EP1438405A1 - Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur gezielten hemmung der expression eines vorgegebenen zielgens - Google Patents

Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur gezielten hemmung der expression eines vorgegebenen zielgens

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EP1438405A1
EP1438405A1 EP02779511A EP02779511A EP1438405A1 EP 1438405 A1 EP1438405 A1 EP 1438405A1 EP 02779511 A EP02779511 A EP 02779511A EP 02779511 A EP02779511 A EP 02779511A EP 1438405 A1 EP1438405 A1 EP 1438405A1
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EP
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dsrna
complementary
target gene
strand
nucleotides
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EP02779511A
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Stefan Limmer
Roland Kreutzer
Matthias John
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Alnylam Europe AG
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Ribopharma AG
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Definitions

  • the invention relates to the use of a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) for the targeted inhibition of the expression in a cell of a given target gene that is point-mutated relative to an original gene. It further relates to the use of such a ribonucleic acid for the manufacture of a medicament, a medicament and a method for the targeted inhibition of the expression of said target gene in a cell.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • DE 101 00 586 C1 discloses a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell, in which an oligoribonucleotide with a double-stranded structure is introduced into the cell. One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene.
  • the object of the present invention is to avoid the disadvantages of the prior art.
  • the use of a dsRNA for the targeted inhibition of the expression of a target gene mutated with respect to an original gene in a cell is to be provided, in which the expression of the original gene remains largely unaffected.
  • a medicament and a method for the targeted inhibition of the expression of a given target gene as well as a use for the production of the medicament are to be provided.
  • a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) for targeted inhibition of the expression in a cell of a given target gene which is point-mutated with respect to an original gene
  • a strand S1 of the dsRNA having a region complementary to the target gene, in which at least one nucleotide is not complementary to the target gene and the number of nucleotides that are not complementary to the original gene is at least one higher than the number of nucleotides that are not complementary to the target gene.
  • the invention further relates to the use of such a dsRNA for the production of a medicament for the targeted inhibition of the expression in a cell of a given target gene which is mutated point-wise relative to an original gene.
  • a nucleotide is "complementary" to the target gene or original gene if it can form a specific Watson-Crick base pairing with a nucleotide corresponding to it in its sequence position.
  • “Complementary region” is understood to mean that the nucleotides contained therein are essentially complementary to the target gene. This means that not all nucleotides in the region are complementary to the target gene. The number of nucleotides that are not complementary to the target gene is one in the lowest case.
  • the target gene is generally understood to mean the DNA strand - the double-stranded DNA present in the cell, which is complementary to a DNA strand which serves as a template during transcription, including all the areas transcribed. So it is in
  • the strand S1 can thus be complementary to an RNA transcript formed during expression or its processing product, such as e.g. an mRNA.
  • an mRNA e.g. an mRNA
  • the target gene can also be part of a viral genome.
  • the viral genome can also be the genome of a (+) strand RNA virus, in particular a hepatitis C virus.
  • the original gene can be any gene which differs from the target gene to be inhibited by only one or a few point mutations. In general, it is a wild-type gene.
  • a dsRNA is present when the ribonucleic acid consisting of one or two nucleic acid strands has a double-stranded structure. Not all nucleotides of the dsRNA must have canonical Watson-Crick base pairing within the dsRNA. The maximum possible number of base pairs is the number of nucleotides in the shortest strand contained in the dsRNA.
  • the region complementary to the target gene can have fewer than 25 successive nucleotides, in particular 19 to 24, preferably 20 to 24, particularly preferably 21 to 23, in particular 22 or 23, nucleotides.
  • the strand S1 can be less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, in particular 23, Have nucleotides. It has been shown that short dsRNAs are particularly efficient in inhibiting the expression of a target gene. These dsRNAs are also known as siRNAs (short interfacing RNAs).
  • the expression of the original gene is less inhibited than that of the target gene.
  • the expression of the original gene remains largely unaffected.
  • a dsRNA that does not optimally inhibit the expression of the target gene is used for this purpose. In this way, a dsRNA can be provided which is so little complementary to the original gene that its expression remains largely unaffected. Side effects by inhibiting the original gene can be avoided or reduced.
  • the nucleotide which is not complementary to the target gene is preferably not located at the 3 'or 5' end of the region. Ideally, the non-complementary nucleotide is in the middle of the range.
  • Target gene can have one or two point mutations compared to the original gene. Then the use according to the invention for the targeted inhibition of the expression of the target gene is particularly suitable for specifically inhibiting only this expression but not that of the original gene.
  • the original gene is a proto-oncogene and the target gene is an oncogene derived therefrom.
  • An oncogene often differs from the corresponding cellular proto-oncogene only by a single point mutation.
  • the inhibition of the expression of the oncogene with conventional dsRNA therefore usually also causes an inhibition of the expression of the corresponding proto-oncogene. This is often associated with such serious side effects that the use of conventional dsRNA to inhibit the target gene in an organism is hardly possible.
  • the cell can be a tumor cell.
  • one nucleotide of the region is not complementary to the target gene and two nucleotides of the region are not complementary to the original gene. Even such a small difference in the number of complementary nucleotides can be sufficient to almost completely inhibit the expression of the target gene and to leave the expression of the original gene largely unaffected.
  • At least one base pair within the dsRNA is not complementary, i.e. the nucleotides of the base pair are not specifically paired according to Watson-Crick.
  • the effectiveness of the dsRNA can be modulated by varying the number of non-complementary base pairs within the dsRNA. A reduced complementary action within the dsRNA reduces its stability in the cell.
  • the dsRNA preferably has at least at one end of the dsRNA a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotides. One end is a region of the dsRNA in which there is a 5 'and a 3' strand end.
  • a dsRNA consisting only of strand S1 accordingly has a loop structure and only one end.
  • a dsRNA formed from the strand S1 and a strand S2 has two ends. One end is then formed in each case by one end of strand S1 and one end of strand S2.
  • Single-stranded overhangs reduce the stability of the dsRNA in blood, serum and cells and at the same time increase the expression-inhibiting effect of the dsRNA.
  • the dsRNA has the overhang only at one end, in particular at its end which has the 3 'end of the strand S1.
  • the other end is then formed smoothly, ie without overhangs, in the case of a dsRNA having two ends.
  • an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to enhance the expression-inhibiting effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs.
  • a dsRNA with only one overhang has proven to be sufficiently stable and particularly effective both in various cell culture media and in blood, serum and cells. The inhibition of expression is particularly effective if the overhang is at the 3 'end of the strand S1.
  • the dsRNA has a strand S2 in addition to the strand S1, i.e. it is made up of two single strands.
  • the dsRNA is particularly effective when the strand S1 (antisense strand) has a length of 23 nucleotides, the strand S2 has a length of 21 nucleotides and the 3 'end of the strand S1 has a single-stranded overhang formed from two nucleotides.
  • the end of the dsRNA located at the 5 'end of the strand S1 is smooth.
  • the strand S1 can be complementary to the primary or processed RNA transcript of the target gene.
  • the dsRNA can be present in a preparation which is suitable for inhalation, oral ingestion, infusion and injection, in particular for intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection.
  • the preparation can, in particular exclusively, consist of a physiologically compatible solvent, preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, and the dsRNA.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • the dsRNA is preferably located in a physiologically compatible solution, in particular a physiologically compatible buffer or a physiological saline solution, or enclosed by or on an icellar structure, preferably a liposome, a virus capsid, a capsoid or a polymeric nano or microcapsule polymeric nano or microcapsule bound.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • An icular structure, a virus capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA into infected cells.
  • the polymeric nano or micro capsule consists of at least one biodegradable polymer, e.g. Polybutyl cyanoacrylate.
  • the polymeric nano- or microcapsule can transport and release dsRNA contained in or bound to it in the body.
  • the dsRNA can be administered orally, by inhalation, infusion or injection, in particular intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection.
  • the dsRNA is preferably used in a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per kg of body weight and day. It has been shown that the dsRNA already has an excellent effectiveness in inhibiting the expression of the given target gene even at this dosage.
  • the invention further relates to a medicament for the targeted inhibition of the expression in a cell of a given target gene which is point-mutated with respect to an original gene, the medicament containing a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA), a strand S1 of the dsRNA being one of the target genes.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • a strand S1 of the dsRNA being one of the target genes.
  • the medicament is preferably present in at least one administration unit which contains the dsRNA in an amount which has a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular allows a maximum of 25 ⁇ g per kg body weight and day.
  • the administration unit can be designed for a single administration or intake per day. Then the entire daily dose is contained in one administration unit. If the administration unit is designed for repeated administration or ingestion per day, the dsRNA is contained therein in a correspondingly smaller amount which enables the daily dose to be reached.
  • the administration unit can also be designed for a single administration or ingestion for several days, e.g. B. by releasing the dsRNA over several days. The administration unit then contains a corresponding multiple of the daily dose.
  • Source gene of point mutated target gene is provided in a cell, a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) being introduced into the cell and a strand S1 of the dsRNA having a region complementary to the target gene in which at least one nucleotide is not complementary to the target gene and the number of nucleotides which are not complementary to the original gene are at least one higher than the number of nucleotides which are not complementary to the target gene.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • FIG. 1 shows a graphic representation of the inhibition of the expression of an HCV-luciferase fusion protein by dsRNAs, which are to a different extent complementary to a sequence of a target gene and
  • FIG. 2 shows a graphical representation of the inhibition of the expression of an HCV-luciferase fusion protein by dsRNAs, which are complementary to a different extent to a sequence of a target gene and are partially formed from RNA strands which are not completely complementary to one another.
  • a 26 nucleotide long sequence of a cDNA sequence serving as the target gene and corresponding to the 3 'untranslated region of an HCV-RNA was fused with the open reading frame of the luciferase gene from the expression vector pGL3.
  • the expression vector pGL3 comes from the Promega company and has been registered under the Gene Accession Number U47296 at the National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA. Nucleotides 280 to 1932 were used as the luciferase gene.
  • the 26 nucleotide long sequence is a highly conserved sequence found in a large number of HCV genomes and their subtypes.
  • nucleotides 9531 to 9556 correspond to nucleotides 9531 to 9556. They have the following sequence: 5'-gtcacggct agctgtgaaa ggtccgt-3 '(SEQ ID NO: 1).
  • the resulting fusion gene is a BamHI / NotI DNA fragment in the eukaryotic expression plasmid pcDNA 3.1 (+) from Invitrogen GmbH, Technologiepark Düsseldorf, Em y-Noether Strasse 10, D-76131 Düsseldorf, catalog No. V790-20 , has been cloned.
  • the resulting plasmid is called p8.
  • This plasmid codes for the enzyme ⁇ -galactosidase and causes its expression.
  • the plasmid containing the fusion gene, the control plasmid and different dsRNAs are combined by transfection into cells of the HuH-7 liver cell line (JCRB0403, Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1-18-1 , Setagaya-ku, Tokyo 158, Japan).
  • the inhibition of the expression of the luciferase gene brought about by the dsRNAs has been determined in relation to the expression of the ⁇ -galactosidase gene.
  • the dsRNAs used have the following sequences, designated SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 13 in the sequence listing:
  • HCV1 + 2 the strand S1 of which is completely complementary to the HCV sequence in the fused HCV luciferase gene:
  • HCV3 + 4 which is neither complementary to the HCV nor to the luciferase sequence in the fused HCV-luciferase gene and serves as a negative control:
  • S2 5'- AGA CAG UCG ACU UCA GCC U GG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Sl 3'-GG UCU GUC AGC UGA AGU CGG A -5' (SEQ ID NO: 13)
  • HCV5 + 6 the strand S1 of which, apart from the nucleotide highlighted in bold, is complementary to the HCV sequence in the fused HCV luciferase gene:
  • S2 5'- ACG GCU AGC UGU GAA UGG UCC GU-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Sl 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU ACC AGG -5 '(SEQ ID NO: 7)
  • HCV7 + 8 the strand S1 of which, apart from the two nucleotides highlighted in bold, is complementary to the HCV sequence in the fused HCV luciferase gene:
  • S2 5'- ACG GCA AGC UGU GAA UGG UCC GU-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Sl 3' -AG UGC CGU UCG ACA CUU ACC AGG -5 '(SEQ ID NO: 9)
  • K3s + K3as which is neither complementary to the HCV nor to a luciferase sequence in the fused HCV luciferase gene and serves as a negative control:
  • S2 5 '- G AUG AGG AUC GUU UCG CAU GA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • Sl 3'-UCC UAC UCC UAG CAA AGC GUA -5 '(SEQ ID NO: 5) HCV5 + 2, whose strand S1 is completely complementary to the HCV sequence and whose strand S2 is complementary to the HCV sequence in the fused HCV-luciferase gene apart from the nucleotide highlighted in bold:
  • S2 5'- ACG GCU AGC UGU GAA UGG UCC GU-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Sl 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU UCC AGG -5 '(SEQ ID NO: 3)
  • HCV1 + 6 whose strand S2 is completely complementary to the HCV sequence and whose strand S1 is complementary to the HCV sequence in the fused HCV-luciferase gene, apart from the nucleotide highlighted in bold:
  • S2 5'- ACG GCU AGC UGU GAA AGG UCC GU-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Sl 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU ACC AGG -5 '(SEQ ID NO: 7)
  • HuH-7 cells have been cultured in DMEM with 10% FCS. To prepare for a transfection, 2 x 10E4 cells were sown per well of a 96-well cell culture plate. The cells were transfected 24 hours after sowing using 110 ⁇ l of transfection medium per well of the 96-well cell culture plate and cultivated further in this total volume. Each transfection has been done in triplicate.
  • the transfection medium contained 0.25 ⁇ g of the mixture of the plasmids and 200, 100, 50, 25, 12.5 or 0 nmol / 1 of one of the dsRNAs mentioned per well.
  • the effect of the dsRNAs used was determined by quantifying the expressed ⁇ -galactosidase using "Galacto-Star” from Tropix, 47 Wiggins Avenue, Bedford, MA 01730, USA catalog number BM100S, and the effect of the expressed luciferase using "Luciferase "from Tropix, catalog number BC100L, determined by chemiluminescence reaction.
  • lysates of the cells were produced in accordance with the manufacturer's instructions and 2 ⁇ l of each for analysis for the detection of ⁇ -galactosidase and 5 ⁇ l for each analysis for detection of luciferase.
  • the chemiluminescence was measured in a Sirius lunometer from Berthold Detection Systems GmbH, Bleichstrasse 56-68, D-75173 Pforzheim, Germany.
  • the relative activity of the luciferase as a measure of the expression is determined by dividing the value of the chemiluminescence determined for luciferase by the value determined for ⁇ -galactosidase. An average is calculated for every 3 values determined in this way.
  • the mean for cells transfected without dsRNA is arbitrarily defined as 1.0. The other mean values are related to this and are shown graphically in FIGS. 1 and 2.
  • Lucl + 2 led to the greatest inhibition of luciferase activity (FIGS. 1 and 2).
  • HCV1 + 2 which was completely complementary to the target sequence for the reporter plasmid, a clear reduction in the luciferase activity can also be seen (FIGS. 1 and 2).
  • HCV7 + 8 inhibits the expression of luciferase both at high and at low concentrations only to the extent of the negative controls HCV3 + 4 and K3S + K3AS (FIGS. 1 and 2).
  • the low inhibition of luciferase activity is considered to be an unspecific effect.
  • a nucleotide in the sense strand S2 is not complementary to the antisense strand S1, the antisense strand S1 being completely complementary to the target gene.
  • This dsRNA is as efficient as LUC1 + 2 and HCVl + 2 (Fig. 1 + 2). This is surprising since a complementarity reduced by one base pair within the dsRNA means that the stability of the dsRNA in the cell and therefore less efficiency could be expected.
  • HCV6 + 1 a nucleotide in the antisense strand S1 is not complementary to the sense strand S2, and the antisense strand S1 is also not complementary to the target gene with a nucleotide.
  • HCV6 + 1 inhibits expression less efficiently than HCV5 + 6, but more efficiently than HCV7 + 8 (Fig. 2).
  • the sequence of the antisense strand S1 is more important than that of the sense strand S2.
  • the HCV3 + 4 (FIG. 1) and K3S + K3AS (FIG. 2) serving as a negative control led to little or no inhibition of the luciferase activity. The low inhibition is unspecific, since it does not depend on the concentration of the dsRNAs used.
  • the data show that at least two nucleotides which are not complementary to an original gene are necessary in the antisense strand of a dsRNA in order to prevent inhibition of the expression of the original gene. Furthermore, the data show that the effectiveness of the inhibition of expression by a dsRNA can be modulated by reducing the degree of complementarity of the single strands forming the dsRNA.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei ein Strang S1 der dsRNA einem zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen und mindestens ein Nukleotid mehr als zum Zielgen nicht komplementär zum Ursprungsgen ist.

Description

Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle. Sie betrifft weiterhin die Verwendung einer solchen Ribonukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments, ein Medikament und ein Verfahren zur gezielten Hemmung der Expression des genannten Zielgens in einer Zelle.
Aus der DE 101 00 586 Cl ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle bekannt, bei dem ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt wird. Ein Strang der doppelsträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen.
Aus Elbashir, S. M. et al . , Nature 411 (2001), Seiten 494 - 498 ist es bekannt, dass eine kurze dsRNA, in welcher drei Nukleotide nicht komplementär zum Zielgen sind, die Expression eines Zielgens kaum noch hemmt. Eine vollständig komplementäre dsRNA bewirkt dagegen eine effektive Hemmung der Expression des Zielgens.
Aus Holen, T. et al . , Nucleic Acids Research 30 (2002), Seiten 1757 - 1766, ist es bekannt, dass eine Hemmung der Expression eines Gens durch kurze dsRNA im Wege der RNA- Interferenz auch mit dsRNAs möglich ist, deren einer Strang ein oder zwei zum Zielgen nicht komplementäre Nukleotide auf- weist.
Viele Krankheiten und Entartungen von Zellen beruhen darauf, dass ein für Zellen wichtiges Gen, häufig ein Proto-Onkogen, durch eine oder wenige Punktmutationen verändert ist. Das Problem bei der Behandlung einer solchen Krankheit oder sol- eher Zellen mit den bisher bekannten Methoden besteht darin, dass die Inhibition der Expression des mutierten Gens häufig ebenfalls zu einer Inhibition des nicht mutierten Gens führt. Dies hat oft gravierende Nebenwirkungen zur Folge.
Aufgabe der vorliegende Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu vermeiden. Insbesondere soll eine Verwendung einer dsRNA zur gezielten Hemmung der Expression eines gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle bereitgestellt werden, bei der die Expression des Ursprungsgens weitgehend unbeeinflusst bleibt. Weiterhin soll ein Medikament und ein Verfahren zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens sowie eine Verwendung zur Herstellung des Medikaments bereitgestellt werden. Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 2, 18 und 33 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 17, 19 bis 32 und 34 bis 44.
Erfindungsgemäß ist eine Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einen Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle vorgesehen, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer solchen dsRNA zur Herstellung eines Medikaments zur ge- zielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle. Ein Nukleotid ist im Sinne dieser Erfindung "komplementär" zum Zielgen oder Ursprungsgen, wenn es mit einem ihm darin in seiner Sequenzposition entsprechenden Nukleotid eine spezifi- sehe Watson-Crick-Basenpaarung ausbilden kann. Unter dem "komplementären Bereich" wird verstanden, dass die darin enthaltenen Nukleotide im Wesentlichen komplementär zum Zielgen sind. Das bedeutet, dass nicht alle Nukleotide in dem Bereich komplementär zum Zielgen sind. Die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind, ist im niedrigsten Fall eins. Unter dem Zielgen wird im Allgemeinen der DNA-Strang- der doppelsträngigen in der Zelle vorhandenen DNA verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Es handelt sich dabei also im
Allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang Sl kann somit komplementär zu einem bei der Expression gebildeten RNA- Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z.B. einer mRNA, sein. Es kann z.B. ausreichend sein, wenn der Strang Sl komplementär zu einem Teil des 3 ' -untranslatierten Bereichs der mRNA ist. Bei dem Zielgen kann es sich aber auch um einen Teil eines viralen Genoms handeln. Das virale Genom kann auch das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus, insbesondere eines Hepatitis C-Virus, sein.
Das Ursprungsgen kann jedes beliebige Gen sein, welches von dem zu hemmenden Zielgen nur durch eine oder wenige Punktmutationen abweicht. Im Allgemeinen handelt es sich dabei um ein Wildtyp-Gen. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Nukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelsträngige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen innerhalb der dsRNA kanonische Watson-Crick- Basenpaarung aufweisen. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenden Strang. Der zum Zielgen komplementäre Bereich kann weniger als 25 aufeinander folgende Nukleotide, insbesondere 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweisen. Der Strang Sl kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweisen. Es hat sich gezeigt, dass kurze dsRNAs besonders effizient in der Hemmung der Expression eines Zielgens sind. Diese dsRNAs werden auch als siRNAs (short inter- fering RNAs) bezeichnet.
Bei der gezielten Hemmung wird die Expression des Ursprungsgens weniger inhibiert als diejenige des Zielgens. Im Idealfall bleibt die Expression des Ursprungsgens weit gehend un- beeinflusst. Dazu wird gezielt eine die Expression des Ziel- gens nicht optimal hemmende dsRNA verwendet. So kann eine dsRNA bereitgestellt werden, welche zum Ursprungsgen so wenig komplementär ist, dass dessen Expression weit gehend unbeein- flusst bleibt. Nebenwirkungen durch Hemmung des Ursprungsgens können vermieden oder verringert werden.
Die Hemmung der Expression durch die dsRNA erfolgt vorzugsweise nach dem Prinzip der RNA-Interferenz . Das zum Zielgen nicht komplementäre Nukleotid ist bevorzugt nicht am 3 ' - oder am 5 ' -Ende des Bereichs gelegen. Idealerweise liegt das nicht komplementäre Nukleotid im mittleren Teil des Bereichs. Das
Zielgen kann gegenüber dem Ursprungsgen eine oder zwei Punktmutationen aufweisen. Dann ist die erfindungsgemäße Verwendung zur gezielten Hemmung der Expression des Zielgens besonders geeignet, gezielt nur diese Expression, nicht aber die- enige des Ursprungsgens zu hemmen.
Bei einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Ursprungsgen ein Proto-Onkogen und das Zielgen ein davon abgeleitetes On- kogen. Ein Onkogen unterscheidet sich häufig von dem ihm ent- sprechenden zellulären Proto-Onkogen nur durch eine einzige Punktmutation. Die Hemmung der Expression des Onkogens mit herkömmlicher dsRNA bewirkt daher üblicherweise auch eine Hemmung der Expression des entsprechenden Proto-Onkogens . Das ist häufig mit so schwer wiegenden Nebenwirkungen verbunden, dass eine Verwendung herkömmlicher dsRNA zur Hemmung des Zielgens in einem Organismus kaum möglich ist.
Die Zelle kann dabei eine Tumorzelle sein. Bei einer Ausge- staltung der Erfindung ist ein Nukleotid des Bereichs nicht komplementär zum Zielgen und zwei Nukleotide des Bereichs sind nicht komplementär zum Ursprungsgen. Bereits ein derart geringer Unterschied in der Zahl komplementärer Nukleotide kann ausreichen, um die Expression des Zielgens nahezu voll- ständig zu hemmen und die Expression des Ursprungsgens weitgehend unbeeinflusst zu lassen.
In einer Ausgestaltung des Verfahrens ist innerhalb der dsRNA mindestens ein Basenpaar nicht komplementär, d.h. die Nukleo- tide des Basenpaars sind nicht spezifisch nach Watson-Crick gepaart. Durch die Variation der Zahl der nicht komplementären Basenpaare innerhalb der dsRNA kann die Wirksamkeit der dsRNA moduliert werden. Eine reduzierte Komplementär!tat innerhalb der dsRNA verringert deren Stabilität in der Zelle.
Vorzugsweise weist die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5 ' - und ein 3 ' - Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang Sl bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem Strang Sl und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dann jeweils von einem auf dem Strang Sl und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet. Einzelsträngige Überhänge verringern die Stabilität der dsRNA in Blut, Serum und Zellen und verstärken gleichzeitig die expressionshemmende Wirkung der dsRNA. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist. Das andere Ende ist dann bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der expressionshemmenden Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend beständig und besonders wirksam erwiesen. Die Hemmung der Expression ist besonders effektiv, wenn sich der Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 auf, d.h. sie ist aus zwei Einzelsträngen gebildet. Beson- ders wirksam ist die dsRNA, wenn der Strang Sl (Antisinn- Strang) eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA ist dabei glatt ausgebildet.
Der Strang Sl kann zum primären oder prozessierten RNA- Transkript des Zielgens komplementär sein. Die dsRNA kann in einer Zubereitung vorliegen, die zur Inhalation, oralen Auf- nähme, Infusion und Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Die Zubereitung kann dabei, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlö- sung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, und der dsRNA bestehen. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein.. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einem solchen Lösungsmittel oder einem solchen Puffer gelöste und verabreichte dsRNA von der Zelle aufgenommen wird und die Expression des Zielgens hemmt, ohne dass die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss.
Vorzugsweise liegt die dsRNA in einer physiologisch verträg- liehen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer icellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vor. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein. Eine icel- lare Struktur, ein Virus-Kapsid, ein Kapsoid oder eine poly- mere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in infizierte Zellen erleichtern. Die polymere Nano- oder Mikro- kapsei besteht aus mindestens einem biologisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacrylat . Die polymere Nano- oder Mikrokapsel kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen. Die dsRNA kann oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbeson- dere intravenöser, intraperitonealer oder intratumoraler Infusion oder Injektion, verabreicht werden. Vorzugsweise wird die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, ins- besondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag verwendet. Es hat es sich nämlich gezeigt, dass die dsRNA bereits in dieser Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Hemmung der Expression des vorgegebenen Zielgens aufweist .
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Medikament zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei das Medikament eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen kom- plementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind. Vorzugsweise liegt das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vor, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht. Die Verabreichungseinheit kann für eine einmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert sein. Dann ist die gesamte Tagesdosis in einer Verabreichungseinheit enthalten. Ist die Verab- reichungseinheit für eine mehrmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert, so ist die dsRNA darin in einer entsprechend geringeren das Erreichen der Tagesdosis ermöglichenden Menge enthalten. Die Verabreichungseinheit kann auch für eine einzige Verabreichung bzw. Einnahme für mehrere Tage konzipiert sein, z. B. indem die dsRNA über mehrere Tage freigesetzt wird. Die Verabreichungseinheit enthält dann ein entsprechend Mehrfaches der Tagesdosis.
Erfindungsgemäß ist weiterhin ein Verfahren zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem
Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle vorgesehen, wobei eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird und ein Strang Sl der dsRNA einem zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem min- destens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ur- sprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind. Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Medikaments und des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beispielhaft erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine grafische Darstellung der Hemmung der Expression eines HCV-Luziferase-Fusionsproteins durch dsRNAs, welche in unterschiedlichem Maße komplementär zu einer Sequenz eines Zielgens sind und
Fig. 2 eine grafische Darstellung der Hemmung der Expression eines HCV-Luziferase-Fusionsproteins durch dsRNAs, welche in unterschiedlichem Maße komplementär zu einer Sequenz eines Zielgens sind und teilweise aus nicht vollständig zueinander komplementären RNA-Strängen gebildet sind.
Zu Herstellung eines Reportersystems wurde eine 26 Nukleotide lange Sequenz einer als Zielgen dienenden, dem 3 ' -nicht- translatierten Bereich einer HCV-RNA entsprechenden cDNA- Sequenz mit dem offenen Leserahmen des Luziferase-Gens aus dem Expressionsvektor pGL3 fusioniert. Der Expressionsvektor pGL3 stammt von der Firma Promega und ist unter der Gene Accession Number U47296 beim National Center for Biotechnology Information (NCBI) , National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA, registriert worden. Als Luzife- rase-Gen sind die Nukleotide 280 bis 1932 verwendet worden. Die 26 Nukleotide lange Sequenz ist eine in sehr vielen HCV- Genomen und deren Subtypen vorkommende hoch konservierte Sequenz. Bei dem unter der Gene Accession Number D89815 beim NCBI registrierten HCV-Genom entsprechen die 26 Nukleotide den Nukleotiden 9531 bis 9556. Sie weisen die folgende Se- quenz auf: 5'-gtcacggct agctgtgaaa ggtccgt-3' (SEQ ID NO: 1).
Das resultierende Fusions-Gen ist als BamHI/Notl-DNA-Fragment in das eukaryotische Expressionsplasmid pcDNA 3.1 (+) von der Firma Invitrogen GmbH, Technologiepark Karlsruhe, Em y- Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe, Katalog Nr. V790-20, kloniert worden. Das resultierende Plasmid wird als p8 bezeichnet.
Als Kontrolle für die Transfektionseffizienz ist das Plasmid pCMVßGal der Firma Clontech, Gene Accession Number U13186, NCBI, verwendet worden. Dieses Plasmid kodiert für das Enzym ß-Galaktosidase und bewirkt dessen Expression.
Das das Fusions-Gen enthaltende Plasmid, das zur Kontrolle dienende Plasmid und unterschiedliche dsRNAs sind gemeinsam durch Transfektion in Zellen der Leberzelllinie HuH-7 (JCRB0403, Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1- 18-1, Setagaya-ku, Tokyo 158, Japan) eingeführt worden. Die durch die dsRNAs herbeigeführte Hemmung der Expression des Luziferase-Gens ist im Verhältnis zur Expression des ß- Galaktosidase-Gens bestimmt worden.
Die eingesetzten dsRNAs weisen folgende, im Sequenzprotokoll mit SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 13 bezeichneten Sequenzen auf:
HCV1+2, deren Strang Sl vollständig komplementär zu der HCV- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist:
S2: 5'- ACG GCU AGC UGU GAA AGG UCC GU-3 ' (SEQ ID NO : 2 ) Sl: 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU UCC AGG -5' (SEQ ID NO : 3 ) HCV3+4, welche weder zu der HCV- noch zu der Luziferase- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen komplementär ist und als Negativkontrolle dient:
S2: 5'- AGA CAG UCG ACU UCA GCC U GG-3' (SEQ ID NO: 12) Sl: 3'-GG UCU GUC AGC UGA AGU CGG A -5' (SEQ ID NO: 13)
HCV5+6, deren Strang Sl abgesehen von dem durch Fettdruck hervorgehobenen Nukleotid komplementär zu der HCV-Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist:
S2: 5'- ACG GCU AGC UGU GAA UGG UCC GU-3' (SEQ ID NO: 6) Sl: 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU ACC AGG -5' (SEQ ID NO : 7 )
HCV7+8, deren Strang Sl abgesehen von den zwei durch Fettdruck hervorgehobenen Nukleotiden komplementär zu der HCV- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist:
S2: 5'- ACG GCA AGC UGU GAA UGG UCC GU-3' (SEQ ID NO: 8) Sl: 3' -AG UGC CGU UCG ACA CUU ACC AGG -5' (SEQ ID NO: 9)
Lucl+2, deren Strang Sl vollständig komplementär zu einer Lu- ziferase-Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist und als Positivkontrolle dient:
S2: 5'- CGU UAU UUA UCG GAG UUG CAG UU-3' (SEQ ID NO: 10)
Sl: 3'-GC GCA AUA AAU AGC CUC AAC GUC -5' (SEQ ID NO: 11)
K3s+K3as, welche weder zu der HCV- noch zu einer Luziferase- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen komplementär ist und als Negativkontrolle dient:
S2: 5 '- G AUG AGG AUC GUU UCG CAU GA-3 ' (SEQ ID NO : 4) Sl: 3'-UCC UAC UCC UAG CAA AGC GUA -5' (SEQ ID NO : 5) HCV5+2, deren Strang Sl vollständig komplementär zu der HCV- Sequenz ist und deren Strang S2 abgesehen von dem durch Fettdruck hervorgehobenen Nukleotid komplementär zu der HCV- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist:
S2: 5'- ACG GCU AGC UGU GAA UGG UCC GU-3' (SEQ ID NO: 6) Sl: 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU UCC AGG -5' (SEQ ID NO : 3 )
HCV1+6, deren Strang S2 vollständig komplementär zu der HCV- Sequenz ist und deren Strang Sl abgesehen von dem durch Fettdruck hervorgehobenen Nukleotid komplementär zu der HCV- Sequenz in dem fusionierten HCV-Luziferase-Gen ist:
S2: 5'- ACG GCU AGC UGU GAA AGG UCC GU-3' (SEQ ID NO : 2 ) Sl: 3' -AG UGC CGA UCG ACA CUU ACC AGG -5' (SEQ ID NO : 7 )
HuH-7-Zellen sind in DMEM mit 10 % FCS kultiviert worden. Zur Vorbereitung einer Transfektion wurden 2 x 10E4 Zellen pro Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte ausgesät. Die Zel- len sind 24 Stunden nach der Aussaat mittels je 110 μl Trans- fektionsmedium pro Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte transfiziert und in diesem Gesamtvolumen weiter kultiviert worden. Jede Transfektion ist dreifach durchgeführt worden.
Dazu sind zunächst 3 μg des Plasmids pCMVßGal mit 1 μg des Plasmids p8 gemischt worden. Das Transfektionsmedium enthielt je Vertiefung 0,25 μg des Gemischs der Plasmide und 200, 100, 50, 25, 12,5 oder 0 nmol/1 einer der genannten dsRNAs .
Zur Transfektion wurde "Gene Porter 2" der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str . 2 b, D-91052 Erlangen, Katalog Nummer 13-T202007 gemäß Herstellervorschrift eingesetzt. Anschließend sind die Zellen bei 37°C und 5% C02 inkubiert worden. Einen Tag nach der Transfektion sind pro Vertiefung 35 μl frisches Medium zugegeben und die Zellen für weitere 24 h inkubiert worden.
Der Effekt der eingesetzten dsRNAs wurde durch Quantifizierung der expri ierten ß-Galactosidase mittels "Galacto-Star" der Firma Tropix, 47 Wiggins Avenue, Bedford, MA 01730, USA Katalog-Nummer BM100S, und der Effekt der exprimierten Luzi- ferase mittels "Luciferase" der Firma Tropix, Katalog-Nummer BC100L, durch Chemolumineszenz-Reaktion ermittelt. Dazu wurden Lysate der Zellen gemäß den Herstellervorschriften hergestellt und davon für den Nachweis der ß-Galactosidase je 2 μl pro Analyse und für den Nachweis der Luziferase je 5 μl pro Analyse eingesetzt. Die Messung der Chemolumineszenz erfolgte in einem Sirius-Lu inometer der Firma Berthold Detec- tion Systems GmbH, Bleichstrasse 56-68, D-75173 Pforzheim, Deutschland. Die relative Aktivität der Luziferase als Maß für die Expression wird ermittelt, indem jeweils der für Lu- ziferase ermittelte Wert der Chemolumineszenz durch den für ß-Galactosidase ermittelten Wert dividiert wird. Für jeweils 3 so ermittelte Werte wird ein Mittelwert berechnet. Der Mittelwert für ohne dsRNA transfizierte Zellen wird willkürlich als 1,0 definiert. Die anderen Mittelwerte sind dazu ins Ver- hältnis gesetzt und in den Figuren 1 und 2 grafisch dargestellt.
Lucl+2 (Positivkontrolle) führte zur stärksten Hemmung der Luziferaseaktivität (Fig. 1 und 2) . In Gegenwart von HCV1+2 , welches vollständig komplementär zur Zielsequenz für das Re- porterplasmid war, ist ebenfalls eine deutliche Reduktion der Luziferaseaktivität erkennbar (Fig. 1 und 2). Mit abnehmender Konzentration von HCV1+2 stieg die Luziferaseaktivität an. Das in einem Nukleotid nicht zur Zielsequenz komplementäre Oligonukleotid HCV5+6 ist ähnlich effizient in der Luzifera- sehemmung wie HCVl+2, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen (Fig. 1) . Für die Spezifität dieser dsRNA bedeutet das, dass es nicht ausreicht, wenn die dsRNA zum Zielgen komplementär, aber zum Ursprungsgen mit einem Nukleotid nicht komplementär ist, um die Expression des Zielgens spezifisch gegenüber der Expression des Ursprungsgens zu hemmen.
HCV7+8 hemmt die Expression der Luziferase sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Konzentrationen nur im Maße der Nega- tivkontrollen HCV3+4 und K3S+K3AS (Fig. 1 und 2) . Die geringe Hemmung der Luziferaseaktivität ist als unspezifischer Effekt zu erachten. Für die Spezifität dieser dsRNA bedeutet das, dass es ausreicht, wenn die dsRNA zu dem Zielgen komplementär oder nur mit einem Nukleotid nicht komplementär, aber zum Ur- sprungsgen in zwei Nukleotiden nicht komplementär ist, um die Expression des Zielgens spezifisch gegenüber der Expression des Ursprungsgens zu hemmen.
In HCV5+2 ist ein Nukleotid im Sinn-Strang S2 nicht komple- mentär zum Antisinn-Strang Sl, wobei der Antisinn-Strang Sl vollständig komplementär zum Zielgen ist. Diese dsRNA ist so effizient wie LUC1+2 und HCVl+2 (Fig. 1 + 2) . Das ist überraschend, da eine um ein Basenpaar reduzierte Komple entarität innerhalb der dsRNA eine geringere Stabilität der dsRNA in der Zelle und deshalb eine geringere Effizienz erwarten ließ.
In HCV6+1 ist ein Nukleotid im Antisinn-Strang Sl nicht komplementär zum Sinn-Strang S2 , wobei der Antisinn-Strang Sl auch mit einem Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist. HCV6+1 hemmt die Expression weniger effizient als HCV5+6, aber effizienter als HCV7+8 (Fig. 2) . Für die Spezifität und Effizienz der expressionshemmenden Wirkung der dsRNA kommt es somit mehr auf die Sequenz des Antisinn-Strangs Sl als diejenige des Sinn-Strangs S2 an. Die als Negativkontrolle dienenden HCV3+4 (Fig. 1) und K3S+K3AS (Fig. 2) führten zu keiner bzw. einer geringen Hemmung der Luziferase-Aktivität . Die geringe Hemmung ist unspezifisch, da sie nicht von der eingesetzten Konzentration der dsRNAs abhängt.
Die Daten zeigen, dass mindestens zwei nicht zu einem Ursprungsgen komplementäre Nukleotide im Antisinn-Strang einer dsRNA notwendig sind, um eine Inhibition der Expression des Ursprungsgens zu verhindern. Weiterhin zeigen die Daten, dass eine Modulation der Wirksamkeit der Hemmung der Expression durch eine dsRNA möglich ist, indem das Maß der Komplementa- rität der die dsRNA bildenden Einzelstränge verringert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind.
2. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber ei- nem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungs- gen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zum Zielgen nicht komplementäre Nukleotid nicht am 3 ' - oder am 5 ' - Ende des Bereichs gelegen ist.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen gegenüber dem Ursprungsgen eine oder zwei Punktmutationen aufweist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ursprungsgen ein Proto-Onkogen und das Zielgen ein davon abgeleitetes Onkogen ist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Nukleotid des Bereichs nicht komplementär zum Zielgen ist und zwei Nukleotide des Bereichs nicht komplementär zum Ursprungsgen sind.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei innerhalb der dsRNA mindestens ein Basenpaar nicht komplementär ist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten ein- zelsträngigen Überhang aufweist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten ein- zelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA- Transkript des Zielgens komplementär ist.
13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur In ala- tion, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbeson- dere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumo- ralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch ver- träglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, , und der dsRNA besteht.
15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer physiologisch verträglichen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
16. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenöser, intraperitonealer oder intratumoraler Infusion oder Injektion, verabreicht wird.
17. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höch- stens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag verwendet wird.
18. Medikament zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei das Medikament eine dop- pelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, deren einer Strang Sl einen zum Zielgen komplementären Bereich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht kom- plementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind.
19. Medikament nach Anspruch 18, wobei das zum Zielgen nicht komplementäre Nukleotid nicht am 3 ' - oder am 5 ' -Ende des Bereichs gelegen ist.
20. Medikament nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Zielgen gegenüber dem Ursprungsgen eine oder zwei Punktmutationen aufweist.
21. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Ursprungsgen ein Proto-Onkogen und das Zielgen ein davon abgeleitetes Onkogen ist.
22. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
23. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei ein Nukleotid des Bereichs nicht komplementär zum Zielgen ist und zwei Nukleotide des Bereichs nicht komplementär zum Ursprungsgen sind.
24. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei innerhalb der dsRNA mindestens ein Basenpaar nicht komplementär ist
25. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist.
26. Medikament nach Anspruch 25, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
27. Medikament nach Anspruch 26, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
28. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist.
29. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
30. Medikament nach Anspruch 29, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträgli- chen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, , und der dsRNA besteht.
31. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physio- logischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren
Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt .
32. Medikament nach einem der Ansprüche 18 bis 31, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vorliegt, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
33. Verfahren zur gezielten Hemmung der Expression eines vorgegebenen, gegenüber einem Ursprungsgen punktmutierten Zielgens in einer Zelle, wobei eine doppeisträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird und ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen komplementären Be- reich aufweist, in welchem mindestens ein Nukleotid nicht komplementär zum Zielgen ist und die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Ursprungsgen sind, um mindestens eins höher ist als die Anzahl der Nukleotide, welche nicht komplementär zum Zielgen sind.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das zum Zielgen nicht komplementäre Nukleotid nicht am 3 ' - oder am 5 ' -Ende des Bereichs gelegen ist.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei das Zielgen gegenüber dem Ursprungsgen eine oder zwei Punktmutationen aufweist.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei das Ursprungsgen ein Proto-Onkogen und das Zielgen ein davon abgeleitetes Onkogen ist.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei ein Nukleotid des Bereichs nicht komplementär zum Zielgen ist und zwei Nukleotide des Bereichs nicht komplementär zum Ursprungsgen sind.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei innerhalb der dsRNA mindestens ein Basenpaar nicht komplementär ist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis
4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 42, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 43, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt .
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