Vorrichtung und Verfahren zur elektrisch ausgelösten Mikro- tropfenabgabe mit einem Dispensierkopf
Die Erfindung betrifft einen Dispensierkopf, der zur zeitlich gesteuerten, elektrisch ausgelösten Abgabe von Mikrotropfen eingerichtet ist, insbesondere einen Mehrkanal-Dispensierkopf mit separat ansteuerbaren Mikropipetten, und ein Verfahren zur Verwendung eines derartigen Dispensierkopfes.
Dispensierköpfe oder - odule werden verbreitet für biotechnologische oder chemisch-technologische Aufgaben eingesetzt, um kontrolliert kleine Flüssigkeitsvolumina in Form von Mikrotropfen abzugeben. Ein Beispiel hierfür ist die Herstellung von miniaturisierten DNS-Arrays für gentechnische Anwendungen, wobei durch eine geringe Tropfengröße eine hohe Klondichte erzielt wird, wofür piezoelektrisch betätigte Mikropipetten besonders gut geeignet sind. DNS-Klone, Mikroorganismen, Zellen, Zellbestandteile oder Biomoleküle werden üblicherweise als Wirksubstanzen in Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen (beispielsweise 96 oder 384) gelagert. Damit Arrays aus beispielsweise zehntausenden verschiedener DNS- Sequenzen (sogenannte DNS-Chips) schnell hergestellt werden können, sind Dispensiermodule erforderlich, die hochparallel oder mit einer hinreichenden seriellen Geschwindigkeit Flüssigkeiten aus Mikrotiterplatten für kombinatorische Zwecke auf Substratoberflächen übertragen können.
Es ist allgemein bekannt, daß als Dispensiersysteme Einkanal- Dispensierköpfe oder Mehrkanal-Dispensierköpfe in Form einer linearen Reihenanordnung aus Mikropipetten eingesetzt werden.
Diese herkömmlichen Dispensiersysteme besitzen die folgenden Nachteile .
Die Verwendung eines Emkanal-Dispensierkopfes mit einer einzelnen Mikropipette bedeutet, daß die zu kombinierenden Substanzen seriell von einem Reservoir (z.B. Mikrotiterplatte) zu einem Reaktionssubstrat befordert werden müssen, wobei bei edem Substanzwechsel ein Reinigungsschritt erforderlich ist. Diese Verfahrensweise ist wegen des Zeitaufwandes für praktische Anwendungen der kombinatorischen Biotechnologie oder Chemie unakzeptabel .
Mehrkanal-Dispensierkopfe, die im wesentlichen aus einer Reihe von beispielsweise 8 bis 16 Emkanal-Dispensierkopfen bestehen, erlauben zwar durch den parallelen Betrieb der einzelnen Mikropipetten eine Verringerung des Zeitaufwandes, erfordern jedoch bisher aufwendige Halterungs- und Steueranordnungen. Da ede einzelne Mikropipette mit zwei Steuerleitungen zur Betätigung des Piezoelements und mit einer Flussigkeitsleitung zum Anlegen eines Spul- oder Beschickungsdruckes ausgestattet ist, stellen herkömmliche Mehrkanal-Dispensierkopfe komplexe und schwerfällige Anordnungen dar. So wäre beispielsweise bei einem Dispensierkopf mit einer Reihe von 8 elektrisch betätigten Mikropipetten die Anbringung von insgesamt 16 Steuerleitungen und 8 Druckleitungen erforderlich, die mit entsprechenden einzelnen Steuer- und Druckeinrichtungen verbunden sind. Soll ein derartiger Mehrkanal-Dispensierkopf beispielsweise mit einer x-y-z-Stellemrichtung über einem Substrat verfahren werden, so stellt der komplexe Aufbau des Dispensierkopfes wegen des Gewichts und der erforderlichen Mitfuhrung einer Vielzahl von Einzelleitungen einen entscheidenden Nachteil für die Genauigkeit der Dispensierkopfpositionierung dar. Bei ungenauer Mikrotropfenplazierung wird jedoch die Effektivität der herkömmlichen Dispensiersysteme m unakzeptabler Weise eingeschränkt. Ein weiterer Nachteil besteht in der verhältnismäßig
hohen Störanfälligkeit der reihenweise angeordneten Emkanal- Mikropipetten . Schließlich benotigt jeder der reihenweise angebrachten Emkanal-Dispensierkopfe so viel Platz, daß die Mikropipetten-Spitzen größere Abstände als die üblichen Rastermaße von Mikrotiterplatten haben. Damit wird eine Substanzaufnahme von Mikrotiterplatten uneffektiv.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Mehrkanal-Dispensierkopf zu schaffen, der sich insbesondere durch einen vereinfachten Aufbau, eine vereinfachte Ansteuerbarkeit, verkürzte Reaktionszeit und erhöhte Positionierungsgenauigkeit auszeichnet. Die Aufgabe der Erfindung ist es ferner, verbesserte Emsatzmoglichkeiten eines derartigen Dispensierkopfes anzugeben .
Diese Aufgabe wird durch einen Mehrkanal-Dispensierkopf mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1 bzw. durch eine Verfahrensweise mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 15 gelost. Vorteilhafte Ausfuhrungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhangigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung besteht in der Schaffung eines Mehrkanal-Dispensierkopfes, bei dem Mikropipetten jeweils mit einer elektrisch betatigbaren Ausloseeinrichtung, die einen Masse- und einen Signalanschluß besitzt, zweidimensional oder flachig auf einem gemeinsamen Trager angeordnet sind, der für jeden Masse- oder Signalanschluß jeweils entsprechend einen Masse- oder einen Signalkontakt aufweist, wobei die Masse- und Signalkontakte am Trager in zwei voneinander beabstandeten und elektrisch isolierten Ebenen angeordnet sind. Die Kontakte am Trager sind m Bezug auf die axiale Ausdehnung (oder: Langsausdehnung) der Mikropipetten voneinander beabstandet. Diese Gestaltung ermöglicht einen wesentlich vereinfachten Aufbau mit einer verdichteten Mikropipettenanordnung .
Die Erfindung kann mit allen Formen von Mikropipetten realisiert werden, die mit einer elektrisch betatigbaren Ausloseeinrichtung ausgerüstet und zur Mikrotropfenabgabe nach Auslosung eines Druckpulses im Volumen der Mikropipette eingerichtet sind. Die Ausloseeinrichtung kann eine Piezoemrichtung, eine Ventilanordnung (m Kombination mit einer Druckleitung) oder jede entsprechende elektrische Druckvorrichtung sein. Die zweidimensionale oder flächige Anordnung von Mikropipetten auf einem gemeinsamen Trager kann jede regelmäßige oder unregelmäßige Anordnung umfassen. Es wird jedoch eine regelmäßige Anordnung mit geraden oder konzentrisch kreisförmigen Reihen bevorzugt. Bei einer rechtwinkligen Matrixanordnung bilden die Mikropipetten rechtwinklig zueinander ausgerichtete Reihen und Spalten. Bei einer schiefwinkligen Matrixanordnung bilden die Mikropipetten gerade Reihen und Spalten, die schräg (nicht senkrecht) zueinander ausgerichtet sind. Bei einer kreisförmigen Anordnung bilden die Mikropipetten konzentrische Kreise. Im letzteren Fall werden die m folgenden genannten Reihen und Spalten durch radial angeordnete (gerade) Mikropipettenreihen und kreisförmige Mikropipettenreihen gebildet.
Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform besteht der Dispensierkopf gemäß der Erfindung aus einer oder mehreren Mikropipettenreihen auf einem gemeinsamen Tragerl wobei die Massekontakte jeder Reihe elektrisch miteinander verbunden sind und die Signalkontakte mit einer Signal-DeDemultiplexschaltung einzeln ansteuerbar sind. Gemäß einer zweiten Ausfuhrungsform besteht der Dispensierkopf gemäß der Erfindung aus einer oder mehreren Mikropipettenreihen auf einem gemeinsamen Trager, wobei die Signalkontakte aller Reihen elektrisch miteinander verbunden sind und die Massekontakte mit einer DeDemultiplexschaltung einzeln ansteuerbar sind. Gemäß einer dritten Ausfuhrungsform besteht der Dispensierkopf gemäß der Erfindung aus einer Mehrzahl von Mikropipettenreihen derart, daß die Mikropipetten zweidimensional maxtπxartig spalten- und reihenweise angeord-
net sind. Bei dieser Ausführungsform sind die Massekontakte jeder Reihe elektrisch verbunden, wobei eine Masse- Demultiplexschaltung vorgesehen ist, mit der die gemeinsamen Massekontakte der einzelnen Mikropipettenreihen einzeln ansteuerbar sind. Außerdem sind die Signalkontakte jeder Mikropipettenspalte elektrisch miteinander verbunden, wobei in diesem Fall die Signal-Demultiplexschaltung dazu vorgesehen ist, daß die gemeinsamen Signalkontakte der Mikropipettenspal- ten einzeln ansteuerbar sind.
Durch die Demultiplex-Technik wird ermöglicht, daß durch Anlegen des Masse- bzw. Signalpotentials an eine der Reihen bzw. Spalten genau eine Auslöseeinrichtung einer Mikropipette betätigt wird, deren Position der ausgewählten Reihe bzw. Spalte entspricht .
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Mikropipette mit einer elektrisch betätigbaren Auslöseeinrichtung, die einen Masse- und einen Signalanschluß besitzt und die zwei Befestigungseinrichtungen aufweist. Jede der Befestigungseinrichtungen erfüllt eine Doppelfunktion. Erstens ist eine Befestigungseinrichtung zur Herstellung einer elektrischen Verbindung zwischen dem Masse- bzw. dem Signalanschluß und entsprechenden elektrischen Steueranschlüssen an einem Träger oder einer Hal- terung vorgesehen. Zweitens dienen die Befestigungseinrichtungen selbst als mechanische Verbindungsmittel oder als Befestigungsmittel zur Anbringung der Mikropipette an dem Träger bzw. der Halterung. Die Befestigungseinrichtungen stellen einen mechanisch sicheren Eingriff der Mikropipette mit dem Träger oder der Halterung bereit und umfassen z.B. Lötösen, Federelemente oder Gewindeansätze.
Gemäß einer vorteilhaften Gestaltung der Mikropipetten ist jede Mikropipette über eine Druckleitung mit einer ebenfalls am Träger angebrachten Verteilereinrichtung verbunden, über die
ein Beschickungs- oder Reinigungsdruck auf die Mikropipetten gegeben werden kann. Die Verteilereinrichtung ist entweder eine Mehrventilanordnung oder ein ventilfreies Verzweigungsstuck.
Die Mikropipetten weisen ein Ladevolumen zur Aufnahme der mikrotropfenweise abzugebenden Wirksubstanz und ein Tragervolumen zur Aufnahme einer Tragerflussigkeit auf. Gemäß einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird der Dispensierkopf derart beschickt, daß zunächst eine Tragerflussigkeit simultan m alle Tragervolumen der Mikropipetten aufgenommen wird. Anschließend werden an einer Wirksubstanzreservoiranord- nung, die eine Vielzahl von Reservoiren enthalt, die jeweils entsprechend der Mikropipettenanordnung am Dispensierkopf ausgerichtet sind, an jeder Mikropipette spezifisch Wirksubstanzen aufgenommen. Die Ausloseeinrichtung ist jeweils im Bereich des Tragervolumens angebracht, so daß die mikrotropfenweise Abgabe durch Betätigung der Ausloseeinrichtungen und Vermittlung des Druckpulses über die Tragerflussigkeit auf die jeweilige Wirksubstanz erfolgt.
Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Der erfindungs- gemaße Mehrkanal-Dispensierkopf besitzt einen wesentlich vereinfachten Aufbau, der je nach konkreter Mikropipettenanordnung durch Einsatz der Demultiplex-Technik auch eine Vereinfachung der Mikropipettenansteuerung erlaubt. Diese betrifft sowohl die Zahl der zum Dispensierkopf fuhrenden Masse- und Signalleitungen, die unabhängig von der Zahl der Mikropipetten bis auf zwei Leitungen reduzierbar sind, als auch den Umfang der zur Ansteuerung der Mikropipetten erforderlichen Steuer- elektromk. Außerdem ist der vereinfachte Aufbau leichter ma- nipulierbar und somit genauer positionierbar. Schließlich erlaubt die Anordnung von Mikropipetten auf einem gemeinsamen Trager eine Verringerung des Mikropipettenabstandes, so daß entsprechend Wirksubstanzen von Mikrotiterplatten mit geringem
Abstand der einzelnen Mikrotitervolumma aufgenommen werden können. Die Zahl der parallel bearbeiteten Substanzen erhöht sich, so daß eine entsprechende Zeitersparung erzielt wird. Der Mehrkanal- Dispensierkopf gemäß der Erfindung erlaubt erstmalig eine vollautomatische und reproduzierbare Steuerung der Dispensierkopfpositionierung und der Mikrotropfen- Abgabezeiten nach vorgegebenen Programmustern, beispielsweise unter Einsatz eines Steuerrechners.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefugten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Fig. 1: eine schematische Teil-Schnittansicht eines erfin- dungsgemäßen Mehrkanal-Dispensierkopfs;
Fig. 2: die Kontaktgestaltung für einen Mehrkanal- Dispensierkopf gemäß der ersten Ausfuhrungsform der Erfindung, bei dem eine Mikropipettenreihe vorgesehen ist;
Fig. 3: eine schematische Ubersichtsdarstellung des Mehrkanal-Dispensierkopfes gemäß der zweiten Ausfuhrungsform der Erfindung, bei dem mehrere Mikropipettenreihen vorgesehen sind;
F g. 4: eine Ubersichtsdarstellung der elektrischen
Steuerung des Mehrkanal-Dispensierkopfes gemäß Fig. 3;
Fig. 5: eine schematische Perspektivansicht eines Tragers eines Dispensierkopfs gemäß der dritten Ausfuhrungsform der Erfindung, bei dem eine Mikropi- pettenmatrix vorgesehen ist;
Fig. 6: eine Ubersichtsdarstellung der elektrischen An- steuerung eines Mehrkanal-Dispensierkopfs gemäß Fig. 5;
Fig. 7: ein Schaltbild einer Hochspannungs-Versorgungseinrichtung für einen Mehrkanal-Dispensierkopf gemäß den Fign. 3 oder 5;
Fig. 8: ein Schaltbild einer Demultiplex-Anordnung gemäß Fig. 5;
Fig. 9: ein Schaltbild zum Zusammenwirken der Hochspannungs-Versorgungseinrichtung mit den Demultiplex- Anordnungen gemäß den Fign. 7 und 8;
Fig. 10: eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäß modifizierten Mikropipette;
Fig. 11: eine schematische Darstellung einer weiteren erfindungsgemäß modifizierten Mikropipette; und
Fig. 12: eine schematische Ubersichtsdarstellung zur Erläuterung des Einsatzes eines Mehrkanal-Dispensierkopfes gemäß der Erfindung.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf einen Dispensierkopf mit piezoelektrisch betätigbaren Mikropipetten beschrieben, die zur vertikalen Abgabe von Mikrotropfen im sub- μl-Bereich auf Substrate eingerichtet sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern allgemein bei allen Mikropartikelplazierungseinrichtungen mit allen Arten von Auslöseeinrichtungen anwendbar, bei denen elektrisch betätigte Dispenser reihen- oder matrixartig angeordnet sind und die einzelnen Auslöseeinrichtungen jedes Dispensers separat betätigbar sein sollen. Die Erfindung ist ferner nicht auf
ein bestimmtes, im folgenden beispielhaft angeführtes Format der Mikropipettenanordnung beschrankt, sondern auf beliebige Reihenlangen oder Matrix-Großen, zur vertikalen oder horizontalen Mikrotropfen- oder partikelabgabe anwendbar. Die Erfindung ist mit beliebigen oder kommerziell verfugbaren, elektrisch betatigbaren Mikropipetten implementierbar , so daß im folgenden Einzelheiten der Mikropipetten nicht beschrieben werden .
Fig. 1 zeigt schematisch eine Schnittteilansicht eines erfin- dungsgemaßen Dispensierkopfs 10 mit einer Gruppe von Mikropipetten 20 (20a, 20b, ... ) , die an einem gemeinsamen Trager 30 angebracht sind, der mit einer x-y-z-Stellemrichtung verstellbar ist. Jede Mikropipette 20 besitzt als Ausloseemrich- tung ein Piezoelement 21 mit zwei Steueranschlussen, die einen Masse-Anschluß 22 und einen Signal-Anschluß (oder: Phase- Anschluß) 23 umfassen. An der Pipettenspitze bildet die Mikropipette 20 ein Ladevolumen 24, das gegebenenfalls m ein Tragervolumen 25 (s. unten) übergeht. Am entgegengesetzten Ende der Mikropipette ist eine Druckleitung 26 vorgesehen, deren Einzelheiten unten beschrieben werden.
Der Trager 30 besteht aus mindestens einem plattenformigen Tragerelement, das mit Aufnahmen 32 (32a, 32b, ...) zur Anbringung der Mikropipetten 20 versehen ist. Außerdem sind am Trager 30 in zwei voneinander beabstandeten, elektrisch isolierten, im wesentlichen ebenen Bereichen, die bei dem dargestellten Beispiel durch die Oberflachen 31, 33 (oder Seiten- flachen) des Tragerelements gebildet werden, mit Kontakten 34, 35 versehen, die jeweils einen Massekontakt 34 und einen Signalkonakt 35 umfassen. Die Masse- und Signalkontakte 34, 35 stehen jeweils entsprechend mit den Masse- und Signal- Anschlussen 22, 23 der Piezoelemente 21 m elektrischer Verbindung. Schließlich können elektronische Bauelemente und Einrichtungen zu deren Befestigung und Verbindung am Trager vor-
gesehen sein. Hierzu ist der Trager vorzugsweise selbst eine Schaltungsplatme . Es kann insbesondere die komplette Versor- gungs- und Demultiplexelektronik auf dem Trager angebracht
An jeder Aufnahme 32 des Tragerelements 31 ist eine Befestigungseinrichtung zur Halterung der Mikropipette 20 vorgesehen. Die Befestigung erfolgt vorzugsweise losbar, um einzelne Mikropipetten austauschen zu können. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird die Befestigungseinrichtung selbst durch die Masse- und Signalkontakte 34, 35 gebildet, falls diese Federelemente sind, unter deren Wirkung die Mikropipetten 20 mit dem Piezoelement 21 in der Aufnahme 32 festgehalten werden.
Die Anordnung der Mikropipetten auf dem gemeinsamen Trager erlaubt es, daß der Abstand zwischen den Mikropipettenspitzen so gering wird (z.B. 4,5 mm oder 9 mm), daß eine unmittelbare Substanzaufnahme aus blicherweise verwendeten Mikrotiterplatten simultan für alle Mikropipetten eines Dispensierkopfes möglich ist. Die Anbringung der Masse- und Signalkontakte 34, 35 auf zwei getrennten Ebenen erlaubt ferner eine kreuzungsfreie, reihen- oder spaltenweise Verbindung von Kontakten, wie dies im folgenden erläutert wird.
Gemäß der ersten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die Mikropipetten als lineare Reihe seitlich an einem gemeinsamen flachen Trager angebracht. Fig. 2 zeigt ein Beispiel für die Kontaktierung einer (nicht dargestellten) Platine (Platinen- layout) , wie sie als ein Trager 30 realisiert sein kann. Fig. 2 zeigt zwei Kontaktreihen 34, 35, die auf der Seitenfläche einer Tragerplatine vorgesehen sind und jeweils eine Vielzahl von Durchgangslochern 341, 351 aufweisen, die zur Aufnahme von federnden Lotosen eingerichtet sind und die mit entsprechenden Aufnahmeoffnungen auf der Tragerplatine (entsprechend den Aufnahmen 32 m Fig. 1) ausgerichtet sind. Die
Mikropipetten verlaufen hier parallel zur Ebene des Tragers. Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung sind die Kontakte einer der Kontaktreihen miteinander elektrisch verbunden. Beim dargestellten Beispiel sind die Massekontakte 34 miteinander verbunden, w hrend die Signalkontakte 35 voneinander getrennt und einzeln ansteuerbar sind. Über ein übliches Anschlußteil 36, dessen Einzelheiten nicht dargestellt sind, sind der gemeinsame Massekontakt 34 mit dem Masse-Anschluß einer Hochspannungs-Versorgungseinrichtung zur Ansteuerung der Piezoele- mente und die einzelnen Steuerkontakte 35 über eine Demulti- plexschaltung mit einem Phase- oder Signal-Anschluß der Hochspannungs-Versorgungseinrichtung verbunden .
Das Bezugszeichen 37 weist auf eine Halterungseinrichtung hm, mit der mehrere Mikropipettenreihen miteinander verbunden werden, um so eine Mikropipettenmatrix zu bilden. Dies wird dadurch erleichtert, daß die Reihenanordnung einen flachen Aufbau ermöglicht, so daß die Mikropipetten auch m Spaltenrichtung mit einem genügend geringen Abstand angeordnet werden können .
Die zweite Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Mehrkanal- Dispensierkopfes ist in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3 illustriert die Gestaltung einer Mikropipettenmatrix (Ausschnitt) und deren elektrische Ansteuerung. Bei der zweiten Ausfuhrungsform sind die Mikropipetten matrixartig zweidimensional n mehreren parallelen Mikropipettenreihen und -spalten an einem gemeinsamen Trager 30 angeordnet. Beispielhaft sind nur drei Spalten und zwei Reihen dargestellt. Anwendungsabhangig sind jedoch wesentlich mehr Mikropipetten matrixartig verteilt. Die Geometrie der Anordnung ist anwendungsabhangig und entspricht vorzugsweise der geometrischen Anordnung der Reservoire einer Mikrotiterplatte. Der Trager 30 umfaßt zwei Tragerteilelemente bestehend aus einer Grundplatte 311 und einer Deckplatte 313. Zusätzlich kann zwischen diesen eine Fuhrungsplatte (nicht
dargestellt) vorgesehen sein, die vor allem der Stabilisierung des Tragers 30 dient und bei der dritten Ausfuhrungsform gemäß Fig. 3 gezeigt ist. Jedes der Tragerteilelemente ist jeweils entsprechend mit Aufnahmen 321 und 323 versehen, die im zusammengesetzten Zustand der Tragerteilelemente zueinander ausgerichtet und zur Halterung jeweils einer Mikropipette eingerichtet sind. Jede der Aufnahmen 321 bzw. 322 ist mit einem inneren Gew debereich versehen, der jeweils mit einem Gewm- deansatz der Mikropipette (s. Fig. 11) zusammenwirkt. Außerdem bildet jede Aufnahme 321 bzw. 323 einen elektrischen Steueranschluß für die zugehörige Mikropipette. Bei der dargestellten Ausfuhrungsform tragt die Deckplatte 313 einen gemeinsamen Signalkontakt für sämtliche Mikropipetten 20. Der Signalkontakt 35 wird beispielsweise durch eine elektrisch leitende Beschichtung (Metallplatte) der Deckplatte 313 gebildet und steht über eine Anschlußleitung mit der zugehörigen Steuerung m Verbindung. Die Massekontakte 34 sind in der Ebene der Grundplatte 311 mit Abstand vom Signalkontakt 35 angeordnet. Jeweils eine Signalleitung 341 fuhrt von der zugehörigen Steuerung zu einer der Mikropipetten 20.
Bei der Ausfuhrungsform gemäß Fig. 3 sind die Signalkontakte sämtlicher Reihen und Spalten der Mikropipetten elektrisch miteinander verbunden, wohingegen die Massekontakte mit einer Demultiplexschaltung 41 einzeln ansteuerbar sind. Die Steuerung des Mehrkanal-Dispensierkopfs gemäß Fig. 3 umfaßt entsprechend den Darstellungen m den Fign. 3 und 4 eine Versorgungseinrichtung 70 mit einer Hochspannungsquelle 71 und einer Schaltstufe 72 sowie die Demultiplexschaltung 41. Sowohl die Versorgungseinrichtung 70 als auch die Demultiplexschaltung 41 sind mit einer rechnergestutzten Steuerung (z.B. Steuerrechner 60) verbunden.
Die Mikropipetten 20 sind z.B. Piezopipetten, die jeweils mit einem Spannungspuls von bis zu 250 Volt angesteuert werden.
Die Regelung der Pulsamplitude erfolgt direkt über die Spannungsversorgung der Hochspannungsquelle 71. Hierzu gibt der Steuerrechner 60 (DA-Karte) einen Spannungswert zwischen 0 und 5 Volt aus, der der Hochspannungsquelle 71 als Steuersignal dient. Der Steuerspannungshub von 5 Volt entspricht beispielsweise einem Hochspannungshub von 250 Volt.
Die Schaltstufe 72 enthält Schalttransistoren, die einerseits mit der eingestellten Hochspannung von der Hochspannungsquelle 71 und andererseits über Schmitt-Trigger mit Steuerpulsen von einer Timer-Counter-Karte im Steuerrechner 60 beaufschlagt werden. Die Schalttransistoren liefern entsprechend der gewünschten Ansteuerung der Mikropipetten 20 einen flankensteilen Rechteckpuls an den Signalkontakt 35, der dort allen Mikropipetten simultan zur Verfügung steht. Die elektrische Verbindung mit den Piezoelementen der Mikropipetten erfolgt über die jeweiligen Gewindeansätze der Mikropipetten.
Die Demultiplexschaltung 41 ist beispielsweise eine 16-aus-4- Demultiplexschaltung . Die Auswahl der gewünschten Mikropipetten 20 erfolgt über einen vom Steuerrechner 60 vorgegebenen BCD-Code. Die Demultiplexschaltung 41 entschlüsselt den Code und gibt die jeweilige Pipettenauswahl an eine von vielen Schaltstufen weiter, deren Anzahl der Zahl von Mikropipetten entspricht. Die dadurch aktivierte Schaltstufe bringt den entsprechenden Massekontakt 34 der gewünschten Mikropipette 20 simultan zum Hochspannungspuls der Versorgungseinrichtung 70 auf Massepotential. Dadurch wird die gewünschte Mikropipette 20 einer Potentialdifferenz ausgesetzt. Das Piezoelement wird dementsprechend betätigt und Flüssigkeit dispensiert. Die Düsen, deren Schaltstufen nicht aktiviert sind, bleiben potentialfrei, so daß die jeweiligen Mikropipetten auch nicht betätigt und keine Flüssigkeiten dispensiert werden. Die elektrischen Verbindung zwischen den Schaltstufen der Demultiplexschaltung 41 mit den Piezoelementen der Mikropipetten
erfolgt über die jeweiligen Gew deansatze (s. Fig. 11) und über Leiterbahnen auf der Grundplatte 311. Die Grundplatte 311 ist dementsprechend vorzugsweise eine Platine mit geatzten Kupferbahnen .
Die Ausfuhrungsform gemäß den Fign. 3 und 4 besitzt den Vorteil, daß das System beliebig erweiterbar ist. Eine Erweiterung auf eine vergrößerte Pipettenzahl ist mit minimalem techischem Aufwand möglich, da jedem Fall nur die eine Versorgungseinrichtung 70 unabhängig von der Zahl der Pipetten erforderlich ist. Die Demultiplexschaltung hingegen kann problemlos mit auf dem Trager 30 angebracht werden, der mit einer Haltevorrichtung (nicht dargestellt) über einem Probensubstrat oder dgl . verfahren werden kann.
Eine alternative Gestaltung eines Tragers 30 für eine matrixartige, zweidimensionale Mikropipettenanordnung gemäß der dritten Ausfuhrungsform der Erfindung ist m Fig. 5 (auseinandergezogene Darstellung) dargestellt. Der Trager 30 umfaßt hier drei Tragerteilelemente bestehend aus einer Grundplatte 311, einer Fuhrungsplatte 312 und einer Deckplatte 313. Jedes der Tragerteilelemente ist jeweils entsprechend mit Aufnahmen 321, 322 und 323 versehen, die im zusammengesetzten Zustand der Tragerteilelemente zueinander ausgerichtet und zur Halterung jeweils einer Mikropipette eingerichtet sind. In jeder der Aufnahmen 321 bzw. 323 der Grundplatte 311 bzw. 313 befindet sich ein elektrischer Kontakt 34 bzw. 35. Die Kontakte 34 (beispielsweise: Massekontakte 34) sind somit m der Ebene der Grundplatte 311 mit Abstand von den Kontakten 35 (hier: Signalkontakte) m der Ebene der Deckplatte 313 angeordnet. Die Massekontakte 34 sind durch einen ersten Kontaktkamm 341 reihenweise miteinander verbunden. Hierzu sind Kontaktstege 341a, 341b, ... vorgesehen, die sich entlang der Reihen erstrecken und jeweils mit jedem der der entsprechenden Reihe befindlichen Kontakte 34 verbunden sind. Für die zweite Kon-
taktgruppe 35 ist entsprechend ein zweiter Kontaktkamm 351 bestehend aus Kontaktstegen 351a, 351b, ... vorgesehen, der die Kontakte spaltenweise miteinander verbindet. Spaltenweise bedeutet hier, daß die Kontakte 35 in linearen Spalten jeweils untereinander verbunden werden, die senkrecht oder schräg zur den linearen Reihen verlaufen, in denen die Kontakte 34 miteinander verbunden sind. Die Kontaktk mme 341, 351 sind mit Demultiplex-Schaltungen (nicht dargestellt) verbunden, deren Funktion unten erläutert wird.
Bei der Ausfuhrungsform gemäß Fig. 5 übernehmen die Kontakte 34, 35 wiederum die Funktion von Befestigungsemrichtungen. Die Kontakte sind jeweils den Aufnahmen federnd so angeordnet, daß der Querschnitt der Aufnahme verringert wird und em in der Aufnahme befindliches Piezoelement einer mechanischen Spannung ausgesetzt ist. Die Dicke der Fuhrungsplatte 312 wird entsprechend der konkreten Piezoelement-Bauform so gewählt, daß die Kontakte 34 bzw. 35 jeweils mit den Masse- und Signalanschlussen der Piezoelemente Kontakt erhalten, wie diese m Fig. 10 gezeigt sind.
Der oben beschriebene Aufbau des erfmdungsgemaßen Mehrkanal- Dispensierkopfes gemäß den Fign. 2 oder 5 erlaubt eine vereinfachte elektronische Steuerung durch Einsatz der Demultiplex- Technik. Um auch die Handhabung des Dispensierkopfs durch Reduzierung der Zahl der elektrischen Steuerleitungen von ortsfesten Steuer- und Versorgungseinrichtungen zu vereinfachen, sind je nach Ausfuhrungsform eine erste Demultiplexschaltung 40 und/oder eine zweite Demultiplexschaltung 50 mit am Dispensierkopf 10 angebracht. Die Demultiplexschaltung 40 ist zur Verteilung von Phasen- oder Steuerimpulsen oder -Signalen auf die Piezoelementsteueranschlusse von einzelnen oder spaltenformig angeordneten Mikropipetten vorgesehen. Die zweite Demultiplexschaltung 50 ist dementsprechend zur Verteilung von Massepotentialen an die Piezoelement-Masseanschlusse
von reihenweise angeordneten Mikropipetten vorgesehen. Fig. 6 zeigt schematisch ein Blockschaltbild der ortsfesten Steuereinrichtung 60 (beispielsweise ein Computer) , der ortsfesten oder mit dem Träger beweglichen Versorgungseinrichtung 70 und des in Bezug auf diese mit einer x-y-z-Stelleinrichtung (nicht dargestellt) beweglichen Dispensierkopfs 10 (gestrichelt umrahmt) . Die Darstellung macht einen wichtigen Vorteil der Erfindung deutlich, daß nämlich neben den zwei Leitungen 74, 75 zur Piezoelementansteuerung lediglich zwei weitere Leitungen 62, 63 zur Ansteuerung der Demultiplexschaltungen 40, 50 zwischen dem beweglichen Dispensierkopf 10 und den ortsfesten Laborsystemen vorgesehen sind.
Die Steuereinrichtung 60 dient der automatischen Steuerung des gesamten Mikroplazierungssystems, insbesondere der Dispensierkopfpositionierung und der zeitlichen Mikrotropfenabgabe . Hierzu wird beispielsweise ein Computer mit einer zusätzlichen Timer-Counter-Karte, einem Digital-Analog-Wandler (z.B. National Instruments PC-A-02DC) und mehreren Digital-Ausgängen für die Steuerbus-Leitungen (z.B. National Instruments PC-DI0- 96) versehen. Die Timer-Counter-Karte (z.B. PCL mit AM 9513- Baustein) wird zur Erzeugung der je nach Anwendungsfall erforderlichen Piezoimpulslänge (TTL-Impulse zur Hochspannungssteuerung) und der Tropfenfrequenz programmiert. Über den Digital-Analog-Wandler in der Steuereinrichtung 60 kann die Ausgangsspannung der Hochspannungsquelle 71 der Versorgungseinrichtung 70 variiert werden. Diese Variationsmöglichkeit ist vorteilhaft, um die Parameter der Versorungseinrichtung 70 an die Kenngrößen der Mikropipetten des jeweils verwendeten Dispensierkopfes und gegebenfalls an die zu dispensierenden Lösungen anzupassen. Die jeweiligen Kenngrößen (Pulspannung, Pulslänge, Tropfenfrequenz usw.) werden von der Steuereinrichtung 60 verwaltet und in Datenbanken gespeichert.
Die Steuereinrichtung 60 ist über einen x-y-Steuerbus 61 mit den Demultiplexschaltungen 40 und 50 verbunden. Außerdem besteht eine Verbindung mit der Versorgungseinrichtung 70 über die Spannungseinstelleitung 64 und die Impulsleitung 65 zur Pulsbreiten- und Frequenz-Steuerung der Versorgungseinrichtung 70.
Fig. 7 zeigt Einzelheiten der Versorgungseinrichtung 70, die aus einer Hochspannungsquelle 71 und einer Pulsformungsschaltung 72 besteht. Die Leitungen 64 bzw. 65 von der Steuereinrichtung 60 sind jeweils entsprechend mit den Schaltungen 71 bzw. 72 verbunden. Von der Versorgungseinrichtung 70 führt dann eine Steuerleitung 74 und eine Masseleitung 75 zum Dispensierkopf 10. Über die Steuerleitung 74 wird ein Hochspannungspuls als Steuersignal für die Piezoelemente der Mikropipetten übertragen. Die Hochspannungs-Steuereinheit 71 besteht aus einem kommerziell erhältlichen Linearspannungsverstärker . Die Pulsformungsschaltung 72 ist eine schnell schaltende, flankenpräzise Hochspannungsschaltstufe, die vom TTL-Puls der Steuereinrichtung 60 gesteuert wird.
Einzelheiten der Demultiplex-Schaltung 40 und deren Zusammenwirken mit der Steuereinrichtung 60 und der Versorgungseinrichtung 70 werden im folgenden unter Bezug auf das erste Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2 mit 16 Mikropipetten erläutert. Bei dem ersten Ausführungsbeispiel ist eine Gruppe von Mikropipetten reihenförmig angeordnet, wobei alle Massenkontakte 34 der Mikropipetten elektrisch miteinander verbunden sind. Eine Demultiplexschaltung 50 gemäß Fig. 6 ist in diesem Fall somit nicht vorgesehen. Die im folgenden unter Bezug auf die Figuren 7 und 8 erläuterten Einzelheiten können jedoch in analoger Weise auf die zweite und dritte Ausführungsform mit einer matrixförmigen Mikropipettenanordnung gemäß dem Fign. 3 oder 5 angewendet werden. Die Demultiplexschaltung 50 besitzt dann grundsätzlich denselben Aufbau und dieselben Funktionen wie
die Demultiplexschaltung 40, dies jedoch in Bezug auf die separate Ansteuerung der Massekontakte miteinander verbundener Reihen .
Die Demultiplexschaltung 40 (s. Fig. 6) umfaßt einen Demulti- plexer 41, eine Anzeigeeinrichtung 42 und eine Schalteranordnung 43. Der Demultiplexer 41 und die Anzeigeeinrichtung 42 sind in Fig. 8 gezeigt. Über den y-Steuerbus 62, der vom x-y- Steuerbus 61 abzweigt, erhält der Demultiplexer 41 ein Selektionssignal, das festlegt, welcher der Signalkontakte 35 des Dispensierkopfs 10 mit dem Hochspannungspuls von der Versorgungseinrichtung 70 beaufschlagt werden soll. Der Demultiplexer 41 ist beispielsweise ein digitaler Demultiplexer vom Typ SN74LS4067. Daraufhin gibt der Demultiplexer 41 über eine der 16 Demultiplexerausgangsleitungen 64 ein Triggersignal aus, das an die Anzeigeeinrichtung 42 und die Schalteranordnung 43 angelegt wird. Die Anzeigeeinrichtung 42 ist lediglich ein Hilfsmittel zur Vereinfachung der Erkennbarkeit, welche Mikropipette des Dispensierkopfs gerade aktuell angesteuert wird. Zur Realisierung der Erfindung ist es nicht zwingend erforderlich, die Anzeigeeinrichtung 42 vorzusehen.
Die Schalteranordnung 43, deren Einzelheiten in Fig. 9 gezeigt sind, wirkt wie eine Relaisgruppe bestehend aus einer Zahl der in der Reihe angeordneten Mikropipetten (z.B. 16) entsprechenden Schalteinheiten 431, ... 4316. Jede der Schalteinheiten enthält als Schaltmittel eine Transistorschaltung, die bei Anlegen eines Triggersignals von einer der sechzehn Demultiplexerausgangsleitungen 64 anspricht und den über die Signalleitung 74 gelieferte Hochspannungspuls an den Signalkontakt 35 des jeweils selektierten Piezoelements 21 weiterschaltet.
Durch das vom Demultiplexer 41 gelieferte Triggersignal wird somit entschieden, welche Mikropipette (bzw. welches Piezoelement) mit dem Hochspannungspuls beaufschlagt wird. Obwohl bei
der ersten Ausführungsform sämtliche Piezoelemente mit dem Massepotential fest verbunden sind, wird nur eine Mikropipette elektrisch versorgt und somit zur Mikrotropfenabgabe veranlaßt. Bei der zweiten Ausführungsform enthält die zweite De- multiplexerschaltung 50 entsprechend einen Demultiplexer 51, eine Anzeigeeinrichtung 52 und eine Schalteranordnung 53. Über den x-Steuerbus 63 wird ein Selektionssignal an den Demultiplexer 51 geliefert, wodurch ausgew hlt wird, welche der in Bezug auf die Massekontakte verbundenen Mikropipettenreihen mit der Masseleitung 75 von der Steuereinrichtung 70 verbunden werden soll. Der Demultiplexer 51 liefert wiederum ein entsprechendes Triggersignal, auf das eine der Schalteinheiten der Schalteranordnung 53 das Massepotential auf die entsprechende Mikropipettenreihe durchschaltet. Durch das Zusammenwirken der Demultiplexschaltungen 40 und 50 wird genau eine Mikropipette elektrisch versorgt, die der Reihe und Spalte entspricht, die aktuell mit dem Hochspannungspuls bzw. dem Massepotential beaufschlagt werden. Beim in Fig. 5 dargestellten Beispiel ist dies die Mikropipette in der zweiten Spalte und zweiten Reihe .
Die Zahl der Schaltereinheiten 431, ..., 531, ... in jeder Schalteranordnung 43, 53 wird an die jeweilige Reihen- und Spaltenzahl des Dispensierkopfes 10 angepaßt. So können beispielsweise bei einem Dispensierkopf mit 96 Mikropipetten für eine Mikrotiterplatte mit 96 Substanzreservoirs (Reservoirabstand rd . 9 mm) in der Schalteranordnung 43 acht Schalteinheiten und in der Schalteranordnung 53 zwölf Schalteinheiten vorgesehen sein. Die Schalteinheiten werden vorzugsweise von den Demultiplexern optoisoliert , um das Übersprechen elektrischer Steuersignale zu vermeiden und um eine Verstärkung der Demul- tiplexersignale zu erzielen. Hierzu sind für jede Schaltereinheit ein Optokoppler vorgesehen.
Eine erfmdungsgemaße modifizierte Mikropipette ist mit Befestigungsemrichtungen versehen, die simultan dem elektrischen und mechanischen Kontakt mit dem Trager dienen. Zwei Ausfuhrungsformen von Befestigungseinrichtungen werden im folgenden unter Bezug auf die Fign. 10 und 11 beschrieben.
Fig. 10 zeigt Einzelheiten eines kommerziell verfugbaren Piezoelements 21 mit Steueranschlussen 22, 23. Bei Anlegen eines Steuersignals (Hochspannung im Bereich von rd. 30 V bis 200 V) erfolgt eine Verformung des Piezoelements derart, daß sich das mit dem Inneren der Mikropipette befindliche Volumen verringert, so daß von der Mikropipettenspitze em Mikrotrop- fen abgegeben wird. Bei der Ausfuhrungsform gemäß Fig. 2 st jeder Steueranschluß über eine Lotose 27, die in die jeweilige Aufnahme am Trager ragt, mit den jeweiligen Kontakten im Trager verbunden. Bei der Ausfuhrungsform gemäß Fig. 5 kann auf die Lotose verzichtet werden, da die Kontakte 34, 35 in den Ausnehmungen 321 bzw. 323 den direkten Kontakt mit den Steueranschlussen 22, 23 herstellen.
Eine alternative Pipettengestaltung ist Fig. 11 gezeigt. Die Mikropipette 20 besteht aus einer Bohrsilikatglaskapillare mit einem Außendurchmesser von 1 mm und einer Wandstarke von 41 μm. Das Piezoelement 21 ist e Piezokeramikrohr mit zwei Steueranschlussen 22, 23, die jeweils eine innere Elektrode und eine äußere Elektrode (Metallisierung auf dem Piezokeramikrohr) umfassen. Die Befestigungseinrichtungen werden durch zwei Gewmdehulsen oder Gew deansatze 28 gebildet, die jeweils an den Enden des Piezokeramikrohrs aufsitzt. Die Steueranschlusse 22, 23 sind so angeordnet, daß jeweils em Ende des Piezokeramikrohrs von einem der Steueranschlusse bedeckt ist. Dementsprechend bestehen die Gewmdeansatze 28 aus metallischem Material in elektrischem Kontakt jeweils mit einem der Steueranschlusse 22 oder 23. Der Außenumfang der Gewmdeansatze 28 ist mit einem Gewinde entspechend dem Innenge-
winde m den Aufnahmen 321, 322 am Trager 30 (s. Fig. 3) versehen. Anstelle der Gewinde können auch andere Eingriffsmog- lichkeiten (z.B. Rastelemente) vorgesehen sein.
Die Gewmdeansatze 28 sind mit einem elektrisch leitenden Klebstoff (z.B. "Circuit Works" von Chemtronics Inc., USA) auf die Steueranschlusse aufgeklebt. Der axiale Abstand der Steueranschlusse 22, 23 betragt rd. 1 cm und der Durchmesser des Piezokeramikrohrs betragt rd. 3 mm. Die Dimensionen der als Dispenser wirkenden Mikropipette können anwendungsabhangig angepaßt sind.
Die Mikropipette 20 enthalt eine Verjüngung 29 zwischen dem Tragervolumen 25 hm zur Pipettenspitze 20a und einem Reservoir 26, das mit einer Druckleitung (nicht dargestellt) verbunden ist (s. Fig. 12) .
Fig. 12 zeigt em weiteres Merkmal gemäß der Erfindung, mit dem die Handhabung eines Mehrkanal-Dispensierkopfes vereinfacht werden kann. Wie unter Bezug auf Fig. 1 angegeben, ist jede Mikropipette 20 mit einer Druckleitung 26 versehen. Die Druckleitungen 26 aller Mikropipetten sind mit einer Verteilereinrichtung 80 verbunden, die auch am Dispensierkopf 10 angebracht ist. Von der Verteilereinrichtung 80 fuhrt eine Druckversorgungsleitung 81 zu einer ortsfesten Druckeinrichtung (nicht dargestellt) fuhrt. Die Druckeinrichtung ist dazu vorgesehen, Unter- bzw. Überdrucke zur Aufnahme von Trager- flussigkeiten oder zu Reinigungszwecken oder eine Druckstabi- lisierung bereitzustellen, die von der Verteilervorrichtung 80 auf die Druckleitungen 26 (z.B. Gasdruckleitungen) übertragen werden .
Die Verteilereinrichtung 80 kann eine Mehrventilanordnung oder eine Verzweigungsanordnung sein. Bei der Mehrventilanordnung ist eine Ventilanzahl entsprechend der Zahl von Mikropipetten
am Dispensierkopf vorgesehen. Die Mehrventilanordnung erlaubt die Druckansteuerung einzelner Mikropipetten für Beschickungsoder Reinigungszwecke. Bei der Verzweigungsanordnung mundet die Druckversorgungsleitung 81 ohne Ventile in die Vielzahl von Druckleitungen 26. Beim Einsatz der Verzweigungsanordnung wird die Verfahrensweise zur Beschickung oder Reinigung und zur Substanzaufnahme wie folgt realisiert. In einem ersten Schritt wird der Dispensierkopf zu einem Tragerflussigkeitsre- servoir 91 gefahren, so daß die Mikropipettenspitzen simultan in eine Tragerflussigkeit eintauchen. Über die Druckversorgungsleitung 81 wird an alle Mikropipetten em Unterdruck derart angelegt, daß die Tragerflussigkeit m das Tragervolumen 25 jeder der Mikropipetten 20 eingesogen wird. Die Einführung der Tragerflussigkeit erfolgt soweit, daß em Füllstand bei der Hohe H oberhalb der jeweiligen Piezoelemente erreicht wird. Die Tragerflussigkeit hat die Aufgabe, einen an den Piezoelementen gebildeten Druckpuls auf eine m die Mikropi- pettenspitze geladene Wirksubstanz im Ladevolumen 24 zur Abgabe von Mikrotropfen zu übertragen. Dadurch werden in vorteilhafter Weise die erforderlichen Wirksubstanzvolumina m dem Submikroliterbereich verringert.
In einem zweiten Schritt wird der Dispensierkopf 10 zu einer Mikrotiterplatte 92 gefahren und derart auf die Mikrotiter- reservoire oder -volumina 921, 922, 923 ... abgesenkt, daß die Mikropipettenspitzen m die Wirksubstanzen m den Reservoiren eintauchen. Durch erneutes Anlegen eines Unterdrucks über die Druckversorgungsleitung 81 wird die jeweilige Wirksubstanz m d e Mikropipettenspitze in die Ladevolumina 24 gezogen. Durch geeignete Auswahl der Tragerflussigkeit und der Losungsmittels der Wirksubstanz wird eine Vermischung von beiden Flüssigkeiten vermieden.
Anschließend wird der Dispensierkopf 10 zum Reaktionssubstrat 93 gefahren, wo der beabsichtigte kombinatorische Reaktionsab-
lauf durch gezieltes Positionieren von Mikrotropfen in den einzelnen Wirksubstanzen an vorbestimmten Orten auf dem Substrat 93 realisiert wird.
Der Vorteil dieser Verfahrensweise besteht darin, daß mit der Verzweigungsanordnung, die einen sehr einfachen Aufbau aufweist, positions- bzw. pipettenspezifisch am Dispensierkopf Wirksubstanzen aufgenommen werden, ohne daß einzelne Ventile betätigt werden müssen.
Der Dispensierkopf gemäß der Erfindung wird vorzugsweise bei biotechnologischen, gentechnischen oder chemisch-technologischen Verfahren eingesetzt. Die beschriebene Matrix mit senkrecht oder schräg zueinander verlaufenden Reihen kann auch durch eine andere zweidimensionale Anordnung ersetzt werden. Sind die Mikropipetten beispielsweise kreisförmig angeordnet, so erfolgt die Ansteuerung nicht über kartesische x-y- Koordinaten, sondern über Polarkoordinaten. Dann realisieren die Demultiplexerschaltungen jeweils eine Radius- und Winkelauswahl .