WO1998046789A1 - New reporter-vectors for one-hybrid and two-hybrids systems - Google Patents

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WO1998046789A1
WO1998046789A1 PCT/EP1998/002194 EP9802194W WO9846789A1 WO 1998046789 A1 WO1998046789 A1 WO 1998046789A1 EP 9802194 W EP9802194 W EP 9802194W WO 9846789 A1 WO9846789 A1 WO 9846789A1
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reporter
nucleic acid
acid sequence
cell
gene
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Application number
PCT/EP1998/002194
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Inventor
Robert Cormack
Imre Somssich
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the invention relates to a reporter vector which comprises a regulatory nucleic acid sequence which contains an operator and a promoter linked to a reporter gene which codes for a photoprotein, the expression of which can be detected by irradiation or treatment.
  • the invention further relates to a method for the detection of molecular interactions, transiently or stably transformed cells, and the use of these cells for the investigation of molecular interactions.
  • Reporter vectors are plasmids which, in addition to the components which are generally customary for a plasmid (origin of replication, selection markers, etc.) carry a reporter gene under the control of a promoter. Strong, constitutive promoters such as the CMV promoter (cytomegalovirus) or the Ca V 35S (cauliflower mosaic virus) are generally used as promoters for reporter vectors. Reporter genes should be easily detectable. For this reason, genes are used whose expression product is easily detectable by a chemical reaction that is easy to carry out, such as a color reaction. Examples of such reporter genes are the LacZ gene or the CAT gene (chloroamphenicol acetyltransferase). Another group of reporter genes are photoproteins, e.g. B. the GFP isolated from Aequorea victoria (Green Fluorescent
  • Such reporter vectors are used, for example, to check the transfection effectiveness in the transfection of cells.
  • _5 Reporter vectors are also used in other examination methods. They are adapted to the respective process by appropriate modifications.
  • molecular interactions are understood to mean an interaction between polypeptides and nucleic acids or the interaction of two or more polypeptides with one another. Either these interactions are investigated per se or one wants to identify molecules that can interact specifically with a certain nucleic acid sequence or with a certain polypeptide.
  • a reporter vector with the LacZ reporter gene described above is used and transformed into a yeast cell _5.
  • Two further expression vectors are transformed into the same cell, an interaction of the two expression products of these vectors leads to activation of the expression of the reporter gene of the reporter vector.
  • the expression is then by adding a chemical inducer, e.g. B. IPTG, made visible.
  • a chemical inducer e.g. B. IPTG
  • the detection of expression can also be verified using the filter assay.
  • An impression of the colonies is taken from the culture plate and the color reaction is carried out using an X-Gal solution (5-bromo-5 4-chloro-3-indolyl / 3-D-galactoside).
  • the colonies in question must be picked and inoculated in culture medium for quantitative detection.
  • the expression can only be quantified in a further process step after an appropriate culture time. 0
  • the determination of the expression level is therefore time and cost intensive. In addition, the number of colonies that can be tested in this way is limited.
  • the reporter vector according to the invention which comprises a regulatory nucleic acid sequence, o which contains an operator and a promoter, operatively linked to a reporter gene, which is characterized in that the reporter gene codes for a photoprotein, the expression of which can be detected by radiation.
  • the reporter vector according to the invention makes it possible to detect positive clones by irradiation, the background of the system surprisingly being very low in vivo and having a good signal / background ratio.
  • the great advantage lies in the fact that for the detection of expression of the reporter gene neither filter impressions have to be made nor that a chemical reaction has to be carried out in a further working step.
  • the colonies can now be applied more densely to the culture plates, so that fewer culture plates are necessary and 5 a larger number of colonies can be screened simultaneously in one work step.
  • Another advantage is that the reporter vector according to the invention the use of expensive chemicals for the detection of positive clones is eliminated. This saves materials and expensive working hours. Above all, however, the working time required to identify positive clones is reduced.
  • the reporter vector according to the invention can in principle be any vector, e.g. B. an extrachromosomal or chromosomal vector.
  • the vector can be a viral vector, a plasmid or an artificial chromosome.
  • the reporter vector is preferably a plasmid. It expediently contains the components required for propagation in the intended host cell. They include an origin of replication e.g. B. a bacterial origin of replication such as Col E 1 or p5A or a eukaryotic origin of replication such as the yeast 2 micron origin of replication.
  • the reporter vector can contain one or more selection markers such as ampicillin, penicillin, tetracycline for selection in bacterial cells and / or selection markers which enable selection in yeast cells, such as the gene for Ura3, Leu2, Lys2, Trpl, Cys3 or Ade2 . These selection markers are used in conjunction with corresponding auxotrophic yeast strains and suitable yeast culture media. The cultural media are also referred to as "dropout" media. By using them, the number of 5 false positive clones can be reduced.
  • the reporter vector contains a Transkriptionstermiationssequenz such as a ADHL sequence. It was surprising that the reporter vector according to the invention showed no basal expression of the reporter gene after transfection in the cell. This advantageously leads to a very good signal / background ratio when used. In addition, the signal strength upon irradiation correlates with the expression level and thus also allows conclusions to be drawn about the strength of the molecular interaction. 5
  • Any suitable promoter that is operatively linked to the reporter gene can be used as the promoter in the reporter vector. is knotting.
  • the reporter vector preferably contains the Gall, 10 minimal promoter.
  • the operator can contain further different sequence motifs, preferably comprising at least one Gal4 binding motif and / or at least one LexA binding motif.
  • the photoprotein is preferably a GFP (Green Fluorescent Protein) from the organism Aequorea victoria or a modified GFP (see, for example, WO 95/07463; WO 95/21191; WO 96/23810; WO 96/23910 or WO 96 / 23898).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the reporter vector may also have unique cloning sites.
  • singular cloning site is meant that a restriction enzyme can only cut at one point in the reporter vector.
  • the singular cloning site is preferably located 5 'to the side of the ATG start codon of the reporter gene.
  • the distance between the ATG and the singular cloning site is preferably 50 to 4,000 bp.
  • the singular cloning site can be an interface for any restriction enzyme, preferably the singular cloning site contains 5 sites for restriction enzymes with a 6 to 8 bp recognition sequence, e.g. B. Notl, Nrul and / or Spei.
  • a heterologous nucleic acid fragment is inserted in the singular cloning site. This can vary in size, preferably it has a size of 20 bp to 4 kbp.
  • Another object of the invention is a cell that is transiently or stably transformed with a reporter vector as described above.
  • Yet another object of the invention is a method for the detection of molecular interactions between a nucleic acid and a polypeptide, wherein a reporter vector into which a first heterologous nucleic acid sequence is inserted is transformed into a cell, at least a second vector is transformed into this cell, which contains a second heterologous nucleic acid sequence under the control of a promoter, the transformed cell is cultivated under conditions such that expression of the second nucleic acid sequence can take place and the expression of the reporter gene is examined in the cell, the increase in expression of the reporter gene resulting in An interaction between the expression product of the second nucleic acid sequence and the first nucleic acid sequence can be detected on the reporter vector.
  • the vectors used in the process which is referred to as a one-hybrid process, are transformed into the cells by processes known to those skilled in the art.
  • a selection with suitable selection methods is carried out if necessary.
  • auxotrophic yeast strains in connection with suitable media and corresponding genes, which are contained in the transformed vectors.
  • the reporter vector and the second vector can be transformed into the cell simultaneously or in succession.
  • the vectors can be transiently or stably transformed into the cell. It is also possible to first transform the reporter vector into the cell and to produce stably transformed cells. In a second transformation, these cells are then transformed transiently or stably with the second vector to investigate the molecular interaction.
  • first heterologous nucleic acid sequence in the reporter vector, whose interaction with poly- peptides to be examined.
  • the method can be used to isolate nucleic acid sequences which code for polypeptides which can interact with a first given heterologous nucleic acid sequence which is inserted in the reporter vector.
  • the second heterologous nucleotide sequence from a sequence library which contains a large number of different, potentially interacting sequences, e.g. B. from a genomic library or a cDNA library.
  • the first heterologous nucleic acid sequence preferably comes from a genomic or cDNA library.
  • the present method offers the advantage that a large number of clones and different gene banks can be examined for the presence of expression products which interact with a specific nucleic acid sequence.
  • nucleic acid sequences that can interact with the given polypeptide can also be identified quickly and easily for a given expression product.
  • the invention relates to a cell that is transiently or stably transformed with a reporter vector as shown above and / or at least one second vector as shown above.
  • Cell 5 is preferably a yeast cell.
  • Another object of the invention is a method for the detection of molecular interactions between two polypeptides, wherein a reporter vector, which optionally contains an o heterologous nucleic acid sequence, is transformed into a cell, at least a second vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene from a first heterologous nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence which codes for a binding domain of the operator on the reporter vector 5, under the control of a promoter, at least one third vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene from a second heterologous nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence which is suitable for encodes a transcription activator of the reporter gene, contains under control o a promoter, the transformed cell is cultivated under such conditions that expression of the heterologous nucleic acid sequences can take place and expression of the reporter gene is examined in the cell, the occurrence of an interaction between the expression product of the first nucleic acid sequence and the expression product of the second nucleic acid sequence being detectable by an increase
  • the first 5 or second heterologous nucleic acid sequence preferably comes from a gene bank.
  • the method is carried out in cells compatible with the vectors used.
  • a yeast cell is preferably used. le.
  • yeast strains and selection markers and suitable culture media PL Bartel et al. , (Cellular Interactions in Development-A Practical Approach, Ed. DA Hartley IRL Press, 1993), 5 which is hereby incorporated into this application.
  • the second vector contains a fusion gene that contains a binding domain.
  • This binding domain can bind to a sequence of the operator of the reporter vector.
  • the binding domain preferably comprises a LexA sequence.
  • the third vector used in this method contains a fusion gene that encodes a transcriptional activator of the reporter gene.
  • This activator can be any suitable activator, preferably it comprises a B42, GAL4 sequence and / or a VP16 (Herpex-Simplex) sequence.
  • one or both interaction partners can be composed of two or more subunits.
  • the individual subunits can be encoded by different vectors or their coding sequences can be present together on one vector.
  • the cells are irradiated, which leads to a color signal.
  • the radiation preferably comprises a wavelength of 280 nm to 400 nm. Most preferably it comprises 350 nm to 375 nm. 0
  • the invention relates to a cell which is transiently or stably transformed with a reporter vector as described above and / or with at least one second vector as described above or / and 5 and with at least a third vector as described above.
  • Another object of the invention is the use of a transiently or stably transformed cell as described above, for the investigation of molecular interactions.
  • FIG. 1 The examples together with FIG. 1 describe the invention in more detail.
  • a BamHI fragment containing the LTA gene from pTDI was subcloned in the same orientation into the unique restriction site BamHI from pJG4-5.
  • the recombinant plasmid was linearized with EcoRI, 5 then filled in with T4 DNA polymerase and recircularized with T4 DNA ligase to put the LTA gene "in-frame”.
  • the reporter vectors pGNGl and pGNG2 are shown in FIG. 1.
  • the minimal Gall, 10 promoter sequence in pSH18-34 (2) contains 4 copies of the LexA binding site. It was amplified using the polymerase chain reaction (4).
  • the first primer was positioned 2 base pairs 5 'on the 5' side of the LexA operator 5 and provided with a HindIII restriction site at its 5 'end.
  • the second primer was complementary to the Gall, 10 sequence up to the ATG start codon for the LacZ gene, without containing it and it contained an Xbal restriction site at its 5 'end.
  • the PCR product was subcloned into the plasmid pGFPuv (Clontech, Palo Alto, California, 5 USA) between the unique restriction sites HindiII and Xbal. From this construct, a HindiII-EcoRI DNA fragment containing the minimal promoter-GFP fusion gene was subcloned into the yeast shuttle vector YEp357R (5) between the HindiII and EcoRI restriction sites of the "Multiple Cloning Site" to give the vector pPGNGl .
  • the complementary deoxyribonucleotides MCSl (5 '-AGCTTGCGGCCGCTCGCGAC-TAGT and MCS2 (5' -AGCTACTAGTCGCGAGCGGCGCA) with compatible Hindlll ends were hybridized and then into the unique restriction site HindiII from pPGNG25 bp EcoRI - 5 XmnI fragment, which contains the ADH1 terminator from pGAD424 (6), cloned into the 6 kbp EcoRI -PvuII fragment of pPGNGl or pPGNG2 in order to give the reprotector vectors pGNGl or pGNG2.
  • the S.cerevisiae strain EGY48 was transformed with the lithium acetate method (7) with pGNGl and on synthetic drop-out uracil (SD-Ura) plates containing 2% (w / v) galactose and 1% (w / v) raffinose contained, selected.
  • the resulting strain 5 was then transformed with different "bait" and pJG4-5-based "prey" plasmids based on pEG202 and selected on a suitable SD medium containing galactose and raffinose. Culture plates containing yeast transformants were examined under a UV lamp (366 nm).
  • a reporter vector for the two-hybrid system (interaction trap), pGNGl (FIG. 1) was produced, which contains the GFP gene (Green Fluorescent Protein).
  • the vector backbone was derived from YEp357R, which contains the URA3 selection marker and a 2 micron origin of replication.
  • the GFPuv gene which was used in the vector, is a "cycle3" variant of the GFP, which is 18 times brighter than the wild-type protein (8).
  • the reporter vector for the one hybrid system pGNG2 (Fig. 1), was constructed. This contains approximately 450 bp on the 5 'side of the ATG start codon of the GFPuv gene, a "multiple cloning site".
  • the reporter vector pGNG2 contains the unique cloning sites Notl, Nrul and Spei. A "bait" DNA sequence can be inserted here for examination in the one-hybrid system.
  • yeast cells containing pGNGl and "bait" vectors showed that capable were able to activate the LacZ reporter gene encoded by pESH18-34, also the ability to activate the GFPuv gene.
  • yeast cells that expressed "Baitl” fluoresced significantly more under UV light than those that expressed "Bait2". This indicates that the transactivation of the "Baitl” was stronger than that of the "Bait2".
  • Yeast cells were also co-transformed with vectors containing a p53-LexA binding domain hybrid protein and the Large-T antigen
  • the reporter vector pGNGl shows no detectable basal expression of the GFP in the absence of the "Bait” and "Prey” vectors. However, in the presence of molecular interactions kung or transactivating "bait" proteins expressed enough GFP in the yeast cells to allow their detection.
  • the sensitivity of the reporter vector according to the invention is lower than that of the known LacZ reporter vectors, 5 which are regulated by the same minimal promoter.
  • the interaction between p53 and the Large-T antigen and the other three protein pairs (Bait and Prey) already detected with other reporter genes was also detected with the aid of the reporter vector according to the invention.
  • the lower sensitivity compared to the known reporter vectors represents an advantage, since it can reduce the number of false positive clones.
  • the variability in the intensity of the fluorescence for each pair of the proteins tested represents a qualitative measurement of the strength of the 5 interactions. This was observed in the same way with the other reporter genes.
  • a practical advantage of the reporter vector according to the invention over the known reporter vectors in the process of the one- and two-hybrid system is the fact that the colonies obtained can be held directly under a UV lamp (366 nm) and the positive clones immediately can be made visible without cultivating them again. The steps of picking the colonies, testing the activity or cultivating on culture plates containing X-Gal, or cultivating again for quantitative detection, are thus no longer necessary in the previously used reporter vectors.
  • the reporter vector pGNG2 for the one-hybrid system also showed no basal expression of GFP in yeast cells. Reporter genes co-transformed with different "bait” and "prey” vectors in S.cerevisiae EGY48

Abstract

Disclosed is a reporter-vector comprising one regulating nucleic acid sequence containing one operator and one promoter as a functional link with a reporter gene encoding for a photoprotein, the expression of which can be highlighted by irradiation. The invention further relates to a method for highlighting molecular interactions, cells subjected to a transient or stable transformation process, as well as the use of cells for examining said molecular interactions.

Description

Neue Reportervektoren für One-Hybrid und Two-Hybrid Systeme New reporter vectors for one-hybrid and two-hybrid systems
Beschreibungdescription
55
Die Erfindung betrifft einen Reportervektor, der eine regulatorische Nukleinsäuresequenz umfaßt, die einen Operator und einen Promotor verknüpft mit einem Reportergen enthält, das für ein Photoprotein kodiert, dessen Expression durch Bestrahlt, lung nachweisbar ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselswirkungen, transient oder stabil transformierte Zellen, sowie die Verwendung dieser Zellen zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen.The invention relates to a reporter vector which comprises a regulatory nucleic acid sequence which contains an operator and a promoter linked to a reporter gene which codes for a photoprotein, the expression of which can be detected by irradiation or treatment. The invention further relates to a method for the detection of molecular interactions, transiently or stably transformed cells, and the use of these cells for the investigation of molecular interactions.
1515
Reportervektoren sind Plasmide, die neben den für ein Plasmid allgemein üblichen Komponenten (Replikationsursprung, Selek- tionsmarker etc.) ein Reportergen unter Kontrolle eines Promotors tragen. Als Promotoren für Reportervektoren werden im o allgemeinen starke, konstitutive Promotoren wie beispielsweise der CMV-Promotor (Cytomegalovirus) oder der Ca V 35S (Cauli- flower-Mosaik-Virus) verwendet. Reportergene sollen leicht nachweisbar sein. Deshalb werden Gene verwendet, deren Expressionsprodukt leicht durch eine einfach durchführbare chemische 5 Reaktion nachweisbar ist, wie beispielsweise eine Farbreaktion. Beispiele für solche Reportergene sind das LacZ-Gen oder das CAT-Gen (Chloroamphenicol-Acetyltransferase) . Eine andere Gruppe von Reportergenen stellen Photoproteine dar, wie z. B. das aus Aequorea victoria isolierte GFP (Green FluorescentReporter vectors are plasmids which, in addition to the components which are generally customary for a plasmid (origin of replication, selection markers, etc.) carry a reporter gene under the control of a promoter. Strong, constitutive promoters such as the CMV promoter (cytomegalovirus) or the Ca V 35S (cauliflower mosaic virus) are generally used as promoters for reporter vectors. Reporter genes should be easily detectable. For this reason, genes are used whose expression product is easily detectable by a chemical reaction that is easy to carry out, such as a color reaction. Examples of such reporter genes are the LacZ gene or the CAT gene (chloroamphenicol acetyltransferase). Another group of reporter genes are photoproteins, e.g. B. the GFP isolated from Aequorea victoria (Green Fluorescent
3o Protein) . 3 o protein).
Derartige Reportervektoren werden beispielsweise zur Überprüfung der Transfektionseffektivität bei der Transfektion von Zellen verwendet.Such reporter vectors are used, for example, to check the transfection effectiveness in the transfection of cells.
_5 Auch bei anderen Untersuchungsverfahren werden Reportervektoren verwendet. Sie sind durch entsprechende Modifikationen an das jeweilige Verfahren angepaßt._5 Reporter vectors are also used in other examination methods. They are adapted to the respective process by appropriate modifications.
5 Ein solches Verfahren ist beispielsweise die Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen. Unter molekularen Wechselwirkungen ist in diesem Zusammenhang eine Wechselwirkung zwischen Polypeptiden und Nukleinsäuren bzw. die Wechselwirkung von zwei oder mehreren Polypeptiden miteinander zu verstehen. Es ιo werden entweder diese Wechselwirkungen an sich untersucht oder man will Moleküle identifizieren, die spezifisch mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz bzw. mit einem bestimmen Poly- peptid wechselwirken können.5 One such method is the investigation of molecular interactions. In this context, molecular interactions are understood to mean an interaction between polypeptides and nucleic acids or the interaction of two or more polypeptides with one another. Either these interactions are investigated per se or one wants to identify molecules that can interact specifically with a certain nucleic acid sequence or with a certain polypeptide.
15 Bis vor kurzem wurden diese Untersuchungen lediglich in in vitro Systemen durchgeführt. Beispielsweise wurden Proteine daduch identifiziert, daß sie mit Hilfe eines Antikörpers, der ein bekanntes Protein erkennt, koimmunopräzipitiert wurden. Einerseits beinhaltet dieses Verfahren den Nachteil, daß der15 Until recently, these investigations were only carried out in in vitro systems. For example, proteins have been identified by co-immunoprecipitation using an antibody that recognizes a known protein. On the one hand, this method has the disadvantage that the
2o Nachweis der molekularen Wechselwirkungen nicht unter physiologischen, d. h. in vivo Bedingungen stattfindet. Andererseits erfordert es weitere aufwendige Verfahrensschritte von den so identifizierten Proteinen zu dem entsprechenden Gen zu gelangen. 2 o Detection of the molecular interactions does not take place under physiological, ie in vivo conditions. On the other hand, it requires further complex process steps to get from the proteins identified in this way to the corresponding gene.
_5_5
S. Fields und 0. Song (Nature 340, 1989, Seite 245 - 246) entwickelten eine Methode, die es erlaubt, molekulare Wechselwirkungen auch unter in vivo Bedingungen zu untersuchen. Dieses als Two-Hybrid System oder "interaction trap" bezeichnete _o Verfahren stellt eine einfache Methode zur Identifizierung und Klonierung dar.S. Fields and 0. Song (Nature 340, 1989, pages 245-246) developed a method that allows molecular interactions to be investigated even under in vivo conditions. This _o method, called a two-hybrid system or "interaction trap", represents a simple method for identification and cloning.
Bei dieser Methode wird ein Reportervektor mit dem oben bezeichnetem LacZ-Reportergen verwendet und in eine Hefezelle _5 transformiert. Zwei weitere Expressionsvektoren werden in dieselbe Zelle transformiert, wobei eine Wechselwirkung der beiden Expressionsprodukte dieser Vektoren zur Aktivierung der Expression des Reportergens des Reportervektors führt .In this method, a reporter vector with the LacZ reporter gene described above is used and transformed into a yeast cell _5. Two further expression vectors are transformed into the same cell, an interaction of the two expression products of these vectors leads to activation of the expression of the reporter gene of the reporter vector.
Im Unterschied zu den oben genannten Reportervektoren, muß ein 5 Reportervektor im vorliegenden Verfahren erhöhten Anforderungen genügen.In contrast to the reporter vectors mentioned above, a 5 reporter vector must meet increased requirements in the present method.
Da es sich hierbei um einen induzierbaren Promotor handelt, d. h. die Expression durch die Wechselwirkungen von zwei Molekü- 0 len in Verbindung mit einer Binde- und einer Aktivator-Domäne vermittelt wird, sollte der Promoter "dicht" sein. Es sollte also ohne Vorliegen von molekularen Wechselwirkungen nur zu sehr geringer oder am besten zu keiner Expression kommen, um ein gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis sicherzustellen. 5Since this is an inducible promoter, i. H. expression is mediated by the interactions of two molecules in conjunction with a binding and an activator domain, should the promoter be "tight". In the absence of molecular interactions, there should be only very little or, best of all, no expression to ensure a good signal / background ratio. 5
Nur so ist es möglich, sicher zwischen positiven und negativen Kolonien zu differenzieren und das Vorliegen von molekularen Wechselwirkungen festzustellen.This is the only way to safely differentiate between positive and negative colonies and to determine the existence of molecular interactions.
o Die Expression wird dann durch Zugabe eines chemischen Induktors, z. B. IPTG, sichtbar gemacht. Der Nachweis der Expression kann auch mit Hilfe des Filterassays nachgewiesen werden. Hierbei wird ein Abdruck der Kolonien von der Kulturplatte genommen und die Farbreaktion mit einer X-Gal-Lösung (5-Brom- 5 4-chlor-3-indolyl-/3-D-galactosid) durchgeführt. Zum quantitativen Nachweis müssen die betreffenden Kolonien gepickt und in Kulturmedium angimpft werden. Die Quantifizierung der Expression kann erst dann nach einer angemessenen Kulturzeit in einem weiteren Verfahrensschritt erfolgen. 0o The expression is then by adding a chemical inducer, e.g. B. IPTG, made visible. The detection of expression can also be verified using the filter assay. An impression of the colonies is taken from the culture plate and the color reaction is carried out using an X-Gal solution (5-bromo-5 4-chloro-3-indolyl / 3-D-galactoside). The colonies in question must be picked and inoculated in culture medium for quantitative detection. The expression can only be quantified in a further process step after an appropriate culture time. 0
Die Bestimmung der Expressionshöhe ist somit Zeit- und Kostenintensiv. Außerdem ist die Anzahl der Kolonien, die so getestet werden können, begrenzt.The determination of the expression level is therefore time and cost intensive. In addition, the number of colonies that can be tested in this way is limited.
5 Die Verwendung von teuren Chemikalien bei diesem Nachweisverfahren ist außerdem nachteilig. Zudem kann aufgrund des hohen Zeitaufwands bei der Durchmusterung einer Genbank nur eine begrenzte Anzahl von Klonen in einem Durchgang untersucht werden. Zur Identifizierung von seltenen Transkripten ist es jedoch notwendig, eine große Anzahl von Klonen zu untersuchen. Bei Verwendung des beschriebenen Reportervektors müssen des- 5 halb unter Umständen mehrere Verfahrenszyklen durchlaufen werden bis die nötige Anzahl von Kolonien getestet wurde. Des weiteren können die Klone nur in einer relativ geringen Dichte auf die Kulturplatten aufgebracht werden, da eine zu hohe Koloniedichte pro Kulturplatte zu Problemen bei der Erstellung o von Abdrücken führen würde .5 The use of expensive chemicals in this detection method is also disadvantageous. In addition, due to the high amount of time required to screen a gene bank, only one can limited number of clones can be examined in one run. To identify rare transcripts, however, it is necessary to examine a large number of clones. If the reporter vector described is used, it may therefore be necessary to go through several process cycles until the necessary number of colonies has been tested. Furthermore, the clones can only be applied to the culture plates in a relatively low density, since an excessively high colony density per culture plate would lead to problems when making impressions.
Es bestand daher das Bedürfnis einen Reportervektor bereitzustellen, der die Nachteile der bekannten Reportervektoren zumindest teilweise überwindet und ein schnelles, Wirtschaft- 5 liches und wirkungsvolles Nachweisverfahren zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen in vivo erlaubt.There was therefore a need to provide a reporter vector which at least partially overcomes the disadvantages of the known reporter vectors and allows a fast, economical and effective detection method for the investigation of molecular interactions in vivo.
Diese Aufgabe wird durch den erfindungsgemäßen Reportervektor gelöst, der eine regulatorische Nukleinsäuresequenz umfaßt, o die einen Operator und einen Promotor enthält, operativ verknüpft mit einem Reportergen, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reportergen für ein Photoprotein kodiert, dessen Expression durch Bestrahlung nachweisbar ist .This object is achieved by the reporter vector according to the invention, which comprises a regulatory nucleic acid sequence, o which contains an operator and a promoter, operatively linked to a reporter gene, which is characterized in that the reporter gene codes for a photoprotein, the expression of which can be detected by radiation.
s Durch den erfindungsgemäßen Reportervektor wird es möglich, positive Klone durch Bestrahlung nachzuweisen, wobei überraschenderweise der Hintergrund des Systems in vivo sehr gering ist und ein gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis aufweist. Der große Vorteil liegt darin begründet, daß für den Nachweis o einer Expression des Reportergens weder Filterabdrücke angefertigt werden müssen, noch daß in einem weiteren Arbeitsschritt eine chemische Reaktion durchgeführt werden muß. Die Kolonien können nun dichter auf die Kulturplatten aufgebracht werden, so daß weniger Kulturplatten notwendig sind und 5 gleichzeitig eine größere Anzahl von Kolonien in einem Arbeitsschritt durchgemustert werden können. Ein weiterer Vorteil ist, daß durch den erfindungsgemäßen Reportervektor die Verwendung von teuren Chemikalien zum Nachweis positiver Klone entfällt. Dadurch werden Materialien und kostspielige Arbeitszeit eingespart. Vor allem reduziert sich jedoch die nötige Arbeitszeit zur Identifizierung positiver Klone.s The reporter vector according to the invention makes it possible to detect positive clones by irradiation, the background of the system surprisingly being very low in vivo and having a good signal / background ratio. The great advantage lies in the fact that for the detection of expression of the reporter gene neither filter impressions have to be made nor that a chemical reaction has to be carried out in a further working step. The colonies can now be applied more densely to the culture plates, so that fewer culture plates are necessary and 5 a larger number of colonies can be screened simultaneously in one work step. Another advantage is that the reporter vector according to the invention the use of expensive chemicals for the detection of positive clones is eliminated. This saves materials and expensive working hours. Above all, however, the working time required to identify positive clones is reduced.
Der erfindungsgemäße Reportervektor kann grundsätzlich ein beliebiger Vektor sein, z. B. ein extrachromosomaler oder chromosomaler Vektor. Weiterhin kann der Vektor ein viraler Vektor, ein Plasmid oder ein künstliches Chromosom sein. Vor- o zugsweise ist der Reportervektor ein Plasmid. Er enthält zweckmäßigerweise die für die Propagierung in der vorgesehenen Wirtszelle erforderlichen Komponenten. Sie beinhalten einen Replikationsursprung z. B. einen bakteriellen Replikations- ursprung wie etwa Col E 1 oder p5A oder einen eukaryontischen 5 Replikationsursprung wie etwa den Hefe 2 micron Replikationsursprung. Weiter kann der Reportervektor einen oder mehrere Selektionsmarker wie etwa Ampicillin, Penicillin, Tetracyclin zur Selektion in Bakterienzellen oder/und Selektionsmarker enthalten, die eine Selektion in Hefezellen möglich machen, o wie beispielsweise das Gen für Ura3 , Leu2 , Lys2 , Trpl, Cys3 oder Ade2. Diese Selektionsmarker werden in Verbindung mit entsprechenden auxotrophen Hefe-Stämmen und geeigneten Hefe- Kulturmedien verwendet. Man bezeichnet die Kulturmedien auch als "dropout" Medien. Durch ihren Einsatz kann die Anzahl der 5 falsch-positiven Klone reduziert werden. Außerdem enthält 'der Reportervektor eine Transkriptionstermiationssequenz wie beispielsweise eine ADHl-Sequenz. Es war überraschend, daß der erfindungsgemäße Reportervektor nach Transfektion in der Zelle keine Basalexpression des Reportergens zeigte. Dies führt o vorteilhafter Weise bei seinem Einsatz zu einem sehr guten Signal/Hintergrund-Verhältnis. Darüber hinaus korreliert die Signalstärke bei Bestrahlung mit der Expressionsstärke und läßt somit auch einen Rückschluß auf die Stärke der molekularen Wechselwirkung zu. 5The reporter vector according to the invention can in principle be any vector, e.g. B. an extrachromosomal or chromosomal vector. Furthermore, the vector can be a viral vector, a plasmid or an artificial chromosome. The reporter vector is preferably a plasmid. It expediently contains the components required for propagation in the intended host cell. They include an origin of replication e.g. B. a bacterial origin of replication such as Col E 1 or p5A or a eukaryotic origin of replication such as the yeast 2 micron origin of replication. Furthermore, the reporter vector can contain one or more selection markers such as ampicillin, penicillin, tetracycline for selection in bacterial cells and / or selection markers which enable selection in yeast cells, such as the gene for Ura3, Leu2, Lys2, Trpl, Cys3 or Ade2 . These selection markers are used in conjunction with corresponding auxotrophic yeast strains and suitable yeast culture media. The cultural media are also referred to as "dropout" media. By using them, the number of 5 false positive clones can be reduced. In addition, 'the reporter vector contains a Transkriptionstermiationssequenz such as a ADHL sequence. It was surprising that the reporter vector according to the invention showed no basal expression of the reporter gene after transfection in the cell. This advantageously leads to a very good signal / background ratio when used. In addition, the signal strength upon irradiation correlates with the expression level and thus also allows conclusions to be drawn about the strength of the molecular interaction. 5
Als Promotor kann jeder geeignete Promotor in dem Reportervektor verwendet werden, der operativ mit dem Reportergen ver- knüpft ist. Vorzugsweise beinhaltet der Reportervektor den Gall,10 Minimalpromotor. Der Operator kann weitere verschiedene Sequenzmotive enthalten, vorzugsweise umfaßt er mindestens ein Gal4 -Bindungsmotiv oder/und mindestens ein 5 LexA-Bindungsmotiv.Any suitable promoter that is operatively linked to the reporter gene can be used as the promoter in the reporter vector. is knotting. The reporter vector preferably contains the Gall, 10 minimal promoter. The operator can contain further different sequence motifs, preferably comprising at least one Gal4 binding motif and / or at least one LexA binding motif.
Als Reportergen kann jedes photoaktivierbare Protein verwendet werden, dessen Expression durch Bestrahlung nachweisbar ist. Bevorzugt ist das Photoprotein ein GFP (Green Fluorescent Pro- 0 tein) aus dem Organismus Aequorea victoria oder ein modifiziertes GFP (vgl. z.B. WO 95/07463; WO 95/21191; WO 96/23810; WO 96/23910 oder WO 96/23898) .Any photoactivatable protein whose expression can be detected by radiation can be used as the reporter gene. The photoprotein is preferably a GFP (Green Fluorescent Protein) from the organism Aequorea victoria or a modified GFP (see, for example, WO 95/07463; WO 95/21191; WO 96/23810; WO 96/23910 or WO 96 / 23898).
Weiter weist der Reportervektor gegebenenfalls singuläre Klo- 5 nierungsstellen auf. Unter singulärer Klonierungsstelle ist zu verstehen, daß ein Restriktionsenzym nur an einer Stelle in dem Reportervektor schneiden kann.The reporter vector may also have unique cloning sites. By singular cloning site is meant that a restriction enzyme can only cut at one point in the reporter vector.
Die singuläre Klonierungsstelle befindet sich vorzugsweise 5'- o seitig des ATG-Startcodons des Reportergens. Der Abstand zwischen ATG und singulärer Klonierungsstelle beträgt dabei vorzugsweise 50 bis 4.000 bp. Die singuläre Klonierungsstelle kann eine Schnittstelle für jedes beliebige Restriktionsenzym sein, vorzugsweise enthält die singuläre Klonierungsstelle 5 Schnittstellen für Restriktionsenzyme mit einer 6 bis 8 bp langen Erkennungssequenz, z. B. Notl, Nrul oder/und Spei .The singular cloning site is preferably located 5 'to the side of the ATG start codon of the reporter gene. The distance between the ATG and the singular cloning site is preferably 50 to 4,000 bp. The singular cloning site can be an interface for any restriction enzyme, preferably the singular cloning site contains 5 sites for restriction enzymes with a 6 to 8 bp recognition sequence, e.g. B. Notl, Nrul and / or Spei.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist in der singulären Klonierungsstelle ein heterologes Nukleinsäurefragment inse- o riert. Dieses kann in seiner Größe variieren, vorzugsweise hat es eine Größe von 20 bp bis 4 kbp.In a preferred embodiment, a heterologous nucleic acid fragment is inserted in the singular cloning site. This can vary in size, preferably it has a size of 20 bp to 4 kbp.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die transient oder stabil mit einem wie oben beschriebenen Repor- 5 tervektor transformiert ist. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen einer Nukleinsäure und einem Polypeptid, wobei ein Reportervektor, in den eine erste heterologe Nukleinsäuresequenz inseriert ist, in eine Zelle transformiert wird, mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der eine zweite heterologe Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines Promotors enthält, die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der zweiten Nukleinsäure- sequenz stattfinden kann und die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der zweiten Nukleinsäuresequenz und der ersten Nukleinsäuresequenz auf dem Reportervek- tor nachweisbar ist.Another object of the invention is a cell that is transiently or stably transformed with a reporter vector as described above. Yet another object of the invention is a method for the detection of molecular interactions between a nucleic acid and a polypeptide, wherein a reporter vector into which a first heterologous nucleic acid sequence is inserted is transformed into a cell, at least a second vector is transformed into this cell, which contains a second heterologous nucleic acid sequence under the control of a promoter, the transformed cell is cultivated under conditions such that expression of the second nucleic acid sequence can take place and the expression of the reporter gene is examined in the cell, the increase in expression of the reporter gene resulting in An interaction between the expression product of the second nucleic acid sequence and the first nucleic acid sequence can be detected on the reporter vector.
Die in dem Verfahren, das als One-Hybrid Verfahren bezeichnet wird, verwendeten Vektoren werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren in die Zellen transformiert. Um die Zahl der Falsch- positiven Klone zu minimieren, wird gegebenenfalls eine Selektion mit geeigneten Selektionsverfahren durchgeführt. Beispielsweise die Verwendung von auxotrophen Hefestämmen in Verbindung mit geeigneten Medien und entsprechenden Genen, die in den tranformierten Vektoren enthalten sind.The vectors used in the process, which is referred to as a one-hybrid process, are transformed into the cells by processes known to those skilled in the art. In order to minimize the number of false positive clones, a selection with suitable selection methods is carried out if necessary. For example, the use of auxotrophic yeast strains in connection with suitable media and corresponding genes, which are contained in the transformed vectors.
Bei dem Transformationsverfahren kann der Reportervektor und der zweite Vektor gleichzeitig oder nacheinander in die Zelle transformiert werden. Die Vektoren können dabei transient oder stabil in die Zelle transformiert sein. Es ist auch möglich zuerst den Reportervektor in die Zelle zu transformieren und stabil transformierte Zellen herzustellen. In einer zweiten Transformation werden diese Zellen dann mit dem zweiten Vektor transient oder stabil zur Untersuchung der molekularen Wechselwirkung tranformiert .In the transformation process, the reporter vector and the second vector can be transformed into the cell simultaneously or in succession. The vectors can be transiently or stably transformed into the cell. It is also possible to first transform the reporter vector into the cell and to produce stably transformed cells. In a second transformation, these cells are then transformed transiently or stably with the second vector to investigate the molecular interaction.
Üblicherweise liegt in dem Reportervektor eine erste heterologe Nukleinsäuresequenz vor, deren Wechselwirkung mit Poly- peptiden untersucht werden soll. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, die für Polypeptide kodieren, die mit einer ersten gegebenen heterolo- gen Nukleinsäuresquenz, welche in dem Reportervektor inseriert ist, wechselwirken können. Hierzu kann die zweite heterologe Nukleotidsequenz aus einer Sequenzbibliothek, die eine Vielzahl von verschiedenen, potentiell wechselwirkenden Sequenzen enthält, z. B. aus einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek, stammen. 0Usually there is a first heterologous nucleic acid sequence in the reporter vector, whose interaction with poly- peptides to be examined. The method can be used to isolate nucleic acid sequences which code for polypeptides which can interact with a first given heterologous nucleic acid sequence which is inserted in the reporter vector. For this purpose, the second heterologous nucleotide sequence from a sequence library which contains a large number of different, potentially interacting sequences, e.g. B. from a genomic library or a cDNA library. 0
Auf diese Weise ist es möglich, die Expressionsprodukte der Sequenzbibliothek auf das Vorhandensein von Polypeptiden zu untersuchen, welche mit einer ersten gegebenen heterologen Nukleinsäuresequenz in dem Reportervektor wechselwirken kön- 5 nen.In this way it is possible to examine the expression products of the sequence library for the presence of polypeptides which can interact with a first given heterologous nucleic acid sequence in the reporter vector.
Es ist aber auch möglich, für eine gegebene zweite heterologe Nukleinsäuresequenz, die in dem zweiten Vektor enthalten ist und exprimiert wird, Nukleinsäuresequenzen aus einer Sequenz- o bibliothek zu bestimmen, die mit diesem Expressionsprodukt wechselwirken. Dazu stammt vorzugsweise die erste heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer genomischen oder cDNA Bibliothek.However, it is also possible for a given second heterologous nucleic acid sequence which is contained in the second vector and is expressed to determine nucleic acid sequences from a sequence library which interact with this expression product. For this purpose, the first heterologous nucleic acid sequence preferably comes from a genomic or cDNA library.
5 Auf diese Weise wird die Wechselwirkung des Expressionsprodukts aus dem zweiten Vektor mit allen aus der Genbank stammenden heterologen Nukleinsäuresequenz untersucht.5 In this way, the interaction of the expression product from the second vector with all heterologous nucleic acid sequences originating from the gene bank is investigated.
Das vorliegende Verfahren bietet den Vorteil, daß eine Viel- 0 zahl von Klonen und unterschiedliche Genbanken auf das Vorhandensein von Expressionsprodukten, welche mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz wechselwirken, untersucht werden können. Andererseits können auch für ein gegebenes Expressionsprodukt einfach und schnell Nukleinsäuresequenzen identifiziert wer- 5 den, die mit dem gegebenen Polypeptid wechselwirken können. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit einem wie oben dargestellten Reportervektor oder/und mindestens einem zweiten wie oben dargestellten Vektor. Die Zelle 5 ist vorzugsweise eine Hefezelle.The present method offers the advantage that a large number of clones and different gene banks can be examined for the presence of expression products which interact with a specific nucleic acid sequence. On the other hand, nucleic acid sequences that can interact with the given polypeptide can also be identified quickly and easily for a given expression product. In a preferred embodiment, the invention relates to a cell that is transiently or stably transformed with a reporter vector as shown above and / or at least one second vector as shown above. Cell 5 is preferably a yeast cell.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen zwei Polypeptiden, wobei ein Reportervektor, der gegebenenfalls eine o heterologe Nukleinsäueresequenz enthält, in eine Zelle transformiert wird, mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer ersten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Bindedomäne des Operators auf dem Reportervektor 5 kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält, mindestens noch ein dritter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer zweiten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nukleinsäuresequenz, die für einen Transkriptions-Aktivator des Reportergens kodiert, unter Kontrolle o eines Promotors enthält, die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der heterologen Nukleinsäuresequenzen stattfinden kann und die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das 5 Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der ersten Nukleinsäuresequenz und dem Expressionsprodukt der zweiten Nukleinsäuresequenz nachweisbar ist.Another object of the invention is a method for the detection of molecular interactions between two polypeptides, wherein a reporter vector, which optionally contains an o heterologous nucleic acid sequence, is transformed into a cell, at least a second vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene from a first heterologous nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence which codes for a binding domain of the operator on the reporter vector 5, under the control of a promoter, at least one third vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene from a second heterologous nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence which is suitable for encodes a transcription activator of the reporter gene, contains under control o a promoter, the transformed cell is cultivated under such conditions that expression of the heterologous nucleic acid sequences can take place and expression of the reporter gene is examined in the cell, the occurrence of an interaction between the expression product of the first nucleic acid sequence and the expression product of the second nucleic acid sequence being detectable by an increase in the expression of the reporter gene.
In diesem Verfahren werden molekulare Wechselwirkungen zwi- 0 sehen zwei Polypeptiden untersucht. Man will für eine gegebene Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, herausfinden, welche anderen Polypeptide mit diesem Polypeptid wechselwirken können. Um die Expressionsprodukte einer Zelle oder eines Gewebes zu untersuchen, stammt vorzugsweise die erste 5 oder zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank. Das Verfahren wird in mit den verwendeten Vektoren kompatiblen Zellen durchgeführt. Vorzugsweise verwendet man eine Hefezel- le. Bezüglich möglicher Hefestämme und Selektionsmarker sowie geeigneter Kulturmedien wird auf die Veröffentlichen von P. L. Bartel et al . , (Cellular Interactions in Development-A Practi- cal Approach, Ed. D. A. Hartley IRL Press, 1993) verwiesen, 5 die hiermit Bestandteil dieser Anmeldung ist .In this method, molecular interactions between two polypeptides are examined. For a given nucleic acid sequence encoding a polypeptide, one wants to find out which other polypeptides can interact with that polypeptide. In order to examine the expression products of a cell or a tissue, the first 5 or second heterologous nucleic acid sequence preferably comes from a gene bank. The method is carried out in cells compatible with the vectors used. A yeast cell is preferably used. le. With regard to possible yeast strains and selection markers and suitable culture media, PL Bartel et al. , (Cellular Interactions in Development-A Practical Approach, Ed. DA Hartley IRL Press, 1993), 5 which is hereby incorporated into this application.
Der zweite Vektor beinhaltet ein Fusionsgen, das eine Bindedomäne enthält. Diese Bindedomäne kann an eine Sequenz des Operators des Reportervektors binden. Vorzugsweise umfaßt die o Bindedomäne eine LexA-Sequenz .The second vector contains a fusion gene that contains a binding domain. This binding domain can bind to a sequence of the operator of the reporter vector. The binding domain preferably comprises a LexA sequence.
Der dritte Vektor, der in diesem Verfahren verwendet wird, enthält ein Fusionsgen, das für einen Transkriptions-Aktivator des Reportergens kodiert. Dieser Aktivator kann jeder geeig- 5 nete Aktivator sein, vorzugsweise umfaßt er eine B42-, GAL4- Sequenz oder/und eine VP16 (Herpex-Simplex) -Sequenz .The third vector used in this method contains a fusion gene that encodes a transcriptional activator of the reporter gene. This activator can be any suitable activator, preferably it comprises a B42, GAL4 sequence and / or a VP16 (Herpex-Simplex) sequence.
Es ist auch möglich, daß sich der eine oder beide Wechselwirkungspartner aus zwei oder mehreren Untereinheiten zusammen- o setzen. Die einzelnen Untereinheiten können von verschiedenen Vektoren kodiert sein oder deren kodierende Sequenzen können gemeinsam auf einem Vektor vorhanden sein.It is also possible for one or both interaction partners to be composed of two or more subunits. The individual subunits can be encoded by different vectors or their coding sequences can be present together on one vector.
Zum Nachweis der Expression des Reportergens, deren Anstieg 5 durch das Auftreten der DNA-Proteine bzw. Protein - Protein- Wechselwirkungen bedingt ist, werden die Zellen bestrahlt, was zu einem Farbsignal führt. Vorzugsweise umfaßt die Bestrahlung eine Wellenlänge von 280 nm bis 400 nm. Am meisten bevorzugt umfaßt sie 350 nm bis 375 nm. 0To detect the expression of the reporter gene, the increase 5 of which is caused by the occurrence of the DNA proteins or protein-protein interactions, the cells are irradiated, which leads to a color signal. The radiation preferably comprises a wavelength of 280 nm to 400 nm. Most preferably it comprises 350 nm to 375 nm. 0
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit einem wie oben beschriebenen Reportervektor oder/und mit mindestens einem zweiten wie oben beschriebenen Vektor oder/und 5 mit mindestens einem dritten wie oben beschriebenen Vektor. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer transient oder stabil transformierten wie oben beschriebenen Zelle, zur Untersuchtung von molekularen Wechselwirkungen.In a preferred embodiment, the invention relates to a cell which is transiently or stably transformed with a reporter vector as described above and / or with at least one second vector as described above or / and 5 and with at least a third vector as described above. Another object of the invention is the use of a transiently or stably transformed cell as described above, for the investigation of molecular interactions.
5 Die Beispiele zusammen mit Figur 1 beschreiben die Erfindung genauer .5 The examples together with FIG. 1 describe the invention in more detail.
BeispieleExamples
0 1. Hefestämme und Plasmide0 1. Yeast strains and plasmids
Es wurden der Saccharomyces cerevisiae Stamm EGY48 (ura3, trpl, his3, lexA Operator-LEU2) (2) und die Hefe-Shuttle-Vektoren, die die lexA DNA-Bindedomäne (pEG202) und die B42 Akti- 5 vatordomäne (pJG4-5) (3) enthalten, verwendet. Die Plasmide pVA3, das für Maus p53 (72-390) kodiert, pTDI , das für das large-T Antigen (84-708) (LTA) kodiert und pGAD424 wurden von Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornien, USA) erhalten. Ein EcoRI -Sall Fragment, das das p53-Gen von pVA3 enthält, o wurde zwischen die singulären Restriktionsstellen EcoRI und Sall in pEG202 subkloniert . Ein BamHI Fragment, das das LTA- Gen von pTDI enthält, wurde in derselben Orientierung in die singuläre Restriktionsschnittstelle BamHI von pJG4-5 subkloniert. Das rekombinante Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert , 5 dann mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und mit T4 DNA-Ligase rezirkularisiert , um das LTA-Gen "in-frame" zu setzen.There were the Saccharomyces cerevisiae strain EGY48 (ura3, trpl, his3, lexA Operator-LEU2) (2) and the yeast shuttle vectors, the lexA DNA binding domain (pEG202) and the B42 Aktiv 5 domain (pJG4-5 ) (3) included, used. Plasmids pVA3 encoding mouse p53 (72-390), pTDI encoding large-T antigen (84-708) (LTA) and pGAD424 were obtained from Clontech Laboratories (Palo Alto, California, USA). An EcoRI -Sall fragment, which contains the p53 gene of pVA3, o was subcloned between the unique restriction sites EcoRI and Sall in pEG202. A BamHI fragment containing the LTA gene from pTDI was subcloned in the same orientation into the unique restriction site BamHI from pJG4-5. The recombinant plasmid was linearized with EcoRI, 5 then filled in with T4 DNA polymerase and recircularized with T4 DNA ligase to put the LTA gene "in-frame".
2. Herstellung der Vektoren2. Production of the vectors
0 Die Reportervektoren pGNGl und pGNG2 sind in Figur 1 dargestellt. Die minimal Gall, 10 -Promotorsequenz in pSH18-34 (2) enthält 4 Kopien der LexA-Bindestelle . Sie wurde mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (4) amplifiziert . Der erste Primer wurde 2 Basenpaare 5'-seitig des LexA-Operators positioniert 5 und mit einer Hindlll Restriktionsschnittstelle an seinem 5'- Ende versehen. Der zweite Primer war komplementär zu der Gall, 10 -Sequenz bis zu dem ATG-Startcodon für das LacZ-Gen, ohne sie zu enthalten und er enthielt eine Xbal Restriktions- schnittstelle an seinem 5 '-Ende. Das PCR-Produkt wurde zwischen die singulären Restrikionsschnittstellen HindiII und Xbal in das Plasmid pGFPuv (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, 5 USA) subkloniert. Von diesem Konstrukt wurde ein HindiII -EcoRI DNA- Fragment, das das Minimalpromotor-GFP Fusionsgen enthielt in den Hefe-Shuttle-Vektor YEp357R (5) zwischen die HindiII und EcoRI Restriktionsschnittstellen der "Multiple Cloning Site" subkloniert, um den Vektor pPGNGl zu ergeben. Die komp- 0 lementären Desoxyribonukleotide MCSl (5' -AGCTTGCGGCCGCTCGCGAC- TAGT und MCS2 (5 ' -AGCTACTAGTCGCGAGCGGCGCA) mit kompatiblen Hindlll Enden wurden hybridisiert und dann in die singuläre Restriktionsschnittstelle HindiII von pPGNGl kloniert, um den Vektor pPGNG2 zu ergeben. Schließlich wurde ein 625 bp EcoRI - 5 XmnI Fragment, das den ADHl -Terminator aus pGAD424 (6) enthält in das 6-kbp EcoRI -PvuII Fragment von pPGNGl bzw. pPGNG2 kloniert, um die Reprotervektoren pGNGl bzw. pGNG2 zu ergeben.0 The reporter vectors pGNGl and pGNG2 are shown in FIG. 1. The minimal Gall, 10 promoter sequence in pSH18-34 (2) contains 4 copies of the LexA binding site. It was amplified using the polymerase chain reaction (4). The first primer was positioned 2 base pairs 5 'on the 5' side of the LexA operator 5 and provided with a HindIII restriction site at its 5 'end. The second primer was complementary to the Gall, 10 sequence up to the ATG start codon for the LacZ gene, without containing it and it contained an Xbal restriction site at its 5 'end. The PCR product was subcloned into the plasmid pGFPuv (Clontech, Palo Alto, California, 5 USA) between the unique restriction sites HindiII and Xbal. From this construct, a HindiII-EcoRI DNA fragment containing the minimal promoter-GFP fusion gene was subcloned into the yeast shuttle vector YEp357R (5) between the HindiII and EcoRI restriction sites of the "Multiple Cloning Site" to give the vector pPGNGl . The complementary deoxyribonucleotides MCSl (5 '-AGCTTGCGGCCGCTCGCGAC-TAGT and MCS2 (5' -AGCTACTAGTCGCGAGCGGCGCA) with compatible Hindlll ends were hybridized and then into the unique restriction site HindiII from pPGNG25 bp EcoRI - 5 XmnI fragment, which contains the ADH1 terminator from pGAD424 (6), cloned into the 6 kbp EcoRI -PvuII fragment of pPGNGl or pPGNG2 in order to give the reprotector vectors pGNGl or pGNG2.
3. Transformation der Hefezellen o3. Transformation of the yeast cells o
Der S.cerevisiae Stamm EGY48 wurde mit der Lithiumacetat Methode (7) mit pGNGl transformiert und auf synthetischem drop- out-uracil (SD-Ura) Platten, die 2 % (w/v) Galactose und 1 % (w/v) Raffinose enthielten, selektiert. Der so erhaltene Stamm 5 wurde dann mit unterschiedlichen auf pEG202 basierenden "bait" und pJG4-5 basierenden "prey" Plasmiden transformiert und auf geeignetem SD-Medium enthaltend Galactose und Raffinose selektiert. Kulturplatten, die Hefetransformanten aufwiesen, wurden unter einer UV-Lampe (366 nm) untersucht. Zusätzlich wurden 0 dieselben "bait" und "prey" Plasmide mit pSH18-34 in EGY48 kotransformiert und auf SD-Mediumkulturplatten, welche X-Gal enthielten, aufgebracht, um das Ausmaß der jß-Galactosidaseak- tivität sichtbar zu machen.The S.cerevisiae strain EGY48 was transformed with the lithium acetate method (7) with pGNGl and on synthetic drop-out uracil (SD-Ura) plates containing 2% (w / v) galactose and 1% (w / v) raffinose contained, selected. The resulting strain 5 was then transformed with different "bait" and pJG4-5-based "prey" plasmids based on pEG202 and selected on a suitable SD medium containing galactose and raffinose. Culture plates containing yeast transformants were examined under a UV lamp (366 nm). In addition, the same "bait" and "prey" plasmids were co-transformed with pSH18-34 in EGY48 and applied to SD medium culture plates which contained X-Gal in order to visualize the extent of the β-galactosidase activity.
5 Ergebnisse5 Results
pGNGl und PGNG2pGNGl and PGNG2
5 Ein Reportervektor für das Two-Hybrid System (interaction trap) , pGNGl (Fig. 1) wurde hergestellt, welcher das GFP-Gen (Green Fluorescent Protein) enthält. Das Vektorgrundgerüst war abgeleitet von YEp357R, welches den URA3 Selektionsmarker und ein 2 Micron Replikationsursprung enthält. Das GFPuv-Gen, o welches in dem Vektor verwendet wurde, ist eine "cycle3" Variante des GFP, welches 18 x heller ist als das Wild-Typ-Protein (8) . Ein Minimalpromotor des Hefe GAL1 , 10-Gens, welches 8 Kopien der LexA-Sequenz enthielt, wurde 5'-seitig mit dem GFPuv-Gen verbunden und 3'-seitig des GFPuv-Gens wurde der 5 ADHl-Terminator mit ihm verbunden.5 A reporter vector for the two-hybrid system (interaction trap), pGNGl (FIG. 1) was produced, which contains the GFP gene (Green Fluorescent Protein). The vector backbone was derived from YEp357R, which contains the URA3 selection marker and a 2 micron origin of replication. The GFPuv gene, which was used in the vector, is a "cycle3" variant of the GFP, which is 18 times brighter than the wild-type protein (8). A minimal promoter of the yeast GAL1, 10 gene, which contained 8 copies of the LexA sequence, was linked to the GFPuv gene on the 5 'side and the 5 ADH1 terminator was linked to it on the 3' side of the GFPuv gene.
Ähnlich wurde der Reportervektor für das One-Hybrid System, pGNG2 (Fig. 1) konstruiert. Dieser enthält ungefähr 450 bp 5'- seitig des ATG Startkodons des GFPuv-Gens eine "Multiple Clo- o ning Site". Der Reportervektor pGNG2 enthält die singulären Klonierungsstellten Notl, Nrul und Spei. Hier kann eine "bait" DNA-Sequenz zur Untersuchung im One-Hybrid System inseriert sein.Similarly, the reporter vector for the one hybrid system, pGNG2 (Fig. 1), was constructed. This contains approximately 450 bp on the 5 'side of the ATG start codon of the GFPuv gene, a "multiple cloning site". The reporter vector pGNG2 contains the unique cloning sites Notl, Nrul and Spei. A "bait" DNA sequence can be inserted here for examination in the one-hybrid system.
5 Aktivierung des GFPuv Reporter-Gens5 Activation of the GFPuv reporter gene
Um die Brauchbarkeit des Vektors pGNGl für das Two-Hybrid System zu untersuchen, wurde es mit verschiedenen "bait" und "prey" Kontrollplasmiden (Tabelle) in S.cerevisiae EGY48 0 transformiert. Da das B42 -Aktivator-Hybridprotein, das von pJG4-5 kodiert wird und seine Abkömmlinge Galactoseinduktion für ihre Expression erfordern, wurden alle Hefetransformanten auf SD-Medium kultiviert, das diese Kohlenstoffquelle enthielt. Hefezellen, welche den pGNG-Vektor alleine enthielten, 5 zeigten keine sichtbare Fluoreszenz, wenn sie unter eine UV- Lampe gehalten wurden. Jedoch zeigten Hefezellen, die pGNGl und "bait" Vektoren (pEG202) enthielten, welche in der Lage waren, das von pESH18-34 kodierte LacZ-Reportergen zu aktivierten, auch die Fähigkeit, das GFPuv-Gen zu aktivieren. Hefezellen, die "Baitl" exprimierten, fluoreszierten deutlich stärker unter UV-Licht als diejenigen, welche "Bait2" expri- mierten. Dies deutet darauf hin, daß die Transaktivierung des "Baitl" stärker als die des "Bait2" war.In order to investigate the usability of the vector pGNGl for the two-hybrid system, it was transformed with various "bait" and "prey" control plasmids (table) in S.cerevisiae EGY48 0. Since the B42 activator hybrid protein encoded by pJG4-5 and its descendants require galactose induction for their expression, all yeast transformants were cultured on SD medium containing this carbon source. Yeast cells, which contained the pGNG vector alone, 5 showed no visible fluorescence when kept under a UV lamp. However, yeast cells containing pGNGl and "bait" vectors (pEG202) showed that capable were able to activate the LacZ reporter gene encoded by pESH18-34, also the ability to activate the GFPuv gene. Yeast cells that expressed "Baitl" fluoresced significantly more under UV light than those that expressed "Bait2". This indicates that the transactivation of the "Baitl" was stronger than that of the "Bait2".
Two-Hybrid System und das GFPuv- eportergenTwo-Hybrid System and the GFPuv eporter gene
Hefezellen wurden auch kotransformiert mit Vektoren, die ein p53-LexA Bindedomänen Hybridprotein und das Large-T AntigenYeast cells were also co-transformed with vectors containing a p53-LexA binding domain hybrid protein and the Large-T antigen
(LTA, von SV-40) , das mit der B42 -Aktivatordomäne fusioniert war, exprimiert . Das Standard Two-Hybrid System von Fields et al . zeigte, daß p53 und LTA wechselwirken (9). Die p53-LTA Wechselwirkung wurde auch beobachtet, wenn LacZ als Reportergene verwendet wurde (Tabelle, Zeile 5) . Diese Wechselwirkung war auch in der Lage das GFPuv-Reportergen des erfindungsgemäßen Reportervektors zu aktivieren (Zeile 5) , während der "Bait" Vektor alleine zu keinem Signal führte.(LTA, from SV-40) fused to the B42 activator domain. The standard two-hybrid system from Fields et al. showed that p53 and LTA interact (9). The p53-LTA interaction was also observed when LacZ was used as reporter genes (Table, line 5). This interaction was also able to activate the GFPuv reporter gene of the reporter vector according to the invention (line 5), while the "bait" vector alone gave no signal.
Drei weitere Proteinpaare wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das GFPuv-Reportergen des erfindungsgemäßen Reportervektors zu aktivieren. Preyl, Prey2 und Prey3 wurden ursprünglich mit Hilfe des Standard Two-Hybrid Systems isoliert und es wurde festgestellt, daß sie "Bait4" binden, da jedes Proteinpaar das LacZ-Reportergen aktivierte (Tabelle, Zeilen 7 bis 9) . Dieselben "Bait" Proteinkombinationen aktivierten das GFPuv-Re- portergen, wenn sie in Gegenwart von pGNGl (Zeilen 7 bis 9) koexprimiert wurden. "Bait4" alleine konnte keines der Repor- tergene aktivieren (Zeile 6) .Three further protein pairs were tested for their ability to activate the GFPuv reporter gene of the reporter vector according to the invention. Preyl, Prey2 and Prey3 were originally isolated using the standard two-hybrid system and were found to bind "Bait4" because each protein pair activated the LacZ reporter gene (Table, lines 7 to 9). The same "bait" protein combinations activated the GFPuv reporter when co-expressed in the presence of pGNGl (lines 7 to 9). "Bait4" alone could not activate any of the reporter genes (line 6).
Die Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen Reportervektors eine deutliche Verbesserung des bekannten Two-Hybrid Systems zur Durchmusterung von cDNA Genbanken dar- stellt. Der Reportervektor pGNGl zeigt keine nachweisbare basale Expression des GFP in Abwesenheit der "Bait" und "Prey" Vektoren. Jedoch wird in Gegenwart von molekularen Wechselwir- kungen oder transaktivierenden "Bait" Proteinen genügend viel GFP in den Hefezellen exprimiert, um ihren Nachweis zu erlauben. Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Reportervektors ist geringer als die der bekannten LacZ-Reportervektoren, 5 welche durch denselben Minimalpromotor reguliert werden. Die bereits mit anderen Reportergenen nachgewiesene Wechselwirkung zwischen p53 und dem Large-T Antigen und den anderen drei Proteinpaaren (Bait und Prey) wurde auch mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reportervektors nachgewiesen. Die geringere Sen- o sitivität gegenüber den bekannten Reportervektoren stellt dabei einen Vorteil dar, da dadurch die Zahl der Falschpositi- ven-Klone reduziert werden kann. Die Variabilität in der Intensität der Fluoreszenz für jedes Paar der getesteten Proteine stellt dabei eine qualitative Messung der Stärke der 5 Wechselwirkungen dar. Dies wurde in gleicher Weise mit den anderen Reportergenen beobachtet. Von praktischem Vorteil des erfindungsgemäßen Reportervektors gegenüber den bekannten Reportervektoren in dem Verfahren des One- und Two-Hybrid Systems stellt dabei die Tatsache dar, daß die erhaltenen o Kolonien direkt unter eine UV-Lampe (366 nm) gehalten werden können und sofort die positiven Klone sichtbar gemacht werden können ohne sie nochmals zu kultivieren. Damit entfallen die bei den bisher gebräuchlichen Reportervektoren nötigen Arbeitsschritte des Pickens der Kolonien, Testen der Aktivität s bzw. Kultivieren auf X-Gal enthaltenden Kulturplatten oder nochmaliges Kultivieren zum quantitativen Nachweis. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn eine Vielzahl von Kolonien getestet werden müssen. Außerdem ist es beim bisher verwendeten Reportervektoren üblich, nur Hefekulturen mit einer be- 0 stimmten Größe für die weitere Untersuchung auszuwählen. Damit werden mögliche positive Kolonien nicht berücksichtigt. Bei dem Verfahren, das den erfindungsgemäßen Reportervektor verwendet, werden alle Kolonien mit Hilfe der Fluoreszenz sichtbar gemacht und können weiter untersucht werden. 5The results show that the use of the reporter vector according to the invention represents a significant improvement in the known two-hybrid system for screening cDNA libraries. The reporter vector pGNGl shows no detectable basal expression of the GFP in the absence of the "Bait" and "Prey" vectors. However, in the presence of molecular interactions kung or transactivating "bait" proteins expressed enough GFP in the yeast cells to allow their detection. The sensitivity of the reporter vector according to the invention is lower than that of the known LacZ reporter vectors, 5 which are regulated by the same minimal promoter. The interaction between p53 and the Large-T antigen and the other three protein pairs (Bait and Prey) already detected with other reporter genes was also detected with the aid of the reporter vector according to the invention. The lower sensitivity compared to the known reporter vectors represents an advantage, since it can reduce the number of false positive clones. The variability in the intensity of the fluorescence for each pair of the proteins tested represents a qualitative measurement of the strength of the 5 interactions. This was observed in the same way with the other reporter genes. A practical advantage of the reporter vector according to the invention over the known reporter vectors in the process of the one- and two-hybrid system is the fact that the colonies obtained can be held directly under a UV lamp (366 nm) and the positive clones immediately can be made visible without cultivating them again. The steps of picking the colonies, testing the activity or cultivating on culture plates containing X-Gal, or cultivating again for quantitative detection, are thus no longer necessary in the previously used reporter vectors. This is particularly useful when a large number of colonies need to be tested. In addition, with the reporter vectors used to date, it is customary to select only yeast cultures with a specific size for further investigation. This does not take into account possible positive colonies. In the method using the reporter vector according to the invention, all colonies are made visible by means of fluorescence and can be examined further. 5
Auch der Reportervektor pGNG2 für das One-Hybrid System zeigte keine basale Expression von GFP in Hefezellen. Reportergene, die mit unterschiedlichen "Bait" und "Prey" Vektoren in S.cerevisiae EGY48 kotransformiert wurdenThe reporter vector pGNG2 for the one-hybrid system also showed no basal expression of GFP in yeast cells. Reporter genes co-transformed with different "bait" and "prey" vectors in S.cerevisiae EGY48
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0001
FußnotenFootnotes
+ = kotransformiert mit pSH18-34+ = co-transformed with pSH18-34
* = kotransformiert mit pGNGl* = co-transformed with pGNGl
§ = Large-T Antigen (84 bis 708)§ = Large-T antigen (84 to 708)
- = kein Signal; += schwach; ++= mittel; +++ = stark Literatur- = no signal; + = weak; ++ = medium; +++ = strong literature
1. Fields, S. &_ Song, 0. (1989) Nature 340, 245-246. 5 2. Estojak, J., Brent, R. & Golemis, E. A. (1995) Mol. Cell . Biol. 15, 5820-5829.1. Fields, S. & _ Song, 0. (1989) Nature 340, 245-246. 5 2. Estojak, J., Brent, R. & Golemis, E.A. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 5820-5829.
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Claims

Patentansprüche claims
Reportervektor umfassend eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, die einen Operator und einen Promotor enthält, operativ verknüpft mit einem Reportergen, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen für ein Photoprotein kodiert, dessen Expression durch Bestrahlung nachweisbar ist.Reporter vector comprising a regulatory nucleic acid sequence which contains an operator and a promoter, operatively linked to a reporter gene, characterized in that the reporter gene codes for a photoprotein, the expression of which can be detected by irradiation.
2. Reportervektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor den GAL1 , 10-Minimalpromotor und der Operator mindestens ein GAL4 -Bindungsmotiv oder/und min- destens ein LexA-Bindungsmotiv umfaßt.2. Reporter vector according to claim 1, characterized in that the promoter comprises the GAL1, 10 minimal promoter and the operator at least one GAL4 binding motif and / or at least one LexA binding motif.
3. Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Photoprotein ein Ca2+-aktivierbares Photoprotein ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aequorin, Obelin, Clytin, Mitrocomin, Berovin, Mnemiopsin oder Thalassicolin ist.3. Reporter vector according to one of claims 1 or 2, characterized in that the photoprotein is a Ca 2+ -activatable photoprotein selected from the group comprising aequorin, obelin, clytin, mitrocomin, berovin, mnemiopsin or thalassicolin.
4. Reportervektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Photoprotein ein GFP (Green Fluorescent Protein) ist .4. Reporter vector according to one of the preceding claims, characterized in that the photoprotein is a GFP (Green Fluorescent Protein).
5. Reportervektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 5'-seitig des ATG-Startcodons des Reportergens eine singuläre Klonierungsstelle enthalten ist.5. Reporter vector according to one of the preceding claims, characterized in that a singular cloning site is contained on the 5 'side of the ATG start codon of the reporter gene.
6. Reportervektor nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand ATG zu singulärer Klonierungsstelle von 50 bis 4.000 bp beträgt. 6. reporter vector according to claim 5, characterized in that the distance ATG to the singular cloning site is from 50 to 4,000 bp.
7. Reportervektor nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die singuläre Klonierungsstelle Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Notl, Nrul oder/und Spei enthält.7. reporter vector according to claim 5 or 6, characterized in that the singular cloning site contains interfaces for the restriction enzymes Notl, Nrul or / and Spei.
8. Reportervektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Klonierungsstelle ein heterologes Nukleinsäurefragment inseriert ist.8. Reporter vector according to one of claims 5 to 7, characterized in that a heterologous nucleic acid fragment is inserted in the cloning site.
9. Reportervektor nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Nukleinsäurefragment eine Größe von 20 bp bis 4 kbp hat.9. reporter vector according to claim 8, characterized in that the heterologous nucleic acid fragment has a size of 20 bp to 4 kbp.
10. Zelle, die transient oder stabil mit einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 transformiert ist.10. Cell that is transformed transiently or stably with a reporter vector according to one of claims 1 to 9.
11. Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen, dadurch gekennzeichnet, daß a) ein Reportervektor nach Anspruch 8 oder 9, in den eine erste heterologe Nukleinsäuresequenz inseriert ist, in eine Zelle transformiert wird, b) mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der eine zweite heterologe Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines Promotors enthält, c) die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der zweiten11. A method for the detection of molecular interactions, characterized in that a) a reporter vector according to claim 8 or 9, into which a first heterologous nucleic acid sequence is inserted, is transformed into a cell, b) at least a second vector is transformed into this cell, which contains a second heterologous nucleic acid sequence under the control of a promoter, c) the transformed cell is cultivated under conditions such that expression of the second
Nukleinsäuresequenz stattfinden kann, und d) die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der zweiten Nuklein- säuresquenz und der ersten Nukleinsäuresequenz auf dem Reportervektor nachweisbar ist. Nucleic acid sequence can take place, and d) the expression of the reporter gene is examined in the cell, an increase in the expression of the reporter gene being able to detect the occurrence of an interaction between the expression product of the second nucleic acid sequence and the first nucleic acid sequence on the reporter vector.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt .12. The method according to claim 11, characterized in that the second heterologous nucleic acid sequence comes from a gene bank.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt .13. The method according to claim 11, characterized in that the first heterologous nucleic acid sequence comes from a gene bank.
14. Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit14. Cell that is transiently or stably transformed with
(a) einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder/und(a) a reporter vector according to one of claims 1 to 9 or / and
(b) mindestens einem zweiten Vektor nach Anspruch 11 (b) .(b) at least one second vector according to claim 11 (b).
15. Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen, dadurch gekennzeichnet, daß (a) ein Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in eine Zelle transformiert wird,15. A method for the detection of molecular interactions, characterized in that (a) a reporter vector according to one of claims 1 to 9 is transformed into a cell,
(b) mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer ersten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nuklein- säuresequenz, die für eine Bindedomäne des Operators auf dem Reportervektor kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält,(b) at least one second vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene from a first heterologous nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence, which codes for a binding domain of the operator on the reporter vector, under the control of a promoter,
(c) mindestens noch ein dritter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer zweiten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer(c) at least one third vector is transformed into this cell, which contains a fusion gene consisting of a second heterologous nucleic acid sequence and one
Nukleinsäuresequenz, die für einen Transkriptions- Aktivator des Reportergens kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält,Contains nucleic acid sequence which codes for a transcription activator of the reporter gene under the control of a promoter,
(d) die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der heterologen(d) culturing the transformed cell under conditions such that expression of the heterologous
Nukleinsäuresequenzen stattfinden kann und (e) die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der ersten Nuklein- säuresequenz und dem Expressionsprodukt der zweitenNucleic acid sequences can take place and (e) the expression of the reporter gene is examined in the cell, an increase in the expression of the reporter gene resulting in an interaction between the expression product of the first nucleic acid sequence and the expression product of the second
Nukleinsäuresequenz nachweisbar ist.Nucleic acid sequence is detectable.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die erste oder zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt .16. The method according to claim 15, characterized in that the first or second heterologous nucleic acid sequence comes from a gene bank.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Hefezelle ist.17. The method according to any one of claims 11 to 16, characterized in that the cell is a yeast cell.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindedomäne eine LexA-Sequenz umfaßt.18. The method according to any one of claims 15 to 17, characterized in that the binding domain comprises a LexA sequence.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator eine B42-, Gal4- oder/und VP16-Sequenz umfaßt .19. The method according to any one of claims 15 to 18, characterized in that the activator comprises a B42, Gal4 or / and VP16 sequence.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung bei einer Expression des Reportergens zu einem Farbsignal führt .20. The method according to any one of claims 13 to 19, characterized in that the radiation leads to a color signal when the reporter gene is expressed.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung eine Wellenlänge von 280 nm bis 400 nm umfaßt, vorzugsweise 350 nm bis 375 nm. 21. The method according to claim 20, characterized in that the radiation comprises a wavelength of 280 nm to 400 nm, preferably 350 nm to 375 nm.
22. Zelle, die transient oder stabil transformiert ist mit22. Cell that is transiently or stably transformed with
(a) einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder/und(a) a reporter vector according to one of claims 1 to 9 or / and
(b) mit mindestens einem zweiten Vektor nach Anspruch 15 s (b) oder/und(b) with at least one second vector according to claim 15 s (b) or / and
(c) mit mindestens einem dritten Vektor nach Anspruch 15(c) with at least a third vector according to claim 15
(c) .(c).
23. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 14 oder o 22 zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen. 23. Use of a cell according to one of claims 14 or o 22 for the investigation of molecular interactions.
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