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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberUS20040067491 A1
Publication typeApplication
Application numberUS 10/240,454
PCT numberPCT/EP2001/004016
Publication date8 Apr 2004
Filing date6 Apr 2001
Priority date6 Apr 2000
Also published asDE60126593D1, DE60126593T2, EP1268857A2, EP1268861A2, EP1272670A2, EP1274865A2, EP1274865B1, EP1274866A2, EP1278893A2, EP1360319A2, EP1370685A2, EP2014776A2, EP2014776A3, US7195870, US20030082609, US20030148326, US20030148327, US20030162194, US20040076956, US20050282157, WO2001076451A2, WO2001076451A3, WO2001076451A9, WO2001077164A2, WO2001077164A3, WO2001077164A8, WO2001077375A2, WO2001077375A3, WO2001077375A8, WO2001077376A2, WO2001077376A3, WO2001077376A8, WO2001077377A2, WO2001077377A3, WO2001077377A8, WO2001077378A2, WO2001077378A3, WO2001081622A2, WO2001081622A3, WO2001081622A8, WO2001092565A2, WO2001092565A3, WO2001092565A8
Publication number10240454, 240454, PCT/2001/4016, PCT/EP/1/004016, PCT/EP/1/04016, PCT/EP/2001/004016, PCT/EP/2001/04016, PCT/EP1/004016, PCT/EP1/04016, PCT/EP1004016, PCT/EP104016, PCT/EP2001/004016, PCT/EP2001/04016, PCT/EP2001004016, PCT/EP200104016, US 2004/0067491 A1, US 2004/067491 A1, US 20040067491 A1, US 20040067491A1, US 2004067491 A1, US 2004067491A1, US-A1-20040067491, US-A1-2004067491, US2004/0067491A1, US2004/067491A1, US20040067491 A1, US20040067491A1, US2004067491 A1, US2004067491A1
InventorsAlexander Olek, Christian Piepenbrock, Kurt Berlin
Original AssigneeAlexander Olek, Christian Piepenbrock, Kurt Berlin
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: USPTO, USPTO Assignment, Espacenet
Diagnosis of diseases associated with metabolism
US 20040067491 A1
Abstract
Chemically modified genomic sequences of genes associated with metabolism, to oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting the cytosine methylation state of genes associated with metabolism which are directed against the sequence are disclosed. In addition, a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism is disclosed.
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Claims(32)
1. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 bases in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the sequences taken from the group of Seq. ID No.1 to Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto.
2. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 base pairs in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to a sequence according to one of the genes DUSP2 (NM004418), EPHX2 (NM001979), QDPR (NM000320), SGSH (NM000199), SHMT2 (NM005412), SLC7A2 (NM003046), SLC7A4 (NM004173), TYMS (NM001071) and sequences complementary thereto.
3. An oligomer, in particular an oligonucleotide or peptide nucleic acid (PNA)-oligomer, said oligomer comprising in each case at least one base sequence having a length of at least 9 nucleotides which hybridizes to or is identical to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the Seq ID Nos 1 to 64 according to claim 1 or to a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2 and sequences complementary thereto.
4. The oligomer as recited in claim 3;
wherein the base sequence includes at least one CpG dinucleotide.
5. The oligomer as recited in claim 3;
characterized in that the cytosine of the CpG dinucleotide is located approximately in the middle third of the oligomer.
6. A set of oligomers, comprising at least two oligomers according to any of claims 3 to 5.
7. A set of oligomers as recited in claim 6,
comprising oligomers for detecting the methylation state of all CpG dinucleotides within one of the sequences according to Seq. ID Nos. 1 through 64 according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto.
8. A set of at least two oligonucleotides as recited in claim 3,
which can be used as primer oligonucleotides for the amplification of DNA sequences of one of Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or sequences of a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto and segments thereof.
9. A set of oligonucleotides as recited in claim 8,
characterized in that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
10. Use of a set of oligomer probes comprising at least ten of the oligomers according to any of claims 6 through 9 for detecting the cytosine methylation state and/or single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a chemically pretreated genomic DNA according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2.
11. A method for manufacturing an arrangement of different oligomers (array) fixed to a carrier material for analyzing diseases associated with the methylation state of the CpG dinucleotides of one of the Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, wherein at least one oligomer according to any of the claims 3 through 5 is coupled to a solid phase.
12. An arrangement of different oligomers (array) obtainable according to claim 11.
13. An array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences as recited in claim 12,
characterized in that these are arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
14. The array as recited in any of the claims 12 or 13,
characterized in that the solid phase surface is composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold.
15. A DNA- and/or PNA-array for analyzing diseases associated with the methylation state of genes,
comprising at least one nucleic acid according to one of the preceeding claims.
16. A method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters for the diagnosis and/or therapy of existing diseases or the predisposition to specific diseases by analyzing cytosine methylations, characterized in that the following steps are carried out:
a) in a genomic DNA sample, cytosine bases which are unmethylated at the 5-position are converted, by chemical treatment, to uracil or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior;
b) fragments of the chemically pretreated genomic DNA are amplified using sets of primer oligonucleotides according to claim 8 or 9 and a polymerase, the amplificates carrying a detectable label;
c) Amplificates are hybridized to a set of oligonucleotides and/or PNA probes according to the claims 6 and 7, or else to an array according to one of the claims 12 through 15;
d) the hybridized amplificates are subsequently detected.
17. The method as recited in claim 16,
characterized in that the chemical treatment is carried out by means of a solution of a bisulfite, hydrogen sulfite or disulfite.
18. The method as recited in one of the claims 16 or 17,
characterized in that more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified.
19. The method as recited in one of the claims 16 through 18,
characterized in that the amplification of several DNA segments is carried out in one reaction vessel.
20. The method as recited in one of the claims 16 through 19,
characterized in that the polymerase is a heat-resistant DNA polymerase.
21. The method as recited in claim 20,
characterized in that the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
22. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are fluorescence labels.
23. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are radionuclides.
24. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are detachable molecule fragments having a typical mass which are detected in a mass spectrometer.
25. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the amplificates or fragments of the amplificates are detected in the mass spectrometer.
26. The method as recited in one of the claims 24 and/or 25, characterized in that the produced fragments have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
27. The method as recited in one of the claims 24 through 26, characterized in that detection is carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
28. The method as recited in one of the claims 16 through 27, characterized in that the genomic DNA is obtained from cells or cellular components which contain DNA, sources of DNA comprising, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, and all possible combinations thereof.
29. A kit comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of the claims 3 through 5.
30. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of the claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the diagnosis of metabolic disease, solid tumours and cancers.
31. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the therapy of metabolic disease, solid tumours and cancers.
32. A kit, comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of claims 3 through 5.
Description
    FIELD OF THE INVENTION
  • [0001]
    The levels of observation that have been well studied by the methodological developments of recent years in molecular biology, are the genes themselves, the translation of these genes into RNA, and the resulting proteins. The question of which gene is switched on at which point in the course of the development of an individual, and how the activation and inhibition of specific genes in specific cells and tissues are controlled is correlatable to the degree and character of the methylation of the genes or of the genome. In this respect, pathogenic conditions may manifest themselves in a changed methylation pattern of individual genes or of the genome.
  • [0002]
    The present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA-oligomers and to a method for the diagnosis and/or therapy of diseases which have a connection with the genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism and, in particular, with the methylation status thereof.
  • PRIOR ART
  • [0003]
    Metabolism is the sum of chemical changes that occur in living organisms. The thousands of different chemical reactions are carried out simultaneously by a cell are closely coordinated. A variety of control mechanisms regulate the activities of key enzymes in response to changing conditions in the cell. One very common form of regulation is a rapidly reversible feedback inhibition exerted on the first enzyme by the final product of that pathway. A longer lasting form of regulation involves the chemical modification of one enzyme by another. Combinations of regulatory mechanisms can produce major and long lasting changes in the metabolism of the cell. Common metabolic diseases are diabetes, cancer, hyperlipidaemia and atherosclerosis. Cancer, for example, is a multistep disease with a multifactorial aetiology. For some genotoxic carcinogens the sequence of events leading to tumour formation is well understood from exposure, to metabolism and ultimately to specific mutations in transformation-associated genes. In the widespread field of metabolic diseases, enzymes, which play a central role in glucose metabolism, like Human hexokinase, are contributing to diseases like pre-non-insulin-dependent diabetes mellitus (Diabetes 1995 March;44(3):347-53 Identification of four amino acid substitutions in hexokinase II and studies of relationships to NIDDM, glucose effectiveness, and insulin sensitivity. Echwald S M, Bjorbaek C, Hansen T, Clausen J O, Vestergaard H, Zierath J R, Printz R L, Granner D K, Pedersen O). Other metabolism based disorders are peroxisomal disorders (Enzyme 1987;38(1-4):161-76 Genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. New findings in clinical and biochemical studies. Schutgens R B, Wanders R J, Nijenhuis A, van den Hoek C M, Heymans H S, Schrakamp G, Bleeker-Wagemakers E M, Delleman J W, Schram A W, Tager J M, et al.). Those disorders are a group of genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. Alcohol-induced oxidative stress, another metabolic disease, is linked to the metabolism of ethanol (J Biomed Sci 2001 January-February;8(1):59-70, Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. Zima T, Fialova L, Mestek O, Janebova M, Crkovska J, Malbohan I, Stipek S, Mikulikova L, Popov P). Three metabolic pathways of ethanol have been described in the human body so far. Some other described metabolic diseases are hereditary tyrosinemia type I, which is the most severe metabolic disease of the tyrosine catabolic pathway mainly affecting the liver (FASEB J 1999 December;13(15):2284-98 Cyclin B-dependent kinase and caspase-1 activation precedes mitochondrial dysfunction in fumarylacetoacetate-induced apoptosis. Jorquera R, Tanguay R M), methylmalonic acidemia (Hum Gene Ther 1994 September;5(9):1095-104 Overexpression of human methylmalonyl CoA mutase in mice after in vivo gene transfer with asialoglycoprotein/polylysine/DNA complexes. Stankovics J, Crane A M, Andrews E, Wu C H, Wu G Y, Ledley F D) or propionic acidemia (Hum Genet 1991 May;87(1):41-4 Genetic heterogeneity of propionic acidemia: analysis of 15 Japanese patients. Ohura T, Miyabayashi S, Narisawa K, Tada K Department of Pediatrics, Tohoku University School of Medicine, Sendai, Japan).
  • [0004]
    The high incidence of metabolic diseases has given rise to the development of methods of treatment and diagnosis targeted specifically to metabolic pathways. The further development of such methods would have considerable benifits. For example, cancer where current therapies may have unwanted side effects or fail to provide effective treatment. Conventional methods such as chemotherapy, which with their massive side effects, sometimes result in unacceptable morbidity or lead up to the death of the patient. In practice, the unwanted side effects associated with cancer therapies frequently limit the treatment which could help a patient.
  • [0005]
    5-methylcytosine is the most frequent covalent base modification in the DNA of eukaryotic cells. It plays a role, for example, in the regulation of the transcription, in genetic imprinting, and in tumorigenesis. Therefore, the identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Moreover, the epigenetic information carried by 5-methylcytosine is completely lost during PCR amplification.
  • [0006]
    A relatively new and currently the most frequently used method for analyzing DNA for 5-methylcytosine is based upon the specific reaction of bisulfite with cytosine which, upon subsequent alkaline hydrolysis, is converted to uracil which corresponds to thymidine in its base pairing behavior. However, 5-methylcytosine remains unmodified under these conditions. Consequently, the original DNA is converted in such a manner that methylcytosine, which originally could not be distinguished from cytosine by its hybridization behavior, can now be detected as the only remaining cytosine using “normal” molecular biological techniques, for example, by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing which can now be fully exploited. In terms of sensitivity, the prior art is defined by a method which encloses the DNA to be analyzed in an agarose matrix, thus preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts with single-stranded DNA), and which replaces all precipitation and purification steps with fast dialysis (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec. 15 ;24(24):5064-6). Using this method, it is possible to analyze individual cells, which illustrates the potential of the method. However, currently only individual regions of a length of up to approximately 3000 base pairs are analyzed, a global analysis of cells for thousands of possible methylation events is not possible. However, this method cannot reliably analyze very small fragments from small sample quantities either. These are lost through the matrix in spite of the diffusion protection.
  • [0007]
    An overview of the further known methods of detecting 5-methylcytosine may be gathered from the following review article: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
  • [0008]
    To date, barring few exceptions (e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 March-April;5(2):94-8) the bisulfite technique is only used in research. Always, however, short, specific fragments of a known gene are amplified subsequent to a bisulfite treatment and either completely sequenced (Olek A, Walter J. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 November;17(3):275-6) or individual cytosine positions are detected by a primer extension reaction (Gonzalgo M L, Jones P A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):2529-31, WO Patent 95/00669) or by enzymatic digestion (Xiong Z, Laird P W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):25324). In addition, detection by hybridization has also been described (Olek et al., WO 99/28498).
  • [0009]
    Further publications dealing with the use of the bisulfite technique for methylation detection in individual genes are: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 June;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 March;6(3):387-95; Feil R, Chariton J, Bird A P, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio M C, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5′ region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.
  • [0010]
    An overview of the Prior Art in oligomer array manufacturing can be gathered from a special edition of Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), published in January 1999, and from the literature cited therein.
  • [0011]
    Fluorescently labeled probes are often used for the scanning of immobilized DNA arrays. The simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5′-OH of the specific probe are particularly suitable for fluorescence labels. The detection of the fluorescence of the hybridized probes may be carried out, for example via a confocal microscope. Cy3 and Cy5 dyes, besides many others, are commercially available.
  • [0012]
    Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-TOF) is a very efficient development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse thus transporting the analyte molecule into the vapor phase in an unfragmented manner. The analyte is ionized by collisions with matrix molecules. An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions are accelerated at different rates. Smaller ions reach the detector sooner than bigger ones.
  • [0013]
    MALDI-TOF spectrometry is excellently suited to the analysis of peptides and proteins. The analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). The sensitivity to nucleic acids is approximately 100 times worse than to peptides and decreases disproportionally with increasing fragment size. For nucleic acids having a multiply negatively charged backbone, the ionization process via the matrix is considerably less efficient. In MALDI-TOF spectrometry, the selection of the matrix plays an eminently important role. For the desorption of peptides, several very efficient matrixes have been found which produce a very fine crystallization. There are now several responsive matrixes for DNA, however, the difference in sensitivity has not been reduced. The difference in sensitivity can be reduced by chemically modifying the DNA in such a manner that it becomes more similar to a peptide. Phosphorothioate nucleic acids in which the usual phosphates of the backbone are substituted with thiophosphates can be converted into a charge-neutral DNA using simple alkylation chemistry (Gut I G, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. Apr. 25, 1995;23(8):1367-73). The coupling of a charge tag to this modified DNA results in an increase in sensitivity to the same level as that found for peptides. A further advantage of charge tagging is the increased stability of the analysis against impurities which make the detection of unmodified substrates considerably more difficult.
  • [0014]
    Genomic DNA is obtained from DNA of cell, tissue or other test samples using standard methods. This standard methodology is found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • DESCRIPTION
  • [0015]
    The object of the present invention is to provide the chemically modified DNA of genes associated with metabolism, as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting cytosine methylations, as well as a method which is particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The present invention is based on the discovery that genetic and epigenetic parameters and, in particular, the cytosine methylation pattern of genes associated with metabolism are particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism.
  • [0016]
    This objective is achieved according to the present invention using a nucleic acid containing a sequence of at least 18 bases in length of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. In the table, after the listed gene designations, the respective data bank numbers (accession numbers) are specified which define the appertaining gene sequences as unique. GenBank was used as the underlying data bank, which is located at the National Institute of Health at the internet address http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • [0017]
    The chemically modified nucleic acid could heretofore not be connected with the ascertainment of genetic and epigenetic parameters.
  • [0018]
    The object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or oligomer for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, containing at least one base sequence having a length of at least 13 nucleotides which hybridizes to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. The oligomer probes according to the present invention constitute important and effective tools which, for the first time, make it possible to ascertain the genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The base sequence of the oligomers preferably contains at least one CpG dinucleotide. The probes may also exist in the form of a PNA (peptide nucleic acid) which has particularly preferred pairing properties. Particularly preferred are oligonucleotides according to the present invention in which the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th-9th nucleotide from the 5′-end of the 13-mer; in the case of PNA-oligomers, it is preferred for the cytosine of the CpG dinucleotide to be the 4th-6th nucleotide from the 5′-end of the 9-mer.
  • [0019]
    The oligomers according to the present invention are normally used in so called “sets” which contain at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides of the sequences of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. Preferred is a set which contains at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.
  • [0020]
    Moreover, the present invention makes available a set of at least two oligonucleotides which can be used as so-called “primer oligonucleotides” for amplifying DNA sequences of one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto, or segments thereof.
  • [0021]
    In the case of the sets of oligonucleotides according to the present invention, it is preferred that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
  • [0022]
    The present invention moreover relates to a set of at least 10 n (oligonucleotides and/or PNA-oligomers) used for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). These probes enable diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The set of oligomers may also be used for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.
  • [0023]
    According to the present invention, it is preferred that an arrangement of different oligonucleotides and/or PNA-oligomers (a so-called “array”) made available by the present invention is present in a manner that it is likewise bound to a solid phase. This array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice. The solid phase surface is preferably composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold. However, nitrocellulose as well as plastics such as nylon which can exist in the form of pellets or also as resin matrices are possible as well.
  • [0024]
    Therefore, a further subject matter of the present invention is a method for manufacturing an array fixed to a carrier material for analysis in connection with diseases associated with metabolism in which method at least one oligomer according to the present invention is coupled to a solid phase. Methods for manufacturing such arrays are known, for example, from U.S. Pat. No. 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protecting groups.
  • [0025]
    A further subject matter of the present invention relates to a DNA chip for the analysis of diseases associated with metabolism which contains at least one nucleic acid according to the present invention. DNA chips are known, for example, for U.S. Pat. No. 5,837,832.
  • [0026]
    Moreover, a subject matter of the present invention is a kit which may be composed, for example, of a bisulfite-containing reagent, a set of primer oligonucleotides containing at least two oligonucleotides whose sequences in each case correspond or are complementary to an 18 base long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto), oligonucleotides and/or PNA-oligomers as well as instructions for carrying out and evaluating the described method. However, a kit along the lines of the present invention can also contain only part of the aforementioned components.
  • [0027]
    The present invention also makes available a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with the cycle cell by analyzing cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, including the following steps:
  • [0028]
    In the first step of the method, a genomic DNA sample is chemically treated in such a manner that cytosine bases which are unmethylated at the 5′-position are converted to uracil, thymine, or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior. This will be understood as ‘chemical pretreatment’ hereinafter.
  • [0029]
    The genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from usual sources of DNA such as cells or cell components, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, or combinations thereof.
  • [0030]
    The above described treatment of genomic DNA is preferably carried out with bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which results in a conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil or to another base which is dissimilar to cytosine in terms of base pairing behavior.
  • [0031]
    Fragments of the chemically pretreated DNA are amplified, using sets of primer oligonucleotides according to the present invention, and a, preferably heat-stable polymerase. Because of statistical and practical considerations, preferably more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified. The amplification of several DNA segments can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. Usually, the amplification is carried out by means of a polymerase chain reaction (PCR).
  • [0032]
    In a preferred embodiment of the method, the set of primer oligonucleotides includes at least two olignonucleotides whose sequences are each reverse complementary or identical to an at least 18 base-pair long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). The primer oligonucleotides are preferably characterized in that they do not contain any CpG dinucleotides.
  • [0033]
    According to the present invention, it is preferred that at least one primer oligonucleotide is bonded to a solid phase during amplification. The different oligonucleotide and/or PNA-oligomer sequences can be arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice, the solid phase surface preferably being composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold, it being possible for other materials such as nitrocellulose or plastics to be used as well.
  • [0034]
    The fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly detectable label. Preferred are labels in the form of fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer, it being preferred that the fragments that are produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The detection may be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
  • [0035]
    The amplificates obtained in the second step of the method are subsequently hybridized to an array or a set of oligonucleotides and/or PNA probes. In this context, the hybridization takes place in the manner described in the following. The set of probes used during the hybridization is preferably composed of at least 10 oligonucleotides or PNA-oligomers. In the process, the amplificates serve as probes which hybridize to oligonucleotides previously bonded to a solid phase. The non-hybridized fragments are subsequently removed. Said oligonucleotides contain at least one base sequence having a length of 13 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide from the 5′-end of the 13-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide. Said PNA-oligomers contain at least one base sequence having a length of 9 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th to 6th nucleotide seen from the 5′-end of the 9-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide.
  • [0036]
    In the fourth step of the method, the non-hybridized amplificates are removed.
  • [0037]
    In the final step of the method, the hybridized amplificates are detected. In this context, it is preferred that labels attached to the amplificates are identifiable at each position of the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • [0038]
    According to the present invention, it is preferred that the labels of the amplificates are fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer. The mass spectrometer is preferred for the detection of the amplificates, fragments of the amplificates or of probes which are complementary to the amplificates, it being possible for the detection to be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
  • [0039]
    The produced fragments may have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The aforementioned method is preferably used for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.
  • [0040]
    The oligomers according to the present invention or arrays thereof as well as a kit according to the present invention are intended to be used for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism. According to the present invention, the method is preferably used for the diagnosis and/or therapy of important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism.
  • [0041]
    The method according to the present invention is used, for example, for the diagnosis and/or therapy of solid tumors and cancer
  • [0042]
    The nucleic acids according to the present invention of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto can be used for the diagnosis and/or therapy of genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.
  • [0043]
    The present invention moreover relates to a method for manufacturing a diagnostic agent and/or therapeutic agent for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent being characterized in that at least one nucleic acid according to the present invention is used for manufacturing it, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.
  • [0044]
    A further subject matter of the present invention relates to a diagnostic agent and/or therapeutic agent for diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent containing at least one nucleic acid according to the present invention, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.
  • [0045]
    The present invention moreover relates to the diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals in which important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism said parameters obtained by means of the present invention may be compared to another set of genetic and/or epigenetic parameters, the differences serving as the basis for a diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals.
  • [0046]
    In the context of the present invention the term “hybridization” is to be understood as a bond of an oligonucleotide to a completely complementary sequence along the lines of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA, forming a duplex structure. To be understood by “stringent hybridization conditions” are those conditions in which a hybridization is carried out at 60° C. in 2.5×SSC buffer, followed by several washing steps at 37° C. in a low buffer concentration, and remains stable.
  • [0047]
    The term “functional variants” denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, and which hybridize to the reference sequence under stringent conditions and have an activity similar to the corresponding polypeptide according to the present invention.
  • [0048]
    In the context of the present invention, “genetic parameters” are mutations and polymorphisms of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. To be designated as mutations are, in particular, insertions, deletions, point mutations, inversions and polymorphisms and, particularly preferred, SNPs (single nucleotide polymorphisms).
  • [0049]
    In the context of the present invention, “epigenetic parameters” are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. Further epigenetic parameters include, for example, the acetylation of histones which, however, cannot be directly analyzed using the described method but which, in turn, correlates with the DNA methylation.
  • [0050]
    In the following, the present invention will be explained in greater detail on the basis of the sequences and examples with respect to the accompanying figure without being limited thereto.
  • [0051]
    Sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism.
  • [0052]
    [0052]FIG. 1
  • [0053]
    [0053]FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • [0054]
    Sequence ID Nos. 1 to 64
  • [0055]
    Sequence ID Nos. 1 to 64 show sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. In particular, sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. Sequences having even sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 2, 4, 6, . . . ) exhibit in each case the sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of genes associated with metabolism which are complementary to the preceeding sequences (e.g., the complementary sequence to Seq. ID No.1 is Seq. ID No.2, the complementary sequence to Seq. ID No.3 is Seq. ID No.4, etc.).
  • [0056]
    Seq. ID No. 65 to seq. ID No. 68 show specific oligonucleotide sequences as used in Example 1.
  • [0057]
    The following example relates to a fragment of a gene associated with metabolism, in this case, OAT in which a specific CG-position is analyzed for its methylation status.
  • EXAMPL 1 Methylation Analysis of the Gene OAT Associated with Metabolism.
  • [0058]
    The following example relates to a fragment of the gene OAT in which a specific CG-position is to be analyzed for methylation.
  • [0059]
    In the first step, a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a manner that all cytosines which are not methylated at the 5-position of the base are modified in such a manner that a different base is substituted with regard to the base pairing behavior while the cytosines methylated at the 5-position remain unchanged.
  • [0060]
    If bisulfite solution is used for the reaction, then an addition takes place at the non-methylated cytosine bases. Moreover, a denaturating reagent or solvent as well as a radical interceptor must be present. A subsequent alkaline hydrolysis then gives rise to the conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil. The chemically converted DNA (sequence ID 159) is then used for the detection of methylated cytosines. In the second method step, the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Preferably, the DNA is subsequently desulfonated (10-30 min, 90-100° C.) at an alkaline pH value. In the third step of the method, the DNA sample is amplified in a polymerase chain reaction, preferably using a heat-resistant DNA polymerase. In the present case, cytosines of the gene OAT are analyzed. To this end, a defined fragment having a length of 572 bp is amplified with the specific primer oligonucleotides TGGAGGTGGATTTAGAGGTA (Sequence ID 65) and AACCAAAACCCCAAAACAAC (Sequence ID No. 66). This amplificate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bonded to a solid phase, forming a duplex structure, for example GTGTATTCGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 67), the cytosine to be detected being located at position 514 of the amplificate. The detection of the hybridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescently labelled primer oligonucleotides which have been used for the amplification. A hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide takes place only if a methylated cytosine was present at this location in the bisulfite-treated DNA. Thus, the methylation status of the specific cytosine to be analyzed is inferred from the hybridization product.
  • [0061]
    In order to verify the methylation status of the position, a sample of the amplificate is further hybridized to another oligonucleotide previously bonded to a solid phase. Said olignonucleotide is identical to the oligonucleotide previously used to analyze the methylation status of the sample, with the exception of the position in question. At the position to be analysed said oligonucleotide comprises a thymine base as opposed to a cytosine base i.e GTGTATTTGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 68). Therefore, the hybridisation reaction only takes place if an unmethylated cytosine was present at the position to be analysed. The procedure was carried out on cell samples from 2 patients, sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample 11 being from an oligodenrogliome grade II tumor sample.
  • [0062]
    From the results (FIG. 1) it can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • EXAMPLE 2 Diagnosis of Diseases Associated with Metabolism
  • [0063]
    In order to relate the methylation patterns to one of the diseases associated with metabolism, it is initially required to analyze the DNA methylation patterns of a group of diseased and of a group of healthy patients. These analyses are carried out, for example, analogously to Example 1. The results obtained in this manner are stored in a database and the CpG dinucleotides which are methylated differently between the two groups are identified. This can be carried out by determining individual CpG methylation rates as can be done, for example, in a relatively imprecise manner, by sequencing or else, in a very precise manner, by a methylation-sensitive “primer extension reaction”. It is also possible for the entire methylation status to be analyzed simultaneously, and for the patterns to be compared, for example, by clustering analyses which can be carried out, for example, by a computer.
  • [0064]
    Subsequently, it is possible to allocate the examined patients to a specific therapy group and to treat these patients selectively with an individualized therapy.
  • [0065]
    Example 2 can be carried out, for example, for metabolic diseases, solid tumours and cancer.
    TABLE 1
    List of preferred genes associated with metabolism
    according to the invention
    Genbank Entry No.
    Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
    DUSP2 NM_004418
    EPHX2 NM_001979
    QDPR NM_000320
    SGSH NM_000199
    SHMT2 NM_005412
    SLC7A2 NM_003046
    SLC7A4 NM_004173
    TYMS NM_001071
  • Diagrams
  • [0066]
    [0066]FIG. 1
  • [0067]
    [0067]FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • 1 68 1 6149 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 1 gtgttgggat tataggtttg agttattata tttggttttt aagagatata ttagagtttt 60 aattcgaagt atttatgaat gtgattattt ggaaatagag aatttgtagg tgtaattaaa 120 ttaagatgag gttataattg gatttggatg ggttttaaat ttaatgatta gtgtttttat 180 agtaagagtg gagaaaaagt tatatatagg ggagaagata ggggttggat tgatgttttt 240 ataaagttag gaatattaag gatttttaat aattattacg attttggaga gaggtatgga 300 atagattttt cgttagaatt tatagaaaga attaattttg ttaatatttg gattttggat 360 tttagttttt agaattgtaa gaaaatatat tttttttgtt ttaagttatt tagttggtgg 420 taatttgttg ttgtaatttt aggaaataaa tatagatttt ggtattgaaa agtggggtgt 480 tgttatatta atatatataa atatggaagt gtttttatta atagattggg gtgatgggta 540 gaggaagaag tttgaggtat atgatagatt aagtttagat tgttttgaag agaaagtggg 600 tggaaatgtg agtgttttat ttttataaaa aataaaaatt aggtgggtat ggtgatatac 660 gtgtagtttt agttatttgg aaggttgagg taggaggatt atttgagttt aggaggttgt 720 agtgagttat gatcgtatta ttgtatttta gtttgggtga tagagtaagg ttttgttttt 780 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gtggtttata tttgtaattt tagtattttg ggagattgag ggaggattgt ttgggtttag 1680 gagttggaga ttagtttggg taatatagtg agaatttgtg tttattaaaa tattagtatt 1740 aataataata aattttaaaa tataaataaa aataattttt ttttaattgt atttaatttt 1800 tattttaata ttttattttt attttataga agaaatgtta atttagttat tttttttttt 1860 ttttttgaga cggagtttcg ttttgttatt taggttgtag tgtagtgata cgattttggt 1920 ttattgtaag tttcgttttt tgggtttacg ttattgtttt attttagttt tttaggtagt 1980 tgggattata ggtggttttt tttatgttta gttaattttt tgtattttta gtagagatag 2040 ggttttatcg tgttaggatg gtttcgattt tttgattttg tgattcgttt gttttggttt 2100 tttaaagtgt tgggattata ggcgtgagtt atcgcgttcg gttaagtttt agatttttaa 2160 atgaaattat tagttatatt tttgtttggt gtttatattg gtgataaagt tatttttatt 2220 tttttgaagt ttagttttaa agagtagttt gtttgttgta gttttagaaa taaatgtatt 2280 attttttttt ttttaatgtt tttaaatgtt tttgaatttt tttagaagtt gttttgatga 2340 atatagtggt attttttttt ggtagtgttt ttgatggtag aattgtttaa ttatagttga 2400 tttttatgtt tttagttagg ttttttttag ggtaggtgtt ttttaagata taattagtgt 2460 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nnnaaaaggt aatatataga atggatgtga gaaaatattt gtaaattatt 1140 tatttaatta gggatttaga atgtatagaa tttttaaaat ttaataataa aaaaataaat 1200 aattttattt aaaaaggggt aaaagagttg aatagatatt tatataaaag tatatatgaa 1260 gggttaataa ttatatgaaa agatgtttaa tattattaat tattagaaaa atgtaaatta 1320 aaattataat aagatattat tttaaattta ttaggatgat tattaataaa aaattagaaa 1380 ataataattg ttagtaagga tgtgttgaaa ttgaaatttt tgtgtattgt tagtggtaat 1440 ataaaatagt atagttattg taaaaaatag tatggtagtt atttaaaaaa ttaaaaatag 1500 gacgggtgtt gttattttag tattttggaa gattaaggtc ggtgtattat ttgaggttaa 1560 gagttcgaga ttagtttgat taatatggta aaattttgtt tttattaaaa atataaaata 1620 attaggtgtg gtggtaggcg tttgtaattt tagttattta ggaggttgag gtaggagaat 1680 tgtttgaatt taggaggtgg aagttatagt gagttaagat tatattattt tatttttttt 1740 tgggcgatag agtgagattt tgtttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaattaaa aatataatga 1800 ttatttaatt tatttttggg tatataattg aattttaaaa taattaaaag taggatttta 1860 aagagatatt tgtatatgta tgtttatagt agtattattt acgatagtta aaatatggaa 1920 gtaatttaag 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tttttttttt tttttttttt tgagatggtg ttttattgtg 720 ttatttaggt aagtgtagtg gtgtgatttt ggtttattgt agttttaatt ttattaagtt 780 taggtaattt ttttatttta atttcgtgag tagttgggat tataggtata tgttatcgag 840 ttcggttaat ttttgtattt ttattagaga tagggttttg ttatgttgtt taggttgtta 900 ttttattttt atttttgttg aaatttggtt gttttttttt atttttatta ttaattatta 960 gttaaatttg atttattaaa aggattattt cgtatgtggg ttttgtaata gtttttttaa 1020 aatttatttt tttttattta gatttttttt taatttttaa attgtagtta atatttttaa 1080 ttttgttatc gtttttgtat attttattta atttttaatt ttttaatggt tttttttgtt 1140 tttaggttaa gttaaattga aaattgttaa agttatagtt ttttagtgta attagtaagt 1200 atagtgatta ttatgtttgg tttattttag ttgttgttga ttaatagtat tttttgaatg 1260 aagaaattat attatcgtat tgtagggaaa aatttgtatt ttaatggaaa attgaattat 1320 ttagagtaaa tttttaaggt tatttgattt tgattttatg ggttttttta ttgggtttta 1380 tattgtttta ttgtttttga gttattttat agatgattga tagaaatgta aaataattat 1440 tgtatgtagt tatgtaagta aaatttgaag gttagggttt aattaatttt ttttttttat 1500 tgtggaagaa gttaatttta tttgtatatt 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Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 8 agaaaaatta ttattattta tagaaaagtt attgagtatt cgttggttag attatataga 60 ggggaaaaaa aaaaaggaaa ttaattgatt tttaaaggtt agtagttaat atagaaattt 120 aatattttga gttgaataaa ttatgtttgt atttagaatt cggttagtta tttataattt 180 ttgtaatgta tattgtttaa tagaatatta gaattaaatt ttagtgatat atagaagagg 240 gataaaatag tagatggggt aagatgatgt aaaaaaagaa tataattttt ttttattttt 300 attataggat ttatgttgag tatttgggaa agatgaaaga gatgtttttt ttaataaaaa 360 atggtaatat ttataatgat ttgttaaatt aaaatgaatg ttattaagta ttgaattgtt 420 atttagtaat ggttatattt taattgtttt aaagaattgt tggtataagt ttttaaaatt 480 ttttgggtgt attggagaag aaatgagtaa agtgaagtaa atgttttttt ttttgaaaat 540 aggaaagttg agaatgaata ttaagatata aattttttgt tttgtgtgga ggaaatagtg 600 aataaaggaa tttttattta aataaagata aattagagta ttaggaaata attttttata 660 agtagtattt tattagtttt cgatatagtt agtttgttta ttgtaaatgg ttaaatatta 720 agcgtataaa ttgtatgcga tattattatt aattttatag tatttgtgga atgttgataa 780 aaatatagga gattagtatt 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gagtgtagtg attatagttt attgtagttt taattattgg 1380 ggtttaagta atttttttat tttagttttt cgagtagttg ggattttagg tatgtattat 1440 tatgtttggt taattttttt ttattatttg tggagatggg gttttgttat gttgtttagg 1500 ttggttttaa atttttgggt ttaagtaatt tatttgcgtt ggttttttaa agtgttggga 1560 ttataggtga tttatttttt aattgtgtta aagaataaag tatttatttt atttgttttt 1620 ttgtatttaa aatggttttt tatattttag atttagaaag ataaatataa gtaaattaat 1680 aagtatttta tttgtattat ttgttgtttt ttaatagttt atatttagtt tatttttgaa 1740 gggtaaagat tattgattgt ttatttaatt tttttatttt gaatttagtg agattttttt 1800 ttatttttta taaatgtatg tttaaaattt gattttagtg tagaattgga attaaaatgt 1860 atgtaatttt attttttata gtaggagtta aatgtttatt aagttttttt ttgagtttag 1920 tattttgtag ttaaatgatt attatttttt agttacgttt ttaaaaaaaa ttatgttggt 1980 ttgtaataaa aattgtattt tttttattag gtaagtgaat tattttgttg ggaagagtat 2040 tttggtttcg agaaaaaaat gattttattt tgaaaggttt tttttttaat ttttttttgt 2100 ataaattttt agtttagtaa tttgttagta ttttggaaaa gtgtattata aaataaaaat 2160 tcgaattaga taaaatatat ttttggaatt tttgaggtag attaatgaag ttttgatttt 2220 aggtgttagt aaaataaagt aggtattttt attttgtatt gttttatttt ttagtttttt 2280 atggtgtttt ttaaattttg atgttttgaa gaagttttaa tgtttgttat attagtagga 2340 gttgattata gggaagagat aaatatagtt ttttttggaa aggtgaaggt ttagttatta 2400 gaattttgtt ttttgatgtt gagaatgtat ttttttcgaa tagatggaaa agaggggtgg 2460 agattatttt agggatatat tttgtaaaat gttgatattc gaagatgtat atagttttgt 2520 gttttggtta tttttttaaa ttatgttttt ggtgaaggta tatggagagg agagtagatg 2580 ttgttagatt acggtgtttg acgttatgta tttttttacg tttagtttgt ttatgtgtat 2640 acggttgtag cgggattttg gggtgtgggt taaataataa gaataggggt ttttttgggg 2700 tttgttataa ggtagagatg ttttacggta attagggatt taggggaaga ggaaggaata 2760 tatatgttga taataagtag tttaatatta ttatttttat tttatagatg tagttattga 2820 gtttagagag gttttataat ttgtttagag ttttttaatt agtaaatagt ggagtcgaga 2880 tttgaacgat ttaaagagga aagtaaataa gtagtttttt tattattttt tttttttttt 2940 aagatgaggg ttttgttatg ttgtttaggt tgatattgaa tttttggtta taagtgattt 3000 attattttgg ttttacgaag 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ttgtttttgt tgttggggga agttttgttt tttgttttcg 5580 gttgtttttt atacgttttt atgtgttttt tagtttttaa tttttagttt tgtttttaat 5640 atcgtagggg tttttagttg attttttttt atttttttaa agggtaggat tttttggtag 5700 agatataacg tttttttgga aatgaaagaa gttgatgtat gttttttttt ttttgaatta 5760 tttaaataag aggaatttat ttttaggtat tttttgtttt gtttttattg tgggagtgtg 5820 gttttagttg tttatttgat tagttgatat agggtttttg gggtttaggt attgttattg 5880 tttgggattg aaagatgaaa gttatagggt taggtatagt agttcgtgtt tttaatttta 5940 ttattttgga aagtcgaggt gggcggatcg ttggaggtta ggagtttgag attagtttgg 6000 ttaatatggt gaaacgttgt ttttattaaa aatataaaaa ttagtaggag gtggtggtat 6060 gtatttgtaa ttatagttat ttaggagttt gaggtacgag aattttttga atttagggat 6120 agaagttgta gtgagtcgag atcgtattat tgtatttttt gagattttgt tttaaaaaaa 6180 aaaaaaaaaa aaaaagggaa agtaatggtt tggtttggtt ggagatggaa tatgtattaa 6240 cgtgttttac gtgtttttag tagggatagc gaaggtttgt tttttggtat atggtagatt 6300 gagtaaatgt tgattagtga gattttgagg tattttagag ttttataatt tagagaggga 6360 gatagattgg aagtttaagg 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gtatttagga gggattattc gggttttatt 1320 aattattagg tttttatagg aaatttgggt tttaggtatt tagagttttt ttagggtttt 1380 tggatttttt ttatttttga aagatgagaa atagttgttt tgttgatgtt gttaatttac 1440 ggagagttgg gaagttttat aaattttata agttattgtc gtaaattgga agagatagag 1500 ggggattttt ttttgttagg cgttgtagtt gtgttttttt atttagtttt tatagtagtt 1560 ttagtagagg ttgtgtttcg tttatttttt ttaggtattc gttattttgt tgtatattta 1620 tagagttttg ttgtaagtat ttgagatttt gtttgaggat tttttttggt ttgtgttggt 1680 ataagttgag agtattaggg agttagtgtt tttgggatag tttttagtta gtggaagtgg 1740 gaggatagat attttagttt ttttatttag tgagggataa ttttaaggta tattttattt 1800 attttttagg gttttttgtg ggagtgaatt tttttaagtt tttagtaata attaacgtat 1860 atttttttgg tttttttttt tttttatttg gtttttagtt ttttttttgt atttttttga 1920 ttaggattgg gattagggtg atgagttttt atttttgggt ttatttaagt gtaaggttgg 1980 tattcgtatg aatttgagag ggttttttta tattttgtat tttaggtata ttatttgtat 2040 tgttttgatt ttggttttgt tttggattat tttttaaata aagttatttg tatttaaatt 2100 aggtttgttt ttgggtttat ttaatttaaa gtaaatttta tgaagatatt agtttttaag 2160 ttttatataa ggaaaatcga ggtttagagg aataagaaat ttgtttaagg ttttttagtt 2220 ggtaatgaga tgggattttg aaattaggtt tgtttgattt tagagttgaa gttttttgta 2280 ttatagtata ttatttttta ttttttattt tagttataaa attaatgatt taagggaaat 2340 tttaggtttg gatgagttta tttttgtttg tgaattaggg tagttattgg ttttaaggtt 2400 gttagtagat gggaatttgg ggaggggaag gtaggtagta agtggatgag agggttgtag 2460 ttgttagtgg aaagatggat tagtggaaag attgttgaaa ttatatgtat taggaagata 2520 gtaagagttt gtttgttttt ttttagtttt aaaagttttg gatttttttt ttttttgaga 2580 tagttttgtt ttgttattta ggttggagta tagtggcgtg atttcggttt attgtaattt 2640 attttgtttt ttaggttcga gtaatttttt tgttttagtt tttcgagtag ttgggattat 2700 aggtgtatat tattacgttc ggttaatttt tttaattttt agtagagacg gggttttatt 2760 gtattggtta ggttgattat gaatttttga ttttaagtga ttcgtttatt tcggtttttt 2820 aaagtgttgg gattataggc gtgagttatt atgtttggtt agtcgtggat tattgagatt 2880 gtgggagggt tttttaattt aataaaaatt aattgatatt tgttttttgt tagataaaga 2940 attgaggttt gaggttgtac gggtgaataa 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tattataatt tttttaggtt aggcgttttt 4680 agtttttttt aggggcgagt tattatttta gaatttatta tatttgtaaa ataaatagtt 4740 tttagtattg tagagggaat ggtttaaaat tttagattta gtttaacgtt ttatttcgcg 4800 gtaattattt tgtttaagtt tttattatag ttttgtttag tttgggttat ttttagggta 4860 ggtttggaag gaagtgtagt tttttgaatt agttgatgtt tggtaagtgg tggtggagga 4920 aaagggtggg gtttgaggat attataattc gggttatttt tgagtgttgt ttttggttat 4980 tggggtgttt tatattgtta gataagagtt tagatttgag gagagtgatt agtttttttg 5040 tgttttaggt aagtatttcg gtttaaatta cgtgttgttt tttttatagt tgttttgttt 5100 tttatttttt cgtttggtta atattaggtg aagtggatat cggaaagatt aagttagtgg 5160 tttttttttt tgtttgagat ggggtttttt tttttattat ttagattgga gtatagggta 5220 tagttaggtt tattttagtt ttgatttttt gggtttaagt gattttttta ttttagtttt 5280 cggagtagtt gagattatag gcgtatatta ttatatttag ttaatttttg ttattttttt 5340 ttagcgatgg cgttttgtta tgttgtttag gttagtttta tatttttggg tttaagtagt 5400 ttgtttgttt tagtttttta aagtgttggg attataggtg taagttatta tatttagttt 5460 gttagttggt tttcgatggt agtttttaat 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tgtgtgtttt ttttttgtag tgcgtggatt 60 cgtttatttc gcgttagtac gtatagggag ttttatttag taagtatatt tattatattt 120 ttaaagacgg tgttataggt tatgaatttg ttgtataggt tatagatgtt tagaatttgt 180 ttgtcggagt tttgtgaatt tttgttggta aattttgatt tgtataggaa agaaaaagta 240 ttagatgttt ggatattttt gttttatttt ttttattttt ttttttatga taattttggt 300 gtatatttta tttagtataa attatttttt tggttttttt tattttataa tatgtagcgt 360 tgtgtcggta gttgtatata gagaatatat aaatttgatt ttatttttta ggattttata 420 attaatttaa gtaatagatt agaaaattaa gtatattaat atatttattt atttagaaaa 480 taataattta atatatggta tatgtaaaat attgtgtttg gaattgaatg aaagtaaaat 540 aaattagtat ttaataggga gtatttttat tatgtagaag attttattta ttttttaaaa 600 aaataaaatt aaaataaaat agaaaatttg tattttacgt tttttagtat tttttaattt 660 ttttattgtt gaattttttg tttttttgtt taatttattt tgataaaaga gttaaaaaat 720 aaaataaggt cgggcgtagt ggtttacgtt tgtaatttta gtattttggg aggacgaggt 780 aggtagatta cgaggttagg agatcgagat tattttggtt aatacggtga aatttcgttt 840 ttaataaaaa tataaaaaat tagtcgggta tgggggcggg tatttgtagt 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gtgttgttta gtaaagagga ggggaaggta ggtgtttttt agggagaaaa agtgttgata 3960 tattgtaaga ggtattatcg tagttaggtt attttttttt tttgtgtgag ttttttgttg 4020 acgttatttt ttgtttatgt ttagatttta ggaaatagag taaaaattgg tttttattaa 4080 ggattaattt tttttttaaa gcgaaaaata aattttttgt tttattttat atatttttta 4140 aatttttgga gtttggatta gtagtttaga gtttatagtg ttgagggaat ataattgaga 4200 gattaaaatg gtgatgagta aaatgttatt gttaggtttg acgatagagt tgaagaagat 4260 ttcgttgttt ttaaaattta ttttttaaaa ataattttaa aaagtttata ataattttgt 4320 attttttttg gttttttaat tagtaataat gattaaatta tttatgtttt tgaatagtaa 4380 ttagaaaata ttttgatata gttatttatt atagaaatta tagtgtttga gaatgattga 4440 ttaaatagta gaaattttaa gaaatttatg ggttatttag atagtatata ttattttaaa 4500 gggaaaaagt tattttatgt atttatttaa atttattaaa ataggtgttt ttgtgttgtg 4560 gtttgtattt attggtttta taaaataaag tttttttttt ttattgatta atatttgaga 4620 tttttatggg atgtttgttt agcgaggttt ttagtaataa agagaattaa tttgtggatt 4680 ttaaaatagt tttgtttttt aaatatttgg tgttttttag ttttatgtaa aacgttaaat 4740 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tatttattta tttttgagat agagttttat tttgttgttt 1560 aggttggagt gtattggtat aattttggtt tattgtaatt ttcgtttttt ggtttgaaga 1620 tttttttgtt ttagtttttt gagtagttgg gattataggt acgtgttatt atgtttggtt 1680 aattttcgta ttttttgtag agttggggtt ttattatgtc ggttaggttg gttttaaatt 1740 tttgatatta ggtgatttgt ttatttcggt tttataaatt gttgtgatta taggtataag 1800 ttattgtgtt tggtttaatt gttttttatt aatattgtat taggttggga agattaattg 1860 ttttagtaat ttttaaattt taatggtgta agaaaataaa aattttattt tttgtttatg 1920 ttatagttcg gtgtaggata gtgagaagga tttgtttttt tttgttattg gagatttagg 1980 ttgtttttgt gtagtgttta gaaaagtttt agtagttgag aggtgaaaag gtgtggagga 2040 ttgtatggaa ggttttataa gttaagttta ggggttgttg aattttatgt ttttttatat 2100 tttattggtt agaaattagg tatagtatta tatcgaattg gaaaggaggt taggatatgt 2160 tgtttaatag gatgtttcga gtagtgtatt tagaagaatg aataggtttg gagatagttt 2220 aagtttgttg tgtttttaat ttttttgggg gtattttttt tataatttat aatttttttt 2280 tttttttttt tgagatggag ttttggtttg tcgtttaggt tggagtgtaa tggtgtagtt 2340 ttagtttatt gaaatttttg tttttcgggt ttaagtgatt tttttgtttt agtttatcga 2400 gtagttggga ttataggggt ttattattat gtttggttaa tgtttgtatt tttagtagag 2460 atggggtttt attatgttgg ttatgttggt ttcgaagtgt tgatttcgtg atttgttcgt 2520 ttcggttttt taaagtgttg ggattatagg cgtgagttat tgttttcggt tataatttat 2580 aattttaaat ggaaaaggta aagataaata ttagtttttt attagtaagg atatatatgt 2640 agttgttgta ataaaggtaa aataaaaaaa tataatgtaa taatttaaat aagatatagt 2700 attttttttg tttgtataaa aatttgaata aagtatttta gggttgacgt ggcggtttta 2760 tagaattagg tattaaaggt ttttggtata ttgttttgtt ttttcgatta tttaattttt 2820 tttttattat ttgagatgat aattttattt ttattgtagt gtttatattt tggtaaattg 2880 gaaagaggag aagggtaagt ggaaagtaag tttttttttt taaaggtata atttaaaagt 2940 tgtttatgtt atttgtgttt atgttttatt ggttaaaatt tagtaattaa attttggtaa 3000 gtatttttgt tgtagtggga gttgggaaat gtagattttt gtttaggtaa gaaagaagag 3060 ggtatggagg gtatagtttt tatattttag attttagtta tggcgttata tttcgttgta 3120 agggaggtta gttattgtag tttttcgttg ggtggttatg tatttagtta gattttaggg 3180 gtatttttat taaagtaatg 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atttgagttt tagagtttga 660 ggtggtagtg agttaagatt atattattgt attttagttt aggtaataga gtaagatttt 720 attgaaaaga gagaaaagaa aggagaaaaa gaaaagagat agagagatat agagagatag 780 atagagatag agagagaatt ttttagtagt tattgttaaa gttagaagga aaaaaatgga 840 ggaaaaaaat tagtaaaagg taattaatag gtattatttt ttagaatttt ttaagatgat 900 aacgatttaa ataagaaata aaatgttttt atagtaatat ttttaaatga attgaaaaat 960 ttgtataatt attttttaaa gagtcgggta ttatggttta tgtttgtaat tttagtattt 1020 tgggaggtta aggtaggtgg attatttgag gttaggagtt tgcgattaga ttggttaaaa 1080 tggcgaaatt tcgtttttat taaaaatata tataaaaaaa ttagcggggt atggtggtat 1140 atatttgtag ttttagttat ttaggaggtt gaggtagaat tgtttgaatt taggaggtgg 1200 aggttgttgt gagtttagat tttgttattg tattttagtt tgggtaataa gagcgaaatt 1260 ttttagaaaa aattaattaa ttatttaatt aatttaaaaa atgtaatttt tgtataaaag 1320 tggaggtaaa agatataaaa agatatagtt tataaaataa aatttttatt aagtaaaaga 1380 ttaagaataa gaaggaattg tgaacgggaa attattattg tgtttttatt aaagattaag 1440 attatttttt atatattttt ttaagtataa ttgtgagtta taagagtatt 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180 taagggaggt ttggtatgat taggttgttg atttagttat tttttaaatt ttggtgttat 240 aagttaggga gtaaaaggta gggtttaagg tagaggatat atatatagaa tgtttttaaa 300 gggatagagg tacgggattg gaaagaaaaa ttgttggaaa gtgaattaga tagggtttta 360 gggagagaag gatttttata gataagggag ttattaagat ttataagttt ggtataggta 420 aggggaatag taggggtttt ggagatggag gtttagattg gaaggaaagg agaaggagtt 480 ggtatttttt gagtacgtat taagtgttga gtatttttgt gattattata attttgtaag 540 ggaggtttat tagttttaag taagggagtt aaatataagt tttgttgttt ttaagtgttt 600 tttggttttt ttttttttgt tttgtacggt ttgtttcgat aatttagata gttttagtat 660 tttttttgga aaggttaatg ataagaggtt ggattatgaa tttgtagttg gtaaaggaga 720 gagaaagttt tatttaaata gtttgtaatc gttttgggta tcggttacgt gttagttacg 780 gggttaggtt tcgggaggta tacgattaga tttttgtttt tcgtaatagt tattatttgt 840 tgtttttata tttcgagggg aattagttgg gatttgggta gttagggcgt ttaaggtgcg 900 gggtcggcgt taggttggaa gtgggaagtt aggattatgg ttgggtttan aggagagtga 960 ggtaggatcg gtatgttttt tatttttttt tttagtttat taggcgtaag tttttcggtt 1020 cgtgtattat tagggaaagg ttgttgggtt tggtcgtcgt cgttatggag tttttttggt 1080 tttggagtgc ggtttggaag gcgcgggacg tttggtcgtt ttggtggcgt tatttagtcg 1140 agggtttagg gtattggatg gaaggtgggg tttgggagaa gcgtcgtacg taggggcggg 1200 attaggtttt tttttttgtg ttagtttggg cggcgttagc gtggaggggc ggggtttttt 1260 agtttttttt agattcggag gcggggcggg gtttcgggag ggggttggga gcgagaagtt 1320 cgggtgttgg ttttatttgt agcgcgttgt tttttttgtt tgtttgtttg tttgtcgtcg 1380 aggttggagt atagtggtgc gatttcggtt tattgtaagt tttgtttttc gggtttaagt 1440 tatttttttg ttttagtttt tcgaatagtt gggattatag gcgtttatta ttacgtattt 1500 ttgtttagta gagacggggt tttatcgtgt tagttaggat ggtttcgata ttttgatttc 1560 gtgatttatt cgttttcgtt ttttaaagtg ttgggattat aggcgtgagt tatcgcgtcg 1620 gttttgtagc gcgttgtttt tgtcgtttta tatgtaagta tatacggttg ttttgaaaat 1680 cgtttgtaga ggtagtaggt attagattag cgtttttaaa cgttagttgt agaagaattg 1740 gggtggggaa tgtgaggcgt tgttgagaat gtatattttt aggattagta tagagatttt 1800 gatatagtag gtttaggttt gaggtgttgt ttgagggttt atatttttag taacgagaat 1860 gttgaggttg tgggtggagt acggtgtgta ttttgcgaga taggtgttat tatgacgtag 1920 cgtttacgtc ggttttttgt ttttagtttt taggaaaggg tttggtacga gtaggagtaa 1980 atgaattcgt gtattattat atgggtttgg tgtttaagta taaaaaagat atgaggtcgg 2040 gcgtagtggt ttttgtttgt aattttagta ttttgggaag tcgaggtagg tggattattt 2100 gaggttagga gttcgagatt agtttgatta atatggtgaa aatttcgttt ttattaaaaa 2160 tataaaaatt agtcgggtat ggtggtatgc gttttaattt tagttattcg ggaggttgat 2220 gataggaaaa tagtttgaat ttgggaagta tagttgtagt gagttgagat tatgttattt 2280 aatattagtt tgggtaataa gagtgaaaat ttgtttttaa aaaaaaaaaa gttatgaaat 2340 ggaatttgtg aatttttttt ttttaattgg atttgttgtt tttatttaaa gtagagtttt 2400 tgtttaaatt ttttttttaa gttttttagt tttttgagaa atagtgaggt tttatttttt 2460 gaggagagag gcgtttttag ataggtttaa gtttataagg tttttttttt ttttgaggat 2520 aatgtttagg attttatttt tttatagttt ttttttttta atatgtaatc gtttaatgga 2580 tttattttgt ttgttgttta gataaaatta atttattaag ataggggaat tgtaataggg 2640 aaagagttta tgtagaatta gttatgtagg agattggaat tttattattg tttaaattcg 2700 gttttttaag 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ggattgaggt tgttaacgtt tgaagaaaat gtattattga tatttgggga ttgtagagtt 3600 tttatggtgt taagataata ttttgtgttt gtattgttat tatttaaatg tataatggga 3660 atcgatatta tgcgttttta atatttttaa gggtaaggta gtatatttta tgaaggatat 3720 tgtgattatt gtttgtattg tggaaaaagt atagaaggag ataagaaata taataatttg 3780 taaaataaat tgaagtttaa ttaaaagtat aggtaaaatt tagaatttgg tttattttat 3840 aatattttga agaattatat ggtttagaga aattaggaaa atttttaatt gtgagaaatt 3900 aagtattttt ttttagtaat tttttattaa ataggaaaat tagagattta tgggatttat 3960 tgttggtaaa aaatatattt tttatttagg aatattgttg gtttttattt ataaataatg 4020 taatgaaaag tatttaaaga tttataaagg agtgtgttat tttatcggaa agattggttt 4080 gatttttttg ttaattttta gaattgtttt tattaaaatg ttataaattg ggtattatta 4140 gaaattaaat attgttaatt aaaggagatt ttaggtgttt ggaatttaat tttttttttt 4200 tttgtttatt ttaaggaaaa ttttttttaa ttaggtattt gtggaagttg attttattat 4260 taaaggatat cgaataattt tgagattaga aaaaaaaaat agttattttt gggtaatgtt 4320 agagaaatag ttaaatagag agagagatag agagagaggg agagatagag aagattagga 4380 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540 attcgaggga agtgaggaaa gtaaagtata tgggttagaa attattggat atattgggag 600 tatagtttgg ttaatgagtt tgaggttttg gattaagtga taagttttat ttggtttttt 660 aataggtaga attgatgtgt taaaaggaga gtttgttggg tagagtaggt gattggtgag 720 gaggagagaa atgataggtt ttaggtttat gagagttgtt tgggggatga gatattgttt 780 ttgtgatagg aacggggtgg gttttttaag ggtgatgtgg atgggggtgt ggtgttttgt 840 gatcgagggt gtggaagtat tttaaatagt ggggttaatt ataggtgcgg gataaggaaa 900 agttgtatgt tttagggtgg gaggtcggag gagtagaaga aggttagaag tttgttagaa 960 gttttggagg ggtttgggtt gatgtgttgg gtattatggg gaatgtggaa gtggagagta 1020 gtgtggagtt ttgaaagaat atttttgttt aggagcggag ttgggtatga aggtaggatt 1080 aagaaagagt gattgaagga aaaggtgttt agggagtaga aaagtggagg ggggttttgg 1140 ggtttggaga tttgtttatt gatttttata atagagattt gggaggattg ggtgggtttt 1200 gaaaatttag gtaaagtaga gtaggttgtt ttaatattaa tttttaaaaa atatgtatgt 1260 ttatttgtta ttattagagt tatttttggt ttagatgaag taatggtagt tgttgggata 1320 tttgttttag ggtattgtta gtttttagtg gtaaggtcga tgagattcga gtaggaggtt 1380 ttggttagtt cggaaaggga tggaggcgat ttttgttgga gtcgtttata gtttgatttt 1440 tattgagttt tttatagagg gggtatagtt tggtgagtat agttgggttt gggtatggtt 1500 tggattagta gtttttattg ttatatttga aataggcgtt aggtggaggt gttttgttag 1560 gaggtttttg tatggagttg tggttttgtg ggtttgtagg gtaaaggtaa gtattggaaa 1620 ttgttttttt tttttatttt ttttattata attgttaaag attttgaagg ttaaattaag 1680 aaggttttat tgtggggttt gagggtcgtt attaattttt tgaagtttgc gttaaatatt 1740 atggtagatt gggtgaggaa ttgaaggttt gaaatagtgg ttttttttgg gttggttggg 1800 tttaggttgg taattttttt atggttttag ttaaataaga gagaaaaagg gttgggtttt 1860 tgttaggatt ttcggtgatt tttgaaagtt ttttatagtt tattatttta tgggtatttt 1920 ttttgagttt tgtaaggaga tatataatta tgaggttttg atggttgtgt ttagaggttt 1980 tgttttgata attttagtgg gggttttggt tgggaattgt ttttgtgtta gtaggttggg 2040 taggagtttg atgatgaatt gtattagtat gtatttgagt tagggtttaa gtacggtgtt 2100 ggttttttgg ggtgagggtg gaagagaaga taagtagttg ttatgttagg ttagtttata 2160 agattgagta aggtattgaa tttttttaat ataagaggta ggattttttg gaaatgaatt 2220 gagttttttg ttagtttgag agagattagt gagggagaag ggaatatgaa ttttaataat 2280 atttttagtt tttgttattt ttcgaagggg gtattttagt attggcgtta aagtacgggt 2340 ggggtatggg ggttaaagat ggtgtcggag ttagtatggg taggagagaa ggaagaagtt 2400 agaaggggtt tttgttgagg gtttgaagag ggaagggggg ttgagttgat aggtattgga 2460 ggatagatac gggtgtaagg tggcgggatg ggtttatagg tttcgtgaga gggttgtaag 2520 gaaggagaat gagtataggt aatgttagag tttttttgag gagaggatgg tataggaaaa 2580 gaagtgggtg atgttggttg ggaagatggt ggttgggaag atggtggttg agaagataat 2640 gaggaagttt ggggagttaa tgaagttggt tgagatggag gggtagggtt tgggaggggt 2700 ggatagtagt ttgttttatt taatgaggaa aaagaggtag ggtcgggagg ataaaggtaa 2760 tgagggcggc gagaatgaag aaggatttga ataggtaagt aagaattgta gaggtcgggt 2820 tgtgatttga gtgtaaaaag gtttggatat aaggaatttt tttttatttt tttagttatt 2880 tgtaataatt gtttaagtta gttaaaattg taaagttgag tgttttattt gcgggttatt 2940 tggattcgtt atttaattta tattgcgatt aggttttatc gtataaaaaa gataaggtat 3000 ttatggtaga tattttgttt gaggtttaag gtttgtagat ttttaatgag gtaggttgga 3060 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tattgttttt tttatatata tatatgagta atatatgtaa taaataaaat ttaaattatg 7320 attatatata aatgtattta tatatatttt attaatgtat agatatttta tatatgtttg 7380 ggtatgttat tttaagtttt tttaggaaaa tatttgtata tttaaataat aattttcgtg 7440 ttagttattt tttgttttgt tttgtttttt tttattagg 7479 40 7479 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 40 tttgatggaa aaaaataaaa taaaataaaa ggtagttaat acgagaattg ttatttgaat 60 atgtaggtat ttttttgaaa ggatttggaa taatatattt aaatatatat aaaatgtttg 120 tgtattgata aaatatatat aaatatattt atatatagtt ataatttaga ttttatttat 180 tgtatatgtt gtttatatgt atatataagg aaggtaatgt atttagagat ttgtaagaag 240 aaattatatt tttaatgtaa tattagtata tttataatta taaataatta ttaaaataag 300 ttattaatat ggtttgattg tttttattta aatttttttt tattttgaat tataattttt 360 ataattttta tgtgtttagg gagggattta gtggtaggtg attggattat ggtgtggatt 420 tttttatgtt gtttttatga tattgagtga gtttttatga gatttgatag ttttataagt 480 gtttggtatt ttttttgttt gtattttttt tttttgttat taagtgagaa gatttaagtt 540 tgtttttttt tagtttttta 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gaatagtgaa gtttttattt 1920 tttgttagtt tttggatttt ttgtttttat cgtaataaga agagtttatg ttaaggtaga 1980 aaagttggtg ttttatgggt aaaattaatg tttttttaga ttttagattt tttaagtagt 2040 gtatttattg atatataata atgtatttag ataaagaggt tataaatatt gatgtcgtta 2100 aatatgggtg ttgatttatt ttttatttgg ttataggttt ttatggggat gatatagttt 2160 gagttgatgg tatgttttgt taaagtgagg taggtaaaaa atttgttttt ttttggggta 2220 tttaaatcga agatgttttt ttttattaag agtcgttttt ttgtgtagtt tggtttttaa 2280 aagttaaatt tgtagttttt atagttgaat tttatgaagt tgttagagta ttggtaggtt 2340 ttattataaa agacggaagg ttacgatttt cggttattta tttttgtgaa gggaaattga 2400 ggtttaagtg gtgtattgga tagaaggata ttttgatagg aatttttgtt tgaaagttgg 2460 ttatagggat ttttgttttc gttttacggt ggatagtatt ttttttttat taggttttta 2520 gaggagatat aggttttagg gaaatggtta gcggaggttt ggaaatttta tagtaggtag 2580 tataaaatag ttaggagtat ttttttttta gtttttataa ggtttgtagg aattggttaa 2640 ttggagttat agattttttt ttttagttat tattatagtg attattatat gttttggttg 2700 agatttatat aatattattt ttatttttag tattaaatat 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3586 63 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 63 ggtagcgacg atttttggag gtggatttag aggtataatt aagtcgcgcg gcgtattagg 60 gtttaagggt atggggtttt cgtagttgtg gttggggtag agttggggtt gttttttttt 120 ttaggagtat aggcggcggt ttagttttac gtttttcgtt tttagttata ttcggttcgc 180 gtagtggggg gtttaataga tttttttttt tcgggtttta gttttttcgt tagtaagggc 240 ggataaggat ttttttcgtt tcgttagagg aggcgatcga ggggtttgag tttaggtata 300 ggtcggcggg tttaggaggc gcgaggcgga tcgaattcgc gggaggagta aagatttttg 360 atgcgcggtc ggagggcggg gcggaggacg ggatttacgc gattggtatt ttgtttttcg 420 ttttagttaa tgagcggcga gggtgttttg ggggcggggt agaattagtt tttaagttgt 480 agtgacgttt cggcgttatt gttgcgtttt atagacgtcg cgtgtattcg gttgttttta 540 ggcgttgtta ggtatcgttt gggcgtcgtt gttttggggt tttggttcgg gtttggtcgg 600 64 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 64 tcggttaggt tcgaattaga gttttaggat agcggcgttt agacggtatt tgatagcgtt 60 tgaggataat cgggtatacg cggcgtttat gaagcgtaat agtgacgtcg gagcgttatt 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Classifications
U.S. Classification435/6.12, 536/24.3
International ClassificationC12N15/09, A61P7/04, C12Q1/68, A61K48/00, G01N37/00, G01N33/483, C12Q1/48, C12M1/00, C07K14/46, A61P9/10, A61P13/12, A61P29/00, G01N27/62, C07K14/47, B01J19/00, A61P11/06, A61P35/00, A61K31/711, G01N33/566, G01N33/53, C07K14/82
Cooperative ClassificationC12Q2600/156, C12Q2600/154, C07K14/4703, C12Q1/6886, C07K14/82, C12Q1/6883
European ClassificationC07K14/82, C12Q1/68M6B, C12Q1/68M6, C07K14/47A1A
Legal Events
DateCodeEventDescription
11 Mar 2003ASAssignment
Owner name: EPIGENOMICS AG, GERMANY
Free format text: ASSIGNMENT OF ASSIGNORS INTEREST;ASSIGNORS:OLEK, ALEXANDER;PIEPENBROCK, CHRISTIAN;BERLIN, KURT;REEL/FRAME:013829/0839
Effective date: 20021001