Elektrochemisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bindungsproteinen Electrochemical method for the quantitative determination of binding proteins
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum immunolo- gisch/enzymatischen Nachweis von Bindungsproteinen in wäßrigen Medien sowie eine Vorrichtung zur Durchfüh¬ rung dieses Verfahrens.The invention relates to a method for the immunological / enzymatic detection of binding proteins in aqueous media and a device for carrying out this method.
Die Bestimmung von Bindungsproteinen besitzt in der klinischen Diagnostik eine besondere Relevanz. Bei¬ spielhaft hierbei sei die Bestimmung von kardialen humanen Fettsäurebindungsproteinen (H-FABP) genannt. Insbesondere die Bestimmung von FABP besitzt in der Diagnostik besondere Bedeutung, da im Falle von Herz¬ muskelschädigungen kardiales FABP (H-FABP) aus dem Herzmuskel austritt und nach wenigen Stunden im Blut nachweisbar ist. Aus diesem Grund ist auch FABP als Herzinfarktmarker anzusehen. Einem schnellen und ge- nauen Verfahren zum Nachweis von FABP kommt deshalb besondere Bedeutung zu. Klassische Methoden der FABP-
Bestimmung beruhen auf ELISA- oder RIA-Verfahren. Neben diesen klassischen Methoden ist weiterhin in Spener, F. et al. , 1992, Dechema Biotechnol. Conf. ein amperometrisches Verfahren zur Bestimmung von FABP bekannt. Dieses Verfahren beruht auf einer Immo¬ bilisierung von Fänger-Antikörpern auf einer Membran und einer Konkurrenzreaktion zwischen FABP der Probe und zugesetztem Katalase gelabelten FABP. Nachteilig bei diesem Konkurrenzverfahren ist jedoch die Anzahl der nötigen Verfahrensschritte, die aufwendige Präpa¬ ration der Antikörpermembranen, die sehr langen Ana¬ lysezeiten, die nicht ausreichende Empfindlichkeit, der bedingte Einsatz in reinem Plasma oder Blut und die Höhe der unspezifischen Meßwerte.The determination of binding proteins is of particular relevance in clinical diagnostics. The determination of cardiac human fatty acid binding proteins (H-FABP) may be mentioned here as an example. In particular, the determination of FABP is of particular importance in diagnostics since cardiac FABP (H-FABP) emerges from the heart muscle in the case of cardiac muscle damage and can be detected in the blood after a few hours. For this reason, FABP can also be regarded as a heart attack marker. A fast and precise method for the detection of FABP is therefore of particular importance. Classic methods of FABP Determination are based on ELISA or RIA methods. In addition to these classic methods, Spener, F. et al. , 1992, Dechema Biotechnol. Conf. an amperometric method for determining FABP is known. This method is based on an immobilization of capture antibodies on a membrane and a competition reaction between FABP of the sample and added catalase-labeled FABP. However, the disadvantage of this competitive process is the number of necessary process steps, the complex preparation of the antibody membranes, the very long analysis times, the insufficient sensitivity, the limited use in pure plasma or blood and the level of the non-specific measured values.
Ausgehend hiervon, ist es die Aufgabe der vorliegen¬ den Erfindung ein empfindliches, schnelles, sicheres, einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Bestim¬ mung von Bindungsproteinen, insbesondere zur Bestim- mung von FABP, anzugeben sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.Proceeding from this, it is the object of the present invention to provide a sensitive, fast, safe, simple and economical method for determining binding proteins, in particular for determining FABP, and an apparatus for carrying out the method.
Die Aufgabe in bezug auf das Verfahren wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1, in bezug auf die Vorrichtung durch die kennzeichnenden Merkma¬ le des Anspruches 15 gelöst. Die Unteransprüche zei¬ gen vorteilhafte Weiterbildungen auf.The object in relation to the method is achieved by the characterizing features of claim 1, in relation to the device by the characterizing features of claim 15. The subclaims show advantageous further developments.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf einer Kombination von drei Verfahrensschritten. In einem ersten Schritt wird eine spezielle Elektrode, nämlich eine Einmalgraphitelektrode mit einem gegen das Bindungsprotein gerichteten Antikörper (Fänger-Anti-
körper) immobilisiert. In einem zweiten Schritt wird dann ein Sandwich aus Antikörper, Bindungsprotein und Konjugat auf der Elektrode erzeugt und letztlich mit einer so hergestellten Elektrode die Messung durchge- führt, indem eine empfindliche amperometrische Detek¬ tion des Spaltungsproduktes des aromatischen Phos¬ phatesters vorgenommen wird.The method according to the invention is therefore based on a combination of three method steps. In a first step, a special electrode, namely a single-use graphite electrode with an antibody directed against the binding protein (catcher anti body) immobilized. In a second step, a sandwich of antibody, binding protein and conjugate is then produced on the electrode and the measurement is ultimately carried out with an electrode produced in this way by performing a sensitive amperometric detection of the cleavage product of the aromatic phosphate ester.
Wesentlich beim anmeldungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung einer Einmalgraphitelektrode und die Immo¬ bilisierung des Antikörpers direkt auf der Elektro¬ den-Oberfläche. Dadurch steht eine Elektrode zur Ver¬ fügung, die in einfacher Weise für das erfindungsge¬ mäße Meßverfahren eingesetzt werden kann. Besonders hervorzuheben ist, daß, wenn die mit Antikörpern im¬ mobilisierte Elektrode z.B. mit einer BSA-Lösung be¬ handelt und getrocknet wird, über eine längere Zeit problemlos gelagert werden kann. Es hat sich dabei gezeigt, daß die so präparierten Graphitelektroden selbst über mehrere Wochen bei 4 °C stabil sind. Be¬ sonders bevorzugt ist es, wenn als Einmalelektrode eine auf einem Trägermaterial mit Siebdruck aufge¬ brachte Graphitschicht eingesetzt wird. Als Trägerma¬ terial ist hierbei besonders eine Laminierfolie be- vorzugt. Verfahrensmäßig wird dabei so vorgegangen, daß z.B. ein Leit-C-Spezialkleber für die Elektronen- mikroskopie mit einem Siebdrucköl versetzt und durch eine Schablone oder durch ein Sieb mit entsprechender Elektrodenform auf eine Laminierfolie aufgebracht wird. In entsprechender Weise kann auch die Referen¬ zelektrode hergestellt werden, indem z.B. eine Sil¬ ber/Silberchloridpaste auf eine weitere Laminierfolie aufgebracht oder zusammen mit der Graphitelektrode
auf eine Folie aufgebracht wird. Es ist auch möglich, zur Versteifung die Elektrodenableitungen mit einer zweiten Laminierfolie zu verschweißen.What is essential in the method according to the application is the use of a disposable graphite electrode and the immobilization of the antibody directly on the electrode surface. As a result, an electrode is available which can be used in a simple manner for the measuring method according to the invention. It should be particularly emphasized that if the electrode immobilized with antibodies is treated, for example with a BSA solution and dried, it can be stored for a long time without any problems. It has been shown that the graphite electrodes prepared in this way are stable even at 4 ° C. for several weeks. It is particularly preferred if a graphite layer applied to a carrier material with screen printing is used as the disposable electrode. A laminating film is particularly preferred as the carrier material. In terms of the process, the procedure is such that, for example, a Leit-C special adhesive for electron microscopy is mixed with a screen printing oil and applied to a laminating film through a stencil or through a sieve with an appropriate electrode shape. The reference electrode can also be produced in a corresponding manner, for example by applying a silver / silver chloride paste to a further laminating film or together with the graphite electrode is applied to a film. It is also possible to weld the electrode leads to a second laminating film for stiffening.
Eine wie vorstehend beschriebene Einmalgraphitelek- trode kann nun in verschiedener Weise für das erfin¬ dungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. So kann zum einen das Bindungsprotein und das Konjugat auf die Graphitelektrode pipettiert werden, so daß dann der Sandwich aus Antikörper, Bindungsprotein und Konjugat entsteht. Erfindungsgemäß wird dabei unter einem Kon¬ jugat ein Phosphatase markierter Antikörper gegen das Bindungsprotein verstanden.A disposable graphite electrode as described above can now be used in various ways for the method according to the invention. For example, the binding protein and the conjugate can be pipetted onto the graphite electrode, so that the sandwich of antibody, binding protein and conjugate is then formed. According to the invention, a conjugate is understood to mean a phosphatase-labeled antibody against the binding protein.
Alternativ dazu kann aber auch das Bindungsprotein vor dem Aufbringen auf die Elektrode mit dem Konjugat vermischt werden und dann die so hergestellte Mi¬ schung auf die Elektrode aufgebracht werden.Alternatively, however, the binding protein can also be mixed with the conjugate before being applied to the electrode and the mixture thus prepared can then be applied to the electrode.
Eine dritte besonders bevorzugte Verfahrensvariante sieht nun vor, daß die mit Antikörper beschichtete Einmalgraphitelektrode zuerst mit Konjugat beschich¬ tet wird. Hierbei wird so vorgegangen, daß das Kon¬ jugat auf die Elektrode aufgebracht und getrocknet wird. Die so präparierte Elektrode ist dann nur noch kurz vor der Messung mit der Probe zu versetzen. Die¬ se letzte Variante hat den Vorteil, daß das Mischen von Konjugat und Bindungsprotein vor der Messung ent¬ fällt und somit ein Pipettierschritt eingespart wird. Die mit Konjugat und Antikörper beschichteten Elek¬ troden sind im übrigen mehrere Wochen stabil.
Die Durchführung der Messung ist in sehr einfacher Weise möglich. Die in Abhängigkeit zur Konzentration an Bindungsprotein bindet nämlich in der alkalischen Phosphatase Bindungsprotein-Antikörper und der immo¬ bilisierte Bindungsprotein-Antikörper an das Bin¬ dungsprotein. Das proportional zur Bindungsprotein- Konzentration fixierte Enzym erzeugt dann bei Zugabe von aromatischem Phosphatester das elektrochemisch umzusetzende Spaltungsprodukt.A third particularly preferred method variant now provides that the single-graphite electrode coated with antibody is first coated with conjugate. The procedure here is that the conjugate is applied to the electrode and dried. The electrode prepared in this way is then only to be added to the sample shortly before the measurement. This last variant has the advantage that the mixing of conjugate and binding protein is omitted before the measurement and thus a pipetting step is saved. The electrodes coated with conjugate and antibody are otherwise stable for several weeks. The measurement can be carried out in a very simple manner. Depending on the concentration of binding protein, the binding protein antibody binds in the alkaline phosphatase and the immobilized binding protein antibody binds to the binding protein. The enzyme, which is fixed in proportion to the concentration of binding protein, then generates the electrochemically convertible product to be converted when aromatic phosphate ester is added.
Besonders bevorzugt beim vorstehend beschriebenen Verfahren ist es, wenn als Bindungsprotein H-FABP eingesetzt wird. Als vorteilhaft hat es sich hierbei herausgestellt, wenn beim Konjugat alkalische Phos- phatase und beim aromatischen Phosphatester p-Amino- phenylphosphat verwendet wird.In the method described above, it is particularly preferred if H-FABP is used as the binding protein. It has proven to be advantageous here if alkaline phosphatase is used for the conjugate and p-aminophenyl phosphate is used for the aromatic phosphate ester.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Die Vorrichtung zeichnet sich besonders dadurch aus, daß in einem Gehäuse min¬ destens eine Reihe mit zwei bis sechs mit Puffern und Substrat befüllbaren Gefäßen vorgesehen ist. Die Vor¬ richtung ist dabei so ausgelegt, daß die Elektroden über eine geeignete Vorrichtung in die Gefäße ein- führbar sind. Dadurch, daß mindestens zwei Gefäße vorgesehen sind, kann sowohl eine Referenzelektrode als auch eine Meßelektrode gleichzeitig vermessen werden.The invention further relates to an apparatus for performing the method. The device is particularly characterized in that at least one row with two to six vessels which can be filled with buffers and substrate is provided in a housing. The device is designed such that the electrodes can be inserted into the vessels via a suitable device. Because at least two vessels are provided, both a reference electrode and a measuring electrode can be measured simultaneously.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausfüh¬ rungsbeispieles und Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 die Kalibrierkurven von FABP in Plasma und einen Vergleich mit dem ELISA-Verfahren;The invention is explained in more detail below using an exemplary embodiment and drawings. Show it: 1 shows the calibration curves of FABP in plasma and a comparison with the ELISA method;
Fig. 2 erfindungsgemäß hergestellte Elektroden;2 electrodes produced according to the invention;
Fig. 3 im Querschnitt eine Vorrichtung zur Durch¬ führung des Verfahrens, und3 shows in cross section a device for carrying out the method, and
Fig. 4 die Vorrichtung in der Draufsicht.Fig. 4 shows the device in plan view.
Beispielexample
Messung von FABP als BindungsproteinMeasurement of FABP as a binding protein
Herstellung der ElektrodenManufacture of the electrodes
Ein Leit-C-Spezialkleber für die Elektronenmikrosko¬ pie (Neubauer Chemikalien) wird mit einem Siebdruckol versetzt und durch eine Schablone oder durch ein Sieb mit entsprechender Elektrodenform auf eine Laminier- folie aufgebracht. Fig. 1 zeigt hier drei verschiede¬ ne Ausführungsformen, wie eine derartige Elektrode aufgebaut sein kann. Die Elektrode 1 besteht aus ei¬ ner Laminierfolie und einer aufgebrachten Graphit¬ schicht in Form eines Steges und eines sich anschlie- ßenden Körpers. Bei der Elektrode 2 ist zusätzlich eine zweite Laminierfolie über den Steg gelegt, um eine Versteifung zu erreichen. Der Kopf der Elektrode bleibt hier frei. Bei der Elektrode 3 ist die zweite Laminierfolie auch über dem Kopf angeordnet, wobei dann in der zweiten Laminierfolie im Bereich des Elektrodenkopfes eine entsprechende Durchbrechung (z.B. Lochung) der zweiten Laminierfolie vorliegt, um einen Kontakt mit der Elektrode herzustellen. Die
Elektrode hat üblicherweise einen Durchmesser von 5 mm und einen ca. 30 mm langen Steg zur Ableitung und zum Abgriff des Stroms. Die Referenzelektrode wird entweder in gleicher Form mit Silber/Silberchloridpa- ste auf eine zweite Folie aufgebracht oder zusammen mit der Graphitelektrode auf eine Folie.A Leit-C special adhesive for electron microscopy (Neubauer chemicals) is mixed with a screen printing oil and applied to a laminating film through a stencil or through a sieve with an appropriate electrode shape. 1 shows three different embodiments of how such an electrode can be constructed. The electrode 1 consists of a laminating film and an applied graphite layer in the form of a web and an adjoining body. In the case of the electrode 2, a second laminating film is additionally placed over the web to achieve stiffening. The head of the electrode remains free here. In the case of the electrode 3, the second laminating film is also arranged above the head, in which case there is a corresponding opening (eg perforation) in the second laminating film in the region of the electrode head in order to make contact with the electrode. The Electrode usually has a diameter of 5 mm and an approximately 30 mm long web for discharging and tapping the current. The reference electrode is either applied in the same form with silver / silver chloride paste on a second foil or together with the graphite electrode on a foil.
Präparation der biochemischen KomponentePreparation of the biochemical component
Der Fänger-Antikörper (1 μg) wird auf die Graphit¬ elektrode, wie vorstehend beschrieben hergestellt, aufgebracht und ca. 15 min adsorptiv immobilisiert. Anschließend wird die Oberfläche ca. 15 min mit einer 2%igen BSA-Lösung behandelt. Die Elektrode kann nun für eine Messung verwendet werden oder nach Trocknung bei 4 °C gelagert werden. Als Variante kann nach dem Blockieren der Elektrode mit BSA eine Beschichtung mit Konjugat und anschließender Trocknung durchge¬ führt werden. Mit der letzten Variante entfällt daε Mischen von Konjugat und Probe vor der Messung und erspart einen Pipettierschritt. Die mit Konjugat und Antikörper beschichteten Elektroden sind ebenfalls mehrere Wochen stabil.The catcher antibody (1 μg) is applied to the graphite electrode, as described above, and immobilized by adsorption for about 15 minutes. The surface is then treated with a 2% BSA solution for about 15 minutes. The electrode can now be used for a measurement or can be stored at 4 ° C after drying. As a variant, after blocking the electrode with BSA, a coating with conjugate and subsequent drying can be carried out. With the last variant, there is no need to mix the conjugate and sample before the measurement and saves a pipetting step. The electrodes coated with conjugate and antibody are also stable for several weeks.
Vorbereitung zur Messung von FABPPreparation for measuring FABP
Auf die Graphitelektrode wird dazu ca. 10 μl Patien¬ tenplasma und 1 μl Konjugat pipettiert. Alternativ dazu kann das Patientenplasma vorher mit Konjugat versetzt werden. Die Inkubationszeit beträgt 15 min. Handelt es sich um die mit Konjugat beschichteten Elektroden, kann das Patientenplasma auch direkt auf¬ getragen werden. Anschließend wird die Elektrode kurz
mit TBS-Puffer abgespült, die Elektroden sind dann für die Messung vorbereitet.For this purpose, about 10 μl of patient plasma and 1 μl of conjugate are pipetted onto the graphite electrode. Alternatively, conjugate can be added to the patient's plasma beforehand. The incubation period is 15 min. If the electrodes are coated with conjugate, the patient plasma can also be applied directly. Then the electrode becomes short Rinsed with TBS buffer, the electrodes are then prepared for the measurement.
Die Messung wird mit einer Vorrichtung gemäß Figuren 2 und 3 durchgeführt.The measurement is carried out with a device according to FIGS. 2 and 3.
Fig. 2 zeigt im Querschnitt schematisch den Aufbau der Vorrichtung. Die Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse 4, in das Potentiostaten 5 und ein Rührmotor 6 eingebaut sind. Bei der Ausführungsform nach Fig. 2 sind in einer Reihe 12 (Meßpuffer-Well) vier Gefäße 14 bis 17 zur Aufnahme der Pufferlösung und des Sub¬ strates angeordnet. In diese Gefäße 14 bis 17 sind die Elektroden 7, 8, 9, 10 einführbar. Die Elektroden sind dabei über eine Leitung 11 mit dem Potentiosta¬ ten 5 verbunden, der seinerseits wiederum zur Auswer¬ tung an einen PC angeschlossen ist.Fig. 2 shows in cross section schematically the structure of the device. The device consists of a housing 4, in which potentiostats 5 and a stirrer motor 6 are installed. In the embodiment according to FIG. 2, four vessels 14 to 17 for receiving the buffer solution and the substrate are arranged in a row 12 (measuring buffer well). The electrodes 7, 8, 9, 10 can be inserted into these vessels 14 to 17. The electrodes are connected via a line 11 to the potentiostat 5, which in turn is connected to a PC for evaluation.
Fig. 3 zeigt die in Fig. 2 beschriebene Vorrichtung in der Draufsicht. Wie Fig. 3 zeigt, ist es mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch möglich, die Elek¬ troden 7 bis 10 nacheinander in verschiedene Meßpuf- fer-Wells 13,18,19,20,21 einzutauchen. Dies kann durch eine automatische Steuerung übernommen werden. Die Elektroden tauchen dabei in einen 0,1 M Carbonat- puffer pH 9,4 0,1 M KCl 1 μg/ml p-Aminophenylphosphat ein. Das amperometrische Stromsignal entwickelt sich in ca. 10 bis 20 sec bei 300 mV gegen Silber/Silber¬ chlorid und wird entsprechend der Kalibrationskurve in die Konzentration von FABP umgerechnet. Die dabei immunologisch und enzymatisch ablaufende Reaktion ist in den folgenden Gleichungen l.a bis l.d wiedergege¬ ben.
LaFig. 3 shows the device described in Fig. 2 in plan view. As shown in FIG. 3, it is also possible with the device according to the invention to immerse the electrodes 7 to 10 in succession in different measuring buffer wells 13, 18, 19, 20, 21. This can be done by automatic control. The electrodes are immersed in a 0.1 M carbonate buffer pH 9.4 0.1 M KCl 1 μg / ml p-aminophenyl phosphate. The amperometric current signal develops in about 10 to 20 seconds at 300 mV against silver / silver chloride and is converted into the concentration of FABP according to the calibration curve. The reaction which proceeds immunologically and enzymatically is shown in the following equations la to ld. La
Anti - FABP - Antikörper + G^rtelektrode lnιmBEiiiBana!g-» Anti - FABP - Antikörper- - -G^phlteiektrodeAnti - FABP - Antibody + G ^ rtelelektrode lnιmBEiiiBana ! G- »Anti - FABP - Antibody- - -G ^ phlteie electrode
1.b1.b
Anti - FABP - Antikörper- • •G-aphitelek.-rFABP + AJk.Phospπatase - Anti - FAaP - Antikörper ►Anti - FABP - Antibodies • • G-aphitelek.-rFABP + AJk.Phospπatase - Anti - FAaP - Antibodies ►
Alk.Phosphatase- Anti - FABP - Antikörper - FABP - Anti - FABP - Antikörper- • -GBphiteiek. I.c p - Amnopheπyiphcsphat →p - Arrinophenoi -r PhosphatAlk.phosphatase- anti - FABP - antibody - FABP - anti - FABP - antibody- • -GBphiteiek. I.c p - Amnopheπyiphcsphat → p - Arrinophenoi -r phosphate
LdLd
. . . . Erttmόβ 300mV . . . . _ _ p-Amπopheπoi > lmπochιnon-r2e. . . . 300mV. . . . _ _ p-Amπopheπoi> lmπochιnon-r2e
Fig. 4 zeigt die bei der Messung erzielten Ergebnisse in bezug auf die Kalibrierung und den Vergleich mit der ELISA-Methode. Fig. 4 macht deutlich, daß mit dem erfindungsgemäßen Meßverfahren in einer einfachen und schnellen Weise Ergebnisse erreicht werden, die mit denen der ELISA-Methode vergleichbar sind.
FIG. 4 shows the results obtained in the measurement in relation to the calibration and the comparison with the ELISA method. Fig. 4 makes it clear that the measurement method according to the invention achieves results in a simple and quick manner which are comparable with those of the ELISA method.