US20040067491A1

US20040067491A1 - Diagnosis of diseases associated with metabolism

Info

Publication number: US20040067491A1
Application number: US10/240,454
Authority: US
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock; Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2004-04-08
Also published as: ATE353975T1; US20030162194A1; JP2003534780A; DE60126593D1; DE60126593T2; WO2001081622A3; WO2001092565A3; EP1272670A2; AU2001254794A1; AU7633001A; WO2001092565A8; US7195870B2; WO2001076451A9; WO2001077375A8; WO2001081622A8; WO2001092565A2; AU2001276330B2; EP1370685A2; WO2001077377A2; WO2001077164A8

Abstract

Chemically modified genomic sequences of genes associated with metabolism, to oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting the cytosine methylation state of genes associated with metabolism which are directed against the sequence are disclosed. In addition, a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism is disclosed.

Description

FIELD OF THE INVENTION

The levels of observation that have been well studied by the methodological developments of recent years in molecular biology, are the genes themselves, the translation of these genes into RNA, and the resulting proteins. The question of which gene is switched on at which point in the course of the development of an individual, and how the activation and inhibition of specific genes in specific cells and tissues are controlled is correlatable to the degree and character of the methylation of the genes or of the genome. In this respect, pathogenic conditions may manifest themselves in a changed methylation pattern of individual genes or of the genome.

The present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA-oligomers and to a method for the diagnosis and/or therapy of diseases which have a connection with the genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism and, in particular, with the methylation status thereof.

PRIOR ART

Metabolism is the sum of chemical changes that occur in living organisms. The thousands of different chemical reactions are carried out simultaneously by a cell are closely coordinated. A variety of control mechanisms regulate the activities of key enzymes in response to changing conditions in the cell. One very common form of regulation is a rapidly reversible feedback inhibition exerted on the first enzyme by the final product of that pathway. A longer lasting form of regulation involves the chemical modification of one enzyme by another. Combinations of regulatory mechanisms can produce major and long lasting changes in the metabolism of the cell. Common metabolic diseases are diabetes, cancer, hyperlipidaemia and atherosclerosis. Cancer, for example, is a multistep disease with a multifactorial aetiology. For some genotoxic carcinogens the sequence of events leading to tumour formation is well understood from exposure, to metabolism and ultimately to specific mutations in transformation-associated genes. In the widespread field of metabolic diseases, enzymes, which play a central role in glucose metabolism, like Human hexokinase, are contributing to diseases like pre-non-insulin-dependent diabetes mellitus (Diabetes 1995 March;44(3):347-53 Identification of four amino acid substitutions in hexokinase II and studies of relationships to NIDDM, glucose effectiveness, and insulin sensitivity. Echwald S M, Bjorbaek C, Hansen T, Clausen J O, Vestergaard H, Zierath J R, Printz R L, Granner D K, Pedersen O). Other metabolism based disorders are peroxisomal disorders (Enzyme 1987;38(1-4):161-76 Genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. New findings in clinical and biochemical studies. Schutgens R B, Wanders R J, Nijenhuis A, van den Hoek C M, Heymans H S, Schrakamp G, Bleeker-Wagemakers E M, Delleman J W, Schram A W, Tager J M, et al.). Those disorders are a group of genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. Alcohol-induced oxidative stress, another metabolic disease, is linked to the metabolism of ethanol (J Biomed Sci 2001 January-February;8(1):59-70, Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. Zima T, Fialova L, Mestek O, Janebova M, Crkovska J, Malbohan I, Stipek S, Mikulikova L, Popov P). Three metabolic pathways of ethanol have been described in the human body so far. Some other described metabolic diseases are hereditary tyrosinemia type I, which is the most severe metabolic disease of the tyrosine catabolic pathway mainly affecting the liver (FASEB J 1999 December;13(15):2284-98 Cyclin B-dependent kinase and caspase-1 activation precedes mitochondrial dysfunction in fumarylacetoacetate-induced apoptosis. Jorquera R, Tanguay R M), methylmalonic acidemia (Hum Gene Ther 1994 September;5(9):1095-104 Overexpression of human methylmalonyl CoA mutase in mice after in vivo gene transfer with asialoglycoprotein/polylysine/DNA complexes. Stankovics J, Crane A M, Andrews E, Wu C H, Wu G Y, Ledley F D) or propionic acidemia (Hum Genet 1991 May;87(1):41-4 Genetic heterogeneity of propionic acidemia: analysis of 15 Japanese patients. Ohura T, Miyabayashi S, Narisawa K, Tada K Department of Pediatrics, Tohoku University School of Medicine, Sendai, Japan).

The high incidence of metabolic diseases has given rise to the development of methods of treatment and diagnosis targeted specifically to metabolic pathways. The further development of such methods would have considerable benifits. For example, cancer where current therapies may have unwanted side effects or fail to provide effective treatment. Conventional methods such as chemotherapy, which with their massive side effects, sometimes result in unacceptable morbidity or lead up to the death of the patient. In practice, the unwanted side effects associated with cancer therapies frequently limit the treatment which could help a patient.

5-methylcytosine is the most frequent covalent base modification in the DNA of eukaryotic cells. It plays a role, for example, in the regulation of the transcription, in genetic imprinting, and in tumorigenesis. Therefore, the identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Moreover, the epigenetic information carried by 5-methylcytosine is completely lost during PCR amplification.

A relatively new and currently the most frequently used method for analyzing DNA for 5-methylcytosine is based upon the specific reaction of bisulfite with cytosine which, upon subsequent alkaline hydrolysis, is converted to uracil which corresponds to thymidine in its base pairing behavior. However, 5-methylcytosine remains unmodified under these conditions. Consequently, the original DNA is converted in such a manner that methylcytosine, which originally could not be distinguished from cytosine by its hybridization behavior, can now be detected as the only remaining cytosine using “normal” molecular biological techniques, for example, by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing which can now be fully exploited. In terms of sensitivity, the prior art is defined by a method which encloses the DNA to be analyzed in an agarose matrix, thus preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts with single-stranded DNA), and which replaces all precipitation and purification steps with fast dialysis (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec. 15 ;24(24):5064-6). Using this method, it is possible to analyze individual cells, which illustrates the potential of the method. However, currently only individual regions of a length of up to approximately 3000 base pairs are analyzed, a global analysis of cells for thousands of possible methylation events is not possible. However, this method cannot reliably analyze very small fragments from small sample quantities either. These are lost through the matrix in spite of the diffusion protection.

An overview of the further known methods of detecting 5-methylcytosine may be gathered from the following review article: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

To date, barring few exceptions (e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 March-April;5(2):94-8) the bisulfite technique is only used in research. Always, however, short, specific fragments of a known gene are amplified subsequent to a bisulfite treatment and either completely sequenced (Olek A, Walter J. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 November;17(3):275-6) or individual cytosine positions are detected by a primer extension reaction (Gonzalgo M L, Jones P A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):2529-31, WO Patent 95/00669) or by enzymatic digestion (Xiong Z, Laird P W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):25324). In addition, detection by hybridization has also been described (Olek et al., WO 99/28498).

Further publications dealing with the use of the bisulfite technique for methylation detection in individual genes are: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 June;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 March;6(3):387-95; Feil R, Chariton J, Bird A P, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio M C, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5′ region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.

An overview of the Prior Art in oligomer array manufacturing can be gathered from a special edition of Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), published in January 1999, and from the literature cited therein.

Fluorescently labeled probes are often used for the scanning of immobilized DNA arrays. The simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5′-OH of the specific probe are particularly suitable for fluorescence labels. The detection of the fluorescence of the hybridized probes may be carried out, for example via a confocal microscope. Cy3 and Cy5 dyes, besides many others, are commercially available.

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-TOF) is a very efficient development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse thus transporting the analyte molecule into the vapor phase in an unfragmented manner. The analyte is ionized by collisions with matrix molecules. An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions are accelerated at different rates. Smaller ions reach the detector sooner than bigger ones.

MALDI-TOF spectrometry is excellently suited to the analysis of peptides and proteins. The analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). The sensitivity to nucleic acids is approximately 100 times worse than to peptides and decreases disproportionally with increasing fragment size. For nucleic acids having a multiply negatively charged backbone, the ionization process via the matrix is considerably less efficient. In MALDI-TOF spectrometry, the selection of the matrix plays an eminently important role. For the desorption of peptides, several very efficient matrixes have been found which produce a very fine crystallization. There are now several responsive matrixes for DNA, however, the difference in sensitivity has not been reduced. The difference in sensitivity can be reduced by chemically modifying the DNA in such a manner that it becomes more similar to a peptide. Phosphorothioate nucleic acids in which the usual phosphates of the backbone are substituted with thiophosphates can be converted into a charge-neutral DNA using simple alkylation chemistry (Gut I G, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. Apr. 25, 1995;23(8):1367-73). The coupling of a charge tag to this modified DNA results in an increase in sensitivity to the same level as that found for peptides. A further advantage of charge tagging is the increased stability of the analysis against impurities which make the detection of unmodified substrates considerably more difficult.

Genomic DNA is obtained from DNA of cell, tissue or other test samples using standard methods. This standard methodology is found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

DESCRIPTION

The object of the present invention is to provide the chemically modified DNA of genes associated with metabolism, as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting cytosine methylations, as well as a method which is particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The present invention is based on the discovery that genetic and epigenetic parameters and, in particular, the cytosine methylation pattern of genes associated with metabolism are particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism.

This objective is achieved according to the present invention using a nucleic acid containing a sequence of at least 18 bases in length of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. In the table, after the listed gene designations, the respective data bank numbers (accession numbers) are specified which define the appertaining gene sequences as unique. GenBank was used as the underlying data bank, which is located at the National Institute of Health at the internet address http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

The chemically modified nucleic acid could heretofore not be connected with the ascertainment of genetic and epigenetic parameters.

The object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or oligomer for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, containing at least one base sequence having a length of at least 13 nucleotides which hybridizes to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. The oligomer probes according to the present invention constitute important and effective tools which, for the first time, make it possible to ascertain the genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The base sequence of the oligomers preferably contains at least one CpG dinucleotide. The probes may also exist in the form of a PNA (peptide nucleic acid) which has particularly preferred pairing properties. Particularly preferred are oligonucleotides according to the present invention in which the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5 ^th-9^thnucleotide from the 5′-end of the 13-mer; in the case of PNA-oligomers, it is preferred for the cytosine of the CpG dinucleotide to be the 4^th-6^thnucleotide from the 5′-end of the 9-mer.

The oligomers according to the present invention are normally used in so called “sets” which contain at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides of the sequences of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. Preferred is a set which contains at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.

Moreover, the present invention makes available a set of at least two oligonucleotides which can be used as so-called “primer oligonucleotides” for amplifying DNA sequences of one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto, or segments thereof.

In the case of the sets of oligonucleotides according to the present invention, it is preferred that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.

The present invention moreover relates to a set of at least 10 n (oligonucleotides and/or PNA-oligomers) used for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). These probes enable diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The set of oligomers may also be used for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.

According to the present invention, it is preferred that an arrangement of different oligonucleotides and/or PNA-oligomers (a so-called “array”) made available by the present invention is present in a manner that it is likewise bound to a solid phase. This array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice. The solid phase surface is preferably composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold. However, nitrocellulose as well as plastics such as nylon which can exist in the form of pellets or also as resin matrices are possible as well.

Therefore, a further subject matter of the present invention is a method for manufacturing an array fixed to a carrier material for analysis in connection with diseases associated with metabolism in which method at least one oligomer according to the present invention is coupled to a solid phase. Methods for manufacturing such arrays are known, for example, from U.S. Pat. No. 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protecting groups.

A further subject matter of the present invention relates to a DNA chip for the analysis of diseases associated with metabolism which contains at least one nucleic acid according to the present invention. DNA chips are known, for example, for U.S. Pat. No. 5,837,832.

Moreover, a subject matter of the present invention is a kit which may be composed, for example, of a bisulfite-containing reagent, a set of primer oligonucleotides containing at least two oligonucleotides whose sequences in each case correspond or are complementary to an 18 base long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto), oligonucleotides and/or PNA-oligomers as well as instructions for carrying out and evaluating the described method. However, a kit along the lines of the present invention can also contain only part of the aforementioned components.

The present invention also makes available a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with the cycle cell by analyzing cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, including the following steps:

In the first step of the method, a genomic DNA sample is chemically treated in such a manner that cytosine bases which are unmethylated at the 5′-position are converted to uracil, thymine, or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior. This will be understood as ‘chemical pretreatment’ hereinafter.

The genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from usual sources of DNA such as cells or cell components, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, or combinations thereof.

The above described treatment of genomic DNA is preferably carried out with bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which results in a conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil or to another base which is dissimilar to cytosine in terms of base pairing behavior.

Fragments of the chemically pretreated DNA are amplified, using sets of primer oligonucleotides according to the present invention, and a, preferably heat-stable polymerase. Because of statistical and practical considerations, preferably more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified. The amplification of several DNA segments can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. Usually, the amplification is carried out by means of a polymerase chain reaction (PCR).

In a preferred embodiment of the method, the set of primer oligonucleotides includes at least two olignonucleotides whose sequences are each reverse complementary or identical to an at least 18 base-pair long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). The primer oligonucleotides are preferably characterized in that they do not contain any CpG dinucleotides.

According to the present invention, it is preferred that at least one primer oligonucleotide is bonded to a solid phase during amplification. The different oligonucleotide and/or PNA-oligomer sequences can be arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice, the solid phase surface preferably being composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold, it being possible for other materials such as nitrocellulose or plastics to be used as well.

The fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly detectable label. Preferred are labels in the form of fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer, it being preferred that the fragments that are produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The detection may be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).

The amplificates obtained in the second step of the method are subsequently hybridized to an array or a set of oligonucleotides and/or PNA probes. In this context, the hybridization takes place in the manner described in the following. The set of probes used during the hybridization is preferably composed of at least 10 oligonucleotides or PNA-oligomers. In the process, the amplificates serve as probes which hybridize to oligonucleotides previously bonded to a solid phase. The non-hybridized fragments are subsequently removed. Said oligonucleotides contain at least one base sequence having a length of 13 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 5 ^thto 9^thnucleotide from the 5′-end of the 13-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide. Said PNA-oligomers contain at least one base sequence having a length of 9 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 4^thto 6^thnucleotide seen from the 5′-end of the 9-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide.

In the fourth step of the method, the non-hybridized amplificates are removed.

In the final step of the method, the hybridized amplificates are detected. In this context, it is preferred that labels attached to the amplificates are identifiable at each position of the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.

According to the present invention, it is preferred that the labels of the amplificates are fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer. The mass spectrometer is preferred for the detection of the amplificates, fragments of the amplificates or of probes which are complementary to the amplificates, it being possible for the detection to be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).

The produced fragments may have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The aforementioned method is preferably used for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.

The oligomers according to the present invention or arrays thereof as well as a kit according to the present invention are intended to be used for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism. According to the present invention, the method is preferably used for the diagnosis and/or therapy of important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism.

The method according to the present invention is used, for example, for the diagnosis and/or therapy of solid tumors and cancer

The nucleic acids according to the present invention of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto can be used for the diagnosis and/or therapy of genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.

The present invention moreover relates to a method for manufacturing a diagnostic agent and/or therapeutic agent for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent being characterized in that at least one nucleic acid according to the present invention is used for manufacturing it, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.

A further subject matter of the present invention relates to a diagnostic agent and/or therapeutic agent for diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent containing at least one nucleic acid according to the present invention, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.

The present invention moreover relates to the diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals in which important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism said parameters obtained by means of the present invention may be compared to another set of genetic and/or epigenetic parameters, the differences serving as the basis for a diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals.

In the context of the present invention the term “hybridization” is to be understood as a bond of an oligonucleotide to a completely complementary sequence along the lines of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA, forming a duplex structure. To be understood by “stringent hybridization conditions” are those conditions in which a hybridization is carried out at 60° C. in 2.5×SSC buffer, followed by several washing steps at 37° C. in a low buffer concentration, and remains stable.

The term “functional variants” denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, and which hybridize to the reference sequence under stringent conditions and have an activity similar to the corresponding polypeptide according to the present invention.

In the context of the present invention, “genetic parameters” are mutations and polymorphisms of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. To be designated as mutations are, in particular, insertions, deletions, point mutations, inversions and polymorphisms and, particularly preferred, SNPs (single nucleotide polymorphisms).

In the context of the present invention, “epigenetic parameters” are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. Further epigenetic parameters include, for example, the acetylation of histones which, however, cannot be directly analyzed using the described method but which, in turn, correlates with the DNA methylation.

In the following, the present invention will be explained in greater detail on the basis of the sequences and examples with respect to the accompanying figure without being limited thereto.

Sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism.

FIG. 1

FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.

Sequence ID Nos. 1 to 64

Sequence ID Nos. 1 to 64 show sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. In particular, sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. Sequences having even sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 2, 4, 6, . . . ) exhibit in each case the sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of genes associated with metabolism which are complementary to the preceeding sequences (e.g., the complementary sequence to Seq. ID No.1 is Seq. ID No.2, the complementary sequence to Seq. ID No.3 is Seq. ID No.4, etc.).

Seq. ID No. 65 to seq. ID No. 68 show specific oligonucleotide sequences as used in Example 1.

The following example relates to a fragment of a gene associated with metabolism, in this case, OAT in which a specific CG-position is analyzed for its methylation status.

EXAMPL 1

Methylation Analysis of the Gene OAT Associated with Metabolism.

The following example relates to a fragment of the gene OAT in which a specific CG-position is to be analyzed for methylation. [0058]
In the first step, a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a manner that all cytosines which are not methylated at the 5-position of the base are modified in such a manner that a different base is substituted with regard to the base pairing behavior while the cytosines methylated at the 5-position remain unchanged. [0059]
If bisulfite solution is used for the reaction, then an addition takes place at the non-methylated cytosine bases. Moreover, a denaturating reagent or solvent as well as a radical interceptor must be present. A subsequent alkaline hydrolysis then gives rise to the conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil. The chemically converted DNA (sequence ID 159) is then used for the detection of methylated cytosines. In the second method step, the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Preferably, the DNA is subsequently desulfonated (10-30 min, 90-100° C.) at an alkaline pH value. In the third step of the method, the DNA sample is amplified in a polymerase chain reaction, preferably using a heat-resistant DNA polymerase. In the present case, cytosines of the gene OAT are analyzed. To this end, a defined fragment having a length of 572 bp is amplified with the specific primer oligonucleotides TGGAGGTGGATTTAGAGGTA (Sequence ID 65) and AACCAAAACCCCAAAACAAC (Sequence ID No. 66). This amplificate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bonded to a solid phase, forming a duplex structure, for example GTGTATTCGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 67), the cytosine to be detected being located at position 514 of the amplificate. The detection of the hybridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescently labelled primer oligonucleotides which have been used for the amplification. A hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide takes place only if a methylated cytosine was present at this location in the bisulfite-treated DNA. Thus, the methylation status of the specific cytosine to be analyzed is inferred from the hybridization product. [0060]
In order to verify the methylation status of the position, a sample of the amplificate is further hybridized to another oligonucleotide previously bonded to a solid phase. Said olignonucleotide is identical to the oligonucleotide previously used to analyze the methylation status of the sample, with the exception of the position in question. At the position to be analysed said oligonucleotide comprises a thymine base as opposed to a cytosine base i.e GTGTATTTGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 68). Therefore, the hybridisation reaction only takes place if an unmethylated cytosine was present at the position to be analysed. The procedure was carried out on cell samples from 2 patients, sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample 11 being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. [0061]
From the results (FIG. 1) it can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514. [0062]

EXAMPLE 2

Diagnosis of Diseases Associated with Metabolism

In order to relate the methylation patterns to one of the diseases associated with metabolism, it is initially required to analyze the DNA methylation patterns of a group of diseased and of a group of healthy patients. These analyses are carried out, for example, analogously to Example 1. The results obtained in this manner are stored in a database and the CpG dinucleotides which are methylated differently between the two groups are identified. This can be carried out by determining individual CpG methylation rates as can be done, for example, in a relatively imprecise manner, by sequencing or else, in a very precise manner, by a methylation-sensitive “primer extension reaction”. It is also possible for the entire methylation status to be analyzed simultaneously, and for the patterns to be compared, for example, by clustering analyses which can be carried out, for example, by a computer. [0063]
Subsequently, it is possible to allocate the examined patients to a specific therapy group and to treat these patients selectively with an individualized therapy. [0064]

Example 2 can be carried out, for example, for metabolic diseases, solid tumours and cancer.

TABLE 1


List of preferred genes associated with metabolism
according to the invention

		Genbank Entry No.
	Gen	(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

	DUSP2	NM_004418
	EPHX2	NM_001979
	QDPR	NM_000320
	SGSH	NM_000199
	SHMT2	NM_005412
	SLC7A2	NM_003046
	SLC7A4	NM_004173
	TYMS	NM_001071

Diagrams

FIG. 1[0066]
FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514. [0067]
1 68 1 6149 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 1 gtgttgggat tataggtttg agttattata tttggttttt aagagatata ttagagtttt 60 aattcgaagt atttatgaat gtgattattt ggaaatagag aatttgtagg tgtaattaaa 120 ttaagatgag gttataattg gatttggatg ggttttaaat ttaatgatta gtgtttttat 180 agtaagagtg gagaaaaagt tatatatagg ggagaagata ggggttggat tgatgttttt 240 ataaagttag gaatattaag gatttttaat aattattacg attttggaga gaggtatgga 300 atagattttt cgttagaatt tatagaaaga attaattttg ttaatatttg gattttggat 360 tttagttttt agaattgtaa gaaaatatat tttttttgtt ttaagttatt tagttggtgg 420 taatttgttg ttgtaatttt aggaaataaa tatagatttt ggtattgaaa agtggggtgt 480 tgttatatta atatatataa atatggaagt gtttttatta atagattggg gtgatgggta 540 gaggaagaag tttgaggtat atgatagatt aagtttagat tgttttgaag agaaagtggg 600 tggaaatgtg agtgttttat ttttataaaa aataaaaatt aggtgggtat ggtgatatac 660 gtgtagtttt agttatttgg aaggttgagg taggaggatt atttgagttt aggaggttgt 720 agtgagttat gatcgtatta ttgtatttta gtttgggtga tagagtaagg ttttgttttt 780 tttttttttt ttttttttgg agatagagtt ttgttttgtc gtttaggttg gagtatagtg 840 gtacgatttc gatttattgt aatttttatt ttttgggttt aagcgatttt tttgttttag 900 ttttttgagt agttgggttt atagaagttt attattatat ttagttaatt ttttgtattt 960 ttattagaga tagggtttta ttatgttagt cgggttggtt tggaattttt gattttaggt 1020 gatttgtttt ttttggtttt ttaaagtgtt agaattatag gtatgagtta ttatatttgg 1080 ttagagattt tgttttttaa ataaatatat tttttggaag gatattgttt aacgtagtat 1140 aacgagttat tttagtagtt taagtttgat agaagttgtt cgttgtagaa gaatttattt 1200 ggaaatgaat attaaatatt tttgtattat aaatataata tttataagtt ttttttaaat 1260 gtttttaatt ttttattagt tttttgttgt gaaaatattg ttttaatatt tttaaaatta 1320 atttttattt ttagaaagtt attttgggtt ttatggatat tttagagggt tttattttat 1380 taatatttta ataatatttt gtaagattta agtttttatt tataagtttg ttattagatg 1440 gaggtattga ttagattttt ttgataaatg taataaattt tagataaatt attttttgag 1500 tagtttttta ttaatatatt tgtttagata ttattgtttg ttatgatagg aatgataatt 1560 taaagttata aatttagata tgtaaaaaat gtttttaaat tttttttttg gttaggtgtg 1620 gtggtttata tttgtaattt tagtattttg ggagattgag ggaggattgt ttgggtttag 1680 gagttggaga ttagtttggg taatatagtg agaatttgtg tttattaaaa tattagtatt 1740 aataataata aattttaaaa tataaataaa aataattttt ttttaattgt atttaatttt 1800 tattttaata ttttattttt attttataga agaaatgtta atttagttat tttttttttt 1860 ttttttgaga cggagtttcg ttttgttatt taggttgtag tgtagtgata cgattttggt 1920 ttattgtaag tttcgttttt tgggtttacg ttattgtttt attttagttt tttaggtagt 1980 tgggattata ggtggttttt tttatgttta gttaattttt tgtattttta gtagagatag 2040 ggttttatcg tgttaggatg gtttcgattt tttgattttg tgattcgttt gttttggttt 2100 tttaaagtgt tgggattata ggcgtgagtt atcgcgttcg gttaagtttt agatttttaa 2160 atgaaattat tagttatatt tttgtttggt gtttatattg gtgataaagt tatttttatt 2220 tttttgaagt ttagttttaa agagtagttt gtttgttgta gttttagaaa taaatgtatt 2280 attttttttt ttttaatgtt tttaaatgtt tttgaatttt tttagaagtt gttttgatga 2340 atatagtggt attttttttt ggtagtgttt ttgatggtag aattgtttaa ttatagttga 2400 tttttatgtt tttagttagg ttttttttag ggtaggtgtt ttttaagata taattagtgt 2460 agtgagtgtt tagaagttta gatttagtaa ttagattgtt tagattttaa ttgtaattgt 2520 gttattaatt attagttttg tgtttttgga taaatttttg gaaaatgtgg ataatgttat 2580 tttttaattt agtggatttt tgggagaatt aaaattaaat tgtaaaagaa ttggtttata 2640 ttaagaatta tgtatatagt tatgtaatta gttttttttt tttttttttt tttttgagat 2700 atagttttat tttgttgttt aggttggagt gtagtggtgt gattttagtt tattgtaatt 2760 tttatttttt aggtttaagt aatttttttg ttttagtttt ttgagtagtt gggattatag 2820 gtgtttatta ttatgtttag ttaatttttg tatttttagt agagatgggg ttttgttatg 2880 ttggttaggt tgtttttaat ttttgatttt aaatgattta tttatttggg ttttttaaag 2940 tgttgtgatt ataggcgtga gcgattacgt ttagtttaat tagttatttt ttattgtgtg 3000 atattttagt tattagtttt ggttttttat aattggtaat ttttatgagg ttagattttt 3060 agttttttga gttatttttt taataattta atttttttag ttagaaatat ttgttttttt 3120 tttttttttt tttttttata tatatatata tataaagttt aaatattgat atataatgta 3180 atgatttttt tttaataatt ttcgaagtag tttagtatga aaaatatttg tttttggttt 3240 ttggtagaag ggaaaggtgt gagtgtgata ttttaaggaa ggaggtaggt tttggtgagt 3300 tgttgaatag agaggttttt cggtgtagga attatagggg attttaaggg ataaatttgg 3360 agtgatgggg aaattaaaga tagggtgtta tattaaaaaa ttattttggt cgcgtgtagt 3420 ggtttacgtt tgtaatttta gtattttggg aggtttagtg ggggcggatt gcgtgagttt 3480 aggagtttga gattagtttt tgggtaatat ggtgaaaatt cgtttttatt aaaatataaa 3540 agattagtta ggtttggtag cgtgcgtttg taattttagt tattcgtgag gttgaggcga 3600 atttaggagg tagaggttgt agtgagttaa gatcgcgttt gggtgataag tgcgagattg 3660 ttttaaaaaa aaaaattatt tttaaataga tttatttagg tggtttatgt ttataatatt 3720 tgtgttttgg gaggttaagg ttagaagatt ttttaaggtt aggagtttga gattagtttg 3780 ggtaatatag taagattttt tttttatata aaataaaaat taaaaaaatt agtatggtgg 3840 agtatgtttg tagttttagt tacgtagtta tttgggaagt agagatagga ggatttttta 3900 gttatttggg aggtagagat aggaggattt tttgagatta ggagtttgag gttgtagtga 3960 gatatgattg tattattgta ttttagattg ggtgataaga gcgagatttt attttaaaaa 4020 aaaaaaatat tttaaaatat aatggtttaa aataataatt tattgttttt tttcgttttt 4080 gtggattatg aatttagata gtatggtggg tatggtttgt ttttgtttta tgatgtttgg 4140 ggttttagtt ggagtggttg aaggttgggg attggaatta tttgaggttt tttatttata 4200 tttgtatttg gattgagttt ggaatttgat tgttttaaaa tatttttacg gttgggtgtg 4260 atggtttacg ttcgttattt tcgtattttg agaggttgag tttggttttt tgtttgagtt 4320 tcggagttag ttattcgttt atggttatat agggagattt agtttttatt aaaaaaaaaa 4380 aatataataa tttgttgggc gtggtcgttt gcgtttgtaa ttttagtatt ttgggaggtc 4440 gaggagggag gtttatttga gtttaggagt ttaagattag tttggttaat atggtgaaat 4500 ttcgttttta taaaaaatat aaaattattt ggttgtggag gttttcgttt gtagttttag 4560 ttattgggat ggttggggag ggaggatcgt ttgagttttg atggtcgaga ttatagtgag 4620 ttgtggttac gttattgtat ttagtttggg tgatagagtg agattttttt tttaaaaaaa 4680 aaaaaaaatt ttaaaatatt tttatgagtt tgtgttgggt aggtttaagg gaaatatgtt 4740 tagtaaatcg aaaaatttcg gattatatat aaattatcgg tttcggtagg ttagatttgg 4800 tggatacggg agttagtagc gtgttaggtg ttcgttgatt ttagcgttag tgtttttatt 4860 tacgtttttt attcgttaat tttttttggt ttaggttgcg gtgttttagc gttaggtttc 4920 gtttcgtttt tggttgtcgg ttaatcgtcg tcgattgaga ggcgattatt ggaggaagcg 4980 ggatgggcgg tgttcgcgtc gggtcgttag gggtgcgggg ttggggagga ggtcgttagt 5040 ttacgtttgt ggagtcgata tttagttttt tgcgattatg gttgtgttgg cggtattttt 5100 gcgtagcggc gttcgtagtc gtagtttttt gtttcggagg ttggtgtagg tgagcggggt 5160 tcgtttttat agtatttaga ttcgggatgc gaggagtttt cgtttcggaa gtttttagtt 5220 cgcggtcgtt gcggttttcg cggttcgggc gcgcggttta ggttttagga tagttacgcg 5280 acgggttttg gtttaaaaat cgtttaagtg tttcgataat atttaggatt cgtttatttt 5340 tatagcgcgt ttttattttt aaggtttcgg cgtaattatt ttaatgagcg ttattggtgt 5400 gttaaataag ggtacgtgtt tgggcgggta ggatcgttag gattggcgtt ggttcggttt 5460 gagcggtggg atcggggaga gtttttttgt aggtttgtgt agttgttttc gagatttttt 5520 ttaaaatata tttgtgtgcg ttattgttag gagaggtttt tttttttttt taatataata 5580 gataattatt gggtatataa ggggagaggg tattatgtga ttataataga tgttttttgg 5640 agtagtttga aatttattag ggaaaataaa tgattattta gataatataa taaattatat 5700 ttgatatatg agtaaagttt atatattgag ggcgttttaa gggttgtcgt ttttttgatc 5760 gttgtgttta gggaatatag taggggtaga gttttaaaga atttattttt tatatgcgta 5820 agtaagggag tacgtattat agattgttag gtaaagtttt aggaataggt agagattttt 5880 agggtgtggt tggtgaagtt tgagtttttt aggtcgatgg gggtaataag tttggagatt 5940 tagttatgtt gtgagtatgg atttgatttt agttaagtag ggattgttga tatgtttgtt 6000 tttgttgtaa tggtaggtta ttttagtttt tacgtttggg cgtagaataa tattatttgt 6060 ataagggtgt tggcggtagg agttttgtaa gagattgtaa aagaattagt ttaggatttg 6120 ataattaggg agtgagggtg cgaagttaa 6149 2 6149 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 2 ttggtttcgt atttttattt tttaattgtt aagttttaga ttggtttttt tataattttt 60 tgtaaagttt ttatcgttag tatttttgtg taagtaatgt tattttacgt ttagacgtaa 120 gaattagagt gatttattat tgtaataaaa ataaatatat taataatttt tatttaatta 180 gggttaagtt tatatttata atataattgg atttttaagt ttattgtttt tatcgattta 240 gaaaatttaa gttttattaa ttatattttg aaggttttta tttatttttg aggttttgtt 300 tgataatttg tggtgcgtat ttttttgttt acgtatgtgg agaataaatt ttttgagatt 360 ttgtttttgt tgtgtttttt aaatataacg gttagaagag cgatagtttt tggaacgttt 420 ttagtatgtg agttttgttt atatgttaag tataatttat tgtattattt gagtagttat 480 ttgttttttt tgataaattt taggttgttt taaaaaatat ttgttatgat tatatggtgt 540 tttttttttt tgtatgttta atgattattt attgtattaa aaaagaaaag gaattttttt 600 tgataataac gtatataaat atgttttaaa gaaaatttcg ggagtagttg tataggtttg 660 taaagagatt tttttcgatt ttatcgttta ggtcgggtta gcgttaattt tggcggtttt 720 gttcgtttag atacgtgttt ttgtttgata tattagtaac gtttattaag atgattacgt 780 cgagattttg gaagtagaaa cgcgttgtaa aaataggcga gttttgggtg ttatcggagt 840 atttaggcgg tttttggatt agaattcgtc gcgtgattgt tttggggttt aagtcgcgcg 900 ttcgggtcgc gggagtcgta acggtcgcgg gttggaagtt ttcgaggcgg ggatttttcg 960 tatttcgggt ttgagtgttg tggggacgaa tttcgtttat ttgtattagt tttcggagta 1020 gggggttgcg gttgcgggcg tcgttgcgta gaagtgtcgt tagtatagtt atggtcgtag 1080 agggttgagt atcggtttta taggcgtaga ttagcggttt tttttttaat ttcgtatttt 1140 tagcggttcg gcgcgggtat cgtttatttc gtttttttta atagtcgttt tttagtcggc 1200 ggcgattggt cggtagttaa gggcggggcg gagtttggcg ttgggatatc gtagtttggg 1260 ttaggaaagg ttgacgagtg aaggacgtgg atggagatat tggcgttggg gttaacgagt 1320 atttgatacg ttgttggttt tcgtgtttat taagtttaat ttgtcggggt cggtggttta 1380 tgtgtaattc gagatttttc gatttattga gtatgttttt tttaggttta tttagtataa 1440 atttatgaaa atattttagg attttttttt ttttttggaa aaagggtttt attttgttat 1500 ttaagttgag tgtagtgacg tgattatagt ttattgtaat ttcgattatt agggtttaag 1560 cgattttttt tttttagtta ttttagtagt tgagattata ggcgaaagtt tttataatta 1620 gataattttg tattttttgt ggagacgggg ttttattatg ttggttagat tggttttgaa 1680 tttttggatt taagtgagtt ttttttttcg gttttttaaa gtgttgggat tataggcgta 1740 ggcgattacg tttagtaaat tgttgtattt tttttttttg gtagagatta ggttttttta 1800 tgtggttata ggcgggtggt tgatttcggg gtttaagtag agggttagat ttagtttttt 1860 aaagtgcggg gataacgggc gtgagttatt atatttagtc gtgaaaatat tttgaagtaa 1920 ttaaatttta ggtttagttt agatataaat atgggtaaaa ggttttaggt gattttagtt 1980 tttaattttt aattatttta gttgagattt tagatattat ggagtagaga taagttatat 2040 ttattatgtt gtttgaattt atggtttata gaaacgagag aaaataatgg gttgttattt 2100 taggttatta tgttttggag tatttttttt ttttaagata gggtttcgtt tttgttattt 2160 agtttggagt atagtggtgt aattatattt tattgtagtt ttaaattttt ggttttaggg 2220 gatttttttg tttttgtttt ttaagtagtt aggggatttt tttgtttttg ttttttaagt 2280 agttacgtag ttaggattat aggtatgttt tattatgtta atttttttaa tttttatttt 2340 atatagagaa ggggttttgt tatgttgttt aggttggttt taaatttttg gttttaagag 2400 attttttggt tttggttttt taaagtatag atattatagg tataagttat ttaaataggt 2460 ttgtttgggg gtaatttttt tttttgagat agtttcgtat ttgttattta ggcgcgattt 2520 tgatttattg taatttttgt tttttgagtt cgttttagtt ttacgagtag ttgggattat 2580 aggcgtacgt tgttaagttt ggttaatttt ttgtatttta gtagagacgg gtttttatta 2640 tgttgtttag aggttggttt taaatttttg agtttacgta attcgttttt attaggtttt 2700 ttaaagtatt gggattatag gcgtgagtta ttgtacgcgg ttagggtaat tttttaatat 2760 agtattttgt ttttaatttt tttattattt taggtttgtt ttttaaagtt ttttgtgatt 2820 tttgtatcga agaatttttt tatttaatag tttattaagg tttatttttt tttttggaat 2880 gttatattta tatttttttt ttttattaga ggttaaagat aaatattttt tatattgggt 2940 tgtttcgaga attattgaaa ggaagttatt atattgtatg ttagtgttta aattttgtgt 3000 gtgtgtgtgt gtgagagaga gagagagaga gagaaataga tatttttaat tgaaaaagtt 3060 gaattgttaa agaaatgatt tagaaaatta aaggtttggt tttatagaga ttattagttg 3120 tgagaggtta aagttgatga ttagggtatt atatagtaaa agatgattgg ttaggttggg 3180 cgtggtcgtt tacgtttgta attatagtat tttgggaggt ttaggtgagt ggattatttg 3240 aagttaggag ttaaaagtag tttggttaat atagtaaaat tttattttta ttaaaaatat 3300 aaaaattagt tgggtatggt agtgggtatt tgtgatttta gttatttagg aggttgaggt 3360 aggagaattg tttaaatttg ggaggtggag gttgtagtga attgagatta tattattgta 3420 ttttagtttg ggtaatagaa tgagattgtg ttttaaaaaa agaagaaaaa aaaaaagatt 3480 ggttatatag ttatgtatat agtttttaat atgaattagt ttttttatag tttaatttta 3540 atttttttaa aaatttattg aattagggag tagtattatt tatatttttt agaagtttgt 3600 ttaagggtat aaagttagta gttagtgata tagttgtaat tggaatttag gtagtttggt 3660 tgttaggttt aggtttttag gtatttatta tattagttgt gttttaggag atatttgttt 3720 taggagaaat ttaattagga atatagaagt tagttgtaat tggataattt tgttattaga 3780 ggtattatta ggaaaaagtg ttattatgtt tattaggata gtttttagag aagtttagag 3840 atatttagga gtattgaggg gagaagaata gtatatttat ttttggagtt atagtaggta 3900 agttgttttt taaaattaaa ttttaaaaaa ataagagtag ttttattatt aatatgagta 3960 ttaggtaaaa atgtagttaa taattttatt taagaattta ggatttggtc gggcgcggtg 4020 gtttacgttt gtaattttag tattttagga ggttaaggta ggcggattat aaggttagga 4080 gatcgagatt attttaatac ggtgaaattt tgtttttatt aaaaatataa aaaattagtt 4140 gggtatggag ggggttattt gtagttttag ttatttggga ggttgaggta ggatagtggc 4200 gtgaatttag gaagcggagt ttgtagtgag ttaagatcgt gttattgtat tatagtttgg 4260 gtgatagagc gagatttcgt tttaaaaaaa aaaaagaaag tgattagatt aatatttttt 4320 ttgtgaaata gaaatggagt gttggaatga aaattaaata taattaagag agaattattt 4380 ttgtttgtat tttaaaattt attattatta gtattagtat tttggtagat ataggttttt 4440 attatgttgt ttaggttggt ttttaatttt tgggtttaag taattttttt ttagtttttt 4500 aaagtgttgg gattataggt gtgagttatt atatttggtt aaagaaaaaa tttaaaaata 4560 ttttttgtat atttgaattt gtggttttgg attattattt ttgttatagt aggtaatagt 4620 gtttggatag atgtattaat gaagagttat ttaaaaagtg gtttatttgg gatttattat 4680 atttgttaag gagatttagt taatattttt atttagtggt aaatttgtaa gtggagattt 4740 aggttttgta aagtattatt aaaatattga taaaataaag ttttttgaaa tgtttatgag 4800 atttagagtg gttttttaga agtagaagtt agttttagga atattagagt aatattttta 4860 tagtaggaaa ttagtggaaa attaaaaata tttaagaaaa atttgtgggt attatattta 4920 taatataaag atgtttgata tttattttta agtaagtttt tttataacga ataatttttg 4980 ttaaatttag attattggaa taattcgttg tattacgtta aatagtgttt ttttaaaaga 5040 tatgtttgtt taagggatag ggtttttggt taggtgtggt ggtttatgtt tgtaatttta 5100 gtattttggg aggttaagga gggtagatta tttgaggtta ggagttttag attagttcgg 5160 ttaatatggt gaaattttgt ttttagtaaa aatataaaaa attagttggg tgtggtgatg 5220 ggtttttgta agtttagtta tttaggaggt tgaggtaaga gaatcgtttg aatttaggag 5280 gtggaggttg tagtgagtcg agatcgtgtt attgtatttt agtttgggcg atagagtaaa 5340 attttgtttt taaaaaaaaa aaaaaagaga gagatagagt tttgttttgt tatttaggtt 5400 ggagtgtagt ggtgcgatta taatttattg tagtttttta agtttaagta atttttttgt 5460 tttagttttt taagtagtta agattatacg tgtgttatta tgtttattta atttttattt 5520 tttgtagaga tggggtattt atatttttat ttattttttt tttaaggtaa tttaggttta 5580 gtttattatg tgttttaaat tttttttttt gtttattatt ttaatttatt aataaaggta 5640 tttttatgtt tgtgtatatt aatatggtag tattttattt tttagtatta aaatttgtat 5700 ttgtttttta agattgtagt agtaaattat tattaattgg gtggtttaaa ataaaagaaa 5760 tgtatttttt tatagttttg gaggttggag tttaagattt aggtgttggt aggattggtt 5820 ttttttgtgg gttttaacgg agagtttgtt ttatgttttt ttttaagatc gtggtggttg 5880 ttggaaattt ttggtatttt tggttttgta gaggtattag tttaattttt gttttttttt 5940 ttgtgtgtgg tttttttttt atttttgtta taaggatatt ggttattgga tttagggttt 6000 atttaaattt aattatgatt ttattttaat ttgattatat ttgtaagttt tttattttta 6060 aatagttata tttataggta tttcgagtta agattttaat atatttttta ggggttaggt 6120 gtggtggttt aggtttgtaa ttttagtat 6149 3 5770 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 3 ttttatttta aattgatacg cgttaggcgt taagttttgc gataagtttt taggatatag 60 aagtgaataa gagttttatt tttattttga gaaatttgaa gttgtggaga aaatagattt 120 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Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 8 agaaaaatta ttattattta tagaaaagtt attgagtatt cgttggttag attatataga 60 ggggaaaaaa aaaaaggaaa ttaattgatt tttaaaggtt agtagttaat atagaaattt 120 aatattttga gttgaataaa ttatgtttgt atttagaatt cggttagtta tttataattt 180 ttgtaatgta tattgtttaa tagaatatta gaattaaatt ttagtgatat atagaagagg 240 gataaaatag tagatggggt aagatgatgt aaaaaaagaa tataattttt ttttattttt 300 attataggat ttatgttgag tatttgggaa agatgaaaga gatgtttttt ttaataaaaa 360 atggtaatat ttataatgat ttgttaaatt aaaatgaatg ttattaagta ttgaattgtt 420 atttagtaat ggttatattt taattgtttt aaagaattgt tggtataagt ttttaaaatt 480 ttttgggtgt attggagaag aaatgagtaa agtgaagtaa atgttttttt ttttgaaaat 540 aggaaagttg agaatgaata ttaagatata aattttttgt tttgtgtgga ggaaatagtg 600 aataaaggaa tttttattta aataaagata aattagagta ttaggaaata attttttata 660 agtagtattt tattagtttt cgatatagtt agtttgttta ttgtaaatgg ttaaatatta 720 agcgtataaa ttgtatgcga tattattatt aattttatag tatttgtgga atgttgataa 780 aaatatagga gattagtatt ttgggaagtc gaggtatgta gattataagg tttggagatt 840 gagattattt tagttaatat ggtgaaattt cgtttttatt aaaaatatta aaaattagtt 900 aggcgtggtg gtatgtattt gtagtcgtag ttatttagga ggttgaggta ggaaaattat 960 ttgaattcgg gaggcggagg ttgtagagag ttaagatcgt attattgtat tttagtttgg 1020 gagatagagt aagattttgt tttagaaaaa aaaaaaagaa aagaaaagaa gagaaaagag 1080 aagaaaaaaa gaaatataag agaaggaatt ttttgattag ttaaaaaaat aggggtaagt 1140 ttaatttgta ataggttgtg aagggatgtt aaattttatt tttttgaata tataaaaaaa 1200 gttttttttt ttttaaatta aatatagatt tttattttat attattagtt tttattatta 1260 tttttaaaat gatttaattt tgtttaattt attgttttgt agttacgtga gttatttgat 1320 atattatgaa tgatagtaaa ttgtattttt agaataatat ttaggttgaa aatatatttt 1380 aaaataaata gaaagtttat attatagtga tataaaaggt attaaggata gaatattatt 1440 gtaatgttta ggttagttta gtaatgttat tttgtaatat gttaataaaa tgttaagttt 1500 taataaaaaa ttgattttgt tttattatta ttattattat tttgtatttt ttttagagat 1560 agggatttat tatgttgttt aggttggttt cgaatttttg ggtttaagta atttgtttgt 1620 ttcgattttt taaagtttta 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tttttttttt tttttttttt ttttttttga gatagagttt tattttgtcg tttaggttgg 780 agggtagtgg tgagattttg gtttattgta attttcgttt ttcgggttta agcgattttt 840 ttgttttagt tttttgagtg gttgggatta taagtatatg ttattattac gttcggttaa 900 tttttgtatt tttagtagag acggggtttt attatgttgg ttaggttgat ttcgaatttt 960 tgattttgtg atttatttat gttggttttt taaagtgtta ggatgatagg cgtgagttat 1020 tgtatttagt tatttttttt tttttttttt ttttagagat agggttttgt tgtgttgttt 1080 aggttggagt agagtgtagt ggcgttatta tggtttattg tagtttcgtt tttttcggtt 1140 taggtaattt ttttattttt tgagtagttg ggattatacg tgtatgttat tatgtttggt 1200 taatttttaa aatttttgta ggggttgggt gtgttggttt atgtttgtaa ttttagtatt 1260 ttgggaggtt aaggtgggtg gattatttaa ggttaggagt ttaagattag tttggttaat 1320 atggtgaaat tatattttta ttgaaaatat aaaaaattag ttgggcgtgg tggcgggcgt 1380 ttgtagtttt agttgtttag gaggttgagg taggagaatc gtttgaattt aggaggtaga 1440 ggttgtagtg agttaagatt ttattattgt attttagttt gggtaataag attgaaattt 1500 cgttttataa aaataaaata aaaaaataaa ttttttgtag atagattttg ttatgtttgg 1560 cgaggttggt 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gttttgtagg ggtttttcgt gaagggttgg ttgtgtagta taagtattac 4140 gtttattgta aataaagaaa ttattaatat aggggtttat atagatagaa gattttgttt 4200 tagttaatga taagttttcg gtgggtagtc gggttggtgt agtaatttat agatggtacg 4260 gttatttttg ttttattttt ttttttattg tttttagtgt ggaggttgtg tttttatagt 4320 tgttgtttta tggttataag atggttgcgg tattttcggg ttttatattt atgttttagg 4380 taagaggaag gagaaggagt aaaaggtcga agagtaaaga gtgagagggt tttttttttg 4440 ttagttttat ttttttattt agaaagggaa ttgtttttta gggatttttg ttttaattta 4500 ttggttagat ttgggttata tggttatttt ggatagtaag gaggtttgga aaatcgaggt 4560 ttttttttgt ttgtttgttt tgtttttgag atggagtttt gtttttgttg tttaggttgg 4620 aatgtaatgg tgtaatttcg gtttattgta atttttgttt ttcgggttta agtgattttt 4680 ttgttttagt tttttgagta gttgggatta tgggtttttg ttattatgtt tggttaattt 4740 tttatatttt tagtagagat ggggttttat tatattggtt aggttggttt tgattttttg 4800 attttaggtg atttatttgt tttatttttt taaagtgttg ggattatagg cgtgagttat 4860 agcgtttggt ttttagaaaa ttaagtttta aaattttgtt ggtttttata gtagaaggag 4920 gaaagggaga 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tgggcgaacg agaaggatgt tatgttgata tattgacgtg ttttgttttt ttgtaga 6177 18 6177 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 18 tttgtaagga gatagagtac gttagtgtgt tagtatggta tttttttcgt tcgtttagta 60 ataagtttgt agggaggttt gttacgttcg ttttatttat aaagaaattt aggtttagga 120 aggggaagga ttggtttgga ggtttttatt tagtagtgta ggtaggattt aatttagatt 180 tttggatgat ggttgtttat ttttttgtat ggttttattt tgttttggtt aaggtttttg 240 tttaattaga tatttatgtt ttttttgttt tcgagttatt gttttaggat ggatataggt 300 taaggaaatt tgggtggagt tgaggttttt ttgtttatgg gaatagaatt tgaggaattt 360 atttaaagtt gtgtagttgg gttaagtttt tttttttttt tgtttaaggt tggttatttt 420 tagatagtgg gagttagtga tgatggtaga ggtgttattt tttgtttttt agggggttta 480 aagttttagg tttttgtttt tcgttttata ttttatttag ttggttttat tttaattttt 540 gagtttgtag gggttgggta gtggaagggg ttttaggagt tgaaggtagt attatttttt 600 agttttatcg gttagtaata atgattattt gttatttgag gagggatatt tggttttgtt 660 tttttttttt atttttattt ttattttttt ttatttttaa agttgatgtt ggtaaatttt 720 agatttttga 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(Homo sapiens) 20 gtataatgga taaaagattt gtttcggttg ggtgtagtgg ttaacgtttg taattttagt 60 atttcgggag gttaggcggg cggattattt ttggttagga gttcgagatt agtttgattt 120 ataaggtgaa attttgtttt tattaaaaat ataaaattag tcgggcgggg cgtttgtaat 180 tttagttatt cgggaggttg aggtaggaga atcgtttgaa ttcgggaggc ggaggttgta 240 gtgaatcgag atcgcgttat tgtattttat tttagtttgg gttaaagaga tttcgatttt 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagagaga tttatttcgt tgtagcgtta aaatcgtaag 360 tttagaattt tgtatagacg gtattatttt aaaggttaaa attaggattt tagtaatttt 420 ttattaggtg attttataaa gtgttataaa agttatgatt attattattt tttataattt 480 agtaagcgga gggaagatcg gggagagtcg ggaggtcgtt taggagagga aattattttg 540 ataaaggttg tataattata gaataaaaat taaaaataat tgatagaatt aaaattgatc 600 gtagtttatg tttttggtag taaattttcg tttgagtcga gtaggaataa acgcgttatg 660 tttgaatttt gtgtatatat aatttttttt ttttttgtac ggttcgtttt taaaatgtat 720 ttatcgttat tttttatgga atttttagcg ggttttgggg gtagttagaa ttttttaaac 780 gaggaagttg aggatcggtt tagaattttg aattttgagg ggagtgagat ttgggttttt 840 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atttgagttt tagagtttga 660 ggtggtagtg agttaagatt atattattgt attttagttt aggtaataga gtaagatttt 720 attgaaaaga gagaaaagaa aggagaaaaa gaaaagagat agagagatat agagagatag 780 atagagatag agagagaatt ttttagtagt tattgttaaa gttagaagga aaaaaatgga 840 ggaaaaaaat tagtaaaagg taattaatag gtattatttt ttagaatttt ttaagatgat 900 aacgatttaa ataagaaata aaatgttttt atagtaatat ttttaaatga attgaaaaat 960 ttgtataatt attttttaaa gagtcgggta ttatggttta tgtttgtaat tttagtattt 1020 tgggaggtta aggtaggtgg attatttgag gttaggagtt tgcgattaga ttggttaaaa 1080 tggcgaaatt tcgtttttat taaaaatata tataaaaaaa ttagcggggt atggtggtat 1140 atatttgtag ttttagttat ttaggaggtt gaggtagaat tgtttgaatt taggaggtgg 1200 aggttgttgt gagtttagat tttgttattg tattttagtt tgggtaataa gagcgaaatt 1260 ttttagaaaa aattaattaa ttatttaatt aatttaaaaa atgtaatttt tgtataaaag 1320 tggaggtaaa agatataaaa agatatagtt tataaaataa aatttttatt aagtaaaaga 1380 ttaagaataa gaaggaattg tgaacgggaa attattattg tgtttttatt aaagattaag 1440 attatttttt atatattttt ttaagtataa ttgtgagtta taagagtatt 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ttttttaaag tgttgggatt ataggcgtga gttattgttt taagttagaa 660 gatagaaatt tttaagtttt gttttattag tgaggattta ggttattaag aagtgaaaag 720 atttgtaata tttatttata gtttataaga ttttagtata gtgtttatta aggatggggt 780 tttgttttaa gtgtttgata aatattaatt tatataagtt ttatgatagt tagttttatg 840 agatgaatgt tgttattatg ttttatttaa agacgaggaa atcgaagtat agagagttta 900 ggtaaattgt tcgaggttat atagttggta agtcgttgag ttaggatttg agattaggta 960 gattggtgtt agagtttaga tgttaggtcg ttttttcgta ggatagtttt taggttttta 1020 aaggttgttt tcgtttgggg attagttata gaaaatgatt gatagtaatt ttaggttaga 1080 tttattagtg tgtgtttaaa atttttttta ttaaaatatg tattttttta tatattttta 1140 ttggataata gaaagatatg atgggtcgag tgtagtggat tatgtttttg attttagtat 1200 tttgtgaggt tgaggtggga ggatcgtttg agtttaggag ttcgagattt gtttgggtaa 1260 tatagcgaga ttttgttttt attttaaaaa ttatatagaa agatatgttt atatttattg 1320 tggtttattt attttagatt taggaatttc gtgttttttt gaatatatta tggtattttt 1380 ttttattaat tttttttagg attttgttat gagagggtat agtttatttt ttatatttat 1440 aaaatgtaaa gttgatatga 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aatatattta 120 taggtttttt ttttattttg tgtattgtgt ttgtattttt tttggttttt aaaatgaatt 180 tatgttttgg ttaatgaaat aggattattt cgtatttgaa ggtaagtagc gtaaagaggg 240 gtaaaaaata aatttatttt ttgtttttaa agaaattata gtgagaatat aatgaaatta 300 gtggttaaag agattagatt atttgtgagt tgtgtttgtt tatgttattt ttttgtttgt 360 ttgttttgag acggagtttt gtttttatta tttaggttgg agtgtagtgg tgcgatttcg 420 gtttattgta attttcgttt ttcgggttta agtgattttt tttgttttag tttttcgagt 480 agttgggatt ataggtgttt attattacgt tcggttaatt tttatatttt tagtagagat 540 ggggttttat tatgttggtt agtttggttt ttaatttttg attttaggtg atttatttgt 600 tttggttttt taaagtattg ggattgtagg tatgagttat tgcgtttggt ttttttatgt 660 tatttttagt tataattaga tattgtttat tttgagtaag ttaaaattat attttaaata 720 aaattatgat ttaattttta ttttaggtaa acgtgatttt tttattaaat aggatttgta 780 agagaagata ttttaaattg attgaagtat gagataaata ttttagggag ataagataaa 840 agaaaagata tttagtattt tttgatttaa atataatggg tttgagttag ttgttttata 900 atttataatt tgaatagttt aaattttgga taggtttttt ttgaagtttt agtagaaatg 960 ttttttgaaa tattgttttt ttgatgtttg ggtggttgtt attgtttgga ggtaaaaagt 1020 ttggaggcgg ggggtgagaa atgatttttt tttagtttta taattgagta aatttgttta 1080 tagtaaaagt attttatgta atggttaagg tttaggttag attataaaat ttatttagta 1140 gtattattat attattttag tttttttttg ttatattttt atatattgac gtgtaaatta 1200 atatgatttt tttataaaaa gtatatttga tgtgtttata ttttatttaa tttagtattg 1260 gattgatttt ggtgagaaga gttaagattg atttgttaag tatattttgg agtgtataag 1320 ttaataggta gaaagttaat tacgtatatt tttatttttt aatagattat tattggataa 1380 agttaataaa tatagataat gatagtgttg gaggaaaata attgaaatat taggaattag 1440 tgttttagtt aatttatagg tagagatagt ttattaatgt attttagaaa aagtgaagga 1500 aatttaggaa tttgggaaga agtaaagttg agagaaggtg aaatagtaaa ttaatggtta 1560 tatttagtaa ttaaatagat gtgttatttt tggtagttaa taaatatttt gtggggttag 1620 aaatttattg tattgtgaaa taaattttta aatataatta tagaaattgt agtttttgga 1680 aggtaggagt ttaaattagt taggcgatag taatagagaa aaggtaattt tttttttaat 1740 tttagagttg aaataatgag gtaggataat gttatataat aaagagtaag aaggggttta 1800 gtgttgtggt atgcgtttgt aattttgcgt ttgtaaagat taggattgtt agaaagttat 1860 ttagatattt ttttttatgg ttttattatt gtgtatttta aaaataagaa ttattgatat 1920 gagtgaaagg aataaagtta aagaagttaa aagttttatt agaagtgtgt gtgtattatt 1980 tttgagtgag agtttgttga aaagataagt ttattattta ttttttttgg agagttataa 2040 aaagattttt tgttaaatgg gatttttttt tgatagagat tacgaataat ttatttaaat 2100 tttaaaaaat aaaaattagg tcgggtatga tggtttatat ttataatttt tagtattttg 2160 ggaggttagg gtgggaggat tatttgaagt taggagttta aagttagttt gggtaatatg 2220 agatttttat ttttataaaa ataaatatta aaaaattagt taggtatggt ggtatatatt 2280 tgaggttata gtgagttatg attgtgttat tgtattttag tttaaaaaaa aaaattaatt 2340 aaaaaaaagt aaaattttaa ttttttaaat atataggaat tatttatgtg aaagaggaaa 2400 aacgttttaa aaattttaga ttttaatagt gtaaattaaa atttttattt attatttata 2460 aagttaaaat attgttagta aagattttat aaaaggagtt atatagaaat gtaaataata 2520 aaataatatt ttaaatgtat ttaatttttt tttatgaaat aagaattatg aaaattataa 2580 attttattta aaaataaaaa tataattttg atatttattt taaagtttta tattaaatat 2640 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ttattataaa gtttttcggt taagagaaat taagttagaa gattcgaaat gagtggggtt 3540 aattggagat tcgaaggagg tcgaggttat ttttttcgtg ttttgtaatt taataggtat 3600 tttttgagta tatcgatttc gtttggcgta tagttgggtt cgggggcggg aggtgggtgt 3660 cgagaagggg gaagtttata cggattttgg cgtgatttcg gttcgtgtcg tttttttcga 3720 ggttaggaac ggaatgtagg gcgcggaggc gaagtaaagg tttttcggtt tttttggcgt 3780 tttttatttc gttttgggtg gttcggtttg gttcgttttg tttttcggtt tcgttttagt 3840 tttattcgcg ttttatttcg gttcgttcgg gaggttttat cggtttttga gaagcgttag 3900 atagtacgcg ggagacggcg gcgagtattt tttttatgaa gtataggtag tggcggtagc 3960 ggcgattttt tataatttag gaggtacgac gcgggtgttt ttaagttttt tttaggtgtt 4020 ttagtagacg ttacgtttta gtcgtatcgc ggcgtgatag agtcgtaata acgttatgcg 4080 ttgcgtcggg tcgcgggtta attagaacgg cgtttagggg gtgtttcgtt ttcgttaaag 4140 gtttgaggtt gtttattggg tattagcgtt agagagggag gggttgaggg tttttttcga 4200 cgttacgtcg cgggcgggtg aggaggcggg gtttgatagc gtttgcgtgg gaaggtgggg 4260 ttttcgtttt tagggcgtcg cgggaaagga gtttttttag atttcgtttt gttgattatc 4320 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gttttttgat atttgtttgg gtgagtatgt aggtagaaag gagattaaat 1200 aaatacgtat ttagtattta gggaatatta ggtattgtta tatatggaag aatcggatgt 1260 aaattttttt ttgttattta ttagttatat aattttaggt aagtgatttt aaattttaag 1320 ttagtttttt tttttgaaaa ataggggtaa aaatttttat attataaggt tatcgtaagt 1380 ttaaaatgag gttgtttagg taaaattata tggtttaggg ttatgggatg agtttatata 1440 ttagtaataa tttttttttt tttttagtag gaagtaatag aagggtatgt gttttgagag 1500 tttttttttg ttgggttttt gttgggatta attattaatt tttttttttt ttttgtgttt 1560 aaagattagt gttagaaata aggttataat tttagattaa ggttatgatt ttagtgtttt 1620 ttttttttat ttttaatttt tggtgggtag ttttgtgagg tttgatggtt tgaagttttt 1680 gtttggttgt tataggaagg attaaaggta tttataggaa aggagaaatg ttgtgagtga 1740 gttgtagtgg ggtaaagaga gggttaggga ttttagaatt gtgagaggta gatatagaga 1800 tataagttag cgattttaag tatagtttta ttgatatttt agttaatatt aatatttttt 1860 ttaattagcg gtgaggggtt tatggggcgg ggtttgaagg tggattgagg gtttcggttt 1920 tttgttgagt gatgatagtt ttatgttttt tttagtggtt ttgtagtttt tttatttttt 1980 agttttagtc gttattttta gtggggtagg aggagttttt attgttattt ggagattttg 2040 gtagggattt gtttattcga tttatatatt agtagggatt tcggcgttgt ttttgggagg 2100 agcggtattg gagagagagg tatataggtt aggagtgagg ttagaggttt ttagtaggag 2160 aatgagaggg gatatttgag tttgaggatg taaaaatatt tgagcgtttt ttcgggggtt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttgagatgg agtttcgttt tgtcgttttg 2280 gttggaatgt attggtatga tttttgttta ttgtaatttt tattttttag gtttaagtaa 2340 tttttttgtt ttagtttttt gagtagttgg gattataggt gtatgttatt atatttggtt 2400 aatttttgta atttttaaaa tagatggggt tttattaggt tgtttaggtt gattttgaat 2460 ttttgatttc gtgatttatt agttttggtt ttttaaagtg ttgggattat aggtatgaga 2520 tatcgtattc ggtttagtgt tttttttttt tagttttttt tttttaatta ataaattgtg 2580 tgtattttgt tagtttggaa tagtagtttt taaagtgacg tttttaaatt cggattacga 2640 gggaatatgt tagaaatgta tattgttagg ttttatttta tattttttga attaggaagg 2700 ttgtcggtgg ggtttagtta tttgtgtggt ataagttttt cggaggattt tgatgtttta 2760 agtttaagag ttattgagtt agggtatttt ttaagtgggt ttttttttat agtgtgtggt 2820 tgattatttt 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ttggttagtt cggaaaggga tggaggcgat ttttgttgga gtcgtttata gtttgatttt 1440 tattgagttt tttatagagg gggtatagtt tggtgagtat agttgggttt gggtatggtt 1500 tggattagta gtttttattg ttatatttga aataggcgtt aggtggaggt gttttgttag 1560 gaggtttttg tatggagttg tggttttgtg ggtttgtagg gtaaaggtaa gtattggaaa 1620 ttgttttttt tttttatttt ttttattata attgttaaag attttgaagg ttaaattaag 1680 aaggttttat tgtggggttt gagggtcgtt attaattttt tgaagtttgc gttaaatatt 1740 atggtagatt gggtgaggaa ttgaaggttt gaaatagtgg ttttttttgg gttggttggg 1800 tttaggttgg taattttttt atggttttag ttaaataaga gagaaaaagg gttgggtttt 1860 tgttaggatt ttcggtgatt tttgaaagtt ttttatagtt tattatttta tgggtatttt 1920 ttttgagttt tgtaaggaga tatataatta tgaggttttg atggttgtgt ttagaggttt 1980 tgttttgata attttagtgg gggttttggt tgggaattgt ttttgtgtta gtaggttggg 2040 taggagtttg atgatgaatt gtattagtat gtatttgagt tagggtttaa gtacggtgtt 2100 ggttttttgg ggtgagggtg gaagagaaga taagtagttg ttatgttagg ttagtttata 2160 agattgagta aggtattgaa tttttttaat ataagaggta ggattttttg gaaatgaatt 2220 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1380 atttatttta tttttagtga tattttaatt tttttttata aatggggaga ttgaagttta 1440 gaaagattga tagaattatt tagagttatt ttttagaatt atagatagaa tttaaaattt 1500 cggtttttaa attcgggatt tttcgtttga ttttttcggt tttgaaattt ttttggaaga 1560 ggttgttatt gatgttggtt atttttaagt ttattttaat tttgttttaa gattttttat 1620 atagtgttaa gtatagtaat ttgaatatag aaggtttttt aatagaaatg cgtttatagg 1680 attttgatat attatggttt atttagtttt tgattttttt tagttgaatt aaatatttag 1740 attttatttt aaaaatttta agaatagttg atttaggggt gtgtgtttgt agttttattt 1800 ttttttgagg ttgaggtaga aggatttttt gagtttaggt gttcgaggtt aatttgggta 1860 atatagttga gattttattt gtaagtgaaa agaaataaaa attttaagaa tgagtattag 1920 taatgttttg aatgatatta ttttgttttt agttattttt taataaaatt gtttaaattt 1980 aataggtaaa tgaatttttt attttatttt tgttggaaat tagttgtgta gataattttt 2040 atataaaata agaatgttga atttagataa tttttgatat tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt ttttttagcg atatagtttc gttttgtagt ttaggttgga gtgttggtgg 2160 tatagatcgt ggtttattgt agtttagaat ttagggttta agagattttt ttattttagt 2220 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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatgt atttatgtat gtatgtatat 3960 gttggtttaa tttaatttgt tgtgaatatt ttaaagttat tataagttaa tatttttttt 4020 ttagtttttt tgttttttat ttttgtttat gataaatttg atttatagaa gttttagata 4080 tttgtggtta aataaaagat tttaggttgg gtatagtggt ttatattttt aattcgaaaa 4140 ttttgggagg tcgtggtggg tagattgttt gagtttagag ggatggatag tttttttgtt 4200 ttttgtttta tgtttagttt ttggtagttt tttttgattt ggtttttttg tttttggttt 4260 ttgttttata gttgtagttg ttttatagta ttgtgtttga tggtattgga ttgtggtagg 4320 tgtttaataa atatttagtg tttagtaggt atttagttaa tatatagtgt attagttttg 4380 gaaagagttt tatttttatt gattggttgg ttgattgatt gtttgattga tagggtatta 4440 ttttgttgtt taggttggtt ttaaattttt gggtttaagt gattttttcg ttttagtttt 4500 ttgagtagtt gggggttata ggtataaatt attatatttg atttaagatt tttatttttt 4560 tttttttttt tatagagatt atgttgttta ggttggtttt taatttttcg gtttaagcga 4620 tttttttatt ttggtttttt aaggtgttgg aattatagat gtgagttatt acgtttggtt 4680 attttttttt ttttgagatt gggttttttt ttgtttttta ggttggagta tagtggtata 4740 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taggttatag ttttagtttg gtggttgttg atttattgat 60 tttgttataa tattggaggt taggattttg ggtaaatgaa agagaaaagg aggtagattg 120 agaatgtgat tttataattt tagttttttt aggggttggg tggttagtgt ttttttagta 180 gttttttttc gtaggaagta gaattgtttg taacgttgat ggagttatag taatttttat 240 tttattgagt ttaggatttg tagagttatt aagattttgg agtaattgtt tttagtattt 300 aatagaagtt gttaaaagga ttatgggtta atttatttta gatatttttt ttagatgttt 360 ttatggaaag ttagggttta aattagtggt ttttattttt ggtagtattt gagttttatt 420 tggggaattg ttagaaagtg aaatttggac ggtatttata ttagtttagt ttttgggtgg 480 ggtttggata ttagtatttg tagaagtttt ttaggtggtt ttggtgtagt taggttggaa 540 attattgatt taattaatag aaatgttagg ttgggatttt tttcgaggta tttttttagg 600 ataggttgtg tatgatagtt ttatagtgtt agggttttaa gatgttttaa tggtttaggt 660 attggtttta attttcgttt tttcgttttt tttgagattt taataaattt tatagggttg 720 ggtataatgg tttacgttta taattttagt attttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttga gattgtttta 840 ttttgtcgtt taggttggag tgtagtggta taattttggt ttattataat ttttattttt 900 taggtttaag cgattttttt gtttaagttt tttaagtagt tgggattata ggtttttgtt 960 attatgttta gttaattttt gtatttttag tagagatagg gttttattat gttggttagg 1020 ttggtttcga atttttgatt acgtgatttt tttattttag ttttttaaag tgttgggatt 1080 ataggcgtga gttattgcgt ttggttaatt ttagtagttt tagaggttaa ggtaagagga 1140 ttttttgagt ttaggagttc gagattagtt tgggtaatat ggtaagattt tattttaatt 1200 taagaaaaaa attaaaatat ttaagtttta taatttttat atttttattg attgattaag 1260 tgtagataat gatatttgtt tttttaattt tattaggttg ttattaggag aaatgaagta 1320 ataaatgaga aattgttttg taaattgtta acgttatgta aatattgtta tttagagtgt 1380 gtttttaggt gcgggaggta tagttgttat ttgttggaga ttatttttga agtaatattt 1440 ttagtgttat gggttagatg ggaattggta tagatatttt aatttagaag gtagttttta 1500 ttgttttata agtaggtgcg ttttttgggg tggtagtttg gtattggtta ttttaatttt 1560 aatttgtgta ggaggtatta tagtaaatga gtagagagag tttaggggat ttgaagggaa 1620 gtggagggtt atttggagag ggagggaatt aaggattttt tgtgggttgg ggtttttttg 1680 aggatttagg gagtaattgt taaggagttt tagtagggat ttaagagtta tgtaagagta 1740 aaaagaggta aattattaag gaaattagtg aagttagtat tggaataata gagaggggat 1800 atagtagtgt agtatgggtt ttggttttag gaagttgttt gattggggta gataggatta 1860 gttttttaga agatagttat ttatattagt taggtagtta tgatttagtg ttatttattt 1920 gaggtttagg ttgtatgagg ggttgggggt gggatggata gagtattggt tgggtattag 1980 gattaggttg gagttttggt ttaaaatttt attataattt gatattgggt aagatggttt 2040 atttgtggta ttttaggttt ttgttttgta aagaggagtt tgggtgtata tttagatgga 2100 ttgtgagtat agtttgagtt tgttttgtcg aggtgttgag gtttgggaga ttggggtgag 2160 tagttgtggt ttagggaagg ttggtaagtt gggttttaga tgagagggga tgtttggtta 2220 ggtagaggtg agtggagaag gtagggtaag gaagggaata tgagcggcga ataaatggag 2280 tggatatggt gggggtagag gatggtggga agtggttttg ttgcggttag agtggaggaa 2340 gagataagtg ggaaagagtg gagtcgatta tagaaggttt cggaaattag gtagagatgt 2400 ttaaattggt ttttttagga aggagagggt tatgaaggga tttagggaag ggttatgata 2460 tgattatgtt gtattttagt aggattaatg tgatttggtg tttagaatga tttggatggt 2520 atgaggttag gagtcgagga ggatagttag aagatttttg 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tattttgtta tttttgttta aattgataaa ttataagtta 1320 atattgagtt ttatatttgt gttttggtga atggttaatt gaaatatagg atattttaga 1380 ttaatattat ataagagttt tgtgaggatt aggagaggaa gttaaatata gttattttgt 1440 tattgttttt aggaattaag gaataatatt tagatgtata ttaattttaa aattttagtt 1500 agattaaaag tttatgaaaa atattaagtg tttgaaagat aggtagttat aattaggagt 1560 taggattttg agtttaaata gggaaataga tttaatatta tattaaataa attaatttgt 1620 ttagatttta agatatacgt tttttattaa aatgggtttt gtatgaaata gtattatata 1680 ggtcgggcgt gatggcgtat atttgtaatt ttagtatttt gggaggttaa ggcgggcgga 1740 ttatgaggag gttaggattt taagattagt ttggttaata tggtgaaatt ttatttttat 1800 taaaaatgta aaaattagtt gggtgtggtg gtttatattt gtaattttag ttgttaggga 1860 ggttgatata ggagaattat ttgaatttag gaggtagagg ttgtagtgtt gagattatgt 1920 tgttgtattt tagtttgggt aatagagtga gattttattt taaaaaaaaa aaaaaaaaga 1980 aatagtatta tatagtttta agggattatt attaagttat gatgtgtgta tttaaaatta 2040 gtatttattg atttatttat gttgaatata aatttttaat tgttgggatt ttatttggtg 2100 tgttaattat tatgatttta 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taataggatt tttagattaa atagtatttt tttttaattg 240 tgtaaaggac gattttatgt ttttgaaaat tttatagtaa gttagttagc gggggttatt 300 taaaaattaa gaaatgtgtt tagttgtagt gagggagtaa aggtaatatt attttttagt 360 ttttttatta aagttttttg gttagagata ttgtagggta gggtgtagga gtatttgaat 420 tttatgttaa gttttatcgt tgtgtatttt ttttggaaga aattttgatt tttttattgt 480 ttggtttttt tattttttat aatatattta tattgttata cgtatgtata aaattaattg 540 ataagtattt attgaggata taatatatgt aaggtattgc ggtattggtt gttgtgaagg 600 tgagtagaag taatttattt agaaaatgta aattggtatt gtaaaaatat agatgtagat 660 gtgatagttt tgagtagtat tatttttatt tattttattt ttttattttt aattgttagt 720 ttttttataa aaataaatag aagtgttttg gaagttattt tgggggtgta agatgataga 780 gaaggtatag taaaaatatt ttagttttgg ggttt 815 57 762 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 57 gagttttatt ttttgttaaa ttagattatt taattagaaa tagtattaga ttttatagta 60 tgttaaattt aattgtgaat tgtatatgta agggatttag gttgtatgtt tttaatgaaa 120 atttaattag tggaaaaatt gttttttacg aaatcggatt ttggtgataa aaaggttggg 180 gatttcgatt tatggtattt gtggagaatt ttatggttag tatatttggt aaataaattt 240 aaaagaaaac gaattttatt ttattaaaaa tgaatatatt tatatgtata aatataagtt 300 ggaatgggga aatttatgta gttggaaaat agttattaaa tgtaaataaa tataattata 360 gtgtagatta aggattagta atttttttag aggtaataat aatattaatg ttgtatattt 420 attttttttt tttttttttt ttttttttga gacggagttt ggttttgtcg tttaggttgg 480 agtgtagtgg ttcgatttcg gtttattgta acgttcgttt tttaagttta tgttattttt 540 ttggtttagt ttttcgagta gttgggatta taggtattcg ttattacgtt tggcgaattt 600 tttgtatttt tagtagagac ggggttttat cgtgttagtt aggatggttt ggattttttg 660 atttcgtgat ttatttattt cggtttttta aagtgttggg attatagata tgagttatcg 720 cgtttagttt tatttatttt tttttaaaag ttagatttta gg 762 58 762 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 58 tttagggttt gatttttgaa aagggatgaa tagggttggg cgcggtggtt tatgtttgta 60 attttagtat tttaggaggt cgaggtgggt ggattacgag gttaggagat ttagattatt 120 ttggttaata cggtgaaatt tcgtttttat taaaaatata aaaaattcgt taggcgtggt 180 ggcgggtgtt tgtagtttta gttattcgag aggttgagtt aggagaatgg tatgaatttg 240 ggaggcggac gttgtagtga gtcgagatcg ggttattgta ttttagtttg ggcgatagag 300 ttaggtttcg ttttaaaaaa aaaaaaaaag aaagaaaagg atgaatgtat aatattggtg 360 ttattattat ttttgaaaag attgttagtt tttaatttat attataatta tgtttgttta 420 tatttaatag ttatttttta attatataaa tttttttatt ttaatttatg tttgtgtatg 480 taaatatgtt tatttttaat gagataagat tcgttttttt ttgaatttgt ttattaagtg 540 tgttagttat aaaatttttt ataaatgtta tagatcgggg tttttagttt ttttgttatt 600 agggttcggt ttcgtggaag atagtttttt tattagttag atttttatta ggagtatgta 660 atttagattt tttgtatgta tagtttataa ttgggtttgg tatattgtag aatttaatgt 720 tgtttttgat tggataattt gatttgatag gaggtggagt tt 762 59 645 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 59 ttgtagtttt tgttaggttt tgttagtcgg ggcgagggtt gggatgattt tggcggttta 60 tgtttgtgtg ggttgttttt ttcgttgtga attttgtatt tgtttcgtaa gtttttattt 120 aggtagattt tttgggtata aagggtgttt gtttagtagt cgggtatgag ttgtttcgat 180 gggcgaagga ggttgtttat tttatagttg gagagggttt tttttgttta gtgggcgatt 240 tgggttacgg ttaagttgtt attagttagt ttcgtttgaa aattattttt ggtttcgtgg 300 gggatttaag cggtttaagc gagggttttt ttgagcgtcg gagtttatag gtttcgtttt 360 gtttcgaaag ttttcgtaat cgaggcggag gcgatcgagt tttcgatttt tttagaacgt 420 tgttataaga aggggaacgt cggaatagtg tattatcggg cggcggtcgg ggcggcggta 480 ggagggcggg cggggggtag ggtttcgggg gattgggcgg gttatggcgg aggacggcga 540 ggaggcggag ttttatttcg cggcgtttta tataagtggg tagtggtcgg attgcgcgta 600 gatattgatt tttagcgttt cggttcggtt atggcgtttt ttagg 645 60 645 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 60 tttggagggc gttatggtcg agtcgaggcg ttgaaggtta gtgtttgcgc gtagttcggt 60 tattgtttat ttatatagag cgtcgcgaag tggaatttcg ttttttcgtc gtttttcgtt 120 atggttcgtt tagtttttcg gagttttgtt tttcgttcgt ttttttgtcg tcgtttcggt 180 cgtcgttcga tgatgtattg tttcgacgtt tttttttttg tggtaacgtt ttaggagagt 240 cgggggttcg gtcgttttcg tttcgattgc gggggttttc gggataaggc gagatttgtg 300 agtttcggcg tttaggggaa ttttcgtttg gatcgtttga gttttttacg gggttagaag 360 tggtttttaa gcggaattag ttggtggtaa tttggtcgta gtttagatcg tttattgggt 420 agagagggtt ttttttaatt gtggaataga taattttttt cgtttatcgg agtagtttat 480 gttcgattgt tgagtaggta ttttttgtat ttagggagtt tatttgagtg aaaatttgcg 540 ggataaatgt agggtttata gcgggagggg tagtttatat aggtataggt cgttaggatt 600 attttaattt tcgtttcggt tggtaaggtt tggtaggaat tgtag 645 61 3586 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 61 tttagaattg ataggaaaaa taatatggtt atagtattgg agagagagag aaaggagaga 60 ggagaaagga gagagagaga aaggagagag gagagagata gaggagagag agagaggata 120 gagggggaga gagagagagg agagagatag aggagagaga gagaggatag aggggagaga 180 gagggagagg gagagagagg gagagagagg gagagagaga gagagagagg gagagagaga 240 gagaaagaga gagagaggga gagagagaga gagagttttt taacgtgaga tattttataa 300 tgaataaatc gtttagttat taaagtgtag ttatttttag gagttgttag aaaatgtatt 360 aggattatta gagaaaagta ttagaaagat tttttttttt gatacgttgt ataaaataaa 420 taaattgaaa tttaataata tataaggaat tttgtttggg ttttgaagat aatttttttt 480 tgtatattga gttttttaaa tattgtagtt tttttatggt ttttgagaaa taattatttt 540 aaatttataa tttttaatat tttttaaatt tttttaataa gagaagtttt atttttgata 600 ttatttttta tttgtaaggt taaattatta ttagttttgt agtttattaa ttgggtttgt 660 ttaggttagg tattattatt attaatttta ttgttaatat tttaattata agaattaaat 720 tattaatggt gaatagagtt ttttatttta atataggttt attttattgg tgggatacga 780 gttaattcga aagaaaagtt agttatgtgt tttttagagg atgaaagttt aagataaaga 840 ttaaaagtgt ttgatgttgg aggtgggagt ggtattatat aggttttagt taagatatgt 900 gataattatt gtagtagtag ttggaaagag aaatttgtga ttttaattag ttagtttttg 960 tagattttgt gaggattaga ggaagaatgt ttttggttgt tttgtattgt ttgttgtgga 1020 gtttttagat tttcgttggt tattttttta gagtttgtgt tttttttaag aatttgatgg 1080 agaaggaatg ttgtttatcg tggagcgggg ataggagttt ttgtggttag tttttaggta 1140 gaggtttttg ttagaatatt tttttgttta atgtattatt tgggttttaa ttttttttta 1200 taggggtgga tgatcgggag tcgtggtttt tcgtttttta taataggatt tgttagtgtt 1260 ttggtaattt tatgggattt aattgtggaa attgtaagtt tggtttttgg ggattaaatt 1320 gtatagagag acgatttttg gtgagaagaa atattttcga tttgagtgtt ttagagaagg 1380 ataaattttt tgtttatttt attttagtaa agtatattat tagtttagat tatgttattt 1440 ttatagggat ttatggttaa atgaaaaatg gattaatatt tatgtttaac gatattaata 1500 tttatgattt ttttgtttgg atgtattatt atgtgttaat ggatgtattg tttgggggat 1560 ttgaaatttg gagagatatt gattttgttt atgaagtatt agtttttttg ttttggtata 1620 gatttttttt gttgcggtgg gaataagaaa tttagaagtt gataggagat gaaaatttta 1680 ttattttata ttgggattgg cgggatgtag aaaagtgtga tatttgtata gatgagtata 1740 tgggaggtta gtattttata aattttaatt tatttagttt agtattattt tttttttttt 1800 ggtaggtaag atatgttaga tatacgatgt tagagtaggg aggaatttta ataattattt 1860 ttttaggtag ggtataaatt ttttatttga atatttattg tagtttttat taaggataga 1920 aatggtgttt tgttaagaat ttttaatgta ttttgtattt tttttttata gtatatttta 1980 gatatttgtg taattatttg tttaatgatt tttattaggt ttttaaattg taatgaatag 2040 agtatttgat ttattattgt attttttaga atatagtatg gtgtttttaa aaatggtaat 2100 agtgtattat gtattttgtg aattgaataa atgagtgaat gaatgaatat ttggatgatt 2160 aaaaaaataa atgatatata ttaatgtttt tgaaaaataa aattattatt tataatagga 2220 tttatatggt gtataaatta aaaatgtaaa tttttggttt tattttagat taattggtta 2280 gaatttttag gagagagttt cgagaaggta taatttatta aatgtttatg gtgatttttt 2340 taattaggaa tgtttgggaa ataattattg gattagattt ttatttttga aagtatgaag 2400 attttgaggt ttaaataggt aaataatgaa gatggttaat atttattgaa tatttagtat 2460 gtgtaaattt cgtggtaagt gtttttgtgt attcgtttat tttatgtttt tattagtttt 2520 tttttatttt agaggttata aaggtattag gtaatttgta taagattata tagttaataa 2580 gtagtaaaaa aaaaattata tttatttttt aatagtttag ttgtatgatt attgtatttt 2640 atttttaagg atgtgattgt tgtgatattt ttagttaaag gatttggttt attttgtttt 2700 attttttttt taggttgtat tagaagttag tttttttttt tagtttttga aaattttaga 2760 taaaatatga agtattatta tttggaattg aatttttatt ttatttattt gaatttttta 2820 ttttgaatta ggggtaaatg gtaattaaag aaatatgtgt ttaattattt attattttaa 2880 aattatatgt taaaggaatg tttttttgtt tgttttttaa aaatttttaa tatagtattt 2940 ttgattagta atgttttatg aaattaagtt taatatgtga atgggatggg aagaattttg 3000 tatttaattt tttataattt gtagttttga aatgtagatg gtttttttcg tttaattaag 3060 tttgtatttt attttaatgg agtttattga agtttattta aaaaatagtt attgtataat 3120 ttttggtgtt attagttagt tatttattaa atgtaatggg ttttgtgtag gaaaggttag 3180 aaaaaatgtg tttggaaaaa aatttatttt aataagtttt tagatttttt attttaattt 3240 ataatgtgta aatttttatt tagtttttat attttttgtt tttgtttaaa aaattgttag 3300 gattggatat gggattttta gttagttatg atgttttatt taattatgtg gtttaatttg 3360 atttagaaag gttggaggat tgtttaaatt attaaaataa gttgtaatat ttataggaaa 3420 ttttaataga tagatatata ttaattttta attatatgag atgtgtaata ttagatgtta 3480 tttataattg tatgagtatt atttttttaa ttatttatta attgtcgagt agaatttttt 3540 tttttttttt tttttatgaa tgtgtttaat tttaatattt tttaga 3586 62 3586 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 62 tttagagagt attaaaattg aatatattta tgaagagaga aaaaggaaaa agttttgttc 60 gataattaat aagtaattag gaaaataata tttatatagt tgtggatagt atttggtatt 120 atatatttta tgtaattaaa aattaatgtg tatttattta ttaagatttt ttgtggatgt 180 tgtagtttat tttggtaatt tagatagttt tttaattttt ttgggttaag ttaagttata 240 tagttaaata aagtattata attgattgaa aattttatgt ttaattttgg tagtttttta 300 aataggaata gaggatataa gagttagatg agagtttgta tattatagat taaggtagga 360 ggtttgaaag tttattgaaa tagatttttt tttaagtata ttttttttag ttttttttgt 420 ataaaattta ttatatttgg taaatagttg attaataata ttagaaatta tatagtggtt 480 attttttaaa tgaattttag tagattttat tgggatgggg tataaatttg gttgggcgga 540 gaaggttatt tatattttaa aattgtagat tgtgggaaat tgagtgtaag atttttttta 600 ttttatttat atattgggtt taattttata gagtattgtt agttaaaagt gttgtattag 660 aaatttttgg aagataggta gaaaagtatt tttttaatat atggttttaa aatgataaat 720 aattaagtat atattttttt ggttattatt tgtttttaat ttagaatgaa aaatttagat 780 agatgaaata ggaatttaat tttaaatagt aatgttttat attttattta aagtttttaa 840 ggattgagaa agaaagttaa tttttaatgt agtttaaaga aaaagtgaga tagaatgaat 900 tagatttttt agttaaagat attatagtag ttatattttt ggaaatagga tatagtggtt 960 atatagttgg attattagag aataaatgtg attttttttt tgttgtttat tagttgtatg 1020 attttatata agttatttga tatttttata atttttaaaa tagggaaaga ttgataagag 1080 tatgaaatga acgaatgtat aaaaatattt gttacggggt ttgtatatgt tagatgttta 1140 atgaatatta gttattttta ttatttattt gtttaagttt taggattttt atatttttaa 1200 aaatgaagat ttaatttaat aattattttt taaatatttt tgattaaaag aattattata 1260 gatatttagt aaattgtgtt ttttcgggat ttttttttga agattttgat taattagttt 1320 gggataaggt taggaatttg tatttttaat ttgtatatta tatgaatttt gttgtgaata 1380 ataattttat tttttagaga tattagtgta tattatttgt ttttttaatt atttagatat 1440 ttatttattt atttatttat ttaatttata aaatatataa tgtattattg ttatttttaa 1500 aggtattata ttatgttttg ggaaatgtaa taatgaatta agtattttgt ttattgtagt 1560 ttagaaattt agtagaagtt attaaataaa taattatata aatatttaaa gtgtgttata 1620 aaggaaaaat ataagatata ttgagagttt ttaatagggt attatttttg tttttgatgg 1680 gggttgtaat gagtgtttag gtgagaagtt tatattttgt ttgaagaagt gattgttaag 1740 gttttttttt attttgatat cgtatattta gtatatttta tttgttaaga ggagaagaat 1800 gatgttgggt tgagtaagtt aggatttgtg gggtgttgat tttttatgta tttatttgtg 1860 taaatgttat atttttttgt atttcgttag ttttaatatg gaatagtgaa gtttttattt 1920 tttgttagtt tttggatttt ttgtttttat cgtaataaga agagtttatg ttaaggtaga 1980 aaagttggtg ttttatgggt aaaattaatg tttttttaga ttttagattt tttaagtagt 2040 gtatttattg atatataata atgtatttag ataaagaggt tataaatatt gatgtcgtta 2100 aatatgggtg ttgatttatt ttttatttgg ttataggttt ttatggggat gatatagttt 2160 gagttgatgg tatgttttgt taaagtgagg taggtaaaaa atttgttttt ttttggggta 2220 tttaaatcga agatgttttt ttttattaag agtcgttttt ttgtgtagtt tggtttttaa 2280 aagttaaatt tgtagttttt atagttgaat tttatgaagt tgttagagta ttggtaggtt 2340 ttattataaa agacggaagg ttacgatttt cggttattta tttttgtgaa gggaaattga 2400 ggtttaagtg gtgtattgga tagaaggata ttttgatagg aatttttgtt tgaaagttgg 2460 ttatagggat ttttgttttc gttttacggt ggatagtatt ttttttttat taggttttta 2520 gaggagatat aggttttagg gaaatggtta gcggaggttt ggaaatttta tagtaggtag 2580 tataaaatag ttaggagtat ttttttttta gtttttataa ggtttgtagg aattggttaa 2640 ttggagttat agattttttt ttttagttat tattatagtg attattatat gttttggttg 2700 agatttatat aatattattt ttatttttag tattaaatat ttttagtttt tattttaagt 2760 ttttattttt tgaaaagtat atgattgatt tttttttcga attggttcgt attttattag 2820 tgggataggt ttatgttaaa gtgaaaaatt ttatttatta ttaatagttt aatttttatg 2880 gttagaatat taataataag gttagtaata ataatgtttg atttaagtaa atttagttaa 2940 tagattataa aattaatgat gatttgattt tgtaaatgag aggtagtgtt aggaatagag 3000 ttttttttat taagaaagtt taggaagtat taaagattat gggtttaagg tagttatttt 3060 ttagagatta taaagaggtt ataatgtttg aagaatttaa tatgtagaga gagattgttt 3120 ttagagttta gatagaattt tttatatgtt attgaatttt agtttgttta ttttatataa 3180 cgtattagaa aaaaaaattt ttttgatatt tttttttgat aattttgatg tattttttga 3240 taatttttaa ggatagttgt attttgataa ttgggcgatt tgtttattgt gggatatttt 3300 acgttaaaga gttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttat 3420 tttttttttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttatt tttttttttt 3480 tttttttgtt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 ttttttttaa tgttgtagtt atattgtttt ttttattaat tttaga 3586 63 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 63 ggtagcgacg atttttggag gtggatttag aggtataatt aagtcgcgcg gcgtattagg 60 gtttaagggt atggggtttt cgtagttgtg gttggggtag agttggggtt gttttttttt 120 ttaggagtat aggcggcggt ttagttttac gtttttcgtt tttagttata ttcggttcgc 180 gtagtggggg gtttaataga tttttttttt tcgggtttta gttttttcgt tagtaagggc 240 ggataaggat ttttttcgtt tcgttagagg aggcgatcga ggggtttgag tttaggtata 300 ggtcggcggg tttaggaggc gcgaggcgga tcgaattcgc gggaggagta aagatttttg 360 atgcgcggtc ggagggcggg gcggaggacg ggatttacgc gattggtatt ttgtttttcg 420 ttttagttaa tgagcggcga gggtgttttg ggggcggggt agaattagtt tttaagttgt 480 agtgacgttt cggcgttatt gttgcgtttt atagacgtcg cgtgtattcg gttgttttta 540 ggcgttgtta ggtatcgttt gggcgtcgtt gttttggggt tttggttcgg gtttggtcgg 600 64 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 64 tcggttaggt tcgaattaga gttttaggat agcggcgttt agacggtatt tgatagcgtt 60 tgaggataat cgggtatacg cggcgtttat gaagcgtaat agtgacgtcg gagcgttatt 120 gtaatttaaa ggttgatttt gtttcgtttt taagatattt tcgtcgttta ttggttgggg 180 cggagggtag gatattaatc gcgtgggttt cgtttttcgt ttcgtttttc ggtcgcgtat 240 taaggatttt tgtttttttc gcggattcga ttcgtttcgc gttttttgag ttcgtcggtt 300 tgtatttgag tttaggtttt tcggtcgttt tttttggcgg gacgagaaga gtttttgttc 360 gtttttgttg acgagaagat tgaggttcga aaaggaaaag tttgttgggt tttttattgc 420 gcgggtcggg tgtggttgga ggcgagagac gtgaggttgg atcgtcgttt gtgtttttgg 480 agggagggat agttttagtt ttgttttagt tatagttgcg ggagttttat gtttttgaat 540 tttgatgcgt cgcgcggttt agttgtgttt ttgagtttat ttttaaaagt cgtcgttgtt 600 65 20 DNA Artificial Sequence OAT primer 65 tggaggtgga tttagaggta 20 66 20 DNA Artificial Sequence OAT primer 66 aaccaaaacc ccaaaacaac 20 67 18 DNA Artificial Sequence OAT detection oligomer 67 gtgtattcgg ttgttttt 18 68 18 DNA Artificial Sequence OAT detection oligomer 68 gtgtatttgg ttgttttt 18

Claims

1. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 bases in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the sequences taken from the group of Seq. ID No.1 to Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto.

2. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 base pairs in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to a sequence according to one of the genes DUSP2 (NM_—004418), EPHX2 (NM_—001979), QDPR (NM_—000320), SGSH (NM_—000199), SHMT2 (NM_—005412), SLC7A2 (NM_—003046), SLC7A4 (NM_—004173), TYMS (NM_—001071) and sequences complementary thereto.

3. An oligomer, in particular an oligonucleotide or peptide nucleic acid (PNA)-oligomer, said oligomer comprising in each case at least one base sequence having a length of at least 9 nucleotides which hybridizes to or is identical to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the Seq ID Nos 1 to 64 according to claim 1 or to a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2 and sequences complementary thereto.

4. The oligomer as recited in claim 3;

wherein the base sequence includes at least one CpG dinucleotide.

5. The oligomer as recited in claim 3;

characterized in that the cytosine of the CpG dinucleotide is located approximately in the middle third of the oligomer.

6. A set of oligomers, comprising at least two oligomers according to any of claims 3 to 5.

7. A set of oligomers as recited in claim 6,

comprising oligomers for detecting the methylation state of all CpG dinucleotides within one of the sequences according to Seq. ID Nos. 1 through 64 according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto.

8. A set of at least two oligonucleotides as recited in claim 3,

which can be used as primer oligonucleotides for the amplification of DNA sequences of one of Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or sequences of a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto and segments thereof.

9. A set of oligonucleotides as recited in claim 8,

characterized in that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.

10. Use of a set of oligomer probes comprising at least ten of the oligomers according to any of claims 6 through 9 for detecting the cytosine methylation state and/or single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a chemically pretreated genomic DNA according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2.

11. A method for manufacturing an arrangement of different oligomers (array) fixed to a carrier material for analyzing diseases associated with the methylation state of the CpG dinucleotides of one of the Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, wherein at least one oligomer according to any of the claims 3 through 5 is coupled to a solid phase.

12. An arrangement of different oligomers (array) obtainable according to claim 11.

13. An array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences as recited in claim 12,

characterized in that these are arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.

14. The array as recited in any of the claims 12 or 13,

characterized in that the solid phase surface is composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold.

15. A DNA- and/or PNA-array for analyzing diseases associated with the methylation state of genes,

comprising at least one nucleic acid according to one of the preceeding claims.

16. A method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters for the diagnosis and/or therapy of existing diseases or the predisposition to specific diseases by analyzing cytosine methylations, characterized in that the following steps are carried out:

a) in a genomic DNA sample, cytosine bases which are unmethylated at the 5-position are converted, by chemical treatment, to uracil or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior;

b) fragments of the chemically pretreated genomic DNA are amplified using sets of primer oligonucleotides according to claim 8 or 9 and a polymerase, the amplificates carrying a detectable label;

c) Amplificates are hybridized to a set of oligonucleotides and/or PNA probes according to the claims 6 and 7, or else to an array according to one of the claims 12 through 15;

d) the hybridized amplificates are subsequently detected.

17. The method as recited in claim 16,

characterized in that the chemical treatment is carried out by means of a solution of a bisulfite, hydrogen sulfite or disulfite.

18. The method as recited in one of the claims 16 or 17,

characterized in that more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified.

19. The method as recited in one of the claims 16 through 18,

characterized in that the amplification of several DNA segments is carried out in one reaction vessel.

20. The method as recited in one of the claims 16 through 19,

characterized in that the polymerase is a heat-resistant DNA polymerase.

21. The method as recited in claim 20,

characterized in that the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).

22. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are fluorescence labels.

23. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are radionuclides.

24. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are detachable molecule fragments having a typical mass which are detected in a mass spectrometer.

25. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the amplificates or fragments of the amplificates are detected in the mass spectrometer.

26. The method as recited in one of the claims 24 and/or 25, characterized in that the produced fragments have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.

27. The method as recited in one of the claims 24 through 26, characterized in that detection is carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).

28. The method as recited in one of the claims 16 through 27, characterized in that the genomic DNA is obtained from cells or cellular components which contain DNA, sources of DNA comprising, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, and all possible combinations thereof.

29. A kit comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of the claims 3 through 5.

30. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of the claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the diagnosis of metabolic disease, solid tumours and cancers.

31. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the therapy of metabolic disease, solid tumours and cancers.

32. A kit, comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of claims 3 through 5.