WO1998056907A1 - Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof - Google Patents

Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof Download PDF

Info

Publication number
WO1998056907A1
WO1998056907A1 PCT/EP1998/003584 EP9803584W WO9856907A1 WO 1998056907 A1 WO1998056907 A1 WO 1998056907A1 EP 9803584 W EP9803584 W EP 9803584W WO 9856907 A1 WO9856907 A1 WO 9856907A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
polypeptide
parts
acid sequence
functional variant
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/003584
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Marion Elke Hofmann
Horst Domdey
Thomas Henkel
Original Assignee
Medigene Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medigene Aktiengesellschaft filed Critical Medigene Aktiengesellschaft
Priority to AU84385/98A priority Critical patent/AU746190B2/en
Priority to CA002293733A priority patent/CA2293733A1/en
Priority to EP98934959A priority patent/EP1000145A1/en
Priority to JP50164199A priority patent/JP2002509433A/en
Publication of WO1998056907A1 publication Critical patent/WO1998056907A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Cardiac and skeletal muscle-specific nucleic acid its production and use
  • the invention relates to a nucleic acid expressed in the human heart and skeletal muscle, its production and use as a diagnostic agent, medicament and test for identifying functional interactors.
  • the heart is a hollow muscular organ with the task of keeping the blood flow in the vessels moving by changing contraction (systole) and relaxation (diastole) of the atria and chambers.
  • the heart muscle the myocardium
  • the heart muscle is composed of specialized striated muscle cells, between which connective tissue lies.
  • Each cell has a central nucleus, is delimited by the plasma membrane, the sarcolemma, and contains numerous contractile myofibrils that are irregularly separated by sarcoplasm.
  • the contractile substance of the heart is formed by long parallel myofibrils.
  • Each myofibril is divided into several identical structural and functional units, the sarcomeres.
  • the sarcomeres are composed of the thin filaments, which mainly consist of actin, tropomyosin and troponin, and the thick filaments, which mainly consist of myosin.
  • the molecular mechanism of muscle contraction is based on cyclic attachment and detachment of the globular myosin heads from the F-actin filaments.
  • Ca 2+ is released from the sarcoplasmic reticulum, which influences the troponin complex and tropomyosin through an allosteric reaction and so on clears the way for contact of the actin filament with the myosin head.
  • the attachment causes a change in the conformation of the myosin, which pulls the actin filament along it. In order to undo this change in conformation and to return to the beginning of a contraction cycle, ATP is required.
  • the activity of the heart muscle can be temporarily influenced by the need for perfusion, i.e. by nervous and hormonal regulatory measures. H. Circulation needs to be adjusted to the body. In this way, both the contraction force and the contraction speed can be increased. Long-term overuse leads to physiological changes in the heart muscle, which are mainly characterized by an increase in myofibrils (myocyte hypertrophy).
  • the present invention is therefore based on the task of identifying and isolating genes which are at least partly responsible, if not causative, for genetically caused heart diseases.
  • An object of the invention is therefore a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, preferably at least 10 nucleotides, in particular at least 15 nucleotides, especially at least 20 nucleotides, excepted a nucleic acid with the sequence: 1 GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA 61 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC 121 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGTTTCC ATAACCAGAG 181 GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC 241 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC
  • the nucleic acid according to the invention was isolated from a cDNA bank of human heart tissue and sequenced.
  • total RNA was first isolated from a healthy and insufficient heart tissue sample according to standard methods and with the aid of a 3'-anchor-primer mixture, e.g. B. a 5'-T 12 ACN-3 'primer, in which N is any deoxyribonucleotide, and reverse transcriptase rewritten in c-DNA.
  • the cDNA was then based on the so-called differential display method according to Liang and Pardee (Liang, P. & Pardee, A. (1992) Science 257 ' , 967-970) under special PCR conditions using a 3' primer, e.g.
  • a T 12 ACN primer and an arbitrarily selected 5 'decamer primer, e.g. B. a 5 * -CCTTCTACCC-3 'decamer primer.
  • a 321 base pair (bp) long DNA fragment could be amplified, which surprisingly is not present in the healthy heart sample, but is clearly present in the inadequate heart sample.
  • the common methods such as differential display method or subtractive cDNA libraries are associated with the problem of redundancy, underrepresentation and false positive clones.
  • the gene products of poorly expressed genes can only be identified under special conditions.
  • the hit rate is generally very low (10-20%) and, for example, in the differential display method also on the selected PCR conditions, the primer length or, for example, in the production of subtractive banks from the hybridization temperature depends.
  • the entire gene was then isolated from a cDNA library using the DNA fragment found and sequenced.
  • mRNAs from different human tissues were hybridized with the DNA fragment found in a so-called Northern blot and the amount of bound m-RNA was determined, for example, by the radioactive labeling of the DNA fragment.
  • This experiment led to the detection of the corresponding RNA, especially in striated muscles, i.e. cardiac muscle and skeletal muscle tissue, and very weakly in prostate tissue.
  • an increased expression for example an approximately 35% higher expression of the RNAs in insufficient tissue compared to healthy tissue, was detected.
  • RNA species preferentially shows an increased expression in insufficient tissue compared to healthy tissue.
  • the increased expression of the smaller RNA species can be easily recognized, for example, in the Northern blot in the form of a double band (see FIG. 5b).
  • Tropomodulin is known as a polypeptide which has an effect on the formation of the myofibrils and the contractility of the cells in chicken cardiomyocytes (Gregorio et al. (1995) Nature 371, 83-86). This protein binds to tropomyosin on the one hand and to the actin filaments on the other, but is not regulated in its activity itself.
  • the derived polypeptide according to the invention also has some structural features of the tropomodulin, such as. B. a tropomyo- sin binding domain.
  • the polypeptide according to the invention has additional structural features which indicate regulation of the activity of the polypeptide by so-called tyrosine kinases (see FIG. 4).
  • the term “functional variant” in the context of the present invention is therefore understood to mean polypeptides that are functionally related to the polypeptide according to the invention, ie. H. can also be described as a regulatable modulator of the contractility of cardiac muscle cells, in striated muscles, preferably in cardiac muscle, skeletal muscle and / or prostate tissue, especially in cardiac muscle and / or skeletal muscle and in particular in cardiac muscle cells, which have structural features of the tropomodulin, such as B. one or more tropomyosin binding domains, and / or their activity can be regulated by tyrosine kinases.
  • Examples of functional variants are the corresponding polypeptides, which are derived from organisms other than humans, preferably from non-human mammals, such as, for. B. monkeys.
  • polypeptides which have a sequence homology, in particular a sequence identity, of approximately 70%, preferably approximately 80%, in particular approximately 90%, especially approximately 95% of the polypeptide with the amino acid sequence Fig. 4 have.
  • sequence homology in particular a sequence identity
  • polypeptides encoded by a nucleic acid derived from non-heart-specific tissue e.g. B. skeletal muscle tissue is isolated, but after expression in a heart-specific cell has the designated function (s).
  • This also includes deletions of the polypeptide in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids.
  • the first amino acid, methionine may be absent without significantly changing the function of the polypeptide.
  • this also includes fusion proteins that the Contain polypeptides according to the invention described above, the fusion proteins themselves already having the function of an adjustable modulator of the contractility of cardiac muscle cells or being able to get the specific function only after the fusion portion has been split off.
  • this includes fusion proteins with a proportion of in particular non-heart-specific sequences of about 1-200, preferably about 1-150, in particular about 1-100, especially about 1-50 amino acids.
  • non-heart-specific peptide sequences are prokaryotic peptide sequences which, for. B. can be derived from the galactosidase of E. coli.
  • the nucleic acid according to the invention is generally a DNA or RNA, preferably a DNA.
  • a double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question and a single-stranded DNA for use as a probe.
  • a double- or single-stranded DNA with a nucleic acid sequence according to FIG. 1, 2 or 3 and the parts thereof already described above are particularly preferred, the DNA region coding for the polypeptide being particularly preferred. This region begins with the nucleic acids "ATG" coding for methionine at position 89 to "TAG" coding for "amber" (stop) at position 1747.
  • the nucleic acid according to the invention can be chemically determined, for example, using the sequences disclosed in FIGS. 1-3 or using the polypeptide sequence disclosed in FIG. 4, using the genetic code z. B. can be synthesized by the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman. A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4).
  • Another way of getting hold of the nucleic acid according to the invention is to isolate it from a suitable gene bank, for example from a heart-specific gene bank, using a suitable probe (see, for example, SJ Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
  • Suitable as a probe are, for example, single-stranded DNA fragments with a length of approximately 100-1000 nucleotides, preferably with a length of approximately 200-500 nucleotides, in particular with a length of approximately 300-400 nucleotides, the sequence of which from the nucleic acid sequences according to FIG 1-3 can be derived.
  • An example of a probe is the 321 bp DNA fragment according to Example 1, which corresponds to the underlined area in FIG. 1, with which the nucleic acid according to the invention has already been successfully isolated from human heart tissue (see Example 2).
  • the nucleic acid according to the invention is usually contained in a vector, preferably in an expression vector or gene therapy vector.
  • the gene therapy vector contains heart-specific regulatory sequences, such as. B. Troponin C (cTNC) promoter (see e.g. Parmacek, MS et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (26) 15970-15976 and Parmacek, MS et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12 (5), 1967-1976), which is functionally linked to the nucleic acid according to the invention.
  • cTNC B. Troponin C
  • the expression vectors can be prokaryotic or eukaryotic expression vectors.
  • prokaryotic expression vectors are for expression in E. co i z. B. the vectors pGEM or pUC derivatives and for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), for expression in insect cells e.g. B. baculovirus vectors as disclosed in EP-B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721, and for expression in mammalian cells e.g. B.
  • the expression vectors also contain suitable promoters for the respective host cell, e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see e.g. EP-B1-0 127 839) or the early SV40 promoter or LTR promoters e.g. B. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).
  • suitable promoters for the respective host cell e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258,
  • virus vectors preferably adenovirus vectors, in particular replication-deficient adenovirus vectors, or adeno-associated virus vectors, e.g. B. an adeno-associated virus vector consisting exclusively of two inverted terminal repeat sequences (ITR).
  • ITR inverted terminal repeat sequences
  • An adenovirus vector and particularly a replication-deficient adenovirus vector, is particularly preferred for the following reasons.
  • the human adenovirus belongs to the class of double-stranded DNA viruses with a genome of approximately 36 kilobase pairs (Kb).
  • the viral DNA codes for about 2700 different gene products, a distinction being made between early (“early genes'”) and late ⁇ "lote genes”).
  • the "early genes” are divided into four transcriptional units, E1 to E4.
  • the late gene ' products encode the capsid proteins.
  • At least 42 different adenoviruses and subgroups A to F can be distinguished immunologically, all of which are suitable for the present invention.
  • the transcription of the viral genes presupposes the expression of the El region which codes for a transactivator of the adenoviral gene expression.
  • the El gene region is generally shared by a foreign gene own promoter or replaced by the nucleic acid construct according to the invention.
  • the exchange of the El gene region which is a prerequisite for the expression of the downstream adenoviral genes, results in a non-replication-capable adenovirus. These viruses can then only multiply in a cell line that replaces the missing El genes.
  • Replication-deficient adenoviruses are therefore generally by homologous recombination in the so-called 293 cell line (human embryonic
  • Renal cell line which has a copy of the El region stably integrated into the genome.
  • a separate promoter e.g. of the above-mentioned troponin C promoter
  • Genome such as dl327 or dell324 (adenovirus 5), in the helper cell line
  • plaque forming units or plaque forming units
  • the exact insertion site of the nucleic acid according to the invention into the adenoviral genome is not critical.
  • the E1 region or parts thereof, for example the E1A or EIB region is preferably replaced by the nucleic acid according to the invention, especially if the E3 region has also been deleted.
  • the present invention is not limited to the adenoviral vector system, but adeno-associated virus vectors are also particularly suitable in combination with the nucleic acid according to the invention for the following reasons.
  • the AAV virus belongs to the parvovirus family. These are characterized by an icosahedral, non-encapsulated capsid with a diameter of 18 to 30 nm, which contains a linear, single-stranded DNA of about 5 kb. A co-infection of the host cell with helper viruses is required for an efficient multiplication of AAV. Suitable aids are, for example, adenoviruses (Ad5 or Ad2), herpes viruses and vaccinia viruses (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129).
  • AAV In the absence of a helper virus, AAV goes into a latency state, whereby the virus genome is able to integrate stably into the host cell genome.
  • the ability of AAV to integrate into the host genome makes it particularly interesting as a transduction vector for mammalian cells.
  • the two approximately 145 bp long inverted terminal repeat sequences (ITR: inverted terminal repeats; see, for example, WO 95/23867) are generally sufficient for the vector functions. They carry the signals necessary for replication in "eis”.
  • ITR inverted terminal repeats
  • a cell-free lysate is produced, which contains adenoviruses in addition to the recombinant AAV particles.
  • the adenoviruses can advantageously by heating to 56 ° C or by banding in Cesium chloride gradients are removed. With this cotransfection method, rAAV titers of 10 5 to 10 6 IU / ml can be achieved. Contamination by wild-type viruses is below the detection limit if the packaging plasmid and the vector plasmid have no overlapping sequences (Samulski, RJ (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).
  • AAV can transfer the nucleic acid according to the invention into somatic body cells into resting, differentiated cells, which is particularly advantageous for gene therapy of the heart. Long-term gene expression in vivo can also be ensured by the integration capability mentioned, which in turn is particularly advantageous. Another advantage of AAV is that the virus is not pathogenic to humans and is relatively stable in vivo.
  • the nucleic acid according to the invention is cloned into the AAV vector or parts thereof by methods known to the person skilled in the art, such as those e.g. in WO 95/23867, by Chiorini, J.A. et al. (1995), Human Gene Therapy 6, 1531-1541 or Kotin, R.M. (1994), Human Gene Therapy 5, 793-801.
  • nucleic acid according to the invention can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes, since this enables a very high transfection efficiency, in particular of cardiac muscle cells, to be achieved (Feigner, PL et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sei USA 84 » 7413-7417).
  • lipofection small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes.
  • Feigner et al. small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA
  • DOGS DOGS
  • TRANSFECTAM Diocadadecylamidoglycylspermin
  • the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide includes one or more non-coding sequences including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the polypeptide, and / or one contains polyA sequence, in particular the naturally occurring polyA sequence or an SV40 virus polyA sequence, especially at the 3 'end of the gene, since this can stabilize the mRNA in the heart muscle cell (Jackson, RJ (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter, RD et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).
  • polypeptide itself with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, preferably with at least 12 amino acids, in particular with at least 15 amino acids and especially with at least 164 amino acids , except a polypeptide with the sequence: PTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQ
  • the polypeptide is produced, for example, by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable expression system, as already described above, using methods which are generally known to the person skilled in the art.
  • suitable host cells are, for example, the E. coli strains DH5, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, the insect cell line Lepidopteran, e.g. B. from Spodoptera frugiperda, or the animal cells COS. Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available.
  • the parts of the polypeptide mentioned can also be synthesized using classic synthesis (Merrifield technique). They are particularly suitable for obtaining antisera, with the aid of which suitable gene expression banks can be searched in order to arrive at further functional variants of the polypeptide according to the invention.
  • Another object of the present invention therefore also relates to antibodies which contain the polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, preferably with at least 12 amino acids, in particular with at least 15 amino acids and especially react specifically with at least 164 amino acids, the above-mentioned parts of the polypeptide either being themselves immunogenic or by coupling to suitable carriers, such as. B. bovine serum albumin, immunogenic or can be increased in their immunogenicity.
  • suitable carriers such as. B. bovine serum albumin, immunogenic or can be increased in their immunogenicity.
  • the antibodies are either polyclonal or monoclonal.
  • the preparation which is also an object of the present invention, is carried out, for example, according to generally known methods by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the said polypeptide or the parts thereof, optionally in the presence of, for. B. Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see e.g. Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349).
  • B. Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels see e.g. Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349.
  • the polyclonal antibodies formed in the animal due to an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and z. B. clean over column chromatography.
  • the antibodies according to the invention specifically recognized the corresponding protein of approximately 80 kD in extracts from human heart tissue.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, using the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).
  • the present invention also relates to a medicament which comprises a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 8 nucleotides or a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or contains a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 6 amino acids and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries and a method for producing a medicament for the treatment of heart diseases, in particular heart failure, in which a nucleic acid or formulating said polypeptide with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • nucleic acid fragments as a therapeutic agent is the use of DNA fragments in the form of antisense oligonucleotides (Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4) .
  • a drug is particularly suitable which contains the nucleic acid mentioned in the naked form or in the form of one of the gene therapy vectors described above or in a form complexed with liposomes.
  • the pharmaceutical carrier is, for example, a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0-8.0, preferably approximately 6.8-7.8, in particular approximately 7.4 and / or an osmolarity of approximately 200-400 milliosmol / liter, preferably from about 290-310 milliosmol / liter.
  • the pharmaceutical carrier can contain suitable stabilizers, such as e.g. B. nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
  • the administration of the nucleic acid mentioned, optionally in the form of the virus vectors described in more detail above or as liposome complexes, is usually carried out intravenously, for. B. with the help of a catheter.
  • a catheter for example, direct infusion of the nucleic acid according to the invention into the patient's coronary arteries (so-called "Percutaneous Coronary Gene Transfer", PCGT) is advantageous, in particular in the form of recombinant adenovirus vectors or adeno-associated virus vectors.
  • Administration with the aid of a balloon catheter is particularly preferred, since this means that transfection not only to the heart, but also to the injection site within the heart can be limited (see e.g. Feldman, LJ et al. (1994) JACC 235A, 906-934).
  • polypeptide itself intravenously or with the aid of a catheter or balloon catheter, if appropriate with suitable additives or auxiliaries, such as e.g. to administer physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors etc. in order to influence the function of the heart immediately and immediately.
  • suitable additives or auxiliaries such as e.g. to administer physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors etc. in order to influence the function of the heart immediately and immediately.
  • Another object of the present invention is also a diagnostic agent containing a nucleic acid, a polypeptide or Antikö ⁇ er according to the present invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries and a method for producing a diagnostic agent for the diagnosis of heart diseases, in particular heart failure, in which a nucleic acid Suitable additives or auxiliaries are added to the polypeptide or antibody according to the present invention.
  • a diagnostic on the basis of the polymerase chain reaction (PCR diagnostics, for example according to EP-0 200 362) or a Northern blot, as in Example 3 using the 321 according to the invention, can be carried out using the nucleic acid mentioned bp DNA fragment shown as a probe, are prepared. These tests are based on the specific hybridization of the nucleic acids mentioned with the complementary counter strand, usually the corresponding mRNA.
  • the nucleic acid can also be modified, such as. B. described in EP 0 063 879.
  • a DNA fragment, in particular the DNA fragment described in Example 1, is preferably prepared using suitable reagents, e.g. B.
  • RNA preferably previously on suitable membranes from z. B. cellulose or nylon was incubated. It is also advantageous to size the isolated RNA prior to hybridization and binding to a membrane, e.g. B. by means of agarose gel electrophoresis. With the same amount of RNA examined from each tissue sample, the amount of mRNA that was specifically labeled by the probe can thus be determined.
  • tissue sample of the heart can also be specifically measured in vitro for the expression strength of the corresponding gene in order to be able to reliably diagnose a possible heart failure (see Example 1).
  • a cDNA with a sequence according to FIG. 1 is particularly suitable for the diagnosis of a possible heart failure (see example 2).
  • Another diagnostic agent contains the polypeptide according to the present invention or the immunogenic parts thereof described in more detail above.
  • the polypeptide or parts thereof, which are preferably attached to a solid phase, e.g. B. are bound from nitrocellulose or nylon, for example, with the body fluid to be examined, for. As blood, are brought into contact in vitro so as to be able to react, for example, with autoimmune antibodies.
  • the antibody-peptide complex can then be detected, for example, using labeled anti-human IgG or anti-human IgM antibodies.
  • the label is, for example, an enzyme, such as peroxidase, that catalyzes a color reaction. The presence and the amount of autoimmune antibodies present can thus be easily and quickly detected via the color reaction.
  • Another diagnostic contains the antibodies according to the invention itself.
  • the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as already described above.
  • the specific antibody-peptide complex can thus be detected easily and just as quickly via an enzymatic color reaction.
  • Another object of the present invention relates to a test for identifying functional interactors containing a nucleic acid of the invention coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 8 nucleotides, a polypeptide with an amino acid sequence according to 4 or a functional variant thereof, and the above-mentioned parts thereof with at least 6 amino acids or the antibodies according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries.
  • a suitable test for identifying functional interactors is e.g. B. the so-called “two-Hyb ⁇ d system” (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292).
  • a cell for example a yeast cell
  • one or more expression vectors which express a fusion protein which comprises a polypeptide according to the present invention and a DNA binding domain of a known protein, for example from Gal4 or LexA from E . coli, and / or expresses a fusion protein which contains an unknown polypeptide and a transcription activation domain, for example of Gal4, He ⁇ es Virus VP16 or B42.
  • the cell contains a reporter gene, for example the lacZ gene from E. coli, "green fluorescence protein” or the amino acid biosynthetic genes of the yeast His3 or Leu2, which is characterized by regulatory sequences, such as B.
  • the unknown polypeptide is encoded, for example, by a DNA fragment that originates from a gene bank, for example from a human tissue-specific gene bank.
  • a cDNA library is immediately produced in yeast using the expression vectors described, so that the test can be carried out immediately thereafter.
  • a nucleic acid according to the present invention is cloned in functional unit to the nucleic acid coding for the LexA-DNA binding domain, so that a fusion protein from the polypeptide according to the invention and the LexA-DNA binding domain is expressed in the transformed yeast .
  • cDNA fragments from a cDNA library are cloned in a functional unit to the nucleic acid coding for the Gal4 transcription activation domain, so that a fusion protein from an unknown polypeptide and the Gal4 transcription activation domain in the transformed yeast is expressed.
  • the yeast transformed with both expression vectors which is for example Leu2 " , additionally contains a nucleic acid which codes for Leu2 and is controlled by the LexA promoter / operator.
  • Gal4 binds -Transcription activation domain via the LexA DNA binding domain to the LexA promoter / operator, whereby this is activated and the Leu2 gene is expressed.
  • the Leu2 " yeast can grow on minimal medium which does not contain leucine .
  • the activation of the transcription can be demonstrated by the fact that blue or green fluorescent forming colonies.
  • the blue or fluorescent staining can also be easily done in a spectrophotometer e.g. B. quantify at 585 nm in the event of a blue color.
  • expression gene banks can be easily and quickly searched for polypeptides that interact with a polypeptide according to the present invention.
  • the new polypeptides found can then be isolated and further characterized.
  • Another application of the "two-hybrid system” is to influence the interaction between a polypeptide according to the present invention and a known or unknown polypeptide by other substances, such as. B. chemical compounds.
  • other substances such as. B. chemical compounds.
  • the present invention is therefore not only limited to a method for finding polypeptide-like interactors, but also extends to a method for finding substances which can interact with the protein-protein complex described above.
  • Such polypeptide-like as well as chemical interactors are therefore referred to as functional interactors in the sense of the present invention.
  • the surprising advantage of the present invention is thus that heart diseases, in particular heart failure, can be diagnosed and treated specifically and safely with the aid of the objects according to the invention.
  • heart diseases in particular heart failure
  • the functional interactors that are easy to track down with the test methods described are so advantageous because, with the help of them, in the form of suitable pharmaceuticals
  • Activity of the polypeptide according to the invention in its natural environment in the heart muscle and thus also the contractility of the heart muscle cells can be influenced in a targeted manner, in particular since the activity of this polypeptide can be regulated, as already described in more detail above.
  • Fig. 1 shows a 1936 nucleotide long heart-specific DNA sequence. The region coding for the corresponding polypeptide is shown in bold. The DNA fragment from Example 1 is underlined.
  • FIG. 2 shows a 2080 nucleotide-long heart-specific DNA sequence which has an extension at the 5 ′ end of the DNA sequence from FIG. 1.
  • the area coding for the corresponding polypeptide is again shown in bold.
  • FIG. 3 shows a 2268 nucleotide-long heart-specific DNA sequence which has an extension at the 5 'end of the DNA sequence from FIG. 1 or FIG. 2.
  • the area coding for the corresponding polypeptide is also shown in bold.
  • FIG. 4 shows a 552 amino acid long polypeptide sequence which is encoded by one of the DNA sequences according to FIGS. 1-3. The areas homologous to human tropomodulin are shown in bold. The sequence motifs Fe that indicate regulation of the polypeptide by tyrosine kinase signal transduction pathways are underlined.
  • FIGS. 5a and 5b show Northern blots of mRNAs which correspond to the nucleic acid sequences according to FIGS. 1-3, for the detection of expression in various human tissues (FIG. 5a) and for the detection of expression in healthy and insufficient human heart tissue (Fig. 5b).
  • a cDNA aliquot was then subjected to a 20 ⁇ l PCR reaction in 1 ⁇ PCR buffer (Perkin-Elmer), which in addition to 1 ⁇ M 3 ′ primer T 12 AC and 1 ⁇ M 5 ′ decamer primer (5 ′ -CCTTCTACCC-3 10 ⁇ Ci ⁇ -P 33 -dCTP, 2 ⁇ M dNTP-Mix and 1 U AmpliTaq (Perkin Elmer)
  • the mixture was first at 94 ° C. for 1 min, then with 40 cycles incubated for 30 s 94 ° C, 2 min 40 ° C and 30 s 72 ° C and finally 10 min at 72 ° C.
  • the resulting DNA fragment mixture was then separated on a 6% polyacrylamide gel and autoradiographed.
  • a 321 bp DNA fragment is thus represented, which is not present in the healthy heart sample, but is clearly present in the insufficient heart sample.
  • This fragment was then cut out of the gel using the X-ray film and reamplified by means of PCR under the conditions already described.
  • the fragment obtained was then cloned into an appropriate vector and the DNA sequence was determined.
  • Such a fragment contains the nucleotides 1627-1936 of the sequence according to claim 1 and the 12 thymine nucleotides from the 3 'anchor primer.
  • ⁇ -P 32 -dCTP-labeled DNA fragment from Example 1 which comprises the nucleotides from position 1627-1936 according to FIG. 1
  • a plaque hybridization was carried out with a cDNA library from cardiac tissue according to standard conditions (see Sambrook, J. , Frisch, EF & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, chap. 8-10).
  • the cDNAs found were then isolated and sequenced. The sequences are shown in Figures 1-3. It was found that the cDNA with the sequence according to FIG. 1 was more likely to be isolated from insufficient heart tissue than the cDNA with the sequence according to FIG. 2 or 3, which was more likely to be isolated from healthy heart tissue.
  • 2400 bp was strong in cardiac tissue and skeletal muscle, very weak in prostate tissue and not in leukocytes, colon, small intestine, ovary, testes, thymus , Spleen, kidney, liver, lung, placenta and brain tissue hybridized (Fig. 5a).
  • RNA was isolated from various human heart tissue samples (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159). Subsequently, 10 ⁇ g RNA were separated using a 1% formaldehyde agarose gel and transferred to a charged nylon membrane using the capillary method (Zeta-Probe GT BioRad # 162-0197). The membrane was briefly washed with 2 x SSC and then baked at 80 ° C for 30 minutes. The membranes were incubated for at least 1 hour with prehybridization solution (0.5 M Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 7% SDS) at 65 ° C.
  • prehybridization solution 0.5 M Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 7% SDS
  • the solution was then exchanged for a fresh solution and the radioactive, heat-denatured probe was added. Hybridization was carried out at 65 ° C for 15 hours.
  • the membranes were then initially at 40 ° C. for 15 hours at 65 ° C. mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 5% SDS, then 2 x 30 minutes at 65 ° C with 40 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 1% SDS washed and then autoradiographed. It was found that various RNA species were separated in 1% agarose gels, which had a size of approximately 2200 to approximately 2400 bp.
  • RNA species correspond well with the sizes of the three cDNAs found, including an average polyA tail of 150 bp in length (see FIGS. 1-3).
  • the smallest RNA species in particular was more clearly detectable in the diseased tissue than in the healthy tissue.
  • CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
  • AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA
  • ATGGAACTGT 540 AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600
  • AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740
  • CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
  • GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560
  • AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740
  • CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
  • GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560
  • AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740

Abstract

The invention relates to a nucleic acid which is specific to the heart and skeleton muscle, to the production and use thereof as a diagnostic agent, a medicament and as a test for identifying functional interactors.

Description

Herz- und Skelettmuskel-spezifische Nukleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung Cardiac and skeletal muscle-specific nucleic acid, its production and use
Die Erfindung betrifft eine im menschlichen Herz- und Skelettmuskel ex- primierte Nukleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung als Diagnostikum, Arzneimittel und Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.The invention relates to a nucleic acid expressed in the human heart and skeletal muscle, its production and use as a diagnostic agent, medicament and test for identifying functional interactors.
Das Herz ist ein muskuläres Hohlorgan mit der Aufgabe, durch wechselnde Kontraktion (Systole) und Erschlaffung (Diastole) von Vorhöfen und Kammern den Blutstrom in den Gefäßen in Bewegung zu halten.The heart is a hollow muscular organ with the task of keeping the blood flow in the vessels moving by changing contraction (systole) and relaxation (diastole) of the atria and chambers.
Der Herzmuskel, das Myokard, setzt sich aus spezialisierten quergestreiften Muskelzellen zusammen, zwischen denen Bindegewebe liegt. Jede Zelle besitzt einen zentralen Kern, wird von der Plasmamembran, dem Sarko- lemm, begrenzt und enthält zahlreiche kontraktile Myofibrillen, die unregel- mäßig durch Sarkoplasma getrennt sind. Die kontraktile Substanz des Herzens bilden lange parallele Myofibrillen. Jede Myofibrille unterteilt sich in mehrere gleiche strukturelle und funktioneile Einheiten, die Sarkomere. Die Sarkomere wiederum setzen sich aus den dünnen Filamenten, die hauptsächlich aus Aktin, Tropomyosin und Troponin bestehen und den dicken Fila- menten zusammen, die hauptsächlich aus Myosin bestehen.The heart muscle, the myocardium, is composed of specialized striated muscle cells, between which connective tissue lies. Each cell has a central nucleus, is delimited by the plasma membrane, the sarcolemma, and contains numerous contractile myofibrils that are irregularly separated by sarcoplasm. The contractile substance of the heart is formed by long parallel myofibrils. Each myofibril is divided into several identical structural and functional units, the sarcomeres. The sarcomeres are composed of the thin filaments, which mainly consist of actin, tropomyosin and troponin, and the thick filaments, which mainly consist of myosin.
Der molekulare Mechanismus der Muskelkontraktion beruht auf einer zyklischen Anheftung und Ablösung der globulären Myosinköpfe von den F- Aktinfilamenten. Bei elektrischer Stimulation des Herzmuskels wird Ca2 + aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzt, welches durch eine allosteri- sche Reaktion den Troponin-Komplex und Tropomyosin beeinflußt und so den Weg frei macht für einen Kontakt des Aktinfilamentes mit dem Myosin- kopf. Die Anheftung bewirkt eine Konformationsänderung des Myosins, welches so das Aktinfilament an sich entlang zieht. Um diese Konformationsänderung rückgängig zu machen und an den Anfang eines Kontraktions- zyklus zurückzukehren, wird ATP benötigt.The molecular mechanism of muscle contraction is based on cyclic attachment and detachment of the globular myosin heads from the F-actin filaments. With electrical stimulation of the heart muscle, Ca 2+ is released from the sarcoplasmic reticulum, which influences the troponin complex and tropomyosin through an allosteric reaction and so on clears the way for contact of the actin filament with the myosin head. The attachment causes a change in the conformation of the myosin, which pulls the actin filament along it. In order to undo this change in conformation and to return to the beginning of a contraction cycle, ATP is required.
Die Aktivität des Herzmuskels kann durch nervöse und hormoneile Regulationsmaßnahmen kurzfristig an den jeweiligen Perfusionsbedarf, d. h. Durchblutungsbedarf, des Körpers angepaßt werden. So können sowohl die Kon- traktionskraft als auch die Kontraktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Bei langfristiger Überbeanspruchung kommt es zu physiologischen Umbauvorgängen im Herzmuskel, die hauptsächlich durch eine Vermehrung der Myofibrillen charakterisiert sind (Myozytenhypertrophie).The activity of the heart muscle can be temporarily influenced by the need for perfusion, i.e. by nervous and hormonal regulatory measures. H. Circulation needs to be adjusted to the body. In this way, both the contraction force and the contraction speed can be increased. Long-term overuse leads to physiological changes in the heart muscle, which are mainly characterized by an increase in myofibrils (myocyte hypertrophy).
Bei Schädigungen des Herzmuskels führen oft die ursprünglich physiologischen Anpassungsmechanismen langfristig zu pathophysiologischen Zuständen, die in chronische Herzinsuffizienz, d. h. Herzschwäche, münden und meistens mit akutem Herzversagen enden. Bei schwerer chronischer Insuffizienz kann das Herz nicht mehr adäquat auf veränderte Leistungsanforderungen reagieren, selbst geringe körperliche Verrichtungen führen zu Erschöpfung und Atemnot.In the case of damage to the heart muscle, the originally physiological adaptation mechanisms often lead to pathophysiological conditions in the long term, which result in chronic heart failure, i.e. H. Heart failure, mouth and usually end with acute heart failure. With severe chronic insufficiency, the heart can no longer respond adequately to changes in performance requirements, even minor physical activity leads to exhaustion and shortness of breath.
Schädigungen des Herzmuskels resultieren aus Ischämie, d. h. Blutleere, verursacht durch Koronarerkrankungen, bakteriellen oder viralen Infektionen, Toxinen, metabolischen Abnormalitäten, Autoimmunerkrankungen oder genetischen Defekten. Therapeutische Maßnahmen richten sich zur Zeit auf eine Stärkung der Kontraktionkraft und eine Kontrolle der kompensatorischen neuronalen und hormonellen Kompensationsmechanismen. Trotz dieser Behandlung ist die Sterblichkeit dieser Erkrankung nach wie vor hoch (35-50% innerhalb der ersten 5 Jahre nach Diagnose). Herzinsuffizienz ist die Haupt- todesursache weltweit. Die einzige Kausaltherapie stellt die Herztransplantation dar.Damage to the heart muscle results from ischemia, ie anemia, caused by coronary diseases, bacterial or viral infections, toxins, metabolic abnormalities, autoimmune diseases or genetic defects. Therapeutic measures are currently aimed at strengthening the contraction force and controlling the compensatory neuronal and hormonal compensation mechanisms. Despite this treatment, the mortality rate of this disease is still high (35-50% within the first 5 years after diagnosis). Heart failure is the main cause of death worldwide. The only causal therapy is heart transplantation.
Die molekularen Veränderungen bei chronischer Herzinsuffizienz sind nur ungenügend bekannt. Insbesondere die genetischen Veränderungen, die der Herzinsuffizienz zugrundeliegen, sind weitgehend unbekannt. Auch die Frage, warum sekundäre Schädigungen durch Toxine oder Viren bei manchen Menschen zur Herzinsuffizienz führen, jedoch bei anderen nicht, bleibt unbeantwortet.The molecular changes in chronic heart failure are not well known. In particular, the genetic changes that underlie heart failure are largely unknown. The question of why secondary toxin or virus damage leads to heart failure in some people but not in others remains unanswered.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Gene zu identifizieren und zu isolieren, die für genetisch bedingte Herzerkrankungen zumindest mitverantwortlich, wenn nicht sogar ursächlich sind.The present invention is therefore based on the task of identifying and isolating genes which are at least partly responsible, if not causative, for genetically caused heart diseases.
Es wurde nun überraschenderweise in einer cDNA-Bank des menschlichen Herzgewebes ein Gen gefunden, das im insuffizienten Herzgewebe stärker exprimiert wird als im gesunden Herzgewebe und somit in einem kausalen Zusammenhang mit einer genetisch bedingten Herzinsuffizienz steht. Zu diesem Gen gibt es bereits ein, wenn auch fehlerhaftes, sogenanntes EST (expressed sequence tag), dem jedoch keinerlei Funktion zugeordnet werden kann (Tanaka, T. et al. (1996) Genomics, 35, 231-235; EMBL AC:CO4498; Klon 3NHC3467).Surprisingly, a gene has now been found in a cDNA library of human heart tissue which is expressed more strongly in insufficient heart tissue than in healthy heart tissue and is therefore causally related to a genetically determined heart failure. There is already an albeit incorrect, so-called EST (expressed sequence tag), which, however, cannot be assigned any function (Tanaka, T. et al. (1996) Genomics, 35, 231-235; EMBL AC: CO4498 ; Clone 3NHC3467).
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktioneile Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 10 Nukleotiden, insbesondere mindestens 15 Nukleotiden, vor allem mindestens 20 Nukleotiden, ausgenommen eine Nukleinsäure mit der Sequenz: 1 GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA 61 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC 121 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGTTTCC ATAACCAGAG 181 GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC 241 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC worin N gleich A, T, G oder C bedeutet.An object of the invention is therefore a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, preferably at least 10 nucleotides, in particular at least 15 nucleotides, especially at least 20 nucleotides, excepted a nucleic acid with the sequence: 1 GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA 61 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC 121 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGTTTCC ATAACCAGAG 181 GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC 241 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC wherein N is A, T, G or C.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure wurde aus einer cDNA-Bank des menschlichen Herzgewebes isoliert und sequenziert. Hierzu wurde zuerst aus einer gesunden und insuffizienten Herzgewebe-Probe Gesamt-RNA nach Standardmethoden isoliert und mit Hilfe eines 3'-Anker-Primergemisches, z. B. eines 5'-T12ACN-3' Primers, bei dem N ein beliebiges Deoxyribonukleo- tid bedeutet, und reverser Transkriptase in c-DNA umgeschrieben. Die cDNA wurde anschießend in Anlehnung an die sogenannte Differential Display Methode nach Liang und Pardee (Liang, P. & Pardee, A. (1992) Science 257 ', 967-970) unter speziellen PCR-Bedingungen mit Hilfe eines 3'- Primers, z. B. eines T12ACN-Primers, und eines willkürlich ausgewählten 5'-Dekamer-Primer, z. B. eines 5*-CCTTCTACCC-3'-Dekamer-Primers, am- plifiziert. Hierbei konnte ein 321 Basenpaar (bp)-langes DNA-Fragment amplifiziert werden, das überraschenderweise nicht in der gesunden Herzprobe, jedoch deutlich in der insuffizienten Herzprobe vorhanden ist. Dies war deshalb so überraschend, da die gängigen Methoden wie Differential Display Methode oder auch substraktive cDNA-Genbanken mit dem Problem der Redundanz, der Unterrepräsentation und der falsch positiven Klone behaftet sind. Insbesondere die Genprodukte schwach exprimierter Gene können nur unter speziellen Bedingungen identifiziert werden. Daher ist es auch nicht verwunderlich, daß die Trefferquote im allgemeinen sehr gering (10-20%) ist und beispielsweise bei der Differentiellen Display Methode auch von den gewählten PCR-Bedingungen, der Primer-Länge oder beispielsweise bei der Herstellung subtraktiver Banken von der Hybridisierungstemperatur abhängt. Anschließend wurde das gesamte Gen aus einer cDNA-Genbank mit Hilfe des gefundenen DNA-Fragmentes isoliert und sequenziert.The nucleic acid according to the invention was isolated from a cDNA bank of human heart tissue and sequenced. For this purpose, total RNA was first isolated from a healthy and insufficient heart tissue sample according to standard methods and with the aid of a 3'-anchor-primer mixture, e.g. B. a 5'-T 12 ACN-3 'primer, in which N is any deoxyribonucleotide, and reverse transcriptase rewritten in c-DNA. The cDNA was then based on the so-called differential display method according to Liang and Pardee (Liang, P. & Pardee, A. (1992) Science 257 ' , 967-970) under special PCR conditions using a 3' primer, e.g. A T 12 ACN primer, and an arbitrarily selected 5 'decamer primer, e.g. B. a 5 * -CCTTCTACCC-3 'decamer primer. Here, a 321 base pair (bp) long DNA fragment could be amplified, which surprisingly is not present in the healthy heart sample, but is clearly present in the inadequate heart sample. This was so surprising because the common methods such as differential display method or subtractive cDNA libraries are associated with the problem of redundancy, underrepresentation and false positive clones. In particular, the gene products of poorly expressed genes can only be identified under special conditions. It is therefore not surprising that the hit rate is generally very low (10-20%) and, for example, in the differential display method also on the selected PCR conditions, the primer length or, for example, in the production of subtractive banks from the hybridization temperature depends. The entire gene was then isolated from a cDNA library using the DNA fragment found and sequenced.
In jedem Fall ist es notwendig, durch weitere Methoden aufzuklären, ob die gefundene cDNA einem aktiven und/oder gewebespezifischen Gen zugeordnet werden kann. Daher wurden mRNAs aus verschiedenen menschlichen Geweben mit dem gefundenen DNA-Fragment in einem sogenannten Northern-Blot hybridisiert und die Menge an gebundener m-RNA beispielsweise über die radioaktive Markierung des DNA-Fragments bestimmt. Dieses Experiment führte zu einem Nachweis der korrespondierenden RNA vor allem in quergestreifter Muskulatur, also Herzmuskel- und Skelettmuskelgewebe sowie sehr schwach in Prostatagewebe. In einem weiteren Vergleichsexperiment zwischen gesundem und insuffizientem Herzgewebe wurde eine erhöhte Expression, beispielsweise eine um ca. 35 % erhöhte Expression der RNAs in insuffizien- tem Gewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe nachgewiesen. Insbesondere konnte nachgewiesen werden, daß eine kleinere RNA-Spezies bevorzugt in insuffizientem Gewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe eine erhöhte Expression aufweist. Die erhöhte Expression der kleineren RNA-Spezies ist beispielsweise im Northern-Blot in Form einer Doppelbande leicht zu erken- nen (siehe Fig. 5b).In any case, it is necessary to clarify by further methods whether the cDNA found can be assigned to an active and / or tissue-specific gene. Therefore, mRNAs from different human tissues were hybridized with the DNA fragment found in a so-called Northern blot and the amount of bound m-RNA was determined, for example, by the radioactive labeling of the DNA fragment. This experiment led to the detection of the corresponding RNA, especially in striated muscles, i.e. cardiac muscle and skeletal muscle tissue, and very weakly in prostate tissue. In a further comparison experiment between healthy and insufficient heart tissue, an increased expression, for example an approximately 35% higher expression of the RNAs in insufficient tissue compared to healthy tissue, was detected. In particular, it could be demonstrated that a smaller RNA species preferentially shows an increased expression in insufficient tissue compared to healthy tissue. The increased expression of the smaller RNA species can be easily recognized, for example, in the Northern blot in the form of a double band (see FIG. 5b).
Ein Vergleich der abgeleiteten Polypeptidsequenz mit einer Proteindatenbank ergab zudem eine gewisse Verwandtschaft (Homologie) mit dem Protein Tropomodulin (siehe Fig. 4). Tropomodulin ist als ein Polypeptid bekannt, das in Hühnchen-Kardiomyozyten Einfluß auf die Ausbildung der Myofibrillen und die Kontraktionsfähigkeit der Zellen hat (Gregorio et al. (1995) Nature 371, 83-86). Dieses Protein bindet zum einen an Tropomyosin und zum anderen an die Actin-Filamente, wird aber selbst nicht in seiner Aktivität reguliert. Das abgeleitete erfindungsgemäße Polypeptid weist ebenso einige Strukturmerkmale des Tropomodulins auf, wie z. B. eine Tropomyo- sin-Bindedomäne. Im Gegensatz zu Tropomodulin besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid zusätzliche Strukturmerkmale, die auf eine Regulation der Aktivität des Polypeptids durch sogenannte Tyrosinkinasen hinweisen (siehe Fig. 4).A comparison of the derived polypeptide sequence with a protein database also revealed a certain relationship (homology) with the protein tropomodulin (see FIG. 4). Tropomodulin is known as a polypeptide which has an effect on the formation of the myofibrils and the contractility of the cells in chicken cardiomyocytes (Gregorio et al. (1995) Nature 371, 83-86). This protein binds to tropomyosin on the one hand and to the actin filaments on the other, but is not regulated in its activity itself. The derived polypeptide according to the invention also has some structural features of the tropomodulin, such as. B. a tropomyo- sin binding domain. In contrast to tropomodulin, the polypeptide according to the invention has additional structural features which indicate regulation of the activity of the polypeptide by so-called tyrosine kinases (see FIG. 4).
Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man daher Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verwandt sind, d. h. ebenso als ein regulierbarer Modulator der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen bezeichnet werden können, in quergestreifter Muskulatur, vorzugsweise in Herzmuskel-, Skelettmuskel- und/oder Prostatagewebe, vor allem in Herzmuskel- und/oder Skelettmuskel und insbesondere in Herzmuskelzellen exprimiert werden, Strukturmerkmale des Tropomodulins aufweisen, wie z. B. eine oder mehrere Tropomyosin-Bindedomänen, und/oder deren Aktivität durch Tyrosinkinasen reguliert werden können. Beispiele funktioneller Varianten sind die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organismen als dem Menschen, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren, wie z. B. Affen, stammen.The term “functional variant” in the context of the present invention is therefore understood to mean polypeptides that are functionally related to the polypeptide according to the invention, ie. H. can also be described as a regulatable modulator of the contractility of cardiac muscle cells, in striated muscles, preferably in cardiac muscle, skeletal muscle and / or prostate tissue, especially in cardiac muscle and / or skeletal muscle and in particular in cardiac muscle cells, which have structural features of the tropomodulin, such as B. one or more tropomyosin binding domains, and / or their activity can be regulated by tyrosine kinases. Examples of functional variants are the corresponding polypeptides, which are derived from organisms other than humans, preferably from non-human mammals, such as, for. B. monkeys.
Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Se- quenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugsweise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 haben. Darunter zählen beispielsweise Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-herzspezifischem Gewebe, z. B. Skelettmuskelgewebe, isoliert wird, jedoch nach Expression in einer herzspezifischen Zelle die bezeichnete Funktion(en) besitzt. Ferner zählen hierzu auch Deletionen des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids we- sentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines regulierbaren Modulators der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen haben oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht- herzspezifischen Sequenzen von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 Aminosäuren. Beispiele von nicht- herzspezifischen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können.In a broader sense, this also includes polypeptides which have a sequence homology, in particular a sequence identity, of approximately 70%, preferably approximately 80%, in particular approximately 90%, especially approximately 95% of the polypeptide with the amino acid sequence Fig. 4 have. These include, for example, polypeptides encoded by a nucleic acid derived from non-heart-specific tissue, e.g. B. skeletal muscle tissue is isolated, but after expression in a heart-specific cell has the designated function (s). This also includes deletions of the polypeptide in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids. For example, the first amino acid, methionine, may be absent without significantly changing the function of the polypeptide. In addition, this also includes fusion proteins that the Contain polypeptides according to the invention described above, the fusion proteins themselves already having the function of an adjustable modulator of the contractility of cardiac muscle cells or being able to get the specific function only after the fusion portion has been split off. Above all, this includes fusion proteins with a proportion of in particular non-heart-specific sequences of about 1-200, preferably about 1-150, in particular about 1-100, especially about 1-50 amino acids. Examples of non-heart-specific peptide sequences are prokaryotic peptide sequences which, for. B. can be derived from the galactosidase of E. coli.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA. Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt und für die Verwendung als Sonde eine einzelsträngige DNA. Besonders bevorzugt ist eine doppel- oder einzelsträngige DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1, 2 oder 3 und die oben bereits näher beschriebenen Teile davon, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit den Nukleinsäuren "ATG" kodierend für Methio- nin an der Position 89 bis "TAG" kodierend für "Amber" (Stop) an der Position 1747.The nucleic acid according to the invention is generally a DNA or RNA, preferably a DNA. A double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question and a single-stranded DNA for use as a probe. A double- or single-stranded DNA with a nucleic acid sequence according to FIG. 1, 2 or 3 and the parts thereof already described above are particularly preferred, the DNA region coding for the polypeptide being particularly preferred. This region begins with the nucleic acids "ATG" coding for methionine at position 89 to "TAG" coding for "amber" (stop) at position 1747.
Die erfmdungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise chemisch anhand der in Fig. 1-3 offenbarten Sequenzen oder anhand der in Fig. 4 offenbarten Polypeptidsequenz unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman. A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4). Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer herzspezifischen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde (siehe z. B. J. Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd edn. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträngige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200- 500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Nukleinsäuresequenzen gemäß Fig. 1-3 abgeleitet werden kann. Ein Beispiel einer Sonde ist das 321 bp große DNA-Fragment gemäß Beispiel 1, das dem unterstrichenen Bereich in Fig. 1 entspricht, mit dem bereits erfolgreich die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus humanem Herzgewebe isoliert wurde (siehe Beispiel 2).The nucleic acid according to the invention can be chemically determined, for example, using the sequences disclosed in FIGS. 1-3 or using the polypeptide sequence disclosed in FIG. 4, using the genetic code z. B. can be synthesized by the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman. A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4). Another way of getting hold of the nucleic acid according to the invention is to isolate it from a suitable gene bank, for example from a heart-specific gene bank, using a suitable probe (see, for example, SJ Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Suitable as a probe are, for example, single-stranded DNA fragments with a length of approximately 100-1000 nucleotides, preferably with a length of approximately 200-500 nucleotides, in particular with a length of approximately 300-400 nucleotides, the sequence of which from the nucleic acid sequences according to FIG 1-3 can be derived. An example of a probe is the 321 bp DNA fragment according to Example 1, which corresponds to the underlined area in FIG. 1, with which the nucleic acid according to the invention has already been successfully isolated from human heart tissue (see Example 2).
Üblicherweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor herzspezifische regulatorische Sequenzen, wie z. B. den Troponin C (cTNC) Promotor (siehe z. B. Parmacek, M. S. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (26) 15970-15976 und Parmacek, M. S. et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12(5), 1967-1976), der funktionell mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden ist.The nucleic acid according to the invention is usually contained in a vector, preferably in an expression vector or gene therapy vector. Preferably, the gene therapy vector contains heart-specific regulatory sequences, such as. B. Troponin C (cTNC) promoter (see e.g. Parmacek, MS et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (26) 15970-15976 and Parmacek, MS et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12 (5), 1967-1976), which is functionally linked to the nucleic acid according to the invention.
Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. co i z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res. , 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40- Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674- 2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. B. EP-B1-0 127 839) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).The expression vectors can be prokaryotic or eukaryotic expression vectors. Examples of prokaryotic expression vectors are for expression in E. co i z. B. the vectors pGEM or pUC derivatives and for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), for expression in insect cells e.g. B. baculovirus vectors as disclosed in EP-B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721, and for expression in mammalian cells e.g. B. the vectors Rc / CMV and Rc / RSV or SV40 vectors, all of which are generally available. In general, the expression vectors also contain suitable promoters for the respective host cell, e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see e.g. EP-B1-0 127 839) or the early SV40 promoter or LTR promoters e.g. B. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovi- rusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.Examples of vectors which are active in gene therapy are virus vectors, preferably adenovirus vectors, in particular replication-deficient adenovirus vectors, or adeno-associated virus vectors, e.g. B. an adeno-associated virus vector consisting exclusively of two inverted terminal repeat sequences (ITR).
Ein Adenovirusvektor und insbesondere ein replikationsdefizienter Adenovirusvektor sind aus den folgenden Gründen besonders bevorzugt.An adenovirus vector, and particularly a replication-deficient adenovirus vector, is particularly preferred for the following reasons.
Das humane Adenovirus gehört zu der Klasse der doppelsträngigen DNA- Viren mit einem Genom von ca. 36 Kilobasenpaaren (Kb). Die virale DNA kodiert für etwa 2700 verschiedene Genprodukte, wobei man frühe ( "early genes '") und späte { "lote genes ") unterscheidet. Die "early genes " werden in vier transkriptioneilen Einheiten, El bis E4, unterteilt. Die späten Gen- ' Produkte kodieren für die Kapsidproteine. Immunologisch können mindestens 42 verschiedene Adenoviren und die Untergruppen A bis F unterschieden werden, die alle für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Die Transkription der viralen Gene setzt die Expression der El-Region voraus, welche für einen Transaktivator der adenoviralen Genexpression kodiert. Diese Abhängigkeit der Expression aller nachfolgenden viralen Gene von dem El- Transaktivator kann für die Konstruktion der nicht replikationsfähigen adeno- viralen Vektoren genutzt werden (siehe z.B. McGrory, W.J. et al. (1988) Virol. 163, 614 - 617 und Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors " (Gluzman, Y. ed.) 187 . 192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). In adenoviralen Vektoren, insbesondere vom Typ 5 (Sequenz siehe Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280 - 285) und vor allem von der Untergruppe C, wird im allgemeinen die El-Genre- gion durch ein Fremdgen mit eigenem Promotor bzw. durch das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ersetzt. Durch den Austausch der El-Genre- gion, welche für die Expression der nachgeschalteten adenoviralen Gene Voraussetzung ist, entsteht ein nicht replikationsfähiges Adenovirus. Diese Viren können sich dann nur in einer Zellinie vermehren, welche die fehlenden El-Gene ersetzt.The human adenovirus belongs to the class of double-stranded DNA viruses with a genome of approximately 36 kilobase pairs (Kb). The viral DNA codes for about 2700 different gene products, a distinction being made between early ("early genes'") and late {"lote genes"). The "early genes" are divided into four transcriptional units, E1 to E4. The late gene ' products encode the capsid proteins. At least 42 different adenoviruses and subgroups A to F can be distinguished immunologically, all of which are suitable for the present invention. The transcription of the viral genes presupposes the expression of the El region which codes for a transactivator of the adenoviral gene expression. This dependence of the expression of all subsequent viral genes on the El transactivator can be used for the construction of the non-replication-capable adeno- viral vectors are used (see, for example, McGrory, WJ et al. (1988) Virol. 163, 614-617 and Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187. 192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). In adenoviral vectors, in particular of type 5 (sequence see Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280-285) and above all from subgroup C, the El gene region is generally shared by a foreign gene own promoter or replaced by the nucleic acid construct according to the invention. The exchange of the El gene region, which is a prerequisite for the expression of the downstream adenoviral genes, results in a non-replication-capable adenovirus. These viruses can then only multiply in a cell line that replaces the missing El genes.
Replikationsdefiziente Adenoviren werden daher im allgemeinen durch homo- löge Rekombination in der sogenannten 293-Zellinie (humane embryonaleReplication-deficient adenoviruses are therefore generally by homologous recombination in the so-called 293 cell line (human embryonic
Nierenzellinie), die eine Kopie der El-Region stabil im Genom integriert hat, gebildet. Hierzu werden unter Kontrolle eines eigenen Promotors, z.B. des bereits oben genannten Troponin C Promotors, die erfindungsgemäßeRenal cell line), which has a copy of the El region stably integrated into the genome. For this purpose, under the control of a separate promoter, e.g. of the above-mentioned troponin C promoter, the invention
Nukleinsäure in rekombinante adenovirale Plasmide kloniert. Anschließend erfolgt die homologe Rekombination mit einem El-defizienten adenoviralenNucleic acid cloned into recombinant adenoviral plasmids. This is followed by homologous recombination with an El-deficient adenoviral
Genom, wie z.B. dl327 oder dell324 (Adenovirus 5), in der HelferzellinieGenome, such as dl327 or dell324 (adenovirus 5), in the helper cell line
293. Bei erfolgreicher Rekombination werden virale Plaques geerntet. Die so erzeugten replikationsdefizienten Viren werden in hohen Titern (beispielsweise293. When recombination is successful, viral plaques are harvested. The replication-deficient viruses generated in this way are found in high titers (for example
109 bis 1011 "plaque forming units" oder plaquebildenden Einheiten) zur Infektion der Zellkultur oder für die somatische Gentherapie eingesetzt.10 9 to 10 11 "plaque forming units" or plaque forming units) for infection of the cell culture or for somatic gene therapy.
Im allgemeinen ist die genaue Insertionsstelle der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das adenovirale Genom nicht kritisch. Es ist z.B. auch möglich, die erfindungsgemäße Nukleinsäure an die Stelle des deletierten E3- Gens zu klonieren (Karlsson, S. et al. EMBO J. 5, 1986, 2377 - 2385). Vorzugsweise wird jedoch die El-Region oder Teile davon, z.B. die E1A- oder EIB-Region (siehe z.B. WO 95/00655) durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure ersetzt, vor allem, wenn auch die E3-Region deletiert ist.In general, the exact insertion site of the nucleic acid according to the invention into the adenoviral genome is not critical. For example, it is also possible to clone the nucleic acid according to the invention in the place of the deleted E3 gene (Karlsson, S. et al. EMBO J. 5, 1986, 2377-2385). However, the E1 region or parts thereof, for example the E1A or EIB region (see, for example, WO 95/00655), is preferably replaced by the nucleic acid according to the invention, especially if the E3 region has also been deleted.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf das adenovirale Vektorsystem beschränkt, sondern auch Adeno-assoziierte Virusvektoren eignen sich in Kombination mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure aus folgenden Gründen in besonderer Weise.However, the present invention is not limited to the adenoviral vector system, but adeno-associated virus vectors are also particularly suitable in combination with the nucleic acid according to the invention for the following reasons.
Das AAV- Virus gehört zur Familie der Parvoviren. Diese zeichnen sich durch ein ikosaedrisches, unbehülltes Kapsid mit einem Durchmesser von 18 bis 30 nm aus, welches eine lineare, einzelsträngige DNA von ca. 5 kb enthält. Für eine effiziente Vermehrung von AAV ist eine Koinfektion der Wirtszelle mit Helferviren erforderlich. Als Helfer eignen sich beispielsweise Adenoviren (Ad5 oder Ad2), Herpesviren und Vacciniaviren (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97 - 129). In Abwesenheit eines Helfervirus geht AAV in einen Latenzzustand über, wobei das Virusgenom in der Lage ist, stabil in das Wirtszellgenom zu integrieren. Die Eigenschaft von AAV, in das Wirtsgenom zu integrieren, macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant. Für die Vektorfunktionen genügen im allgemeinen die beiden ca. 145 bp langen invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR: inverted terminal repeats; siehe z.B. WO 95/23867). Sie tragen die in "eis" notwendigen Signale für Repli- kation. Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom. Zur Verpackung in rekombinante Vektorpartikel wird ein Vektorplasmid, welches die Gene für nicht-strukturelle Proteine (rep-Proteine) und für strukturelle Proteine (cap-Proteine) trägt, in Adenovirus-infizierte Zellen transfiziert. Nach einigen Tagen wird ein zellfreies Lysat hergestellt, welches neben den rekombinanten AAV-Partikeln auch Adenoviren enthält. Die Adenoviren kön- nen vorteilhafterweise durch Erhitzen auf 56 °C oder durch Bandieren im Cäsiumchlorid-Gradienten entfernt werden. Mit dieser Cotransfektionsmethode sind rAAV-Titer von 105 bis 106 IE/ml erzielbar. Die Kontamination durch Wildtypviren liegt unterhalb der Nachweisgrenze, wenn das Verpackungs- plasmid und das Vektorplasmid keine überlappenden Sequenzen besitzen (Samulski, R.J. (1989) J. Virol. 63, 3822 - 3828).The AAV virus belongs to the parvovirus family. These are characterized by an icosahedral, non-encapsulated capsid with a diameter of 18 to 30 nm, which contains a linear, single-stranded DNA of about 5 kb. A co-infection of the host cell with helper viruses is required for an efficient multiplication of AAV. Suitable aids are, for example, adenoviruses (Ad5 or Ad2), herpes viruses and vaccinia viruses (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129). In the absence of a helper virus, AAV goes into a latency state, whereby the virus genome is able to integrate stably into the host cell genome. The ability of AAV to integrate into the host genome makes it particularly interesting as a transduction vector for mammalian cells. The two approximately 145 bp long inverted terminal repeat sequences (ITR: inverted terminal repeats; see, for example, WO 95/23867) are generally sufficient for the vector functions. They carry the signals necessary for replication in "eis". Packaging and integration into the host cell genome. For packaging in recombinant vector particles, a vector plasmid which carries the genes for non-structural proteins (rep proteins) and for structural proteins (cap proteins) is transfected into cells infected with adenovirus. After a few days, a cell-free lysate is produced, which contains adenoviruses in addition to the recombinant AAV particles. The adenoviruses can advantageously by heating to 56 ° C or by banding in Cesium chloride gradients are removed. With this cotransfection method, rAAV titers of 10 5 to 10 6 IU / ml can be achieved. Contamination by wild-type viruses is below the detection limit if the packaging plasmid and the vector plasmid have no overlapping sequences (Samulski, RJ (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).
Der Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in somatische Körperzellen kann durch AAV in ruhende, differenzierte Zellen erfolgen, was für die Gentherapie des Herzens besonders vorteilhaft ist. Durch die erwähnte Integrationsfähigkeit kann auch eine lang anhaltende Genexpression in vivo gewährleistet werden, was wiederum besonders vorteilhaft ist. Ein weiterer Vorteil von AAV ist, daß das Virus nicht pathogen für den Menschen und relativ stabil in vivo ist. Die Klonierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in den AAV- Vektor oder Teilen davon erfolgt nach dem Fachmann bekann- ten Methoden, wie sie z.B. in der WO 95/23867, bei Chiorini, J.A. et al. (1995), Human Gene Therapy 6, 1531 - 1541 oder Kotin, R.M. (1994), Human Gene Therapy 5, 793 - 801 beschrieben sind.AAV can transfer the nucleic acid according to the invention into somatic body cells into resting, differentiated cells, which is particularly advantageous for gene therapy of the heart. Long-term gene expression in vivo can also be ensured by the integration capability mentioned, which in turn is particularly advantageous. Another advantage of AAV is that the virus is not pathogenic to humans and is relatively stable in vivo. The nucleic acid according to the invention is cloned into the AAV vector or parts thereof by methods known to the person skilled in the art, such as those e.g. in WO 95/23867, by Chiorini, J.A. et al. (1995), Human Gene Therapy 6, 1531-1541 or Kotin, R.M. (1994), Human Gene Therapy 5, 793-801.
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Herzmuskelzellen, erreicht werden kann (Feigner, P.L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sei USA 84» 7413 - 7417). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Feigner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (l,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethyl- ammoniumbromid) und DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamm) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr, J.P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6982 - 6986; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 - 2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195 - 203). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[l-(2,3-Dioleoyloxy)proρyl]-N,N,N- trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioc- tadecylamidoglycylspermin). Ein Beispiel für die Herstellung von DNA- Liposomenkomplexen und deren erfolgreiche Anwendung in der Herz-spezifi- sehen Transfektion ist in der DE 44 11 402 beschrieben.Genetically therapeutically effective vectors can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes, since this enables a very high transfection efficiency, in particular of cardiac muscle cells, to be achieved (Feigner, PL et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sei USA 84 » 7413-7417). In lipofection, small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension. The DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes. In addition to those described by Feigner et al. (1987, supra) used lipid mixtures DOTMA (1,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammonium bromide) and DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamm) Numerous new lipid formulations have now been synthesized and tested for their efficiency in transfecting various cell lines (Behr, JP et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6982-6986; Feigner, JH et al. (1994) J Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Examples of the new lipid formulations are DOTAP N- [l- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium ethyl sulfate or DOGS (TRANSFECTAM; Diocadadecylamidoglycylspermin). An example of the production of DNA-liposome complexes and their successful use in heart-specific transfection is described in DE 44 11 402.
Für die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen einschließ- lieh Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3 '-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA in der Herzmuskelzelle erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 478-482).For the gene therapy application of the nucleic acid according to the invention it is also advantageous if the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide includes one or more non-coding sequences including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the polypeptide, and / or one contains polyA sequence, in particular the naturally occurring polyA sequence or an SV40 virus polyA sequence, especially at the 3 'end of the gene, since this can stabilize the mRNA in the heart muscle cell (Jackson, RJ (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter, RD et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Polypeptid selbst mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 15 Aminosäuren und vor allem mit mindestens 164 Aminosäuren, ausgenommen ein Polypeptid mit der Sequenz: PTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQAnother object of the present invention is the polypeptide itself with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, preferably with at least 12 amino acids, in particular with at least 15 amino acids and especially with at least 164 amino acids , except a polypeptide with the sequence: PTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQ
10 20 30 4010 20 30 40
HNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPGHNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPG
50 60 70 80 9050 60 70 80 90
Das Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21 , der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS. Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.The polypeptide is produced, for example, by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable expression system, as already described above, using methods which are generally known to the person skilled in the art. Suitable host cells are, for example, the E. coli strains DH5, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, the insect cell line Lepidopteran, e.g. B. from Spodoptera frugiperda, or the animal cells COS. Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available.
Die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.The parts of the polypeptide mentioned can also be synthesized using classic synthesis (Merrifield technique). They are particularly suitable for obtaining antisera, with the aid of which suitable gene expression banks can be searched in order to arrive at further functional variants of the polypeptide according to the invention.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auch auf Antikörper, die mit dem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 15 Aminosäuren und vor allem mit mindestens 164 Aminosäuren spezifisch reagieren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können. Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem genannten Polypeptid oder den genannten Teilen davon gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reinigen. So konnte beispielsweise gegen ein Polypeptid mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren 1-90 gemäß Fig. 4, das als Fusionsprotein in Bakterien ex- primiert und über eine Affinitätschromatographie gereinigt wurde, ein poly- klonales Antiserum im Kaninchen erzeugt werden. Die erfindungsgemäßen Antiköφer erkannten in Extrakten aus humanem Herzgewebe spezifisch das entsprechende Protein von ca. 80 kD.Another object of the present invention therefore also relates to antibodies which contain the polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, preferably with at least 12 amino acids, in particular with at least 15 amino acids and especially react specifically with at least 164 amino acids, the above-mentioned parts of the polypeptide either being themselves immunogenic or by coupling to suitable carriers, such as. B. bovine serum albumin, immunogenic or can be increased in their immunogenicity. The antibodies are either polyclonal or monoclonal. The preparation, which is also an object of the present invention, is carried out, for example, according to generally known methods by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the said polypeptide or the parts thereof, optionally in the presence of, for. B. Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see e.g. Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). The polyclonal antibodies formed in the animal due to an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and z. B. clean over column chromatography. For example, against a polypeptide with the amino acids 1-90 according to the invention according to FIG. 4, which was expressed as a fusion protein in bacteria and purified by means of affinity chromatography, a polyclonal antiserum could be generated in the rabbit. The antibodies according to the invention specifically recognized the corresponding protein of approximately 80 kD in extracts from human heart tissue.
Monoklonale Antiköφer können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.Monoclonal antibodies can be produced, for example, using the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon und den oben genannten Teilen davon mit mindestens 8 Nukleotiden oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon und den oben genannten Teilen davon mit mindestens 6 Aminosäuren und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzerkrankungen, insbesondere von Herzinsuffizienz, bei dem eine genannte Nukleinsäure oder ein genanntes Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.The present invention also relates to a medicament which comprises a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 8 nucleotides or a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or contains a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 6 amino acids and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries and a method for producing a medicament for the treatment of heart diseases, in particular heart failure, in which a nucleic acid or formulating said polypeptide with a pharmaceutically acceptable carrier.
Ein Beispiel für die Verwendung von Nukleinsäurefragmenten als Therapeuti- kum ist die Verwendung von DNA-Fragmenten in Form von Antisense- Oligonukleotiden (Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, Nr. 4).An example of the use of nucleic acid fragments as a therapeutic agent is the use of DNA fragments in the form of antisense oligonucleotides (Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4) .
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die genannte Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8, insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.For gene therapy use in humans, a drug is particularly suitable which contains the nucleic acid mentioned in the naked form or in the form of one of the gene therapy vectors described above or in a form complexed with liposomes. The pharmaceutical carrier is, for example, a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0-8.0, preferably approximately 6.8-7.8, in particular approximately 7.4 and / or an osmolarity of approximately 200-400 milliosmol / liter, preferably from about 290-310 milliosmol / liter. In addition, the pharmaceutical carrier can contain suitable stabilizers, such as e.g. B. nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
Die Verabreichung der genannten Nukleinsäure gegebenenfalls in Form der oben näher beschriebenen Virusvektoren oder als Liposomenkomplexe erfolgt üblicherweise intravenös, z. B. mit Hilfe eines Katheters. Vorteilhaft ist beispielsweise die direkte Infusion der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Koronararterien des Patienten (sog. "Percutaneous Coronary Gene Transfer", PCGT), insbesondere in Form von rekombinanten Adenovirusvektoren oder Adenoassoziierten Virusvektoren. Besonders bevorzugt ist die Verabreichung mit Hilfe eines Ballonkatheters, da hierdurch die Transfektion nicht nur auf das Herz, sondern auch innerhalb des Herzens auf die Injektionsstelle begrenzt werden kann (siehe z. B. Feldman, L. J. et al. (1994) JACC 235A, 906-934).The administration of the nucleic acid mentioned, optionally in the form of the virus vectors described in more detail above or as liposome complexes, is usually carried out intravenously, for. B. with the help of a catheter. For example, direct infusion of the nucleic acid according to the invention into the patient's coronary arteries (so-called "Percutaneous Coronary Gene Transfer", PCGT) is advantageous, in particular in the form of recombinant adenovirus vectors or adeno-associated virus vectors. Administration with the aid of a balloon catheter is particularly preferred, since this means that transfection not only to the heart, but also to the injection site within the heart can be limited (see e.g. Feldman, LJ et al. (1994) JACC 235A, 906-934).
Es ist auch möglich, das Polypeptid selbst intravenös oder mit Hilfe eines Katheters oder Ballonkatheters gegebenenfalls mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie z.B. physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Protei- naseinhibitoren etc., zu verabreichen, um die Funktion des Herzens sofort und unmittelbar zu beeinflussen.It is also possible to administer the polypeptide itself intravenously or with the aid of a catheter or balloon catheter, if appropriate with suitable additives or auxiliaries, such as e.g. to administer physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors etc. in order to influence the function of the heart immediately and immediately.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder Antiköφer gemäß der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Herzerkrankungen, insbesondere Herzinsuffizienz, bei dem eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder Antiköφer gemäß der vorliegenden Erfindung mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffe versetzt wird.Another object of the present invention is also a diagnostic agent containing a nucleic acid, a polypeptide or Antiköφer according to the present invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries and a method for producing a diagnostic agent for the diagnosis of heart diseases, in particular heart failure, in which a nucleic acid Suitable additives or auxiliaries are added to the polypeptide or antibody according to the present invention.
Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der genannten Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreak- tion (PCR-Diagnostik, z. B. gemäß EP-0 200 362) oder eines Northern- Blots, wie in Beispiel 3 unter Verwendung des erfindungsgemäßen 321 bp DNA-Fragmentes als Sonde näher dargestellt, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der genannten Nukleinsäuren mit dem komplementären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP 0 063 879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein DNA-Fragment, insbesondere das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P32-dCTP oder nicht-radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugs- weise vorher an geeignete Membranen aus z. B. Cellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft, die isolierte RNA vor der Hybridisierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z. B. mittels Agarose-Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.For example, according to the present invention, a diagnostic on the basis of the polymerase chain reaction (PCR diagnostics, for example according to EP-0 200 362) or a Northern blot, as in Example 3 using the 321 according to the invention, can be carried out using the nucleic acid mentioned bp DNA fragment shown as a probe, are prepared. These tests are based on the specific hybridization of the nucleic acids mentioned with the complementary counter strand, usually the corresponding mRNA. The nucleic acid can also be modified, such as. B. described in EP 0 063 879. A DNA fragment, in particular the DNA fragment described in Example 1, is preferably prepared using suitable reagents, e.g. B. radioactive with α-P 32 -dCTP or non-radioactive with biotin, labeled according to generally known methods and with isolated RNA, which preferably previously on suitable membranes from z. B. cellulose or nylon was incubated. It is also advantageous to size the isolated RNA prior to hybridization and binding to a membrane, e.g. B. by means of agarose gel electrophoresis. With the same amount of RNA examined from each tissue sample, the amount of mRNA that was specifically labeled by the probe can thus be determined.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnostikums kann somit auch eine Gewebeprobe des Herzens in vitro auf die Expressionsstärke des korrespondierenden Gens spezifisch gemessen werden, um eine mögliche Herzinsuffi- zienz sicher diagnostizieren zu können (siehe Beispiel 1). Insbesondere eignet sich eine cDNA mit einer Sequenz gemäß Fig. 1 für die Diagnose einer möglichen Herzinsuffizienz (siehe Beispiel 2).With the aid of the diagnostic agent according to the invention, a tissue sample of the heart can also be specifically measured in vitro for the expression strength of the corresponding gene in order to be able to reliably diagnose a possible heart failure (see Example 1). A cDNA with a sequence according to FIG. 1 is particularly suitable for the diagnosis of a possible heart failure (see example 2).
Ein weiteres Diagnostikum enthält das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. die Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Köφerflüssigkeit, z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantiköφer reagieren zu können. Der Antiköφer-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Anti- köφer nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispiels- weie um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantiköφer kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.Another diagnostic agent contains the polypeptide according to the present invention or the immunogenic parts thereof described in more detail above. The polypeptide or parts thereof, which are preferably attached to a solid phase, e.g. B. are bound from nitrocellulose or nylon, for example, with the body fluid to be examined, for. As blood, are brought into contact in vitro so as to be able to react, for example, with autoimmune antibodies. The antibody-peptide complex can then be detected, for example, using labeled anti-human IgG or anti-human IgM antibodies. The label is, for example, an enzyme, such as peroxidase, that catalyzes a color reaction. The presence and the amount of autoimmune antibodies present can thus be easily and quickly detected via the color reaction.
Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antiköφer selbst.Another diagnostic contains the antibodies according to the invention itself.
Mit Hilfe dieser Antiköφer kann beispielsweise eine Gewebeprobe desWith the help of these antibodies, for example, a tissue sample from the
Herzens leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffen- de Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mögliche Herzinsuffizienz zu erhalten. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antiköφer beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antiköφer-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.Heartily and quickly examined whether the polypeptide in question is present in an increased amount, thereby one Get an indication of possible heart failure. In this case, the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as already described above. The specific antibody-peptide complex can thus be detected easily and just as quickly via an enzymatic color reaction.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon und den oben genannten Teilen davon mit mindestens 8 Nukleotiden, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und den oben genannten Teilen davon mit mindestens 6 Aminosäuren oder die erfindungsgemäßen Antiköφer und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe.Another object of the present invention relates to a test for identifying functional interactors containing a nucleic acid of the invention coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof and the above-mentioned parts thereof with at least 8 nucleotides, a polypeptide with an amino acid sequence according to 4 or a functional variant thereof, and the above-mentioned parts thereof with at least 6 amino acids or the antibodies according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries.
Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren ist z. B. das sogenannte "Two-Hybήd-System" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292).A suitable test for identifying functional interactors is e.g. B. the so-called "two-Hybήd system" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292).
Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und eine DNA-Bindedomäne eines bekannten Proteins, beispiels- weise von Gal4 oder LexA aus E. coli, enthält, und/oder ein Fusionsprotein exprimiert, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions-Aktivie- rungsdomäne, beispielsweise von Gal4, Heφes Virus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das lacZ- Gen aus E. coli, "green fluorescence protein" oder die Aminosäure-Biosyn- thesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Sequenzen, wie z. B. den lexA-Promotor/Operator oder durch eine sogenannte "upstream activation sequence" (UAS) der Hefe, kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird beispielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer Herzgewebe-spezifischen Genbank des Menschen, stammt. Üblicherweise wird gleich eine cDNA-Genbank mit Hilfe der beschriebenen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmittelbar danach durchgeführt werden kann.In this test, a cell, for example a yeast cell, is transformed or transfected with one or more expression vectors which express a fusion protein which comprises a polypeptide according to the present invention and a DNA binding domain of a known protein, for example from Gal4 or LexA from E . coli, and / or expresses a fusion protein which contains an unknown polypeptide and a transcription activation domain, for example of Gal4, Heφes Virus VP16 or B42. In addition, the cell contains a reporter gene, for example the lacZ gene from E. coli, "green fluorescence protein" or the amino acid biosynthetic genes of the yeast His3 or Leu2, which is characterized by regulatory sequences, such as B. the lexA promoter / operator or by a so-called "upstream activation sequence" (UAS) of the yeast. The unknown polypeptide is encoded, for example, by a DNA fragment that originates from a gene bank, for example from a human tissue-specific gene bank. Usually, a cDNA library is immediately produced in yeast using the expression vectors described, so that the test can be carried out immediately thereafter.
Beispielsweise wird in einen Hefe-Expressionsvektor eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die LexA-DNA-Bindedomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und der LexA-DNA-Bindedomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe- Expressionsvektor werden cDNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die Gal4-Transkrip- tions-Aktivierungsdomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressionsvektoren transformierte Hefe, die beispielsweise Leu2" ist, enthält zusätzlich eine Nukleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Promotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA-Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu2" Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.For example, in a yeast expression vector, a nucleic acid according to the present invention is cloned in functional unit to the nucleic acid coding for the LexA-DNA binding domain, so that a fusion protein from the polypeptide according to the invention and the LexA-DNA binding domain is expressed in the transformed yeast . In another yeast expression vector, cDNA fragments from a cDNA library are cloned in a functional unit to the nucleic acid coding for the Gal4 transcription activation domain, so that a fusion protein from an unknown polypeptide and the Gal4 transcription activation domain in the transformed yeast is expressed. The yeast transformed with both expression vectors, which is for example Leu2 " , additionally contains a nucleic acid which codes for Leu2 and is controlled by the LexA promoter / operator. In the event of a functional interaction between the polypeptide according to the invention and the unknown polypeptide, Gal4 binds -Transcription activation domain via the LexA DNA binding domain to the LexA promoter / operator, whereby this is activated and the Leu2 gene is expressed. As a result, the Leu2 " yeast can grow on minimal medium which does not contain leucine .
Bei Verwendung des lacZ bzw. "green fluorescense protein" -Reportergens anstelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Trans- kription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blaue bzw. grün-fluoreszie- rende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluoreszenzfärbung läßt sich auch leicht im Spektrophotometer z. B. bei 585 nm im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.When using the lacZ or "green fluorescense protein" reporter gene instead of an amino acid biosynthetic gene, the activation of the transcription can be demonstrated by the fact that blue or green fluorescent forming colonies. The blue or fluorescent staining can also be easily done in a spectrophotometer e.g. B. quantify at 585 nm in the event of a blue color.
Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Polypeptide durchsucht werden, die mit einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung interagieren. Anschließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakterisiert werden.In this way, expression gene banks can be easily and quickly searched for polypeptides that interact with a polypeptide according to the present invention. The new polypeptides found can then be isolated and further characterized.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des "Two-Hybrid Systems" ist die Beeinflussung der Interaktion zwischen einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und einem bekannten oder unbekannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z. B. chemische Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue und wertvolle, chemisch synthetisierbare Wirk- Stoffe auffinden, die als Therapeutikum zur Behandlung einer Herzerkrankung eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von Polypeptid-artigen Interaktoren beschränkt, sondern erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben beschriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Derartige Polypeptid-artige, wie auch chemische Interaktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindung als funktionelle Interaktoren bezeichnet.Another application of the "two-hybrid system" is to influence the interaction between a polypeptide according to the present invention and a known or unknown polypeptide by other substances, such as. B. chemical compounds. In this way, it is also easy to find new and valuable, chemically synthesizable active substances that can be used as a therapeutic agent for the treatment of heart disease. The present invention is therefore not only limited to a method for finding polypeptide-like interactors, but also extends to a method for finding substances which can interact with the protein-protein complex described above. Such polypeptide-like as well as chemical interactors are therefore referred to as functional interactors in the sense of the present invention.
Der überraschende Vorteil der vorliegenden Erfindung ist somit, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Gegenstände Herzerkrankungen, insbesondere die Herzinsuffizienz, spezifisch und sicher diagnostiziert und therapiert werden können. Es ergeben sich jedoch auch weitere wertvolle therapeutische und diagnostische Möglichkeiten. Beispielsweise sind die mit den beschriebenen Testverfahren leicht aufzuspürenden funktionelle Interaktoren deshalb so vorteilhaft, weil mit deren Hilfe in Form von geeigneten Arzneimitteln die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids in seiner natürlichen Umgebung im Herzmuskel und somit auch die Kontraktionsfähigkeit der Herzmuskelzellen gezielt beeinflußt werden kann, insbesondere da die Aktivität dieses Polypeptids, wie oben bereits näher beschrieben, reguliert werden kann.The surprising advantage of the present invention is thus that heart diseases, in particular heart failure, can be diagnosed and treated specifically and safely with the aid of the objects according to the invention. However, there are also other valuable therapeutic and diagnostic options. For example, the functional interactors that are easy to track down with the test methods described are so advantageous because, with the help of them, in the form of suitable pharmaceuticals Activity of the polypeptide according to the invention in its natural environment in the heart muscle and thus also the contractility of the heart muscle cells can be influenced in a targeted manner, in particular since the activity of this polypeptide can be regulated, as already described in more detail above.
Die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie zu beschränken.The following figures and examples are intended to explain the invention in more detail without restricting it.
Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures
Fig. 1 zeigt eine 1936 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist in Fettdruck dargestellt. Das DNA-Fragment aus Beispiel 1 ist unterstrichen.Fig. 1 shows a 1936 nucleotide long heart-specific DNA sequence. The region coding for the corresponding polypeptide is shown in bold. The DNA fragment from Example 1 is underlined.
Fig. 2 zeigt eine 2080 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz, die eine Verlängerung am 5' -Ende der DNA-Sequenz aus Fig. 1 aufweist. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist wiederum in Fettdruck dargestellt.FIG. 2 shows a 2080 nucleotide-long heart-specific DNA sequence which has an extension at the 5 ′ end of the DNA sequence from FIG. 1. The area coding for the corresponding polypeptide is again shown in bold.
Fig. 3 zeigt eine 2268 Nukleotide-lange herzspezifische DNA-Sequenz, die eine Verlängerung am 5 '-Ende der DNA-Sequenz aus Fig. 1 bzw. Fig. 2 aufweist. Der Bereich, der für das entsprechende Polypeptid kodiert, ist ebenso in Fettdruck dargestellt.FIG. 3 shows a 2268 nucleotide-long heart-specific DNA sequence which has an extension at the 5 'end of the DNA sequence from FIG. 1 or FIG. 2. The area coding for the corresponding polypeptide is also shown in bold.
Fig. 4 zeigt eine 552 Aminosäuren-lange Polypeptid-Sequenz, die von einer der DNA-Sequenzen gemäß Fig. 1-3 kodiert wird. Die zu humanem Tropomodulin homologen Bereiche sind in Fettdruck dargestellt. Die Sequenzmoti- fe, die auf eine Regulation des Polypeptides durch Tyrosinkinase-Signaltrans- duktionswege hinweisen, sind unterstrichen.FIG. 4 shows a 552 amino acid long polypeptide sequence which is encoded by one of the DNA sequences according to FIGS. 1-3. The areas homologous to human tropomodulin are shown in bold. The sequence motifs Fe that indicate regulation of the polypeptide by tyrosine kinase signal transduction pathways are underlined.
Fig. 5a und 5b zeigen Northern-Blots von mRNAs, die zu den Nukleinsäu- resequenzen gemäß Fig. 1-3 korrespondieren, zum Nachweis der Expression in verschiedenen menschlichen Geweben (Fig. 5a) und zum Nachweis der Expression in gesundem und insuffizientem menschlichen Herzgewebe (Fig. 5b).5a and 5b show Northern blots of mRNAs which correspond to the nucleic acid sequences according to FIGS. 1-3, for the detection of expression in various human tissues (FIG. 5a) and for the detection of expression in healthy and insufficient human heart tissue (Fig. 5b).
BeispieleExamples
1. Isolierung eines DNA-Fragments aus humanem insuffizientem Herz- gewebe1. Isolation of a DNA fragment from human insufficient heart tissue
Aus einer gesunden und einer insuffizienten Herzgewebe-Probe wurde zunächst durch Standardmethoden (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem, 162 (1), 156-159) Gesamt-RNA isoliert. Die RNA wurde dann mit DNAse behandelt, um DNA-Kontaminationen zu entfernen. Ein Aliquot dieser RNA (0,2 μg) wurde dann in einem 20 μl-Reaktionsmix mit 1 x RT- Puffer (Gibco Y00121), 10 mM DTT, 20 μM dNTP-Mix, lU/μl RNAsin (Promega N2511), 1 μM 3 '-Anker-Primergemisch vom Typ 5 '-T12ACN-3 ' , wobei N ein beliebiges desoxy-Nukleotid sein kann und lOU/μl SuperScript RNAse H" reverser Transkriptase 60 min bei 37°C inkubiert und somit in cDNA umgeschrieben. Ein cDNA-Aliquot wurde anschließend einer 20 μl- PCR-Reaktion in lx PCR-Puffer (Perkin-Elmer) unterworfen, die neben lμM 3 '-Primer T12AC und lμM 5 '-Dekamer-Primer (5 '-CCTTCTACCC-3 '), 10 μCi α-P33-dCTP, 2μM dNTP-Mix und 1 U AmpliTaq (Perkin Eimer) enthält. Das Gemisch wurde zunächst 1 min bei 94 °C, dann 40 Zyklen mit jeweils 30 s 94°C, 2 min 40°C und 30 s 72°C und abschließend 10 min bei 72°C inkubiert. Das entstehende DNA-Fragment-Gemisch wurde dann auf einem 6% igen Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und autoradiographiert. Es wird so ein 321 bp großes DNA-Fragment dargestellt, welches nicht in der Gesundherzprobe, jedoch deutlich in der insuffizienten Herzprobe vorhanden ist. Dieses Fragment wurde dann anhand des Röntgenfilmes aus dem Gel ausgeschnitten und mittels PCR unter den bereits beschriebenen Bedingungen reamplifiziert. Das erhaltene Fragment wurde dann in einen entsprechenden Vektor kloniert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt. Ein derartig darge- stelltes Fragment enthält die Nukleotide 1627-1936 der Sequenz gemäß Anspruch 1 und die 12 Thymin-Nukleotide aus dem 3 '-Anker-Primer.Total RNA was first isolated from a healthy and an insufficient heart tissue sample by standard methods (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem, 162 (1), 156-159). The RNA was then treated with DNAse to remove DNA contamination. An aliquot of this RNA (0.2 μg) was then in a 20 μl reaction mix with 1 × RT buffer (Gibco Y00121), 10 mM DTT, 20 μM dNTP mix, 1U / μl RNAsin (Promega N2511), 1 μM 3 'anchor primer mixture of the type 5' -T 12 ACN-3 ', where N can be any deoxy nucleotide and lOU / ul SuperScript RNAse H " reverse transcriptase incubated for 60 min at 37 ° C and thus rewritten into cDNA. A cDNA aliquot was then subjected to a 20 μl PCR reaction in 1 × PCR buffer (Perkin-Elmer), which in addition to 1 μM 3 ′ primer T 12 AC and 1 μM 5 ′ decamer primer (5 ′ -CCTTCTACCC-3 10 μCi α-P 33 -dCTP, 2 μM dNTP-Mix and 1 U AmpliTaq (Perkin Elmer) The mixture was first at 94 ° C. for 1 min, then with 40 cycles incubated for 30 s 94 ° C, 2 min 40 ° C and 30 s 72 ° C and finally 10 min at 72 ° C. The resulting DNA fragment mixture was then separated on a 6% polyacrylamide gel and autoradiographed. A 321 bp DNA fragment is thus represented, which is not present in the healthy heart sample, but is clearly present in the insufficient heart sample. This fragment was then cut out of the gel using the X-ray film and reamplified by means of PCR under the conditions already described. The fragment obtained was then cloned into an appropriate vector and the DNA sequence was determined. Such a fragment contains the nucleotides 1627-1936 of the sequence according to claim 1 and the 12 thymine nucleotides from the 3 'anchor primer.
2. Isolierung von herzspezifischen Nukleinsäuren2. Isolation of heart-specific nucleic acids
Mit Hilfe eines α-P32-dCTP markierten DNA-Fragmentes aus Beispiel 1 , das die Nukleotide von Position 1627-1936 nach Fig. 1 umfaßt, wurde eine Plaquehybridisierung mit einer cDNA-Genbank aus Herzgewebe nach Standardbedingungen durchgeführt (siehe Sambrook, J. , Frisch, E. F. & Mania- tis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Kap. 8-10). Anschließend wurden die gefundenen cDNAs isoliert und sequenziert. Die Sequenzen sind in Fig. 1-3 dargestellt. Hierbei zeigte sich, daß sich die cDNA mit der Sequenz gemäß Fig. 1 mit größerer Wahrscheinlichkeit aus insuffizientem Herzgewebe isolieren ließ als die cDNA mit der Sequenz gemäß Fig. 2 oder 3, welche sich mit größerer Wahrscheinlichkeit aus gesundem Herzgewebe isolieren ließ.With the aid of an α-P 32 -dCTP-labeled DNA fragment from Example 1, which comprises the nucleotides from position 1627-1936 according to FIG. 1, a plaque hybridization was carried out with a cDNA library from cardiac tissue according to standard conditions (see Sambrook, J. , Frisch, EF & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, chap. 8-10). The cDNAs found were then isolated and sequenced. The sequences are shown in Figures 1-3. It was found that the cDNA with the sequence according to FIG. 1 was more likely to be isolated from insufficient heart tissue than the cDNA with the sequence according to FIG. 2 or 3, which was more likely to be isolated from healthy heart tissue.
3. Nachweis der Expressionsstärke des herzspezifischen Gens in ver- schiedenen menschlichen Geweben anhand von Northern Blots. Das bereits in den Beispielen 1 und 2 und Fig. 1 beschriebene 321 bp große DNA-Fragment wurde zunächst mit α-P32-dCTP mittels der "random primer labeling" -Methode (Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem., 132, 6) radioaktiv markiert. Hierzu wurde das RTS RadPrime DNA Labeling System (GibcoBRL 10387-017) verwendet. Die Hybridisierung von Blots mit poly A+-RNA aus menschlichen Geweben (siehe Fig. 5a und 5b) fand nach Herstellerangaben (Multiple Tissue Northern Blots I & II, Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, #7760-1, #7759-1) in ExpressHyb Hybridisierungslösung (Clontech #8015-1) 1 Stunde bei 68 °C statt. Die Blots wurden anschließend 30 Minuten mit 2 x SSC und 0,05% SDS und danach 1 Stunde mit 0, 1 x SSC und 0, 1 % SDS gewaschen und autoradio- graphiert. Es zeigte sich, daß die 321 bp große Sonde mit einer polyA+- RNA von ca. 2400 bp stark in Herzgewebe und Skelettmuskel, sehr schwach in Prostatagewebe und nicht in Leukozyten, Dickdarm-, Dünndarm-, Eierstock-, Hoden-, Thymus-, Milz-, Niere-, Leber-, Lunge-, Plazenta- und Gehirngewebe hybridisiert (Fig. 5a).3. Detection of the level of expression of the heart-specific gene in various human tissues using Northern blots. The 321 bp DNA fragment already described in Examples 1 and 2 and FIG. 1 was first analyzed with α-P 32 -dCTP using the "random primer labeling" method (Feinberg, AP & Vogelstein, B. (1983) Anal Biochem., 132, 6) radioactively labeled. The RTS RadPrime DNA Labeling System (GibcoBRL 10387-017) was used for this. Hybridization of blots with poly A + RNA from human tissues (see FIGS. 5a and 5b) took place according to the manufacturer's instructions (Multiple Tissue Northern Blots I & II, Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, # 7760-1, # 7759-1) ExpressHyb hybridization solution (Clontech # 8015-1) was held for 1 hour at 68 ° C. The blots were then washed with 2 x SSC and 0.05% SDS for 30 minutes and then with 0, 1 x SSC and 0, 1% SDS for 1 hour and autoradiographed. It was shown that the 321 bp probe with a polyA + RNA of approx. 2400 bp was strong in cardiac tissue and skeletal muscle, very weak in prostate tissue and not in leukocytes, colon, small intestine, ovary, testes, thymus , Spleen, kidney, liver, lung, placenta and brain tissue hybridized (Fig. 5a).
Weiterhin wurde die Expression der entsprechenden RNAs in gesundem und insuffizientem Herzgewebe untersucht. Hierzu wurde aus verschiedenen menschlichen Herzgewebeproben Gesamt-RNA isoliert (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159). Anschließend wurden jeweils 10 μg RNA mittels eines l %igen Formaldehyd-Agarose Gels aufgetrennt und im Kapillarverfahren auf eine geladene Nylon-Membran transferiert (Zeta- Probe GT BioRad #162-0197). Die Membran wurde kurz mit 2 x SSC gewaschen und dann bei 80 °C 30 Minuten gebacken. Die Membranen wurden mindestens 1 Stunde mit Prähybridisierlösung (0,5 M Na2HPO4, pH 7,2; 7% SDS) bei 65 °C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung gegen eine frische Lösung ausgetauscht und die radioaktive, hitzedenaturierte Sonde hinzugegeben. Die Hybridisierung wurde 15 Stunden bei 65 °C durchgeführt. Anschließend wurden die Membranen zunächst 15 Stunden bei 65 °C mit 40 mM Na2HPO4, pH 7,2; 5% SDS, dann 2 x 30 Minuten bei 65 °C mit 40 mM Na2HPO4, pH 7,2; 1 % SDS gewaschen und anschließend autoradiogra- phiert. Es zeigte sich, daß in l %igen Agarose-Gelen verschiedene RNA- Spezien aufgetrennt wurden, die eine Größe von ca. 2200 bis ca. 2400 bp aufwiesen. Diese unterschiedlichen Spezien korrespondieren gut mit den Größen der drei gefundenen cDNAs inklusive eines durchschnittlichen polyA- Schwanzes von 150 bp Länge (siehe Fig. 1-3). Insbesondere die kleinste RNA-Spezie war im erkrankten Gewebe deutlicher nachzuweisen als im gesunden Gewebe. Die Quantifizierung der Blots mittels Phosphoimagers und der ImageQuant Software (Molecular Dynamics GmbH, Krefeld) unter Berücksichtigung einer Kontrollhybridisierung mit ß4-Thymosin und Aktin ergab eine um ungefähr 35 % erhöhte Expression der nachgewiesenen RNAs in insuffizientem Herzgewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe. Furthermore, the expression of the corresponding RNAs in healthy and insufficient heart tissue was examined. For this purpose, total RNA was isolated from various human heart tissue samples (Chomczynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159). Subsequently, 10 μg RNA were separated using a 1% formaldehyde agarose gel and transferred to a charged nylon membrane using the capillary method (Zeta-Probe GT BioRad # 162-0197). The membrane was briefly washed with 2 x SSC and then baked at 80 ° C for 30 minutes. The membranes were incubated for at least 1 hour with prehybridization solution (0.5 M Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 7% SDS) at 65 ° C. The solution was then exchanged for a fresh solution and the radioactive, heat-denatured probe was added. Hybridization was carried out at 65 ° C for 15 hours. The membranes were then initially at 40 ° C. for 15 hours at 65 ° C. mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 5% SDS, then 2 x 30 minutes at 65 ° C with 40 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2; 1% SDS washed and then autoradiographed. It was found that various RNA species were separated in 1% agarose gels, which had a size of approximately 2200 to approximately 2400 bp. These different species correspond well with the sizes of the three cDNAs found, including an average polyA tail of 150 bp in length (see FIGS. 1-3). The smallest RNA species in particular was more clearly detectable in the diseased tissue than in the healthy tissue. The quantification of the blots using phosphoimagers and the ImageQuant software (Molecular Dynamics GmbH, Krefeld), taking into account control hybridization with β4-thymosin and actin, resulted in an approximately 35% higher expression of the detected RNAs in inadequate heart tissue compared to healthy tissue.
SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:(1. GENERAL INFORMATION:
(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:
(A) NAME: MediGene Aktiengesellschaft(A) NAME: MediGene Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Lochhamer Str. 11(B) STREET: Lochhamer Str. 11
(C) ORT: 82152 Martinsried(C) LOCATION: 82152 Martinsried
(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-82152(F) POSTAL NUMBER: D-82152
(G) TELEFON: 089-89 56 32 0 (H) TELEFAX: 089-89 56 32 20(G) TELEPHONE: 089-89 56 32 0 (H) TELEFAX: 089-89 56 32 20
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Herzspezifische Nukleinsaeure, ihre Herstellung und Verwendung(ii) NAME OF THE INVENTION: Heart specific nucleic acid, its production and use
(in) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5(in) NUMBER OF SEQUENCES: 5
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:(iv) COMPUTER READABLE VERSION:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk(A) DISK: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Word Perfect 3.1(D) SOFTWARE: Word Perfect 3.1
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 1936 Basenpaare iB) ART: Nucleoüd(A) LENGTH: 1936 base pairs iB) TYPE: Nucleoüd
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear i) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(D) TOPOLOGY: linear i) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 :(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120
TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180
GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240
GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300
CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360
GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420
GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480
AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540 AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540 AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600
GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660
CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720
TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780
CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840
TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900
CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960
TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020
CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080
GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140
TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200
AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260
ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320
GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380
CCCTC TTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440CCCTC TTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440
GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500
GG ATTACAA A TGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560GG ATTACAA A TGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560
TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620
TTCCCGACCT T TACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAAT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680TTCCCGACCT T TACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAAT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680
AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740
TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800
TCTA-AATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860TCTA-AATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860
ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920
TTCT7TTTTA TGTCGT 1936TTCT7TTTTA TGTCGT 1936
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 2080 Basenpaare(A) LENGTH: 2080 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(in) HYPOTHETISCH: NEIN(in) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:(F) TISSUE TYPE: heart tissue (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120
TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180
GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240
GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300
CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360
GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420
GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480
AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540
AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600
GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660
CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720
TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780
CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840
TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900
CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960
TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020
CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080
GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140
TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200
AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260
ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320
GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380
CCCTCCTTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440CCCTCCTTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440
GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500
GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560
TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620
TTCCCGACCT TCTACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAΛT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680TTCCCGACCT TCTACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAΛT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680
AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740
TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800
TCTAAAATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860TCTAAAATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860
ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920
TTCTTTTTTA TGTCGTGAGA TTTGTATTGG CAAGAAGCAG TTAATTTAAA GATGCTCTTC 1980TTCTTTTTTA TGTCGTGAGA TTTGTATTGG CAAGAAGCAG TTAATTTAAA GATGCTCTTC 1980
CTATCTGTGG ATGTGTTGGT AACTCCGAGT TGTAATGAGT TCATGAAATG TGCTGTTATT 2040CTATCTGTGG ATGTGTTGGT AACTCCGAGT TGTAATGAGT TCATGAAATG TGCTGTTATT 2040
TTTGTAATCT CAATAAATGT GGATTGAAGT TTTTTCCCTT 2080 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:TTTGTAATCT CAATAAATGT GGATTGAAGT TTTTTCCCTT 2080 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 2268 Basenpaare(A) LENGTH: 2268 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(ü) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60CAGCCTGCCA CTTGCCTCCC TGCCTGCTTC TGGCTGCCTT GAATGCCTGG TCCTTCAAGC 60
TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120TCCTTCTGGG TCTGACAAAG CAGGGACCAT GTCTACCTTT GGCTACCGAA GAGGACTCAG 120
TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180TAAATACGAA TCCATCGACG AGGATGAACT CCTCGCCTCC CTGTCAGCCG AGGAGCTGAA 180
GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240GGAGCTAGAG AGAGAGTTGG AAGACATTGA ACCTGACCGC AACCTTCCCG TGGGGCTAAG 240
GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300GCAAAAGAGC CTGACAGAGA AAACCCCCAC AGGGACATTC AGCAGAGAGG CACTGATGGC 300
CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360CTATTGGGAA AAGGAGTCCC AAAAACTCTT GGAGAAGGAG AGGCTGGGGG AATGTGGAAA 360
GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420GGTTGCAGAA GACAAAGAGG AAAGTGAAGA AGAGCTTATC TTTACTGAAA GTAACAGTGA 420
GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480GGTTTCTGAG GAAGTGTATA CAGAGGAGGA GGAGGAGGAG TCCCAGGAGG AAGAGGAGGA 480
AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540AGAAGACAGT GACGAAGAGG AAAGAACAAT TGAAACTGCA AAAGGGATTA ATGGAACTGT 540
AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600AAATTATGAT AGTGTCAATT CTGACAACTC TAAGCCAAAG ATATTTAAAA GTCAAATAGA 600
GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660GAACATAAAT TTGACCAATG GCAGCAATGG GAGGAACACA GAGTCCCCAG CTGCCATTCA 660
CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720CCCTTGTGGA AATCCTACAG TGATTGAGGA CGCTTTGGAC AAGATTAAAA GCAATGACCC 720
TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780TGACACCACA GAAGTCAATT TGAACAACAT TGAGAACATC ACAACACAGA CCCTTACCCG 780
CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840CTTTGCTGAA GCCCTCAAGG ACAACACTGT GGTGAAGACG TTCAGTCTGG CCAACACGCA 840
TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900TGCCGACGAC AGTGCAGCCA TGGCCATTGC AGAGATGCTC AAAGCCAATG AGCACATCAC 900
CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960CAACGTAAAC GTCGAGTCCA ACTTCATAAC GGGAAAGGGG ATCCTGGCCA TCATGAGAGC 960
TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020TCTCCAGCAC AACACGGTGC TCACGGAGCT GCGTTTCCAT AACCAGAGGC ACATCATGGG 1020
CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080CAGCCAGGTG GAAATGGAGA TTGTCAAGCT GCTGAAGGAG AACACGACGC TGCTGAGGCT 1080
GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140GGGATACCAT TTTGAACTCC CAGGACCAAG AATGAGCATG ACGAGCATTT TGACAAGAAA 1140
TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200TATGGATAAA CAGAGGCAAA AACGTTTGCA GGAGCAAAAA CAGCAGGAGG GATACGATGG 1200
AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260AGGACCCAAT CTTAGGACCA AAGTCTGGCA AAGAGGAACA CCTAGCTCTT CACCTTATGT 1260
ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320ATCTCCCAGG CACTCACCCT GGTCATCCCC AAAACTCCCC AAAAAAGTCC AGACTGTGAG 1320
GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380 CCCTCCTTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440GAGCCGTCCT CTGTCTCCTG TGGCCACACT TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CTCCTCCTCC 1380 CCCTCCTTCT TCCCAAAGGC TGCCACCACC TCCTCCTCCT CCCCCTCCTC CACTCCCAGA 1440
GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500GAAAAAGCTC ATTACCAGAA ACATTGCAGA AGTCATCAAA CAACAGGAGA GTGCCCAACG 1500
GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560GGCATTACAA AATGGACAAA AAAAGAAAAA AGGGAAAAAG GTCAAGAAAC AGCCAAACAG 1560
TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620TATTCTAAAG GAAATAAAAA ATTCTCTGAG GTCAGTGCAA GAGAAGAAAA TGGAAGACAG 1620
TTCCCGACCT TCTACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAAT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680TTCCCGACCT TCTACCCCAC AGAGATCAGC TCATGAGAAT CTCATGGAAG CAATTCGGGG 1680
AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740AAGCAGCATA AAACAGCTAA AGCGGGTGGA AGTTCCAGAA GCCCTGCGAT GGGAACATGA 1740
TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800TCTTTAGAAG AGGATGCAGA ACTGTTCAGT GGTATTACAT GAAATGCATT GTGAGATGTT 1800
TCTAAAATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860TCTAAAATAC CTTCTTCAAT TCAAAATGAT CCCTGACTTT AAAAATAATC TCACCCATTA 1860
ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920ATTCCAAAGA GAATCTTAAG AAACAATCAG CATGTTTCTT CTGTAAATAT GAAAATAAAT 1920
TTCTTTTTTA TGTCGTGAGA TTTGTATTGG CAAGAAGCAG TTAATTTAAA GATGCTCTTC 1980TTCTTTTTTA TGTCGTGAGA TTTGTATTGG CAAGAAGCAG TTAATTTAAA GATGCTCTTC 1980
CTATCTGTGG ATGTGTTGGT AACTCCGAGT TGTAATGAGT TCATGAAATG TGCTGTTATT 2040CTATCTGTGG ATGTGTTGGT AACTCCGAGT TGTAATGAGT TCATGAAATG TGCTGTTATT 2040
TTTGTAATCT CAATAAATGT GGATTGAAGT TTTTTCCCTT TTTTTAAAGC CAAACTAATA 2100TTTGTAATCT CAATAAATGT GGATTGAAGT TTTTTCCCTT TTTTTAAAGC CAAACTAATA 2100
TTTTTCTGTG ACTTGATACA TCTGTCAGAT TTTTGTAATC TCGATAAATG TGTATTGAAG 2160TTTTTCTGTG ACTTGATACA TCTGTCAGAT TTTTGTAATC TCGATAAATG TGTATTGAAG 2160
TTTTTTCCCT TTTTTTAAAA AGCCAAACTA ATATTTTTCT GTGAGTTAAT ACATCTGTCA 2220TTTTTTCCCT TTTTTTAAAA AGCCAAACTA ATATTTTTCT GTGAGTTAAT ACATCTGTCA 2220
GGTGTGTATG TAACATTACT GGACATTAAA AAAAATTATT ACATTCTC 2268GGTGTGTATG TAACATTACT GGACATTAAA AAAAATTATT ACATTCTC 2268
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 552 Aminosäuren(A) LENGTH: 552 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein(ii) MOLECULE TYPE: Protein
(iiij HYPOTHETISCH: NEIN(iiij HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Met Ser Thr Phe Gly Tyr Arg Arg Gly Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Ile 1 5 10 15Met Ser Thr Phe Gly Tyr Arg Arg Gly Leu Ser Lys Tyr Glu Ser Ile 1 5 10 15
Asp Glu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Leu Ser Ala Glu Glu Leu Lys Glu 20 25 30Asp Glu Asp Glu Leu Leu Ala Ser Leu Ser Ala Glu Glu Leu Lys Glu 20 25 30
Leu Glu Arg Glu Leu Glu Asp Ile Glu Pro Asp Arg Asn Leu Pro Val 35 " 40 45Leu Glu Arg Glu Leu Glu Asp Ile Glu Pro Asp Arg Asn Leu Pro Val 35 " 40 45
Gly Leu Arg Gin Lvs Ser Leu Thr Glu Lys Thr Pro Thr Gly Thr Phe 50 ' 55 60 Ser Arg Glu Ala Leu Met Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Ser Gin Lys Leu 65 70 75 80Gly Leu Arg Ser Leu Thr Gin Lvs Glu Lys Thr Pro Thr Gly Thr Phe 50 '55 60 Ser Arg Glu Ala Leu Met Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Ser Gin Lys Leu 65 70 75 80
Leu Glu Lys Glu Arg Leu Gly Glu Cys Gly Lys Val Ala Glu Asp Lys 85 90 95Leu Glu Lys Glu Arg Leu Gly Glu Cys Gly Lys Val Ala Glu Asp Lys 85 90 95
Glu Glu Ser Glu Glu Glu Leu Ile Phe Thr Glu Ser Asn Ser Glu Val 100 105 HOGlu Glu Ser Glu Glu Glu Leu Ile Phe Thr Glu Ser Asn Ser Glu Val 100 105 HO
Ser Glu Glu Val Tyr Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Gin Glu Glu 115 120 125Ser Glu Glu Val Tyr Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Gin Glu Glu 115 120 125
Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Glu Glu Glu Arg Thr Ile Glu Thr Ala 130 135 140Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Glu Glu Glu Arg Thr Ile Glu Thr Ala 130 135 140
Lys Gly Ile Asn Gly Thr Val Asn Tyr Asp Ser Val Asn Ser Asp Asn 145 150 155 160Lys Gly Ile Asn Gly Thr Val Asn Tyr Asp Ser Val Asn Ser Asp Asn 145 150 155 160
Ser Lys Pro Lys Ile Phe Lys Ser Gin Ile Glu Asn Ile Asn Leu Thr 165 170 175Ser Lys Pro Lys Ile Phe Lys Ser Gin Ile Glu Asn Ile Asn Leu Thr 165 170 175
Asn Gly Ser Asn Gly Arg Asn Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ile His Pro 180 185 190Asn Gly Ser Asn Gly Arg Asn Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ile His Pro 180 185 190
Cys Gly Asn Pro Thr Val Ile Glu Asp Ala Leu Asp Lys Ile Lys Ser !95 200 205Cys Gly Asn Pro Thr Val Ile Glu Asp Ala Leu Asp Lys Ile Lys Ser! 95 200 205
Asn Asp Pro Asp Thr Thr Glu Val Asn Leu Asn Asn Ile Glu Asn Ile 210 215 220Asn Asp Pro Asp Thr Thr Glu Val Asn Leu Asn Asn Ile Glu Asn Ile 210 215 220
Thr Thr Gin Thr Leu Thr Arg Phe Ala Glu Ala Leu Lys Asp Asn Thr 225 230 235 ' 240Thr Thr Gin Thr Leu Thr Arg Phe Ala Glu Ala Leu Lys Asp Asn Thr 225 230 235 ' 240
Val Val Lys Thr Phe Ser Leu Ala Asn Thr His Ala Asp Asp Ser Ala 245 250 255Val Val Lys Thr Phe Ser Leu Ala Asn Thr His Ala Asp Asp Ser Ala 245 250 255
Ala Met Ala Ile Ala Glu Met Leu Lys Ala Asn Glu His Ile Thr Asn 260 265 270Ala Met Ala Ile Ala Glu Met Leu Lys Ala Asn Glu His Ile Thr Asn 260 265 270
Val Asn Val Glu Ser Asn Phe Ile Thr Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ile 275 280 285Val Asn Val Glu Ser Asn Phe Ile Thr Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ile 275 280 285
Met Arg Ala Leu Gin His Asn Thr Val Leu Thr Glu Leu Arg Phe His 290 295 300Met Arg Ala Leu Gin His Asn Thr Val Leu Thr Glu Leu Arg Phe His 290 295 300
Asn Gin Arg His Ile Met Gly Ser Gin Val Glu Met Glu Ile Val Lys 305 310 315 320Asn Gin Arg His Ile Met Gly Ser Gin Val Glu Met Glu Ile Val Lys 305 310 315 320
Leu Leu Lys Glu Asn Thr Thr Leu Leu Arg Leu Gly Tyr His Phe Glu 325 330 335Leu Leu Lys Glu Asn Thr Thr Leu Leu Arg Leu Gly Tyr His Phe Glu 325 330 335
Leu Pro Gly Pro Arg Met Ser Met Thr Ser Ile Leu Thr Arg Asn Met 340 345 350Leu Pro Gly Pro Arg Met Ser Met Thr Ser Ile Leu Thr Arg Asn Met 340 345 350
Asp Lys Gin Arg Gin Lys Arg Leu Gin Glu Gin Lys Gin Gin Glu Gly 355 360 365Asp Lys Gin Arg Gin Lys Arg Leu Gin Glu Gin Lys Gin Gin Glu Gly 355 360 365
Tyr Asp Gly Gly Pro Asn Leu Arg Thr Lys Val Trp Gin Arg Gly Thr 370 ' 375 380 Pro Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Pro Arg His Ser Pro Trp Ser Ser 385 390 395 400Tyr Asp Gly Gly Pro Asn Leu Arg Thr Lys Val Trp Gin Arg Gly Thr 370 ' 375 380 Pro Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Pro Arg His Ser Pro Trp Ser Ser 385 390 395 400
Pro Lys Leu Pro Lys Lys Val Gin Thr Val Arg Ser Arg Pro Leu Ser 405 410 415Pro Lys Leu Pro Lys Lys Val Gin Thr Val Arg Ser Arg Pro Leu Ser 405 410 415
Pro Val Ala Thr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 420 425 430Pro Val Ala Thr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 420 425 430
Pro Ser Ser Gin Arg Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 435 440 445Pro Ser Ser Gin Arg Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 435 440 445
Leu Pro Glu Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asn Ile Ala Glu Val Ile Lys 450 455 460Leu Pro Glu Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asn Ile Ala Glu Val Ile Lys 450 455 460
Gin Gin Glu Ser Ala Gin Arg Ala Leu Gin Asn Gly Gin Lys Lys Lys 465 470 475 480Gin Gin Glu Ser Ala Gin Arg Ala Leu Gin Asn Gly Gin Lys Lys Lys 465 470 475 480
Lys Gly Lys Lys Val Lys Lys Gin Pro Asn Ser Ile Leu Lys Glu Ile 485 490 495Lys Gly Lys Lys Val Lys Lys Gin Pro Asn Ser Ile Leu Lys Glu Ile 485 490 495
Lys Asn Ser Leu Arg Ser Val Gin Glu Lys Lys Met Glu Asp Ser Ser 500 505 510Lys Asn Ser Leu Arg Ser Val Gin Glu Lys Lys Met Glu Asp Ser Ser 500 505 510
Arg Pro Ser Thr Pro Gin Arg Ser Ala His Glu Asn Leu Met Glu Ala 515 520 525Arg Pro Ser Thr Pro Gin Arg Ser Ala His Glu Asn Leu Met Glu Ala 515 520 525
Ile Arg Gly Ser Ser Ile Lys Gin Leu Lys Arg Val Glu Val Pro Glu 530 ' 535 540Ile Arg Gly Ser Ser Ile Lys Gin Leu Lys Arg Val Glu Val Pro Glu 530 ' 535 540
Ala Leu Arg Trp Glu His Asp LeuAla Leu Arg Trp Glu His Asp Leu
545 ~ 550545 ~ 550
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
(l) SEQUΞNZKEN ZEICHEN:(l) SEQUΞNZKEN SIGN:
(A) LANGE: 10 Basenpaare (3) ART: Nucleotid(A) LONG: 10 base pairs. (3) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
Uli) HYPOTHETISCH: NEINUli) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRUNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: CCTTCTACCC 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: CCTTCTACCC 10 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 279 Basenpaare(A) LENGTH: 279 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE : l inear(D) TOPOLOGY: l inear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GEWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA 60 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC 120 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGGTTTC ATAACCAGAG 180 GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC 240 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC 279GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA 60 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC 120 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGGTTTC ATAACCAGAG 180 GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC 240 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC 279
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUΞNZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE MARK:
(A) LÄNGE: 93 Aminosäuren (3) ART: Aminosäure(A) LENGTH: 93 amino acids (3) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Pεptid(ii) MOLECULE TYPE: Pεptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: JA(iv) ANTISENSE: YES
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:(vi) ORIGINAL ORIGIN:
(F) GΞWEBETYP: Herzgewebe(F) TISSUE TYPE: heart tissue
txi) SEQUE ZBΞSCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:txi) SEQUE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
PTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQPTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQ
10 20 30 40 HNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPG 50 60 70 80 90 10 20 30 40 HNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPG 50 60 70 80 90

Claims

Patentansprüche claims
1. Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, ausgenommen eine1. Nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, with the exception of one
Nukleinsäure mit der Sequenz:Nucleic acid with the sequence:
1 GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA1 GCCAACACGC ANTCCGACGA CAGTGCAGCC ATGGTCATTG CAGAGATGCN TCAAAGTCAA
61 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC61 TGAGCACATC ACCAACGTAA ACGTCGAGTC CAACTTCATA ACGGGAAAGG GGATCCTGGC
121 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGTTTCC ATAACCAGAG121 CATCATGAGA GCTCTCCAGC ACAACACGGT GCTCACGGAG CTGCGTTTCC ATAACCAGAG
Iδl GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGACIδl GCACATCATG GGCAGCCAGG TGGAAATGGA GATTGTCAAG CTNCTGAAGG AGAACACGAC
241 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC241 GCTNCTGAGG CTGGGNTACC ATTTTNAACT CCCAGGACC
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist.2. Nucleic acid according to claim 1, characterized in that the nucleic acid is a DNA or RNA, preferably a DNA, in particular a double-stranded DNA.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 , 2 oder 3 enthält.3. Nucleic acid according to claim 1 or 2, characterized in that the nucleic acid contains a DNA with a nucleic acid sequence according to FIG. 1, 2 or 3.
4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthal- ten ist.4. Nucleic acid according to one of claims 1-3, characterized in that the nucleic acid is contained in a vector, preferably in an expression vector or gene therapy vector.
5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine polyA- Sequenz enthält.5. Nucleic acid according to one of claims 1-4, characterized in that the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide, contains one or more non-coding sequences and / or a polyA sequence.
6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.6. A method for producing a nucleic acid according to any one of claims 1-5, characterized in that the nucleic acid is chemically synthesized or isolated from a gene bank using a probe.
7. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 67. Polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6
Aminosäuren, ausgenommen eiin Polypeptid mit der Sequenz:Amino acids, except a polypeptide with the sequence:
PTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQ 10 20 30 40 HNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPGPTRNPTTVQPWSLQRCIKVNEHITNVNVESNFITGKGILAIMRALQ 10 20 30 40 HNTVLTELRFHNQRHIMGSQVEMEIVKLLKENTTLLRLGYHFKLPG
50 60 70 80 9050 60 70 80 90
8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-3 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.8. A method for producing a polypeptide according to claim 7, characterized in that a nucleic acid according to one of claims 1-3 is expressed in a suitable host cell.
9. Antikörper gegen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren.9. Antibodies against a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids.
10. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren immunisiert und die entstandenen Antikörper isoliert werden. 10. A method for producing an antibody according to claim 9, characterized in that a mammal with a polypeptide having an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof are immunized with at least 6 amino acids and the resulting antibodies are isolated.
11. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.11. Medicament containing a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, or a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von 0 Herzerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und 5 Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.12. A method for producing a medicament for the treatment of 0 heart diseases, characterized in that a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, or a polypeptide with an amino acid sequence 4 or a functional variant thereof, and 5 parts thereof is formulated with at least 6 amino acids with a pharmaceutically acceptable carrier.
13. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funk- Ü tionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, oder Antikörper gemäß Anspruch 9 und gegebenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe. 513. Diagnostic agent containing a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and Parts thereof with at least 6 amino acids, or antibodies according to claim 9 and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries. 5
14. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Herzerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit 0 mindestens 8 Nukleotiden, ein Polypeptid mit einer Aminosäurese- quenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.14. A method for producing a diagnostic for the diagnosis of heart diseases, characterized in that a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with 0 at least 8 nucleotides, a polypeptide with an amino acid sequence. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, or antibodies according to claim 9 with a pharmaceutically acceptable carrier.
15. Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder eine funktionelle15. Test for identifying functional interactors comprising a nucleic acid coding for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, or a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 4 or a functional variant
Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe. Variant thereof, and parts thereof with at least 6 amino acids, and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries.
PCT/EP1998/003584 1997-06-13 1998-06-15 Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof WO1998056907A1 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU84385/98A AU746190B2 (en) 1997-06-13 1998-06-15 Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof
CA002293733A CA2293733A1 (en) 1997-06-13 1998-06-15 Mycardium-and skeletal muscle-specific nucleic acid, its preparation and use
EP98934959A EP1000145A1 (en) 1997-06-13 1998-06-15 Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof
JP50164199A JP2002509433A (en) 1997-06-13 1998-06-15 Nucleic acids specific to cardiac and skeletal muscle, and methods for their production and use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19725186A DE19725186C2 (en) 1997-06-13 1997-06-13 Cardiac and skeletal muscle-specific nucleic acid, its production and use
DE19725186.2 1997-06-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998056907A1 true WO1998056907A1 (en) 1998-12-17

Family

ID=7832477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/003584 WO1998056907A1 (en) 1997-06-13 1998-06-15 Heart and skeleton muscle specific nucleic acid, the production and use thereof

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1000145A1 (en)
JP (1) JP2002509433A (en)
AU (1) AU746190B2 (en)
CA (1) CA2293733A1 (en)
DE (1) DE19725186C2 (en)
WO (1) WO1998056907A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001046388A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Medigene Aktiengesellschaft Pathologically modified myocardial cell, production and use thereof

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7408301A (en) * 2000-05-30 2001-12-11 Medigene Aktiengesellschaft Novel target genes for diseases of the heart
AU2003205611A1 (en) * 2002-01-15 2003-07-30 Medigene Ag Dilated cardiomyopathy associated gene-2 (dcmag-2): a cytoplasmatic inducer of sarcomeric remodeling in cardiomyocytes

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
WO1997017937A2 (en) * 1995-11-17 1997-05-22 Franz Wolfgang M Gene-therapeutic nucleic acid construct, production of same and use of same in the treatment of heart disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
WO1997017937A2 (en) * 1995-11-17 1997-05-22 Franz Wolfgang M Gene-therapeutic nucleic acid construct, production of same and use of same in the treatment of heart disorders

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BABCOCK AND FOWLER: "ISOFORM-SPECIFIC INTERACTION OF TROPOMODULIN WITH SKELETAL MUSCLE AND ERYTHROCYTE TROPOMYOSINS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, no. 44, 1994, pages 27510 - 27518, XP002084566 *
DATABASE EMBL 13 June 1997 (1997-06-13), MARRA ET AL.: "THE WASHU-HHMI MOUSE EST PROJECT", XP002084569 *
DATABASE EMBL 13 March 1997 (1997-03-13), LIEW: "cDNAs FROM HUMAN FETAL HEART", XP002084571 *
DATABASE EMBL 1996, MARRA ET AL.: "THE WASHU-HHMI MOUSE EST PROJECT", XP002084570 *
DATABASE EMBL 1996, TANAKA ET AL.: "CLONE 3NHC3467" *
LIANG P ET AL: "DIFFERENTIAL DISPLAY OF EUKARYOTIC MESSENGER RNA BY MEANS OF THE POLYMERASE CHAIN REACTION", SCIENCE, vol. 257, no. 5072, 14 August 1992 (1992-08-14), pages 967 - 971, XP000508268 *
NABEL E G: "GENE THERAPY FOR CARDIOVASCULAR DISEASE", CIRCULATION, vol. 91, no. 2, 15 January 1995 (1995-01-15), pages 541 - 548, XP000568740 *
TANAKA ET AL.: "CONSTRUCTION OF A NORMALIZED DIRECTIONALLY CLONED cDNA LIBRARY FROM ADULT HEART AND ANALYSIS OF 3040 CLONES BY PARTIAL SEQUENCING", GENOMICS, vol. 35, - 1996, pages 231 - 235, XP002084567 *
WATAKABE ET AL.: "N-TROPOMODULIN: A NOVEL ISOFORM OF TROPOMODULIN IDENTIFIED AS THE MAJOR BINDING PROTEIN TO BRAIN TROPOMYOSIN", JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 109, 1996, pages 2299 - 2310, XP002084565 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001046388A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Medigene Aktiengesellschaft Pathologically modified myocardial cell, production and use thereof
WO2001046388A3 (en) * 1999-12-22 2002-02-07 Medigene Ag Pathologically modified myocardial cell, production and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DE19725186C2 (en) 2000-06-15
JP2002509433A (en) 2002-03-26
EP1000145A1 (en) 2000-05-17
DE19725186A1 (en) 1998-12-24
CA2293733A1 (en) 1998-12-17
AU746190B2 (en) 2002-04-18
AU8438598A (en) 1998-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69636752T2 (en) HUMAN GROWTH FACTOR 2, SPECIFIC FOR VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS
DE69838061T2 (en) TYPE II TGF-BETA RECEPTOR / IMMUNOGLOBULIN CONSTANT DOMAIN FUSION PROTEINS
DE60033431T2 (en) CHIMERIC NATRIURETIC PEPTIDES
DE69838254T2 (en) TWO HUMAN G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR PROTEINS: EBV-INDUCED GPCR2 (EBI-2) AND EGD-1-SIMILAR GPCR
DE69534402T2 (en) APOPTOSIS PROTEASES 3 AND 4, SIMILAR TO THE CONVERSION CYCLE FOR INTERLEUKIN-1BETA
DE69433666T2 (en) INFLAMMATION PROTEINS FROM MACROPHAGES MIP-3, MIP-4 AND MIP-1Gamma
DE69636936T2 (en) FACTOR-1, INDUCIBLE BY HYPOXEMIA, AND METHOD OF USE
DE69733204T3 (en) NOVEL VEGF-SIMILAR FACTORS
EP1027440B2 (en) Inhibitor protein of the wnt signal pathway
DE69434926T2 (en) HUMAN TISSUE INHIBITOR OF METALOPROTEINASE-4
DE69531892T2 (en) FIBROBLAST GROWTH FACTOR 10
DE69433648T2 (en) HUMAN CHEMOKIN POLYPEPTIDE
DE69926764T2 (en) METHODS FOR DETERMINING COMPONENTS FOR MODULATING THE BODY WEIGHT
DE69530944T2 (en) KERATINOCYTE GROWTH FACTOR 2
DE69533627T2 (en) HUMAN CHEMOKIN BETA-13
DE69534044T2 (en) HUMAN BETA-9 CHEMOKIN
US6300484B1 (en) DNA encoding DP. 75 and a process for its use
DE69934239T2 (en) LY6H GEN
US20030175260A1 (en) Novel DNA and a process for its use
DE69534705T2 (en) DICKDARM SPECIFIC GENES AND PROTEINS
DE69931345T2 (en) GEN, WHICH CODES FOR NEW TRANSMEMBRANE PROTEIN
EP0805204B1 (en) Epididymis-specific receptor protein and its use
JP2000506745A (en) New compound
DE19725186C2 (en) Cardiac and skeletal muscle-specific nucleic acid, its production and use
DE69434090T2 (en) EPSILON SUB-UNIT OF THE GABA A-RECEPTOR

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2293733

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2293733

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 84385/98

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998934959

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09445362

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998934959

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 84385/98

Country of ref document: AU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998934959

Country of ref document: EP