WO1994029455A1 - Mutant polypeptide of protein kinase c, nucleic acid sequences coding for said polypeptide and use thereof - Google Patents

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Dominique Joubert
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Laurence Levy
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • This diagnostic method comprises the steps: a) of prior amplification of the genomic DNA or cDNA sequences made from mRNAs contained in a biological sample of a patient, using primers, such as primers d 'DNA, b) bringing the biological sample into contact with a nucleotide probe according to the invention; c) detection of the hybridization complex which has possibly formed.
  • RNA sequence encoding said polypeptide can be carried out by the in situ hybridization technique using a nucleotide probe as defined above and detection of the hybridization complex which has possibly form.
  • These antibodies can be polyclonal antibodies obtained according to conventional animal immunization methods.
  • FIG. 3. Comparison of the activity and expression of the
  • RNAzole [RNA 15.01-100] and the oligonucleotides were obtained from the Bioprobe Company.
  • Amplification was performed in 30 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C (primer of fragment A), 60 ° C (primer B fragment), 60 ° C (primer fragment C), 1 minute at 72 * C in the Cetus Perkin-Elmer Thermocycle.
  • the amplified DNA was purified on agarose gel then cryoeluted and precipitated with ethanol.
  • the purified DNA was directly subcloned into a PCRTM II vector according to the protocol of the TA cloning kit supplied by Invitrogen.

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Abstract

A mutant polypeptide of protein kinase C shows localised D 294 G mutation with respect to PKCα. Nucleic acid sequences coding for said polypeptide nucleotide probes and antisense oligonucleotides are also disclosed. Application in cancer diagnosis or therapy.

Description

POLYPEPTIDE MUTANT DE LA PROTEINE KINASE C, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR LEDIT POLYPEPTIDE ET LEURS UTILISATIONSPROTEIN KINASE C MUTTING POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAID POLYPEPTIDE AND USES THEREOF
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présente invention a pour objet un nouveau polypeptide mutant de la protéine kinase C et les acides nucléiques codant pour ledit polypeptide. Elle a également pour objet les utilisations de ce polypeptide ou des acides nucléiques pour l'élaboration d'outils utiles pour le diagnostic des cancers et/ou pour la préparation de moyens pharmacologiques utiles pour le traitement des cancers, en particulier des cancers de l'hypophyse, du colon, du foie, du sein, de la vessie et de la thyroïde.
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The subject of the present invention is a novel protein kinase C mutant polypeptide and the nucleic acids encoding said polypeptide. It also relates to the uses of this polypeptide or of nucleic acids for the development of tools useful for the diagnosis of cancers and / or for the preparation of pharmacological means useful for the treatment of cancers, in particular cancers of the pituitary gland, colon, liver, breast, bladder and thyroid.
La protéine kinase C, dénommée ci-après la PKC, est une enzyme calcium et phospholipide-dépendante, qui joue un rôle important dans le métabolisme des cellules. En effet, elle participe à de nombreux procédés de régulation cellulaire, notamment à la sécrétion hormonale et la prolifération cellulaire. Elle est directement activée par les esters de phorbol, promoteurs des tumeurs et est une enzyme clé dans la transduction des signaux médiés par des facteurs de croissance ou des hormones.Protein kinase C, hereinafter referred to as PKC, is a calcium and phospholipid-dependent enzyme, which plays an important role in cell metabolism. In fact, it participates in many cellular regulation processes, in particular hormonal secretion and cell proliferation. It is directly activated by phorbol esters, tumor promoters and is a key enzyme in the transduction of signals mediated by growth factors or hormones.
Cette enzyme ainsi que ses propriétés dans les cellules néoplasiques sont décrites notamment par ROTENBERG et al. dans l'ouvrage intitulé "Biochemical and Molecular Aspects of selected cancers" Vol. 1, ch. 2, 1991, édité par Académie Press Inc. Cette enzyme existe sous différentes isoformes, telles que notamment l'isoforme α.This enzyme and its properties in neoplastic cells are described in particular by ROTENBERG et al. in the book "Biochemical and Molecular Aspects of selected cancers" Vol. 1, ch. 2, 1991, published by Académie Press Inc. This enzyme exists in different isoforms, such as in particular the α isoform.
La séquence de l'isoforme α de la protéine kinase C humaine, dénommée ci-après la PKCα humaine, a été décrite par FINKENZELLER et al. dans Nucleic Acids Research Vol. 18, N* 8, 2183 (1990).The sequence of the isoform α of human protein kinase C, hereinafter referred to as human PKCα, has been described by FINKENZELLER et al. in Nucleic Acids Research Vol. 18, N * 8, 2183 (1990).
Des études récentes ont montré que l'activité et l'expression de la PKC étaient plus élevées dans les tumeurs humaines de l'hypophyse que dans les hypophyses humaines normales et les hypophyses de rat. A cet effet, on peut se référer aux travaux de V. ALVARO et al. dans Int. J. Cancer : 50, 724-730 (1992). Aucune relation n'a été trouvée entre l'activité et l'expression d'un côté et le volume tumoral ainsi que les taux hormonaux dans le plasma de l'autre. Cependant, lorsque l'on considère le caractère invasif, une nette distinction peut être faite entre les tumeurs invasives d'une part et les tumeurs non-invasives d'autre part. Selon les tests rapportés dans l'article cité ci-dessus, on a noté une augmentation semblable de l'activité et de l'expression dans les tumeurs non invasives (x 3) alors que dans les tumeurs invasives, l'activité de la PKC était multipliée par 3 environ, tandis que l'expression était multipliée par environ un facteur 9.Recent studies have shown that PKC activity and expression are higher in human pituitary tumors than in normal human and rat pituitaries. To this end, we can refer to the work of V. ALVARO et al. in Int. J. Cancer: 50, 724-730 (1992). No relationship was found between activity and expression on the one hand and tumor volume and plasma hormone levels on the other. However, when considering invasiveness, a clear distinction can be made between invasive tumors on the one hand and non-invasive tumors on the other. According to the tests reported in the article cited above, there was a similar increase in activity and expression in non-invasive tumors (x 3) while in invasive tumors, the activity of PKC was multiplied by approximately 3, while the expression was multiplied by approximately a factor of 9.
On sait que l'activité de la PKC est également altérée dans plusieurs autres tumeurs humaines, telles que par exemple les tumeurs du colon et du sein. Cette activité est augmentée de façon significative dans les tissus du sein malin alors que dans le tissu tumoral du colon elle est réduite par comparaison aux éléments normaux équivalents. Ces observations contribuent à l'idée que la PKC est affectée dans les tumeurs humaines et qu'elle participe à la tumorigénèse.It is known that the activity of PKC is also altered in several other human tumors, such as, for example, colon and breast tumors. This activity is significantly increased in the tissues of the malignant breast whereas in the tumor tissue of the colon it is reduced compared to the normal equivalent elements. These observations contribute to the idea that PKC is affected in human tumors and that it participates in tumorigenesis.
Cependant, lorsque l'on considère l'expression de la PKC, peu d'investigations ont été faites à ce sujet et on n'a pas recherché si les isoformes PKC étaient impliquées dans les modifications observées de l'activité de la PKC. De plus, le manque de corrélation étroite entre l'augmentation de l'activité enzymatique et l'augmentation de l'expression de la PKC dans les tumeurs invasives hypophysaires humaines ainsi que la relation particulière entre la surexpression de la PKC et le caractère invasif dans les tumeurs de l'hypophyse humaine ont conduit à l'hypothèse qu'il existait une anomalie dans la structure de l'enzyme.However, when considering the expression of PKC, few investigations have been made on this subject and it has not been investigated whether the PKC isoforms were involved in the observed changes in PKC activity. In addition, the lack of close correlation between the increase in enzymatic activity and the increase in the expression of PKC in invasive human pituitary tumors, as well as the particular relationship between overexpression of PKC and invasiveness in tumors of the human pituitary gland led to the hypothesis that there was an abnormality in the structure of the enzyme.
On a maintenant trouvé que la PKCα est surexprimée dans les tumeurs invasives de l'hypophyse humaine et que cette PKCα possède une mutation ponctuelle.We have now found that PKCα is overexpressed in invasive tumors of the human pituitary gland and that this PKCα has a point mutation.
La présente invention a donc pour objet un nouveau polypeptide mutant de la protéine kinase C qui présente la séquence [SEQ ID N*2] de 672 acides aminés.The subject of the present invention is therefore a new protein kinase C mutant polypeptide which has the sequence [SEQ ID N * 2] of 672 amino acids.
Cette séquence d'acides aminés diffère de la séquence connue de la PKCα par l'acide aminé en position 294 qui est une glycine au lieu d'un acide aspartique. Le nouveau polypeptide selon l'invention est donc la PKCα présentant une mutation ponctuelle en position 294, dénommée ci- après mutation D 294 G. Il a un poids moléculaire d'environ 80 kdaltons. La mutation D 294 G est située dans une région stratégique de l'enzyme, la région V3. Les différentes régions de la PKC sont indiquées sur la figure 1 qui est une représentation schématique des domaines constants et variables de l'enzyme PKC, telle que décrite par Stabel et al. (Stabel, S, Parker, PJ, 1991, "Protein Kinase C". Pharmacol. Ther. 51 : 71-95). Cette région V3 contient les sites sensibles à la calpaïne, les sites de liaison des "récepteurs" intra¬ cellulaires de la PKC ainsi que le site potentiel de liaison du calcium. La mutation D 294 G est localisée dans ce site potentiel de liaison du calcium et peut affecter l'affinité de l'enzyme pour le calcium. Ce site n'a pas une configuration main EF classique correspondant à un motif hélice-boucle-hélice. En fait, il n'existe pas de possibilité pour qu'une première hélice se forme. La seconde hélice, bien que probablement plus courte que celle habituellement décrite est théoriquement possible (compte-tenu de la structure secondaire prédite en utilisant la méthode GOR ("Prédiction of protein structures and the principles of protein conformation", edited by G. D. Fasman, Plénum Press New York. 1989:417-465)). La boucle calcium démarre à l'acide glutamique à la position 292 (position X dans la boucle) et se termine à l'acide aminé glutamine à la position 303 (position-Z dans la boucle). L'acide aminé 294, qui est habituellement l'acide aspartique ou l'asparagine, est changé ici par une mutation ponctuelle en la glycine apolaire. Ceci pourrait rendre compte des changements proposés pour l'affinité calcium et en conséquence pour la fonctionnalité de l'enzyme. Il est, en effet, connu que la liaison du calcium à l'enzyme est une condition nécessaire pour le transfert de l'enzyme du compartiment intra-cellulaire vers la membrane plasmique. En fait, il semble que la PKC soit accumulée dans le cytosol du fait que sa quantité dans le cytosol est sans aucun doute plus importante que dans la membrane pour les tumeurs invasives. Les conséquences de l'accumulation cytosolique de l'enzyme sont cependant difficiles à tester du fait que l'enzyme ne peut pas être activée in vitro par des activateurs usuels. Sa présence dans les cellules tumorales suggère que la mutation de la PKCα affecte probablement les processus de régulation normalement contrôlés par la PKC. La relation entre la mutation ponctuelle de la PKCα et le phénotype invasif des tumeurs de l'hypophyse conduit aux commentaires ci-après. En fait, la PKC est impliquée dans la régulation des protéinases sécrétées telles que la stromélysine et la collagènase, qui sont des enzymes participant à l'apparition des métastases tumorales et à l'angiogénèse. Elle est également impliquée dans la biosynthèse des inhibiteurs des métalloprotéinases par des fibroblastes humains en culture. L'invention a également pour objet les variants de ce polypeptide résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, étant entendu que ledit variant appartient toujours à la famille protéine kinase C et présente la même mutation ponctuelle que le polypeptide ci-dessus. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomiques, les séquences d'ARNm ou d'ADNc, qui codent pour le polypeptide selon l'invention ou l'un quelconque de ses variants définis ci-dessus et qui sont constituées par : a) la séquence d'ADN [SEQ ID N*l] ; b) les séquences d'ADN hybridant avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci ; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et code pour le polypeptide tel que défini ci-dessus ; d) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.This amino acid sequence differs from the known PKCα sequence by the amino acid at position 294 which is a glycine instead of an aspartic acid. The new polypeptide according to the invention is therefore PKCα having a point mutation in position 294, hereinafter referred to as the D 294 G mutation. It has a molecular weight of approximately 80 kdaltons. The D 294 G mutation is located in a strategic region of the enzyme, the V3 region. The different regions of the PKC are indicated in FIG. 1 which is a schematic representation of the constant and variable domains of the PKC enzyme, as described by Stabel et al. (Stabel, S, Parker, PJ, 1991, "Protein Kinase C". Pharmacol. Ther. 51: 71-95). This region V3 contains the sites sensitive to calpain, the binding sites of the intra-cellular "receptors" of the PKC as well as the potential calcium binding site. The D 294 G mutation is located in this potential calcium binding site and can affect the enzyme's affinity for calcium. This site does not have a classic EF hand configuration corresponding to a propeller-loop-propeller pattern. In fact, there is no possibility for a first propeller to form. The second helix, although probably shorter than that usually described, is theoretically possible (given the secondary structure predicted using the GOR method ("Prediction of protein structures and the principles of protein conformation", edited by GD Fasman, Plenum Press New York. 1989: 417-465)). The calcium loop starts with glutamic acid at position 292 (position X in the loop) and ends with the amino acid glutamine at position 303 (position-Z in the loop). Amino acid 294, which is usually aspartic acid or asparagine, is changed here by a point mutation in apolar glycine. This could account for the proposed changes for calcium affinity and therefore for the functionality of the enzyme. It is, in fact, known that the binding of calcium to the enzyme is a necessary condition for the transfer of the enzyme from the intracellular compartment to the plasma membrane. In fact, it seems that PKC is accumulated in the cytosol because its quantity in the cytosol is undoubtedly greater than in the membrane for invasive tumors. The consequences of the cytosolic accumulation of the enzyme are however difficult to test because the enzyme cannot be activated in vitro by usual activators. Its presence in cells tumor suggests that the PKCα mutation probably affects the regulatory processes normally controlled by PKC. The relationship between the point mutation of PKCα and the invasive phenotype of pituitary tumors leads to the comments below. In fact, PKC is involved in the regulation of secreted proteinases such as stromelysin and collagenase, which are enzymes involved in the development of tumor metastases and angiogenesis. It is also involved in the biosynthesis of metalloproteinase inhibitors by human fibroblasts in culture. The subject of the invention is also the variants of this polypeptide resulting from the addition, deletion and / or replacement of one or more amino acids, it being understood that said variant always belongs to the protein kinase C family and has the same point mutation as the above polypeptide. The present invention also relates to the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the mRNA or cDNA sequences, which code for the polypeptide according to the invention or any of its variants. defined above and which consist of: a) the DNA sequence [SEQ ID N * 1]; b) DNA sequences hybridizing with the above sequence or a fragment thereof; c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code result from the sequences a) and b) above and code for the polypeptide as defined above; d) the corresponding mRNA and cDNA sequences.
Le polypeptide selon l'invention peut être obtenu par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de :The polypeptide according to the invention can be obtained by the technique of genetic engineering which comprises the steps of:
- culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transfectées à l'aide d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention, etculture of a transformed microorganism or of eukaryotic cells transfected using a nucleic acid sequence according to the invention, and
- récupération du polypeptide produit par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes.- recovery of the polypeptide produced by said microorganism or said eukaryotic cells.
Cette technique est bien connue de l'homme de métier. Pour plus de détail la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA technology I, Editors Aies Prokop, Rakesh K. Bajpai ; Annals of the New- York Academy of Sciences, volume 646, 1991.This technique is well known to those skilled in the art. For more details concerning it, one can refer to the work below: Recombinant DNA technology I, Editors Aies Prokop, Rakesh K. Bajpai; Annals of the New- York Academy of Sciences, volume 646, 1991.
Les séquences d'ADN selon l'invention peuvent être obtenues à partir d'un ARN messager provenant d'une tumeur invasive selon les techniques classiques décrites par Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.The DNA sequences according to the invention can be obtained from a messenger RNA originating from an invasive tumor according to the conventional techniques described by Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Par exemple, les séquences d'ADN selon l'invention, peuvent être obenues par le procédé qui consiste : - à préparer les ARN totaux à partir d'une tumeur invasive ;For example, the DNA sequences according to the invention can be obtained by the process which consists in: - preparing the total RNA from an invasive tumor;
- à synthétiser un double brin d'ADN complémentaire (ADNc) à partir de la préparation d'ARN avec une amorce oligodT ;- to synthesize a double strand of complementary DNA (cDNA) from the preparation of RNA with an oligodT primer;
- à amplifier cet ADNc par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des oligonucleotides spécifiques ; - à clôner ce produit amplifié dans un plasmide ou un vecteur d'expression ;- to amplify this cDNA by polymerase chain reaction (PCR) with specific oligonucleotides; - cloning this amplified product into a plasmid or an expression vector;
- à l'amplifier par transformation bactérienne.- to amplify it by bacterial transformation.
Pour chacune de ces étapes on utilise avantageusement les techniques classiques bien connues de l'homme de métier et décrites en détail par MANIATIS et al. dans l'ouvrage cité ci-dessus.For each of these stages, the conventional techniques well known to those skilled in the art and described in detail by MANIATIS et al. in the work cited above.
L'invention a également pour objet les sondes nucléotidiques qui, par hybridation, permettent de détecter dans une tumeur, une séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention, une séquence d'ADN complémentaire ou une séquence d'ARN correspondante. Les sondes nucléotidiques de l'invention sont spécifiques de la région caractéristique de la séquence d'ADN, d'ADNc ou d'ARN, à savoir de la partie portant la mutation ponctuelle du polypeptide selon l'invention.A subject of the invention is also the nucleotide probes which, by hybridization, make it possible to detect in a tumor, a DNA sequence coding for the polypeptide according to the invention, a complementary DNA sequence or a corresponding RNA sequence. The nucleotide probes of the invention are specific for the region characteristic of the DNA, cDNA or RNA sequence, namely the part carrying the point mutation of the polypeptide according to the invention.
Les sondes nucléotidiques selon l'invention sont des oligonucleotides pouvant avoir une longueur variable qui est de préférence au minimum d'environ 5 à 15 nucléotides et au maximum d'environ 50 à 60 nucléotides.The nucleotide probes according to the invention are oligonucleotides which can have a variable length which is preferably at least about 5 to 15 nucleotides and at most about 50 to 60 nucleotides.
Ces oligonucleotides sont préparés selon les techniques bien connues de l'homme de métier, telles que celles décrites par Maillet- Baron et al. (Maillet-Baron L., Soussi T., Séquençage des acides nucléiques. Ed Tech Doc. Collection Génie Génétique, Chap. 6, 1993). La spécificité de ces oligonucleotides permettant leur utilisation comme sondes peut être déterminée par la technique décrite par RandallThese oligonucleotides are prepared according to techniques well known to those skilled in the art, such as those described by Maillet-Baron et al. (Maillet-Baron L., Soussi T., Sequencing of nucleic acids. Ed Tech Doc. Genetic Engineering Collection, Chap. 6, 1993). The specificity of these oligonucleotides allowing their use as probes can be determined by the technique described by Randall
K.SAIKI et al. dans NATURE, vol. 324, p.163-166, 1986, qui est basée sur la reconnaissance spécifique d'un allèle donné par une sonde oligonucléotidique.K. SAIKI et al. in NATURE, vol. 324, p.163-166, 1986, which is based on the specific recognition of an allele given by an oligonucleotide probe.
Dans le cas présent, on pourra utiliser comme allèle le fragment D (fragment 755-983 de la PKCα mutée - voir figure 1). Les oligonucleotides préparés ci-dessus seront appropriés comme sondes aux fins de l'invention s'ils s'hybrident avec le fragment D ci-dessus et ne s'hybrident pas avec le fragment correspondant de la PKCα normale. A titre d'exemple de sonde appropriée aux fins de l'invention, on peut citer la sonde ayant la séquence [SEQ ID N*3] :In the present case, fragment D can be used as an allele (fragment 755-983 of the mutated PKCα - see FIG. 1). The oligonucleotides prepared above will be suitable as probes for the purposes of the invention if they hybridize with the fragment D above and do not hybridize with the corresponding fragment of normal PKCα. As an example of a probe suitable for the purposes of the invention, mention may be made of the probe having the sequence [SEQ ID N * 3]:
ATT CCG GAA GGG GGC GAG GAA GGA AAC A des fins de diagnostic, ces sondes sont soit marquées par un isotope radioactif soit chimiquement modifiées par un agent fluorescent ou un résidu, tel que la digoxigénine, reconnu par un anticorps ou une enzyme. Ces sondes ainsi marquées permettent selon les méthodes classiques d'identifier s'il y a hybridation ou non avec une séquence d'ADN, une séquence d'ADNc ou une séquence d'ARNm. Les sondes nucléotidiques selon l'invention conviennent également comme oligonucleotides antisens pour le blocage de la transcription ou de la traduction de l'ARNm de la PKCα portant la mutation D 294 G soit in vitro, soit in vivo.ATT CCG GAA GGG GGC GAG GAA GGA AAC For diagnostic purposes, these probes are either labeled with a radioactive isotope or chemically modified by a fluorescent agent or a residue, such as digoxigenin, recognized by an antibody or an enzyme. These probes thus labeled make it possible, according to conventional methods, to identify whether there is hybridization or not with a DNA sequence, a cDNA sequence or an mRNA sequence. The nucleotide probes according to the invention are also suitable as antisense oligonucleotides for blocking the transcription or translation of the PKCα mRNA carrying the D 294 G mutation either in vitro or in vivo.
Ces oligonucleotides antisens sont des inhibiteurs de la transcription ou de la traduction de la PKCα mutée qui peuvent être utilisés en thérapie pour le traitement des cancers à tumeur invasive ou des tumeurs exprimant la PKCα mutée, éventuellement en combinaison avec une toxine , telle que la ricine ou tout autre élément permettant de détruire les cellules cancéreuses. La présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic des tumeurs, telles que par exemple des tumeurs du foie, du sein, du colon, de la vessie, de la thyroïde, qui consiste à détecter soit le polypeptide selon l'invention, soit une séquence d'ADN ou une séquence d'ARN codant pour ledit polypeptide dans un échantillon biologique de la tumeur. La détection de la séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide peut être réalisée par la technique d'hybridation à l'aide d'une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus. Ce procédé de diagnostic comprend les étapes : a) d'amplification préalable des séquences d'ADN génomiques ou d'ADNc fabriquées à partir d'ARNm contenues dans un échantillon biologique d'un patient, au moyen d'amorces, telles des amorces d'ADN, b) mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde nucléotidique selon l'invention ; c) détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé.These antisense oligonucleotides are inhibitors of the transcription or translation of mutated PKCα which can be used in therapy for the treatment of invasive tumor cancers or tumors expressing mutated PKCα, possibly in combination with a toxin, such as ricin. or anything else that destroys cancer cells. The present invention also relates to a method for diagnosing tumors, such as for example tumors of the liver, breast, colon, bladder, thyroid, which consists in detecting either the polypeptide according to the invention, or a DNA sequence or an RNA sequence encoding said polypeptide in a biological sample from the tumor. Detection of the DNA sequence coding for said polypeptide can be carried out by the hybridization technique using a nucleotide probe as defined above. This diagnostic method comprises the steps: a) of prior amplification of the genomic DNA or cDNA sequences made from mRNAs contained in a biological sample of a patient, using primers, such as primers d 'DNA, b) bringing the biological sample into contact with a nucleotide probe according to the invention; c) detection of the hybridization complex which has possibly formed.
La détection de la séquence d'ARN codant pour ledit polypeptide peut être réalisée par la technique d'hybridation in situ à l'aide d'une sonde nucléotidique telle que définie ci-dessus et détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé.The detection of the RNA sequence encoding said polypeptide can be carried out by the in situ hybridization technique using a nucleotide probe as defined above and detection of the hybridization complex which has possibly form.
La détection du polypeptide selon l'invention peut être réalisée par immunohistochimie à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement la PKCα mutée.The detection of the polypeptide according to the invention can be carried out by immunohistochemistry using antibodies specifically recognizing the mutated PKCα.
L'invention a également pour objet les anticorps dirigés contre le polypeptide selon l'invention, qui conviennent notamment pour la détection du polypeptide selon l'invention.The subject of the invention is also the antibodies directed against the polypeptide according to the invention, which are particularly suitable for the detection of the polypeptide according to the invention.
Ces anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux.These antibodies can be polyclonal antibodies obtained according to conventional animal immunization methods.
Ces anticorps peuvent également être des anticorps monoclonaux obtenus selon le procédé bien connu des KOHLER G. et MILSTEIN C, Nature (1975) vol. 256, p. 495-497.These antibodies can also be monoclonal antibodies obtained according to the method well known from KOHLER G. and MILSTEIN C, Nature (1975) vol. 256, p. 495-497.
L'invention a également pour objet les vecteurs recombinants pour le clonage et/ou l'expression qui contiennent une séquence d'ADN selon l'invention. Ces vecteurs, qui peuvent être des plasmides, des cosmides, des phages ou des virus, contiennent en plus de la séquence d'ADN selon l'invention, les moyens appropriés pour leur replication et/ou leur expression, tels que promoteurs forts de virus, promoteurs activables par des facteurs variés, origine de replication, etc..A subject of the invention is also the recombinant vectors for cloning and / or expression which contain a DNA sequence according to the invention. These vectors, which may be plasmids, cosmids, phages or viruses, contain in addition to the DNA sequence according to the invention, the means suitable for their replication and / or their expression, such as strong virus promoters , promoters activatable by various factors, origin of replication, etc.
Les vecteurs recombinants peuvent être utilisés pour transfecter des modèles cellulaires à des fins d'études in vitro et pour la sélection de médicaments ou autres agents anti-tumoraux. Ainsi la présente invention a également pour objet les cellules hôtes transfectées avec la séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide des vecteurs ci-dessus. Ces cellules peuvent être par exemple des cellules GC ou des cellules hypophysaires hyperplasiées.Recombinant vectors can be used to transfect cell models for in vitro studies and for the selection of drugs or other anti-tumor agents. Thus the subject of the present invention is also the host cells transfected with the DNA sequence coding for the polypeptide according to the invention using the above vectors. These cells can for example be GC cells or hyperplastic pituitary cells.
Un premier modèle cellulaire approprié peut être obtenu à partir d'une lignée de cellules hypophysaires tumorales n'exprimant pas le phénotype invasif, les cellules GC. Ces cellules sécrètent de l'hormone de croissance et forment des tumeurs in vivo lorsqu'elles sont implantées sous la peau du dos. In vivo, ces tumeurs ne donnent pas de métastases. En plus, elles n'expriment pas la forme mutée de la PKCα.A first suitable cell model can be obtained from a line of tumor pituitary cells not expressing the invasive phenotype, the GC cells. These cells secrete growth hormone and form tumors in vivo when implanted under the skin of the back. In vivo, these tumors do not give metastases. In addition, they do not express the mutated form of PKCα.
Les cellules GC ainsi transfectées pourront être soit cultivées in vitro, soit implantées in vivo.The GC cells thus transfected can be either cultured in vitro or implanted in vivo.
Sur les cellules GC cultivées in vitro on peut mesurer : - l'expression de la PKCα mutée,On GC cells cultured in vitro, it is possible to measure: - the expression of the mutated PKCα,
- l'hormone de croissance (GH),- growth hormone (GH),
- le taux de prolifération cellulaire par incorporation de thyroïdine ^H,- the rate of cell proliferation by incorporation of thyroid ^ H,
- l'activité et l'expression de la PKCα, - la morphologie des cellules,- the activity and expression of PKCα, - cell morphology,
- la sécrétion de la cathépsine D, enzyme protéolytique participant à la destruction de la membrane basale.- the secretion of cathépsine D, proteolytic enzyme participating in the destruction of the basement membrane.
Sur les cellules implantées in vivo on peut mesurer :On cells implanted in vivo we can measure:
- l'invasion locale des tissus, - l'apparition de métastases,- local tissue invasion, - the appearance of metastases,
- l'hormone de croissance (GH),- growth hormone (GH),
- l'expression et l'activité de la PKCα dans les tumeurs.- expression and activity of PKCα in tumors.
Un deuxième modèle expérimental consiste à transfecter la PKC α mutée dans des cellules hypophysaires hyperplasiées, obtenue chez le rat estrogénisé.A second experimental model consists in transfecting the mutated PKC α into hyperplastic pituitary cells, obtained in the estrogenized rat.
Dans ce cas, la transfection est transitoire et les mêmes paramètres que ceux mesurés in vitro pour les cellules GC peuvent aussi être estimés.In this case, the transfection is transient and the same parameters as those measured in vitro for GC cells can also be estimated.
Ces modèles expérimentaux conviennent particulièrement bien pour la sélection de médicaments ou agents anti-tumoraux appropriés. Le polypeptide selon l'invention peut également être utilisé en biochimie et en enzymologie pour étudier les conséquences de la mutation sur les fonctions de l'enzyme, pour tester des molécules visant à reconnaître spécifiquement le polypeptide selon l'invention, pour étudier les interactions spécifiques du polypeptide selon l'invention avec tout élément cellulaire.These experimental models are particularly suitable for the selection of appropriate anti-tumor drugs or agents. The polypeptide according to the invention can also be used in biochemistry and in enzymology to study the consequences of the mutation on the functions of the enzyme, to test molecules aiming to specifically recognize the polypeptide according to the invention, to study specific interactions of the polypeptide according to the invention with any cellular element.
L'invention va être maintenant illustrée plus en détail par les exemples non limitatifs ci-après.The invention will now be illustrated in more detail by the following nonlimiting examples.
Dans ces exemples, on a utilisé des tumeurs de l'hypophyse (sécrétant l'hormone de croissance (GH) , sécrétant la prolactine (PRL) ou sécrétant l'hormone adénocorticotrope (ACTH) et des tumeurs non- sécrétantes) qui ont été obtenues dans des salles d'opération après des adénomectomies transphénoïdales. Des fragments des tumeurs ont été congelés dans de l'azote liquide. D'autres fragments ont été utilisés pour des tests de microscopie et des tests immunocytochimiques. Le diagnostic avant l'opération a été établi par des critères cliniques, biologiques et radiologiques. Les études morphologiques et immunocytochimiques ont confirmé le diagnostic. Le caractère invasif a été établi par le neurochirurgien au cours de l'opération et correspond à l'invasion de la "dura mata" ou du diaphragme sellaire.In these examples, tumors of the pituitary gland (secreting growth hormone (GH), secreting prolactin (PRL) or secreting adenocorticotropic hormone (ACTH) and non-secreting tumors) were used which were obtained in operating theaters after transphenoidal adenomectomies. Fragments of the tumors were frozen in liquid nitrogen. Other fragments were used for microscopy tests and immunocytochemical tests. The diagnosis before the operation was established by clinical, biological and radiological criteria. Morphological and immunocytochemical studies confirmed the diagnosis. The invasiveness was established by the neurosurgeon during the operation and corresponds to the invasion of the "dura mata" or the sellar diaphragm.
FIGURES :FIGURES:
FIG. 1 : Représentation schématique des domaines variables et constants de la PKC ainsi que des fragments A, B, C et D obtenus par PCR.FIG. 1: Schematic representation of the variable and constant domains of PKC as well as fragments A, B, C and D obtained by PCR.
FIG. 2 : Autoradiographie d'un immunoblot de la PKCα : a et d, hypophyse normale ; b et e, tumeur non invasive ; c et f, tumeur invasive ; a, b, c, fraction cytosolique ; d, e, f, fraction membranaire.FIG. 2: Autoradiography of a PKCα immunoblot: a and d, normal pituitary gland; b and e, non-invasive tumor; c and f, invasive tumor; a, b, c, cytosolic fraction; d, e, f, membrane fraction.
FIG. 3. : Comparaison de l'activité et de l'expression de laFIG. 3.: Comparison of the activity and expression of the
PCK dans les tumeurs invasives et non invasives. FIGS. 4 et 5 : Analyse de la séquence nucléotidique dans la région amplifiée par PCR entourant le codon 294 obtenue par séquençage selon la technique de Sanger.PCK in invasive and non-invasive tumors. FIGS. 4 and 5: Analysis of the nucleotide sequence in the region amplified by PCR surrounding codon 294 obtained by sequencing according to the Sanger technique.
Exemple 1 : mesure de l'activité et de l'expression de la PKCα dans des tumeurs invasives et des tumeurs non invasives de l'hypophyse humaineEXAMPLE 1 Measurement of the Activity and Expression of PKCα in Invasive Tumors and Non-Invasive Tumors of the Human Pituitary gland
L'activité protéine kinase C a été déterminée selon la méthode de BIRMAN et al. décrite dans Acta endocrino., 121. 489-494 (1989).The protein kinase C activity was determined according to the method of BIRMAN et al. described in Acta endocrino., 121. 489-494 (1989).
Cette méthode consiste à préparer les fractions soluble et membranaire des homogénats tissulaires et à obtenir par filtration sur colonne échangeuse d'ions, une préparation semi-purifiée de la PKC. L'activité de l'enzyme est mesurée par incorporation de p32 dans un substrat exogène (histone IIIS) en présence et en absence de calcium, phospholipides et diacylglycérol.This method consists in preparing the soluble and membrane fractions of tissue homogenates and in obtaining, by filtration on an ion exchange column, a semi-purified preparation of PKC. The activity of the enzyme is measured by incorporating p32 into an exogenous substrate (histone IIIS) in the presence and in the absence of calcium, phospholipids and diacylglycerol.
Comme indiqué sur la figure 2, l'expression de la PKCα est augmentée dans les fractions solubles et membranaires des tumeurs d'hypophyse testées par comparaison avec les fractions provenant d'hypophyses de rat normales et ceci quelque soit la nature de la tumeurAs indicated in FIG. 2, the expression of PKCα is increased in the soluble and membrane fractions of pituitary tumors tested by comparison with the fractions originating from normal rat pituitaries and this whatever the nature of the tumor.
(sécrétante ou non).(secreting or not).
L'expression de la PKCα est déterminée selon la méthode décrite par V. ALVARO et al. dans Int. J. Cancer : 50, 724-730 (1992).The expression of PKCα is determined according to the method described by V. ALVARO et al. in Int. J. Cancer: 50, 724-730 (1992).
Les résultats sont reportés sur la figure 3 sur laquelle on a utilisé les légendes ci-après :The results are shown in FIG. 3 on which the following legends have been used:
WÊU : activité PKC EZZZ3 : expression PKCWÊU: PKC activity EZZZ3: PKC expression
Cette figure montre que l'activité et l'expression de la PKC dans les tumeurs non invasives sont augmentées de la même façon alors que dans les tumeurs invasives l'augmentation de l'expression de la PKC est nettement supérieure à celle de l'activité de la PKC.This figure shows that the activity and expression of PKC in non-invasive tumors are increased in the same way whereas in invasive tumors the increase in expression of PKC is significantly greater than that of activity of the PKC.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26J Exemple 2 : analyse "Western Blot fimmunoblotV'SUBSTITUTE SHEET (RULE 26J Example 2: "Western Blot fimmunoblotV 'analysis
Dans cet exemple, le matériel ci-après a été utilisé : - membrane "Immobilon" fournie par la Société Millipore.In this example, the following equipment was used: - "Immobilon" membrane supplied by the Millipore Company.
- anti-sérum polyclonal dirigé contre la protéine PKCα, donné généreusement par le Docteur SAITOH, Département de neurochimie, Université de Californie, San Diego, La Jolla, USA.- polyclonal anti-serum directed against the PKCα protein, generously donated by Doctor SAITOH, Department of Neurochemistry, University of California, San Diego, La Jolla, USA.
- le second anticorps marqué à l'iode 125 (anti IgG de lapin) a été fourni par Amersham [Réf. IM 134].- the second antibody labeled with iodine 125 (anti rabbit IgG) was supplied by Amersham [Ref. IM 134].
Séquençage :Sequencing:
Le RNAzole [RNA 15.01-100] et les oligonucleotides ont été obtenus auprès de la Société Bioprobe.RNAzole [RNA 15.01-100] and the oligonucleotides were obtained from the Bioprobe Company.
La reverse transcriptase AMV (superscript preamplication système) a été fournie par Bethesda Research Laboratories USA.AMV reverse transcriptase (superscript preamplication system) was supplied by Bethesda Research Laboratories USA.
La polymèrase DNA Taq a été fourni par Boehringer. Le kit de clonage TA cloning version 1.3 fourni par Invitrogen et le kit de Séquençage par la séquenase 2.0 fourni par USB.DNA Taq polymerase was supplied by Boehringer. The TA cloning kit version 1.3 supplied by Invitrogen and the Sequencing by sequenase 2.0 kit supplied by USB.
Des tumeurs d'hypophyse humaine et des hypophyses de rat normales (200 mg) ont été homogénéisées (1/5 : poids/volume) dans 10 mmol/1 de tampon Tris HCL contenant 2 mmol/1 d'EDTA et 0,1 mmol/1 de phénylméthylsulfonylfluorure pH 7,4 (tampon A). Après centrifugation à 800 x g pendant 4 minutes, le surnageant a été centrifugé pendant 45 minutes à 37000 x g fournissant le cystosol (fraction soluble) et le culot membranaire. Ce dernier a été remis en suspension dans 1 ml de tampon A contenant 1 % de Nonidet P40 [Sigma] et recentrifugé ultérieurement pendant 15 minutes à 37000 x g. Le surnageant résultant constitue la fraction membranaire.Human pituitary tumor and normal rat pituitary (200 mg) were homogenized (1/5: weight / volume) in 10 mmol / 1 of Tris HCL buffer containing 2 mmol / 1 of EDTA and 0.1 mmol / 1 of phenylmethylsulfonylfluoride pH 7.4 (buffer A). After centrifugation at 800 x g for 4 minutes, the supernatant was centrifuged for 45 minutes at 37,000 x g providing the cystosol (soluble fraction) and the membrane pellet. The latter was resuspended in 1 ml of buffer A containing 1% of Nonidet P40 [Sigma] and recentrifuged subsequently for 15 minutes at 37,000 x g. The resulting supernatant constitutes the membrane fraction.
Les fractions solubles et les fractions membranaires ont été portées à ébullition pendant 10 minutes dans le tampon SDS PAGE (25 mM, Tris-HCl pH 8,8, 10 % de dodécyl sulfate de sodium, 10 % de glycérol, 10 % de β mercaptoéthanol et 0,05 % de bleu de bromophenol, concentrations finales). Des quantités égales de protéines de chaque échantillon (100 μg) ont été déposées sur des gels selon la méthode de Laemmli [NATURE 227, 680-685 (1970)] en utilisant un gel de séparation contenant 10 % d'acrylamide, transférées sur la membrane immobilon. Cette membrane est incubée avec l'antisérum polyclonal dirigé contre la protéine PKCα (dilution finale l/2000è).The soluble fractions and the membrane fractions were brought to the boil for 10 minutes in SDS PAGE buffer (25 mM, Tris-HCl pH 8.8, 10% sodium dodecyl sulfate, 10% glycerol, 10% β mercaptoethanol and 0.05% bromophenol blue, final concentrations). Equal amounts of protein from each sample (100 μg) were deposited on gels according to the Laemmli method [NATURE 227, 680-685 (1970)] using a separation gel containing 10% acrylamide, transferred to the immobilon membrane. This membrane is incubated with the polyclonal antiserum directed against the protein PKCα (final dilution 1 / 2000th).
Les immunoblots ont été marqués avec le second anticorps, lui- même marqué à l'iode 125 (anti IgG de lapin) et mis en contact avec un film Kodak à - 80*C. Les concentrations de protéine ont été déterminées par la méthode de Lowry [J. Biol. Chem. 193. 265-271 (1951)].The immunoblots were labeled with the second antibody, itself labeled with iodine 125 (anti rabbit IgG) and contacted with a Kodak film - 80 ° C. Protein concentrations were determined by the method of Lowry [J. Biol. Chem. 193. 265-271 (1951)].
Exemple 3 : séquençageExample 3: sequencing
Pour effectuer le séquençage de l'ADNc amplifié par PCR et sous-clôné, on a extrait l'ARN total de chaque homogénat de tumeurs avec le RNAzole, selon une méthode dérivée de celle de Chomczynski et al. (Annal Biochem, 162, 156, 1987). Un premier brin d'ADNc a été produit dans une réaction contenant 1 μg d'ARN total, des amorces oligo (dT) et la reverse transcriptase en utilisant le kit de réserve transcriptase AMV selon les recommandations du fabricant. 50 % du volume réactionnel de l'ADNc a été amplifié selon la méthode décrite par SAIKI et al. dans SCIENCE 1988, 239, 487-491. La séquence totale de la protéine PKCα a été amplifiée en trois fragments de 1 kb chacun : A, B, C.To carry out the sequencing of the PCR amplified and subcloned cDNA, the total RNA of each tumor homogenate was extracted with RNAzole, according to a method derived from that of Chomczynski et al. (Annal Biochem, 162, 156, 1987). A first strand of cDNA was produced in a reaction containing 1 μg of total RNA, oligo (dT) primers and reverse transcriptase using the AMV transcriptase reserve kit according to the manufacturer's recommendations. 50% of the reaction volume of the cDNA was amplified according to the method described by SAIKI et al. in SCIENCE 1988, 239, 487-491. The total sequence of the PKCα protein was amplified into three fragments of 1 kb each: A, B, C.
Le mélange PCR contenait 2,5 U ADN polymérase de ThermusThe PCR mixture contained 2.5 U DNA polymerase from Thermus
Aquaticus (Taq) et 50 pmoles de chaque amorce. Les amorces suivantes ont été utilisées :Aquaticus (Taq) and 50 pmoles of each primer. The following primers were used:
Pour le fragment A :For fragment A:
5*-GGAGCAAGAGGTGGTTGG-3* [SEQ ID N'4] (amorce 5' ; nucléotides 1 à 18) ;5 * -GGAGCAAGAGGTGGTTGG-3 * [SEQ ID N'4] (primer 5 '; nucleotides 1 to 18);
5'-CTTCAGAGGGACTGATGACT-3' [SEQ ID N*5] (amorce 3' ; nucléotides 975 à 994).5'-CTTCAGAGGGACTGATGACT-3 '[SEQ ID N * 5] (primer 3'; nucleotides 975 to 994).
Pour le fragment B :For fragment B:
5'-GCCTCTGCGGAATGGATCAC-3' [SEQ ID N#6] (amorce 5" ; nucléotides 473 à 492) ;5'-GCCTCTGCGGAATGGATCAC-3 '[SEQ ID N # 6] (primer 5 "; nucleotides 473 to 492);
5'-CTCCATCCATCATGTGTTCC-3' [SEQ ID N'7] (amorce 3' ; nucléotides 1485 à 1504). Pour le fragment C :5'-CTCCATCCATCATGTGTTCC-3 '[SEQ ID N'7] (primer 3'; nucleotides 1485 to 1504). For fragment C:
5'-GACCTCATGTACCACATTCA-3' [SEQ ID N*8] (amorce 5' ; nucléotides 1297 à 1316) ;5'-GACCTCATGTACCACATTCA-3 '[SEQ ID N * 8] (primer 5'; nucleotides 1297 to 1316);
5'-CTTCCACTAAGATAATGTTC-5' [SEQ ID N*9] (amorce 3' ; nucléotides 2226 à 2245).5'-CTTCCACTAAGATAATGTTC-5 '[SEQ ID N * 9] (primer 3'; nucleotides 2226 to 2245).
L'amplification a été réalisée en 30 cycles de 30 secondes à 94*C, 30 secondes à 55* C (amorce du fragment A), 60* C (amorce du fragment B), 60* C (amorce du fragment C), 1 minute à 72* C dans le Thermocycle Cetus Perkin-Elmer. L'ADN amplifié a été purifié sur du gel d'agarose puis cryoélué et précipité à l'ethanol. L'ADN purifié a été directement sous-clôné dans un vecteur PCRTM II selon la protocole du kit de clonage TA cloning fourni par Invitrogen. La méthode de séquençage à la séquenase a été utilisée pour déterminer la séquence codante entière de la protéine PKCα à partir d'au moins 7 sous-clones pour chaque fragment PCR (A, B, C) provenant de deux tumeurs différentes (N* 1 et N* 2 du tableau I) et deux PCR différents pour chaque tumeur de manière à différencier les mutations des erreurs Taq. Le séquençage a été réalisé sur les deux brins avec les amorces utilisées dans la réaction d'amplification. Pour l'examen des autres tumeurs et les tissus contrôles (2 hypophyses humaines normales et un colon normal) le premier brin d'ADNc, l'ADNc amplifié par la méthode PCR et le sous-clonage ont été réalisés comme décrit ci-dessus en utilisant les deux amorces choisies autour du point de mutation trouvé dans les deux premières tumeurs délimitant ainsi un quatrième fragment le fragment D :Amplification was performed in 30 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C (primer of fragment A), 60 ° C (primer B fragment), 60 ° C (primer fragment C), 1 minute at 72 * C in the Cetus Perkin-Elmer Thermocycle. The amplified DNA was purified on agarose gel then cryoeluted and precipitated with ethanol. The purified DNA was directly subcloned into a PCRTM II vector according to the protocol of the TA cloning kit supplied by Invitrogen. The sequenase sequencing method was used to determine the entire coding sequence of the PKCα protein from at least 7 subclones for each PCR fragment (A, B, C) originating from two different tumors (N * 1 and N * 2 in Table I) and two different PCRs for each tumor so as to differentiate the mutations from the Taq errors. The sequencing was carried out on the two strands with the primers used in the amplification reaction. For the examination of the other tumors and the control tissues (2 normal human pituitaries and a normal colon) the first strand of cDNA, the cDNA amplified by the PCR method and the subcloning were carried out as described above in using the two primers chosen around the point of mutation found in the first two tumors thus delimiting a fourth fragment fragment D:
5'-GACCGACGACTGTCTGTAGA-3' [SEQ ID N*10] (amorce 5' ; nucléotides 726 à 745) et5'-GACCGACGACTGTCTGTAGA-3 '[SEQ ID N * 10] (primer 5'; nucleotides 726 to 745) and
5'-CAGGGAGACTTCTGTCCTT-3' [SEQ ID N*ll] (amorce 3' ; nucléotides 983 à 1001). L'amplification a été réalisée au cours de 30 cycles de5'-CAGGGAGACTTCTGTCCTT-3 '[SEQ ID N * ll] (primer 3'; nucleotides 983 to 1001). The amplification was carried out during 30 cycles of
30 secondes à 94* C, 30 secondes à 55* C, 1 minute à 72* C dans un Thermocycle Perkin Elmer Cetus. Pour chaque fragment PCR, 7 sous- clones ont été séquences.30 seconds at 94 * C, 30 seconds at 55 * C, 1 minute at 72 * C in a Perkin Elmer Cetus Thermocycle. For each PCR fragment, 7 subclones were sequenced.
RESULTATSRESULTS
Expression de la protéine PKCα Ainsi que cela est montré dans la figure 3, l'expression de la PKC α est augmentée dans les fractions membranaires et dans les fractions solubles de toutes les tumeurs d'hypophyse testées (n=5) par comparaison aux hypophyses de rats et ceci quelque soit la nature de la tumeur sécrétante ou non.PKCα protein expression As shown in FIG. 3, the expression of the PKC α is increased in the membrane fractions and in the soluble fractions of all the pituitary tumors tested (n = 5) compared to the pituitaries of rats and this somewhat either the nature of the secreting tumor or not.
Analyse de la séquenceSequence analysis
Le séquençage complet de l'ADNc de la protéine PKCα extraite de 8 tumeurs d'hypophyse humaine a révélé la présence d'une mutation ponctuelle à la position 908 de l'ADNc (région V3 de la protéine, voir figure 1) des tumeurs invasives conduisant ainsi à un changement d'aminoacide. L'acide aspartique chargé négativement (position 294) a été changé en une glycine apolaire, le codon GAC devenant alors le codon GGC (voir figures 4 et 5 et tableau 1). Au contraire, aucune mutation ponctuelle n'a été détectée dans les ADNc des tumeurs non- invasives.Complete sequencing of the cDNA of the PKCα protein extracted from 8 human pituitary tumors revealed the presence of a point mutation at position 908 of the cDNA (region V3 of the protein, see FIG. 1) of invasive tumors thus leading to an amino acid change. The negatively charged aspartic acid (position 294) was changed to an apolar glycine, the GAC codon then becoming the GGC codon (see Figures 4 and 5 and Table 1). On the contrary, no point mutation was detected in the cDNAs of non-invasive tumors.
La proportion des sous-clones dérivés de l'ADNc de tumeurs invasives et présentant la mutation variait d'une tumeur à l'autre : 5 sur 7 pour l'adénome 1 ; 2 sur 7 pour l'adénome 2 ; 3 sur 7 pour l'adénome 3 ; et 1 sur 7 pour l'adénome 4. Le mutant de la PKCα est ainsi moins représenté que la PKCα normale.The proportion of subclones derived from the cDNA of invasive tumors and presenting the mutation varied from tumor to tumor: 5 out of 7 for adenoma 1; 2 out of 7 for adenoma 2; 3 out of 7 for adenoma 3; and 1 in 7 for adenoma 4. The PKCα mutant is thus less represented than normal PKCα.
Tableau 1 : mutation de la PKCα dans les tumeurs de l'hypophyseTable 1: PKCα mutation in pituitary tumors
Tumeur Immunocytochimie Codon 294Tumor Immunocytochemistry Codon 294
Groupe 1 : invasiveGroup 1: invasive
1 GH Gly1 GH Gly
2 GH/PRL Gly2 GH / PRL Gly
3 NIR Gly3 NIR Gly
4 ACTH Gly4 ACTH Gly
Groupe 2 : non invasiveGroup 2: non-invasive
5 NIR Asp5 NIR Asp
6 NIR Asp6 NIR Asp
7 GH Asp7 GH Asp
8 PRL Asp8 PRL Asp
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26T * NIR : cellules non immunoréactives GH hormone de croissance ; PRL Prolactine ; ACTH Hormone Adrénocorticotrope ;SUBSTITUTE SHEET (RULE 26T * NIR: non-immunoreactive GH growth hormone cells; PRL Prolactin; ACTH Adrenocorticotropic Hormone;
EXEMPLE 4 : détection de la mutation de la PKCα dans des tumeurs de la thyroïde humaineEXAMPLE 4 Detection of the PKCα mutation in human thyroid tumors
15 prélèvements de thyroïdes adénomateuses ou tumorales ont été examinés. La répartition histologique de ces prélèvements est la suivante :15 adenomatous or tumor thyroid samples were examined. The histological distribution of these samples is as follows:
- thyroïde adénomateuse (hyperplasie multinodulaire) sans signes apparents de malignité (n=9) ;- adenomatous thyroid (multinodular hyperplasia) with no apparent signs of malignancy (n = 9);
- thyroïde hyperplasiée normale provenant de la zone adjacente au nodule bénin ou malin (n=2) ; - tumeur maligne (n=4).- normal hyperplastic thyroid from the area adjacent to the benign or malignant nodule (n = 2); - malignant tumor (n = 4).
Les résultats du séquençage ont montré que : 1) le polypeptide mutant de la PCKα [SEQ ID N*2] n'est pas particulier à la tumeur de l'hypophyse dans laquelle il a été découvert à l'origine. 2) il a été retrouvé dans 4 prélèvements d'hyperplasie multinodulaire sur les 6 déjà analysés. Il est à noter ici que l'hyperplasie mutinodulaire constitue pour la tumeur de la thyroïde le stade préalable à la tumeur.The results of the sequencing have shown that: 1) the mutant polypeptide of PCKα [SEQ ID N * 2] is not specific to the tumor of the pituitary gland in which it was originally discovered. 2) it was found in 4 multinodular hyperplasia samples out of the 6 already analyzed. It should be noted here that mutinodular hyperplasia constitutes for the thyroid tumor the stage prior to the tumor.
3) le polypeptide mutant de la PKCα n'a pas été trouvé dans le tissu hyperplasie normal.3) the mutant PKCα polypeptide was not found in normal hyperplasia tissue.
4) le mutant a déjà été trouvé dans une tumeur des tumeurs analysées, ce résultat est en cours de confirmation.4) the mutant has already been found in a tumor of the tumors analyzed, this result is being confirmed.
La présence du polypeptide mutant de la PKCα dans un nodule caractérisé par l'anatomopathologiste comme hyperplasie bénigne est un signe de malignité et montre l'intérêt de l'utilisation de marqueurs moléculaires fiables indicateurs d'un stade précoce de tumorigénèse. LISTE DE SEQUENCESThe presence of the mutant PKCα polypeptide in a nodule characterized by the pathologist as benign hyperplasia is a sign of malignancy and shows the advantage of using reliable molecular markers indicative of an early stage of tumorigenesis. LIST OF SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSANT:(i) DEPOSITOR:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA(A) NAME: NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH AND
RECHERCHE MEDICALEMEDICAL RESEARCH
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac(B) STREET: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS CEDEX 13(C) CITY: PARIS CEDEX 13
(E) PAYS: France(E) COUNTRY: France
(F) CODE POSTAL: 75654(F) POSTAL CODE: 75654
(G) TELEPHONE: 4423 6000 (H) TELECOPIE: 4 8 6856(G) TELEPHONE: 4423 6000 (H) FAX: 4 8 6856
(ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDE MUTANT DE LA PROTEINE KINASE C, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR LEDIT POLYPEPTIDE ET LEURS UTILISATIONS(ii) TITLE OF THE INVENTION: PROTEIN MUTANT KINASE C POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAID POLYPEPTIDE AND USES THEREOF
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 11
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:(iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D* EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:(vi) DATA FROM THE PREVIOUS APPLICATION:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 07089(A) DEPOSIT NUMBER: FR 93 07089
(B) DATE DE DEPOT: ll-JUN-1993(B) DEPOSIT DATE: ll-JUN-1993
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2245 paires de bases(A) LENGTH: 2245 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(iii) ANTI-SENS: NON ( ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :(iii) ANTI-SENSE: NO (ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: CDS(A) NAME / KEY: CDS
(B) EMPLACEMENT: 28. .2043(B) LOCATION: 28. .2043
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GGAGCAAGAG GTGGTTGGGG GGGGACC ATG GCT GAC GTT TTC CCG GGC AAC 51GGAGCAAGAG GTGGTTGGGG GGGGACC ATG GCT GAC GTT TTC CCG GGC AAC 51
Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn 1 5Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn 1 5
GAC TCC ACG GCG TCT CAG GAC GTG GCC AAC CGC TTC GCC CGC AAA GGG 99 Asp Ser Thr Ala Ser Gin Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly 10 15 20GAC TCC ACG GCG TCT CAG GAC GTG GCC AAC CGC TTC GCC CGC AAA GGG 99 Asp Ser Thr Ala Ser Gin Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly 10 15 20
GCG CTG AGG CAG AAG AAC GTG CAC GAG GTG AAG GAC CAC AAA TTC ATC 1 7 Ala Leu Arg Gin Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile 25 30 35 40GCG CTG AGG CAG AAG AAC GTG CAC GAG GTG AAG GAC CAC AAA TTC ATC 1 7 Ala Leu Arg Gin Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile 25 30 35 40
GCG CGC TTC TTC AAG CAG CCC ACC TTC TGC AGC CAC TGC ACC GAC TTC 195 Ala Arg Phe Phe Lys Gin Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe 45 50 55GCG CGC TTC TTC AAG CAG CCC ACC TTC TGC AGC CAC TGC ACC GAC TTC 195 Ala Arg Phe Phe Lys Gin Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe 45 50 55
ATC TGG GGG TTT GGG AAA CAA GGC TTC CAG TGC CAA GTT TGC TGT TTT 243 Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gin Gly Phe Gin Cys Gin Val Cys Cys Phe 60 65 70ATC TGG GGG TTT GGG AAA CAA GGC TTC CAG TGC CAA GTT TGC TGT TTT 243 Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gin Gly Phe Gin Cys Gin Val Cys Cys Phe 60 65 70
GTG GTC CAC AAG AGG TGC CAT GAA TTT GTT ACT TTT TCT TGT CCG GGT 291 Val Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly 75 80 85GTG GTC CAC AAG AGG TGC CAT GAA TTT GTT ACT TTT TCT TGT CCG GGT 291 Val Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly 75 80 85
GCG GAT AAG GGA CCC GAC ACT GAT GAC CCC AGG AGC AAG CAC AAG TTC 339 Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe 90 95 100GCG GAT AAG GGA CCC GAC ACT GAT GAC CCC AGG AGC AAG CAC AAG TTC 339 Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe 90 95 100
AAA ATC CAC ACT TAC GGA AGC CCC ACC TTC TGC GAT CAC TGT GGG TCA 387 Ljs Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser 105 110 115 120AAA ATC CAC ACT TAC GGA AGC CCC ACC TTC TGC GAT CAC TGT GGG TCA 387 Ljs Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser 105 110 115 120
CTG CTC TAT GGA CTT ATC CAT CAA GGG ATG AAA TGT GAC ACC TGC GAT 435 Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gin Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp 125 130 135CTG CTC TAT GGA CTT ATC CAT CAA GGG ATG AAA TGT GAC ACC TGC GAT 435 Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gin Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp 125 130 135
ATG AAC GTT CAC AAG CAA TGC GTC ATC AAT GTC CCC AGC CTC TGC GGA 483 Met Asn Val His Lys Gin Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly 140 145 150 ATG GAT CAC ACT GAG AAG AGG GGG CGG ATT TAC CTA AAG GCT GAG GTT 531 Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val 155 160 165ATG AAC GTT CAC AAG CAA TGC GTC ATC AAT GTC CCC AGC CTC TGC GGA 483 Met Asn Val His Lys Gin Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly 140 145 150 ATG GAT CAC ACT GAG AAG AGG GGG CGG ATT TAC CTA AAG GCT GAG GTT 531 Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val 155 160 165
GCT GAT GAA AAG CTC CAT GTC ACA GTA CGA GAT GCA AAA AAT CTA ATC 579 Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile 170 175 180GCT GAT GAA AAG CTC CAT GTC ACA GTA CGA GAT GCA AAA AAT CTA ATC 579 Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile 170 175 180
CCT ATG GAT CCA AAC GGG CTT TCA GAT CCT TAT GTG AAG CTG AAA CTT 627 Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu 185 190 195 200CCT ATG GAT CCA AAC GGG CTT TCA GAT CCT TAT GTG AAG CTG AAA CTT 627 Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu 185 190 195 200
ATT CCT GAT CCC AAG AAT GAA AGC AAG CAA AAA ACC AAA ACC ATC CGC 675 Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gin Lys Thr Lys Thr Ile Arg 205 210 215ATT CCT GAT CCC AAG AAT GAA AGC AAG CAA AAA ACC AAA ACC ATC CGC 675 Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gin Lys Thr Lys Thr Ile Arg 205 210 215
TCC ACA CTA AAT CCG CAG TGG AAT GAG TCC TTT ACA TTC AAA TTG AAA 723 Ser Thr Leu Asn Pro Gin Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys 220 225 230TCC ACA CTA AAT CCG CAG TGG AAT GAG TCC TTT ACA TTC AAA TTG AAA 723 Ser Thr Leu Asn Pro Gin Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys 220 225 230
CCT TCA GAC AAA GAC CGA CGA CTG TCT GTA GAA ATC TGG GAC TGG GAT 771 Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp 235 240 245CCT TCA GAC AAA GAC CGA CGA CTG TCT GTA GAA ATC TGG GAC TGG GAT 771 Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp 235 240 245
CGA ACA ACA AGG AAT GAC TTC ATG GGA TCC CTT TCC TTT GGA GTT TCG 819 Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser 250 255 260CGA ACA ACA AGG AAT GAC TTC ATG GGA TCC CTT TCC TTT GGA GTT TCG 819 Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser 250 255 260
GAG CTG ATG AAG ATG CCG GCC AGT GGA TGG TAC AAG TTG CTT AAC CAA 867 Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gin 265 270 275 280GAG CTG ATG AAG ATG CCG GCC AGT GGA TGG TAC AAG TTG CTT AAC CAA 867 Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gin 265 270 275 280
GAA GAA GGT GAG TAC TAC AAC GTA CCC ATT CCG GAA GGG GGC GAG GAA 915 Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Gly Glu Glu 285 290 295GAA GAA GGT GAG TAC TAC AAC GTA CCC ATT CCG GAA GGG GGC GAG GAA 915 Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Gly Glu Glu 285 290 295
GGA AAC ATG GAA CTC AGG CAG AAA TTC GAG AAA GCC AAA CTT GGC CCT 963 Gly Asn Met Glu Leu Arg Gin Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro 300 305 310GGA AAC ATG GAA CTC AGG CAG AAA TTC GAG AAA GCC AAA CTT GGC CCT 963 Gly Asn Met Glu Leu Arg Gin Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro 300 305 310
GCT GGC AAC AAA GTC ATC AGT CCC TCT GAA GAC AGG AAA CAA CCT TCC 1011 Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gin Pro Ser 315 320 32 AAC AAC CTT GAC CGA GTG AAA CTC ACG GAC TTC AAT TTC CTC ATG GTG 1059 Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val 330 335 340GCT GGC AAC AAA GTC ATC AGT CCC TCT GAA GAC AGG AAA CAA CCT TCC 1011 Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gin Pro Ser 315 320 32 AAC AAC CTT GAC CGA GTG AAA CTC ACG GAC TTC AAT TTC CTC ATG GTG 1059 Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val 330 335 340
TTG GGA AAG GGG AGT TTT GGA AAG GTG ATG CTT GCC GAC AGG AAG GGC 1107 Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly 345 350 355 360TTG GGA AAG GGG AGT TTT GGA AAG GTG ATG CTT GCC GAC AGG AAG GGC 1107 Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly 345 350 355 360
ACA GAA GAA CTG TAT GCA ATC AAA ATC CTG AAG AAG GAT GTG GTG ATT H55 Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile 365 370 375ACA GAA GAA CTG TAT GCA ATC AAA ATC CTG AAG AAG GAT GTG GTG ATT H55 Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile 365 370 375
CAG GAT GAT GAC GTG GAG TGC ACC ATG GTA GAA AAG CGA GTC TTG GCC 1203 Gin Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala 380 385 390CAG GAT GAT GAC GTG GAG TGC ACC ATG GTA GAA AAG CGA GTC TTG GCC 1203 Gin Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala 380 385 390
CTG CTT GAC AAA CCC CCG TTC TTG ACG CAG CTG CAC TCC TGC TTC CAG 1251 Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gin Leu His Ser Cys Phe Gin 395 400 405CTG CTT GAC AAA CCC CCG TTC TTG ACG CAG CTG CAC TCC TGC TTC CAG 1251 Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gin Leu His Ser Cys Phe Gin 395 400 405
ACA GTG GAT CGG CTG TAC TTC GTC ATG GAA TAT GTC AAC GGT GGG GAC 1299 Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp 410 415 420ACA GTG GAT CGG CTG TAC TTC GTC ATG GAA TAT GTC AAC GGT GGG GAC 1299 Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp 410 415 420
CTC ATG TAC CAC ATT CAG CAA GTA GGA AAA TTT AAG GAA CCA CAA GCA 1347 Leu Met Tyr His Ile Gin Gin Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gin Ala 425 430 435 440CTC ATG TAC CAC ATT CAG CAA GTA GGA AAA TTT AAG GAA CCA CAA GCA 1347 Leu Met Tyr His Ile Gin Gin Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gin Ala 425 430 435 440
GTA TTC TAT GCG GCA GAG ATT TCC ATC GGA TTG TTC TTT CTT CAT AAA 1395 Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys 445 450 455GTA TTC TAT GCG GCA GAG ATT TCC ATC GGA TTG TTC TTT CTT CAT AAA 1395 Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys 445 450 455
AGA GGA ATC ATT TAT AGG GAT CTG AAG TTA GAT AAC GTC ATG TTG GAT 1443 Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp 460 465 470AGA GGA ATC ATT TAT AGG GAT CTG AAG TTA GAT AAC GTC ATG TTG GAT 1443 Arg Gly Ile Tyr Island Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp 460 465 470
TCA GAA GGA CAT ATC AAA ATT GCT GAC TTT GGG ATG TGC AAG GAA CAC 1 91 Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His 475 480 485TCA GAA GGA CAT ATC AAA ATT GCT GAC TTT GGG ATG TGC AAG GAA CAC 1 91 Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His 475 480 485
ATG ATG GAT GGA GTC ACG ACC AGG ACC TTC TGT GGG ACT CCA GAT TAT 1539 Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr 490 495 500 ATC GCC CCA GAG ATA ATC GCT TAT CAG CCG TAT GGA AAA TCT GTG GAC I587 Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gin Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp 505 510 515 520ATG ATG GAT GGA GTC ACG ACC AGG ACC TTC TGT GGG ACT CCA GAT TAT 1539 Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr 490 495 500 ATC GCC CCA GAG ATA ATC GCT TAT CAG CCG TAT GGA AAA TCT GTG GAC I587 Ile Ala Pro Glu Ile Ala Tyr Gin Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp 505 510 515 520
TGG TGG GCC TAT GGC GTC CTG TTG TAT GAA ATG CTT GCC GGG CAG CCT 163 Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gin Pro 525 530 535TGG TGG GCC TAT GGC GTC CTG TTG TAT GAA ATG CTT GCC GGG CAG CCT 163 Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gin Pro 525 530 535
CCA TTT GAT GGT GAA GAT GAA GAC GAG CTA TTT CAG TCT ATC ATG GAG 1683 Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gin Ser Ile Met Glu 540 5 550CCA TTT GAT GGT GAA GAT GAA GAC GAG CTA TTT CAG TCT ATC ATG GAG 1683 Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gin Ser Ile Met Glu 540 5 550
CAC AAC GTT TCC TAT CCA AAA TCC TTG TCC AAG GAG GCT GTT TCT ATC 1731 His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile 555 560 565CAC AAC GTT TCC TAT CCA AAA TCC TTG TCC AAG GAG GCT GTT TCT ATC 1731 His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile 555 560 565
TGC AAA GGA CTG ATG ACC AAA CAC CCA GCC AAG CGG CTG GGC TGT GGG 177 Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly 570 575 580TGC AAA GGA CTG ATG ACC AAA CAC CCA GCC AAG CGG CTG GGC TGT GGG 177 Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly 570 575 580
CCT GAG GGG GAG AGG GAC GTG AGA GAG CAT GCC TTC TTC CGG AGG ATC 1827 Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile 585 590 595 600CCT GAG GGG GAG AGG GAC GTG AGA GAG CAT GCC TTC TTC CGG AGG ATC 1827 Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile 585 590 595 600
GAC TGG GAA AAA CTG GAG AAC AGG GAG ATC CAG CCA CCA TTC AAG CCC 187 Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gin Pro Pro Phe Lys Pro 605 610 615GAC TGG GAA AAA CTG GAG AAC AGG GAG ATC CAG CCA CCA TTC AAG CCC 187 Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg Glu Ile Gin Pro Pro Phe Lys Pro 605 610 615
AAA GTG TGT GGC AAA GGA GCA GAG AAC TTT GAC AAG TTC TTC ACA CGA 1923 Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg 620 625 630AAA GTG TGT GGC AAA GGA GCA GAG AAC TTT GAC AAG TTC TTC ACA CGA 1923 Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg 620 625 630
GGA CAG CCC GTC TTA ACA CCA CCT GAT CAG CTG GTT ATT GCT AAC ATA 1971 Gly Gin Pro Val Leu Thr Pro Pro Asp Gin Leu Val Ile Ala Asn Ile 635 640 645GGA CAG CCC GTC TTA ACA CCA CCT GAT CAG CTG GTT ATT GCT AAC ATA 1971 Gly Gin Pro Val Leu Thr Pro Pro Asp Gin Leu Val Ile Ala Asn Ile 635 640 645
GAC CAG TCT GAT TTT GAA GGG TTC TCG TAT GTC AAC CCC CAG TTT GTG 2019 Asp Gin Ser Asp Phe Glu Gly Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gin Phe Val 650 655 660GAC CAG TCT GAT TTT GAA GGG TTC TCG TAT GTC AAC CCC CAG TTT GTG 2019 Asp Gin Ser Asp Phe Glu Gly Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gin Phe Val 650 655 660
CAC CCC ATC TTA CAG AGT GCA GTA TGAAACTCAC CAGCGAGAAC AAACACCTCC 2073 His Pro Ile Leu Gin Ser Ala Val 665 670CAC CCC ATC TTA CAG AGT GCA GTA TGAAACTCAC CAGCGAGAAC AAACACCTCC 2073 His Pro Ile Leu Gin Ser Ala Val 665 670
CCAGCCCCCA GCCCTCCCCG CAGTGGAAGT GAATCCTTAA CCCTAAAATT TTAAGGCCAC 2133 GGCTTGTGTC TGATTCCATA TGGAGGCCTG AAAATTGTAG GGTTATTAGT CCAAATGTGA 2193CCAGCCCCCA GCCCTCCCCG CAGTGGAAGT GAATCCTTAA CCCTAAAATT TTAAGGCCAC 2133 GGCTTGTGTC TGATTCCATA TGGAGGCCTG AAAATTGTAG GGTTATTAGT CCAAATGTGA 2193
TCAACTGTTC AGGGTCTTTC TCTCACAACC AAGAACATTA TCTTAGTGGA AG 2245TCAACTGTTC AGGGTCTTTC TCTCACAACC AAGAACATTA TCTTAGTGGA AG 2245
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 672 acides aminés(A) LENGTH: 672 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine(ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gin Asp ValMet Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gin Asp Val
1 10 151 10 15
Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gin Lys Asn Val HisAla Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gin Lys Asn Val His
20 25 3020 25 30
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gin Pro ThrGlu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gin Pro Thr
35 40 4535 40 45
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gin GlyPhe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gin Gly
50 5 6050 5 60
Phe Gin Cys Gin Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu 65 70 75 80Phe Gin Cys Gin Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu 65 70 75 80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr AspPhe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
85 90 9585 90 95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser ProAsp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
100 105 no100 105 no
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His GinThr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gin
115 120 125115 120 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gin Cys ValGly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gin Cys Val
130 135 140130 135 140
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly 145 150 155 160Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly 145 150 155 160
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val ThrArg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr
165 170 175165 170 175
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu SerVal Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
180 185 190180 185 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu SerAsp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
195 200 205195 200 205
Lys Gin Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gin Trp AsnLys Gin Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gin Trp Asn
210 215 220210 215 220
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu 225 230 235 240 Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe MetGlu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu 225 230 235 240 Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
24 0 25524 0 255
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala SerGly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
260 265 270260 265 270
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gin Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn ValGly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gin Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
275 280 285275 280 285
Pro Ile Pro Glu Gly Gly Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gin LysPro Ile Pro Glu Gly Gly Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gin Lys
290 295 300290 295 300
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro 305 310 315 320Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro 305 310 315 320
Ser Glu Asp Arg Lys Gin Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys LeuSer Glu Asp Arg Lys Gin Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
325 330 335325 330 335
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly LysThr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
340 345 350340 345 350
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile LysVal Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys
355 360 365355 360 365
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gin Asp Asp Asp Val Glu Cys ThrIle Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gin Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
370 375 380370 375 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu 385 390 395 400Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu 385 390 395 400
Thr Gin Leu His Ser Cys Phe Gin Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe ValThr Gin Leu His Ser Cys Phe Gin Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
405 410 415405 410 415
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gin Gin ValMet Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gin Gin Val
420 425 430420 425 430
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gin Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile SerGly Lys Phe Lys Glu Pro Gin Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
435 440 445435 440 445
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp LeuIle Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Tyr Arg Asp Asp Leu
450 455 460450 455 460
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala 465 470 475 480Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala 465 470 475 480
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr ArgAsp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
485 490 495485 490 495
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala TyrThr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ala Tyr
500 505 10500 505 10
Gin Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu LeuGin Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
515 520 525515 520 525
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gin Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu AspTyr Glu Met Leu Ala Gly Gin Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
530 535 540530 535 540
Glu Leu Phe Gin Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser 545 550 555 560Glu Leu Phe Gin Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser 545 550 555 560
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys HisLeu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
565 570 575565,570,575
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val ArgPro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
580 585 590580 585 590
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg 595 600 605 Glu Ile Gin Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala GluGlu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg 595 600 605 Glu Ile Gin Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
610 615 620610 615 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gin Pro Val Leu Thr Pro ProAsn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gin Pro Val Leu Thr Pro Pro
625 630 635 640625 630 635 640
Asp Gin Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gin Ser Asp Phe Glu Gly PheAsp Gin Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gin Ser Asp Phe Glu Gly Phe
645 650 655645 650 655
Ser Tyr Val Asn Pro Gin Phe Val His Pro Ile Leu Gin Ser Ala ValSer Tyr Val Asn Pro Gin Phe Val His Pro Ile Leu Gin Ser Ala Val
660 665 670660 665 670
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases(A) LENGTH: 27 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATTCCGGAAG GGGGCGAGGA AGGAAAC 27ATTCCGGAAG GGGGCGAGGA AGGAAAC 27
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GGAGCAAGAG GTGGTTGG 18 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:GGAGCAAGAG GTGGTTGG 18 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5 -(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5 -
CTTCAGAGGG ACTGATGACT 20CTTCAGAGGG ACTGATGACT 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GCCTCTGCGG AATGGATCAC 20GCCTCTGCGG AATGGATCAC 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: ~':(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: ~ ' :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7':(iii) HYPOTHETICS: YES (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 ' :
CTCCATCCAT CATGTGTTCC 20CTCCATCCAT CATGTGTTCC 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GACCTCATGT ACCACATTCA 20GACCTCATGT ACCACATTCA 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO::
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CTTCCACTAA GATAATGTTC 20CTTCCACTAA GATAATGTTC 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GACCGACGAC TGTCTGTAGA 20GACCGACGAC TGTCTGTAGA 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics)
(iii) HYPOTHETIQUE: OUI(iii) HYPOTHETICS: YES
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CAGGGAGACT TCTGTCCTT 19 CAGGGAGACT TCTGTCCTT 19

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide mutant de la protéine kinase C, caractérisé en ce qu'il présente la séquence d'acides aminés [SEQ ID N*2] et possède la mutation ponctuelle D 294 G par rapport à la PKCα ou en ce qu'il est un variant dudit polypeptide résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou de plusieurs acides aminés, ledit variant présentant la même mutation ponctuelle que ledit polypeptide.1. A protein kinase C mutant polypeptide, characterized in that it has the amino acid sequence [SEQ ID N * 2] and has the point mutation D 294 G with respect to PKCα or in that it is a variant of said polypeptide resulting from the addition, deletion and / or replacement of one or more amino acids, said variant having the same point mutation as said polypeptide.
2. Séquence d'acides nucléiques codant pour le polypeptide selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par : a) la séquence d'ADN [SEQ ID N*l] ; b) les séquences d'ADN hybridant avec la séquence ci-dessus ou un fragment de celle-ci ; c) les séquences d'ADN qui en raison de la dégénérescence du code génétique résultent des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour un polypeptide tel que défini ci-dessus, d) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.2. Nucleic acid sequence coding for the polypeptide according to claim 1, characterized in that it consists of: a) the DNA sequence [SEQ ID N * 1]; b) DNA sequences hybridizing with the above sequence or a fragment thereof; c) the DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code, result from the sequences a) and b) above and encode a polypeptide as defined above, d) the mRNA and cDNA sequences corresponding.
3. Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oligonucleotique qui s'hybride avec la séquence d'ADN selon la revendication 2, les séquences d'ADNc ou d'ARN correspondante.3. Nucleotide probe, characterized in that it consists of an oligonucleotic which hybridizes with the DNA sequence according to claim 2, the corresponding cDNA or RNA sequences.
4. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre le polypeptide selon la revendication 1.4. Antibody characterized in that it is directed against the polypeptide according to claim 1.
5. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter la séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide par les étapes a) d'amplification préalable des séquences d'ADN contenues dans un échantillon biologique susceptible de contenir ledit polypeptide, au moyen d'amorces, b) mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde nucléotidique selon la revendication 3 ; c) détection du complexe d'hybridation qui s'est éventuellement formé. 5. A method of in vitro detection of the polypeptide according to claim 1, for the purpose of diagnosing tumors, characterized in that it consists in detecting the DNA sequence coding for said polypeptide by steps a) of prior amplification of the DNA sequences contained in a biological sample capable of containing said polypeptide, by means of primers, b) bringing the biological sample into contact with a nucleotide probe according to claim 3; c) detection of the hybridization complex which has possibly formed.
6. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter, dans un échantillon biologique susceptible de contenir ledit polypeptide, une séquence d'ARN codant pour ledit polypeptide par hybridation in situ à l'aide d'une sonde nucléotidique selon la revendication 3.6. A method of in vitro detection of the polypeptide according to claim 1, for the purpose of diagnosing tumors, characterized in that it consists in detecting, in a biological sample capable of containing said polypeptide, an RNA sequence coding for said polypeptide by in situ hybridization using a nucleotide probe according to claim 3.
7. Procédé de détection in vitro du polypeptide selon la revendication 1, à des fins de diagnostic des tumeurs, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir ledit polypeptide avec un anticorps selon la revendication 4 et à détecter le complexe immunochimique formé.7. A method of in vitro detection of the polypeptide according to claim 1, for the purpose of diagnosing tumors, characterized in that it consists in bringing a biological sample capable of containing said polypeptide into contact with an antibody according to claim 4 and in detect the immunochemical complex formed.
8. Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN selon la revendication 2.8. Recombinant vector, characterized in that it comprises a DNA sequence according to claim 2.
9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, contenant en outre les moyens nécessaires à son expression.9. Recombinant vector according to claim 8, further containing the means necessary for its expression.
10. Microorganismes ou cellules hôtes transformés ou transfectés par un vecteur recombinant d'ADN selon la revendication 9.10. Microorganisms or host cells transformed or transfected with a recombinant DNA vector according to claim 9.
11. Cellules hôtes selon la revendication 10, caractérisées en ce que lesdites cellules sont des cellules GC ou des cellules hypophysaires hyperplasiées.11. Host cells according to claim 10, characterized in that said cells are GC cells or hyperplastic pituitary cells.
12. Application de la sonde nucléotidique selon la revendication 3 à titre d'oligonucléotide antisens pour l'inhibition de la transcription ou de la traduction de l'ARNm de la PKCα portant la mutation D 294 G soit in vitro, soit in vivo.12. Application of the nucleotide probe according to claim 3 as an antisense oligonucleotide for the inhibition of the transcription or of the translation of the mRNA of PKCα carrying the mutation D 294 G either in vitro or in vivo.
13. Application selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'oligonucléotide antisens est utilisé en combinaison avec une toxine ou tout autre élément permettant de détruire la cellule. 13. Application according to claim 12, characterized in that the antisense oligonucleotide is used in combination with a toxin or any other element making it possible to destroy the cell.
14. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une sonde nucléotidique selon la revendication 3, éventuellement en combinaison avec une toxine ou un autre agent anti-tumoral. 14. Medicament, characterized in that it contains a nucleotide probe according to claim 3, optionally in combination with a toxin or another anti-tumor agent.
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