WO1990015882A1 - Acide nucleique et sondes nucleotidiques specifiques de plasmodium falciparum, et leur application pour la detection de plasmodium falciparum - Google Patents

Acide nucleique et sondes nucleotidiques specifiques de plasmodium falciparum, et leur application pour la detection de plasmodium falciparum Download PDF

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WO1990015882A1
WO1990015882A1 PCT/FR1990/000435 FR9000435W WO9015882A1 WO 1990015882 A1 WO1990015882 A1 WO 1990015882A1 FR 9000435 W FR9000435 W FR 9000435W WO 9015882 A1 WO9015882 A1 WO 9015882A1
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hybridization
plasmodium falciparum
probe
dna
nucleotide
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PCT/FR1990/000435
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Bruno Christian Henri Xavier Oury
Yves Michel Markowicz
Bernabé Fortunato Felipe CHUMPITAZI
Nadine Cristina
Régis MACHE
Pierre Ambroise-Thomas
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • nucleic acid and nucleotide probes specific for plasmodium falciparum and their application for the detection of plasmodium falciparum
  • the present invention was made at the Laboratory of Parasitology and Exotic Pathology and the Laboratory of Plant Molecular Biology of the Joseph Fourier-Grenoble I University, both Research Units associated with the CNRS.
  • Malaria is an infectious parasitic disease caused by an infestation of red blood cells with a hematozoal of the genus Plasmodium. transmitted to humans by an insect, the anopheles. Plasmodium falciparum is the most widespread and dangerous plasmodial species, causing high morbidity. About 40% of the world's population is exposed to malaria. Considerable efforts have been made to control, cure and possibly eradicate this disease; However, to achieve these objectives, it remains necessary to have specific, simple and inexpensive diagnostic means.
  • the usual diagnostic techniques are based on observation of the patient's blood under a microscope and must be carried out by a trained manipulator; the detection sensitivity of these techniques is from 10 to 200 parasitized red cells / mm3, however weak parasitaemias (less than 1000 parasitized red cells / mm3) require significant reading time and can give rise to false negatives.
  • Plasmodium falciparum genome has revealed the presence of highly repeated nucleotide sequences specific to the parasite.
  • the construction and then the screening of genomic libraries of Plasmodium falciparum made it possible to identify and sequence fragments of genomic DNA containing these highly repeated sequences.
  • PFR1 it has a rate of variation of 25% and has been identified by the same authors in other DNA clones isolated from the same genomic library of Plasmodium falciparum.
  • This application describes in particular two clones called pPFR1 and .
  • pPFR5 containing respectively an insert of 1.2 kb and 0.32 kb. The sequencing of these inserts showed that the repeated sequence of pPFR1 contained 51 nucleotides and that of pPFR5 contained 21 nucleotides. Zolg, J.. et al (Mol. Biochem. Parasitol.
  • the present invention relates to a new nucleic acid and an oligonucleotide derived therefrom, which constitute nucleotide probes specific for Plasmodium falciparum and which can hybridize the DNA of strains of different geographical origins.
  • the invention also relates to the method of hybridization of the DNA of Plasmodium falciparum with the probes of the invention, as well as to the method for detecting Plasmodium falciparum in a sample and to the kit for carrying out said detection method.
  • This nucleic acid which has received the designation pUF 28 comprises 1.846 kb, of which 33.15% is G and C. It consists of the repetition of a unit sequence of 21 nucleotides in 87 copies; these differ from one to 9 nucleotides but have at least 55% homology over the entire nucleic acid pUF 28 sequence.
  • the present invention therefore relates to a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of FIG. 1 or the corresponding complementary sequence capable of pairing with the same portion of the genomic DNA of Plasmodium falciparum due to its double-stranded nature.
  • the invention also relates to an oligonucleotide which has been given the name OLI 28 and which is derived from the nucleic acid of the invention pUF 28.
  • the oligonucleotide OLI 28 comprises 20 nucleotides whose sequence is as follows:
  • the ol igonu cleot ide OLI 28 is present in the nucleic acid pUF 28 in four copies underlined in FIG. 1.
  • the invention relates, of course, to the oligonucleotide complementary to OLI 28 and having the following nucleotide sequence:
  • nucleic acids and oligonucleotides in which the thymidine groups are replaced by uracyl groups.
  • the oligonucleotide OLI 28 can be prepared by chemical synthesis, the nucleic acid pUF 28 is itself isolated from a recombinant bacterial clone RRlD / pUF28 by methods known in the state of the art.
  • the nucleic acid pUF 28 and the oligonucleotide OLI 28 have the characteristic of specifically hybridizing with the DNA of Plasmodium falciparum.
  • the invention therefore also relates to the probes for detecting the presence of Plasmodium falciparum in a biological sample, consisting of or comprising all or part of the complementary sequence of a nucleic acid according to the invention, or any probe which is not distinguished from the preceding ones. level of the nucleotide sequence only by substitutions and / or additions and / or deletions of one or more nucleotides not causing modification of the hybridization properties of said probe with a nucleic acid according to the invention, under the conditions of hybridization defined below:
  • pre-hybridization solution having the following composition:
  • the invention also relates to probes for detecting the presence of Plasmodium falciparum in a biological sample, consisting of or comprising a sequence of 10 to 450 consecutive nucleotides contained in the complementary sequence of a nucleic acid according to the invention.
  • the invention relates more particularly to probes for detecting Plasmodium falciparum in a sample, constituted by or comprising a nucleotide sequence complementary to an oligonucleotide according to the invention, or any probe distinguished from the previous one at the level of the nucleotide sequence only by substitutions and / or additions and / or deletions of one or more nucleotides which do not modify the hybridization properties of said probe with an oligonucleotide according to the invention, under the hybridization conditions defined below:
  • pre-hybridization treatment of the support on which the probe is fixed at 30 ° C for 30 minutes with a pre-hybridization solution having the following composition:. 5 times SSC buffer
  • REPLACEMENT SHEET Denatured herring sperm DNA 100 ⁇ g / ml
  • hybridization conditions defined above constitute preferred conditions, but are in no way limiting and can be modified without affecting the recognition and hybridization properties of the probes and of the nucleic acids and of the oligonucleotides in accordance with the invention. It is known to "those skilled in the art that a nucleotide sequence can present modifications such as substitutions and / or additions and / or deletions of one or more nucleotides, however, not resulting in modification of the properties, in particular of hybridization of said nucleotide sequence.
  • the invention also relates to the probes for detecting Plasmodium falciparum in a sample, constituted by the repetition of the sequence of one or more probes containing from 10 to 450 nucleotides.
  • the probe corresponding to the pUF 28 nucleic acid and therefore having the sequence of FIG. 1 will be denoted hereinafter by probe pUF 28 r and by probe OLI 28, the probe corresponding to oligonucleotide OLI 28 and therefore having the sequence next :
  • the probes are advantageously marked with any marker conventionally used.
  • the probes can be marked using a radioactive tracer as 32 P, 35 S,
  • radioactive labeling can be carried out according to any method known to those skilled in the art.
  • the probes can be marked in 3 ′ by addition of one or more deoxynucleotides or ribonucleotides or of a dideoxynucleotide, marked in alpha by 32 P, in the presence of the Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; the probes can also be labeled in 5 ′ by transfer of a radioactive phosphate group from a deoxynucleotide or from a free dideoxynucleotide labeled in the gamma position, in the presence of the T4 Polynucleotide Kinase, they can also be labeled at each end by addition of any radiolabelled sequence in the presence of T4 DNA ligase.
  • the pUF 28 probe is advantageously marked with "Nick Translation” or with “Random Priming”.
  • the £ _L_L 28 oligonucleotide probe can be labeled during its chemical synthesis by incorporating one or more radioactive deoxynucleotides, the OLI probe 28 is advantageously labeled at its 5 ′ end.
  • the hybridization detection method will depend on the radioactive marker used and may be based on autoradiography, liquid scintillation, gamma counting or any other technique making it possible to detect the emission of the radiation emitted by the radioactive marker.
  • Non-radioactive labeling can also be used, by combining with the probes of the invention groups having immunological properties such as an antigen, a specific affinity for certain reagents such as a ligand, physical properties such as fluorescence or luminescence, properties allowing the completion of enzymatic reactions such as an enzyme or an enzyme substrate.
  • Non-radioactive labeling can be done by incorporating a nucleotide analog
  • REPLACEMENT SHEET comprising one of these groupings, by "Nick Translation” or by “Random Priming”; or by adding to the 3 'or 5' end of one of these analogs. It can also be done directly by chemical modification of DNA, such as photobiotinylation or sulfonation.
  • the invention also relates to a method of hybridization of a nucleotide probe with the DNA of Plasmodium falciparum, characterized in that it comprises the following stages: - the treatment of pre-hybridization of a support, such as a filter nitrocellulose or a nylon membrane, on which DNA extracted from Plasmodium falciparum is fixed, with a pre-hybridization solution,
  • a support such as a filter nitrocellulose or a nylon membrane
  • the invention also relates to a method of in vitro detection of Plasmodium falciparum in a biological sample likely to contain it, characterized in that after having made the DNA of Plasmodium falciparum, possibly contained in the biological sample, accessible and single-stranded, it is puts in contact with a nucleotide probe according to the invention, under conditions favorable to hybridization and the hybrids which are possibly formed are detected, the probe having been previously marked or made capable of being detected as it was said previously.
  • the probes according to the invention can also be used to detect the DNA of Plasmodium falciparum present at the sporozoite stage in the salivary glands of anopheles.
  • the subject of the invention is also the malaria diagnostic kits implementing methods of in vitro detection of Plasmodium falciparum mentioned above.
  • kits include in particular:
  • REPLACEMENT SHEET a determined quantity of a nucleotide probe in accordance with the invention
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used as a primer in a process of genetic amplification in vitro consisting in fixing the probe on the DNA of Plasmodium falciparum by hybridization, then in carrying out a process of enzymatic extension to l using DNA polymerase, followed by a denaturation process, and repeating the hybridization-extension-denaturation cycle, known as the PCR ("Polymerase Chain Reaction" cycle described by the company Cetus Corporation) sufficient to increase the quantity of the target sequence of the starting oligonucleotide probe in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the pUF 28 nucleic acid is introduced into a host cell using a vector, of the plasmid type capable of replicating in said host cell; advantageously the nucleic acid pUF 28 was introduced into the plasmid pUC 19 and amplified in the strain of Escheri ch-i, a Cûli RR1DM1 (K 12), derived from HP 103. -
  • REPLACEMENT SHEET From a freezer at -70 ° C, the strain is seeded on a solid SOB medium (Bacto Tryptone 2%,
  • the culture is done over 9 hours, at 37 ° C and with stirring (200rpm).
  • Chloramphenicol (170 mg / ml) makes it possible to amplify the number of copies of the plasmid per cell by blocking the bacterial division. This amplification step always takes place at 37 ° C., with stirring
  • the bacteria are recovered by centrifugation at 5000 g, for 10 minutes and at 4 ° C.
  • the plasmid DNA is desiccated under vacuum and then dissolved in water and assayed by measurement with a spectrophotometer of the O.D. of the solution at 260 nm.
  • the purification of the pUF 28 insert is carried out by a double enzymatic digestion of the plasmid by 2 enzymes Sst I (or Sac I) and Xba I whose cleavage sites are
  • REPLACEMENT SHEET are located on either side of the insert, in the polylinker sequence of the plasmid pUC 19.
  • ITIg of plasmid are digested in at least 200 ml of Sac I buffer (Tris-HCl pH 8, 50 mM; 50 mM NaCl; MgCl 2 10 mM) at a rate of 1 unit / mg of each enzyme.
  • Sac I buffer Tris-HCl pH 8, 50 mM; 50 mM NaCl; MgCl 2 10 mM
  • the two digestions are simultaneous and are incubated at 37 ° C for at least 3 hours.
  • the lower strip is cut and the pUF 28 probe is electro-eluted in a BIOTRAP device (trade name), in TAE buffer (0.5 mg / ml of Ethidium Bromide).
  • the insert thus purified is ready for use after 6 extractions of Ethidium Bromide with n-Butanol and 3 extractions with Diethyl Oxide and precipitation in 70% ethanol. After redissolving in water, the quality of the probe is checked by analytical electrophoresis and the DNA concentration is determined by measuring the O.D. at 260nm.
  • the oligonucleotide OLI 28 is labeled at the 5 ′ end with the T4 Polynucleotide Kinase, in the presence of gamma ATP. 50 pmol of OLI 28 probe (330 ng) are incubated in the presence of 7 Units of T4 Polynucleotide Kinase and 150 ⁇ Ci of gamma 32 P ATP in a final volume of 50 IDl. The average specific activity is of the order of 2 to 5.10 8 cpm / mg
  • - first step Lysis of parasitized red cells by adding 2 volumes (100 mi) of double-distilled, sterile water. Incubate for 20 minutes.
  • - uxi th step Lysis of the parasites by adding 0.33 volume (50 mi) of LE buffer (Lauryl Sarcosine 1%; EDTA pH8, 50 mM). EDTA inhibits the enzymatic activity of DNAases.
  • Cesium trifluoroacetate is a highly chaotropic salt which denatures proteins and dissociates them from nucleic acids.
  • REPLACEMENT SHEET - fifth step Centrifugation at 12,000 g for 5 minutes and recovery of the upper aqueous phase.
  • All stock solutions can be stored at room temperature. DNA extracted using this method can be stored at 37 ° C for several months.
  • the DNA is denatured by adding 0.25 volume (62.5 ml) of 2.5 N sodium hydroxide solution (20 minutes at room temperature).
  • the solution is neutralized with 0.5 volume (156 ml) of Tris-HCL buffer (pH8, 3M) and incubated in ice to avoid renaturation of the DNA.
  • Hybridization takes place in three stages: prehybridization, hybridization, washes.
  • the dry filter is placed in a welded plastic bag and incubated in a hybridization buffer, at a rate of 75 ml / cm 2 .
  • the hybridization buffer has the following composition: - 5 times SSC buffer
  • Prehybridization with the pUF 28 probe is carried out for 30 minutes at 33 ° C in the presence of 50% formamide.
  • Prehybridization with the OLI 28 probe is carried out for 1 hour at 30 ° C, in the absence of formamide.
  • hybridization with the single-stranded pUF 28 probe is carried out in the same buffer as the prehybridization; the filter is hybridized with 80 ng / ml of pUF 28 probe for 2 hours at 33 ° C, for a specific activity of at least 10 8 cpm / mg.
  • Hybridization with the OLI 28 probe is done in the same buffer as the prehybridization; the filter is hybridized with 100 ng / ml of OLI 28 probe for 4 hours at 30 ° C, for a specific activity of 2.10 8 cpm / mg at least.
  • the pUF 28 probe radiolabeled at 32 P, can detect 100 ⁇ g of purified Plasmodium falciparum DNA. after 24 hours of exposure to the autoradiography film.
  • the radiolabelled OLI 28 probe can detect 1 ng of DNA after 24 hours of exposure.
  • the detection tests were carried out on red blood cells parasitized in vitro, synchronous at the ring stage.
  • the 32 P-labeled pUF 28 probe detects 50 red blood cells parasitized per mm 3 of culture blood at 50% hematocrit, after 24 hours of exposure to the film, ie a parasitaemia of 0.001% in a reproducible manner.
  • the radiolabelled OLI 28 probe detects 500 red blood cells parasitized per mm 3, ie a parasitemia of 0.01% under the same conditions.
  • Table I below reports the handling time and the sensitivity of the pUF 28 and OLI 28 probes as well as of various probes known to date.
  • the pUF 28 and OLI 28 probes have a detection sensitivity at least equivalent to that of pRep-Hind and PFR1 and which is completely reproducible.
  • hybridization conditions developed specifically for these probes made it possible to achieve these performances after only 2 hours of hybridization for the pUF 28 probe and 4 hours for the OLI 28 probe.
  • the pUF 28 and OLI 28 probes are specific for the DNA of Plasmodium falciparum: thus, in hybridization of
  • Plasmodium malariae Plasmodium ovale and Plasmodium vivax as well as Plasmodium cynomolgi bastianellii which infests the monkey. They recognize the DNA of the following strains of Plasmod um falciparum of different geographic origin:

Abstract

L'invention concerne un acide nucléique et un oligonucléotide en dérivant, ainsi que les sondes constituées par ou comprenant lesdits acide nucléique et oligonucléotide, spécifiques de l'ADN de Plasmodium falciparum. L'invention concerne également un procédé d'hybridation desdites sondes avec l'ADN de Plasmodium falciparum, ainsi qu'un procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum et le kit pour la mise en oeuvre dudit procédé.

Description

Acide nucléique et sondes nucléotidiques spécifiques de plasmodium falciparum, et leur application pour la détection de plasmodium falciparum
La présente invention a été faite au Laboratoire de Parasitologie et Pathologie Exotique et au laboratoire de Biologie moléculaire Végétale de l'Université Joseph Fourier-Grenoble I, tous deux Unités de Recherche associées au CNRS.
Le paludisme est une maladie infectieuse parasitaire due à une infestation des hématies par un hématozoaire du genre Plasmodium. transmis à l'homme par un insecte, l'anophèle. Plasmodium falciparum est l'espèce plasmodiale la plus répandue et la plus dangereuse, à l'origine d'une morbidité élevée. Environ 40% de la population mondiale est exposée au paludisme. Des efforts considérables ont été entrepris pour contrôler, soigner et éventuellement éradiquer cette maladie; il reste toutefois nécessaire pour atteindre ces objectifs de disposer de moyens de diagnostic spécifiques, simples et peu onéreux.
Les techniques usuelles de diagnostic reposent sur l'observation au microscope du sang du malade et doivent être effectuées par un manipulateur entraîné; la sensibilité de détection de ces techniques est de 10 à 200 hématies parasitées/mm3, cependant les faibles parasitémies (inférieure à 1000 hématies parasitées/mm3) nécessitent un temps de lecture important et peuvent donner lieu à de faux négatifs .
Bien qu'impossible à automatiser ces techniques sont utilisées couramment pour le dépistage de l'accès palustre.
Des techniques immunologiques reposant sur la détection d'anticorps dans le sérum de malade ont été proposées mais ce type d'analyse sérologique est peu intéressante car la présence d'anticorps ne témoigne que
FEUILLE DE REMPLACEMENT d'un contact antérieur avec le parasite et une faible positivité du sérum ne permet pas de conclure à la présence ou à l'absence de parasites dans le sang. Ces techniques sont toutefois utilisées dans les centres de transfusion sanguine pour contrôler les s jets particulièrement exposés .
Pour pallier ces inconvénients, des techniques d'hybridation moléculaire ont été développées afin de détecter dans le sang de patients la présence de l'ADN de Plasmodium falciparum. L'utilisation de sondes moléculaires d'ADN spécifiques, pour diagnostiquer le paludisme a été décrite pour la première fois par Franzen, L. et al (The Lancet, 1984, _L, 525-528) .
Excepté l'ADN génomique total utilisé par Pollac et al (Poliack, Y. et al (1985) Am. J. Trop. Med. Hyg., J2 , 663-667), d'autres sondes, clonées dans différents vecteurs ( Barker, R.H. et al (1986) Science, 231 , 1434- 1436; Ξnea, V. (1986) Mol. Cell. Biol., £., 321-324 ; Zolg, J. . et al (1987) Mol. Biochem. Parasitol., 22.. 145-151) ou préparées par synthèse nucléotidique (Me Laughlin, G.L. et al (1987) The Lancet, 714-716) ont été développées.
Parallèlement, l'étude du génome de Plasmodium falciparum a mis en évidence la présence de séquences nucléotidiques hautement répétées spécifiques du parasite. La construction puis le criblage de banques génomiques de Plasmodium falciparum ont permis d'identifier et de séquencer des fragments d'ADN génomique contenant ces séquences hautement répétées. Le clone d'ADN, dénommé pRep- Hind décrit par Aslund, L. et Franzen, L. et al ( J. Mol. Biol. 1985, 185. 509-516) contient 1,7 kb et présente un insert de 0,57 kb constituée de la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides, cette séquence unitaire a été dénommée PFR1 : elle présente un taux de variation de 25% et a été identifiée par les mêmes auteurs dans d'autres clones d'ADN isolés de la même banque génomique de Plasmodium falciparum.
La Demande de Brevet Européen N° 135 108 au nom de ROCKFELLER UNIVERSITY décrit également des fragments de
FEUILLE DE REMPLACEMENT l'ADN génomique de Plasmodium falciparum contenant des séquences hautement répétées, lesdits fragments permettant de constituer des sondes d'hybridation pour la détection de l'ADN de Plasmodium falciparum. Cette demande décrit notamment deux clones dénommés pPFRl et. pPFR5 contenant respectivement un insert de 1,2 kb et 0,32 kb. Le séquençage de ces inserts a montré que la séquence répétée de pPFRl contenait 51 nucléotides et celle de pPFR5 contenait 21 nucléotides . Zolg, J. . et al ( Mol. Biochem. Parasitol.
1987, 22., 145-151) décrivent également un clone dénommé "26" contenant un insert de 0,147 kb constitué de la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides identique à celle décrite par Franzen, L. et al. Les tests d'hybridations réalisés à partir des sondes issues des clones pRep-Hind et "26" permettent une détection satisfaisante de l'ADN de Plasmodium falciparum, ainsi la sonde plasmidique pRep-Hind détecte 100 pg D'ADN génomique après 18 heures d'exposition (Me Laughlin, G. E. et al (1987) J. Clin. Microbiol . , 23., (5), 791-795) .
La présente invention concerne un nouvel acide nucléique ainsi qu'un oligonucléotide en dérivant, lesquelles constituent des sondes nucléotidiques spécifiques de Plasmodium falciparum et pouvant hybrider l'ADN de souches d'origines géographiques différentes. L'invention concerne également le procédé d'hybridation de l'ADN de Plasmodium falciparum avec les sondes de l'invention, ainsi que le procédé pour détecter Plasmodium falciparum dans un échantillon et le kit pour la mise en oeuvre dudit procédé de détection.
Les travaux de recherche réalisés par les Inventeurs ont concerné le clonage et le séquençage de fragments de l'ADN génomique de Plasmodium falciparum comprenant des séquences hautement répétées. Ces travaux ont permis d'obtenir l'acide nucléique de l'invention qui est représenté à la figure 1, dans laquelle les lettres indiquent les nucléotides suivants : A pour le résidu
FEUILLE DE REMPLACEMENT adénylique, C pour le résidu cytidylique, G pour le résidu guanidylique et T pour le résidu thymidylique; et où (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' dudit acide nucléique. Cet acide nucléique qui a reçu la dénomination pUF 28 comporte 1,846 kb dont 33,15 % de G et C. Il est constitué par la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides en 87 copies; celles-ci diffèrent entre elles de 1 à 9 nucléotides mais présentent au moins une homologie de 55 % sur toute la séquence de l'acide nucléique pUF 28. Ces variations résultent de la duplication en nombreux exemplaires d'une séquence de base, et se traduisent par des remplacements et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucléotides. Ces modifications apparaissent clairement à la figure 1, dans laquelle les 87 copies de la séquence unitaire constituant l'acide nucléique pUF 2 sont superposées .
La présente invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence nucleotidique de la figure 1 ou la séquence complémentaire correspondante capable de s'apparier avec la même portion de l'ADN génomique de Plasmodium falciparum en raison de sa nature bicaténaire.
L'invention- concerne également un oligonucléotide qui a reçu la dénomination OLI 28 et qui dérive de l'acide nucléique de l'invention pUF 28. L'oligonucléotide OLI 28 comprend 20 nucléotides dont la séquence est la suivante :
(5 ' ) AGGTCTTAAGGTAACTAAT (3 ' )
L ' ol igonu cléot ide OLI 28 est présent dans l ' acide nucléique pUF 28 en quatre copies soulignées dans la figure 1 .
L ' invent ion concerne nature llement , au s s i 1 ' oligonucléotide complémentaire de OLI 28 et ayant la séquence nucleotidique suivante :
FEUILLE DE REMPLACEMENT (5 ' )ATTAGTTACCTTAAGACCTA(3 ' )
capable de s'apparier avec la même portion d'ADN génomique de Plasmodium falciparum en raison de sa nature bicaténaire.
Font également partie de l'invention les acides nucléiques et les oligonucléotides dans lesquels les groupes thymidine sont remplacés par des groupes uracyles .
L'oligonucléotide OLI 28 peut être préparé par synthèse chimique, l'acide nucléique pUF 28 est lui isolé à partir d'un clone bactérien recombinant RRlD/pUF28 par des méthodes connues dans l'état de la technique.
L'acide nucléique pUF 28 et 1 'oligonucléotide OLI 28 présentent la caractéristique de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN de Plasmodium falciparum.
L'invention concerne donc également les sondes pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon biologique, constituées par ou comprenant tout ou partie de la séquence complémentaire d'un acide nucléique selon l'invention, ou toute sonde ne se distinguant des précédentes au niveau de la séquence nucleotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec un acide nucléique selon l'invention, dans les conditions d'hybridation définies ci après :
- traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé la sonde, à 33°C pendant 30 minutes avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante :
tampon 5 fois SSC (1 fois SSC=Nacl 0,15M; Citrate de
Sodium 0,015M)
Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume
Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume
Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
Glycine 0,1 % Poids/Volume
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume
ADN de Sperme de Hareng dénaturé 100 μg/ml
FEUILLE DE REMPLACEMENT en présence de 50 % de formamide.
- hybridation avec l'acide nucléique complémentaire, pendant 2 heures à 33°C dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation précédente, en présence de 50 % de formamide.
- lavages successifs avec les solutions suivantes :
. 4 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante, . 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 2 fois
SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
L'invention concerne aussi les sondes pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon biologique, constituées par ou comprenant une séquence de 10 à 450 nucléotides consécutifs contenus dans la séquence complémentaire d'un acide nucléique selon 1' invention.
L'invention concerne plus particulièrement les sondes pour détecter Plasmodium falciparum dans un échantillon, constituées par ou comprenant une séquence nucleotidique complémentaire d'un oligonucléotide selon l'invention, ou toute sonde ne se distinguant de la précédente au niveau de la séquence nucleotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec un oligonucléotide selon l'invention, dans les conditions d'hybridation définies ci-après :
- traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé la sonde, à 30°C pendant 30 minutes avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante : . tampon 5 fois SSC
. Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume
. Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume . Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
. Glycine 0,1 % Poids/Volume
. SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume
FEUILLE DE REMPLACEMENT . ADN de Sperme de Hareng dénaturé 100 μg/ml
- hybridation avec 1 ' oligonucléotide complémentaire, pendant 4 heures à 30°C dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation précédente . lavages successifs avec les solutions suivantes :
. 2 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC à température ambiante, . 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois
SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
. 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5' fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
Les conditions d'hybridation définies ci-dessus constituent des conditions préférées, mais ne sont nullement limitatives et peuvent être modifiées sans affecter pour autant les propriétés de reconnaissance et d'hybridation des sondes et des acides nucléiques et des oligonucléotides conformes à l'invention. II est connu de "l'homme du métier qu'une séquence nucleotidique peut présenter des modifications comme des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant cependant pas de modification des propriétés, notamment d'hybridation de ladite séquence nucleotidique.
L'invention concerne encore les sondes pour détecter Plasmodium falciparum dans un échantillon, constituées par la répétition de la séquence d'une ou plusieurs sondes contenant de 10 à 450 nucléotides. On désignera ci-après par sonde pUF 28r la sonde correspondant à l'acide nucléique pUF 28 et présentant donc la séquence de la figure 1, et par sonde OLI 28, la sonde correspondant à 1 'oligonucléotide OLI 28 et présentant donc la séquence suivante :
(5 ' ) TAGGTCTTAAGGTAACTAAT (3 ' )
FEUILLE DE REMPLACEMENT Les sondes sont avantageusement marquées par tout marqueur classiquement utilisé. Les sondes peuvent être marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32P, 35S,
125I, 3H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier.
Les sondes peuvent être marquées en 3 ' par addition d'un ou plusieurs déoxynucléotides ou ribonucléotides ou d'un didéoxynucléotide, marqués en alpha par le 32P, en présence de la Terminal Déoxynucléotidyl Transférase; les sondes peuvent également être marquées en 5' par transfert d'un groupe Phosphate radioactif d'un déoxynucléotidè ou d'un didéoxynucléotide libre marqué en position gamma, en présence de la T4 Polynucléotide Kinase, elles peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque radiomarquée en présence de T4 DNA ligase.
La sonde pUF 28 est marquée de manière avantageuse par "Nick Translation" ou par "Random Priming" . La sonde oligonucléotidique £_L_L 28 peut être marquée lors de sa synthèse chimique en incorporant un ou plusieurs déoxynucléotides radioactifs, la sonde OLI 28 est de manière avantageuse marquée à son extrémité 5' .
La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur 1 ' autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage gamma ou tout autre technique permettant de détecter l'émission du rayonnement émis par le marqueur radioactif.
Un marquage non radioactif peut également être utilisé, en associant aux sondes de l'invention des groupements présentant des propriétés immunologiques comme un antigène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés physiques comme la fluorescence ou la luminescence, des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. Le marquage non radioactif peut être fait par incorporation d'un analogue de nucléotide
FEUILLE DE REMPLACEMENT comportant l'un de ces groupements, par "Nick Translation" ou par "Random Priming"; ou par addition à l'extrémité 3' ou 5' de l'un de ces analogues. Il peut être fait également directement par modification chimique de l'ADN, comme la photobiotinylation ou la sulfonation.
L'invention concerne également un procédé d'hybridation d'une sonde nucleotidique avec l'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - le traitement de pré-hybridation d'un support, comme un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon, sur lequel est fixé l'ADN extrait de Plasmodium falciparum, avec une solution de pré-hybridation,
- l'hybridation dans une solution identique à la solution de pré-hybridation comprenant en outre une sonde nucleotidique conforme à l'invention,
- plusieurs lavages successifs. L'invention concerne aussi un procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum dans un prélèvement biologique susceptible de le contenir, caractérisé en ce que après avoir rendu l'ADN de Plasmodium falciparum, éventuellement contenu dans le prélèvement biologique, accessible et monocaténaire, on le met en contact avec une sonde nucleotidique conforme à l'invention, dans des conditions favorables à l'hybridation et l'on détecte les hybrides éventuellement formés, la sonde ayant été préalablement marquée ou rendue apte à être détectée comme il a été dit précédemment .
Les sondes conformes à l'invention peuvent être également utilisées pour détecter l'ADN de Plasmodium falciparum présent au stade sporozoïte dans les glandes salivaires de l'anophèle.
L'invention a en outre pour objet les kits de diagnostic du paludisme mettant en oeuvre des procédés de détection in vitro de Plasmodium falciparum sus-mentionnés .
A titre d'exemple de tel kits comprennent notamment :
FEUILLE DE REMPLACEMENT - une quantité déterminée d'une sonde nucleotidique conforme à l'invention,
- un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre l'ADN de Plasmodium falciparum et ladite sonde,
- des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre l'ADN et la sonde lors de ladite réaction d'hybridation.
Les sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention peuvent être utilisées comme amorce dans un processus d'amplification génétique in vitro consistant à fixer la sonde sur l'ADN de Plasmodium falciparum par hybridation, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation , et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, connu sous le nom de cycle PCR ("Polymerase Chain Reaction" décrit par la société Cetus Corporation) , un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence-cible de la sonde oligonucléo idique de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre.
Outre les caractéristiques qui précèdent, l'invention comporte -d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention , étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications .
I - PREPARATION DE LA SONDE pUF 28. A) Production de la sonde pUF 28
L'acide nucléique pUF 28 est introduit dans une cellule hôte à l'aide d'un vecteur, du type plasmide apte à se répliquer dans ladite cellule hôte; de manière avantageuse l'acide nucléique pUF 28 a été introduit dans le plasmide pUC 19 et amplifié dans la souche d'Escheri ch-i,a Cûli RR1DM1 (K 12), dérivée de HP 103. -
FEUILLE DE REMPLACEMENT A partir d'un congelât à -70°C, la souche est ensemencée sur un milieu solide SOB (Bacto Tryptone 2 %,
Extrait de Levure 0,5 %, NaCl lOmM, KC1 2,5mM, MgC12 lOmM,
MgS04 lOmM) , en présence d'Ampicilline (50 mg/ml) et mise en culture pendant 18 heures à 37°C.
10 ml de milieu liquide SOB (Ampicilline (50 mg/ml) ) sont ensemencés avec une colonie et mis en culture durant 16 heures, à 37°C, sous une agitation orbitale de 200 rpm. 2 ml de cette préculture servent d'inoculum pour ensemencer un litre de milieu liquide SOB (Ampicilline 50 mg/ml) .
La culture se fait sur 9 heures, à 37°C et sous agitation (200rpm) .
L'addition de Chloramphénicol (170 mg/ml) permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide par cellule en bloquant la division bactérienne. Cette étape d'amplification se déroule toujours à 37°C, sous agitation
(200 rpm), durant 16 heures.
Les bactéries sont récupérées par centrifugation à 5000 g, pendant 10 minutes et à 4°C.
Le plasmide est extrait de manière classique selon la technique de Birboim et Doly, décrite par Maniatis et al (1982 "Molecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory) . Il est purifié, en dernière étape, par ultracentrifugation sur gradient de CsC12 (n = 1,3860; l,55mg/ml; 100000 g; 20°C; 36 heures; en présence de 600 mg/ml de Bromure d'Ethidium. .
Le Bromure d'Ethidium est éliminé par 6 extractions au n-Butanol et 3 extractions au Diéthyl-Oxyde. B) Purification de la sonde pUF 28
Après précipitation dans l'éthanol 70 %, l'ADN plasmidial est déssique sous vide puis solubilisé dans l'eau et dosé par mesure au spectrophotomètre de la D.O. de la solution à 260 nm. La purification de l'insert pUF 28 se fait par une double digestion enzymatique du plasmide par 2 enzymes Sst I (ou Sac I) et Xba I dont les sites de coupure se
FEUILLE DE REMPLACEMENT situent de part et d'autre de l' insert, dans la séquence polylinker du plasmide pUC 19.
De manière préparative, 100 ITIg de plasmide sont digérés dans 200 mi au moins de tampon Sac I (Tris-HCl pH 8, 50mM; NaCl 50mM; MgC12 lOmM) à raison de 1 unité/mg de chaque enzyme. Les deux digestions sont simultanées et sont incubées à 37 °C, pendant au moins 3 heures.
L'insert pUF 28 (1,846 kb) et le plasmide pUC 19
(2,686 kb) sont séparés par électrophorèse sur gel à 0,8 % d'agarose, (gel de 20 cm par 20 cm; deux puits de 7 cm de longueur par 1,5 mm de largeur par 0,8 cm de profondeur), dans un tampon TAE (0,5 mg/ml de Bromure d'Ethidium) .
La bande inférieure est découpée et la sonde pUF 28 est électro-éluée dans un appareil BIOTRAP (dénomination commerciale) , dans le tampon TAE (0,5 mg/ml de Bromure d'Ethidium) . L'insert ainsi purifié est prêt à l'emploi après 6 extractions du Bromure d'Ethidium au n-Butanol et 3 extractions au Diéthyl-Oxyde et précipitation dans l'éthanol 70 %. Après remise en solution dans l'eau, la qualité de la sonde est contrôlée par électrophorèse analytique et la concentration en ADN est déterminée par la mesure de la D.O. à 260nm.
C) Marquage de la sonde pUF 28
Les résultats rapportés ci-dessous ont été obtenus par marquage de la sonde pUF 28 au 32P, par l'intermédiaire d'un nucléotide triphosphate marqué en position alpha; par exemple le alpha 32P dTTP (800 Ci/mmol; AMERSHAM FRANCE (dénomination commerciale) ) . Un microgramme d'insert est ainsi marqué avec 140 μCi par nick translation, l'activité spécifique est alors de 1 à 5.108 cpm/mg. On peut aussi marquer l'insert par la technique du "Random Priming", l'activité spécifique est alors de 1 à 2.109 cpm/mg. II - PREPARATION DE LA SONDE OLI 28. A) Production de la sonde OLI 28 La séquence oligonucléotidique OLI 28 de 20 bases est produite par synthèse chimique sur un appareil automatique (synthétiseur d'APPLIED BIOSYSTEM (dénomination
FEUILLE DE REMPLACEMENT commerciale ) ) . 300 iïlg ont ainsi été synthét i sé s sous forme monocaténaire en une seule fois .
Les se l s pré sent s à haute concent rat ion sont é l iminé s aprè s pré c ip itat ion de l ' ADN monobr in dan s l ' éthanol 70 % .
B) Marquage de la sonde OLI 28
L ' oligonucléotide OLI 28 est marqué à l'extrémité 5' par la T4 Polynucléotide Kinase, en présence de gamma ATP. 50 pmoles de sonde OLI 28 (330 ng) sont incubées en présence de 7 Unités de T4 Polynucléotide Kinase et 150 μCi de gamma 32P ATP dans un volume final de 50 IDl. L'activité spécifique moyenne est de l'ordre de 2 à 5.108 cpm/mg
III - PREPARATION DES ECHANTILLONS A ANALYSER
A) Préparation des échantillons
Le protocole de préparation des échantillons décrits ci-dessous a été mis au point par J. . Zolg et al, et décrit dans Am. J. Trop. Med. Hyg. (1987), 3___., 33-41. Cette technique comporte 5 étapes et permet de manipuler des échantillons de sang parasité d'au moins 501X11.
- première étape : Lyse des hématies parasitées en ajoutant 2 volumes (100 mi) d'eau bidistillée, stérile. Incuber pendant 20 minutes. - de uxi ème é tape : Lyse des parasites en ajoutant 0,33 volume (50 mi) de tampon LE (Lauryl Sarcosine 1 %; EDTA pH8, 50 mM) . L'EDTA inhibe l'activité enzymatique des DNAases.
- troisième étape : Addition de 0,25 volume (50 ml) de trifluoroacétate de césium 5 M. Le trifluoroacétate de Césium est un sel fortement chaotropique qui dénature les protéines et les dissocie des acides nucléiques .
- quatrième étape : Extraction des protéines par addition de 0,33 volume (83 ml) d'un mélange organique (éthanol 2,5 volumes /chloroforme 1 volume /alcool isoamylique 0,04 volume) .
FEUILLE DE REMPLACEMENT - cinquième étape : Centrifugation à 12000 g pendant 5 minutes et récupération de la phase aqueuse supérieure.
Toutes les solutions mères peuvent être conservées à température ambiante. Les ADN extraits selon cette méthode peuvent être conservés à 37°C, pendant plusieurs mois.
B) Dénaturâtion de l'ADN
L'ADN est dénaturé en ajoutant 0,25 volume (62,5 mi) de soude 2,5 N (20 minutes à température ambiante) .
La solution est neutralisée avec 0,5 volume (156 ml) de tampon Tris-HCL (pH8, 3M) et incubée dans la glace pour éviter la renaturation de l'ADN.
C) Dépôt des échantillons Les échantillons sont déposés en duplica sur un support comme un filtre de nitrocellulose à l'aide d'un appareil de filtration 8 fois 12 puits, sous vide (appareil HYBRI-DOT MANIFOLD de BRL (dénomination commerciale) ) .
Le filtre est préalablement mouillé dans le tampon 2 fois SSC (1 fois SSC = NaCl 0,15 M; Citrate de Sodium 0,015M) avant d'être placé dans l'appareil. Chaque échantillon est déposé sous vide. Avant et après chaque dépôt, le puits est rincé avec 200 mi de tampon 2 fois SSC. Après séchage à température ambiante pendant 30 minutes, le filtre est incubé à 80°C pendant 2 heures, entre deux feuilles de papier HATMAN 3MM (dénomination commerciale) pour fixer les ADN sur la membrane. IV - HYBRIDATION
L'hybridation se déroule en trois étapes : la préhybridation, l'hybridation, les lavages.
A) La préhybridation
Le filtre sec est placé dans un sac plastique soudé et incubé dans un tampon d'hybridation, à raison de 75 ml/cm2. Le tampon d'hybridation a la composition suivante : - Tampon 5 fois SSC
FEUILLE DE REMPLACEMENT - Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume
- Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume
- Phosphate de Sodium pH 6, 5 50 mM
- Glycine 1 % Poids/Volume - SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume
- ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 mg/ml
La préhybridation avec la sonde pUF 28 est effectuée pendant 30 minutes à 33°C en présence de 50 % de formamide . La préhybridation avec la sonde OLI 28 est effectuée pendant 1 heure à 30°C, en absence de formamide .
B) L'hybridation
Après dénaturation de la sonde pUF 28 par chauffage à 100°C pendant 10 minutes puis refroidissement dans la glace fondante (0°C) pendant 10 minutes, l'hybridation avec la sonde pUF 28 monocaténaire se fait dans le même tampon que la préhybridation; le filtre est hybride avec 80 ng/ml de sonde pUF 28 pendant 2 heures à 33°C, pour une activité spécifique de 108 cpm/mg au moins. L'hybridation avec la sonde OLI 28 se fait dans le même tampon que la préhybridation ; le filtre est hybride avec 100 ng/ml de sonde OLI 28 pendant 4 heures à 30°C, pour une activité spécifique de 2.108 cpm/mg au moins.
C) Lavaαe des fi 1très Les conditions de lavage sont différentes pour chaque sonde.
- le lavage après hybridation * avec la sonde pUF 28 comprend :
. 4 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante,
. 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 2 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
- le lavage après hybridation avec la sonde OLI 28 comprend : . 2 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois
SSC, à température ambiante,
FEU.LLE 0E BE P ACEMENT . 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. D) Révélation de l'hybridation
Les filtres sont séchés à la température ambiante pendant 30 minutes, enveloppés dans un film plastique, et exposés à un film d'autoradiographie, à -70°C, pendant 24 heures. V - SENSIBILITE DE DETECTION
A) Sensibilité de la détection d'ADN
La ' sonde pUF 28, radiomarquée au 32P peut détecter 100 pg d'ADN purifié de Plasmodium falciparum. après 24 heures d'exposition du film d'autoradiographie. La sonde OLI 28 radiomarquée peut détecter 1 ng d'ADN après 24 heures d'exposition.
B) Sensibilité σ_≤ la détection d'hématies parasitées
Afin de retrouver les conditions physiopathologiques, les tests de détection ont été réalisés sur des hématies parasitées in vitro, synchrones au stade ring.
La sonde pUF 28 marquée au 32P détecte 50 hématies parasitées par mm3 de sang de culture à 50 % d'hématocrite, après 24 heures d'exposition du film, soit une parasitémie de 0,001 % de façon reproductible.
La sonde OLI 28 radiomarquée détecte 500 hématies parasitées par mm3 soit une parasitémie de 0,01 % dans les mêmes conditions . Le tableau I ci-dessous rapporte la durée de manipulation et la sensibilité des sondes pUF 28 et OLI 28 ainsi que de différentes sondes connues à ce jour.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
Figure imgf000019_0001
Comme l'indique le tableau I, les sondes pUF 28 et OLI 28 ont une sensibilité de détection au moins équivalente à celle de pRep-Hind et PFR1 et qui est tour à fait reproductible.
En outre, les conditions d'hybridation mises au point spécifiquement pour ces sondes, ont permis d'atteindre ces performances après seulement 2 heures d'hybridation pour la sonde pUF 28 et 4 heures pour la sonde OLI 28.
Les sondes pUF 28 et OLI 28 sont spécifiques de l'ADN de Plasmodium falciparum: ainsi, en hybridation de
"Southern Blots" elles ne reconnaissent pas l'ADN génomique humain, ni l'ADN des trois autre espèces plasmodiales : Plasmodium malariae. Plasmodium ovale et Plasmodium vivax ainsi que Plasmodium cynomolgi bastianellii qui infeste le singe. Elles reconnaissent l'ADN des souches de Plasmod um falciparum d'origine géographique différente suivantes :
- souche CAM du Sénégal
- souche SGE-1 de Gambie
FEUILLE DE REMPLACEMENT souche JEAN de Centrafrique souche KENYA du Kenya souche LILLY de Centrafrique souche NF7 d'Afrique (aéroport d'Amsterdam) souche NF54 de Tanzanie souche UPA d'Ouganda souche HONDURAS du Honduras souche INDOCHTNΆ-1 du Vietnam
10
15
20
25
30
35
FEUILLE DE REMPLACEMENT FIGURE I
( 5 ' ) GATCCT AACATCAGTAATG TAGGTCTT ACTTCCACTGATC TAGGTCTT AACTTGACTCATA TAGGTCTT ATGATTACTAACC ATGGTAAATCACT AAGGTCTT ACTGTTACTAATA ATGTCAACTAACT TTGGTCTT AAGCTTACTAATT
AAGGTCCT AATTTAACTAATA TAGGTCTT ATGGTTACTAACC TAGGTCAT AAGGTTACTAAC TAGGTCTT AATGTAAATAACG TAGGTCATTAATGTAACTAACG TACGTCTT AACATGACTAACC TACGTCTT AACGTAACTAACA AAGTTCTT ACTTTCATTAATT TAAGTCAT TAAGGTACTAATT CAGGTCCT AACTTCACTAACA TTGGTCTT AACTTAACAAATA TAGGTCCT AACTTGACTAACT TAGGTCCT AACTACAGCAACA TAGGTCTT ACTTTCACTAATA TAGGTCTA TAGGTAAGTAATA TAGGTCTT ACTTTCATTCATA TAGGTCTT ACTTTTACTAACA TAGGTCTT ATGGTAACTAACT TAGGTCTT ACTTTCATTAATT AAGGTCTT AACTTAACTAACT GAGGTCCT AACATTACATACT TAGGTCTT AACTTGACTAACA TAGGTCTT ACGTTGACTAACT TAGGTCTT AGGTTGACTAACT TAGGTCCT TACTATACTAACT TAGGTCTT ACCTTCACTCGTA TAGGTCTT AAGGTAAGTAATA TAGGTCTT ACTTTCACTAACG TAGGTCCT CAATACAGTAACG TAGGCCTC AACTTAACTAACT AAGGTAACTAATA TAGGTCTT AACATAACTAATA
CAGGTCCT AACTACAGCAACA TAGGTCTT AACGTAACTAGCT TAGGTCTA TAGGTAAGTAATA AAGGTCAT ACAATTACTAACC TAGGTCCT AACATTACATACT TAAGTCAT TAAGGTACTAACT TAGGTCTT GACTGGAGTAATG TAGGTCGT AATGTAACTAATA TAGGTCCT AACATTACTAGCT TAG-^T TT aA ^AC^AATG TTCGTCTT TGGGT ACT ACT Afy?rc AA πτAA τ.aATc TAGGTCTT GACTGGAGTAATC TAGGTCCT AACATTAGTAATG TΆFSΠTCT .aaK7TaaC!TVATA TAGGTCTT ACTTTCACTCATA TAGGTCCT ATTATCACTAACG TAGGCCTT ACTTTCACTAACT TAGGTCTT AAGCTAACTAATT TAGGTCTT ACTTTCACTAACT TAGGTCTT ATGGTAACTAATA TAAGTCTT ACTTTCACTAACC AAGCTTACTAACT TAAGTT T ACTTT ACTAACT AACTTAGATGCT TAGGTCTT ACCTTCACTAACA AACATAACCAATA TAGGTCTT ATTTTTACTAACT AACTACACTAACT TAGGTCTT AACGTGACTAACA AACTTAGCTAACA CAGGTCTT AACCTGACTAACA TAGGTCTT AACTTAACTAATA TAGGTCTT AACTTAACTAACCT TAGGTCCT AACTTCACTAACT TAGGTCTT ACTTTCACTAAGT TAGGTCTT AAGGTAACTAACA GAGGTCCT TCTTTTACTAATA TAAGTCAT TAAGGTACTAATT TAGGTCCT AACGTAACTAATATA TTGGTCTT AACTTAACAAATA TAGGTCTT ATAGTCACTAACC TAGGTCCT AACATTACTAACA AAGGTCTT ACTCTTACTGATA TAGGTCTT AAGTTAACTAACT TAGGTCTT ATGGTTACTAACC .. AAGGTCAT ACTTTTACTAACT TAGATC (3 ' )
Séσuences soulignées Oligonucléotide OLI 28 répétées quatre fois
FEUILLE DE REMPLACEMENT

Claims

REVEND ICftT IONS
1 - Acide nucléique caractérisé en ce qu ' il comprend la séquence nucleotidique de la figure 1 ou la séquence complémentaire correspondante .
2 - Oligonucléotide dérivant d'un acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence suivante :
(5 ' ) TAGGTCTTAAGGTAACTAAT (3 ' )
ou la séquence complémentaire correspondante suivante :
( 5 ' ) TTAGTTACCTTAAGACCTA ( 3 ' ) .
3 - Sonde pour détecter la présence de
Plasmodium falciparum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend tout ou partie de la séquence complémentaire de l'acide nucléique de la revendication 1, ou toute sonde nucleotidique ne se distinguant de la précédente au niveau de la séquence nucleotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1.
4 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend une séquence de 10 à 450 nucléotides consécutifs contenus dans la séquence complémentaire de l'acide nucléique selon la revendication 1.
5 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend une séquence nucleotidique complémentaire de 1 'oligonucléotide de la revendication 2, ou toute sonde nucleotidique ne se distinguant de la
FEUILLE DE REMPLACEMENT précédente au niveau de la séquence nucleotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec 1 'oligonucléotide de la revendication 2.
6 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la répétition de la séquence d'une ou plusieurs sondes selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5.
7 - Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est marquée radioactivement ou par un marqueur du type enzymatique, antigènique, ligand, luminescent ou fluorescent . 8 - Procédé d'hybridation d'une sonde nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à
6 avec l'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement de pré-hybridation d'un support, comme un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon, sur lequel est fixé l'ADN extrait de Plasmodium falciparum. avec une solution de pré-hybridation,
- l'hybridation dans une solution identique à la solution de pré-hybridation comprenant en outre une sonde nucleotidique selon l'une quelconque des revendication 3 à 6,
- plus ieurs lavages successifs .
9 - P ro cédé d ' hybridat ion d ' une s onde nucleotidique selon la revendicat ion 3 ave c l ' ADN de Plasmodium falciparum. caractérisé en ce qu ' il comprend les étapes suivantes :
- le traitement de pré-hybridation du filtre . Le filtre sur lequel est fixé l ' ADN extrait de P la smodium falciparum est placé dans un sac plastique soudé , et incubé pendant 30 minute s à 33°C ave c une s olut ion de pré¬ hybridation ayant la composition suivante : - Tampon 5 fois SSC
FEUILLE DE REMPLACEMENT - Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume
- Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume
- Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
- Glycine 1 % Poids/Volume
- SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume
- ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 mg/ml en présence de 50 % de formamide,
- l'hybridation dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation, comprenant en outre la sonde nucleotidique selon la revendication 3 marquée notamment de manière radioactive, en présence de 50 % de formamide, pendant 2 heures à 33°C,
- les lavages successifs suivants :
. 4 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante,
. 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 2 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante.
10 - Procédé d'hybridation d'un sonde nucleotidique selon la revendication 5 avec l'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement de pré-hybridation du filtre. Le filtre sur lequel est fixé l'ADN extrait de Plasmodium falciparum est placé dans un sac plastique soudé, et incubé pendant 1 heure à 30°C avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante :
- Tampon 5 fois SSC
- Ficoll 400 o, 1 % Poids/Volume
- Polyvinylpyrrolidone o, 1 % Poids/Volume
- Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM
- Glycine 1 % Poids/Volume
- SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) o, 1 % Poids/Volume
- ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 mg/ml
- l'hybridation dans une solution tamt identique à la solution de pré-hybridation, comprenant en outre la sonde nucleotidique selon la revendication 5
FEUILLE DE REMPLACEMENT marquée notamment de manière radioactive, pendant 4 heures à 30°C,
- les lavages successifs suivants :
. 2 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC, à température ambiante,
. 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante,
. 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5 fois SSC, en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. 11 - Procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum dans un prélèvement biologique susceptible de le contenir, caractérisé en ce que après avoir rendu l'ADN de Plasmodium falciparum éventuellement contenu dans le prélèvement biologique, accessible et monocaténaire, on le met en contact avec une sonde nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans des conditions favorables à l'hybridation et l'on détecte les hybrides éventuellement formés.
12 - Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend : une quantité déterminée d'une sonde nucleotidique selon l'une des revendications 3 à 6,
- un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre l'ADN de Plasmodium falciparum et ladite sonde,
- des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre l'ADN et la sonde lors de ladite réaction d'hybridation.
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