EP1087790A2 - Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines dans un medicament pour la therapie du cancer - Google Patents

Utilisation d'un compose possedant une affinite pour le recepteur mitochondrial des benzodiazepines dans un medicament pour la therapie du cancer

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EP1087790A2
EP1087790A2 EP99923718A EP99923718A EP1087790A2 EP 1087790 A2 EP1087790 A2 EP 1087790A2 EP 99923718 A EP99923718 A EP 99923718A EP 99923718 A EP99923718 A EP 99923718A EP 1087790 A2 EP1087790 A2 EP 1087790A2
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EP
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phenyl
alkyl
carbon atoms
apoptosis
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Withdrawn
Application number
EP99923718A
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German (de)
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Inventor
Guido Kroemer
Tamara Hirsch
Didier Decaudin
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines

Definitions

  • the present invention relates to the use of the product described above for the manufacture of a medicament intended for the treatment of cancer.
  • said medicament is intended to induce the death of ct7 tumor cells or to facilitate apoptosis.
  • PKI 1 195 facilitates the induction of apoptosis by a variety of sti uli.
  • PK I 1 195 appears to be the most effective of the co- inducers of apoptosis (relative efficacy: PK I 1195 greater than 4'-chlordiazepam>diazepam> Ro-5-4864), this result correlates with the antagonistic potential of these compounds on the mBzR receptor (Zisterer et al 1997).
  • PK I 1195 The synergism between PK I 1195 and several pro-apoptotic agents extends to everything that characterizes the phenomenon of apoptosis. These phenomena include the early loss of mitochondrial transmembrane potential (measured using the potential-sensitive DiOC 6 (3) dye), increased generation of reactive oxygen species (measured by conversion of hydroethidine in ethidinc catalyzed by suproxide anions (see FIGS. 1 to 4), the eradication of phosphatidylserine residues on the surface of the plasma membrane measured using anncxinc V conjugated to F1TC (see FIG.
  • PKI 1195 overcomes the protection conferred by Bcl-2 against glucocorticoids (see Figure 3B), against ⁇ irradiation, doxorubicin, cyclosporin A (see Figure 4B), and etoposide. This effect is also observed in the mitochondrion, the cell redox potential, and the nuclei (see Figures 3 and 4).
  • the present invention relates to a new strategy for improving the susceptibility of cells by the induction of apoptosis.
  • Example 8 Process for the preparation of N, N-diélltyl [(pI ⁇ ényI-2 trifIuoro ⁇ néthyl-8 ⁇ i ⁇ oli ⁇ yl-4) oxy] -2 propanamide.
  • clones which were found to be significantly less sensitive to apoptosis induced by a range of concentrations of agents inducing apoptosis in the absence than in the presence of tetracycline in the culture medium, that is to say when they overexpress the protein Bcl2 rather than when they do not overexpress it.
  • the agents inducing apoptosis tested were for example adriamycin (10-100 ⁇ g / rnl), terbutyl-hydroperoxide (25-100 ⁇ M), vincristine (0.03-0.003 ⁇ g / ml) and camptothecin (0.01- 0.1 ⁇ g / ml).
  • To quantify the induction of apoptosis it is possible, for example, to use the method for assaying apoptosis induced in a cell population described in A.
  • the compound is incorporated into the cell culture medium in the absence of an apoptosis-inducing agent and the clone is cultured in the presence of tetracycline (1 ⁇ g / ml) or anhydrotetracycline (0.5 ⁇ g / ml), that is, it does not overexpress the Bcl2 protein. In this situation, the percentage of cells in apoptosis P4 is determined.

Abstract

La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament notamment destiné à faciliter l'induction de l'apoptose.

Description

UTILISATION D'UN COMPOSE POSSEDANT UNE AFFINITE POUR LE
RECEPTEUR MITOCHONDRIAL DES BENZOD1ΛZEP1NES
EN THERAPIE DU CANCER.
La présente invention concerne notamment un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des bci odiazépincs, cl au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Un autre aspect de la présente invention porte sur l'utilisation dudit composé et/ou dudit produit de combinaison pour la fabrication d'un médicament destiné à faciliter l'induction de l'apoptose.
Les méthodes utilisées actuellement dans le traitement des cancers sont principalement la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces techniques consistent à éradiquer les cellules tumorales identifiées par le biais d'irradiations localisées ou par le biais d'inducteurs pharmacologiqucs de la mort cellulaire, Cependant, ces approches thérapeutiques ne sont pas spécifiques aux seules cellules tumorales. En effet, les tissus avoisinants sont également éradiqués et une toxicité très élevée est constatée. Considérant que les programmes naturels de la mort cellulaire (ou apoptosc) et de la sénescence ne fonctionnent plus chez les cellules tumorales, une approche pour traiter le cancer pourrait résider dans le rétablissement de ces programmes.
De manière générale, l'apoptose se caractérise par trois phases : Une phase d'initiation où les différents stimuli de mort empruntent des voies dites "privées" pour converger vers une phase cficctricc commune, qui conduit in fine à la phase de dégradation caractérisée par les manifestations biochi iques caractéristiques de la mort cellulaire. La phase cficctricc est mise en couvre par le porc de transition de perméabilité mitochondrialc, véritable senscur de la mort cellulaire puisque ses conformations ouvertes ou fermées déterminent le sort des cellules. Ces différentes conformations peuvent être induites par de nombreux ligands des composants de ce porc de transition de perméabilité.
Le pore de transition de perméabilité mitochondriale, communément appelé 5 mcga-canal ou canal à multiples conductances, participe dans la régulation du niveau de calcium dans la matrice, du pH, et du potentiel transmembranaire (ΔΨm) dans les mitochondries. Ce pore (PT) fonctionne donc comme un canal dépendant de Ca2', du voltage, du pH et du potentiel redox avec plusieurs niveaux de conductances et peu de sélectivité aux ions (Zoratti et al 1995, Kinnally et al 1996, Bernardi et al 1996, et
10 Ichas et al 1997). Récemment, il a été mis en évidence que l'ouverture du pore PT, qui est régulée par Bcl-2, est un événement critique dans le processus conduisant à l'apoptose (Krocmer et al 1997a et 1997b). L'ouverture du pore PT permet la dissipation du potentiel transmembranaire interne mitochondrial ((ΔvFnι), ce qui a pour conséquence de perturber l'intégrité de la membrane extérieure conduisant à la
15 libération des protéines intermembranaircs de la mitochondrie (Zamzami et al 1996, Susin et al 1997a, Kantrow et al 1997, et Ellerby et al 1997). En effet, la libération des protéines intramembranaires, telles que le cytochrome c, et/ou la dissipation du Δ I'„, sont les éléments communs de la phase précoce de l'apoptose (Kroemer et al 1997a et 1 97b, Liu et al 1996, Kluck et al 1997, Yang 1997, et Susin et al 1997b), En fonction
20 du système expérimental et du type cellulaire, une augmentation du volume de la matrice cause soit une perturbation physique de la membrane mitrochondriale externe puis la dissipation du ΔΨm (Kluck et al 1997, Yang et ni 1997, et Vandcr Heiden et al 1997), soit une perturbation de la membrane externe et la dissipation du ΔM'„, de la membrane interne de manière simultanée (Zamzami et al 1996 et Susin et al 1996 a).
25 Sur le plan théorique, les auteurs, mentionnés supra, ont postulé que l'augmentation du volume de la matrice, qui précède la réduction du Δ pourrait être contrôlée par l'ouverture du pore PT. Dans ce sens, le porc PT peut aussi bien opérer à un niveau de conductancc faible cl réversible (ce qui causerait une entrée d'ions et d'eau à l'intérieur de la matrice mitochondriale), qu'à un niveau de conductancc élevée et irréversible (ce
? ) qui conduirait à la perturbation du ΔTm). Le pore PT est un complexe multiprotéique formé au site de contact entre les membranes internes et externes mitochondrialcs. On observe une co-localisation du porc PT et de l'oncoprotéine Bcl-2 (De Jong et al 1994). La composition moléculaire exacte de ce porc reste une énigme. Cependant, on sait que des protéines du cytosol (hexokinase), de la membrane externe (récepteur mitochondrial des benzodiazépincs [mBzR], la porine mitochondriale, communément appelée canal à anion voltage dépendent), l'espace intermembranaire (créatine kinase), la membrane interne (adénine nucléotide translocateur, ANT) et la matrice (cyclophiline D) sont impliquées dans la formation du pore PT et/ou dans sa régulation (Zoratti et al, 1995, Beutner et al 1996, McEncry 1992, Kinnally et al 1993, O'Gorman 1997). Le pore PT est régulé par de multiples effecteurs endogènes, ce qui est en accord avec sont architecture composite complexe. Parmi ces effecteurs, on trouve les ions locaux et le gradient de pH, l'ADP/ATP, le NADPH, et les molécules impliquées dans la transduction du signal apoptotique telles que Ca2' ou des espèces réactives à l'oxygène. Ainsi, certaines des sous-unités du pore PT pourraient constituer des cibles pharmacologiques servant à moduler l'apoptose.
Des composés appartenant à la famille des isoquinoline carboxa ides ont été décrit dans US 4,801,595 comme étant utile pour le traitement de l'hypertension. Dans cet famille, PKI 1 195 ( l-(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3- isoquinoline carboxamide) est connu comme étant un ligand antagoniste prototypique du récepteur périphérique des benzodiazépincs mBzR (Ripond et al 1991 et Joseph- Liauzun et al 1997). Plus particulièrement, WO 93/1 1771 concerne l'utilisation de molécules telles que PK I 1 195 pour le traitement des maladies du système nerveux central, notamment les traumatismes.
Or, de manière surprenante, certains composés possédant une affinité pour le récepteur mitochondrial des benzodiazépincs permettent l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale, et les expériences, qui ont conduit à la présente invention, démontrent que PKI 1 195 et les composés de formule 11, II I, IV, et V décrits ci-après permettent notamment de faciliter la mort cellulaire.
Actuellement la cancérothérapie consiste en l'utilisation de la radiothérapie, de la chimiothérapie, ou de leur combinaison. Ces deux méthodes possèdent des effets secondaires néfastes très mal supportés par les patients. Ainsi l'utilisation d'agents pharmacologiqucs, visant à augmenter la susceptibilité des cellules tumorales à l'induction de l'apoptose, est très avantageuse. En effet, elle permet l'utilisation de doses moins fortes de produits de chimio- ou radiothérapie, ce qui minimise leurs effets secondaires. Les composants ayant une forte affinité pour les sous-unités du pore PT, évoquées supra, sont l'objet de la présente invention car ils permettent de faciliter l'apoptose et donc d'utiliser des doses inférieures de produits à fort effets secondaires. Cela permet également d'améliorer l'efficacité de certains traitements.
Ainsi, aucun document de l'art antérieur ne divulgue, ni ne suggère la présente invention telle que décrite ci-dessous.
Description de l'invention
Ainsi, la présente invention concerne un produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépincs, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer. Le terme cancer est utilisé dans un sens large qui regroupe toute néoplasie (par exemple les cancers, les sarcomes, les lymphomes et les leucémies).
Ledit compose est sélectionné parmi plusieurs familles de molécules possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial (périphérique) des benzodiazépincs, de préférence parmi les familles de formule générale I, II, 111, IV, et V décrites infra. • Dans la famille des isoquinolincs on choisit en particulier les molécules de formule générale 1 :
I
Dans laquelle
RI est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R2 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R3 est un atome d'halogène tel que Cl, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, les groupes RI , R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.
De manière avantageuse, ledit composé est le PKI 1 195 (disponible dans le commerce chez SIGMA sous la référence C 0424) répondant à la formule suivante ; l-(2- chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinolinc carboxamide.
Ce composé a été décrit dans Ferry A., 1989, Fund. Clin. Pharmacol., 3, 383 et dans Doble A. et al, 1985, Eur. J. Pharmacol., 1 19, 153.
«On choisit en particulier les molécules représentées par la formule II. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 210 084A1 , incorporé par référence dans la description.
II
dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH,
B représente un atome d'azote ou un groupe CH, V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène
(fluor, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phénylc, thiényle, pyridyle, ou phénylc substitué pamn ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou nitro, la chaîne -X-(CH2)„-(CHR)„,-CONR|R2 est fixée en position ortho ou para par rapport à D,
R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant I à 3 atomes de carbone,
Ri et R2 identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkylc comportant 3 à 6 atomes de carbone, phénylc, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alccnylc comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition que la double liaison ne soit pas située en position 1 , 2 par rapport à l'atome d'azote, Ri et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridinc, morpholinc ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3 , N-R^, SO, SO_ ou un atome d'oxygène ou de soufre. R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 ato es de carbone, R-i représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1 , n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, S02 ou N-R_ι, la somme m + n est au moins égaie à 1 , étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R.t, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de 1 et à l'exception du N,N-diméthylcarbamate de phényl-2 quinolylc-4. autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (lia) ou (11b)
dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, Ri, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.
Ces composés se lient aux récepteurs des benzodiazépincs du type périphérique (EP 210 0S A 1 page 1 1 , ligne 9-10). Au titre de composés particulièrement intéressants, on peut notamment citer ceux décrits de page 1 1 ligne 25 à la page 13 ligne 21 de EP 210 084A1.
• On choisit en particulier les molécules représentées par la formule III ci-dessous. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 248 734B 1 , incorporé par référence dans la description.
III
'
Dans laquelle Ri cl R/ identiques ou différents représentent des groupes alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée de C 1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkylc comporte 3 à 6 atomes de carbone ou phénylc,
Ri et R| ' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridinc.
Λr représente un radical phénylc, thiénylc ou phénylc substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fiuor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, nitro ou trifluorophénylc, ^ représente un des enchaînements suivants
Ces composés de formule III sont des ligands du récepteur périphérique (mitochondriale) des benzodiazépincs (EP 248 734B 1 page 4 lignes 46-54).
• On choisit en particulier ceux appartenant à la formule IV ci-dessous. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrits dans EP 1 12 776B 1 , incorporé par référence dans la description.
IV Dans laquelle R| est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C 1-C6, un groupe phényle, un groupe cycloalkylc possédant de C3-C6, un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dans lequel le radical alkyle contient de C1-C3, ou un groupe
Dans lequel Rj et Rj sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et Rj est un groupe alkenyle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans R3, R-i, et R5 étant comprise entre 2 et 5,
R2 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6 , un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dans lequel le radical alkyl contient de C1 -C3, un groupe
R3
R5
Dans lequel R3, j, et R5 sont définis comme ci-dessus, ou un groupe
Dans lequel n est 0, 1 , 2 ou 3, RI et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétéroeyele à 5, 6 ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote et l'oxygène et pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de C1-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkylc, diméthylaminoalkylc dont la partie alkyle est de C 1-C3, Z est un groupe phénylc, pyridyle, thicnyle, 2-thiazolylc ou un groupe phénylc substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, alkoxy, alkylthio en C 1-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro, 1 1
X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CM, Ou tout stéréoisomère de formule IV.
Parmi ces composés, ceux décrits dans les exemples 8, 10, 15-17, 18, 19-22, 37, 39, 43, et 51 de EP 1 12 776B 1 possèdent une affinité particulièrement élevée pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines (EP 1 12 776B 1 page 21 ).
•On choisit en particulier les molécules de formule V. Leurs formules et leurs procédés de préparation sont décrit dans EP 094 271 B 1 , incorporé par référence dans la description.
Dans laquelle,
Ri et R2 représentent indépendamment un groupe alkyle de C1 -C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkylc de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkylc dont la partie alkyle csi de C 1 -C3 ; Ri et R2 peuvent représenter également un groupe alcénylc ou alcynylc de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en position 1 -2 par rapport à l'atome d'azote ; Ri et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -RA dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié de C2- C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de C 1-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-Rj, Rj représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de C 1 -C3 ; R I cl R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétéroeyele comprenant éventuellement un second hétéroatome. Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les goupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1 -C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe nitro ; A et B sont indépendamment N ou CH.
Représente l'enchaînement
Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants :
\
/
X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène , halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de C1 -C3, le groupe nitro ou trifluorométhyle.
Les propriétés pharmacologiqucs de ces composés sont décrits à la page 1 I colonne 20 et à la page ! 2 colonne 21 de EP 094 271 B 1. On note la bonne affinité pour le récepteur mitochondriale des benzodiazépines particulièrement pour les molécules des exemples 1, 10, 16, 25, 32, 35, et 47 de EP 094 271B 1.
On désigne par agent inducteur de l'apoptose toute substance qui directement ou indirectement affecte la viabilité d'une cellule.
Ledit agent inducteur de l'apoptose de la présente invention peut être sélectionné notamment parmi les agents qui endommagent l'ADN, les iigands du récepteur aux glucocorticoïdes, ou parmi les seconds messagers pro-apoptotiques. Ces agents peuvent également être sélectionnés parmi ceux couramment employés dans le traitement du cancer. Ainsi, ledit second messager pro-apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatinc, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthanc sulfonoxy- alkancs, les dérivés de la pipérazine, parmi les inhibiteurs des topoisomerases tels que les inhibiteurs de la topoisomérasc-II, par exemple les anthracyclines, l'cpipodophyllotoxine tel que l'étoposidc, les inhibiteurs de la topoisomérase-I, par exemple les dérivés de la camptothecinc, parmi les antimétabolites tels que les antifolatcs, par exemple le méthotrexate, les antipurincs, par exemple la 6-mcrcaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la 5-fiuorouracilc, parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamidc, l'asparaginasc, la mitoguazone, la plicamycinc. Ces agents antinéoplastiqucs sont décrits dans Actualité Pharmaceutiques n°302 (Ocl 1992) pages 38 à 39 et 41 à 43 incorporées dans la description par référence.
De préférence, on choisit ledit agent inducteur de l'apoptose parmi les radiations gamma, l'étoposidc, la doxorubicinc, la dexamelhasonc, la céramide telle que la ceramide CS, la lonidaminc. Certains desdits agents anticancéreux, sont plus particulièrement décrits dans US 5,260,327 qui concerne l'utilisation de la lonidamine pour traiter les métastases, dans JO 5017353 qui porte l'utilisation de la lonidamine en association avec d'autres agents anticancéreux, et dans EP 291 151 , qui décrit l'utilisation des dérivés de la phlorizine. Ces documents sont incorporés dans la description par référence.
Le produit selon la présente invention peut également contenir un vecteur viral qui possède un gène qui code pour un enzyme qui permet d'activer les composés et ou les agents susmentionnés, par exemple la thymidine kinase. Dans la famille de EP 41573 1 , on trouve de nombreux brevets portant sur l'utilisation de gènes suicides activés dans des tissus spécifiques. Parmi ces documents, incorporés dans la description par référence, on trouve : EP 494776, EP 690129, EP 657540, et EP 657541 qui concernent notamment la fabrication d'un médicament comprenant un vecteur qui possède un gène capable de catalyser le passage d'une pro-drogue en substance active. Plus particulièrement, EP 657539 a pour objet l'utilisation du gène de la thymidine kinase avec une spécificité cellulaires pour le traitement du cancer.
De même, le produit de la présente invention peut comporter en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur l'utilisation du produit précédemment décrit pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En particulier, ledit médicament est destiné à induire la mort des cellules tumorales ct7ou à faciliter l'apoptose.
La présente invention vise également l'utilisation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur milochondrial des benzodiazépincs pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose. De préférence on peut choisit d'utiliser un composé de la famille répondant à l'une des formules générales 1, II, III, IV, et V décrit ci-dessus, de préférence un composé sélectionné parmi les molécules suivantes : l -(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinolinc carboxamidc (PK I 1 195), N,N-diéthylcarbamatc de phényl-3 naphtylc-1 ,
N,N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyI-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide, N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazolinc-4 propanamide,
N,N-diéthyl phényI-3 isoquinoléinc-1 propanamide,
N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 bcnzo[b]thiophènccarboxamide-5,
N,N-diéthyl phényl-3 naphtalèπecarboxamide-1 ,
Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3, pour la fabrication d'un tel médicament.
Bcl-2 est le représentant prototypique de la famille des oncogènes inhibiteurs de l'apoptose qui contribue à la fois à la genèse du cancer et qui est responsable des difficultés pour éradiquer les tumeurs. La plupart des effets cytoprotcctcurs de Bcl-2 peut être attribué à ses capacités à protéger l'intégrité des membranes mitochondrialcs (Boise et al 1997, Rccd et al 1997). On a montré que bcl-2 stabilise les membranes itrochondrialcs dans différents modèles d'apoptosc (Zamzami et al 1995, cl Decaudain cl al 1997). Cependant, il semble que Bcl-2 ne parvienne pas à inhiber l'apoptose dans certains cas, notamment l'apoptose induite par diamide cl par activation de la caspase (Yasuhara et al 1997, Strasscr et al 1995, et Huang et al 1997). L'effet de Bcl-2 est également surmonté par un traitement avec un taxoïde, tel que le paclitaxel (taxol), un agent qui permet l'hyperphosphorylation de Bcl-2 (Haldar et al 1 95 et 1996), et qui favorise l'ouverture du pore PT (Evtodicnki et al 1 96) Ainsi, la présente invention propose une alternative pour surmonter la chimio- ou radiorésistancc observée par la médiation par Bcl-2. Le traitement des cellules par un ligand de mBzR, rend la cytoprotcction par Bcl-2 largement obsolète, 11 existe une quasi-steechiométric entre l'expression de Bcl-2 et celle de mBzR au moins en ce qui concerne les lignées cellulaires lymphoïdes (Carayon et al 1996). En outre, Bcl-2 protège les mitochondries isolées contre l'ouverture du pore PT induit par de faibles doses de protoporphyrine IX, un ligand de mBzR, et cette inhibition est supprimée par de fortes doses de protoporphyrine IX (Marchetti et al 1996a). Ceci suggère qu'une interaction fonctionnelle existe entre Bcl-2 et mBzR. En revanche, la protection contre l'ouverture du pore PT, contrôlée par Bcl-2, n'est pas surmontée par des doses croissantes des autres agents cibles du porc PT tels que l'atractyloside, un ligand du translocatcur de l'adénine. Puisque la fixation de mBzR ne provoque pas de régulation négative de l'expression de Bcl-2 (Carayon et al 1996), il apparaît donc probable que des changements de conformation provenant de la fixation de PKI 1 195 dans le complexe composé par mBzR et le pore PT affecte indirectement la stabilité de la membrane mictochondriale et surmonte ainsi la fonction anti-apoptotique de Bcl-2. En conséquence la fixation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, appartenant aux familles I, II, III, IV, et V, en particulier le PKI 1 195, représente une stratégie intéressante notamment pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie.
Pour la suite de la description on se référera à la légende des figures présentées ci- dessous. Légende
Figure 1 : Syπcrgisinc entre PKI 1 195 et In cernmiric pour l'induction de l'apoptose des t ymocytes. Les ihymocytes ont été cultivés pendant 4 heures en présence de céramide C« (25 μ M), de diazépame ( 100 μM), et/ou de PKI 1 195 (100 μM).
Le graphique Λ représente le niveau d'apoptosc avec en abscisse la perturbation du A M',,, (déterminé par DiOCc) et en ordonnée la génération d'anion superoxide (déterminé avec HE).
Le graphique B représente le niveau d'apoptosc avec en abscisse l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface de la membrane plasmique (mesuré avec FITC- annexine V) et en ordonnée la viabilité cellulaire (exclusion du bromure d'éthydium) (EthBr). Les nombres désignent les pourcentages de cellules trouvées dans chaque quadrant.
Figure 2 : PK1 1 195 facilite l'induction de l'apoptose dans les cellules T CEM-C7 de in leucémie aiguë.
Les cellules ont été cultivées avec 10 μM d'étoposide, 1 μM de dcxamethasone (DEX), de RU24858, de RU38486, et/ou avec 75 μM de PK I 1 195 pendant soit 12 heures, soit 24 heures. Ce graphique représente la détermination de la fréquence de DiOC6 (3)low (HE->Eth)low, de DiOC6 (3) w (HE->Eth),'i8h et des cellules hypoploïdes telles que décrites dans les exemples. Les astérisques indiquent une amélioration sensible et significatif (p<0,01) de l'induction de l'apoptose par PKI 1 195 comparée aux cultures contrôles (cultivées en l'absence de PKI 1 195).
Figure 3 : PKI 1 195 s'oppose Λ la cytoprotection obtenue par la médiation de Bcl-2 dans les hybridomes de cellules T.
La lignée cellulaire des hybridomes de cellules T 2B4.1 1 transfectées de manière stable avec un vecteur SFFV.néo contenant le gène humain Bcl-2 (graphique li) ou contenant seulement le gène de résistance à la néomycinc (néo) (graphique Λ) ont été cultivées pendant 12 heures en présence de dcxamethasone ( 1 μM), de PK I 1 195 (50 μ M) ou de diazépamc (50 μM), et les caractères associés à l'apoptose, mentionnés supra, ont été déterminés. Les nombres dans les cercles en noir indiquent la fréquence des cellules sous-diploïdes. L'effet synergique de PK I 1 195 + DEX est très significatif (p<0,01 ) comparé aux contrôles (traitement avec DEX ou PK I 1 195 seulement), Des résultats similaires ont été obtenus lorsque l'on remplace la dcxamethasone par l'étoposidc comme inducteur de l'apoptose.
Figure 4 : PKI 1195 améliore la susceptibilité a l'apoptose dans les cellules B WEII I 231 leucémiques qui surcxprinicnt Bcl-2.
Les cellules WEHI 23 1 , soit transfectées avec le vecteur néomycine contrôle (néo, graphique A), soit transfectées par un vecteur contenant le gène Bcl-2 humain (graphique B) ont été traitées par irradiation γ, avec la doxorubicine (doxo), la cyclosporine A (CsA), seule ou en combinaison avec PKI 1 195 (40 μM) ou avec diazépamc (40 μM). Ces graphiques montrent la détermination par cytométrie de flux des paramètres de l'apoptose indiqués. Les astérisques montrent un effet significatif (p<0,001 ) dc PK 1 1 195.
PKI 1 195 facilite l'induction de l'apoptose par une variété de sti uli.
PKI 1 195 est le ligand antagoniste prototypique du récepteur mitochondrial des benzodiazépines mBzR (Ripond et al 1991 et Joscph-Liauzun et al 1997). Jusqu'aux doses de 50 à 100 μM, PKI 1 195 ne montre pas d'effet toxique sur divers types cellulaires comprenant notamment les thymocytes (voir figure 1 ), la cellule T CEM-C7 de la leucémie aiguë1 (voir figure 2), les hybridomes des cellules T 2B4. 1 1 (voir figure 3), et les cellules B WEHI23 1 leucémiques (voir figure 4). Les résultats des expériences menées lors de la présente invention démontrent que le céramide Cδ, qui par lui-même n'induit pas l'apoptose des thymocytes (à une dose de 25 μM), devient apoptogéniquc en présence de PK I 1 195. En revanche, le diazépamc, un agonistc agissant sur le récepteur central mitochondrial des benzodiazépincs ne possède aucun effet important apoptogéniquc (voir figures 1 , 3 et 4). Parmi les différents ligands de mBzR qui ont été testés, PK I 1 195 apparaît comme étant le plus efficace des co- inducteurs de l'apoptose (efficacité relative : PK I 1 195 supérieur à 4'-chlordiazépamc > diazépame > Ro-5-4864), ce résultat corrèle avec le potentiel antagoniste de ces composés sur le récepteur mBzR (Zisterer et al 1997).
Les effets synergiques observés avec PKI 1 195 s'étendent à une variété de différents inducteurs de l'apoptose, notamment avec l'inhibiteur de la topoisomérase I I (étoposide, voir figure 2), irradiation γ (voir figure 4), l'agent intercalant doxorubicine (voir figure 4), et en ce qui concerne les cellules WEHI231 , la cyclosporine Λ (voir figure 4). En outre, PK I 1 195 (mais pas le diazépame), facilite l'induction de l'apoptose par les agonistes du récepteur glucocorticoïde (qui comprennent la dcxamethasone cl le RU24858, (voir figure 2). En revanche, aucun eflét n'a été mis en évidence lors de l'utilisation de RU38486 et de PK I 1 195 simultanément.
Ainsi PK I 1 195 facilite l'induction de l'apoptose en réponse a une très large variété de substances et dans de nombreux types cellulaires différents, notamment dans les lignées cellulaires primaires et transformées d'origine humaine et murinc (voir figures 2 à 4).
PK I 1 195 facilite l'induction des changements mitocliondriaux et post- mitochondriaux associés avec l'apoptose
Le synergisme entre PK I 1 195 et plusieurs agents pro-apoptotiques s'étend pour tout ce qui caractérise le phénomène de l'apoptose. Ces phénomènes comprennent la perte précoce du potentiel transmembranaire mitochondrial (mesuré à l'aide du colorant DiOC6(3) sensible au potentiel), l'augmentation de la génération d'espèces réactives à l'oxygène (mesuré par la conversion d'hydroéthidine en éthidinc catalysée par les anions supcroxides (voir figures 1 à 4), l'exposition éradique des résiducs phosphatidylsérines à la surface de la membrane plasmiquc mesurée à l'aide l'anncxinc V conjuguée à F1TC (voir figure 1 ), et la fragmentation de l'ΛDN nucléaire (hypoploïdic déterminée par la coloration à l'iodurc de propidium des cellules fixées dans l'éthanol (voir figures 1 à 4). Les techniques expérimentales, évoquées supra, sont décrites plus en détail dans Marchetti et al, 1996a, Kroemer et al, 1997a et 1997b, et Zazami et al, 1996, incorporées dans la présente description par référence.
PKI 1 195 permet de surmonter l'inhibition de l'apoptose contrôlée par Bcl-2 dans plusieurs lignées cellulaires différentes.
Bcl-2 possède des effets cytoprotecteurs grâce à son large spectre d'action (Kroemer et al 1997b, et Decaudain et al 1997). Ainsi, la surexpression de Bcl-2 empêche de manière très significative la perturbation de ΔΨm, la production d'anions superoxides, et l'apoptose nucléaire induite par la dcxamethasone dans les hybridomes de cellules T (voir figure 3). Le traitement simultané avec PKI 1 195 et un agent apoptogénique montre un effet hyperadditif facilitant l'apoptose même en présence de Bcl-2. Ainsi, PKI 1 195 permet de restaurer l'induction de l'apoptose dans les cellules surexprimant Bcl-2 au moins partiellement. Cet effet a été observé dans deux types cellulaires différents appelés hybridomes de cellules T 2B4.1 1 (voir figure 3B) et les cellules B WEHI231 leucémiques (voir figure 4B).
PKI 1 195 permet de surmonter la protection conférée par Bcl-2 contre les glucocorticoïdes (voir figure 3B), contre l'irradiation γ, la doxorubicine, la cyclosporine A (voir figure 4B), et l'étoposide. Cet effet est également observé au niveau du mitochondrion, du potentiel redox cellulaire, et du noyaux (voir figures 3 et 4). Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle stratégie pour améliorer la susceptibilité des cellules par l'induction de l'apoptose. Les composés de la famille des isoquinoline carboxamides, en particulier un ligand antagoniste spécifique du récepteur mitochondrial au benzodiazépine (PKI 1 195), facilite l'induction de perturbation de Δ ; ,„ par divers effecteurs apoptotiques, notamment l'cndommagcmcnt de l'ADN (irradiation γ, étoposide, doxorubicine), la fixation de ligands sur le récepteur glucocorticoïde (dexaméthasone, RU24858), et les second messagers pro- apoptotiques du type céramide, tel que la céramide C8. De manière concomitante, les composés de la famille isoquinoline carboxamide améliore l'induction des signaux classiques de l'apoptose telle que l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface des cellules et la fragmentation de l'ADN nucléaire. Il a été démontré que le récepteur mitochondrial au benzodiazépine interagit avec de nombreuses protéines impliquées dans la formation et/ou dans la régulation du porc PT (McEnery et al 1992 et Kinnally et al 1993). En outre, le PKI 1 195 facilite l'ouverture du porc PT induit par un facteur de nécrose de tumeurs (TNF-α) dans les cellules L929 (Pastorino et al 1 96). Dans ce modèle, TNF induit la nécrose (Schulze-Osthoff et al 1994) et l'induction de la nécrose est améliorée par PKI 1 195. En revanche, la présente invention montre que PKI 1 195 permet de faciliter l'induction de l'apoptose, ce qui corrèle avec l'induction de la dissipation de ΔΨm contrôlée par le pore PT. Ces résultats suggèrent que l'ouverture du pore PT pourrait être l'étape limitante de n'importe quelle mort cellulaire (apoptose et nécrose), (Kroemer et al 1997a), et que les événement post-mitochondriaux se terminent par l'activation des enzymes cataboliques (caspases, protéases autres que les caspascs, et nucléases) et/ou que la disponibilité d'ATP cxtramitochondrial dirige la modalité de la mort cellulaire (Hirsch et al 1997, Leist et al 1997, et Nicotera et al 1997).
Ainsi, les résultats des expériences, mises en œuvre lors de la présente invention, démontrent la forte association entre les mitochondries, le potentiel redox, la membrane plasmique et les caractéristiques de l'apoptose, et démontrent que PKI 1 195 agit sur une cible mitochondriale afin de faciliter l'induction de l'apoptose. Cette nouvelle propriété des composés de la famille des isoquinoline carboxamides représente une opportunité pour vaincre la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie et notamment pour faciliter l'induction de la mort cellulaire.
Fxc plc 1 : Cellules et cultures cellulaires
Les lignées cellulaires des hybridomes de thymocytes provenant de souris
Balb/c âgées de 4 à 6 semaines et des cellules T 2B4. 1 1 ont été transfectées avec le vecteur SFFV.nco contenant le gène humain bcl-2 ou seulement le gène de résistance à la néomycine (néo) (Green et al 1994). Les cellules B WEHI231 leucémiques ont été transfectées avec le gène humain bcl-2 ou avec un vecteur néo contrôle (Cuendc et al 1993) et les cellules T CEM-C7.H2 humaines de la leucémie lymphoblastique (Strasser-Wozak, 1 95) ont été cultivées dans RPMI 1640 contenant 10% FCS, des antibiotiques, et la L-glutaminc.
Exemple 2 : Induction de l'apoptose
Les cellules susmentionnées (5-10 x lOVml) ont été cultivées en présence de la quantité indiquée du PKI 1 195, de la diazépame (Sigma), de la dexaméthazone (1 μM, Sigma), de RU24858 (lμM, Roussel Uclaf), de l'antagoniste RU38486 du récepteur glucocorticoïde (l μM, Roussel Uclaf), de la doxorubicine (l μg/ml, Pharmacia), de l'étoposide (10 μMVml, Sigma), de la cytosine arabinoside (10 μg/ml, Upjohn), de la cyclosporine A (10 μM, Sandoz), de la céramide C8 (25 μM, Bio ol, Plymouth Meeting, PA), ou du traitement par irradiation γ (10 Gy). Après les intervalles indiqués, on a récupéré les cellules, et on a testé les caractéristiques associées à l'apoptose.
Exemple 3 : Quantification des paramètres associés a l'apoptose par cvtoinctric de flux.
En suivant les protocoles publiés (Marchetti et al 1996b, Zamzami et al 1995, Kroemer et al 1997c), les fluorochromes suivants ont été utilisés afin de déterminer les différents changements associés à l'apoptose :
- 3,3' dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOCû, 20nM, Bernadi et al 1996) pour la détermination de ΔΨm
- hydroéthidinc (HE, 4 μM) pour la détermination la génération d'anion superoxyde - Anncxine V conjuguée avec FITC ( lμg/ml, Nexins Research, Hoevcn, The Netherlands) pour la détermination de l'exposition de la phosphatidylsérine (PS) sur la membrane plasmique externe.
- Iodurc de propidium (PI) pour la coloration des cellules perméabilisées à l'éthanol afin de déterminer la fréquence des cellules hypoploïdes. Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois et conduisent à des résultats similaires. Les résultats typiques obtenus sont montrés aux différentes figures. La signification statistique des résultats a été calculée en utilisant le test de student.
Exemple 4 : Procédé de préparation de N,N-diétlιγlcnrbaιnntc de plιcnyl-3 naplιtylc-1.
On chauffe au reflux pendant 4 heures, 3, 15 g de phényl-3 naphtol-1, 1 ,95 g de chlorure de N.N-diéthyl carbamoyle, 1 ,45 g de triéthylamine et 0,035 g de diméthylamino-4 pyridine dans 37 cm3 de tétrahydrofuranne. On ajoute 0,4 g de chlorure de N,N-diéthylcarbamoyle, chauffe encore 2 heures puis refroidit à température ambiante (environ 20°C), élimine le précipité par filtration et évapore le filtrat sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographié sur du gel de silice en utilisant comme éluant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80-20 en volume). Après rccristallisation du résidu dans un mélange éther isopropylique-éther de pétrole (1-1 en volume), on isole 2,94 g de N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1 fondant à 74°C (EP 210084A1, exemple 63, page 61, lignes 19-31).
Exemple 5 : Procédé de préparation de N,N-dictlιγl α-méthyl phcnyl-2 πuinnzolinc-4 propanamide. On ajoute, sous azote, 3 g de carbonyldiimidazole à une suspension de 2,67 g d'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque dans 30 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 2 heures d'agitation, on ajoute 6 cm3 de diéthylamine et agite encore 4 heures. On ajoute 150 cm3 d'eau et 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On décante, extrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle, sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec. On chromatographié le résidu sur du gel de silice, une première fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume), puis une deuxième fois avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume). Après recristallisation dans de l'éther isopropylique on obtient 1 g de N.N-diéthyl α méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 124°C. L'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïquc est préparé selon le procédé suivant :
On porte 3 heures à 90°C un mélange de 15 g de méthyI-4 phényl-2 quinazolinc, de 13,3 g de N-bromosuccinimidc et de 1,65 g de peroxyde de bcnzoyle dans 150 cm3 de tétrachlorure de carbone. On filtre, évapore le filtrat et chromatographié le résidu sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (9-1 en volume) comme éluant. On obtient 1 1 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline fondant à 1 10°C.
A 4 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile et 60 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre, sous azote, on ajoute une solution de 23 g de méthylmalonate de diéthyle dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation, on ajoute une solution de 9,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre et agite encore 2 heures à la température ambiante (20°C environ). On ajoute 100 cm3 d'eau et extrait avec 3 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium puis l'évaporé à sec sous pression réduite. On reprend le résidu dans 100 cm3 d'acide chlorhydriquc concentré et 100 cm3 d'acide acétique et porte l'ensemble à 1 10°C pendant 24 heures. Après refroidissement, on filtre le précipité, le lave à l'eau puis à l'éther isopropylique. Après séchage on obtient 4 g d'acide α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à 180°C (EP 210084 A 1 , exemple 7, page 20, linges 6-14).
La méthyl-4 phényl-2 quinazolinc peut être obtenue selon W.L.F. ARMΛREGO, Fuscd pyrimidincs, quinazolines Part. I, p. 39, Intersciences Publishers (1967), incorporé dans la description par référence.
Exemple 6 : Procédé de préparntiou de N-mcthyl N-plιcnγl plιényl-2 πuiua/.oliuc- 4 propanamide.
On opère comme à l'exemple 5 à partir de 1 ,95 g d'acide phényl-2 quinazolinc-
4 propanoïquc, de 1 ,36 g de carbonyldiimidazolc et de 3 cm3 de N-méthylanilinc dans
40 cm3 de tétrahydrofurnnnc anhydre. Après purification par chromatographié sur du gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et recristallisation dans un mélange acétate d'éthyle-éthcr isopropyliquc (1-5 en volume), on obtient 0,63 g de N-méthyl
N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide fondant à 1 16°C.
L'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque est préparé selon le procédé suivant ;
Sous azote, on place 5,4 g d'hydrurc de sodium à 80 % dans l'huile avec 250 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre puis, en refroidissant vers 5°C on ajoute 25,6 g de malonatc de diéthyle. Lorsque le dégagement d'hydrogène a cessé, on ajoute une solution de 23,9 g de bromométhyl-4 phényl-2 quinazoline dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation à la température ambiante (20°C environ), on ajoute 25 cm3 d'acide acétique, évapore le solvant sous pression réduite et reprend le résidu dans 150 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et 150 cm3 d'acide acétique. On porte l'ensemble à 120°C pendant 15 heures, évapore de nouveau, ajoute 200 cm3 d'eau, 150 cm3 d'éther éthylique et alcalinise à pH 1 1 avec une lessive d'hydroxyde de sodium. On décante la phase organique et lave la solution aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'éther éthylique. On ajuste la phase aqueuse à pH 4 et l'extrait avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. On cristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle. On obtient 9 g d'acide phényl-2 quinazoline-4 propanoïque fondant à 159°C (EP 210084A1, exemple 8 ; page 21, 1.15 à p.22, 1.1 1 ensemble p.20, 1.6- 14).
Exemple 7 : Procédé de préparation de N,N-dicthyl (nitro-4 phényl)-2 ηιιiιιazolinc-4 propanamide.
On opère comme à l'exemple 5 à partir de 1,35 g d'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïque, de 0,82 g de carbonyldiimidazole et de 0,9 cm3 de diéthylaminc dans 20 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après chromatographié sur du gel de silice avec l'acétate d'éthyle comme éluant et rccristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient 0,35 g de N.N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazolinc-4 propanamide fondant à 168°C.
L'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazolinc-4 propanoïquc est préparé selon le procédé suivant (EP 2100S4A1 , exemple 1 1 ; p.23,1.20-p.24,1.24 ensemble p.20, 1.6- 14) : On porte au reflux pendant 3 heures un mélange de 3,34 g d'acide para- nitrobenzoïque et de 20 cm3 de chlorure de thionylc. On élimine l'excès de chlorure de thionyle par évaporation sous pression réduite et on ajoute au produit résiduel 20 cm3 de chloroforme, 5,5 cm3 de triéthylaminc et 2,21 g d'(amino-2 bcnzoyl)-3 propionatc d'éthyle. On agite à la température ambiante (environ 20°C) pendant 2 heures. On élimine le solvant sous pression réduite, reprend le résidu dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, filtre et concentre le filtrat à sec, Le produit résiduel est mis en contact avec 20 g d'acétate d'ammonium et porté à 150°C pendant 6 heures. Après refroidissement, on ajoute 250 cm3 d'eau et extrait avec 4 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec 2 fois 100 cm3 d'une solution d'hydroxyde de sodium N et 50 cm3 d'eau. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium, la filtre et l'évaporé à sec sous pression réduite. On obtient 2,8 g de produit que l'on met en contact avec 50 cm3 d'éthanol et 2,5 cm3 d'une solution concentrée d'hydroxyde de sodium. Après 30 minutes à la température ambiante, on élimine l'éthanol par évaporation sous pression réduite et ajoute 200 cm3 d'eau. On lave la phase aqueuse avec 3 fois 50 cm3 d'éther éthylique, on l'acidifie à pH 1 et filtre le précipité formé. Après lavage à l'eau, au chlorure de méthylène et séchage, on obtient 1 ,4 g d'acide (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanoïquc dont le spectre de RMN du proton dans le diméthylsulfoxydc deutérié a les caractéristiques suivantes :
Ar-CH? δ : 3,7 ppm -CH.-COOH δ : 3 ppm
H aromatiques en meta du NO δ : 8,4 ppm H aromatiques en ortho du N02 δ : 8,9 ppm Autres H aromatiques de 7,7 à 8,4 ppm
Exemple 8 : Procédé de préparation de N,N-diélltyl [(pIιényI-2 trifIuoroιnéthyl-8 πιιiιιoliιιyl-4) oxy]-2 propanamide.
On porte , 9 heures, à ébullition un mélange de 6 g de phényl-2 trifluorométhyl-S quinolinol-4, de 4,76 g de N.N-diéthyl bromo-2 propanamide et de 6 g de carbonate de potassium dans 400 cm" de métylcétone. Après refroidissement, on filtre et évapore le filtrat à sec sous pression réduite. On extrait le résidu avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) à 60°C, filtre l'insoluble et évapore le filtrat sous pression réduite. On chromatographié le solide résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (par exemple 7-3 en volume) comme éluant. Après rccristallisation du résidu dans un mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique (1 -4 en volume), on isole 3 g de N,N- diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide fondant à 146°C.
La phényl-2 trifiuorométhyl-8 hydroxy-4 quinoléine peut être préparé par action à 140 °C de bcnzoylacétatc d'éthyle (0, 12 mole) sur la trifluorométhyl-2 aniline (0, 12 mole) en présence d'acide polyphosphoriqu (86 g). Elle présente un point de fusion égal à 136°C ; (EP 210084 Al , exemple 84 ; p.72, 1.28 à p.73, 1.9 ensemble p.55, 1. 1 - 14).
Exemple 9 :~Procédc de préparation de N.N-diétliyl fιnéthoxy-3 plιcnyl)-2 quiιιa/.olinc-4 propanamide.
Un mélange de 1 ,2 g de (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionatc d'éthyle et de 30 cm3 de diéthylamine est chauffé à 250°C pendant 40 heures. Après refroidissement, l'excès de diéthylamine est évaporé. Le résidu est chromatographié sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle ( 1-1 en volume) comme éluant. Le produit récupéré est recristallisé dans de l'éther isopropylique. On obtient 0,36 g de N,N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide qui fond à 87°C.
Le (mélhoxy-3 phényl)-2 quinazolinc-4 propionatc d'éthyle est préparé selon le procédé suivant :
On agite 17 heures à la température ambiante (20°C environ) 26,7 g d'acide
(amino-2 bcnzoyl)-3 propionique et 25 cm3 d'acide sulfuriquc concentré dans 250 cm3 d'éthnnol absolu. On évapore l'éthanol sous pression réduite, ajoute 200 cm3 d'eau, 200 cm3 d'acétate d'éthyle et du carbonate de potassium jusqu'à pH S. On filtre, décante et réextrait la phase aqueuse avec 2 fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. On obtient 24,8 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle sous forme d'huile. Le spectre RMN du proton, dans le chloroforme deutérié présente les caractéristiques suivantes :
CH2-CH3 δ : 1,2 ppm ÇH2-COOC2H5 δ : 2,8 ppm
ÇH2-CH3 δ : : 4,2 ppm Hé δ : 7,9 ppm
Ar-CO-ÇH2- δ : ; 3,3 ppm H4 δ : 7,3 ppm
NH2 δ : : 5,7 ppm H3 et H5 δ : 6,7 ppm A 2,21 g d'(amino-2 benzoyl)-3 propionate d'éthyle et 4,2 cm3 de triéthylamine dans 25 cm3 de chloroforme on ajoute, à 5°C, 2,81 cm3 de chlorure de méthoxy-3 benzoyle. On laisse 1 heure à la température ambiante (envrion 20°C), ajoute 25 cm3 d'eau et décante. On évapore la phase organique sous pression réduite et reprend le résidu avec 17 g d'acétate d'ammonium. On porte l'ensemble à 100°C pendant 7 heures puis évapore l'acide acétique formé sous pression réduite. On verse le résidu sur 100 cm3 d'eau et extrait la phase aqueuse avec 3 fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle. On sèche la phase aqueuse sur sulfate de magnésium, la filtre et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volume) comme éluant. Après recristallisation dans l'éthanol on obtient 1,5 g de (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propionate d'éthyle fondant à 70°C ; (EP 210084A1, exemple 2 ; p.14, 1.1 1-19 ensemble p.13,1.33-p.14, 1.10 ).
L'acide (amino-2 benzoyl)-3 propionique peut être préparé selon D.E. R1VETT et coll., Λust. J. Chem., 24, 2717 (1971), incorporé dans la description par référence.
Exemple 10 : Procédé de préparation de N,N- ic< yl plιénγl-3 isoqtιiιιoléiιιe-1 propanamide. On opère comme à l'exemple 9 à partir de 6,1 g de phényl-3 isoquinoléine-1 propionate d'éthyle et de 30 cm3 de diéthylamine. Le produit brut est purifié au moyen de 4 chromatographies successives sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (7-3 en volume) comme éluant. On obtient 1,4 g de N,N- diéthyl phényl-3 isoquinoléine-1 propanamide fondant à 58°C.
Le phényl-3 isoquinoléine-1 propionate d'éthyle est préparé selon le procédé suivant :
On porte à l'ébullition, 48 heures, un mélange de 21 g de méthyl-1 phényl-3 isoquinoléine, de 30,6 g de N-bromosuccinimide et de 1 g de peroxyde de benzoyle dans 730 cm3 de tétrachlorure de carbone. Après refroidissement, on filtre et évapore le filtrat à sec sous pression réduite. On chromatographié le résidu sur du gel de silice avec un mélange toluène-méthanol (98-2 en volume) comme éluant. Après cristallisation dans l'éther isopropylique on obtient 1 1 g de bromométhyl-1 phényl-3 isoquinoléine fondant à 84°C.
Sous azote, on place 6,5 g d'hydrure de sodium à 80 % dans l'huile avec 160 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute, goutte à goutte, une solution de 34,9 g de malonate de diéthyle dans 200 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre. Après 1 heure d'agitation à la température ambiante (20°C environ), on ajoute une solution de 16,2 g de bromométhyl-1 phényl-3 isoquinoléine dans 200 cm3 de tétrahydrofuranne anhydre.
Après 20 heures d'agitation à 20°C on ajoute 200 cm3 d'eau et extrait la phase aqueuse à l'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le produit résiduel sur du gel de silice avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (8-2 en volume) comme éluant. On récupère
1 1,5 g de produit que l'on reprend dans 1 15 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et porte à ébullition 20 heures. On ajoute 200 cm3 d'eau, filtre le précipité, le lave à l'eau et à l'acétone. On obtient 6,7 g d'acide phényl-3 isoquinoléine- 1 propanoïque fondant à 160°C.
On agite 20 heures à 20°C, 6,7 g d'acide phényl-3 isoquinoléine- 1 propanoïque et 7 cm3 d'acide sulfurique concentré dans 70 cm3 d'éthanol. On verse la solution dans 400 cm3 d'eau et alcalinise la phase aqueuse avec une solution d'ammoniaque concentrée. On extrait avec 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène, sèche la phase organique et l'évaporé à sec sous pression réduite. On obtient 6,3 g de phényl-3 isoquinoléine- 1 propionate d'éthyle fondant à 60°C ; (EP 210084A1 , exemple 4 ; p.17, 1.6-15 ensemble p.13,1.33-p.14, 1.10 ). La méthyl-1 phényl-3 isoquinoléine peut être préparée selon
S. COSZCZYNSKI, Rocznicki Chem., 38(5), 893-5 (1964) ; Chem. Abst. 62, 16188 a (1965), incorporé dans la description par référence.
Exemple 11 : Procédé de préparation de N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzol blthiophènecarboxamide-5.
A 12 cm3 de diméthylsulfoxyde sous atmosphère d'azote, on ajoute, sous agitation, 1,8 g d'hydroxyde de potassium en poudre puis 2 g de N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 et enfin 0,8 cm3 d'iodure de méthyle. On agite 1 heure 30 minutes à température ambiante (20°C environ), verse le mélange réactionnel sur 50 cm3 d'eau et 60 cm3 d'acétate d'éthyle. On agite 15 minutes, décante la phase organique, la lave à l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50-50 en volume) comme éluant. Les fractions contenant le produit sont rassemblées, évaporées sous pression réduite et reprises par un mélange d'eau et d'éther éthylique. La phase organique est décantée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée sous pression réduite. Le résidu est agité 1 heure 30 minutes avec 20 cm3 d'éther de pétrole 40-60°, filtré et séché.
On isole ainsi 1,2 g de N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophène- carboxamidc-5 fondant à 105°C.
Le N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 peut être préparé de la manière suivante : On chauffe à 90°C pendant 2 heures 3 g d'acide phényl-7 benzo[b] thiophènecarboxilique-5 dans 30 cm3 de toluène et 2,6 cm3 de chlorure de thionyle. On évapore sous pression réduite , puis on ajoute au résidu 30 cm3 de toluène et 9,94 cm3 de triéthylamine. On agite et on ajoute, goutte à goutte 1,2 cm3 de butanamine. On agite 1 heure à température ambiante, évapore le toluène sous pression réduite et reprend le résidu par du chlorure de méthylène et une solution aqueuse de carbonate de potassium. On agite 5 minutes, lave la phase organique par de l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évaporé sous pression réduite.
Après chromatographié du résidu sur du gel de silice en utilisant un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50-50 en volume), on obtient 2,35 g de N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5 fondant à 195°C ; (EP 248734B1, exemple 2 ; p.5, 1 39-60 ensemble exemple 1 p.5, 1. 6-37).
Exemple 12 : Procédé de préparation de N,N-diéthyl phényl-3 nnphtalènccnrhoxnmidc-1.
On chauffe au reflux pendant 1 heure 5 g d'acide phényI-3 naphtalènecarboxylique-1 et 20 ml de chlorure de thionyle. On évapore le chlorure de thionyle, reprend le résidu par 100 ml de toluène et évapore à nouveau. On ajoute alors au résidu obtenu 25 ml de pyridine puis, goutte à goutte, sous agition, 4,5 ml de diéthylamine. On agite 2 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite coulé dans 50 ml d'eau. La phase organique est décantée et la phase aqueuse est extraite par 3 fois 100 ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par3 fois 30 ml d'eau, séchées sur sulfate de magnésium et évaporées sous pression réduite.
Après recristallisation du résidu obtenu dans l'hexane, on obtient 3,4 g de N,N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-l , qui fond à 65°C ; (EP 1 12776B 1 , exemple 20 ; p.1 1 , 1.25-35 ensemble p.S, 1.3-14). L'acide phényl-3 naphtalènecarboxylique-1 peut être préparé selon le procédé décrit par F.C. BADDAR et coll., J. Chem. Soc, 1959, 1009, incorporé dans la description par référence.
Exemple 13 : Procédé de préparation de N-méthyl N[méthyl-1 propyll (chloro-2 phénvP-1 isoηuinoléinecflrboxamide-3.
A 1,68 g d'acide (chloro-2 phényl)-l isoquinoléine carboxylique-3 dans 60 ml de chloroforme on ajoute 0,7 g de triéthylamine. On refroidit à 10 °C et ajoute 0,75 g de chloroformiate d'éthyle. On agite 40 n à la température ambiante, introduit une solution de 0,68 g de N-méthyl butanamine-2 dans 60 ml de chloroforme et agite 4h à la température ambiante. On évapore le milieu réactionnel sous pression réduite, reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle, lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée de carbonate de sodium, la sèche sur du sulfate de magnésium et l'évaporé à sec sous pression réduite. On chromatographié le résidu sur du gel de silice et recristallise le produit obtenu dans du cyclohexane. On obtient 1,4 g de N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3 fondant à 136°C , (EP 094 271B 1 exemple 21 ; p.7, col.12, 1.57 - p.8, col.13, 1.2 ensemble p.6, col.9, 1.32- p.6, col.9, 1.54).
Exemple 14 : Activité biologique
L'activité biologique des composés selon la présente invention peut être mise en évidence de la façon suivante (les documents indiqués ci-dessous sont incorporés dans la description par référence) :
A : Méthode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire,
Pour quantifier dans une population cellulaire le nombre de cellules en apoptose de par leur contenu en ADN, une méthode d'analyse par FACS (fluorescence activated cell sorting) utilisant le marquage fluorescent des cellules par 2 agents fluorescents intercalants de l'ADN a été adaptée à partir de celle décrite par Pollack A. et Ciancio G. (Pollack A et Ciancio G.In: Flow Cytometry, Darzynkiewicz Z, Crissman HA (eds). Académie Press, San Diego, CA, 1991, pp 19-24). Après trypsinisation, les cellules sont rincées au PBS (« Phosphate Buffer Saline commercialisé par exemple par Gibco BRL) et fixées dans 1 ml d'éthanol froid pendant 30 minutes. Elle sont ensuite rincées 2 fois dans 2 ml de PBS contenant 0,5 % de Tween 20 et resuspendues dans 1 ml de milieu de coloration ( PBS-Tween 20 0,5 % contenant 1 mg/ml de Rnase bouillie, 10 μg/ml d'iodure de Propidium et 4 μg/ml de DAPI-4',6-diamidino-2- phenylindole dihydrochlorure). L'analyse par FACS a lieu après excitation UV. Les études ont eu lieu sur des populations cellulaires cultivées en plaque 6 puits Nunc à raison de 100 000 cellules par puits dans 2 ml de milieu complet à l'ensemencement, les différents produits induisant ou facilitant l'apoptose étant ajoutés 36 heures après ensemencement des cellules et l'analyse par FACS étant réalisée entre 24 et 72 heures après cet ajout.
B : Dosage de l'inhibition de l'activité anti-apoptotique dépendante de Bcl2 dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle.
Par les techniques de transfection stable et en utilisant des agents de sélection tels que, par exemple la néomycine, l'hygromycine, la zéocine ou la puromycine, des clones dérivés par exemple de la lignée cellulaire NCI-H1299 (obtenue auprès de l'ATCC) peuvent être établis de sorte à avoir une expression conditionnelle de la protéine Bcl2 strictement dépendante de la concentration de tétracycline ou plus avantageusement d'anhydrotétracycline présente dans le milieu. Pour cela, on peut utiliser la technique décrite par Gossen et Bujard (Gossen M & Bujard H. (1992). Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 5547-51 ; Nucleic Acids Res 1993 Sep 1 1 ;21(18):441 1 -2), avec la possibilité de l'adapter tout en conservant les caractéristiques du système de régulation transcriptionnelle décrite par ces auteurs. On a pu établir des clones surexprimant la protéine Bcl2 en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline dans le milieu de culture, alors qu'en présence de 0.5 mg/1 d'anhydrotétracycline, la protéine n'est pas détectable par la technique de western blotting en utilisant l'anticorps anti-Bc!2, clone 124 commercialisé par la société DAKO et en utilisant le protocole décrit par Venot et al. (Venot, C, Maratrat, M., Dureuil, C, Conseiller, E., Bracco, L., and Debussche, L. 1998. EMBO J. 17:4668-4679).
En utilisant l'approche décrite ci-dessus, il a été possible de caractériser des clones qui se sont avérés significativement moins sensibles à l'apoptose induite par une gamme de concentrations d'agents inducteurs d'apoptose en absence qu'en présence de tétracycline dans le milieu de culture, c'est-à-dire lorsqu'ils surexpriment la protéine Bcl2 plutôt que lorsqu'ils ne la surexpriment pas. Les agents inducteurs d'apoptose testés ont été par exemple l'adriamycine (10-100 μg/rnl), le terbutyl-hydroperoxyde (25-100 μM), la vincristine (0.03-0.003 μg/ml) et la camptothécine (0.01-0.1 μg/ml). Pour quantifier l'induction d'apoptose, on peut par exemple utiliser la méthode de dosage de l'apoptose induite dans une population cellulaire décrite dans A.
Une manière possible de doser l'inhibition d'activité anti-apoptotique dans une lignée cellulaire surexprimant Bcl2 de manière conditionnelle par un traitement qui peut être par exemple l'incorporation d'un composé chimique consiste à quantifier, en utilisant par exemple la méthode décrite dans A, le pourcentage d'apoptose induite dans une population de cellules issues par exemple d'un des clones décrits ci-dessus, dans les 4 situations suivantes :
1) le composé chimique à évaluer est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en même temps qu'un agent inducteur d'apoptose tel que par exemple ceux cités ci- dessus et le clone est cultivé en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose PI .
2) le même agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 est incorporé seul dans le milieu de culture cellulaire et le clone est cultivé en absence de tétracycline ou d'anhydrotétracycline, c'est-à-dire qu'il surexprime la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P2.
3) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en même temps que le même agent inducteur d'apoptose que celui utilisé dans la situation 1 et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 μg/ml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 μg/ml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P3.
4) le composé est incorporé dans le milieu de culture cellulaire en absence d'agent inducteur d'apoptose et le clone est cultivé en présence de tétracycline (1 μg/ml) ou d'anhydrotétracycline (0.5 μg/ml), c'est-à-dire qu'il ne surexprime pas la protéine Bcl2. Dans cette situation, on détermine la pourcentage de cellules en apoptose P4.
On calcule alors le ratio R = 100 x (P1-P2)/(P3-P4). Quand R=100, l'inhibition de l'activité anti-apoptotique liée à la surexpression de Bcl2 est de 100 % à la concentration de composé à évaluer utilisée. Quand R= 0, le composé n'est pas inhibiteur à la concentration testée. Une série de résultats peut être obtenue à partir d'une gamme de concentration de composé à évaluer. On peut calculer mathématiquement à partir de ces résultats une concentration inhibitrice de 50 % ou IC50. Plusieurs composés peuvent être comparés en fonction de leur IC50. On dira par exemple qu'un produit A est deux fois plus actif qu'un produit B si l'IC50 de A est deux fois plus faible que l'IC50 de B. Les valeurs d'IC50 peuvent varier en fonction du clone cellulaire utilisé, de la nature et de la concentration de l'inducteur d'apoptose utilisé.
En utilisant la technique décrite dans B, il a été possible de déterminer des 1C50 inférieures ou égales à 50 μM pour le PKI 1 195 et les composés issus des familles II, 111, IV et V .
Avantageusement, les composés des familles II, 111, IV présentent des activités pouvant être au moins 5 fois meilleures que celle présentée par le PKI 1 5.
Préférentiellement, les composés des exemples 4 à 12 décrits plus haut présentent des activités supérieures à celles démontrées par le composé PKI 195. Parmi les composés de formule générale (II), on préfère les composés suivants
N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1
N,N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide N.N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide
N,N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide
N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide
N,N-diéthyl phény!-3 isoquinoléine- 1 propanamide
Parmi les composés de formule générale (III), on préfère : N-méthyl N-(méthyI-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5
Parmi les composés de formule générale (IV), on préfère :
N.N-diéthyl phényI-3 naphtalènecarboxamide-1
Parmi les composés de formule générale (V), on préfère :
N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-! isoquinoléinecarboxamide-3
REFERENCES
Bernardi, P., and Petronilli, V. (1996). The permeabihty transition pore as a mitochondrial calcium release channel; a critical appraisal. J. Bioenerg. Biomembr. 28, 129-136.
Beutner, G., Ruck, A., Riede, B., Welte, W., and Brdiczka, D. (!996). Complexes between kinases, mitochondrial porin, and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability (transition pore. FEBS Lett. 396, 189- 195.
Boise, L. H., and Thompson, C. B. (1997). Bel-XL can inhibit apoptosis in cells that hâve undergone Fasinduced protease activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3759- 3764.
Carayon, P., Portier, M., Dussossoy, D., Bord, A., Petitpretre, G., Canat, X., Le Fur, G., and Casellas, P. (1996). Involvement of peripheral benzodiazepine receptors in the protection of hematopoietic cells against oxygen radical species. Blood 87, 3170- 3178.
Cuende, E., AJés-Martinez, J. E., Ding, L., Gonzalez-Garcia, M., Martinez-A., C, and Nunez, G. (1993). Programmed cell death by BcI-2-dependent and -independent mechanisms in B cell lymphoma cells. EMBO J. 12, 1555- 1560.
De long, D,, Prins, F, A., Mason, D. Y., Reed, J. C, van Ommen, G. B., and Kluin, P. M. (1994). Subcellular Iocalization of the Bcl-2 protein in malignant and normal lymphoid cell s. Cancer Res. 54 , 256-260. Decaudin, D., Geley, S., Hirsch, T., Castedo, M., Marchetti, P., Macho, A., Kofler, R., and Kroemer, G. (1997). Bcl-2 and Bel-XL antagonize the mitochondrial dysfunction preceding nuclear apoptosis induced by chemotherapeutic agents. Cancer Res. 57, 62-67.
Ellerby, H. M., Martin, S. J., Ellerby, L. M., Naiem, S. S„ Rabizadeh, S., Salvese, G. S., Casiano, C. A., Cashman, N. R., Green, D. R., and Bredesen, D. E. (1997). Establishment of a cell-free System of neuronal apoptosis: comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165- 6178.
Evtodienki, Y. V., Teplova, V. V., Sidashi, S. S., Ichas, F., and Mazat, J.-P. (1996). Microtubule-active drugs suppress the closure of the permeability transition pore in tumour mitochondria. FEBS Lett. 393, 86-88.
Green, D. R., Mahboubi, A., Nishioka, W., Oja, S., Echeverri, F., Shi, Y., Glynn, J., Yang, Y., Ashwell, J., and Bissonnette, R. (1994). Promotion and inhibition of activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas by oncogenes and related signais. I munol. Rev. 142, 321-342.
Haldar, S., Chintapalli, J., and Croce, C. M. (1996). Taxol induces bcl-2 phosphorylation and death of prostate cancer cells. Cancer Research 56, 1253- 1255.
Haldar, S., Jena, N., and Croce, C. M. (1995). Inactivation of Bcl-2 by phosphorylation. Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 4507-451 1.
Hirsch, T., Marchetti, P., Susin, S. A., Dallaporta, B., Zamzami, N., Marzo, I., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1997). The apoptosis-necrosis paradox. Apoptogenic proteases activated after mitochondrial permeability transition détermine the mode of cell death. Oncogene 15, 1573- 1582. Hortelano, S., Dallaporta, B., Zamzami, N., Hirsch, T., Susin, S. A., Marzo, 1., Bosca, L., and Kroemer, G. (1997). Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition. FEBS Lett. 410, 373-377.
Huang, D. C. S., Cory, S., and Strasser, A. (1997). Bcl-2, Bel-XL, and adenovirus protein ElB19kD are fûnctionally équivalent in their ability to inhibit cell death. Oncogene 14, 405-414.
Ichas, F., Jouavill, L. S., and Mazat, J.-P. (1997). Mitochondria are excitable organelles capable of generating and conveying electric and calcium currents. Cell 89, 1 145-1 153.
Joseph-Liauzun, E., Farges, R., Delmas, P., Ferrara, P., and Loison, G. (1997). The M-r 18,000 subunit of the peripheral-type benzodiazepine receptor exhibits both benzodiazepine and isoquinoline carboxamide binding sites in the absence of the voltage-dependent anion channel or of the adenine nucleotide carrier. J. Biol. Chem. 272, 28102-28106.
Kantrow, S. P., and Piantadosi, C. A. (1997). Release of cytochrome c from liver mitochondria during permeability transition. Biochem. Biophys. Res. Com . 232, 669-671.
Kinnally, K. W., Lohret, T. A., Campo, M. L., and Mannella, C. A. (1996). Perspectives on the mitochondrial multiple conductance channel. J. Bioenerg. Biomembr. 28, 1 15- 123.
Kinnally, K. W., Zorov, D. B., Antonenko, Y. N., Snyder, S. H., McEnery, M. W., and Tedeschi, H. (1993). Mitochondrial benzodiazepine receptor linked to inner membrane ion channels by nanomolar actions of ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1374-1378.
Kluck, R. M., Bossy-Wetzel, E„ Green, D. R., and Newmeyer, D. D. (1997). The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 régulation of apoptosis. Science 275, 1132- 1136.
Kroemer, G., Zamzami, N., and Susin, S. A. (1997a). Mitochondrial control of apoptosis. Immunol. Today 18, 44-51.
Kroemer, G. (1997b). The proto-oncogene Bcl-2 and its rôle in regulating apoptosis. Nature Medicine 3, 614-620.
Kroemer, G., Lisardo, B., Zamzami, P., Hortelano, S., and Martinez-A., C. (1997c). Détection of apoptosis and apoptosis associated altérations. "The Immunology Methods Manual" (Lefkovitz, R. Ed.); Académie Press, Chapter 14.2., pp. 1 1 1 1 I- 1125.
Leist, M., Single, B., Castoldi, A. F., Kuhnle, S., and Nicotera, P. (1997). Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the décision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 185, 1481 - 1486.
Liu, X., Kim, C. N., Yang, J., Jemmerson, R., and Wang, X. (1996), Induction of apoptotic progra in ccll-fee extracts: requirement for dATP and cytochrome C. Cell 86, 147-157.
Marchetti, P., Castedo, M., Susin, S. A., Zamzami, N., Hirsch, T., Haeffner, A., Hirsch, F., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996a). Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J. Exp. Med 184, 1 155-1 160. Marchetti, P., Hirsch, T., Zamzami, N., Castedo, M., Decaudin, D., Susin, S. A., Masse, B., and Kroemer, G. (1996b). Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis. J. Immunol. 157, 4830-4836.
McEnery, M. W., Snowman, A. M., Trifiletti, R. R., and Snyder, S. H. (1992). Isolation of the mitochondrial benzodiazepine receptor: Association with the voltage- dependent anion channel and the adenine nucleotide carrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3170-3174.
Nicotera, P., and Leist, M. (1997). Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells. Cell Death Diff: 4, 435-442.
O'Gorman, E., Beutner, G., Dolder, M., Koretsky, A. P., Brdiczka, D., and Wallimann, T. (1997). The rôle of creatine kinase in inhibition of mitochondrial permeability transition. FEBS Lett. 414, 253-257.
Pastorino, J. G., Simbula, G., Yamamoto, K., Glascott, P. A. J., Rothman, R. J., and Farber, J. L. (1996). The cytotoxicity of tumor necrosis factor dépends on induction of the mitochondrial permeability transition. J. Biol. Chem. 271, 29792-29799.
Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). A model for p53-induced apoptosis. Nature 389, 300-305.
Reed, J. C. (1997). Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387, 773-
776.
Ripond, J., Mattci, M. G., Kaghad, M., Dumont, X., Guillemot, J. C, Lefur, G., Caput, D., and Ferrara, P. (1991). Molecular cloning and chromosomal locahzation of a hu an peripheral type benzodiazepin receptor. Eur. J. Biochem. 2, 305-31 1. Schulze-Osthoff, K., Krammer, P. H., and Droge, W. (1994). Divergent signalling via APO-1/Fas and the TNF receptor, two homologous molécules involved in physiological cell death. EMBO J. 13, 4587-4596.
5 Strasser, A., Harris, A. W., Huang, D. C. S., Krammer, P. H., and Cory, S. (1995). Bcl-2 and Fas APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis. EMBO J. 14, 6136-6147.
Strasser-Wozak, E., Hattmannstorfer, R., Hala, M., Hartmann, B. L., Fiegl, M., Geley, 10 S., and Kofler, R. (1995). Splice site mutation in the glucocorticoid receptor gène causes résistance to glucocorticoid-induced apoptosis in a human acute leukemic cell une. Cancer Res 55, 348-353.
Susin, S. A., Zamzami, N., Castedo, M., Hirsch, T., Marchetti, P., Macho, A., 15 Daugas, E., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996a). Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. J. Exp. Med. 184, 1331-1342.
Susin, S. A., Zamzami, N., Castedo, M., Daugas, E., Wang, H.-G., Geley, S., Fassy, F., Reed, J., and Kroemer, G. (1997b). The central executioner of apoptosis. Multiple 20 links between protease activation and mitochondria in Fas/Apo-l CD95- and ceramide- induced apoptosis. J. Exp. Med 186, 25-37.
Vander Heiden, M. G., Chandal, N. S., Williamson, E. K., Shcumacker, P. T., and Thompson, C. B. (1997). Bel-XL régulâtes the membrane potential and volume 25 homeostasis of mitochondria. Cell 91, 627-637.
Yang, J., Liu, X„ Bhalla, K., Kim, C. N., lbrado, A. M„ Cai, J., Peng, T.-I., Jones, D. P., and Wang, X. (1997). Prévention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275, 1 129- 1 132.
J 0 Yasuhara, N., Sahara, S., Kamada S, Fguchi, Y., and Tsujimato, Y. (1997). Evidence against a functional site for Bcl-2 downstream of caspase cascade in preventing apoptosis. Oncogene 15, 1921-1928.
Zamzami, N., Marchetti, P., Castedo, M., Decaudin, D., Macho, A., Hirsch, T., Susin, S. A., Petit, P. X., Mignotte, B., and Kroemer, G. (1995). Sequential réduction of mitochondrial transmembrane potential and génération of reactive oxygen species in early programmed cell death. J. Exp. Med 182, 367-377.
Zamzami, N., Susin, S. A., Marchetti, P., Hirsch, T., Gomez-Monterrey, I., Castedo, M., and Kroemer, G. (1996). Mitochondria] control of nuclear apoptosis. J. Exp. Med. 183, 1533-1544.
Zisterer, D. M., and Williams, D. C. (1997). Peripheral-type benzodiazepin receptors. Gen. Pharmacol. 29, 305-314.
Zoratti, M., and Szabo, I. (1995). The mitochondrial permeability transition. Biochem. Biophys. Acta-Rev. Biomembranes 1241, 139-176.

Claims

REVENDICATIONS
1. Produit de combinaison comprenant au moins un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines, et au moins un agent inducteur de l'apoptose pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destiné au traitement du cancer.
2. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale I :
Dans laquelle
RI est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R2 est un groupe alkyl inférieur de C1-C6 ramifié ou linéaire,
R3 est un atome d'halogène tel que CI, F, Br, I, et R4 est un atome d'hydrogène ou d'halogène, les groupes RI , R2, R3, R4 étant choisit indépendamment les uns des autres.
3. Produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composé est le PKI 1 195 l-(2-chlorophényl)-N-méthyI-N-(l-méthylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide.
4. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale II :
II
dans laquelle A représente un atome d'azote ou un groupe CH,
B représente un atome d'azote ou un groupe CH,
V et W, identiques ou différents, représentent des atomes d'hydrogène ou d'halogène
(fluoré, chlore, brome), des groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone, des groupes nitro ou trifluorométhyle, Z est fixé en position ortho ou para par rapport à B et représente un radical phényle, thiényle, pyridyle, ou phényle substitué parun ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle et alcoxy comportant 1 à 4 atomes de carbone, les groupes trifluorométhyle ou nitro, la chaîne -X-(CH2)n-(CHR)m-CONR]R2 est fixée en position ortho ou para par rapport à B,
R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone,
Ri et R2 identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant 1 à 6 atomes de carbone, cycloalkyle comportant 3 à 6 atomes de carbone, phényle, phénylalkyle ou cycloalkylalkyle dont la prtie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone, alcènyle comportant 3 à 6 atomes de carbone à condition que la double liaison ne soit pas située en position 1, 2 par rapport à l'atome d'azote, Ri et R2 peuvent également former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pyrrolidine, pipéridine, morpholine ou thiomorpholine, X représente un groupe CH-R3 , N-R», SO, SO2 ou un atome d'oxygène ou de soufre, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone,
Rj représente un groupe alkyle comportant 1 à 3 atomes de carbone, m est égal à 0 ou 1 , n est égal à 0, 1 ou 2, étant entendu que lorsque X représente un groupe SO, SO2 ou N-R), la somme m + n est au moins égale à 1 , étant entendu que lorsque A et B représentent chacun un atome d'azote et Z est en position para par rapport à B, X ne peut pas représenter le groupe CH-R3, étant entendu que lorsque A représente un groupe CH, B représente un atome d'azote, Z est en position ortho par rapport à B, X représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, le somme m+n est différente de 1 et à l'exception du N.N-diméthylcarbamate de phényI-2 quinolyle-4. autrement dit, les composés de formule (II) répondent à l'une des formules (Ha) ou (Ilb)
dans lesquelles A, B, V, W, X, Z, R, Ri, R2, n et m ont les significations mentionnées ci-dessus.
5. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale III :
III
Dans laquelle Ri et Ri' identiques ou différents représentent des groupes alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée de C1-C4, cycloalkyle dont la partie alkyle comporte 1 à 3 atomes de carbone et la partie cycloalkyle comporte 3 à 6 atomes de carbone ou phényle,
Ri et Ri' peuvent aussi former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un cycle pipéridine. de carbone, nitro ou trifluorophényle,
Ar représente un radical phényle, thiényle ou phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène (fluor, chlore, brome), les groupes alkyle ou alcoxy comportant 1 à 4 atomes
X^ représente un des enchaînements suivants :
6. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale IV : IV
Dans laquelle Ri est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6, un groupe phényle, un groupe cycloalkyle possédant de C3-C6, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, ou un groupe
s
.c- -R.
R,
Dans lequel R3 et R» sont des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyle et Rj est un groupe alkenyle ou alkynyle, la somme des atomes de carbone dans Rj, R-j, et R$ étant compris entre 2 et 5,
R2 est un groupe alkyle linéaire ou ramifié de C1-C6 , un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dans lequel le radical alkyl contient de C1-C3, un groupe 3
Dans lequel Ri, R4, et R5 sont définis comme ci-dessus, ou un groupe
Dans lequel n est 0, 1, 2 ou 3, RI et R2 pouvant former ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un radical hétérocycle à 5, 6 ou 7 chaînons pouvant contenir un autre hétéroatome choisi parmi l'azote et l'oxygène et pouvant porter un ou deux substituants choisis parmi les groupes alkyle de C1-C3, hydroxy, oxo, hydroxyalkyle, diméthylaminoalkyle dont la partie alkyle est de C1-C3,
Z est un groupe phényle, pyridyle, thienyle, 2-thiazolyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, alkoxy, alkylthio en C1-C3, le groupe trifluorométhyle, et le groupe nitro,
X et Y sont identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène, halogène, des groupes alkyle ou alkoxy de C1-C3, des groupes nitro ou trifluorométhyle,
A et B sont indépendamment l'un de l'autre des atomes d'azote ou des groupes CH,
Ou tout stéréoisomère de formule IV.
7. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé est sélectionné parmi les composés de la famille de formule générale V :
Dans laquelle,
Ri et R2 représentent indépendamment un groupe alkyle de C1-C6 linéaire ou ramifié, un groupe cycloalkylc de C3-C7, un groupe phénylalkyle ou cycloalkyle dont la partie alkyle est de C 1-C3 ; Rj et R2 peuvent représenter également un groupe alcényle ou alcynyle de C2-C6 à condition que la double ou la triple liaison ne soit pas située en position 1-2 par rapport à l'atome d'azote ; Ri et R2 peuvent représenter un groupe de formule -R3-Z -Ri dans laquelle R3 est un groupe alkylène linéaire ou ramifié de C2- C6 à condition qu'au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d'azote du groupe Z ; R4 représente un groupe alkyle de C1-C4 et Z l'atome d'oxygène , de soufre ou le groupe N-R5, R5 représentant l'atome d'hydrogène ou un groupe alkyle de C1-C3 ; RI et R2 peuvent former avec l'atome d'azote auquel ils sont rattachés un hétérocycle comprenant éventuellement un second hétéroatome. Ar représente un groupe phényle, pyridyle, ou thienyle ou un groupe phényle substitué par un ou deux substituants pris parmi les atomes d'halogène, les goupes alkyle, alcoxy et alkylthio de C1-C4, le groupe trifluorométhyle et le groupe nitro ; A et B sont indépendamment N ou CH.
Représente l'enchaînement
Ou, lorsque A est N et B représente CH, l'un des enchaînements suivants :
\
/
X, Y représente indépendamment l'atome d'hydrogène, halogène, un groupe alkyle ou alkoxy comprenant de C1-C3, le groupe nitro ou trifluorométhyle.
8. Produit selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que ledit agent inducteur de l'apoptose est sélectionné parmi les agents qui endommagent l'ADN, les ligands naturels ou synthétiques du récepteur aux glucocorticoïdes, ou les seconds messagers pro-apoptotiques.
9. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit agent est de préférence sélectionné parmi les radiations gamma, l'étoposide, la doxorubicine, la dexamethasone, la céramide telle que la céramide C8, la lonidamine.
10. Produit selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit second messager pro- apoptotique est sélectionné parmi les dérivés des glucocorticoïdes, parmi les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, les complexes de Platine, par exemple la cisplatine, les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthane sulfonoxy-alkanes, les dérivés de la pipérazine, parmi les inhibiteurs des topoisomerases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, Pepipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1 , par exemple les dérivés de la camptothecine, parmi les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le methotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidines, par exemple la 5-fluorouracile, parmi les antimitotiques tels que les vinca-alcaloïdes, les taxoïdes tel que le taxol, taxotere, et parmi les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone, la plicamycine.
1 1. Produit selon l'une des revendications 1-10 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un vecteur viral qui possède un gène qui code pour la thymidine kinase.
12. Produit selon l'une des revendications 1 à 1 1 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
13. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
14. Utilisation d'un produit selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné induire la mort des cellules tumorales.
15. Utilisation d'un composé possédant une affinité sur le récepteur mitochondrial des benzodiazépines pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour faciliter l'induction de l'apoptose.
16. Utilisation d'un composé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il est de préférence sélectionné parmi les composés des familles de formule générale I, 11, III, IV et V, notamment parmi les molécules suivantes : 1 -(2-chlorophényl)-N-méthyl-N-(l -méthylpropyl)-3 -isoquinoline carboxamide (PKI 1 195), N,N-diéthylcarbamate de phényl-3 naphtyle-1,
N.N-diéthyl α-méthyl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N-méthyl N-phényl phényl-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl (nitro-4 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N.N-diéthyl [(phényl-2 trifluorométhyl-8 quinolinyl-4) oxy]-2 propanamide, N.N-diéthyl (méthoxy-3 phényl)-2 quinazoline-4 propanamide,
N,N-diéthyl phényl-3 isoquinoléine- 1 propanamide,
N-méthyl N-(méthyl-l propyl) phényl-7 benzo[b]thiophènecarboxamide-5,
N.N-diéthyl phényl-3 naphtalènecarboxamide-1,
Et N-méthyl N[méthyl-1 propyl] (chloro-2 phényl)-l isoquinoléinecarboxamide-3.
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2185000A (en) * 1998-12-18 2000-07-12 Scios Inc. Treatment of diseases involving cyst formation
ES2214273T3 (es) * 1999-04-30 2004-09-16 The Regents Of The University Of Michigan Utilizacion de benzodiazepinas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes inducidas por apoptosis.
US20050113460A1 (en) * 1999-04-30 2005-05-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US20060025388A1 (en) 1999-04-30 2006-02-02 Glick Gary D Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7572788B2 (en) * 1999-04-30 2009-08-11 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
FR2808197A1 (fr) * 2000-04-28 2001-11-02 Centre Nat Rech Scient Utilisation du compose ro5-4864 et de composes derives pour la preparation de medicaments destines au traitement des pathologies tumorales
MXPA04001421A (es) * 2001-08-15 2004-06-03 Univ Michigan Composiciones y metodos que se relacionan con compuestos novedosos de benzodiazepina y sus destinos.
WO2003020701A2 (fr) * 2001-09-04 2003-03-13 Texas Tech University Chelates d'imagerie multimodaux a usages multiples
US7323475B2 (en) 2003-06-06 2008-01-29 Fibrogen, Inc. Nitrogen-containing heteroaryl compounds and methods of use thereof
US20050272723A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-08 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
US20060052369A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
JP2008528448A (ja) 2005-01-03 2008-07-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 新規化合物に関連する組成物および方法、ならびにその標的
WO2007053193A2 (fr) 2005-06-01 2007-05-10 The Regents Of The University Of Michigan Préparations de benzodiazépine non solvatées et méthodes
US20070105844A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Regents Of The University Of Michigan Therapeutic compositions and methods
WO2007053725A2 (fr) 2005-11-01 2007-05-10 The Regents Of The University Of Michigan Nouvelles 1,4-benzodiazépine-2,5-diones dotées de propriétés thérapeutiques
BRPI0707302B8 (pt) 2006-01-27 2021-05-25 Fibrogen Inc compostos de cianoisoquinolina que atuam no dano tecidual associado com isquemia, hipóxia e anemia, bem como composição farmacêutica que os compreende
CA2647596C (fr) * 2006-04-04 2012-06-12 Fibrogen, Inc. Composes de pyrrolo- et de thiazolopyridine et procedes d'utilisation
US7759338B2 (en) * 2006-04-27 2010-07-20 The Regents Of The University Of Michigan Soluble 1,4 benzodiazepine compounds and stable salts thereof
EP2418206A3 (fr) 2006-06-09 2012-06-27 The Regents of the University of Michigan Dérivés de benzodiazépine pour le traitment des troubles auto-immuns
MX2009009645A (es) 2007-03-09 2009-11-19 Univ Michigan Composiciones y metodos relacionados con nuevos compuestos y objetivos de los mismos.
MX2009010828A (es) 2007-04-06 2009-10-29 Neurocrine Biosciences Inc Antagonistas del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina y metodos relacionados con los mismos.
WO2008124614A1 (fr) 2007-04-06 2008-10-16 Neurocrine Biosciences, Inc. Antagonistes des récepteurs de l'hormone libérant la gonadotropine et procédés s'y rapportant
MX2010002732A (es) 2007-09-14 2010-06-02 Univ Michigan Inhibidores de f1f0-atpasa y metodos relacionados.
UA99839C2 (ru) 2007-11-06 2012-10-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Бензодиазепиноновые соединения, применяемые при лечении кожных состояний
WO2010030891A2 (fr) 2008-09-11 2010-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Inhibiteurs de f<sb>1</sb>f<sb>0</sb>-atpase à base d’aryle guanidine et procédés associés
CN105037323A (zh) 2008-11-14 2015-11-11 菲布罗根有限公司 作为hif羟化酶抑制剂的苯并噻喃衍生物
WO2010121164A2 (fr) 2009-04-17 2010-10-21 The Regents Of The University Of Michigan Composés de 1,4-benzodiazépinone et leur utilisation dans le traitement du cancer
GB0907284D0 (en) 2009-04-28 2009-06-10 Queen Mary & Westfield College Compounds for inducing cellular apoptosis
WO2011035124A1 (fr) 2009-09-18 2011-03-24 The Regents Of The University Of Michigan Composés de benzodiazépinone et méthodes de traitement les utilisant
CA2780333C (fr) 2009-11-17 2016-05-24 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepine-2,5-diones et composes apparentes presentant des proprietes therapeutiques
EP2501695B1 (fr) 2009-11-17 2018-08-29 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazépine-2,5-diones et composés apparentés présentant des propriétés thérapeutiques
EP2834220B1 (fr) 2012-03-09 2016-11-09 Fibrogen, Inc. Composés 4-hydroxy-isoquinoléine comme inhibiteurs d'hydroxylase hif
KR20220164068A (ko) 2012-07-16 2022-12-12 피브로겐, 인크. 프롤릴 하이드록실라제 억제제 [(4-하이드록시-1-메틸-7-페녹시-아이소퀴놀린-3-카보닐)-아미노]-아세트산의 결정형
CN103435546B (zh) 2012-07-16 2016-08-10 菲布罗根有限公司 制备异喹啉化合物的方法
US8883823B2 (en) 2012-07-16 2014-11-11 Fibrogen, Inc. Crystalline forms of a prolyl hydroxylase inhibitor
CA2899024C (fr) 2013-01-24 2022-01-04 Fibrogen, Inc. Formes cristallines d'acide {[1-cyano-5-(4-chlorophenoxy)-4-hydroxy-isoquinoline-3-carbonyl]-amino}-acetique

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2582514B1 (fr) * 1985-05-30 1988-02-19 Rhone Poulenc Sante Medicaments a base d'amides, nouveaux amides et leur preparation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9966958A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2274741A1 (fr) 1999-12-22
AU3508999A (en) 2000-01-06
WO1999066958A3 (fr) 2000-04-20
FR2779963A1 (fr) 1999-12-24
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