WO1992014836A1

WO1992014836A1 - Capteur de mesure de la quantite d'un composant en solution

Info

Publication number: WO1992014836A1
Application number: PCT/CH1992/000034
Authority: WO
Inventors: Michael GRÄTZEL; David Fraser; Shaik Mohammed Zakeeruddin; Jean-Paul Randin; Erik Jan Frenkel
Original assignee: Asulab S.A.
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1992-02-19
Publication date: 1992-09-03
Also published as: EP0526602B1; BG96988A; HU212451B; JP2770250B2; FR2673289B1; FI924726A0; ATE147107T1; SK316592A3; DE69216319T2; FI924726A; JPH05506102A; CA2080840A1; AU1221992A; AU656360B2; US5378628A; EP0526602A1; CA2080840C; HUT66200A; DE69216319D1; PL169972B1

Abstract

La présente invention concerne un capteur de mesure de la quantité d'un composant en solution. Le but de l'invention est de perfectionner les capteurs ampérométriques existants. Ce but est atteint à l'aide d'un capteur muni d'une électrode de mesure (20) comprenant au moins un collecteur de courant (37), relié électriquement à l'un des contacts électriques (34) et recouvert d'un mélange (38) comprenant au moins une enzyme d'oxydo-réduction spécifique dudit composant et au moins un médiateur transférant les électrons entre ladite enzyme et ledit collecteur de courant, caractérisé en ce que le médiateur est choisi parmi les complexes d'un métal de transition avec au moins un ligand bipyridine, terpyridine ou phénanthroline substitué par au moins un groupe donneur d'électrons. Ce capteur s'applique plus particulièrement à la détection du glucose.

Description

CAPTEUR DE MESURE DE LA QUANTITE D'UN COMPOSANT EN SOLUTION

La présente invention concerne un capteur de mesure de la

* quantité d'un composant en solution, destiné à être utilisé dans un i dispositif de mesure ampérométrique de la concentration dudit compo¬ sant dans la solution. Ce capteur permet notamment de doser le glucose.

De nombreux malades atteints de diabète, doivent mesurer fré¬ quemment leur taux de glucose sanguin ou glycémie. S'ils détectent un état d'hyperglycémie, ils doivent immédiatement prendre des médicaments régulant leur taux de glucose. Afin de faciliter la vie courante de ces malades, de nombreux dispositifs de mesure du glucose miniaturisés et utilisables par un néophyte, sont apparus sur le marché.

Par ailleurs, on envisage de réaliser des implantations de pompes â insuline chez les diabétiques. Ces pompes à insuline doivent être munies de dispositifs de mesure du glucose également i plantables et qui, en fonction de la glycémie mesurée, donnent une information â la pompe pour la mise en marche éventuelle de celle- ci.

La plupart de ces dispositifs de mesure de la glycémie utilisent une enzyme spécifique du glucose, la glucose oxydase (GOD).

Comme illustrée à la figure 1 annexée, la GOD est une flavopro- téine, (obtenue par exemple à partir de moisissures) qui catalyse l'oxydation du glucose, ici par exemple le glucose sanguin, en gluconolactone, avec formation de peroxyde d'hydrogène FLO » à partir de l'oxygène moléculaire O présent dans la solution à tester, ici dans le sang.

Cette enzyme (la GOD) et l'oxygène, ont donc été fréquemment utilisés dans des dispositifs de mesure du glucose dans lesquels l'oxydation du glucose était détectée par un transducteur électrique ou optique.

De même, cette enzyme (la GOD) et l'oxygène ont souvent été utilisés dans des dispositifs dits ampérométriques et leur emploi est décrit dans la littérature.

Ces dispositifs dits "ampérométriques" comprennent d'une part, un appareil de mesure muni d'au moins deux contacts électriques reliés à un ampèremètre et â des moyens d'affichage et d'autre part, un capteur éventuellement jetable, pouvant être relié â ces deux contacts électriques. Ce capteur comprend au moins deux électrodes, Tune de référence et l'autre de mesure. L'électrode de mesure comprend un conducteur métallique recouvert d'une enzyme spécifique du produit que Ton cherche à détecter.

La figure 2 annexée illustre les réactions chimiques survenant au niveau de cette électrode de mesure. Lorsque Ton dépose la solution à tester sur l'électrode de mesure, le produit â tester (ici le glucose) réagit avec l'enzyme (ici la GOD oxydée) se trou¬ vant sur l'électrode, pour former du gluconolactone, tandis que la GOD passe à l'état réduit (60D(H₂)# _ed%). Cette GOD réduite réagit alors avec Toxygëne 0₂ qui passe à l'état réduit H **_> et qui transfère alors deux électrons e^" vers le conducteur électrique C dont le potentiel est fixe et se situe aux alentours de 650 mV. Le fait que Ton soit obliger de travailler à des potentiels élevés entraîne des problêmes supplémentaires d'interférences. L'oxygène a donc un rôle de médiateur, puisqu'il permet le transfert d'élec¬ trons. Ce transfert d'électrons, proportionnel à la quantité de glucose présente dans la solution à tester, est alors mesuré par l'ampèremètre et la quantité du glucose présente dans la solution est affichée par les moyens d'affichage de l'appareil de mesure.

Des recherches complémentaires ont montré que des dispositifs ampérométriques utilisant des médiateurs non physiologiques, organi¬ ques, inorganiques ou organomëtalliques pouvaient supplanter les dispositifs utilisant Toxygène comme médiateur. En effet, comme on peut le constater sur la figure 2, les dispositifs utilisant Toxy¬ gène comme médiateur ne peuvent pas être utilisés dans des solutions où la concentration stoechiomêtrique en oxygène est inférieure à la concentration du composant que Ton désire mesurer. Car sinon, dans ce cas, tandis que la totalité du composant à mesurer a la possibi¬ lité de réagir avec Tenzyme oxydée pour former Tenzyme réduite, seule une partie de la quantité totale d'enzyme réduite peut réagir avec Toxygëne présent, proportionnellement à cette quantité d'oxy¬ gène. Le reste de Tenzyme réduite ne peut pas réagir et la quantité d'électrons transmise au conducteur C est inférieure à ce qu'elle devrait être. En conséquence, lorsqu'on utilise ce type de dispositif, on est soit limité par les concentrations respectives de l'oxygène et du composant à mesurer, soit obligé d'utiliser une membrane pour limiter la diffusion dudit composant. Ceci explique pourquoi on a cherché à réaliser des dispositifs ampérométriques utilisant un médiateur particulier, remplaçant l'oxygène.

De très nombreux médiateurs ont été cités dans la littérature, tels que les ferrocènes monomères (Cass , A.E.G. et ses collabora¬ teurs (1984), Anal. Chem. 56, 667-671; Degani, Y. et Heller, A. (1987), J. Phys. Chem. 91, 1285-1289), les ferrocènes greffés sur un polymère (Foulds, N.C. et Lowe, C.R. (1988) Anal. Chem. 60, 2473-2478), les sels conducteurs de transfert de charge (Albery, W.J. Bartlett, P.N. et Craston, D.H. (1985) J. Electroanal. Chem. Interfacial. Electrochem. 194, 223-235), les nickels cycla es (Taniguchi, I., Matsushita, K., Oka oto, M., Col1in, J-P et Sauvage, J-P (1990) J. Electroanal. Chem. Interfacial. Electrochem. 280, 221-226) et des composés organiques tels que les quinones et les benzoquinones (Kulys, J.J., et Cënas, N.K. (1983) Biochi . Biophys. Acta 744, 57). Du fait des travaux importants de Hill et ses colla¬ borateurs, par exemple Frew. J.E., et Hill, H.A.O. (1987) (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B316, 95-106)), la famille des composés du ferrocène a été largement instituée et utilisée comme médiateur pour la GOD et d'autres flavoprotéines. En conséquence, on connait un capteur actuellement commercialisé utilisant comme médiateur, un membre de la famille des composés du ferrocène.

Malheureusement, les médiateurs existant actuellement ont rarement les propriétés idéales requises, à savoir, un potentiel électrochimique adapté à Tenzyme choisie, une solubilité adéquate, une bonne stabilité chimique à la lumière, à la température et au pH et une interaction rapide avec Tenzyme choisie.

De plus, l'oxygène présent éventuellement dans les solutions à tester entre en compétition avec certains médiateurs selon le schéma de la figure 3 annexée. En effet, tandis que le médiateur Méd présent sur le conducteur C continue de réagir avec certaines molécules de GOD réduite, il est possible qu'une certaine quantité de l'oxygène 0₂ éventuellement présent réagisse également avec d'autres molécules de GOD réduite en formant du H₂0₂, comme vu précédemment à la figure 2. Lorsque Ton effectue des mesures avec un faible potentiel entre l'électrode de mesure et Télectrode de référence, le H₂0₂ piège les électrons provenant de la réaction entre la GOD et Toxygëne et ces électrons ne passent plus vers Télectrode. Comme la quantité d'oxygène en solution peut varier, la quantité d'électrons piégés varie également. En conséquence, il n'existe alors plus de proportionnalité entre la quantité d'élec¬ trons passant vers Télectrode et la quantité de glucose se trouvant dans la solution à tester. Dans ces conditions, ces capteurs ne donnent donc pas de résultats fiables.

L'invention a pour objet de remédier aux inconvénients précé¬ demment cités.

A cet effet, Tinvention concerne un capteur de mesure de la quantité d'un composant en solution, comprenant : au moins une électrode de mesure et une électrode de réfé¬ rence, isolées électriquement Tune de l'autre et destinées à venir en contact avec ladite solution, lesdites électrodes comprenant respectivement des contacts électriques adaptés pour être branchés sur un dispositif d'exploitation du signal fourni par ledit capteur, Télectrode de mesure comprenant au moins un collecteur de courant, relié électriquement à l'un desdits contacts électriques et recouvert d'un mélange comprenant au moins une enzyme d'oxydo-réduc- tion spécifique dudit composant et au moins un médiateur transférant les électrons entre ladite enzyme et ledit collecteur de courant.

Selon les caractéristiques de l'invention, le médiateur est choisi parmi les complexes d'un métal de transition avec au moins un ligand bipyridine, terpyridine ou phénanthroline, substitué par au moins un groupe donneur d'électrons.

Grâce aux caractéristiques du capteur selon l'invention et notamment grâce aux nouveaux médiateurs utilisés, on obtient une famille de capteurs présentant une large gamme de faibles potentiels d'oxydo-réduction, restant stables à Tair et fournissant une réponse plus rapide que les autres capteurs de Tart antérieur.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante des modes préférentiels de réalisation de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, cette description étant faite en liaison avec les dessins joints dans lesquels : la figure 1 illustre la dégradation du glucose en présence de glucose oxydase GOD, les figures 2 et 3 sont des schémas illustrant les diverses réactions chimiques survenant au niveau des capteurs, la figure 4 est une vue de dessus d'un appareil de mesure muni d'un capteur selon l'invention, la figure 5 représente les courbes de voltamétrie cyclique du complexe tris (4,4' - diméthoxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium en l'absence de GOD et de glucose, â différentes vitesses de balayage, la figure 6 représente sensiblement les mêmes courbes que la figure 5, mais en présence de GOD et de glucose, la figure 7 représente trois courbes illustrant la variation de la densité de courant obtenue après 30 secondes (D_3Q) en fonction de la concentration en glucose dans une solution physiologique, pour des mesures effectuées avec trois types de capteurs selon l'inven¬ tion, dans lesquels la quantité de poudre de carbone varie, la figure 8 représente la pente et l'ordonnée à l'origine des courbes de la figure 7, en fonction de la quantité de poudre de carbone, la figure 9 représente trois courbes illustrant la variation de la densité de courant obtenue après 30 secondes (D₃₀) en fonction de la concentration en glucose dans une solution physiologique, pour des mesures effectuées avec trois types de capteurs selon l'inven¬ tion, dans lesquels la quantité de glucose oxydase varie, la figure 10 représente la pente et l'ordonnée à l'origine des courbes de la figure 9, en fonction de la quantité de glucose oxydase, la figure 11 représente trois courbes illustrant la varia¬ tion de la densité de courant obtenue après 30 secondes (D,Q) en fonction de la concentration en glucose dans une solution physiologique, pour des mesures effectuées avec trois types de capteurs selon l'invention, dans lesquels la quantité de médiateur varie, la figure 12 représente la pente et l'ordonnée à l'origine des courbes de la figure 11, en fonction de la quantité de média¬ teur, la figure 13 représente des mesures de la densité de courant obtenue en fonction de la concentration en glucose, ces mesures étant effectuées dans le sang et dans un tampon phosphate avec des capteurs de glucose munis respectivement d'un des deux médiateurs préférés selon l'invention, la figure 14 représente des mesures de la densité de courant obtenue en fonction de la concentration en glucose, ces mesures étant effectuées avec des capteurs selon l'invention dans des échantillons de sang présentant des hé atocrites différents, les figures 15 et 16 représentent des mesures de la densité de courant obtenue en fonction de la concentration en glucose, ces mesures étant effectuées avec des capteurs selon l'invention dans des échantillons de solution physiologique présentant respectivement diverses concentrations d'acëtaminophênol et d'acide ascorbique.

Comme illustré en figure 4, l'appareil de mesure 2 de la quantité d'un composant donné dans une solution, comprend un capteur 6 selon l'invention et un dispositif d'exploitation 4 du signal fourni par ledit capteur. Ce dispositif 4 est connu en soi et présente la forme générale d'un stylo. Il est bien évident que cette forme n'est pas limitative de l'invention.

Ce stylo 4 comprend à l 'une de ses extrémités référencée 8, une cavité 10 dans laquelle sont logés deux premiers contacts électri¬ ques 12, 14 connectés électriquement à un ampèremètre (non représen¬ té). Cet ampèremètre est lui-même relié à un affichage 16 indiquant la concentration du composant recherché dans une solution donnée. Cette concentration est affichée, par exemple en mg/dl ou en mmol/1. Le stylo 4 comprend en outre un bouchon 18 qui vient coiffer son ex¬ trémité 8 et protéger les contacts 12, 14, lorsque ledit stylo n'est pas util sé.

Le capteur 6 selon l'invention a par exemple la forme d'une lamelle rectangulaire isolante que Ton peut introduire par Tune de ses extrémités référencée 19 dans la cavité 10 du stylo 4. On notera que ce capteur 6 est à usage unique.

Il comprend une électrode de mesure 20 et une électrode de référence 22 disposées, par exemple parallèlement longitudinalement sur le capteur 6. L'électrode de référence 22 comprend une bande 24 réalisée en matière électriquement conductrice. Cette bande 24 présente trois zones, une zone 26 dite de contact électrique, prévue vers l'extrémité 19 dudit capteur, une zone centrale 28 dite "piste conductrice" et une zone 30, prévue à l'autre extrémité du capteur et dite "collecteur de courant". De façon assez similaire, l'élec¬ trode de mesure 20 comprend une bande 32 réalisée en matière élec¬ triquement conductrice. Cette bande 32 comprend également trois zones, un contact électrique 34, une piste conductrice 36 et un collecteur de courant 37, recouvert contrairement au collecteur 30, d'un mélange 38.

Sur la figure 4, ce collecteur 37 n'est pas vraiment visible puisqu'il est caché par le mélange 38. On notera que dans chacune de ces électrodes, le collecteur et le conducteur de courant pourraient être en deux parties reliés électriquement entre elles et ne néces¬ sitent pas obligatoirement d'être sous forme d'une bande unique 24 ou 32. Le mélange 38 comprend au moins une enzyme d'oxydo-réduction spécifique du composant à mesurer et au moins un médiateur transfé¬ rant les électrons entre ladite enzyme et le collecteur de courant formé dans la bande 32.

De façon optionnelle, le mélange 38 précité peut également comprendre au moins une matière conductrice active et/ou au moins un additif qui sera décrit ultérieurement. Dans le cas oD le mélange 38 comprend une matière conductrice active, le médiateur transfère les électrons entre Tenzyme et cette matière conductrice active qui à son tour, transfère les électrons vers le collecteur de courant.

La goutte 40 de l'échantillon de solution à tester, est déposée à cheval sur les deux électrodes 20 et 22 comme illustré en figure 4. Ainsi, le circuit électrique constitué par l'ampèremètre, les contacts 14 et 26, la piste conductrice 28, le collecteur 30, la goutte de solution 40, le mélange 38, le collecteur 37, la piste conductrice 36 et les contacts 34 et 12, est fermé.

L'appareil de mesure 2 qui vient d'être décrit est destiné à la réalisation de mesures in vitro, toutefois il est bien évident que le capteur 6 pourrait être utilisé in vivo, dans des appareils de mesure implantables. Dans ce cas, sa forme ou ses dimensions seraient adaptées â cette nouvelle application. Par ailleurs, pour obtenir une précision accrue, on pourrait ajouter une deuxième électrode de mesure, identique à Télectrode de mesure 20 mais sans Tenzyme ou avec Tenzyme dénaturée.

La goutte 40 de solution â tester peut être de nature biologi¬ que, par exemple, du sang ou de Turine d'un être humain ou d'un animal, ou un milieu de fermentation de micro-organismes. Elle peut éventuellement être d'origine synthétique, par exemple un tampon synthétique contenant des éléments à analyser.

On util se comme enzyme d'oxydo-réduction, une enzyme spécifique du composant que Ton souhaite mesurer. De préférence selon l'inven¬ tion, on utilise une enzyme choisie parmi les oxydases et les flavoprotëines. Lorsque Ton souhaite réaliser un capteur de gluco¬ se, on utilise la glucose oxydase GOD, par exemple une GOD présen¬ tant une activité d'environ 250 UI, obtenue à partir d'une moisis¬ sure d'Aspergillus niger.

La matière conductrice active utilisée de façon optionnelle, se présente de préférence sous forme d'une poudre de carbone, de graphite, d'or, de platine, de palladium ou d'oxyde de métal conduc¬ teur, par exemple d'oxyde de ruthénium ou sous forme d'un film de polymère conducteur, par exemple le polypyrrole. On utilisera de préférence une poudre de carbone.

Comme on Ta vu précédemment, on peut également ajouter un additif formant un réseau d'immobilisation de Tenzyme, du médiateur et/ou de la matière conductrice active sur la surface du collecteur 37 de Télectrode de mesure 20. Cet additif est par exemple, la sérumalbumine bovine (BSA), le glutaraldëhyde, le carbodiimide ou des polymères solubles dans Teau.

Les bandes de matière électriquement conductrices 24, 32 sont réalisées par exemple, sous forme d'une couche d'un matériau choisi parmi Tor, l'argent, le platine, le palladium, le carbone, le graphite ou un oxyde de métal conducteur, tel qu'un oxyde de ruthé¬ nium, par exemple. De préférence, la bande 24 correspondant à Télectrode de référence 22 est réalisée en argent et la bande 32 correspondant à Télectrode de mesure 20 est réalisée en platine. Plus précisément, la partie de la bande 24 correspondant au collec¬ teur de courant 30 est partiellement chlorurée. On a découvert qu'une nouvelle famille de complexes d'un métal de transition avec au moins un ligand bipyridine, terpyridine ou phénanthroline substitué par au moins un groupe donneur d'électrons, présentait de bonnes propriétés de médiateur.

De préférence, le groupe donneur d'électrons est un groupe OH, un groupe alkoxy, un groupe aryloxy ou un groupe aminé primaire, secondaire ou tertiaire.

Dans le cas d'un capteur de glucose et lorsqu'on utilise comme enzyme la glucose oxydase (GOD), on choisit de préférence parmi les médiateurs précités, le complexe tris (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium ou le complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium.

Dans le cas d'un capteur de glucose, le mélange 38 déposé sur le collecteur de Télectrode de mesure 20 comprend pour 1 ml de tampon phosphate 10 mM ajusté à pH 6,8 : 1 à 1000 g de poudre de carbone, de préférence 1 à 100 mg ou mieux 10 mg environ; 1 à 2000 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone, de préférence 10 à 300

UI ou mieux 100 UI et 1 à 10000 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone, de préférence 10 à 300 μmol ou mieux 50 μmol. Ce mélange

2 est déposé â raison de 10 à 300 μl/cm de surface active, de préfé-

2 2 rence 30 à 150 μl/cm ou mieux 70 μl/cm .

Dans le capteur fini, séché, on peut donc considérer que le mélange 38 comprend 1 â 2000 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone, de préférence 10 à 3000 UI ou mieux 100 UI et 1 à 10000 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone, de préférence 10 à 300 μmol ou mieux 50 μmol .

Le capteur selon l'invention, muni des médiateurs précités, présente un certain nombre de propriétés variant en fonction des ligands utilisés et des substitutions réalisées sur ces ligands.

Plusieurs expériences ont été réalisées qui prouvent les perfor¬ mances et l'efficacité de ces nouveaux médiateurs et qui donnent les conditions d'optimalisation des divers éléments constituant Télec¬ trode de mesure. Ces expériences sont décrites ci-après. Expérience 1 :

Mesures de différents médiateurs par voltamétrie cyclique.

a) mesures effectuées avec le complexe tris (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium.

Le complexe précité a été testé par voltamétrie cyclique en courant continu, afin de déterminer d'une part son potentiel normal d'oxydo-réduction E° et d'autre part la constante de vitesse k. Cette constante k correspond à la réaction de transfert d'électrons, â partir de la GOD, vers le médiateur. La voltamétrie cyclique consiste à disposer dans la solution à analyser, une électrode de travail, une contre-électrode et une électrode de référence, puis à effectuer un balayage, â vitesse constante et entre deux bornes, du potentiel de Télectrode de travail et à mesurer l'intensité du courant obtenu. Les courbes des figures 5 et 6 représentent les résultats obtenus par cette méthode. Ces expériences ont été réali¬ sées avec une électrode de travail en carbone vitreux, une électrode de référence au calomel, une contre-électrode en platine et une cellule électrochimique de 5 à 20 ml . Les mesures ont été réalisées dans un tampon phosphate PBS (NaCl lOOmM, NaH₂P0. lOmM, ajusté à pH 7,4; EDTA (acide éthylène tétraacétique) 0,lmM; PMSF (fluorure de phënylméthylsulfonate) 0,01mM et avec une concentration du complexe

-4 précité de 5.10 M. On a utilisé différentes vitesses de balayage du potentiel :5, 10, 25, 50 et 100 mV.s^" . On obtient les courbes de la figure 5 et une valeur de E° de 225 mV. L'addition d'une solution saturée de glucose n'a aucun effet sur les courbes de la figure 5, ce qui est normal puisqu'il n'y a pas la glucose oxydase (GOD).

En revanche, l'addition de GOD (en quantité supérieure à 5.10^" M de préférence 4.10^" M) permet d'obtenir les courbes de la figure 6, présentant une forme dite "vague catalytique" caractéris¬ tique. Dans cette figure 6, on a utilisé comme vitesse de balayage du potentiel : 10, 25, 50 et 100 mV.s^"1. On obtient une première réaction : k Médiateur_(oχydé) + G0D_(réduite) - Mediateur_{(réduit) +} G0D_(oχyd§e)

qui est irréversible, (avec une constante k), et une seconde réac¬ tion :

Médiateur_(rédu._t) + e + Mediateur_(oχydé)

qui est électrochimiquement réversible et extrêmement rapide.

Le médiateur réalise un transfert électrochimiquement réversible d'un électron vers les collecteurs de courant précédemment décrits.

Au cours de la première réaction, on peut mesurer la constante de second ordre k. Pour le complexe étudié ici, on trouve k = 2,5.10⁶ ± 0,5 M^"1.s^"1.

b) mesures effectuées avec d'autres complexes.

Des expériences similaires à celles qui viennent d'être décrites ont été réalisées pour d'autres complexes. Le tableau 1 donne les valeurs des constantes de vitesse k trouvées et des potentiels normaux d'oxydo-réduction E° en mV par rapport à une électrode de référence au calomel (SCE).

TABLEAU 1

Complexes ^E°(^mV/sCE^ ^"1.s^"1)

1 complexe tris (4,4' - dimëthoxy -

2,2' - bipyridine) d'osmium 225 2,5.10⁶

complexe bis (4,4' - dimëthoxy -

2,2' - bipyridine) mono (4,4' - di éthyl

- 2,2' - bipyridine) d'osmium 340 2.10⁶ 3 complexe bis (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - dimëthoxy -

2,2' - bipyridine) d'osmium 390 N.D

4 complexe mono (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - dihydroxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium pH<4,5 340 N.D pH>4,5 190 2.10⁵

5 complexe tris (4,4' - diméthyl - 2,2'

- bipyridine) d'osmium 425 1,5.10

6 complexe tris (4,4' - dihydroxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium -1000 ^ 0

7 complexe tris (4,4'- diamino - 2,2' - bipyridine) de ruthénium 170 1,6.10

8 complexe tris (4,4' - diamino - 2,2' - bipyridine) de fer 70 1,4.10

N.D. signifie non-déterminé.

A la lecture de ce tableau 1, on constate que la famille de médiateurs présente une très large gamme de potentiels rédox, variant entre - 1000 mV et + 425 mV (par rapport à une électrode de référence au calomel SCE). La limite inférieure de cette gamme est beaucoup plus basse que tous les potentiels rédox des médiateurs décrits jusqu'à présent dans la littérature. Par ailleurs, cette gamme de potentiels est également beaucoup plus large que celle que Ton obtenait avec la famille des ferrocènes. Ceci est dû au nombre important de substituants que Ton peut utiliser et au plus grand nombre de combinaisons de substitutions possibles. La constante de second ordre k_f correspondant à la constante de vitesse de la réaction d'oxydo-réduction entre Tenzyme et le média¬ teur selon l'invention, est beaucoup plus rapide qu'avec les autres médiateurs connus jusqu'à présent et est plus rapide qu'avec Toxy¬ gëne. En effet, l'oxygène présente une constante k de 1,5.10 M^" .s^" seulement. Ceci limite les problèmes précédemment décrits de compé¬ tition de l 'oxygène avec le médiateur lors de la réaction de trans¬ fert d'électrons à partir de la GOD. De même, les autres réactions de compétition se réalisant beaucoup plus lentement n'influencent pas le résultat de l'appareil de mesure.

En conséquence, on a sélectionné comme médiateurs pour les capteurs de glucose pour illustrer la suite de la description, les complexes 1 et 2 qui présentent les caractéristiques les plus favorables, à savoir simultanément une constante k élevée et un faible potentiel normal d'oxydo-réduction E° néanmoins supérieur à -300 mV, ce qui correspond au potentiel normal du groupe FAD/FADhL de la GOD.

Expérience 2 :

Optimalisation des différents composants du mélange de Télectrode de mesure.

On a essayé de déterminer les quantités optimales respectives des différents constituants du mélange déposé sur le collecteur de Télectrode de mesure.

Ceci a été réalisé en fabriquant un mélange 38 comprenant Tun des deux complexes préférés précédemment cités, de la poudre de carbone, la glucose oxydase immobilisée et comme additif la sérumal- bumine bovine et le glutaraldëhyde puis en déposant sur la partie collecteur de courant 37 de la bande électriquement conductrice 36

2 une quantité de 70 μl de ce mélange par cm afin de constituer une électrode de mesure 20. On a ensuite réalisé différents types d'électrodes de mesure en faisant varier graduellement Tun des composants du mélange et en maintenant les autres constants.

Les différents capteurs préparés de cette façon ont été utilisés pour des mesures potentiostatiques, à un potentiel de 300 mV, dans de multiples échantillons de sang contenant diverses quantités de glucose. Les résultats sont illustrés ci-après.

a) optimalisation de la quantité de poudre de carbone.

On a réalisé plusieurs types de capteurs différents (mais on a choisi d'en présenter seulement trois), en mélangeant dans 3 ml de tampon phosphate PBS, une quantité constante de GOD, (36,9 mg), une quantité constante de complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium (3,0 mg), utilisé comme médiateur, une quantité constante de glutaral- déhyde à 25 % (25 μl), une quantité constante de sérumalbumine bovine à 15 % (290 μl) et respectivement 25, 50 ou 250 mg de poudre de carbone.

Le tampon phosphate PBS utilisé ici et dans les expériences ci-dessous mentionnées est un tampon 10 mM ajusté à pH 6,8.

Ensuite on a testé ces trois types de capteur dans une solution physiologique contenant des quantités différentes de glucose (entre 0 et 20 mM de glucose) et on a mesuré la densité de courant obtenue au bout de 30 secondes (D _n)- La solution physiologique est composée de NaCl 115 mM, de KC1 25 mM, de K₂HP0₄. 3H₂05 M et de H_£P0₄0,5 mM.

Les résultats obtenus sont illustrés en figure 7 où les droites a, b, c correspondent respectivement aux résultats observés avec des capteurs contenant 25, 50 et 250 mg de carbone dans 3 ml de tampon phosphate PBS, soit des concentrations approximatives de 8, 17 et 83 mg par ml. Là encore on notera que Ton a effectué beaucoup plus de mesures, mais que Ton a choisi de représenter uniquement les droites a, b, c.

On a ensuite calculé la pente (m) de toutes les droites repré¬ sentant la totalité des mesures effectuées et on a reporté ces valeurs en figure 8 (courbe C,) où Taxe des abscisses représente la quantité de carbone en mg par ml de tampon phosphate PBS. De même, on a calculé l'ordonnée à l'origine de ces droites et on a reporté ces valeurs en figure 8 (courbe C₂). L'ordonnée à l'origine corres¬ pond à la valeur du point d'intersection d'une droite de la figure 7 et de Taxe des ordonnées, c'est-â-dire à la valeur du courant résiduel .

On constate que la courbe C, est sensiblement horizontale entre 17 et 83 mg de carbone, ce qui signifie qu'entre ces deux valeurs, la quantité de carbone influence peu les résultats du capteur. Toutefois, comme une mince couche de carbone présente de meilleurs propriétés mécaniques et diffusionnelles, on préfère utiliser le moins possible de carbone. De plus, on constate que la valeur de l'ordonnée à l'origine de la droite a (8 mg de carbone par ml) est la plus faible, ce qui signifie que Ton a le plus faible courant résiduel .

En conséquence, on préfère utiliser environ 10 mg de carbone par ml de tampon phosphate PBS.

b) optimalisation de la quantité d'enzyme (GOD).

On a réalisé plusieurs types de capteurs différents, (mais on a choisi de n'en représenter que trois), en mélangeant dans 3 ml de tampon phosphate PBS, une quantité constante de carbone (25 mg), une quantité constante (3 mg) du même médiateur que celui du paragraphe a) des quantités constantes de glutaraldéhyde à 25 % (25 μl) et de sérumalbumine bovine à 15 % (290 μl) et respectivement des quantités de 2175, 4375 et 8750 UI de glucose oxydase GOD, soit des concentra¬ tions respectives en GOD de 87, 175 et 350 UI de glucose oxydase (GOD) par mg de carbone.

Ensuite on a effectué les mêmes séries de mesures et de calculs qu'au paragraphe a). Les droites a, b, c de la figure 9 correspon¬ dent respectivement aux résultats observés avec des capteurs conte¬ nant 87, 175 et 350 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone. Les courbes C. et C₂ de la figure 10 représentent respec¬ tivement la pente (m) et l'ordonnée à l'origine. L'axe des abcisses de la figure 10 exprime la quantité de GOD en UI par mg de poudre de carbone.

On remarque qu'entre 75 et 350 UI de GOD par mg de poudre de carbone, la courbe C, est sensiblement horizontale, ce qui signifie qu'entre ces deux valeurs la quantité de GOD influence peu les résultats. Par ailleurs, l'ordonnée à l'origine de la droite a est la plus faible ce qui signifie qu'on a le plus faible courant résiduel .

En conséquence, on préfère utiliser environ 100 UI de GOD par mg de poudre de carbone.

c) optimal sation de la quantité de médiateur.

On a réalisé trois types de capteurs différents en mélangeant dans 3 ml de tampon phosphate PBS, une quantité constante de carbone (25 mg), une quantité constante de GOD (36,9 mg), des quantités constantes de glutaraldéhyde à 25 % (25 μl) et de sérumalbumine bovine à 15 % (290 μl) et respectivement 825; 1675 et 3325 μmol de complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium, soit des concentrations en médiateur de 33; 67 et 133 μmol par mg de poudre de carbone.

Ensuite, on a effectué les mêmes séries de mesures et de calculs qu'au paragraphe a). Les droites a, b, c de la figure 11 correspon¬ dent respectivement aux résultats observés avec 33; 67 et 133 μmol de ce complexe par mg de carbone. Les courbes C, et C₂ de la figure 12 représentent respectivement la pente (m) et l'ordonnée à l'ori¬ gine. L'axe des abscisses de la figure 12 représente la quantité de médiateur en μmol par mg de poudre de carbone.

On remarque que les courbes C, et C₂ sont sensiblement horizon¬ tales. Pour des valeurs de médiateur inférieures à 50 μmol, on est obligé d'effectuer les mesures â un potentiel supérieur à 300 mV. Comme on préfère travailler à un potentiel le plus faible possible, on préfère donc utiliser environ 50 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone.

Les optimalisations qui ont été réalisées pour le complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium sont également valables pour le complexe tris (4,4 - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium. Expérience 3 :

Etalonnage du capteur dans du sang et du tampon.

Les courbes de la figure 13 illustrent des mesures potentiosta- tiques effectuées avec des capteurs présentant comme médiateur les deux complexes préférés de Tinvention et en faisant varier la concentration de glucose dans des échantillons de sang ou de tampon phosphate PBS. Les mesures ont été effectuées â 300 V et la lecture de la densité de courant D20 a été faite après 20 secondes.

Les courbes C. et C- correspondent respectivement â des mesures effectuées dans le tampon phosphate et dans le sang avec un capteur utilisant le complexe tris (4,4' - dimëthoxy - 2,2'- bipyridine) d'osmium, tandis que les courbes C₂ et C, correspondent respective¬ ment à des mesures effectuées dans le tampon phosphate et dans le sang avec un capteur utilisant le complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium.

Comme on peut le constater sur la figure 13, les différentes courbes présentent un tracé linéaire et une pente suffisamment importante jusqu'à des valeurs de 20 mM de glucose. En conséquence, chez un patient où les valeurs physiologiques du glucose peuvent varier typiquement de 3 â 20 M, on peut utiliser de façon fiable le capteur selon Tinvention, puisqu'à une faible variation de la concentration en glucose correspond une variation suffisante de la densité de courant mesurée.

Les différences observées entre les mesures effectuées dans du tampon PBS et du sang complet sont dues au même phénomène que celui décrit notamment dans (Fogh-Andersen, N. et ses collaborateurs (1990), Clin. Chim. Acta 189, 33-38), pour le plasma et le sang complet. Cette différence est principalement due au volume occupé par les protéines dans le sang complet. Expérience 4 :

Influence de Thématocrite sur les résultats fournis par le capteur.

Les courbes de la figure 14 illustrent les variations de la densité de courant (D30) obtenue après 30 secondes, en fonction de la concentration en glucose dans du sang humain artificiellement reconstitué. Les échantillons de sang ont été préparés de la façon suivante. On a séparé le plasma et les cellules sanguines par centrifugation à 3000 tours par minute, pendant 15 minutes à 4°C. Ensuite, on a reconstitué le sang de façon â obtenir diverses valeurs d'hématocrite (0,35; 0,50 et 0,60) et on a ajouté à ces échantillons certaines quantités de glucose. La concentration en glucose a été mesurée en utilisant un appareil de laboratoire calibré, par exemple l'appareil référencé 23A, (disponible chez Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, 0HI0). Les mesures potentiostatiques ont été effectuées à 300 V avec des capteurs présentant comme médiateur le complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - biypridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine d'osmium. Les mesures de la densité de courant ont été effectuées après 30 secondes.

Les courbes C,, C₂ et C-. correspondent respectivement à des échantillons contenant 35 % de cellules et 65 % de plasma, 50 % de cellules et 50 % de plasma et 60 % de cellules et 40 % de plasma.

La courbe C₂ correspond à un hématocrite normal. On constate que la courbe C-, (hématocrite 0,60) correspondant à un hématocrite élevé, ne diffère pratiquement pas de la courbe C₂.

En revanche, la courbe C, (hématocrite 0,35) correspondant à Thématocrite d'une personne anémiée diffère de la courbe C_2<

En conséquence, le capteur selon Tinvention donne des résultats fiables chez un patient présentant un hématocrite élevé mais moins fiables chez une personne présentant une anémie. Expérience 5

bipyridine) d'osmium

Ces deux complexes ont été mélangés dans une solution de tampon phosphate PBS dont on a fait varier le pH et dont on a mesuré le potentiel normal d'oxydo-réduction E°.

On observe un potentiel E° stable pour un pH compris entre 1 et 12. Ce potentiel E° est de + 225 V pour le premier complexe et de + 340 V pour le second. Comme dans la pratique, le pH du sang humain est d'environ 7,4, de faibles variations du pH sanguin n'affectent pas le résultat de glycémie donné par le capteur selon l 'invention.

Expérience 6 :

Influence de la présence de certains médicaments, sur les résultats fournis par le capteur.

Enfin, une dernière série d'expériences a été effectuée afin de vérifier si les résultats fournis par ce capteur pouvaient être influencés par la présence de médicaments présents dans le sang au moment de la mesure. En effet, un patient peut parfaitement avoir ingéré des médicaments comme l'aspirine ou la vitamine C avant d'effectuer une mesure de glycémie.

En conséquence, on a testé l'influence possible de l'acide acétylsalicylique, de Tacétaminophénol et de Tacide ascorbique sur les résultats fournis par le capteur selon Tinvention.

Les expériences ont été réalisées avec un capteur utilisant comme médiateur le complexe tris (4,4' - diméthoxy - 2,2' - bipyri¬ dine) d'osmium.

Les mesures potentiostatiques ont été effectuées à 300 mV. La lecture de la densité de courant (D_on) a été effectuée après 30 secondes. Les différentes courbes représentent les variations de la densité de courant en fonction de la concentration en glucose, lorsque différentes quantités de chacun des médicaments testés sont présents dans un échantillon de solution physiologique.

Les résultats obtenus sont les suivants :

acëtaminophënol :

La figure 15 illustre les courbes obtenues. Les courbes C., C₂ (en pointillés) et C₃ correspondent respectivement à des concentra¬ tions de 0, 50 et 500 μM d'acëtaminophënol.

La valeur de 50 μM correspond â ce que Ton retrouve chez un patient ayant absorbé de Tacëtaminophênol selon une posologie normale, en revanche la valeur de 500 μM correspond â un excès. On peut constater qu'entre 4 et 10 mM de glucose (ce qui correspond sensiblement aux valeurs physiologiques), la présence de ce médica¬ ment n'a guère d'influence sur les résultats fournis par ce capteur, puisque toutes les courbes sont sensiblement superposées.

acide ascorbique :

La figure 16 illustre les courbes obtenues. Les courbes C,, C₂ et C₃ correspondent respectivement à des concentrations de 0, 100 et 1000 μM d'acide ascorbique par ml de sang.

La valeur de 100 μM (courbe C₂) correspond aux valeurs que Ton trouve chez un patient ayant absorbé de la vitamine C selon une posologie normale, par contre la valeur de 1000 μM (courbe C₃) correspond â un excès d'acide ascorbique.

On constate donc que lors de la présence d'acide ascorbique en excès (courbe C₃), toutes les valeurs de concentration en glucose sont augmentées par rapport à la normale. Au contraire, la courbe C₂ est sensiblement identique à C, et à des valeurs physiologiques, on remarque que la présence d'acide ascorbique n'affecte pas les résultats fournis par le capteur. acide acétylsalicylique

Il n'a pas été jugé nécessaire de présenter une figure illus¬ trant les résultats obtenus, puisqu'on a constaté qu'une quantité d'acide acétylsalicylique allant jusqu'à 25 M donnait des droites sensiblement identiques à celle correspondant à une quantité de 0 mM d'acide acétylsalicylique. En conséquence, on en déduit que la présence d'acide acétylsalicylique n'affecte pas les résultats fournis par le capteur.

Claims

REVENDICATIONS

1. Capteur de mesure de la quantité d'un composant en solution, comprenant : au moins une électrode de mesure (20) et une électrode de référence (22), isolées Tune de l'autre et destinées à venir en contact avec ladite solution, lesdites électrodes (20, 22) comprenant respectivement des contacts électriques (34; 26) adaptés pour être branchés sur un dispositif d'exploitation (4) du signal fourni par ledit capteur,

Télectrode de mesure (20) comprenant au moins un collecteur de courant relié (37), électriquement à Tun des contacts électri¬ ques (34) et recouvert d'un mélange (38) comprenant au moins une enzyme d'oxydo-réduction spécifique dudit composant et au moins un médiateur transférant les électrons entre ladite enzyme et ledit collecteur de courant, caractérisé en ce que le médiateur est choisi parmi les complexes d'un métal de transition avec au moins un ligand bipyridine, terpyridine ou phénanthroline substitué par au moins un groupe donneur d'électrons.

2. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange (38) de Télectrode de mesure (20) comprend en outre une matière conductrice active et en ce que le médiateur transfère les électrons entre Tenzyme et cette matière conductrice active.

3. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le métal de transition est choisi parmi le fer, le ruthénium, Tosmium ou le vanadium.

4. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe donneur d'électrons est choisi parmi le groupe OH, un groupe alkoxy, un groupe aryloxy ou un groupe aminé primaire, secondaire ou tertiai e.

5. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que Tenzyme d'oxydo-réduction est choisie parmi les oxydases ou les flavoprotëines.

6. Capteur selon la revendication 5 pour mesurer la quantité de glucose présente dans la solution, caractérisé en ce que Tenzyme est la glucose-oxydase.

7. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le médiateur est choisi parmi le complexe tris (4,4' - diméthoxy - 2,2' - bipyridine) d'osmium ou le complexe bis (4,4' - dimëthoxy - 2,2' - bipyridine) mono (4,4' - diméthyl - 2,2' - bipyridine) d'osmium.

8. Capteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière conductrice active est une poudre d'un matériau choisi parmi le carbone, Tor, le platine, le palladium ou un oxyde de métal conducteur.

9. Capteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière conductrice active est un film d'un polymère conducteur.

10. Capteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le mélange (38) de Télectrode de mesure (20) comprend un additif formant un réseau d'immobilisation de Tenzyme du médiateur et/ou de la matière conductrice active sur la surface du collecteur (37) de Télectrode de mesure (20).

11. Capteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'additif est choisi parmi la sérumalbumine bovine, le glutaraldé¬ hyde, le carbodiimide ou des polymères solubles dans Teau.

12. Capteur selon les revendications 6, 7 et 8, caractérisé en ce que le mélange (38) déposé sur le collecteur de Télectrode de mesure (20) comprend entre 1 et 2000 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone et entre 1 et 10000 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone.

13. Capteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que le mélange (38) déposé sur le collecteur de Télectrode de mesure (20) comprend entre 10 et 300 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone et entre 10 et 300 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone.

14. Capteur selon la revendication 13, caractérisé en ce que le mélange (38) déposé sur le collecteur de Télectrode de mesure (20) comprend environ 100 UI de glucose oxydase par mg de poudre de carbone et environ 50 μmol de médiateur par mg de poudre de carbone.

15. Ensemble caractérisé en ce qu'il est composé d'un capteur selon Tune quelconque des revendications 1 à 14 et d'un dispositif d'exploitation du signal fourni par ledit capteur, ce dispositif comprenant au moins deux contacts électriques conçus pour être reliés à au moins deux électrodes dudit capteur, un ampèremètre et des moyens d'affichage des résultats.