EP0000028B1 - Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats - Google Patents

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EP0000028B1
EP0000028B1 EP78100045A EP78100045A EP0000028B1 EP 0000028 B1 EP0000028 B1 EP 0000028B1 EP 78100045 A EP78100045 A EP 78100045A EP 78100045 A EP78100045 A EP 78100045A EP 0000028 B1 EP0000028 B1 EP 0000028B1
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EP
European Patent Office
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enzyme
carrier
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process according
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EP78100045A
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Günter Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. Weidenbach
Dirk Dipl.-Chem. Dr.-Ing. Bonse
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Kali Chemie AG
Original Assignee
Kali Chemie AG
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Definitions

  • Organic materials e.g. cellulose, nylon, polyacrylamide
  • cellulose, nylon, polyacrylamide have considerable disadvantages as carriers because they do not have sufficient mechanical stability, can be attacked by the solvent, are sensitive to changing pH values and ionic strengths, and in some cases tend to attack microbes, which leads to binding to Enzyme can be dissolved.
  • inorganic substances have been proposed as carriers on which enzymes are bound by adsorption or covalently.
  • the preferred type of binding depends on the type and conditions of use of the enzyme and the nature of the substrate. If, for example, the substrate is in a high salt concentration, the adsorption method cannot be used because desorption of the adsorbed enzyme molecules is possible. Therefore, the covalent binding of the enzyme to the carrier is preferred.
  • the carrier surface must then contain specific functional groups that ensure binding of the enzyme. Since the carrier does not have these functional groups in most cases, the surface must be pretreated. For example, the coating of inorganic material with silanes is known, as a result of which the surface receives organically functional groups (e.g. alkylamine) which form a covalent bond with organic substance.
  • organically functional groups e.g. alkylamine
  • Aluminum oxide, nickel oxide, iron oxide, titanium oxide, zirconium oxide, hydroxylapatite, silicates and porous glass have been proposed as materials for inorganic carriers, the pore structure of which ensures the accessibility of the enzyme and the substrate to the inner surface, but their other desirable properties such as optimal pore distribution and surface size, however, vary widely Information is available.
  • the invention is therefore based on the object of the known processes for the preparation of a water-insoluble enzyme preparation, in which an inorganic carrier which has functional groups for the covalent binding of an enzyme is brought into contact with a solution of an enzyme by means of processes known per se binds to the carrier and isolates the enzyme preparations obtained, to improve them so that a maximally active preparation is obtained with minimal enzyme expenditure.
  • This object is achieved according to the invention in that firstly carriers which differ in their most common pore diameter are brought into contact with enzyme solutions which differ in their enzyme concentration, the enzyme is bound to the carriers, the enzyme preparations are isolated and their activity is isolated determined and selected from the different carriers used the carrier with the most common pore diameter which, regardless of the amount of enzyme bound to it, gave the preparation with the highest activity, and then brings the selected carrier into contact with enzyme solutions which differ in their enzyme content, the enzyme binds to the carrier, isolates the enzyme preparations, their activity and specific activity is determined and, from the different enzyme solutions used, selects the one which gives the preparation with the highest activity and a specific activity close to or equal to the specific activity of the enzyme in the free state n has.
  • carriers with different common pore diameters are first provided with coupling agents according to known methods, which both adhere sufficiently firmly to the carrier, in particular form a covalent bond to the carrier, and are capable of covalent binding with the enzyme.
  • coupling agents according to known methods, which both adhere sufficiently firmly to the carrier, in particular form a covalent bond to the carrier, and are capable of covalent binding with the enzyme.
  • silanization has become the most common method for inorganic carriers, but, as already mentioned, other coupling agents can also be used.
  • the number of coupling links on the carrier must be sufficiently large and largely depends on the surface of the carrier.
  • the carriers pretreated in this way are then offered different amounts of enzyme by bringing them into contact with enzyme solutions of different concentrations and by known methods covalently binding the enzyme to the coupling member and thus to the carrier.
  • the activity of the preparations depends on the most common pore diameter regardless of the amount of enzyme bound to them and runs through a maximum.
  • the grain size of the carrier is irrelevant to the position of the maximum and at most influences its absolute value. The grain size of the Carrier therefore has only a subordinate meaning for the teaching according to the invention and largely depends on the intended use, for example the viscosity of the substrate and the procedure.
  • the optimal carrier determined in this way with regard to the most common pore diameter is then again offered different amounts of enzyme. It is shown that preparations are obtained at certain enzyme concentrations, the specific activity of which approaches or reaches the specific activity of the enzyme in the free state, i.e. the relative activity of the preparation reaches a value of 100%.
  • the method according to the invention is therefore a double selection process, i.e. a process by means of which one can select from a number of carriers which are suitable with regard to their pore diameter and from a plurality of enzyme solutions which are possible with regard to their enzyme concentration, the carrier and the enzyme concentration which give a preparation with the highest possible activity with the least possible use of enzyme.
  • the optimal carrier determined is reacted with differently concentrated enzyme solutions, the absolute activity and the specific activity, i.e., of the enzyme preparations obtained.
  • the activity per milligram of enzyme is determined, and the values obtained are compared. It is initially confirmed that, with increasing concentration of the enzyme solution, the absolute activity of the preparations obtained also initially increases, but then remains the same from a certain concentration. Any increase in concentration beyond the concentration determined in this way is therefore a waste of enzyme. This is in contradiction to the known experiences, which act according to the motto "A lot helps a lot".
  • the bound enzyme is just as active as the enzyme in the free state, i.e. the specific activity of both the bound and free enzyme are the same or the relative activity of the enzyme preparation is 100%.
  • the specific activity rapidly decreases from a certain concentration and the relative activity becomes less than 100%, i.e. an increasing proportion of the bound enzyme is in inactive form.
  • the invention provides the teaching set out in the claims for the production of a water-insoluble enzyme preparation, which is both the optimal carrier with regard to maximum activity and the optimum concentration of the enzyme solution on the one hand and in the interest of maximum space-time yield on the one hand and avoiding enzyme waste on the other can be determined.
  • the optimum support can be obtained according to a further development of the invention if the gel, after setting an alkali content, calculated as Na 2 0 and based on dry substance, from 0.1 to 0, 5 wt .-%, and drying, 5 to 10 hours in a steam-containing air stream at 400 ° C to 850 ° C, preferably 570 ° C to 750 ° C, glows.
  • the drying is expediently carried out in water vapor-saturated air at 180 ° C. to 200 ° C.
  • a water vapor-containing air stream with a relative humidity of 40 to 80% has proven to be advantageous for annealing.
  • the carrier thus produced has a most common pore diameter of 175 to 3,000 ⁇ , preferably 250 to 600 ⁇ , optimally about 340 ⁇ .
  • the immobilization method according to the invention can be used for all technically and analytically important enzymes, for example for hydrolases (e.g. amylases, glycosidases, proteases), oxidoreductases (glucose oxidase, catalase), isomerases (glucose isomerase), transferases (dextran sucrase).
  • hydrolases e.g. amylases, glycosidases, proteases
  • oxidoreductases oxidoreductases
  • oxidoreductases oxidoreductases
  • isomerases glucose isomerase
  • transferases dextran sucrase
  • the optimal preparation is obtained when the optimal carrier is brought into contact with a solution containing 25 to 75 mg , preferably 50 mg, contains amyloglucosidase per gram of carrier.
  • the optimal preparation is obtained if the optimal carrier with a Solution is brought into contact containing 20-50 mg, preferably 25 mg, of glucose isomerase per gram of carrier.
  • a SiO 2 gel precipitated from sodium silicate solution with sulfuric acid and having a Na 2 O content of 0.3% by weight was dried at 180 ° C. in water-saturated air for three hours. 1 kg of this material was annealed for 6 hours at 730 ° C in an air flow of 2 l / min, which had a relative moisture content of 80%. After this treatment, the Si0 2 had a most common pore diameter of 1400 ⁇ . Carrier 1 was separated into fractions by sieving. The further preparation was carried out with the fraction 0.25 to 0.5 mm.
  • sample 1.2 10 g of silanized carrier 1 were suspended in 20 ml solution of 0.5 g amyloglucosidase (Merck 1330) in 0.05 m phosphate buffer (pH 7). The further procedure corresponded to the preparation of sample 1.1. The C-N analysis of the finished sample 1.2 showed a protein content of 9.0 mg / g.
  • Carrier 2 calculated on the basis of the mean value of the C and N determination, contained 0.19 m eq of silane / g.
  • silanized carrier 2 Another 10 g of the silanized carrier 2 were suspended in 20 ml solution of 0.5 g amyloglucosidase (Merck 1330) in 0.05 m phosphate buffer (pH 7) and treated as described in Example 1 (sample 1.2).
  • the C-N analysis of the finished sample 2.2 showed a protein content of 17.4 mg / g.
  • Carrier 3 calculated on the basis of the mean value of the C and N determination, contained 0.51 m eq of silane / g.
  • the finished sample 3.1 had a protein content of 26.2 mg / g after the C-N analysis.
  • silanized carrier 3 Another 10 g of the silanized carrier 3 were in 20 ml solution of 0.5 g of amyloglucosidase (Merck 1330) suspended in 0.05 m phosphate buffer (pH 7) and treated as described in Example 1 (sample 1.2).
  • the C-N analysis of the finished sample 3.2 showed a protein content of 12.7 mg / g.
  • the fraction 0.25-0.5 mm was sieved out of the carrier 2 (most common pore diameter 340 A) and 50 g thereof in 500 ml 12.5 % aqueous glutardialdehyde solution stirred for 5 minutes at room temperature. 500 ml of saturated NH 4 CI solution were then added. After four hours of stirring at room temperature, the sample was washed with water until free of chloride and dried over P Z 0 5 in vacuo.
  • the finished sample 4.1 had a protein content of 29.8 mg / g after the C-N analysis.
  • the C-N analysis of the finished sample 4.2 showed a protein content of 17.9 mg.
  • the reaction time was 30 minutes at room temperature. After every 10 minutes, the reaction vessel was evacuated and, after the reaction had ended, the residual solution was suctioned off. Then 3 washes with water and 0.05 m phosphate buffer (pH 7).
  • the finished sample 5.1 had a protein content of 4.8 mg / g after the C-N analysis.
  • the C-N analysis of the finished sample 5.2 showed a protein content of 2.0 mg / g.
  • the further treatment corresponded to Example 5.
  • the finished sample 6.1 had a protein content of 22.0 mg / g after the C-N analysis.
  • sample 6.2 a further 10 g of carrier 2 were suspended in 40 ml of a 0.05 m phosphate buffer solution (pH 7) which contained 0.25 g of glucose isomerase.
  • the further treatment corresponded to example 5.
  • the C-N analysis of the finished sample 6.2 showed a protein content of 10.2 mg / g.
  • the further treatment corresponded to Example 5.
  • the finished sample 7.1 had a protein content of 11.2 mg / g after the C-N analysis.
  • the C-N analysis of the finished sample 7.2 showed a protein content of 5.1 mg / g.
  • Example 4 10 g of the carrier mentioned in Example 4 (most common pore diameter 340 A, treated with aqueous glutardialdehyde solution) were suspended in 40 ml of a 0.05 M phosphate buffer solution (pH 7) which contained 0.5 g of glucose isomerase.
  • the further treatment corresponded to example 5.
  • the finished sample 8.1 had a protein content of 21.3 mg / g.
  • sample 8.2 a further 10 g of the same carrier were suspended in 40 ml of a 0.05 m phosphate buffer solution (pH 7) which contained 0.25 g of glucose isomerase. The further procedure corresponded to preparation 5.1. The C-N analysis of the finished sample 8.2 showed a protein content of 9.8 mg / g.
  • the activity of the preparations 1.1, 1.2 described in Examples 1 to 4; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1, 4.2 and that of the enzyme used for fixation (amyloglucosidase, Merck 1330) was used according to the dinitrosalicylic acid method (cf. Rick, W., Stegbauer, HP in: Bergmeyer, HU "Meth. D. Enzymatic Analysis", Verlag Chemie 1970 S. 848 ff).
  • One activity unit (U) corresponds to that Amount of enzyme that releases 1 ⁇ equivalent of reducing groups (calculated as glucose) per minute under incubation conditions.
  • Carrier-fixed preparations were suspended under the above conditions in a 40 ml reactor at a stirring speed of 600 min -1 (product formation rate regardless of stirring speed).
  • the protein content of the preparations was determined on the basis of the mean values of the C-N determination.
  • the most common pore diameter of the carriers was determined from the pore distribution (measured with a high pressure porosimeter).
  • the carrier-fixed preparations were suspended as described in Example 9 under standard conditions in the stirred reactor.
  • the protein content of the preparations was determined on the basis of the mean values of the C-N determination.
  • the method according to the invention has for the first time made it possible to use expensive enzymes technically, since the method allows the use of carrier according to the invention to optimize the amount of enzyme required for maximum activity.

Description

  • Es ist bekannt, Enzyme durch Bindung an organische oder anorganische Träger zu immobilisieren, d.h. wasserunlöslich zu machen, so dass diese wiederverwendbar sind und in kontinuierlich arbeitenden Verfahren eingesetzt werden können.
  • Organische Materialien (z.B. Zellulose, Nylon, Polyacrylamid) weisen als Träger erhebliche Nachteile auf, da sie keine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, vom Lösungsmittel angegriffen werden können, gegenüber wechselnden pH-Werten und lonenstärken empfindlich sind und teilweise zum Mikrobenbefall neigen, wodurch die Bindung zum Enzym gelöst werden kann.
  • Deshalb wurden anorganische Substanzen als Träger vorgeschlagen, auf denen Enzyme adsorptiv oder kovalent gebunden werden. Die bevorzugte Art der Bindung hängt von der Art und den Einsatzbedingungen des Enzyms und der Beschaffenheit des Substrates ab. Liegt das Substrat beispielsweise in einer starken Salzkonzentration vor, ist die Adsorptionsmethode nicht anwendbar, da eine Desorption der adsorbierten Enzymmoleküle möglich ist. Deshalb wird die kovalente Bindung des Enzyms an den Träger vorgezogen. Die Trägeroberfläche muss dann spezifische funktionelle Gruppen enthalten, die eine Bindung des Enzyms gewährleisten. Da der Träger diese funktionellen Gruppen in den meisten Fällen nicht besitzt, ist eine Vorbehandlung der Oberfläche erforderlich. Bekannt ist beispielsweise die Belegung von anorganischem Material mit Silanen, wodurch die Oberfläche organisch funktionelle Gruppen (z.B. Alkylamin) erhält, die mit organischer Substanz eine kovalente Bindung eingehen. Weiterhin ist die Behandlung anorganischer Träger mit Sulfurylchlorid, Thionylchlorid oder Cyanurchlorid erprobt worden. Ausserdem ist es möglich, die Trägeroberfläche mit einem wasserunlöslichen Polymer zu überziehen, das freie funktionelle Gruppen aufweist, wie z.B. Polyacrolein, das zwischen 10 und 70% freie Aldehydgruppen, bezogen auf die Anzahl der monomeren Moleküle, besitzt.
  • Als Material für anorganischeTräger wurden Aluminiumoxide, Nickeloxid, Eisenoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Hydroxylapatit, Silikate und poröses Glas vorgeschlagen, deren Porenstruktur die Zugänglichkeit des Enzyms und des Substrates zur inneren Oberfläche gewährleistet, über deren weitere wünschenswerte Eigenschaften wie optimale Porenverteilung und Oberflächengrösse jedoch sehr unterschiedliche Angaben vorliegen.
  • Mit keinem der genannten Träger gelang es, unabhängig von der angewandten Bindungsart, Enzyme so zu immobilisieren, dass ihre spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität im freien Zustand nahekommt. Nach Angaben von D.L.Latigue (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, S. 127) liegen auch unter besten Immobilisierungsbedingungen nur maximal 80% des auf dem Träger aufgebrachten Enzyms in aktiver Form vor.
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats, bei dem man einen anorganischen Träger, der funktionelle Gruppen zur kovalenten Bindung eines Enzyms aufweist, mit einer Lösung eines Enzyms in Berührung bringt, das Enzym mittels an sich bekannter Verfahren an den Träger bindet und die erhaltenen Enzympräparate isoliert, so zu verbessern, daß bei minimalem Enzymaufwand ein maximal aktives Präparat erhalten wird.
  • Die Lösung dieser Aufgabe gelingt gemäß der Erfindung dadurch, daß man zunächst Träger, die sich in ihrem häufigsten Porendurchmesser unterscheiden, mit Enzymlösungen, die sich in ihrer Enzymkonzentration unterscheiden, in Berührung bringt, das Enzym an die Träger bindet, die Enzympräparate isoliert, deren Aktivität bestimmt und von den benutzten unterschiedlichen Trägern den Träger mit demjenigen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge das Präparat mit der höchsten Aktivität ergeben hat, und dann den ausgewählten Träger mit Enzymlösungen, die sich in ihrem Enzymgehalt unterscheiden, in Berührung bringt, das Enzym an den Träger bindet, die Enzympräparate isoliert, deren Aktivität und spezifische Aktivität bestimmt und von den benutzten unterschiedlichen Enzymlösungen diejenige auswählt, die das Präparat mit der höchsten Aktivität und einer spezifischen Aktivität nahe oder gleich der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand ergeben hat.
  • Bei der Lehre nach der Erfindung werden zunächst Träger mit unterschiedlichen häufigsten Porendurchmessern nach bekannten Methoden mit Kupplungsmitteln versehen, die sowohl ausreichend fest am Träger haften, insbesondere eine kovalente Bindung zum Träger eingehen, als auch zu einer kovalenten Bindung mit dem Enzym befähigt sind. Als gebräuchlichste Methode hat sich in der Vergangenheit für anorganische' Träger die Silanisierung durchgesetzt, es sind aber, wie schon ausgeführt, auch andere Kupplungsmittel einsetzbar. Die Anzahl der Kupplungsglieder am Träger muss hinreichend gross sein und hängt weitgehend von der Oberfläche des Trägers ab.
  • Den so vorbehandelten Trägern werden dann unterschiedliche Enzymmengen angeboten, indem man sie mit Enzymlösungen unterschiedlicher Konzentration in Berührung bringt und nach bekannten Methoden eine kovalente Bindung des Enzyms zum Kupplungsglied und damit zum Träger herstellt. Nach Bestimmung der Aktivität der so erhaltenen Präparate zeigt sich, dass die Aktivität der Präparate ungeachtet der an sie gebundenen Enzymmenge von dem häufigsten Porendurchmesser abhängt und ein Maximum durchläuft. Es hat sich dabei ausserdem gezeigt, dass die Korngrösse des Trägers für die Lage des Maximums unerheblich ist und allenfalls dessen Absolutwert beeinflusst. Die Korngrösse des Trägers hat daher für die Lehre nach der Erfindung nur eine untergeordnete Bedeutung und richtet sich weitgehend nach dem vorgesehenen Einsatzzweck, beispielsweise der Viskosität des Substrats und der Verfahrensführung.
  • Dem auf diese Weise hinsichtlich des häufigsten Porendurchmessers ermittelten optimalen Träger werden dann wiederum unterschiedliche Mengen Enzym angeboten. Dabei zeigt sich, dass bei bestimmten Enzymkonzentrationen Präparate erhalten werden, deren spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand nahekommt oder diese erreicht, d.h. die relative Aktivität des Präparats erreicht einen Wert von 100%.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich also um ein zweifaches Auswahlverfahren, d.h. um ein Verfahren, mit dessen Hilfe man aus mehreren hinsichtlich ihres Porendurch= messers in Betracht kommenden Trägern, und aus mehreren, hinsichtlich ihrer Enzymkonzentration in Betracht kommenden Enzymlösungen, denjenigen Träger und diejenige Enzymkonzentration auswählt, die ein Präparat mit höchstmöglicher Aktivität bei geringstmöglichem Enzymeinsatz ergeben.
  • Wenn man nämlich erfindungsgemäß mehrere, hinsichtlich ihres häufigsten Porendurchmessers unterschiedliche Träger je für sich mit einer Enzymlösung mit einer bestimmten, zunächst für alle Träger gleichen Konzentration umsetzt, danach diese Operation mit denselben Trägern jedoch mit Enzymlösungen mit von der erstgenannten Enzymlösung verschiedener Konzentration wiederholt, von den erhaltenen Enzympräparaten die absolute Aktivität, d.i. die Aktivität pro Gramm Enzympräparat, bestimmt und die Aktivitäten miteinander vergleicht, dann zeigt sich, daß unabhängig von der Konzentration der benutzten Enzymlösungen immer der hinsichtlich seines häufigsten Porendurchmessers gleiche Träger das aktivste Präparat ergeben hat.
  • Es zeigt sich aber auch, im Gegensatz zu dem zu erwartenden Ergebnis, daß nämlich mit steigender Konzentration der Enzymlösungen auch die Aktivität der erhaltenen Enzympräparate steigen sollte, von einer bestimmten Konzentration der Enzymlösung an eine weitere Steigerung der Konzentration keinen Aktivitätszuwachs mehr bringt, d.h. ein "Mehr" an Enzym bringt nicht unbedingt auch ein "Mehr" an Aktivität.
  • Das wird besonders augenscheinlich, wenn man gemäß der Erfindung den ermittelten optimalen Träger mit unterschiedlich konzentrierten Enzymlösungen umsetzt, von den erhaltenen Enzympräparaten die absolute Aktivität und die spezifische Aktivität, d.i. die Aktivität pro Milligramm Enzym, bestimmt, und die erhaltenen Werte miteinander vergleicht. Dabei bestätigt sich zunächst, daß mit steigender Konzentration der Enzymlösung die absolute Aktivität der erhaltenen Präparate zunächst ebenfalls steigt, dann aber von einer bestimmten Konzentration an gleich bleibt. Jede Steigerung der Konzentration über die so ermittelte Konzentration hinaus ist also Enzymverschwendung. Das steht im Widerspruch zu den bekannten Erfahrungen, die nach dem Motto handeln "Viel hilft Viel".
  • Es zeigt sich aber auch, daß bei niedrigen Konzentrationen der benutzten Enzymlösungen das gebundene Enzym ebenso aktiv ist wie das Enzym im freien Zustand, d.h. die spezifische Aktivität sowohl des gebundenen als auch des freien Enzyms sind gleich bzw. die relative Aktivität des Enzympräparats beträgt 100%. Bei Steigerung der Konzentration fällt dann jedoch von einer bestimmten Konzentration an die spezifische Aktivität rapide ab und die relative Aktivität wird kleiner als 100%, d.h. ein immer größerer Anteil des gebundenen Enzyms liegt in inaktiver Form vor.
  • Aus diesen Erkenntnissen heraus gibt die Erfindung die in den Ansprüchen niedergelegte Lehre zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats, die sowohl den hinsichtlich maximaler Aktivität optimalen Träger als auch die im Interesse einer maximalen Raum-Zeit-Ausbeute einerseits und der Vermeidung von Enzymverschwendung andererseits optimale Konzentration der Enzymlösung ermitteln läßt.
  • Bei Trägern, die aus einem Si02-Gel hergestellt sind, lässt sich gemäss Weiterbildung der Erfindung der optimale Träger erhalten, wenn man das Gel nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na20 und bezogen auf Trockensubstanz, von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, und Trocknung, 5 bis 10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 400°C bis 850°C, vorzugsweise 570°C bis 750°C, glüht.
  • Zweckmässigerweise erfolgt die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180°C bis 200°C. Für das Glühen hat sich ein wasserdampfhaltiger Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% als vorteilhaft erwiesen.
  • Der so heregestellte Träger weist einen häufigsten Porendurchmesser von 175 bis 3.000 Ä, vorzugsweise 250 bis 600 A, optimalerweise etwa 340 Ä, auf.
  • Das erfindungsgemässe Immobilisierungsverfahren ist für alle technisch und analytisch wichtigen Enzyme anwendbar, beispielsweise für Hydrolasen (z.B. Amylasen, Glycosidasen, Proteasen), Oxydoreductasen (Glucoseoxidase, Katalase), Isomerasen (Glucoseisomerase), Transferasen (Dextransucrase).
  • Fur den Fall, dass das Enzym Amyloglucosidase ist, welche im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 10 bis 15 Einheiten/mg aufweist, wird das optimale Präparat dann erhalten, wenn man den optimalen Träger mit einer Lösung in Berührung bringt, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält.
  • Wird als Enzyme Glucoseisomerase eingesetzt, die im freien Zustand eine spezifischeAktivitat von 50-70 Einheiten/mg aufweist, erhält man das optimale Präparat, wenn der optimale Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20-50 mg, vorzugsweise 25 mg, Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.
  • Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
    • Beispiel 1
  • Zur Herstellung des Trägers 1 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes Si02-Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-% bei 180°C in wasserdampfgesättigter Luft drei Stunden getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 730°C in einem Luftstrom von 2 I/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das Si02 einen häufigsten Porendurchmesser von 1400 Ä. Der Träger 1 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.
  • 150 g dieser Trägerfraktion wurde 8 Stunden mit 4 I einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol am Rückfluss gekocht und nach Abkühlung mit je 1000 ml Benzol und mit je 1000 ml Aceton dreimal gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur im Vakuum wurde der Träger zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) und dreimal mit bidest. Wasser gewaschen. Die Trocknung erfolgte über P2O5 im Vakuum. Berechnet auf Basis des Mittelwertes der C-und N-Bestimmung enthielt der Träger 1 0,13 m Äq Silan/g.
  • 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die Aktivität der Amyloglucosidase betrug 11,75 U/mg, wobei als Aktivitätsmass U die Bildung von 1 µ Mol Glucose/min bei 25°C benutzt wurde. Die Suspension wurde 20 Minuten unter Vakuum gehalten, wieder belüftet und nach zwei Stunden nochmals für 20 Minuten evakuiert. Nach vier Stunden erfolgte die Trennung von Träger und Lösung durch Filtration, anschliessend dreimalige Waschung mit bidest. Wasser und schliesslich eine dreimalige Waschung mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 5). Die fertige Probe 1.1 wurde in Phosphatpuffer (pH 5) bei 4°C aufbewahrt. Die C-N-Analyse ergab einen Proteingehalt von 16,5 mg/g.
  • Zur Herstellung der Probe 1.2 wurden 10 g des silanisierten Trägers 1 in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation der Probe 1.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 1.2 ergab einen Proteingehalt von 9,0 mg/g.
    • Beispiel 2
  • Zur Herstellung des Trägers 2 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO2 Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 680°C in einem Luftstrom von 2 1/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das Si02 einen häufigsten Porendurchmesser von 340 Ä. Der Träger 2 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.
  • 150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 4 I einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt.
  • Der Träger 2 enthielt, berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung, 0,19 m Äq Silan/g.
  • 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert. Die fertige Probe 2.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 30,8 mg/g auf.
  • Weitere 10 g des silanisierten Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
  • Die C-N-Analyse der fertigen Probe 2.2 ergab einen Proteingehalt von 17,4 mg/g.
    • Beispiel 3
  • Zur Herstellung des Trägers 3 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes Si02-Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 640°C in einem Luftstrom von 2 I/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 60% aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das Si02 einen häufigsten Porendurchmesser von 180 Ä. Der Träger 3 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,50 mm.
  • 150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 4 I einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt.
  • Der Träger 3 enthielt, berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung 0,51 m Äq Silan/g.
  • 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert.
  • Die fertige Probe 3.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 26,2 mg/g auf.
  • Weitere 10 g des silanisierten Trägers 3 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
  • Die C-N-Analyse der fertigen Probe 3.2 ergab einen Proteingehalt von 12,7 mg/g.
    • Beispiel 4
  • Un den Nachweis zu führen, dass das Kupplungsmittel auf die Aktivität des Präparates keinen Einfluss hat, wurde von dem Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) die Fraktion 0,25-0,5 mm ausgesiebt und davon 50 g in 500 ml 12,5%iger wäßriger Glutardialdehydlösung 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend erfolgte ein Zusatz von 500 ml gesättigter NH4CI-Lösung. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Probe mit Wasser bis zur Chloridfreiheit gewaschen und über PZ05 im Vakuum getrocknet.
  • 10-9 dieses Trägers wurcfen in 20 ml Lösüng von 1 g Ainylöglucösidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert.
  • Die fertige Probe 4.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 29,8 mg/g auf.
  • Weitere 10 g des Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
  • Die C-N-Analyse der fertigen Probe 4.2 ergab einen Proteingehalt von 17,9 mg.
    • Beispiel 5
  • 10 g des Trägers 1 (häufigster Porendurchmesser 1400 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase (Y.Takasaki, Agr.Biol.Chem.33, Nr. 11, 1527-1534 (1969)) enthielt, suspendiert.
  • Die Reaktionszeit betrug bei Raumtemperatur 30 Minuten. Nach jeweils 10 Minuten wurde das Reaktionsgefäss evakuiert und nach Beendigung der Reaktion die Restlösung abgesaugt. Dann erfolgten 3 Waschungen mit Wasser und 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7).
  • Die fertige Probe 5.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 4,8 mg/g auf.
  • Zur Herstellung der Probe 5.2 wurden weitere 10 g des Trägers 1 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.
  • Die C-N-Analyse der fertigen Probe 5.2 ergab einen Proteingehalt von 2,0 mg/g.
    • Beispiel 6
  • 10 g des Trägers 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.
  • Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 6.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 22,0 mg/g auf.
  • Zur Herstellung der Probe 6.2 wurden weitere 10 g des Trägers 2 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 6.2 ergab einen Proteingehalt von 10,2 mg/g.
    • Beispiel 7
  • 10 g des Trägers 3 (häufigster Porendurchmesser 180 A) wurden in 40 mi einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.
  • Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 7.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 11,2 mg/g auf.
  • Zur Herstellung der Probe 7.2 wurden weitere 10 g des Trägers 3 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.
  • Die C-N-Analyse der fertigen Probe 7.2 ergab einen Proteingehalt von 5,1 mg/g.
    • Beispiel 8
  • 10 g des im Beispiel 4 genannten Trägers (häufigster Porendurchmesser 340 A, behandelt mit wäßriger Glutardialdehydlösung) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 8.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 21,3 mg/g auf.
  • Zur Herstellung der Probe 8.2 wurden weitere 10 g des gleichen Trägers in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 8.2 ergab einen Proteingehalt von 9,8 mg/g.
    • Beispiel 9
  • Die Aktivität der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Präparate 1.1, 1.2; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1, 4.2 sowie die des zur Fixierung eingesetzten Enzyms (Amyloglucosidase, Merck 1330) wurde nach der Dinitrosalizylsäuremethode (vergl. Rick, W., Stegbauer, H.P. in: Bergmeyer, H.U. "Meth. d. Enzymatischen Analyse", Verlag Chemie 1970 S. 848 ff) bestimmt. Eine Aktivitätseinheit (U) entspricht der Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 µ Äquivalent reduzierende Gruppen (berechnet als Glucose) pro Minute freisetzt.
    • Inkubationsbedingungen
  • 2%ige Substratlösung (Zulkowsky-Stärke Merck 1257) in 0,1 m Acetatpuffer pH 5,0, 30 Minuten, 25°C.
  • Trägerfixierte Präparate wurden unter o.a. Bedingungen in einem 40 ml Reaktor bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 min-1 (Produktbildungsrate unabhängig von Rührgeschwindigkeit) suspendiert.
  • Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt. Der häufigste Porendurchmesser der Träger wurde aus der Porenverteilung (gemessen mit Hochdruckporosimeter) bestimmt.
  • In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Proben 1-4 zusammengestellt. Die verwendeten Kenngrössen werden wie folgt definiert:
    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
    • Beispiel 10
  • Die Aktivität der in den Beispielen 5-8 beschriebenen Präparate 5.1, 5.2; 6.1, 6.2; 7.1, 7.2; 8.1, 8.2 sowie die der zur Fixierung eingesetzten Glucoseisomerase wurde nach der Takasaki-Methode (vgul. Y.Takasaki: Agr.Biol.Chem. Vol.30, Nr.12, 1247-1253, 1966 und Z.Dische u.E.Borenfreund: J.-Biol.Chem.192, 583, 1951) bestimmt. Eine Aktivitätseinheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 mg Fructose bildet.
    • Inkubationsbedingungen
  • Figure imgb0003
  • Die trägerfixierten Präparate wurden wie im Beispiel 9 beschrieben unter Standardbedingungen im Rührreaktor suspendiert.
  • Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt.
  • In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Proben 5-8 zusammengestellt.
  • Die Definition der verwendeten Kenngrössen ist im Beispiel 9 angegeben.
    Figure imgb0004
    • Die Ergebnisse zeigen:
    • 1. Die Aktivität U der untersuchten Proben verläuft über ein Maximum, das vom häufigsten Porendurchmesser des Trägers abhängig ist.
    • 2. Die spezifische Aktivität Us hängt von der Enzymaufnahme ab und erreicht bei einer bestimmten Enzymkonzentration cE den Wert der Aktivität des Enzyms im freien Zustand USF, so dass Urel=100 wird. Wird diese Enzymmenge überschritten, sinkt die spezifische Aktivität ab, wobei das Produkt aus Us und cE konstant bleibt.
    • 3. Die vom Träger aufgenommene Enzymmenge ist eine Funktion des häufigsten Porendurchmessers. Das System Enzym/Träger weist maximale Aktivität bei kleinstmöglichem Enzymeinsatz auf, wenn der optimale Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) 17,4 mg Amyloglucosidase/g bzw. 10,2 mg Glucoseisomerase/g aufgenommen hat (Proben 2.2 bzw. 6.2).
    • 4. Enzymaufnahme und Aktivität der untersuchten Proben sind vom Kupplungsmittel unabhängig.
  • Da die Enzymkosten beträchtlich sind und mit dem geforderten Reinheitsgrad sehr stark ansteigen, für den wirtschaftlichen Einsatz also eine erhebliche Rolle spielen, ist mit dem erfindungsgemässen Verfahren erstmals die Möglichkeit geschaffen worden, auch teure Enzyme technisch anzuwenden, da es das Verfahren gestattet, bei Einsatz des erfindungsgemässen Trägers, die für maximale Aktivität benötigte Enzymmenge zu optimieren.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats, bei dem man einen anorganischen Träger, der funktionelle Gruppen zur kovalenten Bindung eines Enzyms aufweist, mit einer Lösung eines Enzyms in Berührung bringt, das Enzym mittels an sich bekannter Verfahren an den Träger bindet und die erhaltenen Enzympräparate isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst Träger;. die sich in ihrem häufigsten Porendurchmesser unterscheiden, mit Enzymlösungen, die sich in ihrer Enzymkonzentration unterscheiden, in Berührung bringt, das Enzym an die Träger bindet, die Enzympräparate isoliert, deren Aktivität bestimmt und von den benutzten unterschiedlichen Trägern den Träger mit demjenigen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge das Präparat mit der höchsten Aktivität ergeben hat, und dann den ausgewählten Träger mit Enzymlösungen, die sich in ihrem Enzymgehalt unterscheiden, in Berührung bringt, das Enzym an den Träger bindet, die Enzympräparate isoliert, deren Aktivität und spezifische Aktivität bestimmt und von den benutzten unterschiedlichen Enzymlösungen diejenige auswählt, die das Präparat mit der höchsten Aktivität und einer spezifischen Aktivität nahe oder gleich der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand ergeben hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger aus einem Si02-Gel auswählt, das nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na20, auf 0,1 bis 0,5 Gew.-% und Trocknung 5-10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 400°C bis 850°C, vorzugsweise 570°C bis 750°C, geglüht ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180°C bis 200°C erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Glühen in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme Amyloglucosidase verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer Amyloglucosidase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 10 bis 15 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enhält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Glucoseisomerase verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer Glucoseisomerase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 50 bis 70 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20 bis 50 mg, vorzugsweise 25 mg, Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.
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