WO1999042827A2 - Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization - Google Patents

Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization Download PDF

Info

Publication number
WO1999042827A2
WO1999042827A2 PCT/DE1999/000460 DE9900460W WO9942827A2 WO 1999042827 A2 WO1999042827 A2 WO 1999042827A2 DE 9900460 W DE9900460 W DE 9900460W WO 9942827 A2 WO9942827 A2 WO 9942827A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
alloy
hybridization
dna
metal
Prior art date
Application number
PCT/DE1999/000460
Other languages
German (de)
French (fr)
Other versions
WO1999042827A3 (en
Inventor
Vladimir Mirsky
Michael Riepl
Original Assignee
Wolfbeis, Otto, Samuel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19807338A external-priority patent/DE19807338A1/en
Priority claimed from DE1998107339 external-priority patent/DE19807339A1/en
Application filed by Wolfbeis, Otto, Samuel filed Critical Wolfbeis, Otto, Samuel
Priority to EP99915484A priority Critical patent/EP1055004A2/en
Publication of WO1999042827A2 publication Critical patent/WO1999042827A2/en
Publication of WO1999042827A3 publication Critical patent/WO1999042827A3/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/22—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance
    • G01N27/221—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance by investigating the dielectric properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/02—Analysing fluids
    • G01N29/036—Analysing fluids by measuring frequency or resonance of acoustic waves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
    • G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
    • G01N2291/025—Change of phase or condition
    • G01N2291/0256—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors
    • G01N2291/0257—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors with a layer containing at least one organic compound

Definitions

  • the present invention relates to a device with which the hybridization of oligo- and / or polynucleotides can be detected.
  • the invention relates to an arrangement with which various oligonucleotides and / or polynucleotides can be detected by means of electrochemical measurements.
  • the analysis of biomolecular interactions is a versatile tool to determine the binding of, for example, receptor-ligand pairs without radioactive labeling.
  • Hybridization is generally understood to mean the formation, under certain conditions, of base-pairing double-stranded nucleic acids from two completely separate, single-stranded nucleic acid molecules.
  • DNA-DNA hybridization and DNA-RNA hybridization.
  • Various hybridization techniques are known from the prior art, for example saturation hybridization, plus-minus hybridization, sandwich hybridization, fatigue hybridization, competition hybridization. These hybridization techniques are divided into liquid hybridization and filter hybridization.
  • both reactants are in solution, and in filter hybridization, one of the reactants is bound to a filter, which is then incubated in a solution that contains the second reactant.
  • blocking reagents are usually added to the hybridization solution.
  • SPR surface plasmon resonance method
  • Sensitive surfaces used in the SPR are described in EP 0 589 687.
  • a disadvantage of these sensitive surfaces, however, is that they can only be used for this SPR method, since very good conductivity properties of the metal are a prerequisite for detecting the changes in the refractive index.
  • Metals other than the metals gold, silver, aluminum, copper described here have a lower conductivity and are therefore too bad for the SPR process. With this method, too, it is not possible to carry out a large number of simultaneous verifications with a single device or arrangement.
  • Another object is to provide an arrangement with which it is possible to detect the hybridization of different oligo- and / or polynucleotides in one and / or several method steps.
  • a device which is characterized in that it has an electrode made of a metal or a metal (alloy) with a sensitive surface which comprises a monolayer or a monolayer receptor which or which is immobilized on this electrode surface.
  • HS-X, S X, XSSY or XSi (R 3 )
  • X and Y are arbitrary molecular fragments, in particular functional
  • the detection method is characterized in that changes on or within the sensitive surface of the electrode, that is to say the hybridization of complementary or partially complementary oligo and / or polynucleotide sequences, are detected by means of electrochemical measurement methods, in particular capacitive measurement methods.
  • the electrode and / or electrode arrangement according to the invention can therefore be used, depending on the use, as a biosensor, chemosensor, DNA probe or as an array with any number of identical or different electrodes.
  • This use has the advantage that the device according to the invention can be used directly in a sample medium without the need for lengthy cleaning steps for the substances to be detected. It is also possible to use metal layers of any thickness or geometry.
  • oligonucleotides and / or polynucleotides in particular deoxyribonucleic acids (DNA), ribonucleic acids (RNA), synthetic polyamide or peptide nucleic acids (PNA), nucleic acids that are completely or partially complementary to one another, as well as to detect the interactions between antibodies and antigens.
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • PNA synthetic polyamide or peptide nucleic acids
  • nucleic acids that are completely or partially complementary to one another, as well as to detect the interactions between antibodies and antigens.
  • viruses, phages, prions, microorganisms and the like can be detected.
  • any solid conductive or semiconductive substance preferably a metal such as Ag, Au, Pt, Pd, an alloy, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr, a semiconductor, for example GaAs, Si, is suitable as the material for the electrode , Ge.
  • a metal such as Ag, Au, Pt, Pd, an alloy, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr, a semiconductor, for example GaAs, Si
  • an electrode made of a piece of silicon wafer that is first provided with a titanium-palladium or chrome layer as an adhesion promoter and then with an alloy of palladium and gold in a ratio of at least 65% Au and up to 35% Pd, is coated. The electrode coated in this way is then treated with 16-mercaptohexadecanoic acid.
  • the complementary or partially complementary oligo- and / or polynucleotide sequences of the sequences to be detected are then immobilized on this alkylthiol-coated electrode surface.
  • This immobilization can be done by different methods.
  • the electrode then has the following structure after chemical coupling:
  • the immobilization of avidin must take place on the activated terminal COOH groups of 16-mercaptohexadecanoic acid and the polynucleotide sequence is linked to the sensitive surface by the avidin-biotin binding.
  • the electrode then has the following structure after chemical coupling:
  • the method is then carried out in such a way that the hybridization of the sequences to be detected can be detected by means of electrochemical measurements, in particular the change in capacitance on and within the sensitive surface of the electrode.
  • the hybridization can be detected using other electrochemical methods, for example impedance measurements, voltammetry, measurement of non-linear impedance properties, chronoamperometry and chronopotentiometry. All of these methods can be carried out both with and without a marker.
  • the measurement of the nonlinear impedance properties is preferably understood to mean the measurement of the second and third harmonic, as well as that of the capacitive current, which are very sensitive to electrical or mechanical changes to the receptor layer react. These methods can be used both for the single electrode and for an electrode array.
  • the detection of the hybridization of oligo and / or polynucleotides is also possible with the help of fluorescent markers and intercalation dyes.
  • fluorescent markers and intercalation dyes In order to avoid the problem of quenching on the metal surface of the electrode, it is necessary to create a certain distance between the marker and the metal surface of the electrode.
  • a receptor bound to the metal surface of the electrode for example a DNA double strand with an intercalated marker / fluorescent dye, is removed from the electrode surface by the electrically controlled desorption which releases the thiol-metal bond of the underlying dielectric base layer.
  • the resulting fluorescence / marker staining can be detected with a fluorimeter or fluorescence microscope. This method is also used for oligo- or polynucleotide single strands or other receptors, the marker binding covalently or adsorbently to the molecules.
  • a buffer system consisting of 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM EDTA (TE buffer) is just as suitable for the hybridization reaction as a buffer system made of 5 mM imidazole, 100 mM NaCl, pH 7.1 ( Imidazole buffer).
  • buffers based on phosphate or acetate can also be used.
  • FIG. 2 the capacitive detection of the hybridization of different complementary polynucleotide fragments, the complementary strand being covalently bound to an ⁇ -functionalized alkylthiol layer on a gold alloy
  • FIG. 3 shows the kinetics of DNA hybridization when a certain DNA concentration is added
  • FIG. 4 shows the total change in capacitance, divided into the individual steps of sensor preparation and application
  • FIG. 5 shows the change in capacity during hybridization when using the different immobilization techniques described above
  • Figure 7 shows the detection of bacteriophages when adding different bacteriophage concentrations.
  • FIG. 1 shows the change in capacity as a function of the time during the immobilization of biotinylated polynucleotide sequences, avidin initially being immobilized on the activated terminal COOH groups of 16-mercaptohexadecanoic acid, so that the polynucleotide sequence through the avidin-biotin binding with the sensitive surface of the Link electrode.
  • FIG. 2 shows the detection of DNA fragments on the sensitive surface.
  • a biosensor with the structure Au (alloy) -S- (CH) ⁇ 5 -CO-NH-DNA is used and the degree of DNA hybridization is monitored at different concentrations of complementary DNA by the change in capacity. This change in capacity indicates the level of DNA hybridization.
  • the complete hybridization of a 22mer on a 24mer fragment is achieved within a short time.
  • the graphic representation of the change in capacity in FIG. 3 shows the course of the hybridization of polynucleotides to the activated sensitive surface of the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) ⁇ 5 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide , wherein the kinetics of the hybridization is represented as a change in capacity if constant amounts of complementary or partially complementary polynucleotide sequences to the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH)
  • FIG. 4 schematically shows the course of the changes in capacitance when the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide is produced step by step.
  • FIG. 7 shows the change in capacitance when detecting bacteriophages with a sensor of the structure Au-S- (CH 2 ) ⁇ 5 -CO-NH-Antibodies when various bacteriophage concentrations are added. Each symbol shown represents a series of measurements.
  • thiol-modified oligonucleotides can also be adsorbed onto gold first and the gaps in the self-assembling monolayer can be filled with stable alkylthiols. Simultaneous coating with HS spacer oligonucleotide and alkylthiols in a certain ratio also produces the monolayer, which is required for the detection method by means of a change in capacity. In this case, the immobilization is simplified and the hybridization described above can be carried out immediately.
  • the hybridization and immobilization can be controlled by changes in potential. It was found that the potential applied has an influence both on the immobilization of oligonucleotide strands and bacteriophages and on the hybridization of oligonucleotides. Already by Kelley, S.O. et al. It was described in Langmuir 14 (1998), 6781-6784 that double-stranded DNA helices, depending on the applied potential, orient themselves differently on the electrode surface due to their negatively charged phosphoric acid building blocks, depending on the electrode potential. The orientation of the DNA can therefore be controlled in order to achieve an optimal configuration for the hybridization of the nucleic acid molecules on the electrode surface.
  • Biosensor or a DNA probe is provided with which it is possible by means of measuring the change in capacity, the sequences of DNA, RNA, PNA, gene segments, genetic defects, changes in the sequences in certain gene areas, effects of antibodies / antigens. It could also be shown that the detection of many different fragments is possible with an electrode array.
  • the electrode according to the invention with the sensitive surface is suitable for use in chemical, medical or biological analysis.
  • the device settings (20 Hz, +300 mV) were optimized for a two-electrode configuration for sensitive electrodes with a surface area of approx. 1 to 2 mm 2 .
  • lower frequencies are required for an optimized measurement, whereas smaller electrodes behave in reverse.
  • the following example describes the production of a sensor for the detection of hybridization of polynucleotide sequences.
  • the sensitive electrodes are prepared as follows:
  • Silicon wafer pieces with a size of 3.20 mm ⁇ 10.02 mm and a thickness of 450 ⁇ m were produced in a generally customary sputtering process or vapor deposition process with an electrode measuring 1.56 mm ⁇ 1.56 mm (reactive surface) and a feed line 10 ⁇ m wide and 6.65 mm long.
  • the electrode was made up of titanium and palladium layers (bonding agent, each 50 nm thick) and a covering layer of gold alloy (200 nm).
  • a silver wire was soldered onto the upper end of the leads as a contact point for the measuring system. First, the wafers were completely immersed in chloroform pa for 30 minutes.
  • the wafer was immersed in a 1: 1 (v / v) mixture of chloroform and methanol and treated in an ultrasound bath for 10 minutes. Analogous to the chloroform used, ethanol (99%) and a 1: 1 (v / v) mixture of ethanol and methanol can also be used in this cleaning step.
  • the gold alloy wafer was immersed in a hot 3: 1 (v / v) mixture of concentrated sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide solution for 5 minutes.
  • the electrodes were thoroughly rinsed with ultrapure water (Millipore: Mili.QPlus-185; 18.2 M ⁇ cm "1 ) and dried. All glass and Teflon devices were cleaned in an analogous manner before use. The electrodes are then coated as described below:
  • a chloroform solution containing 5 mM 16-mercaptohexadecanoic acid was used for the coating.
  • the surface of the electrode was coated with alkylthiol by immersing the wafer in the unstirred coating solution at room temperature for 15 hours.
  • the electrode was rinsed with chloroform for 15 seconds to remove excess molecules adhering to the surface. After drying in a stream of nitrogen and washing several times with ultrapure water, the electrode was installed in the measuring cell.
  • the measurement is carried out as follows:
  • the wafer plate with the alkylthiol-coated electrode was attached together with an AG / AgCl reference electrode (surface approx. 1 cm) to a Teflon holder, which serves as a cover for the measuring cell (Eppendorf cup 1.5 ml) and an opening for the addition and removal of Owns liquids.
  • the cell was filled with electrolyte (100 mM KC1, pH 5.1, approx. 200 to 300 ⁇ l) until the reactive surface of the gold electrode and the reference electrode (Ag / AgCl) were completely immersed.
  • a magnetic stirrer was used for constant mixing.
  • a lock-in amplifier with an integrated sine generator generated a constant sine signal with a frequency of 20 Hz and an amplitude of 10 mV.
  • the lock-in amplifier is also used to register the capacitive current.
  • a DC voltage is applied via a voltage generator.
  • the adsorption of molecules on the electrode surface was measured by changing the capacitance.
  • the measurement signal was recorded on an xt recorder and transferred to the computer via a 16 bit AD converter.
  • the absolute capacitance of the coated electrodes was determined at an electrical potential of +300 mV. This is followed by the immobilization of the oligo- and / or polynucleotide sequences:
  • the immobilization of polynucleotide sequences was carried out in two different ways.
  • the terminal COOH group of mercaptohexadecanoic acid was activated first.
  • the activation was achieved, for example, with N-hydroxysuccinimide.
  • the coated electrodes were immersed in 5 ml of dioxane and the solution was stirred for 10 minutes. After adding 50 mg of dicyclohexylcarbodiimide and 25 mg of N-hydroxysuccinimide, the solution was stirred for a further 4 hours. After cleaning the activated electrode with dioxane and methanol, it was placed in the measuring cell.
  • the change in capacity when adding an amino-functionalized DNA sequence indicates the immobilization rate.
  • water-soluble carbodiimide EDC is used as a reagent, immobilization can take place directly in the measuring cell without external activation.
  • biotinylated polynucleotide sequences the immobilization of avidin to the activated terminal COOH groups of mercaptohexadecanoic acid is necessary, the polynucleotide sequence being linked to the surface by rinsing and changing the buffer by the avidin-biotin binding.
  • the detection of the hybridization is carried out as follows:
  • the detection of DNA requires the construction of a sensitive surface as described above.
  • the measurement is carried out in an Eppenorf Cup containing 350 ⁇ l buffer (pH 7.1; 100 mM NaCl; 5 mM imidazole).
  • the addition of non-complementary DNA and RNA shows little or no change in capacity.
  • Different amounts of a complementary 22-mer DNA fragment are added to a biosensor of the structure Au (alloy) -S- (CH) ⁇ 5 -CO-NH-DNA and the hybridization is followed by changing the capacity (FI
  • nucleotide double strand is immobilizing a nucleotide double strand on the electrode first.
  • One of the two strands has at least one functional group that binds to the terminal groups of the monolayer via chemical coupling. If the nucleotide strand has e.g. a thiol group, it can be applied directly to the metal surface of the electrode. If the bound double strand is denatured by increasing the temperature or other methods, only the coupled single strand remains in an oriented form on the electrode surface. After changing the electrolyte solution and removing the free nucletide segments, the associated complementary strand can now be detected.

Abstract

The invention relates to a device enabling the detection of oligonucleotide and/or polynucleotide. The invention further relates to an array enabling detection of different oligonucleotides and/or polynucleotides by means of electrochemical measurements.

Description

Vorrichtung zur Detektion von Oligo- und/oder Polynukleotid-Hybridisierungen Device for the detection of oligo- and / or polynucleotide hybridizations
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit der die Hybridisierung von Oligo- und/oder Polynukleotiden nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine Anordnung, mit der verschiedene Oligo- und/oder Polynukleotide mittels elektrochemischer Messungen nachgewiesen werden können.The present invention relates to a device with which the hybridization of oligo- and / or polynucleotides can be detected. In addition, the invention relates to an arrangement with which various oligonucleotides and / or polynucleotides can be detected by means of electrochemical measurements.
Hybridisierungen von Oligo- und Polynukleotiden mit den unterschiedlichsten Nukleinsäureträgermaterialien und Wechselwirkungen spezifischer Enzyme mit solchen Trägermaterialien. die eingesetzt werden, um Desoxyribonukleinsäuren oder Ribonukleinsäuren zu modifizieren, sind in allen Bereichen der Molekularbiologie von besonderem Interesse. Deshalb wird der Nachweis von spezifischen Sequenzen auf vielen Gebieten in zunehmendem Maße immer wichtiger. z.B. in der klinischen Diagnostik. Die Analyse von biomolekularen Wechselwirkungen ist ein vielseitiges Werkzeug um die Bindung von beispielsweise Rezeptor-Liganden-Paaren ohne radioaktive Markierung zu bestimmen.Hybridizations of oligo- and polynucleotides with a wide variety of nucleic acid carrier materials and interactions of specific enzymes with such carrier materials. which are used to modify deoxyribonucleic acids or ribonucleic acids are of particular interest in all areas of molecular biology. Therefore, the detection of specific sequences is becoming increasingly important in many areas. e.g. in clinical diagnostics. The analysis of biomolecular interactions is a versatile tool to determine the binding of, for example, receptor-ligand pairs without radioactive labeling.
Insbesondere die DNA als Träger vererbter oder implementierter Information ist in den letzten Jahren zum wichtigsten Forschungsobjekt der Bioanalytik geworden. Durch die Aufklärung der Sequenzen der Genome erhofft man sich einen Einblick in die molekularbiologischen Grundlagen des Lebens und damit auch in Abweichungen von der ..Normalität". Die Abweichungen können natürlicher Art sein und in Folge zu Krankheiten fuhren, können aber auch erst durch gentechnische Veränderungen hervorgerufen sein, um z.B. eine gezielte Resistenz zu bewirken. Der Nachweis derartiger „Abweichungen" oder Veränderungen gehört demnach zu den wichtigsten Aufgaben der gegenwärtigen Bioanalytik. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß ohne eine hochqualifizierte Bioanalytik der Nachweis genetischer Veränderungen nicht möglich ist.In particular, DNA as the carrier of inherited or implemented information has become the most important research object in bioanalytics in recent years. By elucidating the sequences of the genomes, one hopes to gain an insight into the molecular-biological foundations of life and thus also into deviations from "normality". The deviations can be natural and consequently lead to diseases, but can also only be caused by genetic engineering changes be caused, for example, to bring about targeted resistance. The detection of such "deviations" or changes is therefore one of the most important tasks of current bioanalytics. It must be taken into account here that without highly qualified bioanalytics the detection of genetic changes is not possible.
Verschiedene Verfahren zum Nachweis von genetischen Veränderungen oder zum Nachweis von der Nukleotidsequenzen in Genen sind bekannt. Zu diesen Verfahren gehört auch die Nukleinsäure-Hybridisierung. Unter Hybridisierung versteht man generell die unter bestimmten Bedingungen durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung doppelsträngiger Nukleinsäuren aus zwei vollständig voneinander getrennten, einzelsträngigen Nukleinsäure- Molekülen. Dabei wird zwischen DNA-DNA-Hybridisierung und DNA-RNA-Hybridisierung unterschieden. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Hybridisierungstechniken, beispielsweise Sättigungshybridisierung, Plus-Minus-Hybridisierung, Sandwich- Hybridisierung, Erschöpfungshybridisierung, Kompetitionshybridisierung, bekannt. Diese Hybridisierungstechniken werden unterteilt in Flüssigkeitshybridisierung und Filterhybridisierung. Bei der Flüssigkeitshybridisierung befinden sich beide Reaktionspartner in Lösung und bei der Filterhybridisierung ist einer der Reaktionspartner an einen Filter gebunden, der dann in einer Lösung inkubiert wird, die den zweiten Reaktionspartner enthält. Um unspezifische Reaktionen zwischen der in Lösung befindlichen Nukleinsäure und dem Filtermaterial zu unterdrücken, werden der Hybridisierungslösung meist Blockierungsreagenzien zugegeben.Various methods for the detection of genetic changes or for the detection of the nucleotide sequences in genes are known. These methods also include nucleic acid hybridization. Hybridization is generally understood to mean the formation, under certain conditions, of base-pairing double-stranded nucleic acids from two completely separate, single-stranded nucleic acid molecules. A distinction is made between DNA-DNA hybridization and DNA-RNA hybridization. Various hybridization techniques are known from the prior art, for example saturation hybridization, plus-minus hybridization, sandwich hybridization, fatigue hybridization, competition hybridization. These hybridization techniques are divided into liquid hybridization and filter hybridization. In liquid hybridization, both reactants are in solution, and in filter hybridization, one of the reactants is bound to a filter, which is then incubated in a solution that contains the second reactant. In order to suppress non-specific reactions between the nucleic acid in solution and the filter material, blocking reagents are usually added to the hybridization solution.
Nachteilig an diesen Verfahren ist der Einsatz von radioakiv markierten Verbindungen, um eine Hybridisierung nachweisen zu können. Diese Verfahren können auch nur an Arbeitsplätzen durchgeführt werden, an denen das Arbeiten mit diesen Substanzen erlaubt ist. Alle verwendeten Materialien müssen eigens entsorgt werden, diese Entsorgungsprobleme machen diese Verfahren vergleichsweise teuer. Darüber hinaus ist es nur sehr begrenzt möglich, voneinander verschiedene Oligo- oder Polynukleotide in einem Verfahrensschritts mittels einer dafür ausgestatteten Anordnung nachzuweisen, dies bedeutet, daß jeder Nachweis meistens einzeln geführt werden muß. Eine Massenanalyse mittels eines Arrays in einem Schritt kann nur mit großem Aufwand durchgeführt werden und ist auf eine sehr geringe Anzahl von parallelen Messungen beschränkt. Gerade in der Bioanalytik wurden in den letzten Jahren große Anstrenungen unternommen mit Hilfe von Biosensoren Nachweissysteme für die unterschiedlichsten Anforderungen zu entwickeln. Diese Sensoren werden immer häufiger benötigt, um Analysen rasch und am Ort des Geschehens durchzuführen. Dafür werden insbesondere Moleküle benötigt, die das Ziel erkennen können. Gleichzeitig müssen die vielen anderen ebenfalls vorhandenen Stoffe ignoriert werden. Ein Biosensor muß also die Voraussetzung erfüllen, daß der Vorgang der Erkennung/Bindung nachgewiesen und in ein meßbares Signal „übersetzt" werden kann. Diese „Übersetzung" stößt jedoch auf Schwierigkeiten, so daß ein Bedarf an einem einfach durchführbaren Nachweissystem besteht. Sowohl für Monosysteme als auch für multiple Systeme ist es erforderlich, daß die komplementären und/oder teilweise komplemetären Sequenzen der nachzuweisenden Oligo- und/oder Polynukleotide immobilisiert auf einer Oberfläche angeordnet sind. Aus dem Stand der Technik ist ein solches System nicht bekannt.The disadvantage of these methods is the use of radioactively labeled compounds in order to be able to detect hybridization. These procedures can also only be carried out at workplaces where work with these substances is permitted. All materials used have to be disposed of separately, these disposal problems make these processes comparatively expensive. In addition, it is only possible to a very limited extent to detect oligo- or polynucleotides that differ from one another in one process step by means of an arrangement equipped for this purpose, which means that each detection must usually be carried out individually. A mass analysis using an array in one step can only be carried out with great effort and is limited to a very small number of parallel measurements. Especially in bioanalytics, great efforts have been made in recent years to develop detection systems for a wide variety of requirements with the help of biosensors. These sensors are increasingly required to carry out analyzes quickly and on site. For this, molecules are needed that can recognize the target. At the same time, the many other substances that are also present must be ignored. A biosensor must therefore meet the prerequisite that the process of recognition / binding can be detected and "translated" into a measurable signal. However, this "translation" encounters difficulties, so that there is a need for an easily implemented detection system. Both for monosystems and for multiple systems, it is necessary that the complementary and / or partially complementary sequences of the oligo- and / or polynucleotides to be detected are arranged immobilized on a surface. Such a system is not known from the prior art.
Neben den oben beschriebenen Hybridiserungsverfahren wurden in den letzten Jahren weitere Verfahren entwickelt, um Bindungen zwischen Oligo- oder Polynukleotiden mit Nukleinsäuren nachzuweisen. Grundlegendes Prinzip ist die sensitive Bestimmung von Änderungen des Brechungsindex auf einer Wellenleiteroberfläche, die zu einer wirksamen Diskriminierung zwischen gebundenen und nicht gebundenen Spezies führt. Zu diesen Bestimmungsmethoden gehört auch die Oberflächenplasmonresonanzmethode (SPR).In addition to the hybridization methods described above, other methods have been developed in recent years to detect bonds between oligo- or polynucleotides with nucleic acids. The basic principle is the sensitive determination of changes in the refractive index on a waveguide surface, which leads to effective discrimination between bound and unbound species. The surface plasmon resonance method (SPR) is one of these methods of determination.
Bei der SPR werden die Änderungen im Brechungsindex in einer Schicht, die auf einer dünnen Metallschicht aufgebracht ist, durch konsequente Änderung der Intensität eines reflektierenden Lichtstrahls detektiert. Sensitive Oberflächen, die in der SPR eingesetzt werden, sind in der EP 0 589 687 beschrieben. Nachteilig an diesen sensitiven Oberflächen ist jedoch, daß sie nur für dieses SPR- Verfahren eingesetzt werden können, da bei diesem Verfahren sehr gute Leitfähigkeitseigenschaften des Metalls Voraussetzung sind, um die Änderungen im Brechungsindex nachzuweisen. Andere Metalle als die hier beschriebenen Metalle Gold, Silber, Aluminium, Kupfer haben eine niedrigere Leitfähigkeit und sind deshalb zu schlecht für das SPR- Verfahren. Auch bei diesem Verfahren ist es nicht möglich, eine größere Anzahl gleichzeitiger Nachweise mit einer einzigen Vorrichtung oder Anordnung zu fuhren. Auf Grund der oben beschriebenen Nachteile der bisher bekannten Verfahren, besteht deshalb ein Bedarf an Nachweissystemen, die ohne radioakive Markierungen auskommen, mit denen die Hybridisierung von Oligo- und/oder Polynukleotiden nachgewiesen werden kann, die universell und die darüber hinaus auch als Multisensorarry einsetzbar sind.With SPR, the changes in the refractive index in a layer that is applied to a thin metal layer are detected by consequently changing the intensity of a reflecting light beam. Sensitive surfaces used in the SPR are described in EP 0 589 687. A disadvantage of these sensitive surfaces, however, is that they can only be used for this SPR method, since very good conductivity properties of the metal are a prerequisite for detecting the changes in the refractive index. Metals other than the metals gold, silver, aluminum, copper described here have a lower conductivity and are therefore too bad for the SPR process. With this method, too, it is not possible to carry out a large number of simultaneous verifications with a single device or arrangement. Because of the above-described disadvantages of the previously known methods, there is therefore a need for detection systems which do not need radioactive markings, with which the hybridization of oligo- and / or polynucleotides can be detected, which can be used universally and which can also be used as a multisensor array .
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der in einfacher Weise die Hybridisierungen von Oligo- und/oder Polynukleotiden nachgewiesen werden können und mit denen die oben genannten Nachteile vermieden werden können.It is therefore an object of the present invention to provide a device with which the hybridizations of oligo- and / or polynucleotides can be detected in a simple manner and with which the disadvantages mentioned above can be avoided.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Anordnung bereitzustellen, mit der es möglich ist, die Hybridisierung verschiedener Oligo- und/oder Polynukleotiden in einem und/oder mehreren Verfahrensschritten nachzuweisen.Another object is to provide an arrangement with which it is possible to detect the hybridization of different oligo- and / or polynucleotides in one and / or several method steps.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird dadurch gelöst, daß eine Vorrichtung bereitgestellt wird, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Elektrode aus einem Metall oder einer Metall(Legierung) mit einer sensitiven Oberfläche aufweist, die Monoschicht oder einen Monoschicht-Rezeptor umfaßt, die bzw. der auf dieser Elektrodenoberfläche immobilisiert ist. Die Metall(Legierung) wird zunächst mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HS-X, S=X, X-S-S-Y oder XSi(R3), wobei X und Y beliebige Molekülfragmente darstellen, insbesondere funktionalisierte oder unfunktionalisierte Alkylfragemente, quervernetzende Verbindungen, insbesondere solche, die konjugierte Doppel- und/oder Dreifachbindungen aufweisen und R für -OH und/oder ein und/oder mehrere identische und/oder verschiedene Halogene steht besonders bevorzugt sind 16- Mercaptohexadecansäure, 16-Mercaptohexadecanamin, aktiviert, um dann über eine Metall- Schwefel-Bindung eine Monoschicht auszubilden, an die dann komplementäre oder teilweise komplementäre Oligo- und/oder Polynukleotide, PNA oder Antikörper/ Antigene kovalent gebunden werden. Darüber hinaus hat sich der Einsatz von HS-(CH2)n-(SiR -O-SiR )m- (CH2)W-SH, wobei n=2 bis 25, m=l bis 10, w=2 bis 25 für dieses Verfahren als ebenso vorteilhaft erwiesen wie die Verwendung von Epoxy-terminierten Alkylthiolverbindungen. Das Nachweisverfahren zeichnet sich dadurch aus, daß Änderungen auf oder innerhalb der sensitiven Oberfläche der Elektrode, daß heißt die Hybridisierung von komplementären oder teilweise komplementären Oligo- und/oder Polynukleotidsequenzen, mittels elektrochemischer Meßmethoden, insbesondere kapazitiver Meßmethoden nachgewiesen werden.The object of the present invention is achieved in that a device is provided which is characterized in that it has an electrode made of a metal or a metal (alloy) with a sensitive surface which comprises a monolayer or a monolayer receptor which or which is immobilized on this electrode surface. The metal (alloy) is first selected with a compound selected from the group consisting of HS-X, S = X, XSSY or XSi (R 3 ), where X and Y are arbitrary molecular fragments, in particular functionalized or unfunctionalized alkyl fragments, cross-linking compounds , in particular those which have conjugated double and / or triple bonds and R represents -OH and / or one and / or more identical and / or different halogens, 16-mercaptohexadecanoic acid, 16-mercaptohexadecanamine, are particularly preferably activated and then activated via a Metal-sulfur bond form a monolayer to which complementary or partially complementary oligo- and / or polynucleotides, PNA or antibodies / antigens are then covalently bound. In addition, the use of HS- (CH 2 ) n - (SiR -O-SiR) m - (CH 2 ) W -SH has been used, where n = 2 to 25, m = 1 to 10, w = 2 to 25 proven to be as advantageous for this process as the use of epoxy-terminated alkylthiol compounds. The detection method is characterized in that changes on or within the sensitive surface of the electrode, that is to say the hybridization of complementary or partially complementary oligo and / or polynucleotide sequences, are detected by means of electrochemical measurement methods, in particular capacitive measurement methods.
Die erfindungsgemäße Elektrode und/oder Elektrodenanordnung kann deshalb je nach Verwendung als Biosensor, Chemosensor, DNA-Sonde oder als Array mit beliebiger Anzahl gleicher oder verschiedenen Elektroden eingesetzt werden. Diese Verwendung hat den Vorteil, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung direkt in einem Probenmedium eingesetzt werden kann, ohne daß langwierige Reinigungsschritte der nachzuweisenden Substanzen notwendig werden. Außerdem ist es möglich Metallschichten von beliebiger Dicke oder Geometrie einzusetzen.The electrode and / or electrode arrangement according to the invention can therefore be used, depending on the use, as a biosensor, chemosensor, DNA probe or as an array with any number of identical or different electrodes. This use has the advantage that the device according to the invention can be used directly in a sample medium without the need for lengthy cleaning steps for the substances to be detected. It is also possible to use metal layers of any thickness or geometry.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Verfahren ist es nun möglich, Oligo- und/oder Polynukleotide, insbesondere Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA), synthetische Polyamid- oder Peptidnukleinsäuren (PNA), Nukleinsäuren, die ganz oder teilweise zueinander komplementär sind nachzuweisen, sowie die Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und Antigenen zu detektieren. Darüber hinaus können je nach Art des Rezeptors, der an der sensitiven Oberfläche der Elektrode gebunden ist, Viren, Phagen, Prionen, Mikroorganismen und dergleichen nachgewiesen werden.With the device and the method according to the invention it is now possible to detect oligonucleotides and / or polynucleotides, in particular deoxyribonucleic acids (DNA), ribonucleic acids (RNA), synthetic polyamide or peptide nucleic acids (PNA), nucleic acids that are completely or partially complementary to one another, as well as to detect the interactions between antibodies and antigens. In addition, depending on the type of receptor that is bound to the sensitive surface of the electrode, viruses, phages, prions, microorganisms and the like can be detected.
Bei Verwendung der erfϊndungsgemäßen Elektrode in einem Sensorenarray, der sich aus vielen einzelnen Elektroden zusammensetzt, ist es nun möglich, in einem und/oder mehreren Verfahrensschritten eine Vielzahl der unterschiedlichsten Fragmente nachzuweisen.When using the electrode according to the invention in a sensor array, which is composed of many individual electrodes, it is now possible to detect a large number of the most varied fragments in one and / or several method steps.
Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird nun im folgenden beschrieben. Als Material für die Elektrode eignet sich jede feste leitende oder halbleitende Substanz, vorzugsweise ein Metall, wie Ag, Au, Pt, Pd, eine Legierung, insbesondere Au/Pd, Ag/Pd, Au/Cr, ein Halbleiter, z.B. GaAs, Si, Ge. Besonders bevorzugt ist eine Elektrode, die aus einem Silizium-Wafer-Stückchen, daß zunächst mit einer Titan-Palladium- oder Chromschicht als Haftvermittler versehen wird und anschließend mit einer Legierung aus Palladium und Gold im Verhältnis von mindestens 65 % Au und bis zu 35 % Pd, beschichtet wird, besteht. Die so beschichtete Elektrode wird dann mit 16-Mercaptohexadecansäure behandelt. Auf diese alkylthiolbeschichteten Elektrodenoberfläche werden dann die komplementären oder teilweise komplementären Oligo- und/oder Polynukleotidsequenzen der nachzuweisenden Sequenzen immoblilisiert. Diese Immobilisierung kann durch unterschiedliche Verfahren erfolgen. (1) Wenn eine aminoterminale Sequenz verwendet wird, wird zuerst die endständige COOH- Gruppe der 16-Mercaptohexadecansäure durch beispielsweise N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Die Elektrode besitzt dann nach der chemischen Kopplung folgende Struktur:The structure of the device according to the invention will now be described in the following. Any solid conductive or semiconductive substance, preferably a metal such as Ag, Au, Pt, Pd, an alloy, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr, a semiconductor, for example GaAs, Si, is suitable as the material for the electrode , Ge. Particularly preferred is an electrode made of a piece of silicon wafer that is first provided with a titanium-palladium or chrome layer as an adhesion promoter and then with an alloy of palladium and gold in a ratio of at least 65% Au and up to 35% Pd, is coated. The electrode coated in this way is then treated with 16-mercaptohexadecanoic acid. The complementary or partially complementary oligo- and / or polynucleotide sequences of the sequences to be detected are then immobilized on this alkylthiol-coated electrode surface. This immobilization can be done by different methods. (1) When an amino terminal sequence is used, the terminal COOH group of 16-mercaptohexadecanoic acid is first activated by, for example, N-hydroxysuccinimide. The electrode then has the following structure after chemical coupling:
Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH-Polynukleotid.Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH polynucleotide.
(2) Wenn biotinylierte Polynukleotidsequenzen muß die Immobilisierung von Avidin an den aktivierten endständigen COOH-Gruppen der 16-Mercaptohexadecansäure erfolgen und die Polynukleotidsequenz wird durch die Avidin-Biotin-Bindung mit der sensitiven Oberfläche verknüpft. Die Elektrode besitzt dann nach der chemischen Kopplung folgende Struktur:(2) If biotinylated polynucleotide sequences, the immobilization of avidin must take place on the activated terminal COOH groups of 16-mercaptohexadecanoic acid and the polynucleotide sequence is linked to the sensitive surface by the avidin-biotin binding. The electrode then has the following structure after chemical coupling:
Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH-Avidin-Biotin-Polynukleotid.Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide.
Anschließend wird das Verfahren derart durchgeführt, daß die Hybridisierung der nachzuweisenden Sequenzen mittels elektrochemischer Messungen, insbesondere der Kapazitätsänderung auf und innerhalb der sensitiven Oberfläche der Elektrode nachgewiesen werden kann.The method is then carried out in such a way that the hybridization of the sequences to be detected can be detected by means of electrochemical measurements, in particular the change in capacitance on and within the sensitive surface of the electrode.
Darüber hinaus kann die Hybridisierung mit weiteren elektrochemischen Methoden, z.B. Impedanzmessungen, Voltammetrie, Messung nicht-linearer Impedanzeigenschaften, Chronoamperometrie und Chronopotentiometrie detektiert werden. Alle diese Verfahren können sowohl mit als auch ohne Marker durchgeführt werden. Unter der Messung der nichtlinearen Impedanzeigenschaften versteht man vorzugsweise die Messung der zweiten und dritten Oberschwingung, sowie die des kapazitiven Stromes, die sehr empfindlich auf elektrische oder mechanische Änderungen an der Rezeptorschicht reagieren. Diese Verfahren sind sowohl für die Einzelektrode als auch für einen Elektrodenarray anwendbar.In addition, the hybridization can be detected using other electrochemical methods, for example impedance measurements, voltammetry, measurement of non-linear impedance properties, chronoamperometry and chronopotentiometry. All of these methods can be carried out both with and without a marker. The measurement of the nonlinear impedance properties is preferably understood to mean the measurement of the second and third harmonic, as well as that of the capacitive current, which are very sensitive to electrical or mechanical changes to the receptor layer react. These methods can be used both for the single electrode and for an electrode array.
Die Detektion der Hybridisierung von Oligo und/oder Polynukleotiden ist auch mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern und Interkalationsfarbstoffen möglich. Um das Problem des Quenchings auf der Metalloberfläche der Elektrode zu vermeiden, ist es notwendig, zwischen dem Marker und der Metalloberfläche der Elektrode eine gewisse Distanz zu schaffen. Es wurde gefunden, daß ein an die Metalloberfläche der Elektrode gebundener Rezeptor, beispielsweise ein DNA- Doppelstrang mit interkaliertem Marker/Fluoreszenzfarbstoff durch die elektrisch gesteuerte Desorption, die die Thiol-Metall-Bindung der darunterliegenden dielektrischen Basisschicht löst, von der Elektrodenoberfläche entfernt wird. Die Detektion der daraus resultierenden Fluoreszenz/Markerfärbung kann mit einem Fluorimeter oder Fluoreszenzmikroskop erfolgen. Dieses Verfahren wird ebenfalls bei Oligo- oder Polynukleotideinzelsträngen oder anderen Rezeptoren angewendet, wobei der Marker kovalent oder adsorbtiv an die Moleküle bindet.The detection of the hybridization of oligo and / or polynucleotides is also possible with the help of fluorescent markers and intercalation dyes. In order to avoid the problem of quenching on the metal surface of the electrode, it is necessary to create a certain distance between the marker and the metal surface of the electrode. It has been found that a receptor bound to the metal surface of the electrode, for example a DNA double strand with an intercalated marker / fluorescent dye, is removed from the electrode surface by the electrically controlled desorption which releases the thiol-metal bond of the underlying dielectric base layer. The resulting fluorescence / marker staining can be detected with a fluorimeter or fluorescence microscope. This method is also used for oligo- or polynucleotide single strands or other receptors, the marker binding covalently or adsorbently to the molecules.
Um unspezifische Adsorptionen auf der Elektrodenoberfläche zu vermeiden, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Elektrodenoberfläche mit fluorierten Verbindung wie HS-(CH3)n- (CF3)m-CF3 zu behandeln, wobei n=0 bis 15 und m=0 bis 25 und m+n größer gleich 2 sind.In order to avoid unspecific adsorption on the electrode surface, it has proven to be advantageous to treat the electrode surface with fluorinated compound such as HS- (CH 3 ) n - (CF 3 ) m -CF 3 , where n = 0 to 15 and m = 0 to 25 and m + n greater than or equal to 2.
Außerdem wurde gefunden, daß sich für die Hybridisierungsreaktion ein Puffersystem aus 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM EDTA (TE-Puffer) ebenso gut eignet wie ein Puffersystem aus 5 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,1 (Imidazolpuffer). Je nach Verwendung können aber auch auf Phosphat oder Acetat basierende Puffer verwendet werden. Mit dem erfindungsgemäßen Sensor ist es möglich, 100 bis 200 nmol/1 Oligo- bzw. Polynukleotid in Abhängigkeit vom verwendeten Sensor und dem nachzuweisenden Oligo- bzw. Polynukleotid zu detektieren.It was also found that a buffer system consisting of 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM EDTA (TE buffer) is just as suitable for the hybridization reaction as a buffer system made of 5 mM imidazole, 100 mM NaCl, pH 7.1 ( Imidazole buffer). Depending on the use, buffers based on phosphate or acetate can also be used. With the sensor according to the invention it is possible to detect 100 to 200 nmol / 1 oligo- or polynucleotide depending on the sensor used and the oligo- or polynucleotide to be detected.
Darüber hinaus wurde festgestellt, daß ein Temperaturbereich von 5°C bis 50°C, insbesondere 22°C bis 37°C für die Hybridisierungsreaktion optimal ist.In addition, it was found that a temperature range of 5 ° C to 50 ° C, in particular 22 ° C to 37 ° C is optimal for the hybridization reaction.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindungen wird nun mit Hilfe der beigefugten Abbildungen näher erläutert. Es zeigen: Figur 1 die kovalente Immobilisierung einer biotinylierten Polynukleotidsequenz auf einer Elektrode, die mit 16-Mercaptohexadecansäure und Avidin beschichtet wurde, die Beschichtung wurde mittels Kapazitätsänderungen verfolgt,The method of the present invention will now be explained in more detail with the aid of the attached figures. Show it: 1 shows the covalent immobilization of a biotinylated polynucleotide sequence on an electrode which was coated with 16-mercaptohexadecanoic acid and avidin, the coating was monitored by means of changes in capacity,
Figur 2 die kapazitive Detektion der Hybridisierung unterschiedlicher komplementärer Polynukleotidfragmente, wobei der komplementäre Strang kovalent an eine ω- funktionalisierte Alkylthiolschicht auf einer Goldlegierung gebunden ist,FIG. 2 the capacitive detection of the hybridization of different complementary polynucleotide fragments, the complementary strand being covalently bound to an ω-functionalized alkylthiol layer on a gold alloy,
Figur 3 die Kinetik der DNA-Hybridisierung bei Zugabe einer bestimmten DNA- Konzentration,FIG. 3 shows the kinetics of DNA hybridization when a certain DNA concentration is added,
Figur 4 die Gesamtänderung der Kapazität, aufgeteilt auf die Einzelschritte der Sensorvorbereitung und der Anwendung,FIG. 4 shows the total change in capacitance, divided into the individual steps of sensor preparation and application,
Figur 5 die Kapazitätsänderung bei der Hybridisierung bei Verwendung der oben beschriebenen unterschiedlichen Immobilisierungstechniken,FIG. 5 shows the change in capacity during hybridization when using the different immobilization techniques described above,
Figur 6 den Vergleich der Kapazitätsänderung einer DNA-Sonde bei Zugabe von komplementären und nicht-komplementären Oligonukleotidsequenzen, und6 shows the comparison of the change in capacity of a DNA probe when complementary and non-complementary oligonucleotide sequences are added, and
Figur 7 den Nachweis von Bakteriophagen bei Zugabe verschiedener Bakteriophagenkonzentrationen.Figure 7 shows the detection of bacteriophages when adding different bacteriophage concentrations.
Die Abbildungen werden nun im einzelnen erläutert.The illustrations are now explained in detail.
Figur 1 zeigt die Kapazitätsänderung in Abhängigkeit von der Zeit bei der Immobilisierung von biotinylierte Polynukleotidsequenzen, wobei zunächst Avidin an den aktivierten endständigen COOH-Gruppen der 16-Mercaptohexadecansäure immobilisiert wurde, um so die Polynukleotidsequenz durch die Avidin-Biotin-Bindung mit der sensitiven Oberfläche der Elektrode zu verknüpfen. In Figur 2 wird die Detektion von DNA-Fragmenten auf der sensitiven Oberfläche gezeigt. Dazu wird ein Biosensor mit der Struktur Au(Legierung)-S-(CH )ι5-CO-NH-DNA verwendet und der Grad der DNA-Hybridisierung wird bei unterschiedlichen Konzentrationen komplementärer DNA durch die Kapazitätsänderung verfolgt. Diese Kapzitätsänderung zeigt den Grad der DNA-Hybridisierung an. Die vollständige Hybridisieung eines 22mer auf einem 24mer-Fragment wird innerhalb kurzer Zeit erreicht.FIG. 1 shows the change in capacity as a function of the time during the immobilization of biotinylated polynucleotide sequences, avidin initially being immobilized on the activated terminal COOH groups of 16-mercaptohexadecanoic acid, so that the polynucleotide sequence through the avidin-biotin binding with the sensitive surface of the Link electrode. FIG. 2 shows the detection of DNA fragments on the sensitive surface. For this purpose, a biosensor with the structure Au (alloy) -S- (CH) ι 5 -CO-NH-DNA is used and the degree of DNA hybridization is monitored at different concentrations of complementary DNA by the change in capacity. This change in capacity indicates the level of DNA hybridization. The complete hybridization of a 22mer on a 24mer fragment is achieved within a short time.
Die graphische Darstellung der Kapazitätsänderung in Figur 3 zeigt den Verlauf der Hybridisierung von Polynukleotiden an die aktivierte sensitive Oberfläche des Biosensors mit der Struktur Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)ι5-CO-NH-Avidin-Biotin-Polynukleotid, wobei die Kinetik der Hybridisierung als Kapazitätsänderung dargestellt wird, wenn konstante Mengen komplementärer oder teilweise komplementärer Polynukleotidsequenzen zu dem Biosensor mit der Struktur Pd/Au(Legierung)-S-(CH )|5-CO-NH-Avidin-Biotin-Polynukleotid gegeben werden.The graphic representation of the change in capacity in FIG. 3 shows the course of the hybridization of polynucleotides to the activated sensitive surface of the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide , wherein the kinetics of the hybridization is represented as a change in capacity if constant amounts of complementary or partially complementary polynucleotide sequences to the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH) | 5 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide are given.
Figur 4 zeigt schematisch den Verlauf der Kapazitätsänderungen, wenn schrittweise der Biosensor mit der Struktur Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH-Avidin-Biotin-Polynukleotid hergestellt wird.FIG. 4 schematically shows the course of the changes in capacitance when the biosensor with the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH-avidin-biotin polynucleotide is produced step by step.
Der Aufbau des Biosensors und das Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren sind weiter unten beschrieben.The structure of the biosensor and the method for detecting the hybridization of nucleic acids are described below.
Für den Nachweis der Kapazitätsänderung der Hybridisierung, die in Figur 5 dargestellt ist, wurden zwei verschiedene Sensortypen verwendet: Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH- Oligonukleotidmonostrang (24mer) (Quadrate) und Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-NH- Avidin-Biotin-Oligonukleotidmonostang (24mer) (Kreise). Die Messungen wurden bei Raumtemperatur von 22°C durchgeführt. Bei beiden Systemen konnte gezeigt werden, daß nach Zugabe der komplementären Stränge eine Kapazitätsänderung auftritt, mit deren Hilfe die Hybridisierung nachgewiesen werden konnte.For the detection of the change in capacitance of the hybridization, which is shown in FIG. 5, two different sensor types were used: Au (alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH-oligonucleotide monostrand (24mer) (squares) and Pd / Au ( Alloy) -S- (CH 2 ) 15 -CO-NH- avidin-biotin oligonucleotide monostang (24mer) (circles). The measurements were carried out at room temperature of 22 ° C. In both systems it could be shown that after the addition of the complementary strands a change in capacity occurs, with the help of which the hybridization could be detected.
Im Vergleich dazu zeigen die Ergebnisse, die in Figur 6 dargestellt sind, daß bei Zugabe von komplementärer (24mer) und nicht komplementärer Oligonukleotidsequenz (21mer) eine starke Hybridisierung der komplementären Sequenz erhalten wird, wohingegen die nicht komplementäre Sequenz nur eine unspezifische Adsorption zeigt, die etwa halb so groß ist, wie die, die durch die Hybridisierung hervorgerufen wird.In comparison, the results, which are shown in FIG. 6, show that when complementary (24mer) and non-complementary oligonucleotide sequence (21mer) are added, a strong hybridization of the complementary sequence is obtained, whereas the non-complementary sequence only shows an unspecific adsorption which is about half as large as that caused by the hybridization.
In Figur 7 wird die Kapazitätsänderung beim Nachweis von Bakteriophagen mit einem Sensor der Struktur Au-S-(CH2)ι5-CO-NH-Antikörper bei Zugabe verschiedener Bakteriophagenkonzentrationen. Jedes dargestellte Symbol steht für eine Meßreihe.FIG. 7 shows the change in capacitance when detecting bacteriophages with a sensor of the structure Au-S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH-Antibodies when various bacteriophage concentrations are added. Each symbol shown represents a series of measurements.
Neben der Kopplung von Oligonukleotidmonosträngen mit ω-fünktionalisierten Alkylthiolen auf Gold oder anderen Metallen oder Legierungen über Avidin/Biotin und/oder NH -Gruppen können auch thiolmodifizierte Oligonukleotide zuerst auf Gold adsorbiert werden und die Lücken in der selbstorganisierenden Monoschicht mit stabilen Alkylthiolen aufgefüllt werden. Auch eine gleichzeitige Beschichtung mit HS-Spacer-Oligonukleotid und Alkylthiolen in einem bestimmten Verhältnis erzeugt die Monoschicht, die für das Nachweisverfahren mittels Kapazitätsänderung erforderlich ist. In diesem Fall wird die Immobilisierung vereinfacht und es kann sofort die Hybridisierung, die weiter oben beschrieben ist, durchgeführt werden.In addition to coupling oligonucleotide monostrands with ω-functionalized alkylthiols on gold or other metals or alloys via avidin / biotin and / or NH groups, thiol-modified oligonucleotides can also be adsorbed onto gold first and the gaps in the self-assembling monolayer can be filled with stable alkylthiols. Simultaneous coating with HS spacer oligonucleotide and alkylthiols in a certain ratio also produces the monolayer, which is required for the detection method by means of a change in capacity. In this case, the immobilization is simplified and the hybridization described above can be carried out immediately.
Darüber hinaus kann die Hybridisierung und Immobilisierung durch Potentialänderungen gesteuert werden. Es wurde gefunden, daß das angelegte Potential sowohl einen Einfluß auf die Immobilisierung von Oligonukleotidsträngen und Bakteriophagen als auch auf die Hybridisierung von Oligonukleotiden hat. Bereits von Kelley, S.O. et al. wurde in Langmuir 14 (1998), 6781-6784 beschrieben, daß sich doppelsträngige DNA-Helices in Abhängigkeit vom angelegten Potential aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphorsäurebausteine je nach Elektrodenpotential unterschiedlich auf der Elektrodenoberfläche orientieren. Darum kann die Orientierung der DNA gesteuert werden, um so eine optimale Konfiguration für die Hybridisierung der Nukleinsäure-Moleküle auf der Elektrodenoberfläche zu erreichen.In addition, the hybridization and immobilization can be controlled by changes in potential. It was found that the potential applied has an influence both on the immobilization of oligonucleotide strands and bacteriophages and on the hybridization of oligonucleotides. Already by Kelley, S.O. et al. It was described in Langmuir 14 (1998), 6781-6784 that double-stranded DNA helices, depending on the applied potential, orient themselves differently on the electrode surface due to their negatively charged phosphoric acid building blocks, depending on the electrode potential. The orientation of the DNA can therefore be controlled in order to achieve an optimal configuration for the hybridization of the nucleic acid molecules on the electrode surface.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen klar, daß mit der erfindungsgemäßen Elektrode einThe results described above clearly show that with the electrode according to the invention
Biosensor oder eine DNA- Sonde bereitgestellt wird, mit der es mittels Messung der Kapazitätsänderung möglich ist, die Sequenzen von DNA, RNA, PNA, Genabschnitten, genetische Defekte, Veränderungen der Sequenzen in bestimmten Genbereichen, Wirkungen von Antikörpern/ Antigenen nachzuweisen. Ebenfalls konnte gezeigt werden, daß mit einem Elektrodenarray der Nachweis von vielen verschiedenen Fragmenten möglich ist.Biosensor or a DNA probe is provided with which it is possible by means of measuring the change in capacity, the sequences of DNA, RNA, PNA, gene segments, genetic defects, changes in the sequences in certain gene areas, effects of antibodies / antigens. It could also be shown that the detection of many different fragments is possible with an electrode array.
Die erfindungsgemäße Elektrode mit der sensitiven Oberfläche eignet sich je nach Affinität ihrer Oberfläche zum Einsatz in der chemischen, medizinischen oder biologischen Analytik.Depending on the affinity of its surface, the electrode according to the invention with the sensitive surface is suitable for use in chemical, medical or biological analysis.
Die Geräteeinstellungen (20 Hz, +300 mV) wurden für eine Zwei-Elektrodenkonfiguration für sensitive Elektroden mit einer Oberfläche von ca. 1 bis 2 mm2 optimiert. Bei sensitiven Elektroden mit einer größeren Oberfläche werden niedrigere Frequenzen für eine optimierte Messung benötigt, wohingegen sich kleinere Elektroden umgekehrt verhalten.The device settings (20 Hz, +300 mV) were optimized for a two-electrode configuration for sensitive electrodes with a surface area of approx. 1 to 2 mm 2 . For sensitive electrodes with a larger surface, lower frequencies are required for an optimized measurement, whereas smaller electrodes behave in reverse.
Im folgenden Beispiel wird die Herstellung eines Sensors für die Detektion der Hybridisierung von Polynukleotidsequenzen beschrieben.The following example describes the production of a sensor for the detection of hybridization of polynucleotide sequences.
Zunächst werden die sensitiven Elektroden wie folgt vorbereitet:First, the sensitive electrodes are prepared as follows:
Silizium- Wafer- Stückchen mit einer Größe von 3,20 mm x 10,02 mm und einer Stärke von 450 μm wurden in einem allgemein üblichen Sputterprozeß oder Bedampfungsprozeß mit einer Elektrode der Größe 1,56 mm x 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 μm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus Titan- und Palladiumschichten (Haftvermittler, jeweils 50 nm dick) und einer deckenden Schicht aus Goldlegierung (200 nm) aufgebaut. Als Kontaktstelle für das Meßsystem wurde am oberen Ende der Zuleitungen ein Silberdraht angelötet. Zuerst wurden die Wafer 30 Minuten vollständig in Chloroform p.a. getaucht. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wurde der Wafer in eine 1:1 (v/v) Mischung aus Chloroform und Methanol getaucht und 10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Analog zu dem verwendeten Chloroform kann bei diesem Reinigungsschritt auch Ethanol (99%) und eine 1 : 1 (v/v) Mischung aus Ethanol und Methanol verwendet werden. Der Wafer mit der Goldlegierung wurde für 5 Minuten in eine heiße 3 : 1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung getaucht. Die Elektroden wurden gründlich mit Reinstwasser (Millipore: Mili.QPlus-185; 18,2 MΩ cm"1) gespült und getrocknet. Alle Glas- und Teflongeräte wurden vor ihrer Verwendung in analoger Weise gereinigt. Anschließend werden die Elektroden wie nachfolgend beschrieben beschichtet:Silicon wafer pieces with a size of 3.20 mm × 10.02 mm and a thickness of 450 μm were produced in a generally customary sputtering process or vapor deposition process with an electrode measuring 1.56 mm × 1.56 mm (reactive surface) and a feed line 10 μm wide and 6.65 mm long. The electrode was made up of titanium and palladium layers (bonding agent, each 50 nm thick) and a covering layer of gold alloy (200 nm). A silver wire was soldered onto the upper end of the leads as a contact point for the measuring system. First, the wafers were completely immersed in chloroform pa for 30 minutes. After drying in a stream of nitrogen, the wafer was immersed in a 1: 1 (v / v) mixture of chloroform and methanol and treated in an ultrasound bath for 10 minutes. Analogous to the chloroform used, ethanol (99%) and a 1: 1 (v / v) mixture of ethanol and methanol can also be used in this cleaning step. The gold alloy wafer was immersed in a hot 3: 1 (v / v) mixture of concentrated sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide solution for 5 minutes. The electrodes were thoroughly rinsed with ultrapure water (Millipore: Mili.QPlus-185; 18.2 MΩ cm "1 ) and dried. All glass and Teflon devices were cleaned in an analogous manner before use. The electrodes are then coated as described below:
Zur Beschichtung wurde eine Chloroform-Lösung verwendet, die 5 mM 16- Mercaptohexadecansäure enthielt. Durch 15 -stündiges Eintauchen des Wafers bei Raumtemperatur in die ungerührte Beschichtungslösung wurde die Oberfläche der Elektrode mit Alkylthiol beschichtet. Zum Entfernen überschüssiger, auf der Oberfläche haftender Moleküle wurde die Elektrode 15 Sekunden mit Chloroform gespült. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom und mehrmaligem Waschen mit Reinstwasser wurde die Elektrode in die Meßzelle eingebaut.A chloroform solution containing 5 mM 16-mercaptohexadecanoic acid was used for the coating. The surface of the electrode was coated with alkylthiol by immersing the wafer in the unstirred coating solution at room temperature for 15 hours. The electrode was rinsed with chloroform for 15 seconds to remove excess molecules adhering to the surface. After drying in a stream of nitrogen and washing several times with ultrapure water, the electrode was installed in the measuring cell.
Die Messung wird folgendermaßen durchgeführt:The measurement is carried out as follows:
Die Waferplatte mit der alkylthiolbeschichteten Elektrode wurde gemeinsam mit einer AG/AgCl-Referenzelektrode (Oberfläche ca. 1 cm ) an einem Teflonhalter befestigt, der als Deckel für die Meßzelle (Eppendorfcup 1,5 ml) dient und eine Öffnung für die Zugabe und Entnahme von Flüssigkeiten besitzt. Die Zelle wurde mit Elektrolyt (100 mM KC1, pH 5,1, ca. 200 bis 300 μl) soweit gefüllt, daß die reaktive Oberfläche der Goldelektrode und die Referenzelektrode (Ag/AgCl) vollständig eingetaucht waren. Für eine gleichbleibende Durchmischung wurde ein Magnetrührer verwendet. Ein Lock-in- Verstärker mit integriertem Sinusgenerator erzeugte ein konstantes Sinussignal mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Amplitude von 10 mV. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Der Lock-in- Verstärker wird auch zur Registrierung des kapazitiven Stroms verwendet. zusätzlich zu der Wechselspannung wird eine Gleichspannung über einen Spannungsgeber angelegt. Die Adsorption von Molekülen auf der Elektrodenoberfläche wurde mittels Kapazitätsänderung gemessen. Dazu wurde das Meßsignal auf einem x-t Schreiber aufgezeichnet und über einen 16 bit A-D Umwandler auf den Rechner übertragen. Zu Beginn der Messung wurde die absolute Kapazität der beschichteten Elektroden bei einem elektrischen Potential von +300 mV bestimmt. Daran schließt sich die Immobilisierung der Oligo- und/oder Polynukleotidsequenzen an:The wafer plate with the alkylthiol-coated electrode was attached together with an AG / AgCl reference electrode (surface approx. 1 cm) to a Teflon holder, which serves as a cover for the measuring cell (Eppendorf cup 1.5 ml) and an opening for the addition and removal of Owns liquids. The cell was filled with electrolyte (100 mM KC1, pH 5.1, approx. 200 to 300 μl) until the reactive surface of the gold electrode and the reference electrode (Ag / AgCl) were completely immersed. A magnetic stirrer was used for constant mixing. A lock-in amplifier with an integrated sine generator generated a constant sine signal with a frequency of 20 Hz and an amplitude of 10 mV. All measurements were carried out at room temperature (22 ° C). The lock-in amplifier is also used to register the capacitive current. in addition to the AC voltage, a DC voltage is applied via a voltage generator. The adsorption of molecules on the electrode surface was measured by changing the capacitance. For this purpose, the measurement signal was recorded on an xt recorder and transferred to the computer via a 16 bit AD converter. At the beginning of the measurement, the absolute capacitance of the coated electrodes was determined at an electrical potential of +300 mV. This is followed by the immobilization of the oligo- and / or polynucleotide sequences:
Die Immobilisierung von Polynukleotidsequenzen erfolgte auf 2 unterschiedliche Arten. Bei der Verwendung von aminoterminalen Sequenzen wurde zuerst die endständige COOH- Gruppe der Mercaptohexadecansäure aktiviert. Die Aktivierung wurde beispielsweise mit N- Hydroxysuccinimid erreicht. Dazu wurden die beschichteten Elektroden in 5 ml Dioxan getaucht und die Lösung 10 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 25 mg N-Hydroxysuccinimid wurde die Lösung für 4 weitere Stunden gerührt. Nach der Reinigung der aktivierten Elektrode mit Dioxan und Methanol wurde sie in die Meßzelle gegeben. Die Kapazitätsänderung bei Zugabe einer aminofunktionalisierten DNA-Sequenz gibt die Immobilisierungsrate an. Wird wässerlösliches Carbodiimid EDC als Reagenz verwendet, so kann die Immobilisierung direkt in der Meßzelle ohne externe Aktivierung erfolgen. Bei Verwendung von biotinylierten Polynukleotidsequenzen wird die Immobilisierung von Avidin an die aktivierten endständigen COOH-Gruppen der Mercaptohexadecansäure notwendig, wobei die Polynukleotidsequenz nach Spülen und Pfufferwechsel durch die Avidin-Biotin-Bindung mit der Oberfläche verknüpft wurde.The immobilization of polynucleotide sequences was carried out in two different ways. When using amino terminal sequences, the terminal COOH group of mercaptohexadecanoic acid was activated first. The activation was achieved, for example, with N-hydroxysuccinimide. For this purpose, the coated electrodes were immersed in 5 ml of dioxane and the solution was stirred for 10 minutes. After adding 50 mg of dicyclohexylcarbodiimide and 25 mg of N-hydroxysuccinimide, the solution was stirred for a further 4 hours. After cleaning the activated electrode with dioxane and methanol, it was placed in the measuring cell. The change in capacity when adding an amino-functionalized DNA sequence indicates the immobilization rate. If water-soluble carbodiimide EDC is used as a reagent, immobilization can take place directly in the measuring cell without external activation. When using biotinylated polynucleotide sequences, the immobilization of avidin to the activated terminal COOH groups of mercaptohexadecanoic acid is necessary, the polynucleotide sequence being linked to the surface by rinsing and changing the buffer by the avidin-biotin binding.
Der Nachweis der Hybridisierung wird wie folgt durchgeführt:The detection of the hybridization is carried out as follows:
Alle Hybridisierungsmessungen wurden mit Elektroden aus Palladium-Gold-Legierungen, Goldelektroden und Palladiumelektroden durchgeführt.All hybridization measurements were carried out with electrodes made of palladium-gold alloys, gold electrodes and palladium electrodes.
Die Detektion von DNA erfordert den Aufbau einer sensitiven Oberfläche, wie sie weiter oben beschrieben ist. Die Messung erfolgt in einem Eppenorf-Cup, der 350 μl Puffer (pH 7,1; 100 mM NaCl; 5 mM Imidazol) enthält. Zu einem Biosensor mit der Struktur Au(Legierung)- S-(CH2)ι5-CO-NH-DNA oder Au(Legierung)-S-(CH2)ι5-CO-NH-Avidin-Biotin-DNA werden unterschiedliche Konzentrationen an komplementärer DNA gegeben und die Hybridisierung mittels Kapazitätsänderung gemessen (Figur 2). Bei Zugabe einer konstanten Menge des komplementären Stranges wurde die Kinetik der Hybridisierung kapazitiv gemessen. Die Zugabe nicht-komplementärer DNA und RNA zeigt hingegen keine oder geringe Kapazitätsänderungen. Zu einem Biosensor der Struktur Au(Legierung)-S-(CH )ι5-CO-NH-DNA werden unterschiedliche Mengen eines komplemetären 22mer-DNA-Fragementes gegeben und die Hybridisierung mittels Kapazitätsänderung verfolgt (Figur 3).The detection of DNA requires the construction of a sensitive surface as described above. The measurement is carried out in an Eppenorf Cup containing 350 μl buffer (pH 7.1; 100 mM NaCl; 5 mM imidazole). A biosensor with the structure Au (alloy) - S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH-DNA or Au (alloy) -S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH-avidin-biotin-DNA given different concentrations of complementary DNA and the hybridization measured by means of capacity change (Figure 2). When a constant amount of the complementary strand was added, the kinetics of the hybridization were measured capacitively. The addition of non-complementary DNA and RNA shows little or no change in capacity. Different amounts of a complementary 22-mer DNA fragment are added to a biosensor of the structure Au (alloy) -S- (CH) ι 5 -CO-NH-DNA and the hybridization is followed by changing the capacity (FIG. 3).
Ebenfalls konnte ein System mit einem HS-Spacer-Oligonukleotid (poly A) und Oktanthiol gezeigt werden, daß eine Immobilisierungsschritt nicht erforderlich ist, bei Zugabe des komplementären Stranges poly T wurde eine Kapazitätsänderung von mehreren Prozenten erreicht.It was also possible to show a system with an HS spacer oligonucleotide (poly A) and octanethiol that an immobilization step is not necessary; when the complementary strand poly T was added, a change in capacity of several percent was achieved.
Eine weitere Möglichkeit die Hybridisierung von Oligo- oder Polynukleotiden mittels elektrochemischer Methoden nachzuweisen, besteht darin, daß zuerst ein Nukleotiddoppelstrang auf der Elektrode immobilisiert wird. Einer der beiden Stränge verfugt über mindestens eine funktioneile Gruppe, die über eine chemische Kopplung an die endständigen Gruppen der Monoschicht bindet. Besitzt der Nukleotidstrang z.B. eine Thiolgruppe, kann er direkt auf die Metalloberfläche der Elektrode aufgebracht werden. Erfolgt nun die Denaturierung des gebundenen Doppelstranges durch Temperaturerhöhung oder andere Methoden, bleibt nur der gekoppelte Einzelstrang auf der Elektrodenoberfläche in orientierter Form zurück. Nach dem Wechsel der Elektrolytlösung, wobei die freie Nukletidsegmenten entfernt werden, kann der zugehörige komplementäre Strang nun detektiert werden.Another possibility of detecting the hybridization of oligo- or polynucleotides by means of electrochemical methods consists in immobilizing a nucleotide double strand on the electrode first. One of the two strands has at least one functional group that binds to the terminal groups of the monolayer via chemical coupling. If the nucleotide strand has e.g. a thiol group, it can be applied directly to the metal surface of the electrode. If the bound double strand is denatured by increasing the temperature or other methods, only the coupled single strand remains in an oriented form on the electrode surface. After changing the electrolyte solution and removing the free nucletide segments, the associated complementary strand can now be detected.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen klar, daß mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, ein Nachweissystem geschaffen werden konnte, mit dem alle Nachteile, die aus dem Stand der Technik bekarmt sind, überwunden wurden und die durch eine hohe Selektivität und Spezifität ausgezeichnet ist. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß die Hybridisierung von Oligo- und Polynukleotide mittels elektrochemischer Messungen nachgewiesen werden kann, ohne daß strenge Einschränkungen in der Größe und Geometrie der sensitiven Oberfläche oder die Nachteile, die bei Verwendung von radioaktiv markierten Verbindungen hingenommen werden müssen, auftreten. The results described above clearly show that with the device according to the invention it was possible to create a detection system with which all the disadvantages which are overcome in the prior art were overcome and which is distinguished by a high selectivity and specificity. In particular, it could be shown that the hybridization of oligo- and polynucleotides can be detected by means of electrochemical measurements, without stringent restrictions in the size and geometry of the sensitive surface or the disadvantages that have to be accepted when using radioactively labeled compounds.

Claims

Vorrichtung zur Detektion von Oligo- und/oder Polynukleotid-HybridisierungenAnsprüche Device for the detection of oligonucleotide and / or polynucleotide hybridizations
1. Vorrichtung zum Nachweis von Oligo- und/oder Polynukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Elektrode mit einer sensitiven Oberfläche aufweist.1. Device for the detection of oligo- and / or polynucleotides, characterized in that it has an electrode with a sensitive surface.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sensitive Oberfläche der Elektrode aus einem Metall oder einer Metall(Legierung) besteht, auf der eine organische Monoschicht oder eine organische Monoschicht mit einem Rezeptor aufgebracht ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the sensitive surface of the electrode consists of a metal or a metal (alloy) on which an organic monolayer or an organic monolayer is applied with a receptor.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Monoschicht oder die organische Monoschicht mit Rezeptor über eine Schwefel-Metall-Bindung an die Elektrode gebunden ist.3. Device according to one of claims 1 or 2, characterized in that the organic monolayer or the organic monolayer with receptor is bound to the electrode via a sulfur-metal bond.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall(Legierung) mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HS- X, S=X, X-S-S-Y oder XSi(R3), wobei X und Y beliebige Molekülfragmente darstellen, insbesondere funktionalisierte oder unfunktionalisierte Alkylfragemente, quervernetzende Verbindungen, insbesondere solche, die konjugierte Doppel- und/oder Dreifachbindungen aufweisen oder Epoxyde und R für -OH und/oder ein und/oder mehrere identische und/oder verschiedene Halogene steht, beschichtet ist.4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the metal (alloy) with a compound selected from the group consisting of HS-X, S = X, XSSY or XSi (R 3 ), wherein X and Y represent any molecular fragments, in particular functionalized or unfunctionalized alkyl fragments, crosslinking compounds, in particular those which have conjugated double and / or triple bonds or epoxides and R is -OH and / or one and / or more identical and / or different halogens, is coated .
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß organische5. Device according to one of claims 1 to 4, characterized in that organic
Moleküle, insbesondere Alkylthiolverbindungen auf der Metall(Legierung) eine Monoschicht ausbilden, an die dann komplementäre oder teilweise komplementäreMolecules, especially alkyl thiol compounds form a monolayer on the metal (alloy), to which complementary or partially complementary ones
Oligo- und/oder Polynukleotide, wie DNA, RNA, PNA, sowie Antikörper/ Antigene der nachzuweisenden Verbindungen, wie DNA, RNA, PNA, Viren, Phagen, Prionen, Antikörper/ Antigene kovalent gebunden sind.Oligonucleotides and / or polynucleotides, such as DNA, RNA, PNA, and antibodies / antigens Compounds to be detected, such as DNA, RNA, PNA, viruses, phages, prions, antibodies / antigens, are covalently bound.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall(Legierung) mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 16-6. Device according to one of claims 1 to 5, characterized in that the metal (alloy) with a compound selected from the group consisting of 16-
Mercaptohexadecansäure, 16-Mercaptohexadecanamin, HS-(CH2)n-(SiR2-O-SiR2)m-Mercaptohexadecanoic acid, 16-mercaptohexadecanamine, HS- (CH2) n - (SiR 2 -O-SiR2) m -
(CH2)W-SH, wobei n=2 bis 25, m=l bis 10, w=2 bis 25 darstellen, die Monoschicht ausbildet.(CH 2 ) W -SH, where n = 2 to 25, m = 1 to 10, w = 2 to 25, the monolayer forms.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Material für die Elektrode, ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem Metall, insbesondere Ag, Au, Pt, Pd, einer Legierung, insbesondere Au/Pd, Ag/Pd, Au/Cr, einem Halbleiter, insbesondere GaAs, Si, Ge.7. Device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the material for the electrode is selected from the group consisting of a metal, in particular Ag, Au, Pt, Pd, an alloy, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr, a semiconductor, in particular GaAs, Si, Ge.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode die Struktur Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)ι5-CO-NH-Polynukleotid, wobei n=2 bis 30 ist, aufweist.8. Device according to one of claims 1 to 7, characterized in that the electrode has the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH polynucleotide, where n = 2 to 30, has .
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode die Struktur Pd/Au(Legierung)-S-(CH2)ι5-CO-NH-Avidin-Biotin-9. Device according to one of claims 1 to 8, characterized in that the electrode has the structure Pd / Au (alloy) -S- (CH 2 ) ι 5 -CO-NH-avidin-biotin
Polynukleotid, wobei n= 2 bis 30 ist. aufweist.Polynucleotide, where n = 2 to 30. having.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung von komplementären oder teilweise komplementären Oligo- und/oder Polynukleotidsequenzen, wie DNA, RNA, PNA, sowie Antikörper/Antigene, Viren,10. The device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the hybridization of complementary or partially complementary oligo- and / or polynucleotide sequences, such as DNA, RNA, PNA, and antibodies / antigens, viruses,
Phagen, Prionen der nachzuweisenden Verbindungen mittels elektrochemischer Meßmethoden detektiert werden.Phages, prions of the compounds to be detected can be detected by means of electrochemical measurement methods.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung von komplementären oder teilweise komplementären Oligo- und/oder11. The device according to one of claims 1 to 10, characterized in that the hybridization of complementary or partially complementary oligo- and / or
Polynukleotidsequenzen mittels kapazitiver Meßmethoden, Impedanzmessungen, Voltammetrie, Messung nicht-linearer Impedanzeigenschaften, Chronoamperometrie, Chronopotentiometrie detektiert wird.Polynucleotide sequences using capacitive measurement methods, impedance measurements, Voltammetry, measurement of non-linear impedance properties, chronoamperometry, chronopotentiometry is detected.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mehreren Elektroden mit sensitiven Oberflächen besteht.12. The device according to one of claims 1 to 11, characterized in that it consists of several electrodes with sensitive surfaces.
13. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Biosensor.13. Use of the device according to one of claims 1 to 12 as a biosensor.
14. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Chemosensor.14. Use of the device according to one of claims 1 to 12 as a chemical sensor.
15. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als DNA-Sonde.15. Use of the device according to one of claims 1 to 12 as a DNA probe.
16. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Multisensorarray mit mehreren sensitiven Elektroden zum Nachweis gleicher und/oder verschiedener Oligo- und/oder Polynukleotidsequenzen, wie DNA, RNA, PNA, sowie16. Use of the device according to one of claims 1 to 12 as a multi-sensor array with a plurality of sensitive electrodes for detecting the same and / or different oligo- and / or polynucleotide sequences, such as DNA, RNA, PNA, and
Antikörper/Antigene, Viren, Phagen, Prionen in einem oder mehreren Verfahrensschritten. Antibodies / antigens, viruses, phages, prions in one or more process steps.
PCT/DE1999/000460 1998-02-20 1999-02-19 Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization WO1999042827A2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99915484A EP1055004A2 (en) 1998-02-20 1999-02-19 Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19807338A DE19807338A1 (en) 1998-02-20 1998-02-20 Device for detecting nucleic acid hybridization
DE19807338.0 1998-02-20
DE1998107339 DE19807339A1 (en) 1998-02-20 1998-02-20 Sensitive surface for sensor
DE19807339.9 1998-02-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1999042827A2 true WO1999042827A2 (en) 1999-08-26
WO1999042827A3 WO1999042827A3 (en) 1999-10-28

Family

ID=26044047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE1999/000460 WO1999042827A2 (en) 1998-02-20 1999-02-19 Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP1055004A2 (en)
WO (1) WO1999042827A2 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001001144A2 (en) * 1999-06-30 2001-01-04 Iris Bio Technologies Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs
WO2001084132A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Vladimir Mirsky Chemosensor and method for calibrating chemosensors
WO2002027319A1 (en) * 2000-09-27 2002-04-04 Santron Ag Device for the detection of charged macromolecules
WO2004065624A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Sy-Lab Vgmbh Measuring device and method for the detection of dna sequence
US7108971B2 (en) 1999-05-14 2006-09-19 Iris Biotechnologies, Inc. Reversible binding of molecules to metal substrates through affinity interactions

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993020230A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 Environmental & Medical Products Ltd Electrochemical detection of dna hybridisation
US5653939A (en) * 1991-11-19 1997-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
WO1999014596A1 (en) * 1997-09-15 1999-03-25 Ab Sangtec Medical Capacity affinity sensor
WO1999027355A1 (en) * 1997-11-21 1999-06-03 Wolfbeis, Otto, Samuel Method for producing laterally organized structures on supporting surfaces
WO1999028047A2 (en) * 1997-11-29 1999-06-10 Wolfbeis, Otto, Samuel Artificial surface with predetermined affinity
DE19901761A1 (en) * 1999-01-18 1999-07-01 Gerhard Dr Hartwich Oligonucleotides tagged with photoinducible redox-active unit

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5653939A (en) * 1991-11-19 1997-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
WO1993020230A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 Environmental & Medical Products Ltd Electrochemical detection of dna hybridisation
WO1999014596A1 (en) * 1997-09-15 1999-03-25 Ab Sangtec Medical Capacity affinity sensor
WO1999027355A1 (en) * 1997-11-21 1999-06-03 Wolfbeis, Otto, Samuel Method for producing laterally organized structures on supporting surfaces
WO1999028047A2 (en) * 1997-11-29 1999-06-10 Wolfbeis, Otto, Samuel Artificial surface with predetermined affinity
DE19901761A1 (en) * 1999-01-18 1999-07-01 Gerhard Dr Hartwich Oligonucleotides tagged with photoinducible redox-active unit

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASHIMOTO K ET AL.: "Novel DNA sensor for electrochemical gene detection" ANALYTICA CHIMICA ACTA, Bd. 286, 1994, Seiten 219-224, XP002113742 *
MARRAZZA G ET AL.: "Disposable DNA electrochemical sensor for hybridization detection" BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, Bd. 14, 1999, Seiten 43-51, XP002113746 *
MIKKELSEN S R : "Electrochemical sensors for DNA sequence detection" ELECTROANALYSIS, Bd. 8, Nr. 1, 1996, Seiten 15-19, XP002113745 *
SCHLENOFF J B ET AL.: "Stability and self-exchange in alkanethiol monolayers" THE JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, Bd. 117, 1995, Seiten 12528-12536, XP002113743 *
TARLOV M J: "Electron-transfer reaction of cytochrome c adsorbed on carboxylic acid terminated alkanethiol monolayer electrodes" THE JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, Bd. 113, 1991, Seiten 1847-1849, XP002113744 *
WANG J ET AL.: "Nucleic-acid immobilization, recognition and detection at chronopotentiometric DNA chips" BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, Bd. 12, Nr. 7, 1997, Seiten 587-599, XP002113741 *
WANG J ET AL: "DNA ELECTROCHEMICAL BIOSENSOR FOR THE DETECTION OF SHORT DNA SEQUENCES RELATED TO THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS" ANALYTICAL CHEMISTRY, Bd. 68, Nr. 15, 1. August 1996 (1996-08-01), Seiten 2629-2634, XP000623884 ISSN: 0003-2700 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7108971B2 (en) 1999-05-14 2006-09-19 Iris Biotechnologies, Inc. Reversible binding of molecules to metal substrates through affinity interactions
WO2001001144A2 (en) * 1999-06-30 2001-01-04 Iris Bio Technologies Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs
WO2001001144A3 (en) * 1999-06-30 2001-05-03 Iris Bio Technologies Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs
WO2001084132A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Vladimir Mirsky Chemosensor and method for calibrating chemosensors
WO2001084132A3 (en) * 2000-04-28 2002-08-01 Vladimir Mirsky Chemosensor and method for calibrating chemosensors
WO2002027319A1 (en) * 2000-09-27 2002-04-04 Santron Ag Device for the detection of charged macromolecules
WO2004065624A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Sy-Lab Vgmbh Measuring device and method for the detection of dna sequence

Also Published As

Publication number Publication date
EP1055004A2 (en) 2000-11-29
WO1999042827A3 (en) 1999-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0886773B1 (en) Detection of molecules and molecule complexes
DE19860547C1 (en) Affinity sensor for the detection of specific molecular binding events and its use
DE19916921A1 (en) Electrical sensor array
DE10049901C2 (en) Apparatus and method for electrically accelerated immobilization and for detection of molecules
EP1377685A2 (en) Method of detecting macromolecular biopolymers by means of an electrode arrangement
EP1376128A1 (en) Method and apparatus for impedimetric detection of one or more analytes in a sample
DE602004011028T2 (en) METHOD AND DEVICE FOR DETECTING BIOMOLECULES
WO1999027355A1 (en) Method for producing laterally organized structures on supporting surfaces
WO1999042827A2 (en) Device for detecting oligonucleotide and/or polynucleotide hybridization
EP1412528B1 (en) Biosensor and method for detecting macromolecular biopolymers by means of at least one unit for immobilizing macromolecular biopolymers
WO2002031482A2 (en) Device and method for electrically accelerated immobilisation of molecules
DE10319155B4 (en) Electrically readable bonds of analyte molecules to immobilized probe molecules
DE10327683A1 (en) Method and device for the quantitative electrical detection of analytes
DE10332804A1 (en) Biosensor for detection of microorganisms, polynucleotide sequences, peptides, polypeptides, metal ions or organic molecules using auxiliary electrode, reference electrode and at least one working electrode
DE10065278A1 (en) Biochip accelerating macromolecule immobilization electrically, for detection or recognition, has electrically-conductive polymer coated onto electrodes
WO2002064823A2 (en) Method for detecting and/or quantifying an analyte
DE10221091B4 (en) SECM for the detection of nucleic acid oligomer hybridization events
DE10227042B4 (en) Method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte
DE10320312A1 (en) Substrate as a carrier for ligates
DE10049902A1 (en) Biochip accelerating macromolecule immobilization electrically, for detection or recognition, has electrically-conductive polymer coated onto electrodes
DE10307402A1 (en) Electrochemical device for detecting ligand-binding reactions, useful e.g. for diagnosis and toxicological testing, includes measuring chamber where ligands and sample are applied to a biochip that carries binding agents
DE19807339A1 (en) Sensitive surface for sensor
DE10221004A1 (en) Detection of oligonucleotide hybridization comprises electrochemically detecting reduction and/or oxidation of a redox-active species
DE10330717A1 (en) Apparatus and method for detection of analyte
DE19807338A1 (en) Device for detecting nucleic acid hybridization

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999915484

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09622580

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999915484

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999915484

Country of ref document: EP