Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen Detection of microsporidia and microsporidia infections
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft den Nachweis von Mikrosporidien, insbesondere aus klinischem Material von Menschen und Tieren sowie aus Umweltproben und Nahrungsmitteln durch Antigen-Antikörper-Reaktionen.The invention relates to the detection of microsporidia, in particular from clinical material of humans and animals as well as from environmental samples and foods by antigen-antibody reactions.
Es ist bekannt, daß Mikrosporidien eine ungewöhnlich schwer nachzuweisende Gruppe von Parasiten darstellen. Obwohl vor dem Auftreten von HIV-Infektionen klinische Manifestationen der Mikrosporidien selten waren, bzw. nicht als solche erkannt worden sind, deuten serologische Untersuchungen aus Schweden darauf hin, daß 12% immunkompetenter Erwachsener und 33% der AIDS-Patienten mit Mikrosporidien infiziert sind oder waren [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24:13-18]. In Europa, Australien und den USA wurden sie bei 15 bis 30% von AIDS-Patienten, die an Durchfall litten, gefunden [Canning et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27:229-236]. Neuere Untersuchungen belegen, daß auch für Deutschland davon ausgegangen werden muß, daß die überwiegende Zahl der Mikrosporidiosen nicht als solche diagnostiziert werden [Franzen et al. (1994) Infection 22:417-419]. Besondere Schwierigkeiten bereitet der Nachweis von Mikrosporidien der Gattung Enterozytozoon. E. bieneusi ist zusammen mit Encephalitozoon (Septata) intestinalis und Encephalitozoon hellem nicht nur am häufigsten für Mikrosporidieninfektionen bei AIDS- Patienten verantwortlich, sondern auch für die klinisch fulminantesten Verläufe [Curry & Canning (1993) J. Inf. 27:229-236; Garcia & Shimizo (1993) b. Med 24:13-18]. E. bieneusi befallt vor allem Εnterozyten des Dünndarms, aber auch den Dickdarm und führt zu unstillbaren, chronisch-sekretorischen Diarrhöen mit ausgeprägtem körperlichem Verfall. Über die Epidemiologie ist äußerst wenig bekannt, lediglich der Nachweis von E. bieneusi bei einem HIV-negativen Patienten mit schwerer Diarrhö [Sandfort et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27:229-236] läßt darauf schließen, daß zumindest diese Art beim Menschen verbreiteter ist als bisher angenommen wurde.Microsporidia is known to be an unusually difficult group of parasites to detect. Although clinical manifestations of microsporidia were rare, or were not recognized as such, prior to the onset of HIV infection, serological studies from Sweden indicate that 12% of immunocompetent adults and 33% of AIDS patients are or were infected with microsporidia [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24: 13-18]. In Europe, Australia and the USA, they were found in 15 to 30% of AIDS patients with diarrhea [Canning et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236]. Recent studies show that it must also be assumed for Germany that the majority of microsporidiosis are not diagnosed as such [Franzen et al. (1994) Infection 22: 417-419]. The detection of microsporidia of the genus Enterozytozoon presents particular difficulties. E. bieneusi, together with Encephalitozoon (Septata) intestinalis and Encephalitozoon hellem, is not only most frequently responsible for microsporidia infections in AIDS patients, but also for the most clinically fulminant courses [Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236; Garcia & Shimizo (1993) b. Med 24: 13-18]. E. bieneusi mainly affects the uterus of the small intestine, but also the large intestine, and leads to unquenchable, chronic secretory diarrhea with pronounced physical deterioration. Very little is known about epidemiology, only the detection of E. bieneusi in an HIV-negative patient with severe diarrhea [Sandfort et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236] suggests that at least this species is more common in humans than previously thought.
Der Nachweis von Mikrosporidieninfektionen im Rahmen der konventionellen parasitologischen und histologischen Diagnostik ist unverändert problematisch. Einerseits wird der lichtoptische Nachweis durch die geringe Größe der Sporen erschwert (1 bis 1,5 μm bei E. bieneusi); andererseits stehen derzeit noch keine spezifischen Färbemethoden für Mikrosporidien zur Verfügung. Die Sporen fallen nicht nur in die Größenordnung von Bakterien, sondern müssen auch von Hefesporen und anderen Pilzen unterschieden werden. Alle bisher verwendeten Färbemethoden (PAS, Versilberung, modifizierte Trichromfärbung, Trichrom-Blau, modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbungen, Chromotrop-Färbungen, Interferenz/Phasenkontrast) sowie die bisher untersuchten immunologischen Methoden haben nur den Stellenwert von Such- oder Screening-Methoden mit sehr begrenzter Sensitivität und Spezifität [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24: 13-18; Weber et al. (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7:426-461; Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:89-93]. Als immunologische Methoden wurden IFAT, Western-Blot und ELISA eingesetzt, wobei zur Erzeugung der mono- oder polyklonalen Antikörper stets Antigenpräparationen aus ganzen Sporen von E. cuniculi [Weiss et al. (1992) Am. J. Trop. Med. Hyg. 47:456-462], E. intestinalis [Ombrouck et al. (1996) C. R. Acad. Sei. Paris 319:39-43; Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33:3138-3145; Beckers et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34:282-285], E.
hellem [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32:2760-2768; Schwartz et al. (1993) J. Ophthal. 115:285-292; Croppo et al. (1991) J. Protozool. 38:31S], Glugea atherinae [Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:89-93] oder mehreren, kult vierbaren Mikrosporidienspezies [Didier et al. (1995) Parasitol. 111:411-421; De Groote et al. (1995) J. Infect. Dis. 171:1375-1378; Visvesvara et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33:930-936; Zierdt et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31:3071-3074; Aldras et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32:608- 612; Visvesvara et al. (1991) J. Protozool. 38:105S-111S; Sobottka et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33:2948-2952] eingesetzt wurden. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Mikrosporidien wurden ebenfalls entweder Sporen oder ihr Gesamtantigen verwendet [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32:2760-2768; Schottelius et al. (1995) Folia Parasitol.42:169-172]. Eindeutige Identifikation und Artdifferenzierung waren bislang auf den elektronenmikroskopischen Direktnachweis angewiesen, der jedoch nur bei sehr hoher Parasitendichte erfolgversprechend ist und meist Biopsate und damit invasive Techniken voraussetzt. Der zweifelsfreie Nachweis im Sinne eines Goldstandards war somit nicht nur mit einem erheblichen methodischen Aufwand verbunden, sondern setzte außerdem noch eine ausreichende vorherige Anreicherung voraus, die direkt aus Stuhl oft nicht zu erreichen ist [Corcoran et al. (1995) J. Clin. Pathol. 48:725-727]. Eine hierzu wünschenswerte Kultivierung ist jedoch gerade für die klinisch wohl bedeutendste Art, E. bieneusi, bislang noch nicht gelungen. Der Direktnachweis von Mikrosporiden-DNA mittels PCR brachte deshalb einen wichtigen methodischen Fortschritt, ist bisher aber auf Forschungslabors beschränkt und derzeit noch nicht umfangreich validiert [u. a.: Franzen et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1038- 1040; Weiss et al. (1994) Folia Parasitol. 41:81-90; Katzwinkel-Wladarsch et al. (1997) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16:7-10]. Ein weiterer wichtiger Grund, der die Mikrosporidiendiagnostik bisher verhinderte, ist das Fehlen aussagekräftiger immundiagnostischer Tests. Die bisher untersuchten Antikörper zeigten noch kein ausreichendes diagnostisches Potential für einen sensitiven und spezifischen Nachweis von Mikrosporidien-Antigenen [Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33:3138-3145]. Dies gilt vor allem für E. bieneusi, da bislang nur unzureichend gereinigte Antigenpräparationen als Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen. Dadurch wird auch die Zuverlässigkeit ihres Einsatzes für seroepidemiologische Untersuchungen beeinträchtigt.The detection of microsporid infections in the context of conventional parasitological and histological diagnostics remains problematic. On the one hand, the small size of the spores makes the optical detection difficult (1 to 1.5 μm for E. bieneusi); on the other hand, no specific staining methods for microsporidia are currently available. The spores not only fall into the order of magnitude of bacteria, but must also be distinguished from yeast spores and other fungi. All staining methods used so far (PAS, silvering, modified trichrome staining, trichrome blue, modified Ziehl-Neelsen staining, chromotropic staining, interference / phase contrast) and the immunological methods examined so far have only the importance of search or screening methods with very much limited sensitivity and specificity [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24: 13-18; Weber et al. (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7: 426-461; Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52: 89-93]. IFAT, Western blot and ELISA were used as immunological methods, antigen preparations from whole spores of E. cuniculi [Weiss et al. Always being used to generate the mono- or polyclonal antibodies. (1992) Am. J. Trop. Med. Hyg. 47: 456-462], E. intestinalis [Ombrouck et al. (1996) CR Acad. Be. Paris 319: 39-43; Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 3138-3145; Beckers et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 282-285], E. bright [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 2760-2768; Schwartz et al. (1993) J. Ophthal. 115: 285-292; Croppo et al. (1991) J. Protozool. 38: 31S], Glugea atherinae [Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52: 89-93] or more cultivatable microsporidia species [Didier et al. (1995) Parasitol. 111: 411-421; De Groote et al. (1995) J. Infect. Dis. 171: 1375-1378; Visvesvara et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 930-936; Zierdt et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 3071-3074; Aldras et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 608-612; Visvesvara et al. (1991) J. Protozool. 38: 105S-111S; Sobottka et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 2948-2952] were used. For the detection of antibodies against microsporidia either spores or their total antigen were also used [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 2760-2768; Schottelius et al. (1995) Folia Parasitol. 42: 169-172]. Until now, clear identification and differentiation of species had to rely on direct electron microscopic detection, which, however, is only promising if the density of parasites is very high and usually requires biopsies and thus invasive techniques. The unequivocal detection in the sense of a gold standard was therefore not only associated with a considerable methodological effort, but also required a sufficient prior enrichment, which is often not directly possible from stool [Corcoran et al. (1995) J. Clin. Pathol. 48: 725-727]. A cultivation that is desirable for this purpose has not yet been successful, especially for the most clinically significant species, E. bieneusi. The direct detection of microsporid DNA by means of PCR therefore brought important methodological progress, but has so far been limited to research laboratories and has not yet been extensively validated [including: Franzen et al. (1996) J. Infect. Dis. 173: 1038-1040; Weiss et al. (1994) Folia Parasitol. 41: 81-90; Katzwinkel-Wladarsch et al. (1997) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16: 7-10]. Another important reason that has hitherto prevented microsporidia diagnosis is the lack of meaningful immunodiagnostic tests. The antibodies examined so far have not yet shown sufficient diagnostic potential for sensitive and specific detection of microsporidia antigens [Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 3138-3145]. This is especially true for E. bieneusi, since so far only insufficiently purified antigen preparations are available as starting material. This also affects the reliability of their use for seroepidemiological examinations.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen Nachweis von Mikrosporidien ohne vorherige Kultivierung des Erregers, ohne DNA-Amplifizierungstechniken und ohne mikroskopische Methoden zu ermöglichen.The object of the invention is to enable detection of microsporidia without prior cultivation of the pathogen, without DNA amplification techniques and without microscopic methods.
Dieses Problem wird durch die Gegenstände der Ansprüche 1 bis 21 gelöst.This problem is solved by the subject matter of claims 1 to 21.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß damit auch nicht-spezialisierten Routinelabors der Nachweis von Mikrosporidien ermöglicht wird und damit dem Großteil der betroffenen Patienten zugute kommt. Der Nachweis wird dadurch vereinfacht, daß die zu untersuchenden Materialien zunächst mit einem sensitiven Suchtest untersucht, und nur die dort positiven Fälle mit artspezifischen Bestätigungstests genauer charakterisier; werden können. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß artspezifische Antigene und durch sie auch artspezifische Antikörper auch ohne Kultivierung der jeweiligen Mikrosporidienart erzeugt werden können.The advantages achieved by the invention are that even non-specialized routine laboratories are able to detect microsporidia and thus benefit the majority of the patients concerned. The proof is simplified by the fact that the materials to be examined are first examined with a sensitive search test and only characterize the positive cases there with species-specific confirmation tests; can be. Another advantage is that species-specific antigens and, by means of them, species-specific antibodies can also be generated without culturing the respective type of microsporidia.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden näher beschrieben:Exemplary embodiments of the invention are described in more detail below:
Eine in Kultur vermehrungsfähige Mikrosporidienart ist E. cuniculi. Aus einer solchen Kultur
werden die Mikrosporidien während der logarithmischen Phase und damit zu einer Zeit hoher Syntheseleistung, verbunden mit hoher Genexpression und damit einem großen Gehalt an mRNA, gewonnen und ihre mRNA nach Standardmethoden [z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, USA] isoliert. Ebenfalls nach Standardmethoden wird aus dieser mRNA nach Überführen in cDNA eine cDNA-Bank angelegt und mit einem Antiserum "gescreent", das durch Immunisierung geeigneter Tiere, z. B. Kaninchen, gewonnen wurde. Für die Immunisierung können Mikrosporidien aus der gleichen Kultur verwendet werden wie für die Gewinnung der mRNA. Die immunogenen Klone werden aus der cDNA-Bank nach Standardmethoden isoliert und in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Vektor umkloniert und exprimiert [z. b. J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, USA].A type of microsporidia that can be propagated in culture is E. cuniculi. From such a culture the microsporidia are obtained during the logarithmic phase and thus at a time of high synthesis performance combined with high gene expression and thus a large content of mRNA, and their mRNA according to standard methods [e.g. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, USA]. A standard cDNA library is also created from this mRNA after transfer to cDNA and "screened" with an antiserum which is immunized by suitable animals, e.g. B. rabbit. Microsporidia from the same culture can be used for the immunization as for the extraction of the mRNA. The immunogenic clones are isolated from the cDNA library according to standard methods and cloned and expressed in a prokaryotic or eukaryotic vector [eg J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, USA].
Die einzelnen, rekombinanten Antigene werden anschließend in Immunoassays, beispielsweise nach Beschichtung einer Titerplatte in einem ELISA-Assay, zum Nachweis von Antikörpern gegen Mikrosporidien und damit zum Nachweis einer Mikrosporidieninfektion eingesetzt. Es ist mit Antigenen unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität zu rechnen: Für einen möglichst sensitiven Suchtest werden diejenigen Antigene ausgewählt, die mit Antiseren gegen eine möglichst große Zahl verschiedener Mikrosporidienarten reagieren. Für die möglichst spezifischen Bestätigungstests werden diejenigen Antigene ausgewählt, die möglichst ausschließlich mit der zu ihrer Herstellung verwendeten Mikrosporidienart reagieren.The individual recombinant antigens are then used in immunoassays, for example after coating a titer plate in an ELISA assay, for the detection of antibodies against microsporidia and thus for the detection of a microsporidia infection. Antigens of different sensitivity and specificity are to be expected: For a search test that is as sensitive as possible, those antigens are selected which react with antisera against as large a number of different types of microsporidia as possible. For the most specific confirmation tests possible, those antigens are selected that react as exclusively as possible with the type of microsporidia used for their production.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist die Verwendung dieser sensitiven, bzw. spezifischen Antigene zur Immunisierung von Tieren, z. B. von Kaninchen und/oder Mäusen, und der dadurch möglichen Erzeugung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen diese Antigene. Diese werden nach Beschichtung einer Titerplatte in einem Antigen- "Capture"-Assay, z. B. einem Koproantigen-ELISA, zum Nachweis von Antigenen von Mikrosporidien aus klinischem Material und Umweltproben verwendet. Es ist mit Antikörpern unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität zu rechnen: Für einen möglichst sensitiven Suchtest werden diejenigen Antikörper ausgewählt, die mit Antigenen einer möglichst großen Zahl verschiedener Mikrosporidienarten reagieren. Für die möglichst spezifischen Bestätigungstests werden diejenigen Antikörper ausgewählt, die möglichst ausschließlich mit der zu ihrer Herstellung verwendeten Mikrosporidienart reagieren.Another embodiment of the invention is the use of these sensitive or specific antigens for immunizing animals, for. B. rabbits and / or mice, and the thereby possible generation of polyclonal and / or monoclonal antibodies against these antigens. These are coated after coating a titer plate in an antigen "capture" assay, e.g. B. a coproantigen ELISA, for the detection of antigens of microsporidia from clinical material and environmental samples. Antibodies with different sensitivity and specificity are to be expected: For a search test that is as sensitive as possible, those antibodies are selected which react with antigens of a large number of different types of microsporidia. For the most specific confirmation tests possible, those antibodies are selected that react as exclusively as possible with the type of microsporidia used for their production.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist die Erzeugung rekombinanter Antigene weiterer, auch nicht-kultivierbarer Mikrosporidienarten, ohne daß diese zur Antigengewinnung kultiviert oder angereichert werden müssen. Vielmehr werden zu den flankierenden Bereichen der DNA, die für ein bereits charakterisiertes Antigen einer anderen Mikrosporidienart, z. B. E. cuniculi, kodiert, PCR-Primer synthetisiert und damit in einer PCR-Amplifikation der homologe Genabschnitt der anderen, u. U. nicht kultivierbaren Mikrosporidienart, z. B. E. bieneusi, isoliert. Dazu wird genomische DNA dieser Spezies verwendet, die aus klinischem Material, z. B. aus dem Stuhl eines infizierten Patienten, ohne vorherige Anreicherung oder Kultivierung gewonnen werden kann [z. B. gem. Katzwinkel-Wladarsch et al. (1996) Trop. Med. Int. Health 1:373-378]. Alternativ kann die homologe DNA-Sequenz der zweiten Mikrosporidienart auch durch Hybridisierung einer genomischen DNA oder einer cDNA mit dem Genabschnitt der ersten Mikrosporidienart identifiziert und isoliert werden, wozu aber eine größere Menge an genomischer DNA oder mRNA notwendig ist und deshalb von einer Anreicherung oder einer Kultivierung der Mikrosporidien abhängig ist.
A further embodiment of the invention is the generation of recombinant antigens of other, also non-cultivable types of microsporidia, without these having to be cultivated or enriched for antigen production. Rather, the flanking regions of DNA, which are responsible for an already characterized antigen of another type of microsporidia, e.g. B. E. cuniculi, encoded, PCR primer synthesized and thus in a PCR amplification of the homologous gene segment of the other, u. U. non-cultivable Microsporidienart, z. B. E. bieneusi, isolated. For this, genomic DNA of this species is used, which is made of clinical material, e.g. B. can be obtained from the stool of an infected patient without prior enrichment or cultivation [e.g. B. acc. Katzwinkel-Wladarsch et al. (1996) Trop. Med. Int. Health 1: 373-378]. Alternatively, the homologous DNA sequence of the second type of microsporidia can also be identified and isolated by hybridizing a genomic DNA or a cDNA with the gene section of the first type of microsporidia, but this requires a larger amount of genomic DNA or mRNA and therefore from an enrichment or a cultivation who is dependent on microsporidia.