WO1994026322A1 - Utilisation d'un materiau poreux a base de carbonate de calcium comme support pour un facteur de croissance dans la preparation d'un implant bioresorbable - Google Patents

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Definitions

  • the subject of the invention is the use of a material based on calcium carbonate as a support for a growth factor in the preparation of a bioresorbable implant intended to be placed in a living organism.
  • Such a material can be used in particular as an osteoforming implant. It is known that bone surgery often requires the placement of bone grafts or implants constituting artificial substitutes for such grafts. The production of allografts raises objections, for obvious reasons of public health, taking into account the risks of transmission of certain serious viral diseases or diseases caused by non-conventional transmissible agents or "prions".
  • biocompatible materials such as tricalcium phosphate, hydroxyapatite, plaster, coral, polymers based on poly (lactic acid) and / or poly (acid glycolic), etc.
  • Some of these materials, including calcium carbonate, are bioresorbable and allow the progressive formation of newly formed bone tissue at the expense of the material implanted in the process of resorption; see in particular European patent 0 022 724.
  • a material based on porous calcium carbonate such as coral, can serve as a support for osteoinductive factors, and more generally for growth factors, in the preparation of bioresorbable implants and that the presence collagen is neither necessary nor desirable in the case where the implant is intended to be used as an osteoforming implant.
  • the present invention therefore relates to the use of a porous material based on calcium carbonate as a support for at least one growth factor in the preparation of a bioresorbable implant intended to be placed in a living animal organism, in particular in a vertebrate animal, including humans, said support being free of collagen in the case where said growth factor is an osteoinductive factor.
  • the growth factors are osteoinductive factors
  • the implants can be used as osteoforming implants.
  • these implants may contain, in addition to osteoinductive factors, other growth factors.
  • the implants thus obtained can either be placed as progressively absorbable bone filling pieces for the benefit of a newly formed tissue, or implanted in a non-bone site, for example a connective tissue, where they will give rise to bone tissue which can later be used as bone autograft material.
  • the calcium carbonate support When the calcium carbonate support is loaded with a non-osteoinductive growth factor, it can be used in particular as a support for the in vivo culture of living cells.
  • the implant after placement, can serve in particular as a support for obtaining new tissue at the location of implantation. This newly formed tissue can be used as a replacement for failing organ parts (pancreas-intestine connection, urethra, bladder, pericardium, etc.).
  • the implant of the invention can also be used as an in vivo culture support for genetically modified cells, in particular by insertion of an appropriate gene, in a manner known per se, to remedy a genetic defect.
  • the modified cells can possibly come from an autologous sample.
  • the implants thus obtained constitute an "organoid" serving as a therapeutic treatment device, the installation of which makes it possible to replace a failing organ, and in particular to remedy certain dysfunctions of genetic origin. It is therefore a new mode of implementation of gene therapies.
  • a hollow piece of coral can be produced, provided with an opening which can be closed by a plug, screwed or fitted, also made of coral.
  • ⁇ implantation in humans it can be a hollow cylinder having 2 to 10 cm of the eu 1 to 3 cm in external diameter and 0.5 to 2 cm in internal diameter.
  • the inner wall can be impregnated with collagen loaded with growth factors like TGF beta.
  • the outer wall can be impregnated with a solution of an angiogenic factor (FGF).
  • FGF angiogenic factor
  • the autologous cells (for example fibroblasts) modified are previously cultured in vitro on a solid support such as a network of collagen fibers or coral granules. The culture of modified cells, with its solid support, is introduced into the hollow part of the implant.
  • the implanted cells are organized into vascularized tissue surrounded by connective tissue replacing the coral as it is absorbed.
  • the cells introduced into the implant can be undifferentiated cells whose differentiation is effected by endogenous or exogenous cytokines.
  • the calcium carbonate-based material which can be used as a support for the growth factors is preferably aragonite.
  • One of the advantages of using the coral skeleton is that it contains communicating pores, which promotes neovascularization as well as invasion of the material by bone cells or by other cells previously introduced or recruited. in situ.
  • the porosity that is to say the volume proportion of the pores relative to the total volume of the material, is generally between 20 and 80%, for example between 40 and 60%.
  • Materials of this type can be obtained by using in particular the coral of the genera Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Simphyllia and Millipora.
  • growth factors are polypeptides which act locally on certain cells by influencing their proliferation, their migration and / or their differentiation or which stimulate the production of other growth factors.
  • the growth factors having an osteoinductive effect are known and their effects have been studied in particular in vitro on cultures of various bone cells.
  • DBM Demineralized Bone Matrix
  • BP Bone Protein
  • BMP Bone Morphogenetic Protein
  • Another active protein is osteogenin.
  • growth factors influencing cellular growth in general including bone cell growth
  • IGF Insulin-like Growth Factor
  • PDGF Plateelet-Derived Growth Factor
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • BDGF II or beta-2-microglobulin
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF beta or bTGF
  • the doses of growth factors that can be used are known or can be determined by routine experiments in animal models. Generally, growth factors, whose action is local, are used at doses of a few micrograms or a few tens of micrograms.
  • the invention also relates to the preparation of porous calcium carbonate supports loaded with growth factors. These can be incorporated:
  • binding agent in particular a binding agent capable of forming a gel.
  • binding agents are known. These are, for example, collagen or cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, etc. These products are biocompatible. They are commercially available.
  • a fibrin precursor for example fibrinogen or a biological glue (cryoprecipitate) can also be used as binding agents.
  • the binding agent notably has the effect of promoting the fixation of the growth factor and possibly its gradual release.
  • the binding agent is gradually absorbed as the implant is rehabilitated by a newly formed tissue.
  • Bovine BP having a protein concentration of 1.52 mg / ml is used as the osteoinductive factor.
  • the BP is diluted so as to obtain doses of 10, 35 and 100 micrograms of active principle in a volume of 20 microliters.
  • Each coral disc is impregnated with 20 microliters of one of the solutions obtained. After infiltration of the solution into the pores, the discs are frozen quickly and then subjected to lyophilization.
  • subcutaneous implants are produced in the ventral region in rats.
  • Three groups of five animals which each receive a coral implant impregnated with 10, 35 or 100 micrograms of BP, respectively.
  • the animals are administered, subcutaneously, a dose of
  • the implants are extracts, weighed, photographed and fixed in methanol.
  • the samples are coated in poly (methyl methacrylate) for histological examination.
  • the samples are cut and stained with the Rapid Bone Stain reagent and with Van Gieson micro-fuchsin. The sections are examined under a microscope.
  • the weights of the coral discs before implantation and after explantation are indicated in the following table 1, in which the results are expressed in the form of an average ⁇ standard deviation.
  • group I microscopic examination shows formation of still immature bone and hematopoietic marrow throughout the implant, as well as bone formation on the surface. Bone is formed and conduction by the material allows bone to grow. There is a harmony between osteoinduction and osteoconduction.
  • the mineralization is good throughout the implant, the newly formed bone is mature and lines the coral.
  • the osteoinduction dominates the osteoconduction and the bone is more important around the periphery of the implant.
  • the samples have a thick outer edge of mature bone with hematopoietic marrow in the center. In several cases, cartilage and cartilage in the process of mineralization are observed after a few weeks.
  • EXAMPLE 2 A trepanation is carried out on rats by ablation of a circular flap 8 mm in diameter on the top of the skull. In the window thus obtained, a disk of coral 8 mm in diameter. The coral discs are impregnated, in a manner analogous to that described in the previous example, by the osteoinductive factor (recombinant human BMP-2), at the rate of 0.5 micrograms of BMP-2 per 1 mg of coral. The day of the operation, intramuscular injection of calcein at a rate of 20 mg / kg. On the 27th day, orange xylenol (90 mg / kg) is injected intramuscularly.
  • the osteoinductive factor recombinant human BMP-2
  • part of the skullcap, including the implant is removed and fixed in 10% neutral formalin for histological study after inclusion in methyl methacrylate on non-demineralized sections stained with Giemsa dye. -Paragon. Microradiographs highlight the mineralization.
  • the sections show bone formation from the edges of the bone lesion and extending over the edges of the coral disc
  • Bilateral and symmetrical trepanation of the skull is performed on rabbits at the level of the parietal bones, by removal of two circular flaps 10 mm in diameter. Five batches of rabbits are made up: four test groups and one control group. Only one side of the individuals in each test group is treated.
  • Group 1 (Symbol MF): 50 microliters of methylcellulose gel containing 1 ⁇ g of TGF beta is applied in one of the windows.
  • Group 2 (Symbol BF): 100 ⁇ l of biological glue is applied to one of the windows to which 1 ⁇ g of TGF beta has been added.
  • Group 3 50 microliters of a mixture similar to that applied to the BF group are applied, but also containing 70 mg of Porites coral granules, marketed under the name BIOCORAL 450 by the company INOTEB.
  • Group 4 (Symbol BC): the same mixture is applied as for group 3, but without growth factor.
  • the diameter of the treated side is less than the diameter of the control side.
  • the diameter of the control side is less than the diameters observed in the control group.
  • VTO volume of the bone spans
  • the BCF group has the highest VTO, followed by the BC group.
  • the addition of the growth factor increases the speed of remineralization.
  • a piece of coral (porosity: 50%) is covered with a murine type I collagen gel containing an angiogenic growth factor (bFGF).
  • bFGF angiogenic growth factor
  • the coral pieces thus treated are implanted in a subcutaneous site in mice. Macroscopic and histological observation of the implants is carried out for one year.
  • the coral In a few months, the coral is absorbed. It gives way to a connective tissue of the same size and shape as the implant. After three months, there is a strong vascularization and the absence of any inflammatory cell compared to the coral residues.
  • the connective tissue is made up of sparse mesenchymal cells.
  • the collagen was replaced by carboxymethylcellulose or fibrinogen.
  • a network of collagen fibers containing autologous fibroblasts genetically modified by insertion of a gene using a retro viral vector is introduced.
  • the external wall of the cylinder was impregnated with a type I collagen gel associated with heparin.
  • the coral thus pretreated is incubated in the presence of a factor ar2iogenic growth (bFGF).
  • bFGF factor ar2iogenic growth
  • the implant After 45 days, the implant is removed. The vascularization of the latter is important and includes large caliber vessels. The resorption of the coral is initiated. The modified cells are viable and express the inserted gene. They are organized in vascularized tissue. A similar experiment was carried out on mice deficient in beta-glucuronidase and having a lysosomal overload disease. A human cDNA encoding beta-glucuronidase is inserted into a retroviral vector which is then used to modify mouse (autologous) cells. The modified cells are introduced into a network of collagen fibers and the whole is introduced into a coral cylinder treated in a similar manner to that described above. The implants thus prepared are inserted into the mesentery of the deficient mice.
  • the modified implanted cells are capable of secreting the missing enzyme which passes into the general circulation, thus causing the regression of the physiological consequences of the genetic defect, and in particular the correction of the hepatic and spleen lesions.

Abstract

Utilisation d'un matériau poreux à base de carbonate de calcium comme support pour au moins un facteur de croissance dans la préparation d'un implant biorésorbable destiné à être mis en place dans un organisme animal vivant, en particulier chez un animal vertébré. Avec un facteur de croissance ostéoinducteur, l'implant peut constituer une pièce de comblement osseux, ou peut être implanté dans un tissu conjonctif où il donnera naissance à un tissu osseux utilisable comme autogreffe. Avec un facteur de croissance non ostéoinducteur, l'implant peut servir à cultiver des cellules in vivo. On peut par exemple utiliser un implant creux dans lequel on introduit des cellules autologues modifiées, notamment par insertion d'un gène. Après mise en place, l'implant constitue un organoïde permettant par exemple de remédier à un dysfonctionnement d'origine génétique.

Description

Utilisation d'un matériau poreux à base de carbonate de calcium comme support pour un facteur de croissance dans la préparation d'un implant biorésorbable
L'invention a pour objet l'utilisation d'un matériau à base de carbonate de calcium comme support pour un facteur de croissance dans la préparation d'un implant biorésorbable destiné à être mis en place dans un organisme vivant.
Un tel matériau peut être utilisé notamment comme implant ostéoformateur. On sait que la chirurgie osseuse nécessite souvent la mise en place de greffons osseux ou d'implants constituant des produits de remplacement artificiels de tels greffons. La réalisation d'allogreffes soulève des objections, pour des raisons évidentes de santé publique, compte-tenu des risques de transmission de certaines maladies virales graves ou de maladies provoquées par des agents transmissibles non conventionnels ou "prions".
De ce point de vue, la réalisation d' autogreffes est plus satisfaisante, mais le prélèvement du greffon entraîne des risques de morbidité importants ; voir par exemple Christopher J. Damien et J. Russell Parsons, Journal of Applied Biomaterials, Vol.2, 187-208 (1991).
Pour ces raisons, on a préconisé l'utilisation d'implants à base de matériaux biocompatibles, comme le phosphate tricalcique, l'hydroxyapatite, le plâtre, le corail, les polymères à base de poly(acide lactique) et/ou poly(acide glycolique), etc. Certains de ces matériaux, dont le carbonate de calcium, sont biorésorbables et permettent la formation progressive de tissu osseux néoformé aux dépens du matériau implanté en voie de résorption ; voir notamment le brevet européen 0 022 724.
On sait par ailleurs que la présence de certains facteurs ostéoinducteurs dans les implants favorise la repousse osseuse. Toutefois, les spécialistes estimaient jusqu'à présent qu'il était nécessaire d'ajouter à l'implant du collagène servant de support pour les facteurs ostéoinducteurs ; voir à ce sujet l'article de Damien et Russell Parsons déjà cité ci-dessus et la demande de brevet FR-2.637.502.
On a maintenant découvert qu'un matériau à base de carbonate de calcium poreux, tel que le corail, peut servir de support à des facteurs ostéoinducteurs, et plus généralement à des facteurs de croissance, dans la préparation d'implants biorésorbables et que la présence de collagène n'est ni nécessaire ni souhaitable dans le cas où l'implant est destiné à être utilisé comme implant ostéoformateur..
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un matériau poreux à base de carbonate de calcium comme support pour au moins un facteur de croissance dans la préparation d'un implant biorésorbable destiné à être mis en place dans un organisme animal vivant, en particulier chez un animal vertébré, y compris les humains, ledit support étant exempt de collagène dans le cas où ledit facteur de croissance est un facteur ostéoinducteur. Lorsque les facteurs de croissance sont des facteurs ostéoinducteurs, les implants sont utilisables comme implants ostéoformateurs. Bien entendu, ces implants peuvent contenir, outre les facteurs ostéoinducteurs, d'autres facteurs de croissance. Les implants ainsi obtenus peuvent être soit mis en place comme pièces de comblement osseux progressivement résorbables au profit d'un tissu néoformé, soit implantés dans un site non osseux, par exemple un tissu conjonctif, où ils donneront naissance à un tissu osseux utilisable ultérieurement comme matériau d'autogreffe osseuse.
Lorsque le support de carbonate de calcium est chargé avec un facteur de croissance non ostéoinducteur, il peut être utilisé notamment comme support pour la culture in vivo de cellules vivantes. Selon les cellules et les facteurs de croissance utilisés, l'implant, après mise en place, peut servir notamment de support pour l'obtention d'un tissu néoformé sur le lieu d'implantation. Ce tissu néoformé peut être utilisé comme élément de remplacement de parties d'organe défaillant (raccord pancréas-intestin, urètre, vessie, péricarde, etc). L'implant de l'invention peut également être utilisé comme support de culture in vivo pour des cellules modifiées génétiquement, notamment par insertion d'un gène approprié, de façon connue en soi, pour remédier à un défaut génétique. Les cellules modifiées peuvent éventuellement provenir d'un prélèvement autologue. Les implants ainsi obtenus constituent un "organoïde" servant de dispositif de traitement thérapeutique dont la mise en place permet de suppléer un organe défaillant, et en particulier de remédier à certains dysfonctionnements d'origine génétique. Il s'agit donc d'un nouveau mode de mise en oeuvre des thérapies géniques.
Par exemple, on peut réaliser une pièce creuse en corail, munie d'une ouverture obturable par un bouchon, vissé ou emboîté, réalisé également en corail. Par exemple,
Figure imgf000004_0001
~ l'implantation chez l'homme, il peut s'agir d'un cylindre creux ayant de 2 à 10 cm de l ue 1 à 3 cm de diamètre externe et de 0,5 à 2 cm de diamètre interne. La paroi interne peut être imprégnée d'un collagène chargé de facteurs de croissance comme le TGF bêta. La paroi externe peut être imprégnée avec une solution d'un facteur angiogénique (FGF). Les cellules autologues (par exemple des fibroblastes) modifiées sont préalablement cultivées in vitro sur un support solide comme un réseau de fibres de collagène ou des granules de corail. On introduit dans la partie creuse de l'implant la culture de cellules modifiées, avec son support solide. On obture ensuite à l'aide du bouchon puis on procède à l'implantation, par exemple intra-abdominale. Les cellules implantées s'organisent en un tissu vascularisé entouré d'un tissu conjonctif remplaçant le corail au fur et à mesure de la résorption de celui-ci. Les cellules introduites dans l'implant peuvent être des cellules non différenciées dont la différenciation s'effectue grâce à des cytokines endogènes ou exogènes. Le matériau à base de carbonate de calcium utilisable comme support pour les facteurs de croissance est de préférence de l'aragonite. On peut utiliser en particulier le squelette de corail. L'un des intérêts de l'utilisation du squelette de corail est qu'il contient des pores communiquants, ce qui favorise la néo-vascularisation ainsi que l'envahissement du matériau par les cellules osseuses ou par d'autres cellules introduites préalablement ou recrutées in situ.
De préférence, on utilise comme matériau support un matériau ayant des diamètres de pores compris entre 50 et 500 micromètres, en particulier entre 200 et 400 micromètres. La porosité, c'est-à-dire la proportion volumique des pores par rapport au volume total du matériau, est comprise généralement entre 20 et 80 %, par exemple entre 40 et 60 %.
On peut obtenir des matériaux de ce type en utilisant notamment le corail des genres Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Simphyllia et Millipora.
On sait que les facteurs de croissance sont des polypeptides qui agissent localement sur certaines cellules en influençant leur prolifération, leur migration et/ou leur différenciation ou qui stimulent la production d'autres facteurs de croissance.
De nombreux facteurs de croissance sont connus à l'heure actuelle.
Par exemple, les facteurs de croissance ayant un effet ostéoinducteur sont connus et leurs effets ont été étudiés notamment in vitro sur des cultures de diverses cellules osseuses.
Parmi les facteurs de croissance dont l'activité est spécifique au milieu osseux, on peut citer certaines protéines de l'os déminéralisé, ou DBM (Demineralized Bone Matrix) et en particulier les protéines appelées BP (Bone Protein) ou BMP (Bone Morphogenetic Protein), qui contiennent en fait plusieurs constituants ; chez l'homme, par exemple, on a isolé notamment les constituants appelés ostéonectine et ostéocalcine. Une autre protéine active est l'ostéogénine. Parmi les facteurs de croissance influençant la croissance cellulaires en général, y compris la croissance des cellules osseuses, on peut citer notamment les somatomédines ou IGF (Insulin-like Growth Factor), le PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), le FGF (Fibroblast Growth Factor), le BDGF II (ou bêta-2-microglobuline), les TGF (Transforming Growth Factor), en particulier le TGF bêta (ou bTGF), etc. Les doses de facteurs de croissances utilisables sont connues ou peuvent être déterminées par des expériences de routine sur des modèles animaux. Généralement, on utilise les facteurs de croissance, dont l'action est locale, à des doses de quelques microgrammes ou de quelques dizaines de microgrammes.
L'invention concerne également la préparation des supports de carbonate de calcium poreux chargés de facteurs de croissance. Ces derniers peuvent être incorporés :
- par imprégnation, suivie ou non de séchage, à l'aide d'une solution ou d'un gel contenant le facteur de croissance,
- par dépôt de films par capillarité à l'aide d'une solution du facteur de croissance par liaison avec le carbonate de calcium par l'intermédiaire d'un revêtement à potentiel de surface électronégatif (héparine, sulfate d'héparane, sulfate de dextrane, sulfate de dermatane, sulfate de xylane, etc).
Il est possible de faciliter la fixation et la rétention des facteurs de croissance sur le support de carbonate de calcium en les appliquant sous la forme d'une association avec un agent liant, notamment un agent liant capable de former un gel. De tels agents liants sont connus. Il s'agit par exemple du collagène ou de dérivés de cellulose comme la méthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, etc. Ces produits sont biocompatibles. Ils sont disponibles commercialement. On peut encore utiliser comme agents liants un précurseur de la fibrine, par exemple du fïbrinogène ou une colle biologique (cryoprécipité).
L'agent liant a notamment pour effet de favoriser la fixation du facteur de croissance et éventuellement son relargage progressif.
Généralement, l'agent liant est progressivement résorbé au fur et à mesure de la réhabitation de l'implant par un tissu néoformé.
On a cependant constaté que, dans le cas d'un implant ostéoformateur, la présence de collagène comme agent liant ne favorise pas la création d'un nouveau tissu osseux, mais aurait au contraire tendance à la retarder.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1 :
On utilise comme matériau de départ des disques de corail ayant un diamètre de 6 mm et une épaisseur de 2 mm (origine : INOTEB).
On utilise comme facteur ostéoinducteur une BP bovine ayant une concentration en protéines de 1,52 mg/ml.
On dilue la BP de façon à obtenir des doses de 10, 35 et 100 microgrammes de principe actif sous un volume de 20 microlitres. On imprègne chaque disque de corail avec 20 microlitres de l'une des solutions obtenues. Après infiltration de la solution dans les pores, les disques sont congelés rapidement puis soumis à une lyophilisation.
Avec les disques ainsi traités, on réalise des implants sous-cutanés dans la région ventrale chez des rats. On utilise trois groupes de cinq animaux qui reçoivent chacun un implant de corail imprégné de 10, 35 ou 100 microgrammes de BP, respectivement. Au bout de 27 jours, on administre aux animaux, par voie sous-cutanée, une dose de
20 mg/kg d'un agent marqueur constitué de calcéine. Le vingt-huitième jour, les implants sont extraits, pesés, photographiés et fixés dans le méthanol. Les échantillons sont enrobés dans du poly(méthacrylate de méthyle) en vue de l'examen histologique. Les échantillons sont coupés et colorés avec le réactif Rapid Bone Stain et avec de la picro-fuchsine Van Gieson. Les coupes sont examinées au microscope.
Les poids des disques de corail avant implantation et après explantation sont indiqués dans le tableau 1 suivant, dans lequel les résultats sont exprimés sous la forme d'une moyenne ± écart-type.
TABLEAU 1
Poids des disq Lies (mg)
Groupe Gain de poids avant après implantation explantation
I 86,0±11,2 97,2±13,0 11,2+6,0
II 84,4±4,1 114,2±14,2 29,8±12,1
III 83,2±9,5 128±12,2 45,4±10,1
Dans le groupe I, l'examen au microscope montre une formation d'os encore immature et de moelle hematopoïetique à travers tout l'implant, ainsi que la formation d'os en surface. L'os se forme et la conduction par le matériau permet la croissance de l'os. Il y a une harmonie entre l'ostéoinduction et l'ostéoconduction.
Dans le groupe II, la minéralisation est bonne dans l'ensemble de l'implant, l'os néoformé est mature et tapisse le corail. L'ostéoinduction domine l'ostéoconduction et l'os est plus important sur le pourtour de l'implant. Dans le groupe III, les échantillons ont un bord externe épais d'os mature avec de la moelle hematopoïetique au centre. Dans plusieurs cas, du cartilage et du cartilage en voie de minéralisation sont observés au bout de quelques semaines.
EXEMPLE 2 : On procède sur des rats à une trépanation par ablation d'un volet circulaire de 8 mm de diamètre sur le dessus du crâne. On applique dans la fenêtre ainsi obtenue un disque de corail ayant de 8 mm de diamètre. Les disques de corail sont imprégnés, de façon analogue à celle décrite à l'exemple précédent, par le facteur ostéoinducteur (BMP-2 humaine recombinante), à raison de 0,5 microgramme de BMP-2 pour 1 mg de corail. Le jour de l'opération, on injecte par voie intramusculaire de la calcéine à raison de 20 mg/kg. Au vingt-septième jour, on injecte par voie intramusculaire du xylènol orange (90 mg/kg).
Ces colorants donnent une fluorescence jaune et orange délimitant les formations osseuses.
Au vingt-huitième jour, on prélève une partie de la calotte crânienne, incluant l'implant, et on la fixe dans le formol neutre à 10 % pour étude histologique après inclusion dans le méthacrylate de méthyle sur coupes non déminéralisées colorées avec le colorant Giemsa-Paragon. Des microradiographies mettent en évidence la minéralisation.
Les coupes montrent une formation osseuse à partir des berges de la lésion osseuse et s'étendant sur les bords du disque de corail
Dans le cas du corail imprégné de BMP-2, de l'os est présent sur l'ensemble du disque. La résorption du corail est plus rapide qu'en absence de BMP-2.
EXEMPLE 3 :
On procède sur des lapins à une trépanation bilatérale et symétrique du crâne au niveau des os pariétaux, par ablation de deux volets circulaires de 10 mm de diamètre. On constitue cinq lots de lapins : quatre groupes de test et un groupe témoin. Sur les individus de chaque groupe de test, un seul côté est traité.
Groupe 1 (Symbole MF) : on applique dans l'une des fenêtres 50 microlitres de gel de méthylcellulose contenant 1 μg de TGF bêta.
Groupe 2 (Symbole BF) : on applique dans l'une des fenêtres 100 μl de colle biologique à laquelle on a ajouté 1 μg de TGF bêta.
Groupe 3 (Symbole BCF) : on applique 50 microlitres d'un mélange analogue à celui appliqué au groupe BF, mais contenant en outre 70 mg de granulés de corail Porites, commercialisés sous la dénomination BIOCORAL 450 par la Société INOTEB.
Groupe 4 (Symbole BC) : on applique le même mélange que pour le groupe 3, mais sans facteur de croissance.
On suit l'évolution de la construction osseuse par tomodensitométrie crânienne. Les diamètres et surface des trépanations sont mesurées sur un analyseur d'images. Après le sacrifice des animaux étudiés, au bout d'un mois, la calotte crânienne est prélevée puis préparée avec un microtome pour l'analyse histologique par histomorphométrie et microscopie en fluorescence. Pour marquer les surfaces d'ostéoformation, on a injecté 2 ml d'oxytétraquinol aux dixième et troisième jours précédant le sacrifice. On a fait les observations suivantes :
Au bout de 30 jours, les groupes BC et BCF ont complètement recouvert la cicatrice par un tissu ostéoïde.
Pour les autres groupes, le recouvrement n'est pas complet. Le diamètre du côté traité est inférieur au diamètre du côté témoin. Le diamètre du côté témoin est inférieur aux diamètres observés dans le groupe témoin.
Le volume des travées osseuses (VTO) a été déterminé par histomorphométrie.
Le groupe BCF a le VTO le plus élevé, suivi par le groupe BC.
L'étude des animaux des groupes traités avec du corail montre que les granulés sont résorbés progressivement. Le corail a permis la création rapide de travées osseuses entre ces granulés.
D'une façon générale, l'adjonction du facteur de croissance élève la vitesse de reminéralisation.
EXEMPLE 4 :
On recouvre une pièce de corail (porosité : 50 %) avec un gel de collagène murin de type I contenant un facteur de croissance angiogénique (bFGF).
En utilisant un bFGF marqué à l'iode radioactif, on a pu montrer, par des essais de relargage, que la liaison du bFGF avec le support de corail est très forte. Cette liaison est encore augmentée en présence d'héparanes ou d'héparines.
Les pièces de corail ainsi traitées sont implantées en site sous-cutané chez des souris. On procède durant un an à l'observation macroscopique et histologique des implants.
En quelques mois, le corail est résorbé. Il laisse place à un tissu conjonctif de même taille et de de même forme que l'implant. Au bout de trois mois, on observe une forte vascularisation et l'absence de toute cellule inflammatoire en regard des résidus de corail. Le tissu conjonctif est formé de cellules mésenchymateuses peu denses.
Dans d'autres expériences, on a remplacé le collagène par de la carboxyméthylcellulose ou du fibrinogène.
EXEMPLE 5 :
On réalise un cylindre creux en corail.
Dans la partie creuse, on introduit un réseau de fibres de collagène contenant des fibroblastes autologues génétiquement modifiés par insertion d'un gène à l'aide d'un vecteur rétro viral. Préalablement, on a imprégné la paroi externe du cylindre avec un gel de collagène de type I associé à de l'héparine. Le corail ainsi prétraité est incubé en présence d'un facteur de croissance ar2iogénique (bFGF). Finalement, le cylindre est obturé à l'aide d'un bouchon de corail, puis on effectue une implantation intrapéritonéale, chez un chien de 25 kg.
Au bout de 45 jours, on retire l'implant. La vascularisation de ce dernier est importante et comporte des vaisseaux de gros calibre. La résorption du corail est initiée. Les cellules modifiées sont viables et expriment le gène inséré. Elles sont organisées en un tissu vascularisé. On a réalisé une expérience analogue sur des souris déficitaires en beta-glucuronidase et présentant une maladie de surcharge lysosomale. Un cDNA humain codant pour la beta-glucuronidase est inséré dans un vecteur rétroviral que l'on utilise ensuite pour modifier des cellules (autologues) de souris. Les cellules modifiées sont introduites dans un réseau de fibres de collagène et l'ensemble est introduit dans un cylindre de corail traité de façon analogue à celle décrite ci-dessus. Les implants ainsi préparés sont insérés dans le mésentère des souris déficientes.
Les cellules modifiées implantées sont capables de sécréter l'enzyme manquante qui passe dans la circulation générale, entraînant ainsi la régression des conséquences physiologiques du défaut génétique, et notamment la correction des lésions hépatiques et spléniques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un matériau poreux à base de carbonate de calcium comme support pour au moins un facteur de croissance dans la préparation d'un implant biorésorbable destiné à être mis en place dans un organisme animal vivant, en particulier chez un animal vertébré, ledit support étant exempt de collagène dans le cas où ledit facteur de croissance est un facteur ostéoinducteur.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit carbonate de calcium est sous forme d'aragonite, et en particulier de squelette de corail.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que ledit facteur de croissance est un facteur ostéoinducteur.
4. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que ledit implant est destiné à être mis en place comme pièce de comblement osseux.
5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée par le fait que ledit implant est destiné à être mis en place dans un site non osseux.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que ledit facteur de croissance est un facteur non ostéoinducteur.
7. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que ledit implant est destiné à la culture de cellules in vivo.
8. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que lesdites cellules sont des cellules modifiées génétiquement, en particulier des cellules autologues.
9. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que lesdites cellules sont modifiées par insertion d'un gène destiné à remédier à un défaut génétique.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée par le fait que ledit implant se présente sous la forme d'une pièce creuse munie d'une ouverture obturable par un bouchon.
11. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'au moins un facteur de croissance est déposé par imprégnation sur la paroi interne de ladite pièce creuse.
12. Utilisation selon la revendication 10 ou 11, caractérisée par le fait que l'on introduit dans la partie creuse de l'implant une culture de cellules à cultiver, puis on obture ladite partie creuse à l'aide du bouchon avant de procéder à l'implantation.
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