POUR LE
RECEPTEUR MITOCHONDRIAL DES BENZOD1ΛZEP1NES
EN THERAPIE DU CANCER.
La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des bci odiazépincs, cl au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament destiné à faciliter l'induction de l'apoptose.
Les méthodes utilisées actuellement dans le traitement des cancers sont principalement la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces techniques consistent à éradiquer les cellules tumorales identifiées par le biais d'irradiations localisées ou par le biais d'inducteurs pharmacologiqucs de la mort cellulaire, Cependant, ces approches thérapeutiques ne sont pas spécifiques aux seules cellules tumorales. En effet, les tissus avoisinants sont également éradiqués et une toxicité très élevée est constatée. Considérant que les programmes naturels de la mort cellulaire (ou apoptosc) et de la sénescence ne fonctionnent plus chez les cellules tumorales, une approche pour traiter le cancer pourrait résider dans le rétablissement de ces programmes.
De manière générale, l'apoptose se caractérise par trois phases : Une phase d'initiation où les différents stimuli de mort empruntent des voies dites "privées" pour converger vers une phase cficctricc commune, qui conduit in fine à la phase de dégradation caractérisée par les manifestations biochi iques caractéristiques de la mort cellulaire. La phase cficctricc est mise en couvre par le porc de transition de perméabilité mitochondrialc, véritable senscur de la mort cellulaire puisque ses conformations ouvertes ou fermées déterminent le sort des cellules. Ces différentes conformations peuvent être induites par de nombreux ligands des composants de ce porc de transition de perméabilité.
Le pore de transition de perméabilité mitochondriale, communément appelé 5 mcga-canal ou canal à multiples conductances, participe dans la régulation du niveau de calcium dans la matrice, du pH, et du potentiel transmembranaire (ΔΨm) dans les mitochondries. Ce pore (PT) fonctionne donc comme un canal dépendant de Ca2', du voltage, du pH et du potentiel redox avec plusieurs niveaux de conductances et peu de sélectivité aux ions (Zoratti et al 1995, Kinnally et al 1996, Bernardi et al 1996, et
10 Ichas et al 1997). Récemment, il a été mis en évidence que l'ouverture du pore PT, qui est régulée par Bcl-2, est un événement critique dans le processus conduisant à l'apoptose (Krocmer et al 1997a et 1997b). L'ouverture du pore PT permet la dissipation du potentiel transmembranaire interne mitochondrial ((ΔvFnι), ce qui a pour conséquence de perturber l'intégrité de la membrane extérieure conduisant à la
15 libération des protéines intermembranaircs de la mitochondrie (Zamzami et al 1996, Susin et al 1997a, Kantrow et al 1997, et Ellerby et al 1997). En effet, la libération des protéines intramembranaires, telles que le cytochrome c, et/ou la dissipation du Δ I'„, sont les éléments communs de la phase précoce de l'apoptose (Kroemer et al 1997a et 1 97b, Liu et al 1996, Kluck et al 1997, Yang 1997, et Susin et al 1997b), En fonction
20 du système expérimental et du type cellulaire, une augmentation du volume de la matrice cause soit une perturbation physique de la membrane mitrochondriale externe puis la dissipation du ΔΨm (Kluck et al 1997, Yang et ni 1997, et Vandcr Heiden et al 1997), soit une perturbation de la membrane externe et la dissipation du ΔM'„, de la membrane interne de manière simultanée (Zamzami et al 1996 et Susin et al 1996 a).
25 Sur le plan théorique, les auteurs, mentionnés supra, ont postulé que l'augmentation du volume de la matrice, qui précède la réduction du Δ pourrait être contrôlée par l'ouverture du pore PT. Dans ce sens, le porc PT peut aussi bien opérer à un niveau de conductancc faible cl réversible (ce qui causerait une entrée d'ions et d'eau à l'intérieur de la matrice mitochondriale), qu'à un niveau de conductancc élevée et irréversible (ce
? ) qui conduirait à la perturbation du ΔTm). Le pore PT est un complexe multiprotéique formé au site de contact entre les membranes internes et externes mitochondrialcs. On observe une co-localisation du porc PT et de l'oncoprotéine Bcl-2 (De Jong et al 1994). La composition moléculaire exacte de ce porc reste une énigme. Cependant, on sait que des protéines du cytosol (hexokinase), de la membrane externe (récepteur mitochondrial des benzodiazépincs [mBzR], la porine mitochondriale, communément appelée canal à anion voltage dépendent), l'espace intermembranaire (créatine kinase), la membrane interne (adénine nucléotide translocateur, ANT) et la matrice (cyclophiline D) sont impliquées dans la formation du pore PT et/ou dans sa régulation (Zoratti et al, 1995, Beutner et al 1996, McEncry 1992, Kinnally et al 1993, O'Gorman 1997). Le pore PT est régulé par de multiples effecteurs endogènes, ce qui est en accord avec sont architecture composite complexe. Parmi ces effecteurs, on trouve les ions locaux et le gradient de pH, l'ADP/ATP, le NADPH, et les molécules impliquées dans la transduction du signal apoptotique telles que Ca2' ou des espèces réactives à l'oxygène. Ainsi, certaines des sous-unités du pore PT pourraient constituer des cibles pharmacologiques servant à moduler l'apoptose.
Des composés appartenant à la famille des isoquinoline carboxa ides ont été décrit dans US 4,801,595 comme étant utile pour le traitement de l'hypertension. Dans cet famille, PKI 1 195 ( l-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3- isoquinoline carboxamide) est connu comme étant un ligand antagoniste prototypique du récepteur périphérique des benzodiazépincs mBzR (Ripond et al 1991 et Joseph- Liauzun et al 1997). Plus particulièrement, WO 93/1 1771 concerne l'utilisation de molécules telles que PK I 1 195 pour le traitement des maladies du système nerveux central, notamment les traumatismes.
Or, de manière surprenante, certains composés possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépincs permettent l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale, et les expériences, qui ont conduit à la présente invention, démontrent que PKI 1 195 et les composés de formule 11, II I, IV, et V décrits ci-après permettent notamment de faciliter la mort cellulaire.
Actuellement la cancérothérapie consiste en l'utilisation de la radiothérapie, de la chimiothérapie, ou de leur combinaison. Ces deux méthodes possèdent des effets secondaires néfastes très mal supportés par les patients. Ainsi l'utilisation d'agents pharmacologiqucs, visant à augmenter la susceptibilité des cellules tumorales à l'induction de l'apoptose, est très avantageuse. En effet, elle permet l'utilisation de doses moins fortes de produits de chimio- ou radiothérapie, ce qui minimise leurs effets secondaires. Les composants ayant une forte affinité pour les sous-unités du pore PT, évoquées supra, sont l'objet de la présente invention car ils permettent de faciliter l'apoptose et donc d'utiliser des doses inférieures de produits à fort effets secondaires. Cela permet également d'améliorer l'efficacité de certains traitements.
Ainsi, aucun document de l'art antérieur ne divulgue, ni ne suggère la présente invention telle que décrite ci-dessous.
Description de l'invention
Ainsi, la présente invention concerne un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépincs, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Le terme cancer est utilisé dans un sens large qui regroupe toute néoplasie (par exemple les cancers, les sarcomes, les lymphomes et les leucémies).
Ledit compose est sélectionné parmi plusieurs familles de molécules possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial (périphérique) des benzodiazépincs, de préférence parmi les familles de formule générale I, II, 111, IV, et V décrites infra. • Dans la famille des isoquinolincs on choisit en particulier les molécules de formule générale 1 :
I
Figure imgf000007_0001
Dans laquelle
RI est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R2 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R3 est un atome d'halogène tel que Cl, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, les groupes RI , R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.
De manière avantageuse, ledit composé est le PKI 1 195 (disponible dans le commerce chez SIGMA sous la référence C 0424) répondant à la formule suivante ; l-(2- chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinolinc carboxamide.
Figure imgf000007_0002
Ce composé a été décrit dans Ferry A., 1989, Fund. Clin. Pharmacol., 3, 383 et dans Doble A. et al, 1985, Eur. J. Pharmacol., 1 19, 153.
«On choisit en particulier les molécules représentées par la formule II. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 210 084A1 , incorporé par référence dans la description.
II
Figure imgf000008_0001
dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH,
B représente un atome d'azote ou un groupe CH, V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène
(fluor, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phénylc, thiényle, pyridyle, ou phénylc substitué pamn ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou nitro, la chaîne -X-(CH2)„-(CHR)„,-CONR|R2 est fixée en position ortho ou para par rapport à D,
R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant I à 3 atomes de carbone,
Ri et R2 identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkylc comportant 3 à 6 atomes de carbone, phénylc, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alccnylc comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition que la double liaison ne soit pas située en position 1 , 2 par rapport à l'atome d'azote, Ri et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridinc, morpholinc ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3 , N-R^, SO, SO_ ou un atome d'oxygène ou de soufre. R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 ato es de carbone, R-i représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1 , n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, S02 ou N-R_ι, la somme m + n est au moins égaie à 1 , étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R.t, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de 1 et à l'exception du N,N-diméthylcarbamate de phényl-2 quinolylc-4. autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (lia) ou (11b)
Figure imgf000010_0001
dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, Ri, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.
Ces composés se lient aux récepteurs des benzodiazépincs du type périphérique (EP 210 0S A 1 page 1 1 , ligne 9-10). Au titre de composés particulièrement intéressants, on peut notamment citer ceux décrits de page 1 1 ligne 25 à la page 13 ligne 21 de EP 210 084A1.
• On choisit en particulier les molécules représentées par la formule III ci-dessous. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 248 734B 1 , incorporé par référence dans la description.
III
'
Figure imgf000010_0002
Dans laquelle Ri cl R/ identiques ou différents représentent des groupes alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée de C 1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkylc comporte 3 à 6 atomes de carbone ou phénylc,
Ri et R| ' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridinc.
Λr représente un radical phénylc, thiénylc ou phénylc substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fiuor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, nitro ou trifluorophénylc, ^ représente un des enchaînements suivants
Figure imgf000011_0001
Ces composés de formule III sont des ligands du récepteur périphérique (mitochondriale) des benzodiazépincs (EP 248 734B 1 page 4 lignes 46-54).
• On choisit en particulier ceux appartenant à la formule IV ci-dessous. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 1 12 776B 1 , incorporé par référence dans la description.
Figure imgf000011_0002
IV Dans laquelle R| est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C 1-C6, un groupe phényle, un groupe cycloalkylc possédant de C3-C6, un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dans lequel le radical alkyle contient de C1-C3, ou un groupe
Figure imgf000012_0001
Dans lequel Rj et Rj sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et Rj est un groupe alkenyle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans R3, R-i, et R5 étant comprise entre 2 et 5,
R2 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6 , un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dans lequel le radical alkyl contient de C1 -C3, un groupe
R3
Figure imgf000012_0002
R5
Dans lequel R3, j, et R5 sont définis comme ci-dessus, ou un groupe
Figure imgf000012_0003
Dans lequel n est 0, 1 , 2 ou 3, RI et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétéroeyele à 5, 6 ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote et l'oxygène et pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de C1-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkylc, diméthylaminoalkylc dont la partie alkyle est de C 1-C3, Z est un groupe phénylc, pyridyle, thicnyle, 2-thiazolylc ou un groupe phénylc substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, alkoxy, alkylthio en C 1-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro, 1 1
X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CM, Ou tout stéréoisomère de formule IV.
Parmi ces composés, ceux décrits dans les exemples 8, 10, 15-17, 18, 19-22, 37, 39, 43, et 51 de EP 1 12 776B 1 possèdent une affinité particulièrement élevée pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines (EP 1 12 776B 1 page 21 ).
•On choisit en particulier les molécules de formule V. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrit dans EP 094 271 B 1 , incorporé par référence dans la description.
Figure imgf000013_0001
Dans laquelle,
Ri et R2 représentent indépendamment un groupe alkyle de C1 -C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkylc de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dont la partie alkyle csi de C 1 -C3 ; Ri et R2 peuvent représenter également un groupe alcénylc ou alcynylc de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en position 1 -2 par rapport à l'atome d'azote ; Ri et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -RA dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié de C2- C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de C 1-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-Rj, Rj représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de C 1 -C3 ; R I cl R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétéroeyele comprenant éventuellement un second hétéroatome. Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les goupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1 -C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe nitro ; A et B sont indépendamment N ou CH.
Figure imgf000014_0001
Représente l'enchaînement
Figure imgf000014_0002
Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants :
\
/
X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène , halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de C1 -C3, le groupe nitro ou trifluorométhyle.
Les propriétés pharmacologiqucs de ces composés sont décrits à la page 1 I colonne 20 et à la page ! 2 colonne 21 de EP 094 271 B 1. On note la bonne affinité pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines particulièrement pour les molécules des exemples 1, 10, 16, 25, 32, 35, et 47 de EP 094 271B 1.
On désigne par agent inducteur de l'apoptose toute substance qui directement ou indirectement affecte la viabilité d'une cellule.
Ledit agent inducteur de l'apoptose de la présente invention peut être sélectionné notamment parmi les agents qui endommagent l'ADN, les iigands du récepteur aux glucocorticoïdes, ou parmi les seconds messagers pro-apoptotiques. Ces agents peuvent également être sélectionnés parmi ceux couramment employés dans le traitement du cancer. Ainsi, ledit second messager pro-apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatinc, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthanc sulfonoxy- alkancs, les dérivés de la pipérazine, parmi les inhibiteurs des topoisomerases tels que les inhibiteurs de la topoisomérasc-II, par exemple les anthracyclines, l'cpipodophyllotoxine tel que l'étoposidc, les inhibiteurs de la topoisomérase-I, par exemple les dérivés de la camptothecinc, parmi les antimétabolites tels que les antifolatcs, par exemple le méthotrexate, les antipurincs, par exemple la 6-mcrcaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la 5-fiuorouracilc, parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamidc, l'asparaginasc, la mitoguazone, la plicamycinc. Ces agents antinéoplastiqucs sont décrits dans Actualité Pharmaceutiques n°302 (Ocl 1992) pages 38 à 39 et 41 à 43 incorporées dans la description par référence.
De préférence, on choisit ledit agent inducteur de l'apoptose parmi les radiations gamma, l'étoposidc, la doxorubicinc, la dexamelhasonc, la céramide telle que la ceramide CS, la lonidaminc. Certains desdits agents anticancéreux, sont plus particulièrement décrits dans US 5,260,327 qui concerne l'utilisation de la lonidamine pour traiter les métastases, dans JO 5017353 qui porte l'utilisation de la lonidamine en association avec d'autres agents anticancéreux, et dans EP 291 151 , qui décrit l'utilisation des dérivés de la phlorizine. Ces documents sont incorporés dans la description par référence.
Le produit selon la présente invention peut également contenir un vecteur viral qui possède un gène qui code pour un enzyme qui permet d'activer les composés et ou les agents susmentionnés, par exemple la thymidine kinase. Dans la famille de EP 41573 1 , on trouve de nombreux brevets portant sur l'utilisation de gènes suicides activés dans des tissus spécifiques. Parmi ces documents, incorporés dans la description par référence, on trouve : EP 494776, EP 690129, EP 657540, et EP 657541 qui concernent notamment la fabrication d'un médicament comprenant un vecteur qui possède un gène capable de catalyser le passage d'une pro-drogue en substance active. Plus particulièrement, EP 657539 a pour objet l'utilisation du gène de la thymidine kinase avec une spécificité cellulaires pour le traitement du cancer.
De même, le produit de la présente invention peut comporter en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur l'utilisation du produit précédemment décrit pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En particulier, ledit médicament est destiné à induire la mort des cellules tumorales ct7ou à faciliter l'apoptose.
La présente invention vise également l'utilisation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur milochondrial des benzodiazépincs pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose. De préférence on peut choisit d'utiliser un composé de la famille répondant à l'une des formules générales 1, II, III, IV, et V décrit ci-dessus, de préférence un composé sélectionné parmi les molécules suivantes : l -(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinolinc carboxamidc (PK I 1 195), N,N-diéthylcarbamatc de phényl-3 naphtylc-1 ,
N,N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyI-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide, N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazolinc-4 propanamide,
N,N-diéthyl phényI-3 isoquinoléinc-1 propanamide,
N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 bcnzo[b]thiophènccarboxamide-5,
N,N-diéthyl phényl-3 naphtalèπecarboxamide-1 ,
Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3, pour la fabrication d'un tel médicament.
Bcl-2 est le représentant prototypique de la famille des oncogènes inhibiteurs de l'apoptose qui contribue à la fois à la genèse du cancer et qui est responsable des difficultés pour éradiquer les tumeurs. La plupart des effets cytoprotcctcurs de Bcl-2 peut être attribué à ses capacités à protéger l'intégrité des membranes mitochondrialcs (Boise et al 1997, Rccd et al 1997). On a montré que bcl-2 stabilise les membranes itrochondrialcs dans différents modèles d'apoptosc (Zamzami et al 1995, cl Decaudain cl al 1997). Cependant, il semble que Bcl-2 ne parvienne pas à inhiber l'apoptose dans certains cas, notamment l'apoptose induite par diamide cl par activation de la caspase (Yasuhara et al 1997, Strasscr et al 1995, et Huang et al 1997). L'effet de Bcl-2 est également surmonté par un traitement avec un taxoïde, tel que le paclitaxel (taxol), un agent qui permet l'hyperphosphorylation de Bcl-2 (Haldar et al 1 95 et 1996), et qui favorise l'ouverture du pore PT (Evtodicnki et al 1 96) Ainsi, la présente invention propose une alternative pour surmonter la chimio- ou radiorésistancc observée par la médiation par Bcl-2. Le traitement des cellules par un ligand de mBzR, rend la cytoprotcction par Bcl-2 largement obsolète, 11 existe une quasi-steechiométric entre l'expression de Bcl-2 et celle de mBzR au moins en ce qui concerne les lignées cellulaires lymphoïdes (Carayon et al 1996). En outre, Bcl-2 protège les mitochondries isolées contre l'ouverture du pore PT induit par de faibles doses de protoporphyrine IX, un ligand de mBzR, et cette inhibition est supprimée par de fortes doses de protoporphyrine IX (Marchetti et al 1996a). Ceci suggère qu'une interaction fonctionnelle existe entre Bcl-2 et mBzR. En revanche, la protection contre l'ouverture du pore PT, contrôlée par Bcl-2, n'est pas surmontée par des doses croissantes des autres agents cibles du porc PT tels que l'atractyloside, un ligand du translocatcur de l'adénine. Puisque la fixation de mBzR ne provoque pas de régulation négative de l'expression de Bcl-2 (Carayon et al 1996), il apparaît donc probable que des changements de conformation provenant de la fixation de PKI 1 195 dans le complexe composé par mBzR et le pore PT affecte indirectement la stabilité de la membrane mictochondriale et surmonte ainsi la fonction anti-apoptotique de Bcl-2. En conséquence la fixation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, appartenant aux familles I, II, III, IV, et V, en particulier le PKI 1 195, représente une stratégie intéressante notamment pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie.
Pour la suite de la description on se référera à la légende des figures présentées ci- dessous. Légende
Figure 1 : Syπcrgisinc entre PKI 1 195 et In cernmiric pour l'induction de l'apoptose des t ymocytes. Les ihymocytes ont été cultivés pendant 4 heures en présence de céramide C« (25 μ M), de diazépame ( 100 μM), et/ou de PKI 1 195 (100 μM).
Le graphique Λ représente le niveau d'apoptosc avec en abscisse la perturbation du A M',,, (déterminé par DiOCc) et en ordonnée la génération d'anion superoxide (déterminé avec HE).
Le graphique B représente le niveau d'apoptosc avec en abscisse l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface de la membrane plasmique (mesuré avec FITC- annexine V) et en ordonnée la viabilité cellulaire (exclusion du bromure d'éthydium) (EthBr). Les nombres désignent les pourcentages de cellules trouvées dans chaque quadrant.
Figure 2 : PK1 1 195 facilite l'induction de l'apoptose dans les cellules T CEM-C7 de in leucémie aiguë.
Les cellules ont été cultivées avec 10 μM d'étoposide, 1 μM de dcxamethasone (DEX), de RU24858, de RU38486, et/ou avec 75 μM de PK I 1 195 pendant soit 12 heures, soit 24 heures. Ce graphique représente la détermination de la fréquence de DiOC6 (3)low (HE->Eth)low, de DiOC6 (3) w (HE->Eth),'i8h et des cellules hypoploïdes telles que décrites dans les exemples. Les astérisques indiquent une amélioration sensible et significatif (p<0,01) de l'induction de l'apoptose par PKI 1 195 comparée aux cultures contrôles (cultivées en l'absence de PKI 1 195).
Figure 3 : PKI 1 195 s'oppose Λ la cytoprotection obtenue par la médiation de Bcl-2 dans les hybridomes de cellules T.
La lignée cellulaire des hybridomes de cellules T 2B4.1 1 transfectées de manière stable avec un vecteur SFFV.néo contenant le gène humain Bcl-2 (graphique li) ou contenant seulement le gène de résistance à la néomycinc (néo) (graphique Λ) ont été cultivées pendant 12 heures en présence de dcxamethasone ( 1 μM), de PK I 1 195 (50 μ M) ou de diazépamc (50 μM), et les caractères associés à l'apoptose, mentionnés supra, ont été déterminés. Les nombres dans les cercles en noir indiquent la fréquence des cellules sous-diploïdes. L'effet synergique de PK I 1 195 + DEX est très significatif (p<0,01 ) comparé aux contrôles (traitement avec DEX ou PK I 1 195 seulement), Des résultats similaires ont été obtenus lorsque l'on remplace la dcxamethasone par l'étoposidc comme inducteur de l'apoptose.
Figure 4 : PKI 1195 améliore la susceptibilité a l'apoptose dans les cellules B WEII I 231 leucémiques qui surcxprinicnt Bcl-2.
Les cellules WEHI 23 1 , soit transfectées avec le vecteur néomycine contrôle (néo, graphique A), soit transfectées par un vecteur contenant le gène Bcl-2 humain (graphique B) ont été traitées par irradiation γ, avec la doxorubicine (doxo), la cyclosporine A (CsA), seule ou en combinaison avec PKI 1 195 (40 μM) ou avec diazépamc (40 μM). Ces graphiques montrent la détermination par cytométrie de flux des paramètres de l'apoptose indiqués. Les astérisques montrent un effet significatif (p<0,001 ) dc PK 1 1 195.
PKI 1 195 facilite l'induction de l'apoptose par une variété de sti uli.
PKI 1 195 est le ligand antagoniste prototypique du récepteur mitochondrial des benzodiazépines mBzR (Ripond et al 1991 et Joscph-Liauzun et al 1997). Jusqu'aux doses de 50 à 100 μM, PKI 1 195 ne montre pas d'effet toxique sur divers types cellulaires comprenant notamment les thymocytes (voir figure 1 ), la cellule T CEM-C7 de la leucémie aiguë1 (voir figure 2), les hybridomes des cellules T 2B4. 1 1 (voir figure 3), et les cellules B WEHI23 1 leucémiques (voir figure 4). Les résultats des expériences menées lors de la présente invention démontrent que le céramide Cδ, qui par lui-même n'induit pas l'apoptose des thymocytes (à une dose de 25 μM), devient apoptogéniquc en présence de PK I 1 195. En revanche, le diazépamc, un agonistc agissant sur le récepteur central mitochondrial des benzodiazépincs ne possède aucun effet important apoptogéniquc (voir figures 1 , 3 et 4). Parmi les différents ligands de mBzR qui ont été testés, PK I 1 195 apparaît comme étant le plus efficace des co- inducteurs de l'apoptose (efficacité relative : PK I 1 195 supérieur à 4'-chlordiazépamc > diazépame > Ro-5-4864), ce résultat corrèle avec le potentiel antagoniste de ces composés sur le récepteur mBzR (Zisterer et al 1997).
Les effets synergiques observés avec PKI 1 195 s'étendent à une variété de différents inducteurs de l'apoptose, notamment avec l'inhibiteur de la topoisomérase I I (étoposide, voir figure 2), irradiation γ (voir figure 4), l'agent intercalant doxorubicine (voir figure 4), et en ce qui concerne les cellules WEHI231 , la cyclosporine Λ (voir figure 4). En outre, PK I 1 195 (mais pas le diazépame), facilite l'induction de l'apoptose par les agonistes du récepteur glucocorticoïde (qui comprennent la dcxamethasone cl le RU24858, (voir figure 2). En revanche, aucun eflét n'a été mis en évidence lors de l'utilisation de RU38486 et de PK I 1 195 simultanément.
Ainsi PK I 1 195 facilite l'induction de l'apoptose en réponse a une très large variété de substances et dans de nombreux types cellulaires différents, notamment dans les lignées cellulaires primaires et transformées d'origine humaine et murinc (voir figures 2 à 4).
PK I 1 195 facilite l'induction des changements mitocliondriaux et post- mitochondriaux associés avec l'apoptose
Le synergisme entre PK I 1 195 et plusieurs agents pro-apoptotiques s'étend pour tout ce qui caractérise le phénomène de l'apoptose. Ces phénomènes comprennent la perte précoce du potentiel transmembranaire mitochondrial (mesuré à l'aide du colorant DiOC6(3) sensible au potentiel), l'augmentation de la génération d'espèces réactives à l'oxygène (mesuré par la conversion d'hydroéthidine en éthidinc catalysée par les anions supcroxides (voir figures 1 à 4), l'exposition éradique des résiducs phosphatidylsérines à la surface de la membrane plasmiquc mesurée à l'aide l'anncxinc V conjuguée à F1TC (voir figure 1 ), et la fragmentation de l'ΛDN nucléaire (hypoploïdic déterminée par la coloration à l'iodurc de propidium des cellules fixées dans l'éthanol (voir figures 1 à 4). Les techniques expérimentales, évoquées supra, sont décrites plus en détail dans Marchetti et al, 1996a, Kroemer et al, 1997a et 1997b, et Zazami et al, 1996, incorporées dans la présente description par référence.
PKI 1 195 permet de surmonter l'inhibition de l'apoptose contrôlée par Bcl-2 dans plusieurs lignées cellulaires différentes.
Bcl-2 possède des effets cytoprotecteurs grâce à son large spectre d'action (Kroemer et al 1997b, et Decaudain et al 1997). Ainsi, la surexpression de Bcl-2 empêche de manière très significative la perturbation de ΔΨm, la production d'anions superoxides, et l'apoptose nucléaire induite par la dcxamethasone dans les hybridomes de cellules T (voir figure 3). Le traitement simultané avec PKI 1 195 et un agent apoptogénique montre un effet hyperadditif facilitant l'apoptose même en présence de Bcl-2. Ainsi, PKI 1 195 permet de restaurer l'induction de l'apoptose dans les cellules surexprimant Bcl-2 au moins partiellement. Cet effet a été observé dans deux types cellulaires différents appelés hybridomes de cellules T 2B4.1 1 (voir figure 3B) et les cellules B WEHI231 leucémiques (voir figure 4B).
PKI 1 195 permet de surmonter la protection conférée par Bcl-2 contre les glucocorticoïdes (voir figure 3B), contre l'irradiation γ, la doxorubicine, la cyclosporine A (voir figure 4B), et l'étoposide. Cet effet est également observé au niveau du mitochondrion, du potentiel redox cellulaire, et du noyaux (voir figures 3 et 4). Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle stratégie pour améliorer la susceptibilité des cellules par l'induction de l'apoptose. Les composés de la famille des isoquinoline carboxamides, en particulier un ligand antagoniste spécifique du récepteur mitochondrial au benzodiazépine (PKI 1 195), facilite l'induction de perturbation de Δ ; ,„ par divers effecteurs apoptotiques, notamment l'cndommagcmcnt de l'ADN (irradiation γ, étoposide, doxorubicine), la fixation de ligands sur le récepteur glucocorticoïde (dexaméthasone, RU24858), et les second messagers pro- apoptotiques du type céramide, tel que la céramide C8. De manière concomitante, les composés de la famille isoquinoline carboxamide améliore l'induction des signaux classiques de l'apoptose telle que l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface des cellules et la fragmentation de l'ADN nucléaire. Il a été démontré que le récepteur mitochondrial au benzodiazépine interagit avec de nombreuses protéines impliquées dans la formation et/ou dans la régulation du porc PT (McEnery et al 1992 et Kinnally et al 1993). En outre, le PKI 1 195 facilite l'ouverture du porc PT induit par un facteur de nécrose de tumeurs (TNF-α) dans les cellules L929 (Pastorino et al 1 96). Dans ce modèle, TNF induit la nécrose (Schulze-Osthoff et al 1994) et l'induction de la nécrose est améliorée par PKI 1 195. En revanche, la présente invention montre que PKI 1 195 permet de faciliter l'induction de l'apoptose, ce qui corrèle avec l'induction de la dissipation de ΔΨm contrôlée par le pore PT. Ces résultats suggèrent que l'ouverture du pore PT pourrait être l'étape limitante de n'importe quelle mort cellulaire (apoptose et nécrose), (Kroemer et al 1997a), et que les événement post-mitochondriaux se terminent par l'activation des enzymes cataboliques (caspases, protéases autres que les caspascs, et nucléases) et/ou que la disponibilité d'ATP cxtramitochondrial dirige la modalité de la mort cellulaire (Hirsch et al 1997, Leist et al 1997, et Nicotera et al 1997).
Ainsi, les résultats des expériences, mises en œuvre lors de la présente invention, démontrent la forte association entre les mitochondries, le potentiel redox, la membrane plasmique et les caractéristiques de l'apoptose, et démontrent que PKI 1 195 agit sur une cible mitochondriale afin de faciliter l'induction de l'apoptose. Cette nouvelle propriété des composés de la famille des isoquinoline carboxamides représente une opportunité pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie et notamment pour faciliter l'induction de la mort cellulaire.
Fxc plc 1 : Cellules et cultures cellulaires
Les lignées cellulaires des hybridomes de thymocytes provenant de souris
Balb/c âgées de 4 à 6 semaines et des cellules T 2B4. 1 1 ont été transfectées avec le vecteur SFFV.nco contenant le gène humain bcl-2 ou seulement le gène de résistance à la néomycine (néo) (Green et al 1994). Les cellules B WEHI231 leucémiques ont été transfectées avec le gène humain bcl-2 ou avec un vecteur néo contrôle (Cuendc et al 1993) et les cellules T CEM-C7.H2 humaines de la leucémie lymphoblastique (Strasser-Wozak, 1 95) ont été cultivées dans RPMI 1640 contenant 10% FCS, des antibiotiques, et la L-glutaminc.
Exemple 2 : Induction de l'apoptose
Les cellules susmentionnées (5-10 x lOVml) ont été cultivées en présence de la quantité indiquée du PKI 1 195, de la diazépame (Sigma), de la dexaméthazone (1 μM, Sigma), de RU24858 (lμM, Roussel Uclaf), de l'antagoniste RU38486 du récepteur glucocorticoïde (l μM, Roussel Uclaf), de la doxorubicine (l μg/ml, Pharmacia), de l'étoposide (10 μMVml, Sigma), de la cytosine arabinoside (10 μg/ml, Upjohn), de la cyclosporine A (10 μM, Sandoz), de la céramide C8 (25 μM, Bio ol, Plymouth Meeting, PA), ou du traitement par irradiation γ (10 Gy). Après les intervalles indiqués, on a récupéré les cellules, et on a testé les caractéristiques associées à l'apoptose.
Exemple 3 : Quantification des paramètres associés a l'apoptose par cvtoinctric de flux.
En suivant les protocoles publiés (Marchetti et al 1996b, Zamzami et al 1995, Kroemer et al 1997c), les fluorochromes suivants ont été utilisés afin de déterminer les différents changements associés à l'apoptose :
- 3,3' dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOCû, 20nM, Bernadi et al 1996) pour la détermination de ΔΨm
- hydroéthidinc (HE, 4 μM) pour la détermination la génération d'anion superoxyde - Anncxine V conjuguée avec FITC ( lμg/ml, Nexins Research, Hoevcn, The Netherlands) pour la détermination de l'exposition de la phosphatidylsérine (PS) sur la membrane plasmique externe.
- Iodurc de propidium (PI) pour la coloration des cellules perméabilisées à l'éthanol afin de déterminer la fréquence des cellules hypoploïdes. Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois et conduisent à des résultats similaires. Les résultats typiques obtenus sont montrés aux différentes figures. La signification statistique des résultats a été calculée en utilisant le test de student.
Exemple 4 : Procédé de préparation de N,N-diétlιγlcnrbaιnntc de plιcnyl-3 naplιtylc-1.
On chauffe au reflux pendant 4 heures, 3, 15 g de phényl-3 naphtol-1, 1 ,95 g de chlorure de N.N-diéthyl carbamoyle, 1 ,45 g de triéthylamine et 0,035 g de diméthylamino-4 pyridine dans 37 cm3 de tétrahydrofuranne. On ajoute 0,4 g de chlorure de N,N-diéthylcarbamoyle, chauffe encore 2 heures puis refroidit à température ambiante (environ 20°C), élimine le précipité par filtration et évapore le filtrat sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographié sur du gel de silice en utilisant comme éluant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80-20 en volume). Après rccristallisation du résidu dans un mélange éther isopropylique-éther de pétrole (1-1 en volume), on isole 2,94 g de N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1 fondant à 74°C (EP 210084A1, exemple 63, page 61, lignes 19-31).
Exemple 5 : Procédé de préparation de N,N-dictlιγl α-méthyl phcnyl-2 πuinnzolinc-4 propanamide. On ajoute, sous azote, 3 g de carbonyldiimidazole à une suspension de 2,67 g d'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque dans 30 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 2 heures d'agitation, on ajoute 6 cm3 de diéthylamine et agite encore 4 heures. On ajoute 150 cm3 d'eau et 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On décante, extrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle, sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec. On chromatographié le résidu sur du gel de silice, une première fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume), puis une deuxième fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume). Après recristallisation dans de l'éther isopropylique on obtient 1 g de N.N-diéthyl α méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 124°C. L'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïquc est préparé selon le procédé suivant :
On porte 3 heures à 90°C un mélange de 15 g de méthyI-4 phényl-2 quinazolinc, de 13,3 g de N-bromosuccinimidc et de 1,65 g de peroxyde de bcnzoyle dans 150 cm3 de tétrachlorure de carbone. On filtre, évapore le filtrat et chromatographié le résidu sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (9-1 en volume) comme éluant. On obtient 1 1 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline fondant à 1 10°C.
A 4 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile et 60 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre, sous azote, on ajoute une solution de 23 g de méthylmalonate de diéthyle dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation, on ajoute une solution de 9,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre et agite encore 2 heures à la température ambiante (20°C environ). On ajoute 100 cm3 d'eau et extrait avec 3 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium puis l'évaporé à sec sous pression réduite. On reprend le résidu dans 100 cm3 d'acide chlorhydriquc concentré et 100 cm3 d'acide acétique et porte l'ensemble à 1 10°C pendant 24 heures. Après refroidissement, on filtre le précipité, le lave à l'eau puis à l'éther isopropylique. Après séchage on obtient 4 g d'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à 180°C (EP 210084 A 1 , exemple 7, page 20, linges 6-14).
La méthyl-4 phényl-2 quinazolinc peut être obtenue selon W.L.F. ARMΛREGO, Fuscd pyrimidincs, quinazolines Part. I, p. 39, Intersciences Publishers (1967), incorporé dans la description par référence.
Exemple 6 : Procédé de préparntiou de N-mcthyl N-plιcnγl plιényl-2 πuiua/.oliuc- 4 propanamide.
On opère comme à l'exemple 5 à partir de 1 ,95 g d'acide phényl-2 quinazolinc-
4 propanoïquc, de 1 ,36 g de carbonyldiimidazolc et de 3 cm3 de N-méthylanilinc dans
40 cm3 de tétrahydrofurnnnc anhydre. Après purification par chromatographié sur du gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et recristallisation dans un mélange acétate d'éthyle-éthcr isopropyliquc (1-5 en volume), on obtient 0,63 g de N-méthyl
N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 1 16°C.
L'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque est préparé selon le procédé suivant ;
Sous azote, on place 5,4 g d'hydrurc de sodium à 80 % dans l'huile avec 250 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre puis, en refroidissant vers 5°C on ajoute 25,6 g de malonatc de diéthyle. Lorsque le dégagement d'hydrogène a cessé, on ajoute une solution de 23,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation à la température ambiante (20°C environ), on ajoute 25 cm3 d'acide acétique, évapore le solvant sous pression réduite et reprend le résidu dans 150 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et 150 cm3 d'acide acétique. On porte l'ensemble à 120°C pendant 15 heures, évapore de nouveau, ajoute 200 cm3 d'eau, 150 cm3 d'éther éthylique et alcalinise à pH 1 1 avec une lessive d'hydroxyde de sodium. On décante la phase organique et lave la solution aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'éther éthylique. On ajuste la phase aqueuse à pH 4 et l'extrait avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle. On obtient 9 g d'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à 159°C (EP 210084A1, exemple 8 ; page 21, 1.15 à p.22, 1.1 1 ensemble p.20, 1.6- 14).
Exemple 7 : Procédé de préparation de N,N-dicthyl (nitro-4 phényl)-2 ηιιiιιazolinc-4 propanamide.
On opère comme à l'exemple 5 à partir de 1,35 g d'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïque, de 0,82 g de carbonyldiimidazole et de 0,9 cm3 de diéthylaminc dans 20 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après chromatographié sur du gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et rccristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient 0,35 g de N.N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazolinc-4 propanamide fondant à 168°C.
L'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazolinc-4 propanoïquc est préparé selon le procédé suivant (EP 2100S4A1 , exemple 1 1 ; p.23,1.20-p.24,1.24 ensemble p.20, 1.6- 14) : On porte au reflux pendant 3 heures un mélange de 3,34 g d'acide para- nitrobenzoïque et de 20 cm3 de chlorure de thionylc. On élimine l'excès de chlorure de thionyle par évaporation sous pression réduite et on ajoute au produit résiduel 20 cm3 de chloroforme, 5,5 cm3 de triéthylaminc et 2,21 g d'(amino-2 bcnzoyl)-3 propionatc d'éthyle. On agite à la température ambiante (environ 20°C) pendant 2 heures. On élimine le solvant sous pression réduite, reprend le résidu dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, filtre et concentre le filtrat à sec, Le produit résiduel est mis en contact avec 20 g d'acétate d'ammonium et porté à 150°C pendant 6 heures. Après refroidissement, on ajoute 250 cm3 d'eau et extrait avec 4 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec 2 fois 100 cm3 d'une solution d'hydroxyde de sodium N et 50 cm3 d'eau. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium, la filtre et l'évaporé à sec sous pression réduite. On obtient 2,8 g de produit que l'on met en contact avec 50 cm3 d'éthanol et 2,5 cm3 d'une solution concentrée d'hydroxyde de sodium. Après 30 minutes à la température ambiante, on élimine l'éthanol par évaporation sous pression réduite et ajoute 200 cm3 d'eau. On lave la phase aqueuse avec 3 fois 50 cm3 d'éther éthylique, on l'acidifie à pH 1 et filtre le précipité formé. Après lavage à l'eau, au chlorure de méthylène et séchage, on obtient 1 ,4 g d'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïquc dont le spectre de RMN du proton dans le diméthylsulfoxydc deutérié a les caractéristiques suivantes :
Ar-CH? δ : 3,7 ppm -CH.-COOH δ : 3 ppm
H aromatiques en meta du NO δ : 8,4 ppm H aromatiques en ortho du N02 δ : 8,9 ppm Autres H aromatiques de 7,7 à 8,4 ppm
Exemple 8 : Procédé de préparation de N,N-diélltyl [(pIιényI-2 trifIuoroιnéthyl-8 πιιiιιoliιιyl-4) oxy]-2 propanamide.
On porte , 9 heures, à ébullition un mélange de 6 g de phényl-2 trifluorométhyl-S quinolinol-4, de 4,76 g de N.N-diéthyl bromo-2 propanamide et de 6 g de carbonate de potassium dans 400 cm" de métylcétone. Après refroidissement, on filtre et évapore le filtrat à sec sous pression réduite. On extrait le résidu avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) à 60°C, filtre l'insoluble et évapore le filtrat sous pression réduite. On chromatographié le solide résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) comme éluant. Après rccristallisation du résidu dans un mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique (1 -4 en volume), on isole 3 g de N,N- diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide fondant à 146°C.
La phényl-2 trifiuorométhyl-8 hydroxy-4 quinoléine peut être préparé par action à 140 °C de bcnzoylacétatc d'éthyle (0, 12 mole) sur la trifluorométhyl-2 aniline (0, 12 mole) en présence d'acide polyphosphoriqu (86 g). Elle présente un point de fusion égal à 136°C ; (EP 210084 Al , exemple 84 ; p.72, 1.28 à p.73, 1.9 ensemble p.55, 1. 1 - 14).
Exemple 9 :~Procédc de préparation de N.N-diétliyl fιnéthoxy-3 plιcnyl)-2 quiιιa/.olinc-4 propanamide.
Un mélange de 1 ,2 g de (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionatc d'éthyle et de 30 cm3 de diéthylamine est chauffé à 250°C pendant 40 heures. Après refroidissement, l'excès de diéthylamine est évaporé. Le résidu est chromatographié sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle ( 1-1 en volume) comme éluant. Le produit récupéré est recristallisé dans de l'éther isopropylique. On obtient 0,36 g de N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide qui fond à 87°C.
Le (mélhoxy-3 phényl)-2 quinazolinc-4 propionatc d'éthyle est préparé selon le procédé suivant :
On agite 17 heures à la température ambiante (20°C environ) 26,7 g d'acide
(amino-2 bcnzoyl)-3 propionique et 25 cm3 d'acide sulfuriquc concentré dans 250 cm3 d'éthnnol absolu. On évapore l'éthanol sous pression réduite, ajoute 200 cm3 d'eau, 200 cm3 d'acétate d'éthyle et du carbonate de potassium jusqu'à pH S. On filtre, décante et réextrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. On obtient 24,8 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle sous forme d'huile. Le spectre RMN du proton, dans le chloroforme deutérié présente les caractéristiques suivantes :
CH2-CH3 δ : 1,2 ppm ÇH2-COOC2H5 δ : 2,8 ppm
ÇH2-CH3 δ : : 4,2 ppm Hé δ : 7,9 ppm
Ar-CO-ÇH2- δ : ; 3,3 ppm H4 δ : 7,3 ppm
NH2 δ : : 5,7 ppm H3 et H5 δ : 6,7 ppm A 2,21 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle et 4,2 cm3 de triéthylamine dans 25 cm3 de chloroforme on ajoute, à 5°C, 2,81 cm3 de chlorure de méthoxy-3 benzoyle. On laisse 1 heure à la température ambiante (envrion 20°C), ajoute 25 cm3 d'eau et décante. On évapore la phase organique sous pression réduite et reprend le résidu avec 17 g d'acétate d'ammonium. On porte l'ensemble à 100°C pendant 7 heures puis évapore l'acide acétique formé sous pression réduite. On verse le résidu sur 100 cm3 d'eau et extrait la phase aqueuse avec 3 fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase aqueuse sur sulfate de magnésium, la filtre et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume) comme éluant. Après recristallisation dans l'éthanol on obtient 1,5 g de (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionate d'éthyle fondant à 70°C ; (EP 210084A1, exemple 2 ; p.14, 1.1 1-19 ensemble p.13,1.33-p.14, 1.10 ).
L'acide (amino-2 benzoyl)-3 propionique peut être préparé selon D.E. R1VETT et coll., Λust. J. Chem., 24, 2717 (1971), incorporé dans la description par référence.
Exemple 10 : Procédé de préparation de N,N- ic< yl plιénγl-3 isoqtιiιιoléiιιe-1 propanamide. On opère comme à l'exemple 9 à partir de 6,1 g de phényl-3 isoquinoléine-1 propionate d'éthyle et de 30 cm3 de diéthylamine. Le produit brut est purifié au moyen de 4 chromatographies successives sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (7-3 en volume) comme éluant. On obtient 1,4 g de N,N- diéthyl phényl-3 isoquinoléine-1 propanamide fondant à 58°C.
Le phényl-3 isoquinoléine-1 propionate d'éthyle est préparé selon le procédé suivant :
On porte à l'ébullition, 48 heures, un mélange de 21 g de méthyl-1 phényl-3 isoquinoléine, de 30,6 g de N-bromosuccinimide et de 1 g de peroxyde de benzoyle dans 730 cm3 de tétrachlorure de carbone. Après refroidissement, on filtre et évapore le filtrat à sec sous pression réduite. On chromatographié le résidu sur du gel de silice avec un mélange toluène-méthanol (98-2 en volume) comme éluant. Après cristallisation dans l'éther isopropylique on obtient 1 1 g de bromométhyl-1 phényl-3 isoquinoléine fondant à 84°C.
Sous azote, on place 6,5 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile avec 160 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute, goutte à goutte, une solution de 34,9 g de malonate de diéthyle dans 200 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation à la température ambiante (20°C environ), on ajoute une solution de 16,2 g de bromométhyl-1 phényl-3 isoquinoléine dans 200 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre.
Après 20 heures d'agitation à 20°C on ajoute 200 cm3 d'eau et extrait la phase aqueuse à l'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume) comme éluant. On récupère
1 1,5 g de produit que l'on reprend dans 1 15 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et porte à ébullition 20 heures. On ajoute 200 cm3 d'eau, filtre le précipité, le lave à l'eau et à l'acétone. On obtient 6,7 g d'acide phényl-3 isoquinoléine- 1 propanoïque fondant à 160°C.
On agite 20 heures à 20°C, 6,7 g d'acide phényl-3 isoquinoléine- 1 propanoïque et 7 cm3 d'acide sulfurique concentré dans 70 cm3 d'éthanol. On verse la solution dans 400 cm3 d'eau et alcalinise la phase aqueuse avec une solution d'ammoniaque concentrée. On extrait avec 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène, sèche la phase organique et l'évaporé à sec sous pression réduite. On obtient 6,3 g de phényl-3 isoquinoléine- 1 propionate d'éthyle fondant à 60°C ; (EP 210084A1 , exemple 4 ; p.17, 1.6-15 ensemble p.13,1.33-p.14, 1.10 ). La méthyl-1 phényl-3 isoquinoléine peut être préparée selon
S. COSZCZYNSKI, Rocznicki Chem., 38(5), 893-5 (1964) ; Chem. Abst. 62, 16188 a (1965), incorporé dans la description par référence.
Exemple 11 : Procédé de préparation de N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzol blthiophènecarboxamide-5.
A 12 cm3 de diméthylsulfoxyde sous atmosphère d'azote, on ajoute, sous agitation, 1,8 g d'hydroxyde de potassium en poudre puis 2 g de N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 et enfin 0,8 cm3 d'iodure de méthyle. On agite 1 heure 30 minutes à température ambiante (20°C environ), verse le mélange réactionnel sur 50 cm3 d'eau et 60 cm3 d'acétate d'éthyle. On agite 15 minutes, décante la phase organique, la lave à l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50-50 en volume) comme éluant. Les fractions contenant le produit sont rassemblées, évaporées sous pression réduite et reprises par un mélange d'eau et d'éther éthylique. La phase organique est décantée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée sous pression réduite. Le résidu est agité 1 heure 30 minutes avec 20 cm3 d'éther de pétrole 40-60°, filtré et séché.
On isole ainsi 1,2 g de N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophène- carboxamidc-5 fondant à 105°C.
Le N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 peut être préparé de la manière suivante : On chauffe à 90°C pendant 2 heures 3 g d'acide phényl-7 benzo[b] thiophènecarboxilique-5 dans 30 cm3 de toluène et 2,6 cm3 de chlorure de thionyle. On évapore sous pression réduite , puis on ajoute au résidu 30 cm3 de toluène et 9,94 cm3 de triéthylamine. On agite et on ajoute, goutte à goutte 1,2 cm3 de butanamine. On agite 1 heure à température ambiante, évapore le toluène sous pression réduite et reprend le résidu par du chlorure de méthylène et une solution aqueuse de carbonate de potassium. On agite 5 minutes, lave la phase organique par de l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évaporé sous pression réduite.
Après chromatographié du résidu sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50-50 en volume), on obtient 2,35 g de N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 fondant à 195°C ; (EP 248734B1, exemple 2 ; p.5, 1 39-60 ensemble exemple 1 p.5, 1. 6-37).
Exemple 12 : Procédé de préparation de N,N-diéthyl phényl-3 nnphtalènccnrhoxnmidc-1.
On chauffe au reflux pendant 1 heure 5 g d'acide phényI-3 naphtalènecarboxylique-1 et 20 ml de chlorure de thionyle. On évapore le chlorure de thionyle, reprend le résidu par 100 ml de toluène et évapore à nouveau. On ajoute alors au résidu obtenu 25 ml de pyridine puis, goutte à goutte, sous agition, 4,5 ml de diéthylamine. On agite 2 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite coulé dans 50 ml d'eau. La phase organique est décantée et la phase aqueuse est extraite par 3 fois 100 ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par3 fois 30 ml d'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées sous pression réduite.
Après recristallisation du résidu obtenu dans l'hexane, on obtient 3,4 g de N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-l , qui fond à 65°C ; (EP 1 12776B 1 , exemple 20 ; p.1 1 , 1.25-35 ensemble p.S, 1.3-14). L'acide phényl-3 naphtalènecarboxylique-1 peut être préparé selon le procédé décrit par F.C. BADDAR et coll., J. Chem. Soc, 1959, 1009, incorporé dans la description par référence.
Exemple 13 : Procédé de préparation de N-méthyl N[méthyl-1 propyll (chloro-2 phénvP-1 isoηuinoléinecflrboxamide-3.
A 1,68 g d'acide (chloro-2 phényl)-l isoquinoléine carboxylique-3 dans 60 ml de chloroforme on ajoute 0,7 g de triéthylamine. On refroidit à 10 °C et ajoute 0,75 g de chloroformiate d'éthyle. On agite 40 n à la température ambiante, introduit une solution de 0,68 g de N-méthyl butanamine-2 dans 60 ml de chloroforme et agite 4h à la température ambiante. On évapore le milieu réactionnel sous pression réduite, reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle, lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée de carbonate de sodium, la sèche sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le résidu sur du gel de silice et recristallise le produit obtenu dans du cyclohexane. On obtient 1,4 g de N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3 fondant à 136°C , (EP 094 271B 1 exemple 21 ; p.7, col.12, 1.57 - p.8, col.13, 1.2 ensemble p.6, col.9, 1.32- p.6, col.9, 1.54).
Exemple 14 : Activité biologique
L'activité biologique des composés selon la présente invention peut être mise en évidence de la façon suivante (les documents indiqués ci-dessous sont incorporés dans la description par référence) :
A : Méthode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire,
Pour quantifier dans une population cellulaire le nombre de cellules en apoptose de par leur contenu en ADN, une méthode d'analyse par FACS (fluorescence activated cell sorting) utilisant le marquage fluorescent des cellules par 2 agents fluorescents intercalants de l'ADN a été adaptée à partir de celle décrite par Pollack A. et Ciancio G. (Pollack A et Ciancio G.In: Flow Cytometry, Darzynkiewicz Z, Crissman HA (eds). Académie Press, San Diego, CA, 1991, pp 19-24). Après trypsinisation, les cellules sont rincées au PBS (« Phosphate Buffer Saline commercialisé par exemple par Gibco BRL) et fixées dans 1 ml d'éthanol froid pendant 30 minutes. Elle sont ensuite rincées 2 fois dans 2 ml de PBS contenant 0,5 % de Tween 20 et resuspendues dans 1 ml de milieu de coloration ( PBS-Tween 20 0,5 % contenant 1 mg/ml de Rnase bouillie, 10 μg/ml d'iodure de Propidium et 4 μg/ml de DAPI-4',6-diamidino-2- phenylindole dihydrochlorure). L'analyse par FACS a lieu après excitation UV. Les études ont eu lieu sur des populations cellulaires cultivées en plaque 6 puits Nunc à raison de 100 000 cellules par puits dans 2 ml de milieu complet à l'ensemencement, les différents produits induisant ou facilitant l'apoptose étant ajoutés 36 heures après ensemencement des cellules et l'analyse par FACS étant réalisée entre 24 et 72 heures après cet ajout.
B : Dosage de l'inhibition de l'activité anti-apoptotique dépendante de Bcl2 dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle.
Par les techniques de transfection stable et en utilisant des agents de sélection tels que, par exemple la néomycine, l'hygromycine, la zéocine ou la puromycine, des clones dérivés par exemple de la lignée cellulaire NCI-H1299 (obtenue auprès de l'ATCC) peuvent être établis de sorte à avoir une expression conditionnelle de la protéine Bcl2 strictement dépendante de la concentration de tétracycline ou plus avantageusement d'anhydrotétracycline présente dans le milieu. Pour cela, on peut utiliser la technique décrite par Gossen et Bujard (Gossen M & Bujard H. (1992). Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 5547-51 ; Nucleic Acids Res 1993 Sep 1 1 ;21(18):441 1 -2), avec la possibilité de l'adapter tout en conservant les caractéristiques du système de régulation transcriptionnelle décrite par ces auteurs. On a pu établir des clones surexprimant la protéine Bcl2 en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline dans le milieu de culture, alors qu'en présence de 0.5 mg/1 d'anhydrotétracycline, la protéine n'est pas détectable par la technique de western blotting en utilisant l'anticorps anti-Bc!2, clone 124 commercialisé par la société DAKO et en utilisant le protocole décrit par Venot et al. (Venot, C, Maratrat, M., Dureuil, C, Conseiller, E., Bracco, L., and Debussche, L. 1998. EMBO J. 17:4668-4679).
En utilisant l'approche décrite ci-dessus, il a été possible de caractériser des clones qui se sont avérés significativement moins sensibles à l'apoptose induite par une gamme de concentrations d'agents inducteurs d'apoptose en absence qu'en présence de tétracycline dans le milieu de culture, c'est-à-dire lorsqu'ils surexpriment la protéine Bcl2 plutôt que lorsqu'ils ne la surexpriment pas. Les agents inducteurs d'apoptose testés ont été par exemple l'adriamycine (10-100 μg/rnl), le terbutyl-hydroperoxyde (25-100 μM), la vincristine (0.03-0.003 μg/ml) et la camptothécine (0.01-0.1 μg/ml). Pour quantifier l'induction d'apoptose, on peut par exemple utiliser la méthode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire décrite dans A.
Une manière possible de doser l'inhibition d'activité anti-apoptotique dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle par un traitement qui peut être par exemple l'incorporation d'un composé chimique consiste à quantifier, en utilisant par exemple la méthode décrite dans A, le pourcentage d'apoptose induite dans une population de cellules issues par exemple d'un des clones décrits ci-dessus, dans les 4 situations suivantes :
1) le composé chimique à évaluer est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en même temps qu'un agent inducteur d'apoptose tel que par exemple ceux cités ci- dessus et le clone est cultivé en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose PI .
2) le même agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 est incorporé seul dans le milieu de culture cellulaire et le clone est cultivé en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P2.
3) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en même temps que le même agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 μg/ml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 μg/ml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P3.
4) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en absence d'agent inducteur d'apoptose et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 μg/ml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 μg/ml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P4.
On calcule alors le ratio R = 100 x (P1-P2)/(P3-P4). Quand R=100, l'inhibition de l'activité anti-apoptotique liée à la surexpression de Bcl2 est de 100 % à la concentration de composé à évaluer utilisée. Quand R= 0, le composé n'est pas inhibiteur à la concentration testée. Une série de résultats peut être obtenue à partir d'une gamme de concentration de composé à évaluer. On peut calculer mathématiquement à partir de ces résultats une concentration inhibitrice de 50 % ou IC50. Plusieurs composés peuvent être comparés en fonction de leur IC50. On dira par exemple qu'un produit A est deux fois plus actif qu'un produit B si l'IC50 de A est deux fois plus faible que l'IC50 de B. Les valeurs d'IC50 peuvent varier en fonction du clone cellulaire utilisé, de la nature et de la concentration de l'inducteur d'apoptose utilisé.
En utilisant la technique décrite dans B, il a été possible de déterminer des 1C50 inférieures ou égales à 50 μM pour le PKI 1 195 et les composés issus des familles II, 111, IV et V .
Avantageusement, les composés des familles II, 111, IV présentent des activités pouvant être au moins 5 fois meilleures que celle présentée par le PKI 1 5.
Préférentiellement, les composés des exemples 4 à 12 décrits plus haut présentent des activités supérieures à celles démontrées par le composé PKI 195. Parmi les composés de formule générale (II), on préfère les composés suivants
N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1
N,N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide N.N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide
N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide
N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide
N,N-diéthyl phény!-3 isoquinoléine- 1 propanamide
Parmi les composés de formule générale (III), on préfère : N-méthyl N-(méthyI-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5
Parmi les composés de formule générale (IV), on préfère :
N.N-diéthyl phényI-3 naphtalènecarboxamide-1
Parmi les composés de formule générale (V), on préfère :
N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-! isoquinoléinecarboxamide-3
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer.
2. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale I :
Figure imgf000046_0001
Dans laquelle
RI est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R2 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R3 est un atome d'halogène tel que CI, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, les groupes RI , R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.
3. Produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composé est le PKI 1 195 l-(2-chlorophényl)-N-méthyI-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide.
4. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale II :
II
Figure imgf000047_0001
dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH,
B représente un atome d'azote ou un groupe CH,
V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène
(fluoré, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes nitro ou trifluorométhyle, Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phényle, thiényle, pyridyle, ou phényle substitué parun ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou nitro, la chaîne -X-(CH2)n-(CHR)m-CONR]R2 est fixée en position ortho ou para par rapport à B,
R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone,
Ri et R2 identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkyle comportant 3 à 6 atomes de carbone, phényle, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la prtie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alcènyle comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition que la double liaison ne soit pas située en position 1, 2 par rapport à l'atome d'azote, Ri et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridine, morpholine ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3 , N-R», SO, SO2 ou un atome d'oxygène ou de soufre, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone,
Rj représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1 , n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, SO2 ou N-R), la somme m + n est au moins égale à 1 , étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R3, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de 1 et à l'exception du N.N-diméthylcarbamate de phényI-2 quinolyle-4. autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (Ha) ou (Ilb)
Figure imgf000048_0001
dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, Ri, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.
5. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale III :
III
Figure imgf000049_0001
Dans laquelle Ri et Ri' identiques ou différents représentent des groupes alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée de C1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone ou phényle,
Ri et Ri' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridine. de carbone, nitro ou trifluorophényle,
Ar représente un radical phényle, thiényle ou phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fluor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes
X^ représente un des enchaînements suivants :
Figure imgf000049_0002
6. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale IV : IV
Figure imgf000050_0001
Dans laquelle Ri est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6, un groupe phényle, un groupe cycloalkyle possédant de C3-C6, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, ou un groupe
s
.c- -R.
R,
Dans lequel R3 et R» sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et Rj est un groupe alkenyle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans Rj, R-j, et R$ étant compris entre 2 et 5,
R2 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6 , un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, un groupe 3
Figure imgf000050_0002
Dans lequel Ri, R4, et R5 sont définis comme ci-dessus, ou un groupe
Figure imgf000050_0003
Dans lequel n est 0, 1, 2 ou 3, RI et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétérocycle à 5, 6 ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote et l'oxygène et pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de C1-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkyle, diméthylaminoalkyle dont la partie alkyle est de C1-C3,
Z est un groupe phényle, pyridyle, thienyle, 2-thiazolyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, alkoxy, alkylthio en C1-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro,
X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CH,
Ou tout stéréoisomère de formule IV.
7. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale V :
Figure imgf000051_0001
Dans laquelle,
Ri et R2 représentent indépendamment un groupe alkyle de C1-C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkylc de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dont la partie alkyle est de C 1-C3 ; Rj et R2 peuvent représenter également un groupe alcényle ou alcynyle de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en position 1-2 par rapport à l'atome d'azote ; Ri et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -Ri dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié de C2- C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de C1-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-R5, R5 représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de C1-C3 ; RI et R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétérocycle comprenant éventuellement un second hétéroatome. Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les goupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1-C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe nitro ; A et B sont indépendamment N ou CH.
Figure imgf000052_0001
Représente l'enchaînement
Figure imgf000052_0002
Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants :
\
/
X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène, halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de C1-C3, le groupe nitro ou trifluorométhyle.
8. Produit selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que ledit agent inducteur de l'apoptose est sélectionné parmi les agents qui endommagent l'ADN, les ligands naturels ou synthétiques du récepteur aux glucocorticoïdes, ou les seconds messagers pro-apoptotiques.
9. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit agent est de préférence sélectionné parmi les radiations gamma, l'étoposide, la doxorubicine, la dexamethasone, la céramide telle que la céramide C8, la lonidamine.
10. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit second messager pro- apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatine, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthane sulfonoxy-alkanes, les dérivés de la pipérazine, parmi les inhibiteurs des topoisomerases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, Pepipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1 , par exemple les dérivés de la camptothecine, parmi les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le methotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidines, par exemple la 5-fluorouracile, parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone, la plicamycine.
1 1. Produit selon l'une des revendications 1-10 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un vecteur viral qui possède un gène qui code pour la thymidine kinase.
12. Produit selon l'une des revendications 1 à 1 1 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
13. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
14. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné induire la mort des cellules tumorales.
15. Utilisation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose.
16. Utilisation d'un composé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il est de préférence sélectionné parmi les composés des familles de formule générale I, 11, III, IV et V, notamment parmi les molécules suivantes : 1 -(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l -méthylpropyl)-3 -isoquinoline carboxamide (PKI 1 195), N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1,
N.N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N.N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide, N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl phényl-3 isoquinoléine- 1 propanamide,
N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5,
N.N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1,
Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3.
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