DE69938293T2 - Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose - Google Patents

Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte und gereinigte Nucleinsäuren und codierte Proteine aus der Gattung Gaussia. Genauer werden Nucleinsäuren bereitgestellt, die die Luciferase und die fluoreszierenden Proteine von Arten dieser Gattung codieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Lumineszenz ist ein Phänomen, bei dem Energie spezifisch in ein Molekül eingeschleust wird, um einen angeregten Zustand zu erzeugen. Die Rückkehr in einen niedrigeren Energiezustand wird von der Freisetzung eines Photons (hv) begleitet. Die Lumineszenz schließt die Fluoreszenz, die Phosphoreszenz, die Chemilumineszenz und die Biolumineszenz ein. Biolumineszenz ist der Vorgang, durch den lebende Organismen Licht emittieren, das für andere Organismen sichtbar ist. Die Lumineszenz kann folgendermaßen dargestellt werden: A + B → X. + Y X. → X + hv, worin X. ein elektronisch angeregtes Molekül ist und hv die Lichtemission bei der Rückkehr von X. in einen niedrigeren Energiezustand darstellt. Wenn die Lumineszenz eine Biolumineszenz ist, stammt die Erzeugung des angeregten Zustands von einer enzymkatalysierten Reaktion. Die Farbe des in einer Biolumineszenzreaktion (oder Chemilumineszenz- oder sonstigen Lumineszenzreaktion) emittierten Lichts ist für das angeregte Molekül charakteristisch und unabhängig von der Anregungsquelle und der Temperatur.
  • Eine wesentliche Bedingung für Biolumineszenz ist die Verwendung von molekularem Sauerstoff, entweder gebunden oder frei in Gegenwart einer Luciferase. Luciferasen sind Oxygenasen, die auf ein Substrat, Luciferin, in Gegenwart von molekularem Sauerstoff einwirken und das Substrat in einen angeregten Zustand überführen. Bei der Rückkehr auf ein niedrigeres Energieniveau wird Energie in Form von Licht freigesetzt (für Überblicksartikel siehe z. B. McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in Cell Physiology, Hayashi et al., Hrsg., Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, S. 63–80; Ward et al., Kapitel 7 in Chemi- and Bioluminescence, Burr, Hrsg., Marcel Dekker, Inc. NY, S. 321–358; Hastings, J. W. in (1995) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis (Hrsg.), Academic Press, S. 665–681; Luminescence, Narcosis and Life in the Deep Sea, Johnson, Vantage Press, NY, siehe bes. S. 50–56).
  • Obwohl insgesamt selten, ist die Biolumineszenz in Meeresorganismen üblicher als in Erdorganismen. Die Biolumineszenz hat sich von nicht weniger als dreißig evolutionär verschiedenen Ursprüngen aus entwickelt und zeigt sich demnach in einer Vielzahl von Wegen, weshalb die biochemischen und physiologischen Mechanismen, die für die Biolumineszenz verantwortlich sind, in verschiedenen Organismen verschieden sind. Biolumineszierende Arten erstrecken sich über viele Gattungen und schließen mikroskopische Organismen, wie Bakterien (primär Meeresbakterien einschließlich Vibrio-Arten), Pilze, Algen und Dinoflagellaten, Meeresorganismen, einschließlich Arthropoden, Mollusken, Echinodermata und Chordatiere und Erdorganismen, einschließlich Ringelwürmer und Insekten, ein.
  • Assays unter Einsatz der Biolumineszenz
  • Im Laufe der letzten zwanzig Jahre haben hochempfindliche biochemische Assays, die in der Forschung und in der Medizin verwendet werden, zunehmend die Lumineszenz und die Fluoreszenz anstelle von Radioisotopen eingesetzt. Dieser Wandel wurde teilweise durch die steigenden Kosten für die Entsorgung der Radioisotope und teilweise durch den Bedarf an der Entwicklung schnellerer und bequemerer Assayverfahren angetrieben. In letzter Zeit hat der Bedarf an der Durchführung biochemischer Assays in situ in lebenden Zellen und in unversehrten Tieren die Forscher in Richtung Lumineszenz und Fluoreszenz auf Proteinbasis gelenkt. Die Verwendung der Leuchtkäfer-Luciferase für ATP-Assays, von Aequorin und Obelin als Calcium-Reporter, Vargula-Luciferase als neurophysiologischer Indikator und des grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea als Protein-Tracer und pH-Indikator zeigen das Potential der Verfahren auf Biolumineszenzbasis in den Forschungslabors.
  • Die Biolumineszenz fängt auch an, einen direkten Einfluss auf die Medizin und die Biotechnologie zu haben; beispielsweise wird das Aequorea-GFP für die Markierung von Zellen in murinen Modellsystemen und als Reporter bei der Durchmusterung von Arzneimitteln mit hohem Durchsatz eingesetzt. Die Renilla-Luciferase befindet sich in der Entwicklung für die Verwendung in diagnostischen Programmen.
  • Biolumineszenz-erzeugende Systeme
  • Die Biolumineszenz wird wie andere Typen der Chemilumineszenz für die quantitative Bestimmung bestimmter Substanzen in der Biologie und der Medizin verwendet. Beispielsweise sind Luciferase-Gene kloniert und als Reportergene in zahlreichen Assays für vielfältige Zwecke verwendet worden. Da die verschiedenen Luciferase-Systeme verschiedene spezielle Anforderungen stellen, können sie verwendet werden, um eine Vielzahl von Substanzen nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Mehrheit der kommerziellen Biolumineszenzan wendungen basieren auf der Leuchtkäfer-Luciferase (Photinus pyralis). Einer der ersten und immer noch weit verbreitet verwendeten Assays schließt die Verwendung der Leuchtkäfer-Luciferase für den Nachweis des Vorhandenseins von ATP ein. Er wird auch für den Nachweis und die Quantifizierung anderer Substrate oder Cofaktoren in der Reaktion verwendet. Jede beliebige Reaktion, die NAD(H), NADP(H) oder ein langkettiges Aldehyd entweder direkt oder indirekt erzeugt oder verwendet, kann an die lichtemittierende Reaktion einer bakteriellen Luciferase gekoppelt werden.
  • Ein anderes Luciferase-System, das kommerziell für analytische Zwecke verwendet worden ist, ist das Aequorin-System. Das gereinigte Photoprotein Aequorin der Qualle wird verwendet, um intrazelluläres Ca2+ und seine Veränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen nachzuweisen und zu quantifizieren. Das Aequorin-Photoprotein ist relativ klein [~20 kDa], nicht toxisch und kann in Zellen in Mengen injiziert werden, die für den Nachweis von Calcium über einen großen Konzentrationsbereich (3 × 10–7 bis 10–4 M) geeignet sind.
  • Wegen ihrer analytischen Brauchbarkeit sind Luciferasen und Substrate untersucht und gut charakterisiert worden und im Handel erhältlich (z. B. ist Leuchtkäfer-Luciferase von Sigma, St. Louis, MO, und Boehringer Mannheim, Biochemicals, Indianapolis; IN erhältlich; rekombinant erzeugte Leuchtkäfer-Luciferase und andere Reagenzien auf der Basis dieses Gens oder zur Verwendung mit diesem Protein sind von Promega Corporation, Madison, WI, erhältlich; die Aequorin-Photoprotein-Luciferase der Qualle und die Luciferase von Renilla sind im Handel von Sealite Sciences, Bogart, GA, erhältlich; Coelenterazin, das natürlich vorkommende Substrat für diese Luciferasen, ist von Molecular Probes, Eugene, OR erhältlich). Diese Luciferasen und ähnliche Reagenzien werden als Reagenzien für die Diagnostik, die Qualitätskontrolle, Umweltuntersuchungen und andere derartige Analysen verwendet.
  • Wegen der Brauchbarkeit der Luciferasen als Reagenzien in analytischen Systemen und wegen ihres Potenzials für die Verwendung in Durchmusterungssystemen mit hohem Durchsatz gibt es einen Bedarf an dem Nachweis und der Isolierung einer Vielzahl von Luciferasen, die verbesserte oder andere spektrale Eigenschaften haben, verglichen mit denjenigen, die derzeit verfügbar sind. Aus all diesen Gründen wäre es vorteilhaft, Luciferasen von einer Vielzahl von Arten, wie von Gaussia und von verschiedenen Renilla-Arten zur Verfügung zu haben.
  • Fluoreszierende Proteine
  • Reportergene liefern, wenn sie mit einem interessierenden Gen in Empfängerzellen cotransfiziert werden, ein Mittel für den Nachweis der Transfektion und anderer Ereignisse. Zu den Reportergenen gehören die Gene, die fluoreszierende Proteine codieren. Die Biolumineszenz-erzeugenden Systeme, die hier beschrieben werden, gehören zu denjenigen, die als Reportergene verwendet werden. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit wurden Biolumineszenz-erzeugende Systeme mit fluoreszierenden Verbindungen und Proteinen, wie natürlich fluoreszierenden Phycobili-Proteinen, kombiniert. Ebenfalls interessant sind die fluoreszierenden Proteine, die in einer Vielzahl von wirbellosen Meerestieren vorkommen, wie die grün und blau fluoreszierenden Proteine, vor allem das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Aequorea victoria.
  • Die grün fluoreszierenden Proteine (GFP) bilden eine Klasse von Chromoproteinen, die nur bei bestimmten biolumineszierenden Hohltieren (Coelenterata) gefunden werden. Diese akzessorischen Proteine fluoreszieren und haben in diesen Organismen die Funktion des Moleküls, das schlussendlich die Biolumineszenz emittiert, indem sie Energie vom enzymgebundenen Oxyluciferin im angeregten Zustand aufnehmen (siehe z. B. Ward et al. (1979) J. Biol. Chem. 254: 781–788; Ward et al. (1978) Photochem. Photobiol. 27: 389–396; Ward et al. (1982) Biochemistry 21: 4535–4540).
  • Die am besten charakterisierten GFPs sind diejenigen, die von den Quallenarten Aequorea isoliert werden, vor allem von Aequorea victoria (A. victoria) und Aequorea forskålea (Ward et al. 1982) Biochemistry 21: 4535–4540; Prendergast et al. (1978) Biochemistry 17: 3448–3453). Gereinigtes A. victoria-GFP ist ein monomeres Protein von etwa 27 kDa, das blaues Licht mit einem Maximum der Anregungswellenlänge bei 395 nm mit einem kleineren Peak bei 470 nm absorbiert und grüne Fluoreszenz mit einer Emissionswellenlänge von etwa 510 nm und einem kleineren Peak nahe 540 nm emittiert (Ward et al. (1979) Photochem. Photobiol. Rev 4: 1–57). Dieses GFP hat bestimmte Einschränkungen. Das Anregungsmaximum des Wildtyp-GFPs liegt nicht innerhalb des Wellenlängenbereichs von Standard-Fluorescein-Nachweisoptiken.
  • Für den Nachweis der grünen Fluoreszenz werden keine exogenen Substrate oder Cofaktoren benötigt. Stattdessen resultiert das hohe Niveau der Fluoreszenz von dem intrinsischen Chromophor des Proteins. Der Chromophor schließt modifizierte Aminosäurereste innerhalb der Polypeptidkette ein. Der fluoreszierende Chromophor des GFPs von A. victoria-GFP wird beispielsweise durch die Hexapeptidsequenz FSYGVQ codiert, die die Aminosäurereste 64–69 umfasst. Der Chromophor wird durch die intrazelluläre Cyclisierung des Polypeptidrückgrats bei den Resten Ser65 und Gly67 und die Oxidation der α,β-Bindung des Restes Tyr66 gebildet (siehe z. B. Cody et al. (1993) Biochemistry 32: 1212–1218; Shimomura (1978) FEBS Letters 104: 220–222; Ward et al. (1989) Photochem. Photobiol. 49: 62S). Das Emissionsspektrum des isolierten Chromophors und des denaturieren Proteins bei neutralem pH stimmen nicht mit dem Spektrum des nativen Proteins überein, was darauf hindeutet, dass die Chromophorbildung nach der Translation stattfindet (siehe z. B. Cody et al. (1993) Biochemistry 32: 1212–1218).
  • Zusätzlich ist die Kristallstruktur von gereinigtem A. victoria-GFP bestimmt worden (siehe z. B. Ormö (1996) Science 273: 1392–1395). Das vorherrschende Strukturmerkmal des Proteins ist eine 11-strängige β-Can (β-Barrel), die einen nahezu perfekten Zylinder bildet, der eine einzelne zentrale α-Helix einhüllt, die den modifizierte p-Hydroxybenzylidenimadaxolidinon-Chromophor enthält. Der Chromophor ist zentral innerhalb der β-Can-Struktur angeordnet und wird vollständig vor einem Kontakt mit dem Volumenlösemittel abgeschirmt.
  • Eine DNA, die einen Isotyp des A. victoria-GFPs codiert, ist isoliert worden, und ihre Nucleotidsequenz ist bestimmt worden (siehe z. B. Prasher (1992) Gene 111: 229–233). Die cDNA von A. victoria enthält einen offenen Leserahmen aus 714 Nucleotiden, der ein Polypeptid aus 238 Aminosäuren mit einem berechneten Mr von 26888 Da codiert. Rekombinant exprimierte A. victoria-GFPs behalten ihre Fähigkeit zu fluoreszieren in vivo in einer großen Vielzahl von Organismen, eingeschlossen Bakterien (siehe z. B. Chalfie et al. (1994) Science 263: 802–805; Miller et al. (1997) Gene 191: 149–153), Hefe und Pilze (Fey et al. (1995) Gene 165: 127–130; Straight et al. (1996) Curr. Biol. 6: 1599–1608; Cormack et al. (1997) Microbiology 143: 303–311), Drosophila (siehe z. B. Wang et al. (1994) Nature 369: 400–403; Plautz (1996) Gene 173: 83–87), Pflanzen (Heinlein et al. (1995); Casper et al. (1996) Gene 173: 69–73), Fische (Amsterdam et al. (1995)), und Säugetiere (Ikawa et al. 1995). Aequorea-GFP-Vektoren und isolierte Aequorea-GFP-Proteine sind als Marker für die Messung der Genexpres sion, der Zellwanderung und -Lokalisierung, der Bildung von Mikrotubuli und des Aufbaus funktionsfähiger Innenkanäle verwendet worden (siehe z. B. Terry et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 217: 21–27; Kain et al. (1995) Biotechniques 19: 650–655). Das A. victoria-GFP ist jedoch nicht ideal für die Verwendung in analytischen und diagnostischen Verfahren. Folglich sind GFP-Mutanten in der Hoffnung ausgewählt worden, dass Mutanten identifiziert werden, die einen einzelne spektrale Anregungspeaks aufweisen, der rotverschoben ist.
  • Tatsächlich bestand ein dargelegter Zweck bei der Konstruktion derartiger Mutanten darin, zu versuchen, das A. victoria-GFP ähnlicher dem GFP von Renilla zu machen, das bislang nicht kloniert wurde, das aber Eigenschaften aufweist, die es wesentlich idealer für die Verwendung als analytisches Werkzeug machen. Bei vielen praktischen Anwendungen wäre das Spektrum des Renilla-GFP dem Spektrum des Aequorea-GFPs gegenüber bevorzugt, weil die Wellenlängenunterscheidung zwischen verschiedenen Fluorophoren und der Nachweis des Resonanzenergietransfers einfacher sind, wenn die Komponentenspektren hoch und schmal und nicht niedrig und breit sind (siehe U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ). Weiterhin ist der langwelligere Anregungspeak (475 nm) des Renilla-GFPs nahezu ideal für Fluorescein-Filtersätze, und er ist widerstandsfähig gegenüber einem Photobleichen, hat aber eine geringere Amplitude als der kurzwelligere Peak bei 395 nm, der mehr zu einem Photobleichen neigt (Chalfie et al. (1994) Science 263: 802–805).
  • Es gibt ein phylogenetisch mannigfaltiges und weitgehend unerforschtes Repertoire an biolumineszierenden Proteinen, die ein Reservoir für die zukünftige Entwicklung darstellen. Viele von ihnen, wie die Nucleinsäuren, die Renilla-GFPs codieren, haben dies jedoch nicht, trotz konzentrierter Bemühungen, so zu tun.
  • Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, eine Vielzahl neuer Luciferasen und fluoreszierender Proteine, vor allem Renilla-GFP, zur Verfügung zu haben, statt mutierte Proteine von A. victoria-GFP zu verwenden. Es ist noch nicht möglich gewesen, das Gen zu klonieren, das ein beliebiges der Renilla-GFPs codiert. Es wäre auch wünschenswert, eine Vielzahl von GFPs und Luciferasen zur Verfügung zu haben, um die Systeme für spezielle Anwendungen zu optimieren und um existierende Verfahren zu verbessern. Es ist hier daher eine Aufgabe, isolierte Nucleinsäuren, die bislang nicht verfügbare Luciferasen codieren, und das dadurch codierte Protein bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe, Biolumineszenz-erzeugende Systeme bereitzustellen, die die Luciferasen, Luciferine einschließen und die auch GFPs einschließen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Isolierte Nucleinsäuren, die Luciferasen codieren, werden bereitgestellt.
  • Nucleinsäuremoleküle, die die Luciferase einer Gaussia-Art codieren, werden bereitgestellt. Nucleinsäuresonden, die davon abgeleitet werden, werden ebenfalls bereitgestellt. Funktionell äquivalente Nucleinsäuren, wie diejenigen, die unter hohen Stringenzbedingungen mit den offenbarten Molekülen hybridisieren, werden ebenfalls betrachtet.
  • Bereitgestellt werden Wirtszellen, eingeschlossen bakterielle Wirtszellen, Hefe- und Säugetierwirtszellen, und Plasmide für die Expression der Nucleinsäuren, die die Luciferase codieren und Kombinationen der Luciferase und von GFPs, werden ebenfalls in diesen Wirten bereitgestellt. Die Gene können durch die Substitution von Codons, die für die Expression in ausgewählten Wirtszellen oder Wirten, wie Menschen und anderen Säugetieren, optimiert sind, modifiziert werden, oder sie können einer Mutagenese unterzogen werden, um die Emissionseigenschaften zu verändern.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass die Gaussia-Luciferase Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, während die Renilla mulleri-Luciferase und die Pleuromamma-Luciferase sowie das Renilla-GFP und das Ptilosarcus-GFP nur als Vergleichsbeispiele offenbart werden.
  • Luciferasen
  • Isolierte Nucleinsäuren, die Luciferasen von Gaussia codieren, werden hier bereitgestellt. Es werden vor allem Nucleinsäurefragmente, die die Gaussia princeps-Luciferase codieren, und Nucleinsäuresonden, die davon abgeleitet sind, bereitgestellt. In einer besonderen Ausführungsform wird die Luciferase durch die Nucleotidsequenz codiert, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird. Weiterhin werden Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die unter mittlerer oder hoher Stringenz mit der Nucleotidsequenz hybridisieren, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird, vor allem wenn die Sonden verwendet werden, die hier bereitgestellt werden. Sonden, die von dieser Nucleinsäure abgeleitet werden, die in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um Luciferasen aus beliebigen Gaussia-Arten zu isolieren, werden beschrieben. In einer beispielhaften Ausführungsform wird die Nucleinsäure, die die Luciferase von Gaussia princeps codiert, bereitgestellt. Diese Nucleinsäure codiert die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird.
  • Expressionsvektoren, die DNA enthalten, die eine Gaussia-Luciferase codiert, die in funktionsfähiger Kombination mit einem Promotorelement verbunden ist, das die konstitutive oder induzierbare Expressi on der Luciferase ermöglicht, werden bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Vektoren imstande, die Renilla mulleri-Luciferase in einer großen Vielzahl von Wirtszellen zu exprimieren. Vektoren für die Erzeugung chimärer Renilla mulleri-Luciferase-Fusionsproteine, vorzugsweise chimärer Antikörper-Luciferase- oder Acetylcholinesterase-Fusionsproteine, die ein Promotorelement und eine multiple Klonierungsstelle enthalten, die stromaufwärts oder stromabwärts der DNA, die die Renilla mulleri-Luciferase codiert, angeordnet ist, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Rekombinante Zellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die eine Gaussia-Luciferase codiert, werden ebenfalls bereitgestellt. Gereinigte Gaussia-Luciferasen und Zusammensetzungen, die eine Gaussia-Luciferase allein oder in Kombination mit anderen Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, wie einem grün fluoreszierenden Protein von Renilla, enthalten, werden bereitgestellt. Die Gaussia-Luciferase kann beispielsweise verwendet werden, um für die Fluoreszenzbeleuchtung von eine Novität darstellenden Gegenständen oder Artikeln (im Folgenden kurz "Novitäten") zu sorgen, oder sie kann in Verfahren zum Nachweisen und Sichtbarmachen von neoplastischem Gewebe und anderer Gewebe, für den Nachweis infektiöser Stoffe unter Verwendung von Immunoassays, wie homogener Immunoassays und in vitro-Durchmusterungsassays auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung von Multivertiefungen-Assayvorrichtungen, verwendet werden; oder sie kann in Kits für die Durchführung all dieser beschriebenen Verfahren bereitgestellt werden. Die Gaussia-Luciferase kann vor allem in Verbindung mit geeigneten fluoreszierenden Proteinen in Assays verwendet werden, die hier bereitgestellt werden.
  • Verfahren, die die Sonden für die Isolierung und die Klonierung von Luciferase-codierender DNA in Gaussia verwenden, werden ebenfalls bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Nucleinsäuresonden entartete Sonden aus mindestens 14 Nucleotiden, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotiden, die auf den Aminosäuren basieren, die in SEQ ID NO: 19 offenbart werden.
  • Vektoren, die DNA enthalten, die eine Gaussia-Luciferase codiert, werden bereitgestellt. Es werden vor allem Expressionsvektoren bereitgestellt, die DNA enthalten, die die Luciferase codiert und die in funktionsfähiger Kombination mit einem Promotorelement verbunden ist, das die konstitutive oder induzierbare Expression der Luciferase ermöglicht. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Vektoren imstande, die Luciferase in einer großen Vielfalt von Wirtszellen zu exprimieren. Vektoren für die Erzeugung von chimären Luciferase-Fusionsproteinen (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,464,745 , das die Verwendung von proteinbindenden Domänen beschreibt; siehe SEQ ID NO: 21 und 22, die die Sequenzen eines Fusionsproteins aus einer Cellulose-Bindungsdomäne und Luciferase offenbaren; und die in den 1 und 2 dargestellt sind), die ein Promotorelement und eine multiple Klonierungsstelle, die stromaufwärts oder stromabwärts der DNA angeordnet ist, die die Gaussia-Luciferase codiert, werden ebenfalls bereitgestellt. In einer besonderen Ausführungsform ist die DNA, die die Luciferase codiert, mit DNA, die den N-teminalen Teilbereich der Cellulose-Bindungsdomäne codiert (CBDclos; siehe SEQ ID NO: 21 und 22) in einem PET-Vektor verbunden (Novagen; siehe U.S.-Patente Nr. 5,719,044 und 5,738,984 , 5,670,623 und 5,496,934 und den Novagen-Katalog; vollständige Sequenzen von jedem PET-Vektor werden mit dem Kauf des Vektors bereitgestellt).
  • Fusionen der Nucleinsäure, vor allem von DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert, mit DNA, die ein GFP oder ein Phycobili-Protein codiert, werden hier ebenfalls bereitgestellt. In diesen Fusionen kann die die Luciferase und das GFP codierende DNA zusammenhängend sein oder durch ein Abstandshalterpeptid getrennt sein. Die Fusionen werden verwendet, um Fusionsproteine herzustellen, die auf Grund der Wechselwirkung in dem von der Luciferase und dem GFP gebildeten Paar eine Vielzahl von einzigartigen analytischen Anwendungen haben. Die Wechselwirkung wird durch das Emissionsspektrum des Luciferase-GFP-Proteinpaares in Gegenwart eines Luciferins und geeigneter Bindungsfaktoren beurteilt.
  • Rekombinante Wirtszellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die eine Gaussia-Luciferase codiert, werden bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen werden die rekombinanten Zellen, die die heterologe DNA enthalten, die die Luciferase codiert, durch die Transfektion mit DNA, die eine Luciferase codiert, oder durch das Einschleusen von RNA-Transkripten von DNA, die das Protein codiert, erzeugt. Die DNA kann als ein lineares DNA-Fragment eingeführt werden, oder sie kann in einen Expressionsvektor für die stabile oder transiente Expression der codierenden DNA eingeschlossen werden.
  • Die Zellen, die eine funktionsfähige Luciferase exprimieren, können allein oder in Verbindung mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System in Assays auf Zellbasis und in Durchmusterungsverfahren verwendet werden, wie denjenigen, die hier beschrieben werden. Derzeit bevorzugte Wirtszellen für die Expression der Luciferase sind Bakterien, Hefen, Pilze, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen.
  • Gereinigte Gaussia-Luciferase wird bereitgestellt. Diese Luciferase wird vorzugsweise durch die Expression der Nucleinsäure, die hier bereitgestellt wird, in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die die Nucleinsäure enthalten, die das Luciferaseprotein codiert, und das Isolieren des exprimierten Proteins erhalten.
  • Zusammensetzungen, die die Luciferase enthalten, werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen können eine beliebige Form aus einer Anzahl von Formen in Abhängigkeit von dem Verfahren, das für deren Anwendung beabsichtigt ist, einnehmen. In bestimmten Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen zum Beispiel eine Gaussia-Luciferase, ein Gaussia-Luciferase-Peptid oder ein Gaussia-Luciferase-Fusionsprotein, die/das für die Verwendung in lumineszierenden Novitäten, in Immunoassays, Donoren in FET-Assays (Fluoreszenz-Energie-Transfer), FRET-Assays (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), HTRF-Assays (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) oder in Verbindung mit Multivertiefungen-Assayvorrichtungen, die integrierte Photodetektoren enthalten, wie denjenigen, die hier beschrieben werden, formuliert ist.
  • In bevorzugteren Ausführungsformen schließt das Biolumineszenz-erzeugende System zusätzlich zu der Luciferase ein Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFP ein. Diese Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Verfahren und Systemen, wie in Verbindung mit diagnostischen Systemen für den in vivo-Nachweis von neoplastischen Geweben und anderer Gewebe, wie in denjenigen Verfahren, die hier beschrieben werden, verwendet werden.
  • Kombinationen, die eine erste Zusammensetzung, die eine Luciferase enthält, und eine zweite Zusammensetzung umfassen, die einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält, zur Verwendung mit Herstellungsgegenständen, um Novitäten zu erzeugen, werden bereitgestellt. Diese Novitäten werden für die Unterhaltung, die Freizeit und den Zeitvertreib gestaltet und schließen nicht einschränkend ein: Spielzeuge vor allem Wasserspritzpistolen, Spielzeugzigaretten, Spielzeug-"Halloween"-Eier, Jonglierbälle vom Typ "Footbag" und Brettspiele/Kartenspiele; Fingerfarben und andere Farben, Spielzeuge aus glibberigen Materialien; Tex tilien, vor allem Kleidung, wie Hemden, Hüte und Sportbekleidungsanzüge, Zwirne und Garne; Luftblasen in blasenerzeugenden Spielzeugen und anderen Spielzeugen, die Blasen erzeugen; Ballons; Figürchen; Artikel für den persönlichen Gebrauch, wie Kosmetika, Badepulver, Körperlotionen, Gele, Puder und Cremes, Nagelpolituren, Make-up, Zahnpasten und andere Zahnputzmittel, Seifen, Körperfarben und Schaumbäder; Artikel wie Tinten, Papier; Nahrungsmittel, wie Gelatinen, Kuchenglasuren und Zuckerguss; Fischfutter, das Luciferine enthält, und transgene Fische, vor allem transgene Fische, die eine Luciferase exprimieren; Pflanzennahrung, die ein Luciferin oder eine Luciferase enthält, vorzugsweise ein Luciferin zur Verwendung mit transgenen Pflanzen, die Luciferase exprimieren; und Getränke, wie Bier, Wein, Sekt, Erfrischungsgetränke und Eiswürfel sowie Eis in anderen Gestaltungen; Springbrunnen, eingeschlossen flüssiges "Feuerwerk", und andere, wie Strahlen oder Sprühnebel oder Aerosole von Zusammensetzungen, die Lösungen, Gemische, Suspensionen, Puder, Pasten, Partikel oder andere geeignete Formen sind.
  • Jeder Herstellungsgegenstand, der mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System kombiniert werden kann, wie es hier bereitgestellt wird, und der so für die Unterhaltung, die Freizeitgestaltung und/oder den Zeitvertreib sorgen kann, eingeschlossen die Verwendung der Gegenstände für die Freizeitgestaltung und das Erregen von Aufmerksamkeit, wie zum Bewerben von Waren und/oder Dienstleistungen, was mit einem Logo oder einer Marke zusammenhängt, wird hier ins Auge gefasst. Derartige Verwendungen können ein Zusatz zur oder in Verbindung mit der oder anstelle der gewöhnlichen oder normalen Verwendung derartiger Gegenstände sein. Als Ergebnis der Kombination leuchten die Gegenstände oder erzeugen, wie im Fall von Wasserspritzpistolen und Springbrunnen, eine leuchtende Flüssigkeit oder einen leuchtenden Sprühnebel einer Flüssigkeit oder von Partikeln. Die Neuheit der Novität ergibt sich aus seiner Biolumineszenz.
  • GFPs
  • Isolierte Nucleinsäuren, die GFPs von Renilla codieren, werden hier beschrieben. Weiterhin werden isolierte und gereinigte Nucleinsäuren, die eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems und ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) einer Art aus der Gattung Renilla codieren, und die dadurch codierten Proteine beschrieben. Es werden vor allem Nucleinsäurefragmente, die die grün fluoreszierenden Proteine (GFPs) von Renilla und die Renilla mulleri-Luciferase codieren, und die davon abgeleiteten Nucleinsäuresonden beschrieben.
  • Nucleinsäuremoleküle, die ein Renilla-GFP codieren, werden beschrieben. Es werden vor allem Nucleinsäuremoleküle, die ein Renilla-GFP codieren, die den codierenden Teil der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 15 offenbart wird, einschließen oder die unter mäßigen oder hohen Stringenzbedingungen mit der Nucleotidsequenz hybridisieren, die in SEQ ID NO: 15 offenbart wird, vor allem wenn Sonden verwendet werden, die hier bereitgestellt werden, beschrieben. Sonden, die von dieser Nucleinsäure abgeleitet werden, können in hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um GFPs von beliebigen Renilla-Arten zu isolieren. Eine Nucleinsäure, die das Renilla mulleri-GFP codiert, wird beschrieben. Diese Nucleinsäure codiert die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 16 offenbart wird.
  • Nucleinsäuresonden können markiert werden, die erforderlichenfalls für den Nachweis mindestens etwa 14, vorzugsweise mindestens etwa 16 oder gewünschtenfalls 20 oder 30 oder mehr zusammenhängende Nucleotide einer Nucleotidsequenz enthalten, die ein Renilla-GFP, vor allem das Renilla mulleri-GFP, codiert. Die Nucleinsäuresonden für das Renilla-GFP werden vorzugsweise aus der Nucleotidsequenz ausgewählt, die in SEQ ID NO: 15 offenbart wird.
  • Verfahren unter Verwendung der Sonden für die Isolierung und Klonierung der GFP-codierenden DNA in Renilla und anderen Arten werden ebenfalls beschrieben. Die Nucleinsäuresonden sind vorzugsweise entartete Sonden, die auf den Regionen des GFPs basieren, die unter den Renilla-Arten konserviert sind, wie sie in 3 offenbart werden. Derartige entartete Sonden enthalten mindestens 14 Nucleotide, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotide, die auf den Aminosäuren 51 bis 68, 82 bis 98 und 198 bis 208, die in SEQ ID NO: 16 offenbart werden, der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 24 offenbart wird, den Aminosäuren 9–20, die in SEQ ID NO: 25 offenbart werden, und den Aminosäuren 39–53, die in SEQ ID NO: 27 offenbart werden, basieren. Die Nucleinsäuresonden, die die oben beschriebenen bevorzugten Aminosäureregionen codieren, werden vorzugsweise unter den Nucleotidsequenzen ausgewählt, die diese Regionen codieren, wie in SEQ ID NO: 15 offenbart. Alternativ können Nucleinsäuren, vor allem diejenigen, die in SEQ ID NO: 15 offenbart werden, die die angegebenen Regionen codieren, als Primer für die PCR-Amplifikation der Genbanken einer ausgewählten Renilla-Art verwendet werden, wodurch DNA, die ein Renilla-GFP codiert, isoliert wird.
  • Nucleinsäuren, die ein Ptilosarcus-GFP codieren, werden in den SEQ ID NO: 30 und 31 offenbart; das codierte GFP wird in SEQ ID NO: 32 offenbart. Weiterhin werden Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die unter mäßiger oder hoher Stringenz mit den Nucleotidsequenzen hybridisieren, die in den SEQ ID NO: 28, 30 und 31 offenbart werden.
  • Vektoren, die eine DNA enthalten, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, werden beschrieben. Vor allem werden Expressionsvektoren, die eine DNA enthalten, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, die in funktionsfähiger Kombination mit einem Promotorelement verknüpft ist, das die konstitutive oder induzierbare Expression von Renilla- oder Ptilosarcus-GFP ermöglicht, beschrieben. Natives Renilla-GFP ist exprimiert worden.
  • Die Vektoren sind imstande, das Renilla-GFP in einer großen Vielzahl von Wirtszellen zu exprimieren. Vektoren für die Erzeugung chimärer Renilla-GFP-Fusionsproteine, die ein Promotorelement und eine multiple Klonierungsstelle enthalten, die stromaufwärts oder stromabwärts der DNA angeordnet ist, die das Renilla-GFP codiert, werden ebenfalls beschrieben.
  • Rekombinante Zellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die ein Ptilosarcus-GFP, ein Renilla-GFP, eine Renilla-mulleri-Luciferase, eine Gaussia-Luciferase oder eine Pleuromamma-Luciferase codiert, werden ebenfalls bereitgestellt. Gereinigtes Renilla mulleri-GFP-Peptid, Renilla reniformis-GFP-Peptid und Zusammensetzungen, die ein Renilla-GFP und GFP-Peptide allein oder in Kombination mit mindestens einer Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, wie einer Renilla mulleri-Luciferase, enthalten, werden beschrieben. Die Renilla-GFP- und GFP-Peptid-Zusammensetzungen können beispielsweise verwendet werden, um für eine fluoreszierende Beleuchtung von Novitäten zu sorgen, oder sie können in Verfahren für den Nachweis und das Sichtbarmachen eines neoplastischen Gewebes und anderer Gewebe, für den Nachweis infektiöser Substanzen unter Verwendung von Immunoassays, wie homogener Immunoassays, und bei den in vitro-Durchmusterungsverfahren auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung von Multivertiefungen-Assayvorrichtungen verwendet werden, oder sie können in Kits für die Durchführung jedes beliebi gen der oben beschriebenen Verfahren bereitgestellt werden. Diese Proteine können vor allem in FP-Assays (FP = Fluoreszenzpolarisation), FET-Assays (FET = Fluoreszenzenergietransfer), FRET-Assays (FREI = Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) und HTRF-Assays (HTRF = homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz) verwendet werden.
  • Nicht radioaktive Energietransferreaktionen, wie FET- oder FRET-, FP- und HTRF-Assays, sind homogene Lumineszenzassays, die auf einem Energietransfer basieren, der zwischen einem Donorlumineszenzmarker und einem Akzeptormarker stattfindet (siehe z. B. Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8790–8794; Peerce et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8092–8096; U.S.-Patent Nr. 4,777,128 ; U.S.-Patent Nr. 5,162,508 ; U.S.-Patent Nr. 4,927,923 ; U.S.-Patent Nr. 5,279,943 ; und Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 92/01225 ). Nicht radioaktive Energietransferreaktionen unter Verwendung von GFPs sind entwickelt worden (siehe Internationale PCT-Anmeldungen Nr. WO 98/02571 und WO 97/28261 ). Nicht radioaktive Energietransferreaktionen unter Verwendung von GFPs und Luciferasen, wie einer Luciferase und ihres verwandten GFPs (oder von Multimeren davon), wie in einem Fusionsprotein, werden hier ins Auge gefasst.
  • Nucleinsäuren, die eine beträchtliche Sequenzidentität mit den Nucleinsäuren zeigen, die hier bereitgestellt werden, werden ebenfalls ins Auge gefasst. Hierbei handelt es sich um Nucleinsäuren, die hergestellt werden können, indem Codons substituiert werden, die konservative Aminosäuren codieren, und um Nucleinsäuren, die mindestens etwa 80% und vorzugsweise 90 oder 95% Sequenzidentität zeigen. Die Sequenzidentität bezieht sich auf die Identität wie sie unter Verwendung von Standardprogrammen mit "Default-Gap-Penalties" und anderen "Default"-Werten, die von deren Herstellern bereitgestellt, ermittelt wird.
  • Die Nucleinsäuren bieten eine Möglichkeit für die Herstellung von Luciferasen und GFPs, die eine vorteilhafte Anwendung auf allen Gebieten haben, auf denen Luciferasen/Luciferine und GFPs eine Anwendung haben. Die Nucleinsäuren können verwendet werden, um GFPs und GFPs von anderen, vor allem von Renilla-Arten, unter Verwendung der Sonden, die hier beschrieben werden, die den konservierten Regionen entsprechen (siehe z. B. 3), zu erhalten und zu erzeugen. Diese GFPs haben vorteilhaften Anwendungen auf allen Gebieten, auf denen GFPs und/oder Luciferasen/Luciferine eine Anwendung haben. Die GFPs stellen beispielsweise ein Mittel dar, mit dem das Ausgabesignal von Biolumineszenz-erzeugenden Systemen verstärkt wird. Das Renilla-GFP hat einen einzigen Anregungsabsorptionspeak im Bereich von blauem Licht (und bei etwa 498 nm) und einen dominierenden einzigen Emissionspeak bei etwa 510 nm (mit einer schmalen Schulter nahe 540). Dieses Spektrum liefert ein Mittel für die Absorption von blauem Licht und dessen effiziente Umwandlung in grünes Licht. Dies führt zu einer Verstärkung des Ausgabewertes. Bei Verwendung in Verbindung mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System, das blaues Licht liefert, wie Aequorea oder Renilla oder Vargula (Cypridina), wird das Ausgabesignal bei jeder beliebigen Anwendung, eingeschlossen diagnostische Anwendungen, verstärkt. Zusätzlich kann dieses grüne Licht als ein Energiedonor in Assays auf Fluoreszenzbasis dienen, wie in Fluoreszenzpolarisations-Assays, FET-Assays (Fluoreszenzenergietransfer), FREI-Assays (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) und HTRF-Assays (homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz). Spezielle Assays, die hier als BRET-Assays bezeichnet werden (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer-Assays, in denen Energie von einer Biolumineszenzreaktion einer Luciferase auf ein fluoreszierendes Protein übertragen wird), werden beschrieben.
  • Nicht radioaktive Energietransferreaktionen, wie FET- oder FRET-, FP- und HTRF-Assays, sind homogene Lumineszenzassays, die auf einem Energietransfer basieren, der zwischen einem Donorlumineszenzmarker und einem Akzeptormarker stattfindet (siehe z. B. Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8790–8794; Peerce et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8092–8096; U.S.-Patent Nr. 4,777,128 ; U.S.-Patent Nr. 5,162,508 ; U.S.-Patent Nr. 4,927,923 ; U.S.-Patent Nr. 5,279,943 ; und Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 92/01225 ). Nicht strahlende Energietransferreaktionen unter Verwendung von GFPs sind entwickelt worden (siehe Internationale PCT-Anmeldungen Nr. WO 98/02571 und WO 97/28261 ).
  • Die Mutagenese der GFPs wird hier ins Auge gefasst, vor allem eine Mutagenese, die zu modifizierten GFPs führt, die eine rotverschobenes Anregungsspektrum und Emissionsspektrum haben. Die resultierenden Systeme haben einen höheren Ausgabewert, verglichen mit den nicht mutierten Formen. Diese GFPs können durch eine zufällige Mutagenese und die Auswahl auf GFPs mit veränderten Spektren oder durch die gezielte Mutagenese der Chromophorregion des GFPs ausgewählt werden.
  • Rekombinante Wirtszellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, werden ebenfalls beschrieben. Die rekombinanten Zellen, die die heterologe DNA enthalten, die das Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, werden durch die Transfektion mit DNA, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, oder durch das Einführen von RNA-Transkripten von DNA, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-Protein codiert, erzeugt. Die DNA kann als ein lineares DNA-Fragment eingeführt werden, oder sie kann in einen Expressionsvektor für die stabile oder transiente Expression der codierenden DNA eingeschlossen werden.
  • Die Zellen enthalten eine DNA oder RNA, die ein Renilla mulleri-GFP oder ein Ptilosarcus-GFP (vor allem von einer Art verschieden von P. gurneyi) codiert, und exprimieren auch das rekombinante Renilla mulleri-GFP oder Ptilosarcus-Polypeptid. Es ist bevorzugt, dass die Zellen so ausgewählt werden, dass sie funktionsfähige GFPs exprimieren, die die Fähigkeit zur Fluoreszenz behalten und die nicht toxisch für die Wirtszelle sind. Die Zellen können auch eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, vorzugsweise ein Photoprotein oder eine Luciferase, codiert. Die Nucleinsäure, die die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems codiert, kann aus den Arten von Aequorea, Vargula, Pleuromamma, Ptilosarcus oder Renilla isoliert werden. Die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems kann eine Renilla mulleri-Luciferase, die die Aminosäuresequenz einschließt, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird, oder die Pleuromamma-Luciferase, die in SEQ ID NO: 28 offenbart wird, oder die Gaussia-Luciferase, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird, sein.
  • Die hier beschriebenen GFPs können in Kombination mit jedem geeigneten Biolumineszenz-erzeugenden System verwendet werden, sie werden aber vorzugsweise in Kombination mit einer Renilla- oder Aequorea-, Pleuromamma- oder Gaussia-Luciferase verwendet.
  • Gereinigte Renilla-GFPs, vor allem Renilla mulleri-GFP und gereinigte Renilla reniformis-GFP-Peptide werden beschrieben. Derzeit bevorzugtes Renilla-GFP zur Verwendung in den Zusammensetzungen hier ist das Renilla mulleri-GFP, das die Aminosäuresequenz einschließt, die in SEQ ID NO: 16 offenbart wird. Derzeit bevorzugte Renilla reniformis-GFP-Peptide sind diejenigen, die die GFP-Peptide enthalten, die unter den Aminosäuresequenzen ausgewählt werden, die in den SEQ ID NO: 19–23 offenbart werden.
  • Das Renilla-GFP, die GFP-Peptide und die Luciferase können aus natürlichen Quellen oder aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle isoliert ist, die mit einer Nucleinsäure transfiziert sind, die das Renilla-GFP und/oder das Luciferase-Protein codiert.
  • Fusionen einer Nucleinsäure, vor allem einer DNA, die eine Renilla- oder Ptilosarcus-GFP codiert, mit einer DNA, die eine Luciferase codiert, werden hier ebenfalls beschrieben.
  • Die Zellen, die eine funktionsfähige Luciferase und/oder ein funktionsfähiges GFP exprimieren, können allein oder in Verbindung mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System in Assays auf Zellbasis und in Durchmusterungsverfahren, wie denjenigen, die hier beschrieben werden, verwendet werden.
  • Derzeit bevorzugte Wirtszellen für die Expression eines GFPs und einer Luciferase sind Bakterien, Hefen, Pilze, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen.
  • Die Luciferasen und GFPs oder die Zellen, die sie exprimieren, können auch in Verfahren zur Durchmusterung auf eine bakterielle Verunreinigung und in Verfahren zur Durchmusterung auf metallische verunreinigende Stoffe verwendet werden. Für die Durchmusterung auf eine bakterielle Verunreinigung werden Bakterienzellen, die die Luciferase und/oder das GFP exprimieren, in Autoklaven oder in andere Bereiche gegeben, in denen ein Test ins Auge gefasst wird. Nach der Behandlung oder Verwendung des Bereichs wird der Bereich auf das Vorhandensein von leuchtenden Bakterien getestet. Das Vorhandensein derartiger Bakterien ist ein Hinweis auf das Misslingen der vollständigen Beseitigung anderer Bakterien. Die Durchmusterung im Hinblick auf Schwermetalle und andere Umweltverunreinigungen kann ebenfalls mit Zellen durchgeführt werden, die die Nucleinsäu ren enthalten, die hier bereitgestellt werden, falls die Expression mit einem System verknüpft ist, das von dem speziellen Schwermetall oder der speziellen Verunreinigung abhängig ist.
  • Die hier bereitgestellten Systeme und Zellen können für Durchmusterungsprotokolle mit hohem Durchsatz, intrazelluläre Assays, medizinische diagnostische Assays, Umweltuntersuchungen, wie das Aufspüren von Bakterien in Wasserversorgungen, in Verbindung mit Enzymen für den Nachweis von Schwermetallen, in Sporen für das Prüfen von Autoklaven in Krankenhäuser, in Nahrungsmitteln und in industriellen Autoklaven verwendet werden. Nicht pathogene Bakterien, die die Systeme enthalten, können in Tierfutter eingebracht werden, um bakterielle Verunreinigungen in Tierprodukten und in Fleisch nachzuweisen.
  • Zusammensetzungen, die ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP enthalten, werden beschrieben. Die Zusammensetzungen können in Abhängigkeit von dem vorgesehenen Anwendungsverfahren eine beliebige Form aus einer Vielzahl von Formen einnehmen. Die Zusammensetzungen können beispielsweise ein Renilla-GFP oder ein GFP-Peptid enthalten, vorzugsweise das Renilla mulleri-GFP oder ein Renilla reniformis-GFP-Peptid, das für die Verwendung in leuchtenden bzw. lumineszierenden Novitäten, Immunoassays, FET-Assays (Fluoreszenzenergietransfer), FREI-Assays (Fluoreszenzresonanzenergietransfer), HTRF-Assays formuliert ist oder das in Verbindung mit Multivertiefungen-Assayvorrichtungen, die integrierte Photodetektoren enthalten, wie denjenigen, die hier beschrieben werden, verwendet wird. In anderen Fällen werden die GFPs in Getränken, Nahrungsmitteln oder Kosmetika verwendet.
  • Zusammensetzungen, die ein Renilla mulleri-GFP oder ein GFP-Peptid und mindestens eine Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugen den Systems, vorzugsweise eine Luciferase, ein Luciferin oder eine Luciferase und ein Luciferin, enthalten, werden beschrieben. Das Luciferase/Luciferin-Biolumineszenz-erzeugende System wird unter denjenigen Systemen ausgewählt, die isoliert werden aus: einem Insektensystem, einem Coelenterat-System, einem Ctenophor-System, einem bakteriellen System, einem Molluskensystem, einem Crustaceen-System, einem Fischsystem, einem Ringelwurm-System und einem Erdwurm-System. Biolumineszenz-erzeugende Systeme schließen diejenigen die, die aus Renilla, Aequorea und Vargula, Gaussia und Pleuromamma isoliert werden.
  • Kombinationen, die eine erste Zusammensetzung, die ein Renilla mulleri-GFP oder Ptilosarcus-GFP oder ein Gemisch davon enthält, und eine zweite Zusammensetzung, die ein Biolumineszenz-erzeugendes System enthält, umfassen, zur Verwendung mit unbelebten Herstellungsgegenständen zur Erzeugung von Novitäten werden beschrieben. Diese Novitäten, die Herstellungsgegenstände sind, werden für die Unterhaltung, die Freizeit und den Zeitvertreib gestaltet und schließen nicht einschränkend ein: Spielzeuge, vor allem Wasserspritzpistolen, Spielzeugzigaretten, Spielzeug-"Halloween"-Eier, Jonglierbälle vom Typ "Footbag" und Brettspiele/Kartenspiele; Fingerfarben und andere Farben, Spielzeuge aus glibberigen Materialien; Textilien, vor allem Kleidung, wie Hemden, Hüte und Sportbekleidungsanzüge, Zwirne und Garne; Luftblasen in blasenerzeugenden Spielzeugen und andere Spielzeuge, die Blasen erzeugen; Ballons; Figürchen; Artikel für den persönlichen Gebrauch, wie Badepulver, Körperlotionen, Gele, Puder und Cremes, Nagelpolituren, Kosmetika einschließlich Make-up, Zahnpasten und andere Zahnputzmittel, Seifen, Kosmetika, Körperfarben und Schaumbäder, Blasen, die aus Quellen erzeugt werden, bei denen es sich nicht um Tenside handelt, vor allem Proteinen, wie Albumin und andere nicht toxische Proteine; in Fischereiködern, vor allem vernetztem Polyacrylamid, das ein fluores zierendes Protein und/oder Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems erhält, die im Kontakt mit Wasser leuchten, Artikel wie Tinten, Papier; Nahrungsmittel, wie Gelatinen, Kuchenglasuren und Zuckerguss; Fischfutter, das Luciferine enthält und transgene Fische, vor allem transgene Fische, die eine Luciferase exprimieren; Pflanzennahrung, die ein Luciferin oder eine Luciferase enthält, vorzugsweise ein Luciferin zur Verwendung mit transgenen Pflanzen, die eine Luciferase exprimieren; und Getränke, wie Bier, Wein, Sekt, Erfrischungsgetränke und Eiswürfel sowie Eis in anderen Gestaltungen; Springbrunnen, eingeschlossen flüssiges "Feuerwerk", und andere, wie Strahlen oder Sprühnebel oder Aerosole von Zusammensetzungen, die Lösungen, Gemische, Suspensionen, Puder, Pasten, Partikel oder andere geeignete Formen sind.
  • Jeder Herstellungsgegenstand, der mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System kombiniert werden kann, wie es hier bereitgestellt wird, und der so für die Unterhaltung, die Freizeitgestaltung und/oder den Zeitvertreib sorgt, eingeschlossen die Verwendung der Gegenstände für die Freizeit oder das Erregen von Aufmerksamkeit, wie zum Bewerben von Waren und/oder Dienstleistungen, was mit einem Logo oder einer Marke zusammenhängt, wird hier ins Auge gefasst. Derartige Verwendungen können ein Zusatz zur oder in Verbindung mit der oder anstelle der gewöhnlichen oder normalen Verwendung derartiger Gegenstände sein. Als Ergebnis der Kombination leuchten die Gegenstände oder erzeugen, wie im Fall von Wasserspritzpistolen und Springbrunnen, eine leuchtende Flüssigkeit oder einen leuchtenden Sprühnebel einer Flüssigkeit oder von Partikeln.
  • Verfahren für die Diagnose und das Sichtbarmachen von Geweben in vivo oder in situ unter Verwendung der Zusammensetzungen, die ein Renilla-mulleri-GFP und/oder eine Renilla-mulleri-Luciferase oder andere der hier beschriebenen Luciferasen und/oder GFPs enthalten, werden beschrieben. Das Renilla-mulleri-GFP-Protein kann beispielsweise in Verbindung mit diagnostischen Systemen verwendet werden, die sich auf die Biolumineszenz für das Sichtbarmachen von Geweben in situ stützen. Die Systeme sind besonders nützlich für das Sichtbarmachen und den Nachweis von neoplastischem Gewebe und Spezialgewebe, wie im Laufe von nicht invasiven und invasiven Verfahren. Die Systeme schließen Zusammensetzungen ein, die Konjugate enthalten, die ein gewebespezifisches, vor allem tumorspezifisches Ansteuerungsmittel (= das "Targeting-Mittel" oder "targeting agent" oder "Mittel für die zielgerichtete Ansteuerung) enthalten, das mit einer ausgerichteten Substanz (= die "Targeted-Substanz" oder das "targeted agent" oder die "an ein Ziel adressierte Substanz"), einem Renilla-mulleri-GFP, einer Luciferase oder einem Luciferin, verknüpft ist. Die Systeme schließen auch eine zweite Zusammensetzung ein, die die übrigen Bestandteile für eine Biolumineszenz-erzeugende Reaktion und/oder das Renilla-mulleri-GFP enthält. Alle Komponenten, mit Ausnahme der Aktivatoren, die in situ bereitgestellt werden oder die in dem Körper oder Gewebe vorhanden sind, können in eine einzige Zusammensetzung eingeschlossen sein.
  • Verfahren für die Diagnose und das Sichtbarmachen von Geweben in vivo oder in situ unter Verwendung von Zusammensetzungen, die eine Gaussia-Luciferase enthalten, werden beschrieben. Die Gaussia-Luciferase oder das Gaussia-Luciferase-Peptid kann beispielsweise in Verbindung mit diagnostischen Systemen verwendet werden, die sich auf die Biolumineszenz zum in situ-Sichtbarmachen von Geweben stützen. Die Systeme sind besonders gut brauchbar für das Sichtbarmachen und den Nachweis eines neoplastischen Gewebes und von Spezialgewebe, wie während nicht invasiven und invasiven Verfahren. Die Systeme schließen Zusammensetzungen ein, die Konjugate enthalten, die ein gewebespezifisches, vor allem tumorspezifisches Ansteuerungsmittel enthalten, das mit einer ausgerichteten Sub stanz, einer Gaussia-Luciferase, einem GFP oder einem Luciferin, verknüpft ist. Die Systeme schließen auch eine zweite Zusammensetzung ein, die die übrigen Bestandteile für eine Biolumineszenz-erzeugende Reaktion und/oder die Gaussia-Luciferase enthält. In einigen Ausführungsformen sind alle Bestandteile, mit Ausnahme der Aktivatoren, die in situ bereitgestellt werden oder die in dem Körper oder Gewebe vorhanden sind, in eine einzige Zusammensetzung eingeschlossen.
  • Die diagnostischen Systeme schließen vor allem zwei Zusammensetzungen ein. Eine erste Zusammensetzung wird bereitgestellt, die Konjugate enthält, die in bevorzugten Ausführungsformen Antikörper enthalten, die gegen Tumorantigene gerichtet sind, die mit einer Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion, einer Luciferase oder einem Lucifern, vorzugsweise einer Luciferase, konjugiert sind. In bestimmten Ausführungsformen sind Konjugate, die tumorspezifische Ansteuerungsmittel enthalten, mit Luciferasen oder Luciferinen verknüpft. In anderen Ausführungsformen sind tumorspezifische Ansteuerungsmittel mit Mikroträgern verknüpft, die mit vorzugsweise mehr als einer der Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten, vorzugsweise mehr als einem Luciferase-Molekül, gekoppelt sind.
  • Die zweite Zusammensetzung enthält die übrigen Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, typischerweise das Luciferin oder das Luciferase-Substrat. In einigen Ausführungsformen sind diese Komponenten, vor allem das Luciferin, an ein Protein, wie ein Serumalbumin, oder andere Proteinträger, gebunden. Der Träger und Depot- bzw. Retard-Formulierungen ermöglichen es systemisch verabreichten Komponenten, ohne eine Wechselwirkung mit Blutzellbestandteilen, wie Hämoglobin, die/das das Luciferin oder die Lucifera se deaktivieren/deaktiviert, zu dem angsteuerten Gewebe zu wandern.
  • Verfahren für die Diagnose von Krankheiten, insbesondere infektiöser Krankheiten, unter Verwendung der Chip-Methodik (siehe z. B. die gleichzeitig anhängige U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/990,103), eines Luciferase/Luciferin-Biolumineszenz-erzeugenden Systems und eines Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFPs werden beschrieben. Der Chip umfasst vor allem einen integrierten Photodetektor, der die Photonen nachweist, die von dem Biolumineszenz-erzeugenden System emittiert werden, vor allem unter Verwendung einer Luciferase, die von den Nucleinsäuren codiert wird, die hier bereitgestellt werden, und/oder von Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFP.
  • In einer Ausführungsform wird der Chip unter Verwendung eines integrierten Schaltkreises mit einem Array, wie einem X-Y-Array, von Photodetektoren hergestellt. Die Oberfläche des Schaltkreises wird behandelt, um ihn den Bedingungen der diagnostischen Assays gegenüber, für den der Chip vorgesehen ist und an die er angepasst ist, inert zu machen, wie zum Beispiel durch die Derivatisierung für Verbindungsmoleküle, wie Antikörper. Ein ausgewählter Antikörper oder ein Panel von Antikörpern, wie ein Antikörper, der für ein bakterielles Antigen spezifisch ist, wird auf der Oberfläche des Chips oberhalb eines jeden Photodetektors fixiert. Nach dem Inkontaktbringen des Chips mit einer Testprobe wird der Chip mit einem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht, der mit einem Renilla- oder Pleuromamma-GFP, einem chimären Antikörper-Renilla-GFP-Fusionsprotein oder einem Antikörper, der mit einer Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems verbunden ist, wie einer Luciferase oder einem Luciferin, die für das Antigen spezifisch sind, verknüpft. Die übrigen Komponenten der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion werden zu gegeben, und falls irgendeiner der Antikörper, die mit einer Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems verbunden sind, auf dem Chip vorhanden ist, wird Licht erzeugt und durch den benachbarten Photodetektor nachgewiesen. Der Photodetektor ist betriebsbereit mit einem Computer verbunden, der mit Informationen programmiert ist, die die angebundenen Antikörper identifizieren, der das Ereignis aufzeichnet und dadurch Antigene identifiziert, die in der Testprobe vorhanden sind.
  • Verfahren zur Erzeugung chimärer GFP-Fusionsproteine werden beschrieben. Die Verfahren schließen das Verknüpfen der DNA, die ein interessierendes Gen oder einen Teil davon codiert, mit einer DNA, die eine GFP-codierende Region codiert, in dem gleichen Translationsleserahmen ein. Das interessierende codierte Protein kann innerhalb des Rahmens mit dem Amino- oder dem Carboxyterminus des GFPs verknüpft werden. Die DNA, die das chimäre Protein codiert, wird dann in einer funktionsfähigen Kombination mit einem Promotorelement eines geeigneten Expressionsvektors verknüpft. Alternativ kann das Promotorelement direkt von dem ausgerichteten interessierenden Gen erhalten werden, und das promotorhaltige Fragment kann stromaufwärts der GFP-codierenden Sequenz verknüpft werden, um chimäre GFP-Proteine zu erzeugen.
  • Verfahren für den Nachweis von Verbindungen unter Verwendung von rekombinanten Zellen, die eine heterologe DNA, die ein GFP codiert, unter der Kontrolle eines Promotorelements eines interessierenden Gens exprimieren, werden beschrieben. Die rekombinanten Zellen können verwendet werden, um neue Verbindungen oder Liganden zu identifizieren, die das Transkriptionsniveau des interessierenden Promotors modulieren, indem die GFP-vermittelte Fluoreszenz gemessen wird. Rekombinante Zellen, die die chimären Renilla- oder Ptilosarcus-GFPs exprimieren, können auch für die Überwachung der Genexpression oder des Proteintransports oder für die Bestimmung der zellulären Lokalisierung des Zielproteins ("target Protein") durch das Identifizieren lokalisierter Regionen einer GFP-vermittelten Fluoreszenz innerhalb der rekombinanten Zelle verwendet werden.
  • Andere Assays die die GFPs und/oder Luciferasen verwenden, werden hier ins Auge gefasst. Alle Assays oder diagnostischen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in denen Aequorea-GFPs und/oder andere Luciferasen verwendet werden, werden hier ins Auge gefasst.
  • Kits, die die GFPs zur Verwendung in den Verfahren, eingeschlossen die hier beschriebenen Verfahren, enthalten, werden beschrieben. Die Kits, die einen Herstellungsgegenstand und geeignete Reagenzien für die Erzeugung von Biolumineszenz enthalten, werden beschrieben. Die Kits, die derartige Seifenzusammensetzungen, vorzugsweise mit einem mittleren pH-Wert (zwischen 5 und 8), und Biolumineszenz-erzeugende Reagenzien, eingeschlossen Luciferase und Luciferin und das GFP, enthalten, werden hier beschrieben. Diese Kits können beispielsweise mit einem Blasen abgebenden oder Blasen erzeugenden Spielzeug verwendet werden. Diese Kits können auch eine Beladungs- oder Ladekartusche enthalten oder können in Verbindung mit einem Nahrungsmittel verwendet werden.
  • Die Kits können für den Nachweis und das Sichtbarmachen von neoplastischem Gewebe und anderer Gewebe verwendet werden, und sie können eine erste Zusammensetzung, die das GFP und mindestens eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält, und eine zweite Zusammensetzung, die die aktivierende Zusammensetzung enthält, die die übrigen Bestandteile des Biolumineszenz-erzeugenden Systems und jedes beliebige notwendige Aktivierungsmittel enthält, einschließen.
  • Diese Kits enthalten demnach typischerweise zwei Zusammensetzungen, eine erste Zusammensetzung, die das GFP enthält, formuliert für die systemische Verabreichung (oder in einigen Ausführungsformen für die lokale oder topische Anwendung), und eine zweite Zusammensetzung, die die Komponenten oder übrigen Bestandteile eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält, in Abhängigkeit von der Anwendung für die systemische, topische oder lokale Verabreichung formuliert. Die Gebrauchsanleitung für die Verabreichung wird beigefügt.
  • Die Kits können für den Nachweis und die Identifizierung von Krankheiten, insbesondere infektiöser Krankheiten, unter Verwendung von Multivertiefungen-Assayvorrichtungen verwendet werden, und sie umfassen eine Multivertiefungen-Assayvorrichtung, die eine Vielzahl von Vertiefungen aufweist, von denen jede einen integrierten Photodetektor hat, in denen ein Antikörper oder ein Panel von Antikörpern, der/das spezifisch für einen oder mehrere infektiöse Stoffe befestigt ist, und eine Zusammensetzung, die einen zweiten Antikörper enthält, wie einen Antikörper, der für den infektiösen Stoff spezifisch ist, der mit einem Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFP-Protein, einem chimären Antikörper-Renilla mulleri(oder Ptilosarcus)-GFP-Fusionsprotein oder F(Ab)2-Antikörperfragment-Renilla-mulleri-GFP-Fusionsprotein verknüpft ist. Eine zweite Zusammensetzung enthält ein Biolumineszenz-erzeugendes System, das eine Lichtwellenlänge innerhalb des Anregungsbereichs des Renilla-mulleri-GFP emittiert, wie Arten von Renilla oder Aequorea, mit der Renilla mulleri angeregt wird, das grünes Licht erzeugt, das durch den Photodetektor der Vorrichtung nachgewiesen wird, um das Vorhandensein des Stoffes nachzuweisen.
  • Wie oben angegeben, werden Fusionen einer Nucleinsäure, die die Luciferasen oder GFPs codiert, die hier bereitgestellt werden, mit an deren Luciferasen und GFPs bereitgestellt. Von besonderem Interesse sind die Fusionen, die Paare von Luciferasen und GFPs codieren, wie eine Renilla-Luciferase und ein Renilla-GFP (oder ein Homodimer oder anderes Vielfaches eines Renilla-GFPs). Die Luciferase und das GFP binden, und in Gegenwart eines Luciferins erzeugen sie eine Fluoreszenz, die rotverschoben ist, verglichen mit der Luciferase in Abwesenheit des GFPs. Diese Fusion oder Fusionen, in der/denen das GFP und die Luciferase über ein Zielmolekül, wie ein Peptid, verknüpft sind, kann/können als ein Werkzeug für die Untersuchung von allem, was mit dem Linker in Wechselwirkung tritt, verwendet werden.
  • Mutierte Proteine der GFPs und der Luciferasen werden beschrieben. Von besonderen Interesse sind mutierte Proteine, wie temperaturempfindliche Mutanten, des GFPs und der Luciferasen, die deren Wechselwirkung verändern, wie Mutationen in der Renilla-Luciferase und dem Renilla-GFP, die deren Wechselwirkung bei einer kritischen Temperatur verändern.
  • Antikörper, polyklonale und monoklonale Antikörper, die spezifisch an ein beliebiges Protein der Proteine binden, die durch die hier bereitgestellten Nucleinsäuren codiert werden, werden ebenfalls beschrieben. Diese Antikörper, monoklonal wie polyklonal, können unter Einsatz von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Vor allem werden Immunglobuline oder Antikörper, die aus dem Serum eines Tieres erhalten werden, das mit einer im Wesentlichen reinen Zubereitung einer Luciferase oder eines GFPs, die/das hier bereitgestellt wird, oder eines epitophaltigen Fragments davon immunisiert wurde, beschrieben. Monoklonale Antikörper werden ebenfalls bereitgestellt. Die Immunglobuline, die hergestellt werden, haben neben anderen Eigenschaften die Fähigkeit, spezifisch und bevorzugt an ein GFP oder eine Luciferase, vor allem ein Renilla- oder Ptsilocarpus-GFP oder eine Pleuromamma-, Gaussia- oder Renilla-mulleri-Luciferase zu binden und/oder die Immunpräzipitation dieser GFPs oder Luciferasen hervorzurufen, die in einer biologischen Probe oder einer Lösung, die von einer solchen Probe abgeleitet wird, vorhanden sein kann.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt die Komponenten des im Handel erhältlichen PET-34-Vektors (EK ist die Enterokinase) dar.
  • 2 zeigt einen Teilbereich des Vektors mit der insertierten Gaussia-codierenden Sequenz.
  • 3 stellt eine Aufstellung der abgeleiteten Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Renilla mulleri und der Aminosäuresequenz von isolierten Renilla reniformis-GFP-Peptiden dar, die durch den proteolytischen Abbau von gereinigtem Renilla- reniformis-GFP erhalten werden. Die Positionen in der Aminosäuresequenz mit direkter Identität werden durch die durchgezogenen vertikalen Linien (I) zwischen den beiden Renilla-Arten markiert.
  • 4 zeigt das Fluoreszenzemissions- und das Anregungsspektrum des Renilla mulleri-GFPs mit einer Peakemission bei 506 nm.
  • 5 zeigt das Fluoreszenzemissions- und das Anregungsspektrum des Ptiloscircus-GFPs mit einer maximalen Emission bei 508 nm.
  • 6 zeigt eine Photoemission in Abhängigkeit vom Salz und vom pH-Wert für Pleuromamma-Luciferase.
  • 7 stellt die Komponenten eines Renilla mulleri-Luciferase-GFP-Fusionskonstrukts in pET-34 dar; rbs: Ribosomenbindungssequenz, CDS: codierende Domänensequenz, CBD; die Cellulose-Bindungsdomäne; thrombin: Thrombin-Spaltstelle; EK: Enterokinase-Spaltstelle; S Tag: das RNase-S-Peptid-Tag; und LIC: ligationsunabhängige Klonierungsstelle.
  • 8 zeigt eine Photoemission in Abhängigkeit vom Salz und vom pH-Wert für eine Gaussia-Luciferase.
  • 9 zeigt ein Photoemissionsspektrum einer Gaussia-Luciferase.
  • 10 zeigt ein Photoemissionsspektrum einer Pleuromamma-Luciferase.
  • 11 veranschaulicht das dem Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) zugrunde liegende Prinzip und seine Verwendung als Sensor: A) im isolierten Zustand emittiert eine Luciferase, vorzugsweise eine Anthozoan-Luciferase, blaues Licht von dem Coelenterazin-abgeleiteten Chromophor; B) im isolierten Zustand emittiert ein GFP, vorzugsweise ein Anthozoan-GFP, das an die Luciferase bindet, die mit blaugrünem Licht angeregt wird, grünes Licht von seinem integralen Fluorophor auf Peptidbasis; C) wenn die Luciferase und das GFP in vivo oder in vitro zu einem Komplex assoziieren, überträgt die Luciferase nichtstrahlend ihre Reaktionsenergie auf das GFP-Fluorophor, das dann das grüne Licht emittiert. D) jede molekulare Wechselwirkung, die den Luciferase-GFP-Komplex unterbricht, kann quantitativ untersucht werden, indem die spektrale Verschiebung vom grünen Licht zum blauen Licht beobachtet wird.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass die Gaussia-Luciferase den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet, während die Renilla-mulleri- Luciferase und die Pleuromamma-Luciferase sowie das Renilla-GFP und das Ptilosarcus-GFP als Vergleichsbeispiele angegeben werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • INHALTSVERZEICHNIS
    • A. DEFINITIONEN
    • B. BIOLUMINESZENZ-ERZEUGENDE SYSTEME 1. Beispielhafte Biolumineszenz-erzeugende Systeme a. Allgemeine Beschreibung (1) Luciferasen (2) Luciferine (3) Aktivatoren (4) Reaktionen b. Ctenophor-Systeme (1) Das Aequorin-System (a) Aequorin und verwandte Photoproteine (b) Luciferin (2) Das Renilla-System c. Crustaceen, vor allem Cypridina-Systeme (1) Varguia-Luciferase (a) Reinigung aus Cypridina (b) Herstellung durch rekombinante Verfahren (2) Vargula-Luciferin (3) Reaktion d. Insekten-Bioluminenszenz-Systeme, eingeschlossen Leuchtkäfer, Schnellkäfer und anderes Insektensystem (1) Luciferase (2) Luciferin (3) Reaktion e. Bakterielle Systeme (1) Luciferasen (2) Luciferine (3) Reaktionen f. Andere Systeme (1) Dinoflagellat-Biolumineszenz-erzeugende Systeme (2) Systeme von Mollusken, wie Latia und Pholas (3) Erdwürmer und andere Ringelwürmer (4) Glühwürmchen (5) Marine Polycheat-Wurmsysteme (6) Südamerikanischer Railroadwurm (7) Fische g. Fluoreszierende Proteine (1) Grün und blau fluoreszierende Proteine (2) Phycobili-Proteine
    • C. ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON NUCLEINSÄUREN, DIE LUCIFERASEN CODIEREN ISOLIERUNG UND IDENTIZIERUNG EINER NUCLEINSÄURE, DIE Gaussia-LUCIFERASE CODIERT 1. Isolierung von Proben aus der Gattung Gaussia 2. Herstellung von Gaussia-cDNA-Expressionsbanken 3. Isolierung und Identifizierung von DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG EINER NUCLEINSÄURE, DIE Renilla-PROTEINE CODIERT 1. Isolierung von Proben aus der Gattung Renilla 2. Herstellung von Renilla- cDNA-Expressionsbanken a. RNA-Isolierung und cDNA-Synthese b. Konstruktion von cDNA-Expressionsbanken 3. Isolierung und Identifizierung von DNA, die Renilla-GFP codiert 4. Isolierung und Identifizierung von DNA, die Renilla-Luciferase codiert
    • D. NUCLEINSÄURESONDEN UND VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG UND KLONIERUNG VON LUCIFERASE- und GFP-CODIERENDEN NUCLEINSÄUREN VON ANDEREN ARTEN Gaussia NUCLEINSÄURSONDEN UND VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG UND KLONIERUNG VON GFP-CODIERENDEN NUCLEINSÄUREN VON ANDEREN ARTEN VON Renilla Andere Arten
    • E. REKOMBINANTE EXPRESSION VON PROTEINEN Gaussia 1. DNA, die Gaussia-Proteine codiert 2. DNA-Konstrukte für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen 3. Wirtsorganismen für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen 4. Verfahren für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen Renilla 1. DNA, die Renilla-Proteine codiert 2. DNA-Konstrukte für die rekombinante Erzeugung von Renilla-Proteinen 3. Wirtsorganismen für die rekombinante Erzeugung von Renilla-Proteinen 4. Verfahren für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen
    • F. REKOMBINANTE ZELLEN, DIE EINE HETEROLOGE NUCLEINSÄURE EXPRIMIEREN, DIE LUCIFERASEN UND GFPs CODIEREN Gaussia REKOMBINANTE ZELLEN, DIE EINE HETEROLOGE NUCLEINSÄURE EXPRIMIEREN, DIE EIN GRÜN FLUORESZIERENDES PROTEIN UND/ODER EINE LUCIFERASE VON RENILLA CODIERT
    • G. Luciferasen
    • H. Renilla- und Ptilosarcus-GFPs
    • I. ZUSAMMENSETZUNGEN 1. Gaussia-Luciferase-Zusammensetzungen 2. Renilla-Luciferase-Zusammensetzungen 3. Renilla-GFP-Zusammensetzungen 4. Konjugate a. Linker b. Ansteuerungsmittel ("Targeting-Mittel") Anti-Tumor-Antigen-Antikörper Herstellung der Konjugate 5. Formulierung der Zusammensetzungen zur Verwendung in der a. Die erste Zusammensetzung: Formulierung der Konjugat-Diagnose-Systeme b. Die zweite Zusammensetzung c. Durchführung der Reaktionen in Kombination mit Ansteuerungsmitteln
    • J. KOMBINATIONEN
    • K. ANWENDUNGSVERFAHREN 1. Verfahren für die Diagnose von Neoplasmen und anderer Gewebe 2. Verfahren für die Diagnose von Krankheiten 3. Verfahren für die Erzeugung von chimärem Renilla- oder Ptilosarcus-GFP-, Renilla-mulleri-Luciferase, Pleuromamma-Luciferase- und Gaussia-Luciferase-Fusionsproteinen. 4. Assays auf Zellbasis für die Identifizierung von Verbindungen
    • L. KITS 1. Ausgabe- und Verpackungsapparat für die Kombination mit dem GFP und den Komponenten des Biolumineszenz-Systems 2. Kapseln, Pellets, Liposomen, Endosomen, Vakuolen, mikronisierte Partikel a. Verkapselungsvehikel im Allgemeinen b. Verkapselungsvehikel – Liposomen c. Verkapselungsvehikel – Gelatine und polymere Vehikel d. Endosomen und Vakuolen e. Mikrovisierte Partikel 3. Immobilisierte Systeme a. Matrixmaterialien b. Immobilisierung und Aktivierung
    • M. Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer-System (BRET)
    • N. BEISPIELE
  • A. DEFINITIONEN
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung wie die Ausdrücke üblicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Alle Patente und Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wird, werden durch die Bezugnahme in ihrem vollständigen Umfang hier aufgenommen.
  • So wie der Begriff "Chemilumineszenz" hier verwendet wird, bezieht er sich auf eine chemische Reaktion, in der Energie spezifisch zu einem Molekül kanalisiert wird, was zu dessen elektronischer Anregung und anschließend zur Freisetzung eines Photons führt, so dass es zur Emission von sichtbarem Licht kommt. Die Temperatur trägt nicht zu dieser kanalisierten Energie bei. Chemilumineszenz ist demnach mit der direkten Umwandlung von chemischer Energie in Lichtenergie verbunden.
  • So wie der Begriff "Lumineszenz" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die nachweisbare elektromagnetische (EM) Strahlung, im Allgemeinen UV-, IR- oder sichtbare EM-Strahlung, die erzeugt wird, wenn das angeregte Produkt eines exergonischen chemischen Prozesses unter Emission von Licht in seinen Grundzustand zurückkehrt. Die Chemilumineszenz ist eine Lumineszenz, die aus einer chemischen Reaktion resultiert. Die Biolumineszenz ist eine Chemilumineszenz, die aus einer chemischen Reaktion resultiert, bei der biologische Moleküle (oder synthetische Varianten oder Analoges davon) als Substrate und/oder Enzyme verwendet werden.
  • So wie der Begriff verwendet wird, bezieht sich "Biolumineszenz", die ein Typ der Chemilumineszenz ist, auf die Emission von Licht durch biologische Moleküle, vor allem Proteine. Die wesentliche Bedingung für Biolumineszenz ist molekularer Sauerstoff, entweder gebunden oder frei in Gegenwart einer Oxygenase, einer Luciferase, die auf das Substrat, ein Luciferin, einwirkt. Die Biolumineszenz wird durch ein Enzym oder ein anderes Protein (Luciferase) erzeugt, das eine Oxygenase ist, die auf ein Substrat Luciferin (ein Biolumineszenzsubstrat) in Gegenwart von molekularem Sauerstoff einwirkt und das Substrat in einen angeregten Zustand umwandelt, der bei der Rückkehr auf ein niedrigeres Energieniveau die Energie in der Form von Licht freisetzt.
  • So wie die Begriffe "Substrate bzw. Enzyme für die Erzeugung von Biolumineszenz" hier verwendet werden, beziehen sie sich gattungsge mäß auf Luciferin bzw. Luciferase. Wenn auf eine spezielle Molekülsorte davon Bezug genommen wird, wird aus Gründen der Klarheit jeder gattungsgemäße Begriff mit dem Namen des Organismus verwendet, von dem das Molekül abgeleitet ist, beispielsweise bakterielles Luciferin oder Leuchtkäfer-Luciferase.
  • So wie der Begriff "Luciferase" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Oxygenasen, die eine lichtemittierende Reaktion katalysieren. Bakterielle Luciferasen katalysieren beispielsweise die Oxidation von Flavinmononucleotid (FMN) und aliphatischen Aldehyden, wobei diese Reaktion Licht erzeugt. Eine andere Klasse von Luciferasen, die unter den Meeresarthropoden gefunden wird, katalysiert die Oxidation von Cypridina (Vargula)-Luciferin, und eine andere Klasse von Luciferasen katalysiert die Oxidation von Coleoptera-Luciferin.
  • Luciferase bezieht sich demnach auf ein Enzym oder Photoprotein, das eine Biolumineszenzreaktion katalysiert (eine Reaktion, die Biolumineszenz erzeugt). Die Luciferasen, wie Leuchtkäfer- und Gaussia- und Renilla-Luciferase, sind Enzyme, die katalytisch wirken und während der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion unverändert bleiben. Die Luciferase-Photoproteine, wie das Aequorin-Photoprotein, an die das Luciferin nicht kovalent gebunden ist, werden verändert, wie durch die Freisetzung des Luciferins während der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion. Die Luciferase ist ein Protein, das natürlich in einem Organismus oder in einer Variante oder einer Mutante davon vorkommt, wie einer abweichenden Form bzw. Variante, die durch Mutagenese erzeugt wird, die eine oder mehrere Eigenschaften, wie Wärmestabilität, hat, die verschieden von den Eigenschaften des natürlich vorkommenden Proteins sind. Luciferasen und modifizierte Mutanten oder abweichende Formen davon sind wohlbekannt. Für die Zwecke hier bedeutet die Bezugnahme auf eine Lucife rase die Bezugnahme entweder auf die Photoproteine oder die Luciferasen.
  • Bei der Bezugnahme beispielsweise auf "Gaussia-Luciferase" geht es um ein Enzym, das aus einer Art der Gattung Gaussia isoliert wurde, oder ein äquivalentes Molekül, das von einer beliebigen anderen Quelle erhalten wird, wie von einem anderen verwandten Copepoden, oder das synthetisch hergestellt wurde. Es ist beabsichtigt, Gaussia-Luciferasen mit konservativen Aminosäuresubstitutionen einzuschließen, die die Aktivität nicht wesentlich verändern. Geeignete konservative Substitutionen von Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt und können im Allgemeinen ohne Veränderung der biologischen Aktivität des resultierenden Moleküls erzeugt werden. Der Fachmann weiß dass einzelne Aminosäuresubstitutionen in nicht essentiellen Regionen eines Polypeptids die biologische Aktivität im Allgemeinen nicht verändern (siehe z. B. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, 1987, The Bejacmin/Cummings. Pub. Co., S. 224).
  • Der Begriff "Renilla-GFP" bezieht sich auf die GFPs aus der Gattung Renilla und auf die Mutanten oder Varianten davon. Es ist beabsichtigt, die Renilla-GFPs mit konservativen Aminosäuresubstitutionen, die die Aktivität nicht wesentlich verändern, einzuschließen.
  • Diese Substitutionen werden vorzugsweise denjenigen Substitutionen gemäß durchgeführt, die in der folgenden TABELLE 1 offenbart werden. TABELLE 1
    Ursprünglicher Rest Konservative Substitution
    Ala (A) Gly; Ser
    Arg (R) Lys
    Asn (N) Gln; His
    Cys (C) Ser
    Gln (Q) Asn
    Glu (E) Asp
    Gly (G) Ala; Pro
    His (H) Asn; Gln
    Ile (I) Leu; Val
    Leu (L) Ile; Val
    Lys (K) Arg; Gln; Glu
    Met (M) Leu; Tyr; Ile
    Phe (F) Met; Leu; Tyr
    Ser (S) Thr
    Thr (T) Ser
    Trp (W) Tyr
    Tyr (Y) Trp; Phe
    Val (V) Ile; Leu
  • Andere Substitutionen sind ebenfalls zulässig und können empirisch oder gemäß den bekannten konservativen Substitutionen ermittelt werden.
  • Die Luciferasen und Luciferin und die Aktivatoren davon werden als Biolumineszenz-erzeugende Reagenzien oder Komponenten bezeichnet. Typischerweise wird eine Teilmenge dieser Reagenzien bereitgestellt oder mit einem Herstellungsgegenstand kombiniert. Die Biolumineszenz wird beim Inkontaktbringen der Kombination mit den übrigen Reagenzien erzeugt. Somit werden, wie hier verwendet, die Komponenten Luciferasen, Luciferine und andere Faktoren, wie O2, Mg2+, Ca2+ auch als Biolumineszenz-erzeugende Reagenzien (oder Mittel oder Komponenten) bezeichnet.
  • So wie der Begriff "Biolumineszenzsubstrat" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die Verbindung, die in Gegenwart einer Luciferase und jedes sonstigen erforderlichen Aktivators oxidiert wird und Licht erzeugt. Diese Substrate werden hier als Luciferine bezeichnet, und sie sind Substrate, die in einer Biolumineszenzreaktion oxidiert werden. Diese Biolumineszenzsubstrate schließen jedes beliebige Luciferin oder Analogon davon oder jede synthetische Verbindung ein, die mit einer Luciferase unter Erzeugung von Licht in Wechselwirkung tritt. Bevorzugte Substrate sind diejenigen, die in Gegenwart einer Luciferase oder eines Proteins in einer lichterzeugenden Reaktion oxidiert werden. Die Biolumineszenzsubstrate schließen somit diejenigen Verbindungen ein, die der Fachmann als Luciferine kennt. Die Luciferine schließen beispielsweise das Leuchtkäfer-Luciferin, Cypridina-Luciferin (auch bekannt als Vargula-Luciferin) (Coelenterazin), bakterielles Luciferin sowie synthetische Analoga dieser Substrate oder andere Verbindungen ein, die in Gegenwart einer Luciferase in einer Reaktion unter Erzeugung von Biolumineszenz oxidiert werden.
  • So wie der Ausdruck "befähigt zur Umwandlung in ein Biolumineszenz-Substrat" hier verwendet wird, bedeutet er die Eignung für chemische Reaktionen, wie eine Oxidation oder Reduktion, die ein Biolumineszenzsubstrat liefert. Die Lumineszenz-erzeugende Reaktion von Biolumineszenz-Bakterien schließt beispielsweise die Reduktion einer Flavinmononucleotid-Gruppe (FMN) zu reduziertem Flavinmononucleotid (FMNH2) durch ein Flavinreduktase-Enzym ein. Das reduzierte Flavinmononucleotid (Substrat) reagiert dann mit Sauerstoff (einem Aktivator) und bakterieller Luciferase, um ein Peroxyflavin als Zwischenprodukt zu bilden, das in Gegenwart eines langkettigen Aldehyds weitere Reaktionen durchläuft, wobei Licht erzeugt wird. In Bezug auf diese Reaktion sind das reduzierte Flavin und der langkettige Aldehyd die Substrate.
  • So wie der Begriff "Biolumineszenz-erzeugendes System" hier verwendet wird, bezieht er sich auf den Satz von Reagenzien, die benötigt werden, um eine Biolumineszenzreaktion durchzuführen. Somit bilden die spezielle Luciferase, das Luciferin und andere Substrate, Lösemittel und andere Reagenzien, die erforderlich sein können, um eine Biolumineszenzreaktion auszuführen, ein Biolumineszenzsystem. Ein Biolumineszenz-erzeugendes System bezieht sich somit auf jeden beliebigen Satz von Reagenzien, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen eine Biolumineszenz liefern. Der Begriff "geeignete Reaktionsbedingungen" bezieht sich auf die Bedingungen, die erforderlich sind, damit eine Biolumineszreaktion stattfindet, wie pH-Wert, Salzkonzentrationen und Temperatur. Im Allgemeinen schließen Biolumineszenzsysteme ein Biolumineszenz-Substrat, ein Luciferin, eine Luciferase, die die Enzyme Luciferasen und Photoproteine einschließt, und einen oder mehrere Aktivatoren ein. Ein spezielles Biolumineszenzsystem kann durch die Bezugnahme auf den speziellen Organismus gekennzeichnet werden, von dem die Luciferase abstammt; Das Vargula-Biolumineszenzsystem (Vargula wird auch als Cypridina bezeichnet) (oder Vargula-System) schließt beispielsweise eine Vargula-Luciferase, wie eine Luciferase, die aus dem Ostracod Vargula isoliert wurde oder die unter Verwendung von Rekombinationstechniken erzeugt wurde, oder Abwandlungen dieser Luciferasen ein. Dieses System würde auch die speziellen Aktivatoren einschließen, die für die Ausführung der Biolumineszenzreaktion erforderlich sind, wie Sauerstoff und ein Substrat, mit dem die Luciferase in Gegenwart des Sauerstoffs unter Erzeugung von Licht reagiert.
  • Die hier bereitgestellten Luciferasen können in Biolumineszenz-erzeugende Systeme eingebracht werden und soweit erforderlich mit den GFPs, die hier bereitgestellt werden, oder mit anderen GFPs verwendet werden. Ähnlich können die hier bereitgestellten GFPs mit bekannten Biolumineszenz-erzeugenden Systemen verwendet werden.
  • Wie hier verwendet, werden die Aminosäuren, die in den verschiedenen hier erscheinenden Aminosäuresequenzen vorkommen, gemäß ihren allgemein bekannten Dreibuchstaben- oder Einbuchstabeabkürzungen bezeichnet. Die Nucleotide, die in den verschiedenen DNA-Fragmenten vorkommen, werden mit ihren Standardeinbuchstabenbezeichnungen, die routinemäßig auf dem Fachgebiet verwendet werden, bezeichnet.
  • So wie der Begriff "fluoreszierendes Protein" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Protein, das die Fähigkeit besitzt, zu fluoreszieren (d. h. Energie bei einer Wellenlänge zu absorbieren und sie bei einer anderen Wellenlänge zu emittieren). Diese Proteine können als fluoreszierende Label oder Marker und in beliebigen Anwendungen verwendet werden, in denen derartige Label verwendet werden, wie Immunoassays, CRET-, FRET- und FET-Assays, und in den Assays, die hier als BRET-Assays bezeichnet werden. Ein grün fluoreszierendes Protein bezieht sich beispielsweise auf ein Polypeptid, das in seinem Emissionsspektrum einen Peak bei etwa 510 nm hat.
  • So wie der Begriff "BRET" (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer) hier verwendet wird, bezieht er sich auf einen nicht strahlenden Energietransfer von der Luciferase auf das FP. Er unterscheidet sich vom "FRET" (Fluoreszenz-Resonanzenergie-Transfer), der historisch für den Energietransfer zwischen chemischen Fluoren verwendet wurde, seit kurzem aber für den Energietransfer zwischen spektralen Aequorea-GFP-Varianten verwendet wird.
  • So wie der Begriff "BRET-System" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die Kombination eines FP mit einer Luciferase für den Resonanz energie-Transfer, und BRET bezieht sich auf jedes Verfahren, in dem die Luciferase verwendet wird, um das Licht durch die Umsetzung mit einem Lucifern zu erzeugen, das dann nicht strahlend auf ein FP übertragen wird. Die Energie wird auf ein FP, vor allem ein GFP, übertragen, das die Energie fokussiert und verschiebt und sie bei einer anderen Wellenlänge emittiert. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das BRET-System ein Biolumineszenz-erzeugendes System und ein GFP aus der selben Quelle wie die Luciferase in dem System ein. Ein bevorzugtes Paar bilden eine Renilla-Luciferase und ein Renilla-GFP, die in einen spezifische Wechselwirkung treten. Veränderungen in der Bindung äußern sich in Veränderungen in den Emissionsspektren des Lichts, das von der Luciferase erzeugt wird. Im Ergebnis kann das Paar als ein Sensor für externe Ereignisse funktionieren.
  • So wie der Begriff "Biosensor" (oder "Sensor") hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein BRET-System, das verwendet wird, um Veränderungen in einer Umgebung in vitro oder in vivo nachzuweisen, in der das BRET-System verwendet wird.
  • So wie der Ausdruck "nicht streng katalytisch" hier verwendet wird, bedeutet er, dass das Photoprotein als Katalysator wirkt, der die Oxidation des Substrats fördert, dass es jedoch bei der Reaktion verändert wird, da das gebundene Substrat oxidiert wird und da in der Reaktion gebundener molekularer Sauerstoff verwendet wird. Derartige Photoproteine werden durch die Zugabe vom Substrat und von molekularem Sauerstoff unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, regeneriert.
  • So wie der Begriff "Nucleinsäuresonde" hier verwendet wird, handelt es sich hierbei um eine einzelsträngige DNA oder RNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens 14 zusammenhängende Base, vorzugsweise mindestens 16, typischerweise etwa 30 zusammenhängende Basen aufweist, die identisch sind mit (oder Gegenstück zu) beliebigen 14 oder mehr als 14 zusammenhängenden Basen, die in einer der SEQ ID NO, vor allem in SEQ ID NO: 15, 19, 21, 28, 30, 31, offenbart sind, und auch eine Nucleinsäure, die irgendeines der Peptide in den SEQ ID NO: 23–27 codiert. Zu den bevorzugten Regionen, aus denen die Sonden konstruiert werden sollen, gehören 5'- und 3'-codierende Sequenzen, bei denen es sich um Sequenzen handelt, für die vorhergesagt wird, dass sie Regionen codieren, die unter den Renilla-Arten konserviert sind. Sonden von Regionen, die unter den GFPs der Renilla-Arten konserviert sind, sind für das Isolieren der GFP-codierenden Nucleinsäure aus Renilla-Genbanken vorgesehen.
  • Die Nucleinsäuresonden können entartete Sonden von mindestens 14 Nucleotiden, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotiden, sein, die auf den Aminosäuren 51 bis 68, 82 bis 98 und 198 bis 208, die in SEQ ID NO: 16 offenbart werden, der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No: 24 offenbart wird, den Aminosäuren 9–20, die in SEQ ID NO: 25 offenbart werden, und den Aminosäuren 39–53, die in SEQ ID NO: 27 offenbart werden, basieren. Die Nucleinsäuresonden, die die oben beschriebenen Aminosäureregionen codieren, werden unter den Nucleotidsequenzen ausgewählt, die diese Regionen codieren, die in SEQ ID NO: 15 offenbart werden.
  • Die Nucleinsäuresonden können entartete Sonden von mindestens 14 Nucleotiden, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotiden, sein, die auf den Aminosäuren basieren, die in SEQ ID NO: 20 offenbart werden. Die Nucleinsäuresonden, die die oben beschriebenen Aminosäureregionen codieren, werden unter den Nucleotidsequenzen ausgewählt, die diese Regionen codieren, die in SEQ ID NO: 19 offenbart werden.
  • So wie er Begriff "Vektor" (oder "Plasmid") hier verwendet wird, bezieht er sich auf eigenständige Elemente, die verwendet werden, um eine heterologe DNA entweder für deren Expression oder deren Replikation in Zellen einzubringen. Auswahl und Verwendung derartiger Vehikel gehören zum allgemeinen Fachwissen des Fachmanns. Ein Expressionsvektor schließt die Vektoren ein, die imstande sind, DNAs zu exprimieren, die funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen, wie Promotorregionen, verknüpft sind, die imstande sind, die Expression derartiger DNA-Fragmente herbeizuführen. Somit bezieht sich der Begriff "Expressionsvektor" auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderen Vektor, das nach dem Einbringen in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen diejenigen ein, die in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, die episomal bleiben, oder diejenigen, die sich in das Genom der Wirtszelle integrieren. Derzeit bevorzugte Plasmide für die Expression einer Gaussia-Luciferase, eines Renilla-GFPs oder eines Renilla-Luciferase sind diejenigen, die in Bakterien und Hefe exprimiert werden, wie diejenigen, die hier beschrieben werden.
  • So wie hier die Begriff "Promotorregion" oder "Promotorelement" verwendet werden, beziehen sie sich auf ein DNA- oder RNA-Segment, das die Transkription der DNA oder der RNA, mit der es funktionsfähig verbunden ist, kontrolliert. Die Promotorregion schlieft spezifische Sequenzen ein, die ausreichend sind für die RNA-Polymerase-Erkennung, das Binden und die Initiierung der Transkription. Dieser Bereich der Promotorregion wird als der Promotor bezeichnet. Zusätzlich schließt die Promotorregion Sequenzen ein, die diese Aktivitäten der Erkennung, der Bindung und der Initiierung der Transkription der RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis- wirkend sein, oder sie können verantwortlich für trans-wirkende Faktoren sein. Promotoren können in Abhängigkeit von der Art der Regulation konstitutiv oder reguliert sein. Beispielhafte Promotoren, die für die Verwendung in Prokaryoten vorgesehen sind, schließen die Promotoren der Bakteriophagen T7 und T3 und dergleichen ein.
  • So wie die Ausdrücke "funktionsfähig verknüpft" oder "funktonsfähig kombiniert" hier verwendet werden, beziehen sie sich auf den funktionellen Zusammenhang zwischen der DNA und den regulatorischen Sequenzen und Effektor-Sequenzen von Nucleotiden, wie Promotoren, Verstärkern, Transkriptions- und Translationsstoppstellen, und anderen Signalsequenzen. Die "funktionsfähige Verknüpfung" von DNA mit einem Promotor bezieht sich beispielsweise auf die physikalische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, die so ist, dass die Transkription einer derartigen DNA von dem Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, die spezifisch die DNA erkennt, daran bindet und sie transkribiert. Für die Optimierung der Expression und/oder die in vitro-Transkription kann es erforderlich sein, 5'-nicht translatierte Bereiche der Klone zu entfernen, hinzuzufügen oder zu verändern, um zusätzliche potentiell unpassende alternative Translationsinitiierungscodons (d. h. Startcodons) oder andere Sequenzen zu entfernen, die die Expression stören oder sie verringern können, entweder auf dem Niveau der Transkription oder der Translation. Alternativ können Konsensus-Ribosomenbindungsstellen (siehe z. B. Kozak (1991) J. Biol Chem. 266: 19867–19870) unmittelbar 5' des Startcodons insertiert werden, die die Expression verstärken können. Die Gewünschtheit (oder die Notwendigkeit) einer derartigen Abwandlung kann empirisch ermittelt werden.
  • So wie der Ausdruck "Ausrichten bzw. Adressieren einer ausgerichteten Substanz (targeted agent)", wie einer Luciferase, verwendet wird, bedeutet er, die Substanz zielgerichtet zu einer Zelle zu lenken, die einen ausgewählten Rezeptor oder ein sonstiges Zelloberflächenprotein exprimiert, indem die Substanz mit einem derartigen Mittel verknüpft wird. Infolge des Bindens der ausgerichteten Substanz an oder ihrer Wechselwirkung mit dem Rezeptor oder dem Zelloberflächenprotein kann sie mit einem geeigneten Substrat und aktivierenden Stoffen umgesetzt werden, wodurch Biolumineszenzlicht erzeugt wird und das tumoröse Gewebe oder tumoröse Zellen von nicht tumorösem Gewebe unterschieden wird/werden.
  • So wie der Begriff "wirksame Menge einer Verbindung für die Behandlung einer speziellen Krankheit" hier verwendet wird, bedeutet er eine Menge, die ausreicht, um die Symptome, die mit dieser Krankheit verbunden sind, zu verbessern oder in irgendeiner Weise zu reduzieren. Eine derartige Menge kann in Form einer einzigen Dosis verabreicht werden, oder sie kann nach einem Einnahmeplan verabreicht werden, wodurch sie wirksam ist. Die Menge kann die Krankheit heilen, sie wird jedoch typischerweise verabreicht, um die Symptome der Krankheit zu lindern. Die wiederholte Verabreichung kann erforderlich sein, um die gewünschte Linderung der Symptome zu erreichen.
  • So wie der Begriff "wirksame Menge eines Konjugats für die Diagnose einer Krankheit" hier verwendet wird, bedeutet er eine Menge, die dazu führt, dass ein Gewebe nachgewiesen werden kann. Die Gewebe werden durch das Sichtbarmachen entweder ohne Hilfe eines Detektors, der empfindlicher als das menschliche Auge ist, oder unter Verwendung einer Lichtquelle, um beliebige fluoreszierende Produkte anzuregen, nachgewiesen.
  • So wie der Begriff "sichtbar machbar" hier verwendet wird, bedeutet er die Nachweisbarkeit mit dem Auge, vor allem während eines chi rurgischen Eingriffs unter normalen chirurgischen Bedingungen, oder erforderlichenfalls bei leicht abgeblendetem Licht.
  • So wie der Begriff "pharmazeutisch akzeptable Salze, Ester oder Derivate der Konjugate" hier verwendet wird, schließt er beliebige Salze, Ester oder andere Derivate ein, die vom Fachmann unter Verwendung bekannter Verfahren, wie der Derivatisierung, leicht hergestellt werden können und die Verbindungen ergeben, die Tieren oder Menschen ohne wesentliche toxische Auswirkungen verabreicht werden können und die entweder pharmazeutisch wirksam sind oder Pro-Pharmaka darstellen.
  • So wie der Begriff "Behandlung" hier verwendet wird, bedeutet er jeden Weg, auf dem die Symptome eines Zustands, einer Störung oder einer Krankheit verbessert werden oder sonst wie günstig verändert werden. Die Behandlung schließt auch jede pharmazeutische Verwendung der hier beschriebenen Zusammensetzungen ein.
  • So wie der Begriff "Verbesserung der Symptome eines speziellen Leidens durch die Verabreichung einer speziellen pharmazeutischen Verbindung" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jede beliebige Verminderung, ob nun dauerhaft oder vorübergehend, nachhaltig oder transient, die der Verabreichung der Zusammensetzung zugeschrieben oder mit ihr in Verbindung gebracht werden kann.
  • So wie der Ausdruck "im Wesentlichen rein" hier verwendet wird, bedeutet er ausreichend homogen, um frei von leicht nachweisbaren Verunreinigungen zu erscheinen, die durch Standardanalyseverfahren nachgewiesen werden, wie Dünnschichtchromatographie (TLC), Gelelektrophorese und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), die vom Fachmann verwendet werden, um eine derartigen Reinheit zu ermitteln, oder so ausreichend rein, dass die weitere Rei nigung die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie enzymatische und biologische Aktivitäten, der Substanz nicht nachweisbar verändern würde. Verfahren für die Reinigung der Verbindungen zur Erzeugung von im Wesentlichen chemisch reinen Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Eine im Wesentlichen chemisch reine Verbindung kann jedoch ein Gemisch von Stereoisomeren oder Isomeren sein. In derartigen Fällen könnte die weitere Reinigung die spezifische Aktivität der Verbindung erhöhen.
  • So wie der Begriff "Pro-Pharmakon" hier verwendet wird, handelt es sich um eine Verbindung, die bei der in vivo-Verabreichung zu der biologisch, pharmazeutisch oder therapeutisch aktiven Form der Verbindung metabolisiert oder anderswie umgewandelt wird. Für die Erzeugung eines Pro-Pharmakons wird die pharmazeutisch aktive Verbindung so verändert, dass die aktive Verbindung durch metabolische Prozesse regeneriert wird. Das Pro-Pharmakon kann so entworfen sein, dass es die metabolische Stabilität oder die Transporteigenschaften eines Arzneimittels verändert, dass Nebenwirkungen oder eine Toxizität maskiert werden, dass der Geschmack eines Arzneimittels verbessert wir oder andere Merkmale oder Eigenschaften eines Arzneimittels verbessert werden. Auf Grund des Wissens über pharmakodynamische Vorgänge und die in vivo-Metabolisierung von Arzneimitteln kann der Fachmann, sobald eine pharmazeutisch aktive Verbindung bekannt ist, Pro-Pharmaka der Verbindung entwerfen (siehe z. B. Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biological Approach, Oxford University Press, New York, Seiten 388–392).
  • So wie der Begriff "biologische Aktivität" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die in vivo-Aktivitäten einer Verbindung oder die physiologischen Antworten, die aus einer in vivo-Verabreichung einer Verbindung, einer Zusammensetzung oder eines anderen Gemischs resultieren. Die biologische Aktivität schließt somit therapeutische Effekte und die pharmazeutische Aktivität solcher Verbindungen, Zusammensetzungen und Gemische ein. Biologische Aktivitäten können in in vitro-Sytemen beobachtet werden, die für das Testen oder die Anwendung derartiger Aktivitäten entwickelt worden sind. Für die Zwecke hier ist daher die biologische Aktivität einer Luciferase ihre Oxygenase-Aktivität, durch, die infolge der Oxidation eines Substrats, Licht erzeugt wird.
  • So wie der Begriff "Ansteuerungsmittel" (Targeting-Mittel)" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Mittel, das eine damit verknüpfte ausgerichtete Substanz, ein Luciferin oder eine Luciferase, spezifisch oder bevorzugt auf eine neoplastische Zelle oder ein neoplastisches Gewebe zielgerichtet ausrichtet.
  • So wie der Begriff "Tumorantigen" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Zelloberflächenprotein, das auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert wird oder dort lokalisiert ist.
  • So wie der Begriff "neoplastische Zellen" hier verwendet wird, schließt er jeden Typ von transformierten oder veränderten Zellen ein, die Eigenschaften zeigen, die typisch für transformierte Zellen sind, wie das Fehlen einer Kontakthemmung und das Erwerben von tumorspezifischen Antigenen. Derartige Zellen schließen Leukämiezellen und Zellen, die von einem Tumor abgeleitet sind, ein, sind jedoch nicht auf diese Zellen beschränkt.
  • So wie der Begriff "neoplastische Krankheit" hier verwendet wird, handelt es sich hierbei um jede beliebige Krankheit, in der neoplastische Zellen in dem Individuum, das von der Krankheit betroffen ist, vorhanden sind. Derartige Krankheiten schließen alle Krankheiten ein, die als Krebs charakterisiert werden.
  • So wie der Begriff "metastatische Tumore" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Tumore, die nicht an einer Stelle lokalisiert sind.
  • So wie der Begriff "Spezialgewebe" hier verwendet wird, bezieht er sich auf nicht tumoröses Gewebe, über das Informationen hinsichtlich seiner Lokalisierung gewünscht sind. Derartige Gewebe schließen beispielsweise endometriotisches Gewebe, ektopische Schwangerschaften, Gewebe, die mit bestimmten Störungen und Myopathien oder Pathologien zusammenhängen, ein.
  • So wie der Begriff "Rezeptor" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein Molekül, das eine Affinität für einen gegebenen Liganden hat. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Rezeptoren können auf dem Fachgebiet auch als Anti-Liganden bezeichnet werden. So wie sie hier verwendet werden, sind die Begriffe Rezeptor und Anti-Ligand austauschbar. Rezeptoren können in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Molekülsorten verwendet werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht kovalent an einem Bindungselement befestigt sein, oder sich damit in physikalischem Kontakt befinden, entweder direkt oder indirekt über eine spezifische Bindungssubstanz oder einen spezifischen Linker. Beispiele für Rezeptoren schließen nicht einschränkend ein: Antikörper, Zellmembranrezeptoren, Oberflächenrezeptoren und internalisierende Rezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, die mit spezifischen Antigendeterminanten reaktiv sind (wie gegenüber Viren, Zellen oder anderen Materialien), Arzneimittel, Polynucleotide, Nucleinsäuren, Peptide, Cofaktoren, Lektine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organellen ein.
  • Beispiele für Rezeptoren und Anwendungen unter Verwendung derartiger Rezeptoren schließen nicht einschränkend ein:
    • a) Enzyme: spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben von Mikroorganismen wesentlich sind, die als Ziele für die antiobiotische Selektion (Ligand) dienen können;
    • b) Antikörper: die Identifizierung einer Liganden-bindenden Stelle auf dem Antikörpermolekül, die mit dem Epitop eines interessierenden Antigens kombiniert, kann untersucht werden, die Bestimmung einer Sequenz, die ein antigenes Epitop imitiert, kann zur Entwicklung von Impfstoffen führen, bei dem das Immunogen auf einer oder mehreren derartigen Sequenzen basiert, oder kann zur Entwicklung von verwandten diagnostischen Mitteln oder Verbindungen führen, die bei therapeutischen Behandlungen, wie von Autoimmunerkrankungen, brauchbar sind.
    • c) Nucleinsäuren: Identifizierung eines Liganden, wie eines Proteins oder einer RNA, für Bindungsstellen.
    • d) katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die imstande sind, eine chemische Reaktion zu fördern, die die Umwandlung eines oder mehrerer Reaktanden in ein oder mehrere Produkte einschließt; derartige Polypeptide umfassen im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die spezifisch für mindestens einen Reaktanden oder ein Reaktionszwischenprodukt ist, und eine aktive Funktionalität benachbart zu der Bindungsstelle, worin die Funktionalität imstande ist, den gebundenen Reaktanden chemisch zu verändern. [siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,215,899 ];
    • e) Hormonrezeptoren: die Ermittlung der Liganden, die mit einer hohen Affinität an einen Rezeptor binden, ist nützlich für die Entwicklung von Hormonersatztherapien; die Identifizierung von Liganden, die an derartige Rezeptoren binden, kann beispielsweise zur Entwicklung von Arzneimitteln für die Kontrolle des Blutdrucks führen.
    • f) Opiatrezeptoren: die Ermittlung der Liganden, die an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich für die Entwicklung von weniger süchtig machenden Ersatzstoffen für Morphin und verwandte Arzneimittel.
  • So wie der Begriff "Antikörper" hier verwendet wird, schließt er Antikörperfragmente, wie Fab-Fragmente, ein, die aus einer leichten Kette und dem variablen Bereich einer schweren Kette zusammengesetzt sind.
  • So wie der Begriff "Antikörper-Konjugat" verwendet wird, bezieht er sich auf ein Konjugat, in dem das Ansteuerungsmittel ein Antikörper ist.
  • So wie der Begriff "Antikörperaktivierung" hier verwendet wird, bezieht er sich auf den Vorgang, durch den aktivierte Antikörper erzeugt werden. Antikörper werden durch die Umsetzung mit einem Linker, wie einem heterobifunktionellen Reagens, aktiviert.
  • So wie der Begriff "chirurgisches Betrachten" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jedes Verfahren, bei dem in dem Körper eines Tieres eine Öffnung erzeugt wird. Derartige Verfahren schießen herkömmliche chirurgische Eingriffe und diagnostische Verfahren ein, wie Laparoskopien und arthroskopische Verfahren.
  • So wie der Begriff "humanisierte Antikörper" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Antikörper, die so verändert sind, dass sie "humane" Aminosäuresequenzen einschließen, damit die Verabreichung beim Menschen keine Immunantwort auslöst. Verfahren für die Herstellung derartiger Antikörper sind bekannt. Das Hybridom, das den monoklonalen Antikörper exprimiert, wird beispielsweise durch re kombinante DNA-Techniken so verändert, dass es einen Antikörper exprimiert, in dem die Aminosäurezusammensetzung der nicht variablen Regionen auf humanen Antikörpern basiert. Es sind Computerprogramme entwickelt worden, um derartige Regionen zu identifizieren.
  • So wie die Begriffe "ATP, AMP, NAD+ und NADH" hier verwendet werden, beziehen sie sich auf Adenosintriphosphat, Adenosinmonophosphat, Nicotinamidadenindinucleotid (oxidierte Form) bzw. Nicotinamidadenindinucleotid (reduzierte Form).
  • So wie der Ausdruck "Herstellung durch rekombinante Mittel unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren" hier verwendet wird, bedeutet er die Anwendung der wohlbekannten Verfahren der Molekularbiologie für die Expression von Proteinen, die von klonierter DNA codiert werden.
  • So wie der Ausdruck "im Wesentlichen identisch mit einem Produkt" hier verwendet wird, bedeutet er so ausreichend ähnlich, dass die interessierende Eigenschaft ausreichend unverändert ist, so dass das im Wesentlichen identische Produkt anstelle des Produkts verwendet werden kann.
  • So wie der Begriff "äquivalent" hier verwendet wird, wenn es um zwei Nucleinsäuresequenzen geht, bedeutet er, dass die beiden besagten Sequenzen die gleiche Aminosäuresequenz oder äquivalente Protein codieren. Wenn der Begriff "äquivalent" verwendet wird, um auf zwei Proteine oder Peptide zu verweisen, bedeutet er, dass die beiden Proteine oder Peptide eine im Wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz ausschließlich mit konservativen Aminosäuresubstitutionen haben (siehe z. B. Tabelle 1 weiter oben), die die Aktivität oder die Funktion des Proteins oder Peptids nicht wesentlich verändern. Wenn sich "ä quivalent" auf eine Eigenschaft bezieht, muss die Eigenschaft nicht im gleichen Ausmaß vorhanden sein (z. B. können zwei Peptide verschiedene Geschwindigkeiten des gleichen Typs einer enzymatischen Aktivität zeigen), aber die Aktivitäten sind vorzugsweise im Wesentlichen gleich. "Komplementär" bedeutet, wenn sich der Begriff auf zwei Nucleotidsequenzen bezieht, dass die beiden Nucleotidsequenzen imstande sind, zu hybridisieren, vorzugsweise mit weniger als 25%, noch bevorzugter mit weniger als 15%, noch bevorzugter mit weniger als 5% und am bevorzugtesten ohne falsche Basenpaarungen zwischen gegenüberliegenden Nucleotiden. Die beiden Moleküle hybridisieren vorzugsweise unter hohen Stringenzbedingungen.
  • Wie hier verwendet ist die Stringenz der Hybridisierung bei der Bestimmung des prozentualen Anteils falscher Basenpaarungen wie folgt:
    • 1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
    • 2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
    • 3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
  • Offensichtlich können äquivalente Stringenzen unter Verwendung alternativer Puffer, Salze und Temperaturen erzielt werden.
  • Der Ausdruck "im Wesentlichen" identisch oder homolog oder ähnlich variiert mit dem Zusammenhang, wie er vom Fachmann auf dem relevanten Fachgebiet verstanden wird, und er bedeutet im Allgemeinen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, noch bevorzugter mindestens 90% und am bevorzugtesten mindestens 95% Identität.
  • So wie der Begriff "Zusammensetzung" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jedes beliebige Gemisch. Es kann sich um eine Lösung, eine Suspension, eine Flüssigkeit, ein Pulver, eine Paste, wässrig, nicht wässrig, oder jede Kombination davon handeln.
  • So wie der Begriff "Kombination" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jede beliebige Vereinigung von zwei oder mehr als zwei Einheiten oder Artikeln.
  • So wie der Begriff "Fluid" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jede Zusammensetzung, die zu fließen vermag. Fluide umfassen demnach Zusammensetzungen, die in Form von halbfesten Stoffen, Pasten, Lösungen, wässrigen Gemischen, Gelen, Lotionen, Cremes und anderen derartigen Zusammensetzungen vorliegen.
  • Beispiele für Rezeptoren und Anwendungen unter Verwendung derartiger Rezeptoren schließen die folgenden Beispiele ein, sind aber nicht auf diese beschränkt:
    • a) Enzyme: spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überleben von Mikroorganismen wesentlich sind, die als Ziele für die antiobiotische Selektion (Ligand) dienen können;
    • b) Antikörper: die Identifizierung einer Liganden-bindenden Stelle auf dem Antikörpermolekül, die mit dem Epitop eines interessierenden Antigens kombiniert, kann untersucht werden. Die Bestimmung einer Sequenz, die ein antigenes Epitop imitiert, kann zur Entwicklung von Impfstoffen führen, bei denen das Immunogen auf einer oder mehreren derartigen Sequenzen basiert, oder kann zur Entwicklung von verwandten diagnostischen Mitteln oder Verbindungen führen, die bei therapeutischen Behandlungen, wie von Autoimmunerkrankungen, brauchbar sind.
    • c) Nucleinsäuren: Identifizierung von Liganden-Bindungsstellen, wie eines Proteins oder einer RNA.
    • d) katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die imstande sind, eine chemische Reaktion zu fördern, die die Umwandlung eines oder mehrerer Reaktanden in ein oder mehrere Produkte einschließt; derartige Polypeptide umfassen im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die spezifisch für mindestens einen Reaktanden oder ein Reaktionszwischenprodukt ist, und eine aktive Funktionalität benachbart zu der Bindungsstelle, wobei die Funktionalität imstande ist, den gebundenen Reaktanden chemisch zu verändern. [siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,215,899 ];
    • e) Hormonrezeptoren: die Ermittlung von Liganden, die mit einer hohen Affinität an einen Rezeptor binden, ist nützlich für die Entwicklung von Hormonersatztherapien; die Identifizierung von Liganden, die an derartige Rezeptoren binden, kann beispielsweise zur Entwicklung von Arzneimitteln für die Kontrolle des Blutdrucks führen.
    • f) Opiatrezeptoren: die Ermittlung von Liganden, die an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich für die Entwicklung von weniger süchtig machenden Ersatzstoffen für Morphin und verwandte Arzneimittel.
  • So wie der Begriff "komplementär" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die topologische Kompatibilität oder die Übereinstimmung ("matching") wechselwirkender Oberflächen eines Ligandenmoleküls und seines Rezeptors. Demnach können der Rezeptor und sein Ligand als komplementär beschrieben werden, und weiterhin sind die Kontaktoberflächeneigenschaften zueinander komplementär.
  • So wie der Begriff "Ligand-Rezeptor-Paar" hier verwendet wird, handelet es sich um einen Komplex, der gebildet wird, wenn zwei Makromoleküle durch molekulare Erkennung unter Bildung eines Kornplexes miteinander kombinieren.
  • So wie der Begriff "Träger" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jede Matrix, die entweder direkt oder nach einer geeigneten Derivatisierung als ein fester Träger für chemische Synthesen, Assays und andere derartige Verfahren verwendet wird. Bevorzugte Träger sind hier Siliciumträger oder silicierte Träger, die auf der Oberfläche derivatisiert sind, die für die Anbindung von Anti-Liganden und Liganden und anderer Makromoleküle, eingeschlossen die fluoreszierenden Proteine, Phycobili-Proteine und andere die Emission verschiebende Stoffe, vorgesehen sind.
  • So wie der Begriff "Matrix" hier verwendet wird, bezieht er sich auf jeden festen oder halbfesten oder unlöslichen Träger, auf dem das interessierende Molekül, typischerweise ein biologisches Molekül, Makromolekül, organisches Molekül oder biospezifischer Ligand, angebunden ist oder mit dem es in Kontakt gebracht wird. Typischerweise ist eine Matrix ein Trägermaterial, das eine steife oder halbsteife Oberfläche hat. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Trägers im Wesentlichen flach, obwohl es in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein kann, Syntheseregionen für verschiedene Polymere beispielsweise mit Vertiefungen, erhöhten Regionen, geätzten Gräben oder einer anderen derartigen Topologie physikalisch zu trennen. Matrixmaterialien schließen beliebige Materialien ein, die als Affinitätsmatrizes oder Träger für chemische und biologische Molekülsynthesen und -analysen verwendet werden, wie nicht einschränkend: Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Nylon, Glas, Dextran, Chitin, Sand, Bims, Polytetrafluorethylen, Agarose, Polysaccharide, Dendrimere, Fullerene, Polyacrylamid, nicht kovalen tes Kieselguhr-Polyacrylamid-Verbundmaterial, kovalentes Polystyrol-Polyacrylamid-Verbundmaterial, Polystyrol-PEG-(Polyethylenglycol)-Verbundmaterial, Silicium, Gummi und andere Materialien, die als Träger für Festphasensynthesen, Affinitätstrennungen und -reinigungen, Hybridisierungsreaktionen, Immunoassays und andere derartige Anwendungen verwendet werden.
  • So wie der Begriff "Befestigungsschicht" hier verwendet wird, beziehat er sich auf die Oberfläche der Chipvorrichtung, an die Moleküle gebunden sind. Der Chip ist typischerweise eine Halbleitervorrichtung, die auf mindestens einem Teil der Oberfläche beschichtet ist, um sie für das Anbinden von Molekülen geeignet zu machen und inert gegenüber beliebigen Reaktionen zu machen, denen die Vorrichtung ausgesetzt ist. Moleküle werden direkt oder indirekt mit der Oberfläche verbunden, wobei die Bindungen durch Absorption oder Adsorption, durch kovalente Bindungen, ionische Wechselwirkungen oder eine beliebige andere Wechselwirkung erreicht werden kann. Wo erforderlich ist die Befestigungsschicht, wie durch eine Derivatisierung, für die Anbindung der Moleküle angepasst.
  • B. BIOLUMINESZENZ-ERZEUGENDE SYSTEME UND KOMPONENTEN
  • Das Folgende ist eine Beschreibung von Biolumineszenz-erzeugenden Systemen und deren Komponenten. Diese Luciferasen und Luciferine und fluoreszierenden Protein können mit den hier bereitgestellten Luciferasen und GFPs verwendet werden.
  • 1. Beispielhafte Biolumineszenz-erzeugende Systeme
  • Ein Biolumineszenz-erzeugendes System bezieht sich auf die Komponenten, die notwendig und hinreichend sind, um Biolumineszenz zu erzeugen. Diese schließen eine Luciferase, ein Luciferin und alle sonstigen notwendigen Cofaktoren oder Bedingungen ein. Praktisch jedes Biolumineszenz-erzeugende System, das dem Fachmann bekannt ist, ist zugänglich für die Verwendung in den Vorrichtungen, Systemen, Kombinationen und Verfahren, die hier bereitgestellt werden. Faktoren, die bei der Auswahl eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems berücksichtigt werden müssen, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: das Ansteuerungsmittel, das in Kombination mit der Biolumineszenz verwendet wird; das Medium, in dem die Reaktion durchgeführt wird; die Stabilität der Komponenten, wie Temperatur- oder pH-Empfindlichkeit; Haltbarkeit der Komponenten; Nachhaltigkeit der Lichtemission, ob sie konstant oder vorübergehend ist; Verfügbarkeit der Komponenten; gewünschte Lichtintensität; Farbe des Lichts; und andere derartige Faktoren.
  • a. Allgemeine Beschreibung
  • Im Allgemeinen bezieht sich Biolumineszenz auf eine energieliefernde chemische Reaktion, bei der ein spezielles chemisches Substrat, ein Luciferin, eine Oxidation durchmacht, die von einem Enzym, einer Luciferase, katalysiert wird. Biolumineszenzreaktionen können leicht aufrechterhalten werden, da sie nur das Nachfüllen von verbrauchtem Luciferin oder eines anderen Substrats oder Cofaktors oder eines anderen Proteins erfordert, damit die Reaktion fortgesetzt wird oder wieder auflebt. Biolumineszenz-erzeugende Reaktionen sind dem Fachmann wohlbekannt, und jede derartige Reaktion kann an die Verwendung in Kombination mit Herstellungsgegenständen, wie sie hier beschrieben werden, angepasst werden.
  • Es gibt zahlreiche Organismen und Quellen für Biolumineszenz-erzeugende Systeme, und einige repräsentative Gattungen und Arten, die Biolumineszenz zeigen, werden in der folgenden Tabelle offenbart (teilweise kopiert von Hastings in (1995) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis (Hrsg.), Academic Press, S. 665–681): TABELLE 2 Repräsentative leuchtende Organismen
    Typ des Organismus Repräsentative Gattungen
    Bakterien Photobacterium
    Vibrio
    Xenorhabdus
    Pilze Panus, Armillaria
    Pleurotus
    Gonyaulax
    Pyrocystis
    Dinoflagellaten Noctiluca
    Cnidaria (Coelenterata)
    Qualle Aequorea
    Polyp Obelia
    Seefeder Renella
    Ctenophora Mnemiopsis
    Beroe
    Anneliden
    Erdwürmer Diplocardia
    Marine Polychaeta Chaetopterus, Phtyxotrix
    Sylliden-Feuerwurm Odontosyllis
    Mollusken
    Napfschnecke Latia
    Muschel Pholas
    Kalmar Heteroteuthis
    Heterocarpus
    Crustacea
    Ostracoda Vargula (Cypridina)
    Garnelen (Ephasia) Meganyctiphanes
    Acanthephyra
    Oplophorus
    Gnathophausia
    Decapoda Sergestes
    Copepoda
    Insekten
    Coleoptera (Käfer)
    Leuchtkäfer Photinus, Photuris
    Schnellkäfer Pyrophorus
    Railroadwurm Phengodes, Phrixothrix
    Diptera (Fliegen) Arachnocampa
    Echinodermata
    Schlangensterne Ophiopsila
    Seewalzen Laetmogone
    Chordata
    Tunicata Pyrosoma
    Fische
    Knorpelfische Squalus
    Knochenfische
    Ponyfisch Leiognathus
    Blitzlichtfisch Photoblepharon
    Anglerfisch Cryptopsaras
    Bootsmannfisch Porichthys
    Laternenfisch Benia
    Weichstrahlenfisch Aristostomias
    Silberbeil-Fisch Argryopelecus
    und andere Fische Pachystomias
    Malacosteus
    Pelagialfisch Cyclothone
    Neoscopelus
    Tarletonbeania
  • Andere biolumineszierende Organismen, die für die Verwendung hier in Betracht gezogen werden, sind Gonadostomias, Gaussia (Copepoden), Watensia, Halisturia, Vampirtintenfisch, Glyphus, Mycotophiden (Fisch), Vinciguerria, Howella, Florenciella, Chaudiodus, Melanocostus und Seefedern.
  • Ganz offensichtlich kann ein Biolumineszenz-erzeugendes System aus natürlichen Quellen isoliert werden, wie denjenigen in der obigen Tabelle, es kann aber auch synthetisch hergestellt werden. Zusätzlich müssen die Komponenten für die Verwendung hier nur ausreichend rein sein, damit ein Gemisch davon unter geeigneten Reaktionsbedingungen ein Leuchten produziert, durch das Zellen und Gewebe während eines chirurgischen Eingriffs sichtbar gemacht werden können.
  • Demnach kann ein Rohextrakt oder das Zermahlen des Organismus angemessen sein. Ganz allgemein werden jedoch im Wesentlichen reine Komponenten verwendet. Die Komponenten können auch synthetische Komponenten sein, die nicht aus natürlichen Quellen isoliert werden. DNA, die Luciferasen codiert, steht zur Verfügung (siehe z. B. SEQ ID NO: 1–13) und ist modifiziert worden (siehe z. B. SEQ ID NO: 3 und 10–13), und synthetische und alternative Substrate sind ausgedacht worden. Die DNA, die hier aufgezählt wird, ist nur repräsentativ für die DNA, die Luciferasen codiert, die verfügbar ist.
  • Alle Biolumineszenz-erzeugenden Systeme, unabhängig davon, ob sie synthetisch sind oder aus natürlichen Quellen isoliert werden, wie diejenigen, die in Tabelle 2 oder hier an anderer Stelle offenbart werden oder die dem Fachmann bekannt sind, sind für die Verwendung in den hier bereitgestellten Kombinationen und Systemen vorgesehen. Chemilumineszenzsysteme an sich, die nicht auf Oxygenasen (Luciferasen) zurückgreifen, sind hier nicht umfasst.
  • (1) Luciferasen
  • Die ausgerichteten bzw. adressierten Substanzen hier schließen Luciferasen oder Luciferine ein. Luciferasen bezieht sich auf jede Verbindung, die in Gegenwart aller notwendigen Aktivatoren die Oxidation eines Biolumineszenz-Substrats (Luciferin) in Gegenwart von molekularem Sauerstoff, unabhängig davon, ob dieser frei oder gebunden vorliegt, von einem niedrigeren Energiezustand in einen höheren Energiezustand katalysiert, so dass das Substrat bei der Rückkehr in den niedrigeren Energiezustand Licht emittiert. Für die Zwecke hier wird der Begriff Luciferase so allgemein verwendet, dass er Enzyme, die katalytisch wirken und dabei Licht durch die Oxidation eines Substrats erzeugen, und auch Photoproteine, wie Aequorin, umfasst, die, wenngleich nicht streng katalytisch (da diese Proteine bei der Umsetzung verbraucht werden), in Verbindung mit einem Substrat in Gegenwart von Sauerstoff unter Erzeugung von Licht wirken. Diese Luciferasen, eingeschlossen die Photoproteine, wie Aequorin, werden hier ebenfalls unter den Luciferasen zusammengefasst. Diese Reagenzien schließen die natürlich vorkommenden Luciferasen (eingeschlossen Photoproteine), die Proteine, die durch rekombinante DNA erzeugt werden, und die mutierten oder modifizierten Varianten davon, die die Fähigkeit zur Erzeugung von Licht in Gegenwart eines geeigneten Substrats, von Cofaktoren und Aktivatoren, erhalten haben, und jedes beliebige sonstige Protein, das die Wirkung eines Katalysators hat, ein Substrat zu oxidieren, durch die Licht erzeugt wird, ein.
  • Allgemein wird das Protein, das die Biolumineszenzreaktion katalysiert oder initiiert, als eine Luciferase bezeichnet, und das oxidierbare Substrat wird als ein Luciferin bezeichnet. Das oxidierte Reaktionsprodukt wird als Oxyluciferin bezeichnet, und bestimmte Luciferin-Vorläufer werden als Etioluciferin bezeichnet. Für die Zwecke hier umfasst der Ausdruck Biolumineszenz das Licht, das durch Reaktionen erzeugt wird, die (im Fall von Luciferasen, die enzymatisch wirken) durch ein biologisches Protein oder ein Analogon, ein Derivat oder eine Mutante davon katalysiert werden oder die (im Fall der Photoproteine, wie Aequorin, das in der Reaktion nicht regeneriert wird) durch ein biologisches Protein oder ein Analogon, ein Derivat oder eine Mutante davon initiiert werden.
  • Aus Gründen der Klarheit werden diese katalytischen Proteine hier als Luciferasen bezeichnet und schließen die Enzyme, wie die Luciferasen, die die Oxidation von Luciferin katalysieren, Licht emittieren und Oxyluciferin freisetzen, ein. Ebenfalls eingeschlossen unter den Luciferasen sind die Photoproteine, die die Oxidation von Luciferin unter Lichtemission katalysieren, die jedoch bei der Umsetzung verändert werden und die wieder hergestellt werden müssen, um erneut verwendet zu werden. Die Luciferasen können natürlich vorkommend sein, oder sie können modifiziert sein, wie gentechnisch modifiziert sein, um bestimmte Eigenschaften zu verbessern oder zu verändern. So lange das resultierende Molekül die Fähigkeit beibehält, die Biolumineszenzreaktion zu katalysieren, ist es hier eingeschlossen.
  • Jedes Protein, das eine Luciferase-Aktivität hat (ein Protein, das die Oxidation eines Substrats in Gegenwart von molekularem Sauerstoff unter Erzeugung von Licht katalysiert, wie dies hier definiert ist), kann verwendet werden. Die bevorzugten Luciferasen sind diejenigen, die hier beschrieben werden oder die kleinere Sequenzabweichungen haben. Derartige kleinere Sequenzabweichungen schließen nicht ein schränkend kleinere Allelabweichungen oder Artabweichungen und Insertionen oder Deletionen von Resten, vor allem von Cysteinresten, ein. Geeignete konservative Substitutionen von Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt und können im Allgemeinen erzeugt werden, ohne dass dadurch die biologische Aktivität des resultierenden Moleküls verändert wird. Derartige Substitutionen werden vorzugsweise den Substitutionen entsprechend erzeugt, die in der oben beschriebenen TABELLE 1 offenbart werden.
  • Die Luciferasen können im Handel erworben werden, aus natürlichen Quellen isoliert werden, in Wirtszellen unter Verwendung von DNA, die die Luciferase codiert, exprimiert werden oder in jeder sonstigen Weise erhalten werden, die dem Fachmann bekannt ist. Für die Zwecke hier können Rohextrakte, die durch das Zermahlen ausgewählter Quellorganismen erhalten werden, ausreichend sein. Da große Mengen der Luciferase erwünscht sein können, ist die Isolierung der Luciferase aus Wirtszellen bevorzugt. Die DNA für derartige Zwecke ist weit verbreitet verfügbar, wie dies auch die modifizierten Formen davon sind.
  • Beispiele für Luciferasen schließen nicht einschränkend diejenigen ein, die aus den Ctenophoren Mnemiopsis (Mnemiopsin) und Beroe ovata (Berovin) isoliert werden, diejenigen, die aus den Coelenteraten Aequorea (Aequorin), Obelia (Obelin), Pelagia, isoliert werden, die Renilla-Luciferase, die Luciferasen, die aus den Mollusken Pholas (Pholasin) isoliert werden, die Luciferasen, die aus Fischen isoliert werden, wie Aristostomias, Pachystomias und Poricthys, und aus den Ostracoden, wie Cypridina (auch als Vargula bezeichnet), isoliert werden. Bevorzugte Luciferasen sind das Aequorin-Protein, die Renilla-Luciferase und die Cypridina-Luciferase (auch als Vargula bezeichnet) (siehe z. B. SEQ ID NO: 1, 2 und 4–13). Ebenfalls bevorzugt sind die Luciferasen, die unter Erzeugung von rotem Licht und/oder Licht im nahen Infrarot reagieren. Diese schließen die Luciferasen ein, die in Arten von Aristostomias, wie A. scintillans, Pachystomias, Malacosteus, wie M. niger, gefunden werden.
  • (2) Luciferine
  • Die Substrate für die Reaktion oder für den Einschluss in die Konjugate schließen beliebige Moleküle ein, mit denen die Luciferase unter Erzeugung von Licht reagiert. Derartige Moleküle schließen die natürlich vorkommenden Substrate, die modifizierten Formen davon und synthetische Substrate ein (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,374,534 und 5,098,828 ). Beispielhafte Luciferine schließen diejenigen ein, die hier beschrieben werden, wie Derivate davon, Analoga davon, synthetische Substrate, wie Dioxetane (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,004,565 und 5,455,357 ), und andere Verbindungen, die von einer Luiferase in einer lichterzeugenden Reaktion oxidiert werden (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,374,534 , 5,098,828 und 4,950,588 ). Derartige Substrate können auch empirisch identifiziert werden, indem Verbindungen ausgewählt werden, die in einer Biolumineszenzreaktion oxidiert werden.
  • (3) Aktivatoren
  • Die Biolumineszenz-erzeugenden Systeme benötigen außerdem zusätzliche Komponenten, die hier diskutiert werden und die dem Fachmann bekannt sind. Alle Biolumineszenzreaktionen benötigen molekularen Sauerstoff in der Form von gelöstem oder gebundenem Sauerstoff. Demnach ist molekularer Sauerstoff, gelöst in Wasser oder in Luft oder gebunden an ein Photoprotein, der Aktivator für Biolumineszenzreaktionen. In Abhängigkeit von der Form der Komponenten schließen anderen Aktivatoren nicht einschränkend ATP (für die Leuchtkäfer-Luciferase), die Flavin-Reduktase (bakterielle Systeme) für die Regeneration von FMNH2 aus FMN, und Ca2+ oder andere geeignete Metallionen (Aequorin) ein.
  • Die meisten der hier bereitgestellten Systeme erzeugen Licht, wenn die Luciferase und das Luciferin vermischt und Luft oder Wasser ausgesetzt werden. Die Systeme, die Photoproteine verwenden, die gebundenen Sauerstoff haben, wie Aequorin, müssen jedoch Ca2+ ausgesetzt werden (oder einem anderen geeigneten Metallion), das in Form einer wässrigen Zusammensetzung eines Calciumsalzes bereitgestellt werden kann. In diesen Fällen führt die Zugabe von Ca2+ (oder anderer geeigneter Metallionen) zu einem Gemisch aus Luciferase (Aequorin) und Luciferin (wie Coelenterazin) zur Erzeugung von Licht. Das Renilla-System und andere Anthozoa-Systeme benötigen ebenfalls Ca2+ (oder ein anderes geeignetes Metallion).
  • Wenn Rohzubereitungen verwendet werden, wie gemahlene Cypridina (Garnelen) oder gemahlene Leuchtkäfer, kann es sein, dass nur Wasser zugegeben werden muss. In Fällen, in denen Leuchtkäfer (oder ein Leuchtkäfer- oder Käferluciferase) verwendet werden, kann es sein, dass nur ATP zu der Reaktion zugegeben werden muss. Die genauen Komponenten sind dem Fachmann im Lichte der hier vorliegenden Offenbarung ersichtlich oder können leicht empirisch ermittelt werden.
  • Es versteht sich weiterhin, dass diese Gemische auch beliebige zusätzliche Salze oder Puffer oder Ionen enthalten, die für den Ablauf jeder Reaktion erforderlich sind. Da diese Reaktionen gut charakterisiert sind, sind die Fachleute imstande, die genauen Mengenanteile und die erforderlichen Komponenten zu bestimmen. Die Auswahl der Komponenten hängt von der Vorrichtung, dem Herstellungsgegenstand und der Luciferase ab. Verschiedene Ausführungsformen wer den hier beschrieben und beispielhaft dargestellt; angesichts dieser Beschreibung werden andere Ausführungsformen ersichtlich.
  • (4) Reaktionen
  • In allen Ausführungsformen werden bis auf eine Komponente, entweder die Luciferase oder das Luciferin, alle Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden System vermischt oder miteinander verpackt oder anderweitig kombiniert. Die verbleibende Komponente ist an ein Ansteuerungsmittel als Konjugat gebunden und ist dafür vorgesehen, einem Tier verabreicht zu werden.
  • Vor einem chirurgischen Verfahren wird das Konjugat auf einem beliebigen geeigneten Weg verabreicht, wodurch das Ansteuerungsmittel auf Grund seiner spezifischen Wechselwirkung mit einem gewebespezifischen Zelloberflächenprotein an das anvisierte Gewebe bindet.
  • Während des chirurgischen Eingriffs wird das Gewebe mit der oder den übrigen Komponenten) in Kontakt gebracht, typischerweise durch das Besprühen des Gebietes oder durch eine lokale Injektion, und jedes Gewebe, an das Konjugat gebunden ist, leuchtet. Das Leuchten sollte ausreichend sein, um es bei gedämpftem Licht oder erforderlichenfalls im Dunkeln zu sehen.
  • Da im Allgemeinen das zu erreichende Ergebnis die Erzeugung von Licht, das mit dem bloßen Auge gesehen werden kann, für qualitative, nicht quantitative diagnostische Zwecke ist, müssen die genauen Mengeverhältnisse und Mengen der Komponenten der Biolumineszenzreaktion nicht streng ermittelt oder eingehalten werden. Sie müssen ausreichend sein, damit es zur Erzeugung von Licht kommt. Im Allgemeinen wird eine Menge Luciferin und Luciferase verwendet, die ausreichend ist, um ein sichtbares Leuchten zu erzeugen; diese Menge kann leicht empirisch ermittelt werden und hängt von dem ausgewählten System und der ausgewählten Anwendung ab. Wo quantitative Messungen benötigt werden, kann eine höhere Präzision erforderlich sein.
  • Für die Zwecke hier entspricht eine derartige Menge vorzugsweise mindestens den Konzentrationen und Mengenverhältnissen, die vom Fachmann für analytische Zwecke verwendet werden: Höhere Konzentrationen können verwendet werden, wenn das Leuchten nicht ausreichend hell ist. Alternativ kann ein Mikroträger, der an mehr als ein Luciferasemolekül gekoppelt ist, der mit einem Ansteuerungsmittel verknüpft ist, verwendet werden, um die Signalstärke zu erhöhen. Da außerdem die Bedingungen, unter denen die Reaktionen verwendet werden, keine Laborbedingungen sind und die Komponenten einer Lagerung unterzogen werden, kann eine höhere Konzentration verwendet werden, um jeden Aktivitätsverlust zu überwinden. Typischerweise betragen die Mengen 1 mg, vorzugsweise 10 mg und noch bevorzugter 100 mg einer Luciferase pro Liter Reaktionsgemisch oder 1 mg, vorzugsweise 10 mg, noch bevorzugter 100 mg. Die Zusammensetzungen können mindestens etwa 0,01 mg/l und typischerweise 0,1 mg/l, 1 mg/l, 10 mg/l oder mehr einer jeden Komponente auf dem Gegenstand enthalten. Die Menge Luciferin liegt ebenfalls zwischen etwa 0,01 und 100 mg/l, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/l, zusätzliches Luciferin kann zu vielen der Reaktionen gegeben werden, um die Reaktion fortdauern zu lassen. In Ausführungsformen, in denen die Luciferase katalytisch wirkt und nicht regeneriert werden muss, können geringere Mengen Luciferase verwendet werden. In denjenigen Ausführungsformen, in denen sie während der Reaktion verändert wird, kann sie auch wieder nachgefüllt werden; typischerweise werden höhere Konzentrationen ausgewählt. Konzentrationsbereiche pro Liter (oder die Menge der Beschichtung auf dem Träger, die aus dem Kontaktieren mit einer derartigen Zusammenset zung resultiert) einer jeden Verbindung in der Größenordnung von 0,1 bis 20 mg, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg, noch bevorzugter im Bereich von etwa 1 bis 10 mg einer jeden Komponente, sind ausreichend. Wenn beschichtete Träger wie hier beschrieben hergestellt werden, können größere Mengen der Beschichtungszusammensetzungen, die höhere Konzentrationen der Luciferase oder des Luciferins enthalten, verwendet werden.
  • Beispielsweise leuchten 5 mg Luciferin, wie Coelenterazin, in Gegenwart von Calcium in einem Liter Wasser in Abhängigkeit von der Temperatur des Wassers mindestens etwa 10 bis 20 min hell, wenn etwa 10 mg Luciferase, wie Aequorin-Photoprotein-Luciferase oder Luciferase von Renilla, dazugegeben werden. Das Erhöhen der Konzentration der Luciferase beispielsweise auf 100 mg/l sorgt für eine besonders brillante Lichtanzeige.
  • Es ist offensichtlich, dass die Konzentrationen und Mengen, die verwendet werden sollen, von dem ausgewählten Biolumineszenz-erzeugenden System abhängen, aber diese können leicht empirisch ermittelt werden. Mengenverhältnisse, vor allem diejenigen, die verwendet werden, wenn eine empirische Bestimmung beginnt, sind im Allgemeinen diejenigen, die für analytische Zwecke verwendet werden, und die Mengen oder Konzentrationen sind mindestens diejenigen, die für analytische Zwecke verwendet werden, die Mengen können aber erhöht werden, vor allem wenn ein anhaltendes und helleres Leuchten erwünscht sind.
  • 2. Das Renilla-System
  • Renilla, auch bekannt als Seefeder-Weichkorallen ("sea pansy"), sind Mitglieder der Klasse der Coelenteraten Anthozoa, die andere biolumineszierende Gattungen, wie Cavarnularia, Ptilosarcus, Stylatula, Acanthoptilum und Parazoanthus einschließt. Biolumineszierende Arten der Gattung Anthozoa enthalten Luciferasen und Luciferine, die hinsichtlich der Struktur ähnlich sind (siehe z. B. Comier et al. (1973) J. Cell. Physiol. 81: 291–298; siehe auch Ward et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 2530–2534). Die Luciferasen und Luciferine all dieser Anthozoane zeigen untereinander eine Kreuzreaktion und erzeugen eine charakteristische blaue Lumineszenz.
  • Renilla-Luciferase und die anderen Coelenterat- und Ctenophor-Luciferasen, wie das Aequorin-Photoprotein, verwenden Imidazopyrazin-Substrate, vor allem die Substrate, die gattungsgemäß als Coelenterazin bezeichnet werden (siehe die Formeln (I) und (II) in obigem Abschnitt B.1.b). Andere Gattungen, die Luciferasen haben, die ein Coelenterazin verwenden, schließen ein: Kalmare, wie Chiroteuthis, Eucleoteuthis, Onychoteuthis, Watasenia, Tintenfisch, Sepiolina; Garnelen, wie Oplophorus, Acanthophyra, Sergestes und Gnathophausia; Tiefseefische, wie Aryropelecus, Yarella, Diaphus, Gonadostomias und Neoscopelus ein.
  • Renilla-Luciferase hat jedoch keinen gebundenen Sauerstoff und benötigt daher gelösten Sauerstoff, um Licht in Gegenwart eines geeigneten Luciferin-Substrats zu erzeugen. Da die Renilla-Luciferase wie ein echtes Enzym wirkt (d. h. es muss für die weitere Verwendung nicht wieder hergestellt werden), kann die resultierende Lumineszenz in Gegenwart von Sättigungsmengen an Luciferin lang andauernd sein. Renilla-Luciferase ist außerdem relativ stabil gegenüber Hitze.
  • Renilla-Luciferasen, DNA, die Renilla reniformis-Luciferase codiert, und die Verwendung der Renilla reniformis-DNA für die Herstellung von rekombinanter Luciferase sowie DNA, die die Luciferase von anderen Coelenteraten codiert, sind wohlbekannt und verfügbar (siehe z. B. SEQ ID NO: 1, U.S.-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658 ; siehe auch Prasher et al. (1985) Biochem. Bioophys. Res. Commun. 126: 1259–1268; Cormier (1981) "Renilla and Aequorea bioluminescence" in Bioluminescence and Chemiluminescence, S. 225–233; Charbonneau et al. (1979) J. Biol. Chem. 254: 769–780; Ward et al. (1979) J. Biol. Chem. 254: 781–788; Lorenz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 4438–4442; Hori et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 4285–4287; Hori et al. (1975) Biochemistry 14: 2371–2376; Hori et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 4285–4287; Inouye et al. (1975) Jap. Soc. Chem. Lett. 141m144; und Matthews et al. (1979) Biochemistry 16: 85–91). Die DNA, die die Renilla-reniformis-Luciferase codiert, und Wirtszellen, die eine derartige DNA enthalten, stellen ein bequemes Mittel für die Herstellung großer Mengen des Renilla-reniformis-Enzyms dar, wie in diejenigen, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658 , die die rekombinante Erzeugung der Renilla reniformis-Luciferase beschreiben).
  • Die Renilla-Luciferase kann in lyophilisierter Form, verkapselt in einem Vehikel, entweder allein oder in Kombination mit dem Luciferin-Substrat, verpackt werden. Vor der Verwendung wird das Gemisch mit einer wässrigen Zusammensetzung, vorzugsweise einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung pH 7–8, in Kontakt gebracht. Gelöster O2 aktiviert die Reaktion. Endkonzentrationen der Luciferase in dem leuchtenden Gemisch liegen in der Größenordnung von 0,01 bis 1 mg/l oder darüber. Die Konzentrationen des Luciferins betragen mindestens etwa 10–4 M, sind aber 1 bis 100 Größenordnungen größer, um eine lang andauernde Biolumineszenz zu erzeugen.
  • Etwa 1 bis 10 mg oder vorzugsweise 2–5 mg, noch bevorzugter etwa 3 mg Coelenterazin werden mit etwa 100 mg Renilla-Luciferase verwendet. Die genauen Mengen können selbstverständlich empirisch bestimmt werden und hängen auch in gewissem Maß von der End konzentration und der Anwendung ab. Insbesondere war die Zugabe von etwa 0,25 ml eines Rohextrakts der Bakterien, die Renilla exprimieren, zu 100 ml eines geeigneten Assay-Puffers und etwa 0,005 μg ausreichend, um ein sichtbares und lang andauerndes Leuchten zu erzeugen (siehe U.S.-Patente Nr. 5,418,155 und 5292,658 , die die rekombinante Erzeugung von Renilla-reniformis-Luciferase beschreiben).
  • Lyophilisierte Gemische und Zusammensetzungen, die die Renilla-Luciferase enthalten, werden ebenfalls beschrieben. Die Luciferase oder die Gemische aus Luciferase und Luciferin können in geeigneten Zufuhrvehikeln verkapselt sein, wie Liposomen, Glaspartikel, Kapillarröhrchen, Arzneimittelzufuhrvehikel, Gelatine, Überzügen mit verzögerter Freisetzung oder anderen derartigen Vehikeln.
  • b. Ctenophor-Systeme
  • Ctenophore, wie Mnemiopsis (Mnemiopsin) und Beroe ovata (Berovin) und Coelenterate, wie Aequorea (Aequorin), Obelia (Obelin) und Pelagia, erzeugen Biolumineszenzlicht unter Verwendung ähnlicher chemischer Systeme (siehe z. B. Stephenson et al. (1981) Biochimica et Biophysica Acta 678: 65–75; Hart et al. (1979) Biochemistry 18: 2204–2210; Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18342 , die auf der U.S.-Anmeldung Seriennummer 08/017,116 basiert, U.S.-Patent Nr. 5,486,455 und andere hier zitierte Literaturstellen und Patente). Das Aequorin-System und das Renilla-System sind repräsentativ und werden hier beispielhaft und als zu den derzeit bevorzugten Systemen gehörend im Detail beschrieben. Das Aequorin-System und das Renilla-System können das gleiche Luciferin verwenden und Licht unter Ausnutzung der gleichen chemischen Vorgänge erzeugen, aber jede Luciferase ist anders. Die Aequorin-Luciferase Aequorin, ebenso beispielsweise die Luciferasen Mnemiopsin und Berovin, ist ein Photo- Protein, das gebundenen Sauerstoff und gebundenes Luciferin einschließt, benötigt Ca2+ (oder ein anderes geeignetes Metallion), um die Reaktion auszulösen, und muss für die wiederholte Verwendung regeneriert werden; während die Renilla-Luciferase wie ein echtes Enzym wirkt, weil sie während der Reaktion unverändert bleibt, und sie benötigt gelösten molekularen Sauerstoff.
  • (1) Das Aequorin-System
  • Das Aequorin-System ist allgemein bekannt (siehe z. B. Tsuji et al. (1986) "Site-specific mutagenesis of the calcium-binding Photoprotein aequorin", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8107–8111; Prasher et al. (1985) "Cloning and Expression of the cDNA Coding for Aequorin, a Bioluminescent Calcium-Binding Protein" Biochemical and Biophysical Research Communications 126: 1259–1268; Prasher et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 288–297; Prasher, et al. (1987) "Sequence Comparisons of cDNAs Encoding for Aequroin Isotypes," Biochemistry 26: 1326–1332; Charbonneau et al. (1985) "Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin," Biochemistry 24: 6762–6771; Shimomura et al. (1981) "Resistivity to denaturation of the apoprotein of aequorin and reconstitution of the luminescent Photoprotein from the partially denatured apoprotein," Biochem. J. 199: 825–828; Inouye et al. (1989) J. Biochem. 105: 473–477; Inouye et al. (1986) "Expression of Apoaequorin Complementary DNA in Escherichia coli," Biochemistry 25: 8425–8429; Inouye et al. (1985) "Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent Protein aequorin," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3154–3158; Prendergast, et al. (1978) "Chemical and Physical Properties of Aequorin and the Green Fluorescent Protein Ioslated from Aequorea forskalea" J. Am. Chem. Soc. 17: 3448–3453; Europäische Patentanmeldung 0 540 064 A1 ; Europäische Patentanmeldung 0 226 979 A2 , Europäische Patentanmeldung 0 245 093 A1 und Europäische Patentanmeldung 0 245 093 B1 ; U.S.-Patent Nr. 5,093,240 ; U.S.-Patent Nr. 5,360,728 ; U.S.-Patent Nr. 5,139,937 ; U.S.-Patent Nr. 5,422,266 ; U.S.-Patent Nr. 5,023,181 ; U.S.-Patent Nr. 5,162,227 ; und SEQ ID NO: 5–13, die DNA offenbaren, die das Apoprotein codiert; und eine Form, die in dem U.S.-Patent Nr. 5,162,227 , der Europäischen Patentanmeldung 0 540 064 A1 und Sealite Sciences Technical Report Nr. 3 (1994) beschrieben wird, ist von Sealite, Sciences, Bogart, GA als AQUALITE® im Handel erhältlich.
  • Dieses System gehört zu den bevorzugten Systemen. Da das Aequorin-Photoprotein nicht kovalent gebundenes Luciferin und molekularen Sauerstoff enthält, ist es, wie ersichtlich sein wird, in dieser Form für die Lagerung als lyophilisiertes Pulver oder verkapselt in einem ausgewählten Zufuhrvehikel geeignet. Das System kann in Pellets, wie Liposomen, oder anderen Zufuhrvehikeln verkapselt sein. Wenn Vehikel verwendet werden, werden diese mit einer Zusammensetzung, sogar Leitungswasser, in Kontakt gebracht, die Ca2+ (oder andere geeignete Metallionen) enthält, um ein Gemisch zu erzeugen, das leuchtet.
  • (a) Aequorin und verwandte Photoproteine
  • Das Photoprotein Aequorin, das aus der Qualle Aequorea isoliert wird, emittiert Licht bei der Zugabe von Ca2+ (oder anderer geeigneten Metallionen). Das Aequorin-Photoprotein, das gebundenes Luciferin und gebundenen Sauerstoff enthält, der durch Ca2+ freigesetzt wird, benötigt keinen gelösten Sauerstoff. Die Lumineszenz wird durch Calcium ausgelöst, das den Sauerstoff und das Luciferin-Substrat unter Bildung von Apoaequorin freisetzt.
  • Das Biolumineszenz-Photoprotein Aequorin wird aus einer Anzahl von Arten der Qualle Aequorea isoliert. Es ist ein Peptidkomplex mit einem Molekulargewicht von 22 Kilodalton (kD) (siehe z. B. Shimomura et al. (1962) J. Cellular and Corp. Physiol. 59: 233–238; Shimomura et al. (1969) Biochemistry 8: 3991–3997; Kohama et al. (1971) Biochemistry 10: 4149–4152; und Shimomura et al. (1972) Biochemistry 11: 1602–1608). Das native Protein enthält Sauerstoff und eine heterocyclische Verbindung Coelenterazin, ein Luciferin, (siehe weiter unten), das nicht kovalent daran gebunden ist. Das Protein enthält drei Calciumbindungsstellen. Bei der Zugabe von Spurenmengen Ca2+ (oder anderer geeigneter Metallionen, wie Strontium) zu dem Photoprotein macht dieses eine Änderung der Konformation durch, die die Oxidation des gebundenen Coelenterazins unter Verwendung des Protein-gebundenen Sauerstoffs katalysiert. Die Energie aus dieser Oxidation wird als Blitz aus blauem Licht, das sein Zentrum bei 469 nm hat, freigesetzt. Calciumionen-Konzentrationen von nur 10–6 M sind ausreichend, um die Oxidationsreaktion auszulösen.
  • Natürlich vorkommendes Apoaequorin ist nicht eine einzelne Verbindung, sondern vielmehr ein Gemisch von mikroheterogenen Molekülsorten. Extrakte einer Aequoria-Qualle enthalten nicht weniger als zwölf verschiedene Varianten des Proteins (siehe z. B. Prasher et al. (187) Biochemistry 26: 1326–1332; Blinks et al. (1975) Fed. Proc. 34: 474): DNA, die zahlreiche Formen codiert, ist isoliert worden (siehe z. B. SEQ ID NO: 5–9 und 13).
  • Das Photoprotein kann rekonstituiert werden (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,023,181 ), indem das Apoprotein, wie ein rekombinant in E. coli erzeugtes Protein, mit einem Coelenterazin, wie einem synthetischen Coelenterazin, in Gegenwart von Sauerstoff und eines Reduktionsmittels (siehe z. B. Shimomura et al. (1975) Nature 256: 236–238; Shimomura et al. (1981) Biochemistry J. 199: 825–828), wie 2-Mercaptoethanol, und auch von EDTA oder EGTA (Konzentrationen im Bereich von etwa 5 bis etwa 100 mM oder darüber für die Anwendungen hier), die jegliches Ca2+ aufnehmen, um das Auslösen der Oxidationsreaktion bis erwünscht zu verhindern, kombiniert wird. Eine DNA, die eine modifizierte Form des Apoproteins codiert, das kein 2-Mercaptoethanol für die Rekonstitution benötigt, ist ebenfalls verfügbar (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,093,240 ). Das rekonstituierte Photoprotein ist ebenfalls im Handel erhältlich (es wird z. B. unter der Marke AQUALITE® verkauft und in dem U.S.-Patent Nr. 5,162,227 beschrieben).
  • Die Lichtreaktion wird durch die Zugabe von Ca2+ in einer Konzentration ausgelöst, die ausreichend groß ist, um die Wirkungen des Chelatbildners zu überkommen und die 10–6 M-Konzentration zu erreichen. Da derartig niedrige Konzentrationen an Ca2+ die Reaktion auslösen können, können höhere Konzentrationen des Chelatbildners in den Zusammensetzungen des Photoproteins enthalten sein. Dem gemäß sind höhere Konzentrationen an zugegebenem Ca2+ in der Form eines Calciumsalzes erforderlich. Genaue Mengen können empirisch ermittelt werden. Es kann ausreichend sein, lediglich Wasser zu dem Photoprotein zu geben, das in der Form einer konzentrierten Zusammensetzung oder in lyophilisierter Form oder pulverförmig bereitgestellt wird. Für die Zwecke hier sollte die Zugabe kleiner Mengen Ca2+, wie derjenigen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (BPS) oder anderen geeigneten Puffern oder der Feuchtigkeit auf dem Gewebe, mit dem die Zusammensetzungen in Kontakt gebracht werden, vorhanden sind, die Biolumineszenzreaktion auslösen.
  • Zahlreiche Isoforme des Aequorin-Apoproteins sind identifiziert und isoliert worden. DNA, die diese Proteine codiert, ist kloniert worden, und die Proteine und die modifizierten Formen davon sind unter Verwendung geeigneter Wirtszellen erzeugt worden (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,162,227 , 5,360,728 , 5,093,240 ; siehe auch Prasher et al. (1985) Biophys. Biochem. Res. Commun. 126: 1259–1268; Inouye et al. (1986) Biochemistry 25: 8425–8429). U.S.-Patent Nr. 5,093,240 ; U.S.-Patent Nr. 5,360,728 ; U.S.-Patent Nr. 5,139,937 ; U.S.-Patent Nr. 5,288,623 ; U.S.-Patent Nr. 5,422,266 , U.S.-Patent Nr. 5,162,227 und SEQ ID NO: 5–13, die DNAs offenbaren, die das Apoprotein codieren; und eine Form ist im Handel von Sealite, Sciences, Bogart, GA als AQUALITE® erhältlich. Eine DNA, die das Apoaequorin oder Varianten davon codiert, ist für die rekombinante Herstellung großer Mengen des Apoproteins brauchbar. Das Photoprotein wird bei der Zugabe des Luciferins, des Coelenterazins, vorzugsweise eines sulfatierten Derivats oder eines Analogons davon, und von molekularem Sauerstoff rekonstituiert (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,023,181 ). Das Apoprotein und andere Bestandteile des Photoproteins und der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion können unter geeigneten Bedingungen vermischt werden, um das Photoprotein zu regenerieren und gleichzeitig das Photoprotein zur Lichterzeugung zu veranlassen. Die Rekonstitution erfordert das Vorhandensein eines Reduktionsmittels, wie von Mercaptoethanol, mit Ausnahme der modifizierten Formen, die weiter unten diskutiert werden, die so gestaltet sind, dass kein Reduktionsmittel benötigt wird (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,093,240 ).
  • Es ist bevorzugt, das Aequorin unter Verwendung von DNAs zu erzeugen, wie denjenigen, die in SEQ ID NO: 5–13 offenbart werden und die dem Fachmann bekannt sind, oder von modifizierten Formen davon. Die DNA, die Aequorin codiert, wird in einer Wirtszelle exprimiert, wie E. coli, isoliert und unter Erzeugung des Photoproteins rekonstituiert (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,418,155 , 5,292,658 , 5,360,728 , 5,422,266 , 5,162,227 ).
  • Von Interesse sind hier die Formen des Apoproteins, die so modifiziert worden sind, dass die Biolumineszenzaktivität größer als bei dem nicht modifizierten Apoaequorin ist (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,360,728 , SEQ ID NO: 10–12). Modifizierte Formen, die eine größere Biolumineszenzaktivität als das nicht modifizierte Apoaequorin zeigen, schließen die Proteine ein, die die Sequenzen haben, die in SEQ ID NO: 10–12 offenbart werden, in denen das Aspartat 124 durch Serin ersetzt ist, das Glutamat 135 durch Serin ersetzt ist bzw. das Glycin 129 durch Alanin ersetzt ist. Andere modifizierte Formen mit erhöhter Biolumineszenz stehen ebenfalls zur Verfügung.
  • Für die Verwendung in bestimmten hier angegebenen Ausführungsformen werden das Apoprotein und andere Komponenten des Aequorin-Biolumineszenz-erzeugenden Systems als ein Gemisch verpackt oder bereitgestellt, das, sobald dies erwünscht ist, Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen das Photoprotein aus dem Apoprotein, Luciferin und Sauerstoff rekonstituiert wird (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,023,181 ; und U.S.-Patent Nr. 5,093,240 ). Besonders bevorzugt sind Formen des Apoproteins, die für die Rekonstitution kein Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol benötigen. Diese Formen, die beispielsweise in dem U.S.-Patent Nr. 5,093,240 beschrieben werden (siehe auch Tsuji et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8107–8111), werden durch den Austausch eines oder mehrerer, vorzugsweise aller drei Cysteinreste beispielsweise durch Serin modifiziert. Der Austausch kann beispielsweise durch die Veränderung der DNA, die das Aequorin-Apoprotein codiert, wie denjenigen, die in SEQ ID NO: 5 offenbart wird, und Ersetzen des Cystein-Codons durch das Serin-Codon erfolgen.
  • Die Photoproteine und die Luciferasen verwandtet Arten, wie Obelia, werden hier auch für eine Verwendung ins Auge gefasst. Die DNA, die das Ca2+-aktivierte Photoprotein Obelin des Hydroidpolypen Obelia longissima codiert, ist bekannt und verfügbar (siehe z. B. Illarionov et al. (1995) Gene 153: 273–274; und Bondar et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1231: 29–32). Dieses Photoprotein kann auch durch Mn2+ aktiviert werden (siehe z. B. Vysotski et al. (1995) Arch. Bioch. Biophys. 316: 92–93, Vysotski et al. (1993) J. Biolumin. Chemilumin. 8: 301–305).
  • Für die Verwendung hier werden die Komponenten der Biolumineszenz im Allgemeinen so verpackt oder bereitgestellt, dass es nicht genügend Metallionen gibt, um die Reaktion zu starten. Bei der Verwendung werden die Spurenmengen der die Reaktion auslösenden Metallionen, vor allem Ca2+, mit den anderen Komponenten in Kontakt gebracht. Für ein länger andauerndes Leuchten kann da Aequorin kontinuierlich rekonstituiert werden, oder es kann zugegeben oder in großem Überschuss bereitgestellt werden.
  • (b) Luciferin
  • Das Aequorin-Lucifern ist ein Coelenterazin oder ein Analogon davon, wobei die Moleküle eingeschlossen sind, die die Struktur (Formel (I))
    Figure 00860001
    haben, worin R1 CH2C6H5 oder CH3 ist; R2 C6H5 ist und R3 p-C6H4OH oder CH3 ist, oder andere derartige Analoga, die eine Aktivität zeigen. Ein bevorzugtes Coelenterazin hat die Struktur, in der R1 p-CH2C6H4OH ist, R2 C6H5 ist und R3 p-C6H4OH ist, das durch bekannte Verfahren hergestellt werden kann (siehe z. B. Inouye et al. (1975) Jap. Chem. Soc., Chemistry Letters, S. 141–144 und Hart et al. (1979) Biochemistry 18: 2204–2210). Zu den bevorzugten Analoga gehören diejenigen, die in einer Weise modifiziert sind, dass die Spektralfrequenz des resultierenden Lichts zu einer anderen Frequenz verschoben ist.
  • Das bevorzugte Coelenterazin hat die Struktur (Formel (II)):
    Figure 00870001
    und sulfatierte Derivate davon.
  • Ein anderes Coelenterazin hat die Formel (V)
    Figure 00870002
    (siehe Hart et al. (1997) Biochemistry 18: 2204–2210). Bei Verwendung dieses Derivats in Gegenwart von Luciferase ist das gesamte Licht im Ultraviolettbereich mit einem Peak bei 390 nm. Bei der Zugabe von GFP liegt das gesamte emittierte Licht dann im sichtbaren Bereich mit einem Peak bei 509 nm, begleitet von einer etwa 200-fachen Zunahme der emittierten Lichtmenge. Mit einem Kantenfilter bei 470 nm gesehen wäre die Lichtausbeute in Abwesenheit von GFP etwa Null, und sie wäre nachweisbar in Gegenwart von GFP. Dies lie fert die Grundlage für einen Immunoassay, der in den BEISPIELEN beschrieben wird.
  • Die Reaktion des Coelenterazins, wenn es an das Aequorin-Photoprotein mit gebundenem Sauerstoff gebunden ist und in Gegenwart von Ca2+ kann wie folgt dargestellt werden:
    Figure 00880001
  • Das Photoprotein Aequorin (das das Apoaequorin gebunden an ein Coelenterat-Luciferase-Molekül gebunden enthält) und die Renilla-Luciferase, die weiter unten diskutiert wird, können das gleiche Coelenterat-Luciferin verwenden. Das Aequorin-Photoprotein katalysiert die Oxidation des Coelenterat-Luciferins (Coelenterazin) zum Oxyluciferin (Coelenteramid) unter gleichzeitiger Erzeugung von blauem Licht (Lambdamax = 469 nm).
  • Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass das Sulfatderivat des Coelenterat-Luciferins (Laurylluciferin) in Wasser besonders stabil ist, so dass es in einem Coelenterat-artigen Biolumineszenz-System verwendet werden kann. In diesem System werden Adenosindiphosphat (ADP) und eine Sulpha-Kinase verwendet, um das Coelenterazin in die sulfatierte Form umzuwandeln. Anschließend wird Sulfatase verwendet, um das Laurylluciferin in das native Coelenterazin zurück umzuwandeln. Das stabilere Laurylluciferin wird demnach in dem Gegenstand verwendet, der beleuchtet werden soll, und die Luciferase in Kombination mit der Sulfatase werden zu dem Luciferingemisch gegeben, wenn die Beleuchtung erwünscht ist.
  • Demnach ist das Biolumineszenzsystem von Aequorea besonders gut für die Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren geeignet. Die jeweiligen Mengen und die Art und Weise, in der die Komponenten bereitgestellt werden, hängen vom Typ der Neoplasie oder des Spezialgewebes, die/das sichtbar gemacht werden soll, ab. Dieses System kann in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, das bei der Zugabe von Ca2+ leuchtet. Es kann verkapselt werden, gebunden an einen Mikroträger sein, wie Mikrokügelchen, oder in einer Zusammensetzung sein, wie einer Lösung oder Suspension, vorzugsweise in Gegenwart von genügend Chelatbildner, um das Auslösen der Reaktion zu verhindern. Die Konzentration des Aequorin-Photoproteins variiert und kann empirisch ermittelt werden. Typischerweise werden Konzentrationen von mindestens 0,1 mg/l, noch bevorzugter von mindestens 1 mg/l und darüber ausgewählt. In einigen Ausführungsformen werden 1 bis 10 mg Luciferin pro 100 mg Luciferase in ausgewählten Volumina und in den gewünschten Konzentrationen verwendet.
  • c. Crustaceen, vor allem Cypridina
  • Die Ostracoden, wie Vargula serata, hilgendorfii und noctiluca sind kleine marine Crustaceen, die manchmal auch als Meeresleuchtkäfer bezeichnet werden. Diese Meeresleuchtkäfer werden in den Gewässern vor der Küsten von Japan gefunden und emittieren Licht, indem sie Luciferin und Luciferase in das Wasser spritzen, wo die Reaktion stattfindet, die eine helle blau leuchtende Wolke hervorruft. An der Reaktion sind nur Luciferin, Luciferase und molekularer Sauerstoff beteiligt, und sie ist daher für die Anwendung hier sehr gut geeignet.
  • Die Systeme, wie die Vargula-Biolumineszenzsysteme, sind hier besonders bevorzugt, da die Komponenten bei Raumtemperatur stabil sind, wenn sie getrocknet und pulverisiert sind, und weil sie selbst dann weiterhin reagieren, wenn sie verunreinigt sind. Außerdem benötigt die Biolumineszenzreaktion für ihren Ablauf nur die Komponenten Luciferin/Luciferase in Konzentrationen von nur 1:40 Teilen pro Milliarde bis 1:100 Teilen pro Milliarde, Wasser und molekularen Sauerstoff. Ein erschöpftes System kann durch die Zugabe von Luciferin aufgefrischt werden.
  • (1) Vargula-Luciferase
  • Die Vargula-Luciferase ist wasserlöslich und gehört zu den Luciferasen, die für die Verwendung in den hier dargestellten Verfahren bevorzugt ist. Die Vargula-Luciferase ist ein Polypeptid aus 555 Aminosäuren, das durch das Isolieren aus Vargula und auch unter Verwendung der Rekombinationstechnik durch die Expression der DNA in geeigneten bakteriellen Wirtszellen und Säugetierwirtszellen hergestellt wurde (siehe z. B. Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6567–6571; Inouye et al. (1992) Proc. Natl. Aad. Sci. U.S.A. 89: 9584–9587; Johnson et al. (1978) Methods in Enzymoloy LVII: 331–349; Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57: 364–72; Tsuji (1974) Biochemistry 13: 5204–5209; Japanische Patentanmeldung Nr. JP-3-30678 Osaka; und Europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 387 355 A1 ).
  • (a) Reinigung aus Cypridina
  • Die Verfahren für die Reinigung von Vargula-Luciferase (Cypridina-Luciferase) sind wohlbekannt. Der Rohextrakt, der den Wirkstoff enthält, kann beispielsweise leicht durch das Zermahlen oder Zerdrücken der Vargula-Garnele hergestellt werden. In anderen Ausführungsformen kann eine Zubereitung von Cypridina hilgendorfii-Luciferase durch das Eintauchen von gelagertem gefrorenem C. hilgendorfii in destilliertes Wasser, das 0,5 bis 5,0 M Salz, vorzugsweise 0,5 bis 2,0 M Natrium- oder Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, enthält, bei 0 bis 30°C, vorzugsweise 0 bis 10°C, über 1 bis 48 h, vorzugsweise 10 bis 24 h, für die Extraktion, auf die eine hydrophobe Chromatographie und anschließend eine Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie folgt, hergestellt werden (TORAY IND INC, Japanische Patentanmeldung JP 4258288 , veröffentlicht am 14. September 1993; siehe auch Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57: 364–72 für andere Verfahren).
  • (b) Herstellung durch Rekombinationstechniken
  • Die Luciferase wird vorzugsweise durch die Expression von klonierter DNA, die die Luciferase codiert, hergestellt ( Europäische Patentanmeldung Nr. 0 387 355 A1 ; Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/001542 ; siehe auch SEQ ID NO: 5, die die Sequenz aus der Japanischen Patentanmeldung Nr. JP 3-30678 offenbart, und Thomson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6567–6571). Die DNA, die die Luciferase oder eine Variante davon codiert, wird in E. coli unter Verwendung von geeigneten Vektoren eingebracht und unter Anwendung von Standardverfahren isoliert.
  • (2) Vargula-Luciferin
  • Das natürliche Luciferin ist ein substituierter Imidazopyrazin-Kern, wie eine Verbindung der Formel (III)
    Figure 00910001
  • Das Luciferin kann aus zermahlener getrockneter Vargula durch Erhitzen des Extrakts isoliert werden, durch das die Luciferase zerstört wird, das Luciferin aber intakt bleibt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,853,327 ).
  • Analoga davon und andere Verbindungen, die mit der Luciferase in einer lichterzeugenden Reaktion reagieren, können ebenfalls verwendet werden.
  • Andere biolumineszierende Organismen, die Luciferasen haben, die mit dem Vargula-Luciferin reagieren können, schließen die Gattungen Apogon, Parapriacanthus und Porichthys ein.
  • (3) Reaktionen
  • Das Luciferin bildet bei der Reaktion mit Sauerstoff ein Dioxetanon-Zwischenprodukt (das ein cyclisches Peroxid ähnlich dem Zwischenprodukt des Leuchtkäfers aus einem cyclischen Peroxidmolekül). Im abschließenden Schritt der Biolumineszenzreaktion zerfällt das Peroxid unter Bildung von CO2 und eines angeregten Carbonyls. Das angeregte Molekül emittiert dann ein blaues bis blaugrünes Licht.
  • Der optimale pH-Wert für die Reaktion beträgt etwa 7. Für die Zwecke hier kann jeder pH-Wert, bei dem die Reaktion stattfindet, verwendet werden. Die Konzentrationen der Reagenzien entsprechen den Konzentrationen, die normalerweise für analytische Reaktionen verwendet werden, oder liegen darüber (siehe z. B. Thompson et al. (1990) Gene 96: 257–262). Typischerweise wird die Luciferase in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 10 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 2,5 mg/l, oder darüber verwendet. Ähnliche Konzentrationen oder höhere Konzentrationen des Luciferins können verwendet werden.
  • d. Insekten-Biolumineszenz-System eingeschlossen das Leuchtkäfer, das Schnellkäfer-, und andere Insektensysteme
  • Die Biochemie der Leuchtkäfer-Biolumineszenz war das erste Biolumineszenz-System, das charakterisiert wurde (siehe z. B. Wienhausen et al. (1985) Photochemistry and Photobiology 42: 609–611; McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in cell Physiology, Hayashi et al., Hrsg. Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, S. 63–80), und es ist ein System, das im Handel erhältlich ist (z. B. von Promega Corporation, Madison, WI, siehe z. B. Leach et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 51–70, insb. Tabelle 1). Die Luciferasen der verschiedenen Leuchtkäfer-Arten sind hinsichtlich der Antigenität ähnlich. Diese Arten schließen Mitglieder der Gattungen Photinus, Photurins und Luciela ein. Weiterhin erzeugt die Biolumineszenzreaktion bei 30°C mehr Licht als bei 20°C, die Luciferase wird durch kleine Mengen Rinderserumalbumin stabilisiert, und die Reaktion kann mit Tricin gepuffert werden.
  • (1) Luciferase
  • DNA-Klone, die Luciferasen verschiedener Insekten codieren, und ihre Verwendung für die Herstellung der codierten Luciferase sind allgemein bekannt. Beispielsweise sind DNA-Klone, die die Luciferase von Photinus pyralis, Luciola cruciata codieren, erhältlich (siehe z. B. de Wet et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7870–7873; de Wet et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 3; U.S.-Patent Nr. 4,968,613 , siehe auch SEQ ID NO: 3). Die DNA wurde auch in Saccharomyces (siehe z. B. Japanische Patentanmeldung Nr. JP 63317079 , veröffentlicht am 26. Dezember 1988, KIKKOMAN CORP) und in Tabak exprimiert.
  • Zusätzlich zu der Wildtyp-Luciferase sind modifizierten Insekten-Luciferasen hergestellt worden. Beispielsweise sind hitzestabile Luciferase-Mutanten, DNA-codierende Mutanten, Vektoren und transformierte Zellen für die Herstellung der Luciferasen erhältlich. Ein Protein mit 60% Aminosäuresequenzhomologie mit den Luciferasen von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, L. cruciata oder L. lateralis, das eine Luciferase-Aktivität hat, ist erhältlich (siehe z. B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/25798 . Es ist oberhalb von 30°C stabiler als die natürlich vorkommenden Insekten-Luciferasen und kann auch bei 37°C oder darüber in hoher Ausbeute hergestellt werden.
  • Modifizierte Luciferasen, die Licht bei anderen Wellenlängen erzeugen (verglichen mit der nativen Luciferase) sind bekannt und können daher im Hinblick auf ihre farberzeugenden Eigenschaften ausgewählt werden. Beispielsweise sind synthetische mutierte Käfer-Luciferasen und DNAs, die derartige Luciferasen codieren, die eine Biolumineszenz bei einer Wellenlänge erzeugen, die verschieden von der Wildtyp-Luciferase ist, bekannt (Promega Corp, Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/18853 , die auf der U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/177,081 basiert). Die mutierte Käfer-Luciferase hat eine Aminosäuresequenz, die von der Sequenz der entsprechenden Wildtyp-Luciferase von Luciola cruciata (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,182,202 , 5,219,737 , 5,352,598 , siehe auch SEQ ID NO: 3) durch Substitutionen) in einer oder zwei Positionen verschieden ist. Die mutierte Luciferase erzeugt eine Biolumineszenz mit einer Wellenlänge mit einer Peakintensität, die um mindestens 1 nm von der Wellenlänge verschieden ist, die von Wildtyp-Luciferasen erzeugt wird.
  • Andere mutierte Luciferasen können erzeugt werden. Mutierte Luciferasen mit der Aminosäuresequenz der Wildtyp-Luciferase, jedoch mit mindestens einer Mutation, in der Valin durch Isoleucin bei der Aminosäurenummer 233, Valin durch Isoleucin bei 239, Serin durch Asparagin bei 286, Glycin durch Serin bei 326, Histidin durch Tyrosin bei 433 oder Prolin durch Serin bei 452 ersetzt ist, sind bekannt (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,219,737 und 5,330,906 ). Die Luciferasen werden durch die Expression der DNAs, die die mutierten Luciferasen codieren, in E. coli und das Isolieren des Proteins erzeugt. Die Luciferasen erzeugen Licht mit Farben, die von der Farbe des Wildtyps verschieden sind. Die mutierten Luciferasen katalysieren Lucifern unter Erzeugung von rotem (λ 609 nm und 612 nm), orangefarbenem (λ 595 und 607 nm) oder grünem (λ 558 nm) Licht. Die übrigen physikalischen und chemischen Eigenschaften der mutierten Luciferase sind im Wesentlichen identisch mit der nativen Wildtyp-Luciferase. Die mutierte Luciferase hat die Aminosäuresequenz der Luciola-cruciata-Luciferase mit einer Veränderung, die ausgewählt wird unter Ser 286 ersetzt durch Asn, Gly 326 ersetzt durch Ser, His 433 ersetzt durch Tyr oder Pro 452 ersetzt durch Ser. Hitzestabile Luciferasen sind ebenfalls erhältlich (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,229,285 ; siehe auch Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/25798 , die eine Photinus-Luciferase, in der Glutamin in der Position 354 durch Lysin ersetzt ist, und eine Luciola-Luciferase, in der Glutamat bei 356 durch Lysin ersetzt ist, bereitstellt).
  • Diese mutierten Luciferasen sowie die Wildtyp-Luciferasen können in Kombination mit den hier beschriebenen GFPs verwendet werden, vor allem in Situationen, in denen eine Vielzahl von Farben erwünscht ist oder in denen Stabilität bei höheren Temperaturen erwünscht ist.
  • (2) Luciferin
  • Das Leuchtkäfer-Luciferin ist ein Benzothiazol:
    Figure 00950001
  • Analoga dieses Luciferins und synthetische Leuchtkäfer-Luciferine sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,374,534 und 5,098,828 ). Diese schließen Verbindungen der Formel (IV) (siehe U.S.-Patent Nr. 5,098,828 )
    Figure 00960001
    ein, in der
    R1 Hydroxy, Amino, geradkettiges oder verzweigtes C1-C20-Alkoxy, C2-C20-Alkenyloxy, ein L-Aminosäurerest, der über die α-Aminogruppe angebunden ist, ein Oligopeptidrest mit bis zu zehn L-Aminosäureeinheiten, der über die α-Aminogruppe der endständigen Einheit angebunden ist, ist;
    R2 Wasserstoff, H2PO3, HSO3, nicht substituiertes oder phenylsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes C1-C20-Alkyl oder C2-C20-Alkenyl, Aryl, das 6 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, oder R3-C(O)- ist,
    R3 nicht substituiertes oder phenylsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes C1-C20-Alkyl oder C2-C20-Alkenyl, Aryl, das 6 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, ein Nucleotidrest mit 1 bis 3 Phosphatgruppen oder ein glykosidisch angebundenes Mono- oder Disaccharid ist mit der Ausnahme, wenn Formel (IV) ein D-Luciferin oder D-Luciferinmethylester ist.
  • Modifizierte Luciferine, die so modifiziert wurden, dass sie Licht bei verschobenen Frequenzen erzeugen, sind dem Fachmann bekannt.
  • (3) Reaktionen
  • Die Reaktion, die durch die Leuchtkäfer-Luciferase und verwandete Insekten-Luciferasen katalysiert wird, benötigt ATP, Mg2+ sowie mo lekularen Sauerstoff. Lucifern muss exogen zugegeben werden. Die Leuchtkäfer-Luciferase katalysiert die Aktivierung des Leuchtkäfer-Luciferins und die nachfolgenden Schritte, die zu dem angeregten Produkt führen. Das Luciferin reagiert mit ATP unter Bildung eines Lucifery-Adenylat-Zwischenprodukts. Das Zwischenprodukt reagiert dann mit Sauerstoff unter Bildung eines cyclischen Luciferylperoxymoleküls, das dem Coelenterat-Zwischenprodukt in Form eines cyclischen Peroxids ähnelt, das unter Entstehung von CO2 und eines angeregten Zustands des Carbonylprodukts zerfällt. Das angeregte Molekül emittiert dann ein gelbes Licht; die Farbe ist jedoch abhängig vom pH-Wert. Mit sinkendem pH-Wert wechselt die Farbe der Biolumineszenz von gelbgrün hin zu rot.
  • Verschiedene Leuchtkäfer-Arten emittieren Biolumineszenz mit unterschiedlichen Farben, so dass die Farbe der Reaktion von der Art abhängt, von der die Luciferase erhalten wird. Zusätzlich ist die Reaktion für einen pH-Wert von 7,8 optimiert.
  • Die Zugabe von ATP und Luciferin zu einer Reaktion, die erschöpft ist, erzeugt eine zusätzliche Lichtemission. Demnach kann das System, sobald es eingerichtet ist, relativ leicht aufrechterhalten werden. Daher ist es bestens für die Verwendung hier in den Asuführungsformen geeignet, in denen ein lang andauerndes Leuchten erwünscht ist.
  • e. Bakterielle Systeme
  • Leuchtende Bakterien emittieren typischerweise ein kontinuierliches, üblicherweise blaugrünes Licht. Bei starker Expression kann ein einziges Bakterium 104 bis 105 Photonen pro Sekunde emittieren. Bakterielle Biolumineszenz-Systeme schließen unter anderem diejenigen Systeme ein, die in biolumineszierenden Arten der Gattungen Photo bacterium, Vibrio und Xenorhabdus gefunden werden. Diese Systeme sind wohlbekannt und gut charakterisiert (siehe z. B. Baldwin et al. (1984) Biochemistry 23: 3663–3667; Nicoli et al. (1974) J. Biol. Chem. 249: 2393–2396; Welches et al. (1981) Biochemistry 20: 512–517; Engebrecht et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 83–99; Frackman et al. (1990) J. of Bacteriology 172: 5767–5773; Miyamoto et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 70; U.S.-Patent Nr. 4,581,335 ).
  • (1) Luciferasen
  • Bakterielle Luciferasen, wie sie durch die Luciferase beispielhaft angegeben werden können, die von Vibrio harveyi stammt (EC 1.14.14.3, Alkanol-reduzierte-FMN-Sauerstoff Oxidoreduktase 1-hydroxylierend, lumineszierend), ist eine Oxidase mit gemischten Funktionen, die durch die Assoziation von zwei verschiedenen Proteinuntereinheiten α und β gebildet wird. Die α-Untereinheit hat ein apparentes Molekulargewicht von etwa 42000 kD, und die β-Untereinheit hat ein apparentes Molekulargewicht von 37000 kD (siehe z. B. Cohn et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 90: 102–123). Diese Untereinheiten assoziieren miteinander unter Bildung eines 2-Kettenkomplex-Luciferaseenzyms, das die lichtemittierende Reaktion biolumineszierender Bakterien, wie von Vibrio harvey ( U.S.-Patent Nr. 4,581,335 ; Belas et al. (1982) Science 218: 791–793), Vibrio fischeri (Engebrecht et al. (1983) Cell 32: 773–781; Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 4154–4158) und anderer Bakterien, katalysiert.
  • Bakterielle Luciferase-Gene sind kloniert worden (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,221,623 ; U.S.-Patent Nr. 4,581,335 ; Europäische Patentanmeldung Nr. EP 386 691 A ). Plasmide für die Expression einer bakteriellen Luciferase, wie von Vibrio harveyi, schließen pFIT001 (NRRL B-18080), pPALE001 (NRRL B-18082) und pMR19 (NRRL B-18081)) ein und sind bekannt. Beispielsweise ist die Sequenz des vollständigen lux-Regulons von Vibrio fisheri ermittelt worden (Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663–3667; Baldwin et al. (1981) Biochem. 20: 512–517; Baldwin et al. (1984) Biochem. 23: 3663–3667; siehe auch z. B. U.S.-Patente Nr. 5,196,318 , 5,221,623 und 4,581,335 ). Dieses Regulon schließt das luxI-Gen, das ein Protein codiert, das für die Autoinducer-Synthese benötigt wird (siehe z. B. Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 4154–4158), das luxC-, luxD- und luxE-Gen, die Enzyme codieren, die die Luciferase mit einem Aldehydsubstrat versorgen, und das luxA-Gen und das luxB-Gen ein, die die α-Untereinheit und die β-Untereinheit der Luciferase codieren.
  • Lux-Gene anderer Bakterien sind ebenfalls kloniert worden und sind im Handel erhältlich (siehe z. B. Cohn et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 6139–6146; U.S.-Patent Nr. 5,196,524 , das eine Fusion des luxA-Gens und des lux-B-Gens von Vibrio harveyi bereitstellt). Demnach wird eine DNA bereitgestellt, die die α-Untereinheit und die β-Untereinheit der Luciferase codiert, die verwendet werden kann, um die Luciferase herzustellen. Die DNA, die die α-Unterheit (1065 bp) und die β-Untereinheit (984 bP) codiert, die DNA, die ein Luciferase-Gen von 2124 bp enthält, das die α-Untereinheit und die β-Untereinheit codiert, ein rekombinanter Vektor, der die DNA enthält, die beide Untereinheiten codiert, und ein transformiertes E. coli und andere bakterielle Wirte für die Expression und Herstellung der codierten Luciferase, sind im Handel erhältlich. Zusätzlich sind bakterielle Luciferasen im Handel erhältlich.
  • (2) Luciferine
  • Bakterielle Luciferine schließen
    Figure 00990001
    oder
    Figure 01000001
    ein, worin R beispielsweise
    Figure 01000002
    ist, worin das Tetradecanal und das reduzierte Flavin-Nucleotid als Luciferin eingestuft werden, da beide während der lichtemittierenden Reaktion oxidiert werden.
  • (3) Reaktionen
  • Die bakteriellen Systeme benötigen zusätzlich zu reduziertem Flavin fünf Polypeptide, um die Biolumineszenzreaktion zu vervollständigen: zwei Untereinheiten α und β des bakteriellen Luciferins und drei Einheiten eines Fettsäure-Reduktasesystem-Komplexes, der das Tetradecanalaldehyd liefert. Beispiele für bakterielle Biolumineszenz-Systeme, die in der Vorrichtung und den Verfahren, die hier bereitgestellt werden, brauchbar sind, schießen diejenigen ein, die von Vibrio fisheri und Vibrio harveyi stammen. Ein Vorteil dieses Systems ist seine Fähigkeit, bei niedrigen Temperaturen zu funktionieren; bestimmte chirurgische Verfahren werden durchgeführt, indem der Körper auf niedrigere Temperaturen gekühlt wird.
  • Bakterielle Luciferase katalysiert die Flavin-vermittelte Hydroxylierung eines langkettigen Aldehyds unter Erhalt einer Carbonsäure und eines angeregten Flavins; das Flavin kehrt unter gleichzeitiger Emission von blauem Licht (λmax = 490 nm; siehe z. B. Legocki et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 9080; siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,196,524 ) in den Grundzustand zurück:
    Figure 01010001
  • Die Reaktion kann initiiert werden, indem reduziertes Flavinmononucleotid (FMNH2) mit einem Gemisch aus bakterieller Luciferase, Sauerstoff und einem langkettigem Aldehyd, üblicherweise n-Decylaldehyd, in Kontakt gebracht wird.
  • Die DNA, die die Luciferase des fluoreszierenden Bakteriums Alteromonas hanedai codiert, ist bekannt (CHISSO CORP; siehe auch Japanische Anmeldung JP 7222590 , veröffentlicht am 22. August 1995). Das reduzierte Flavinmononucleotid (FMNH2; Luciferin) reagiert mit Sauerstoff in Gegenwart von bakterieller Luciferase unter Erzeugung eines Peroxyflavins als Zwischenprodukt. Dieses Zwischenprodukt reagiert mit einem langkettigen Aldehyd (Tetradecanal) unter Bildung der Säure und des Luciferase-gebundenen Hydroxyflavins in seinem angeregten Zustand. Das angeregte Luciferase-gebundene Hydroxyflavin emittiert dann Licht und löst sich von der Luciferase als oxidiertes Flavinmononucleotid (FMN) und Wasser. In vivo wird FMN wieder reduziert und in den Prozess zurückgeführt, und der Aldehyd wird aus der Säure regeneriert.
  • Flavinreduktasen sind kloniert worden (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,484,723 ; siehe SEQ ID NO: 14 für eine repräsentative Sequenz aus diesem Patent). Diese wie auch NAD(P)H können in der Reaktion für die Regeneration von FMNH2 für die Reaktion mit der bakteriellen Luciferase und dem langkettigen Aldehyd eingesetzt werden. Die Flavinreduktase katalysiert die Umsetzung von FMN zu FMNH2, bei der es sich um die Luciferase-Reaktion handelt; Wenn die Luciferase und die Reduktase in das Reaktionssystem eingebracht werden, ist es demnach möglich, die Biolumineszenzreaktion aufrechtzuerhalten. Da die bakterielle Luciferase mehrmals umgesetzt wird, hält die Bio lumineszenz so lange an, wie ein langkettiger Aldehyd in dem Reaktionssystem vorhanden ist.
  • Die Farbe des durch die biolumineszierenden Bakterien erzeugten Lichts resultiert auch aus einem blau fluoreszierenden Protein (BFP), das an der Biolumineszenzreaktion teilnimmt. Dieses Protein, das wohlbekannt ist (siehe z. B. Lee et al. (1978) Methods in Enzymology LVII: 226–234), kann ebenfalls zu bakteriellen Biolumineszenzreaktionen gegeben werden, um eine Verschiebung der Farbe zu verursachen.
  • f. Andere Systeme
  • (1) Dinoflagellat-Biolumineszenz-erzeugende Systeme
  • In Dinoflagellaten findet die Biolumineszenz in Organellen statt, die als Scintillonen bezeichnet werden. Diese Organellen sind Ausstülpungen des Cytoplasmas in die Zellvakuole. Die Scintillonen enthalten ausschließlich Dinoflagellat-Luciferase und Luciferin (mit seinem Bindungsprotein), wobei andere cytoplasmische Komponenten mehr oder weniger ausgeschlossen sind. Das Dinoflagellat-Luciferin ist ein mit dem Chlorophyll verwandtes Tetrapyrrol
    Figure 01020001
    oder ein Analogon davon.
  • Die Luciferase ist ein Protein von 135 kD aus einer Ketten, das bei pH 6,5 aktiv, bei pH 8 jedoch inaktiv ist (siehe z. B. Hastings (1981) Bioluminescence and Chemiluminscence, DeLuca et al., Hrsg. Academic Press, NY, S. 343–360). In den Extrakten kann eine Lumineszenzaktivität erhalten werden, die bei pH 8 hergestellt wurden, indem einfach der pH-Wert von 8 nach 6 verschoben wird. Dies geschieht in löslichen und teilchenförmigen Fraktionen. In dem intakten Scintillon dauert der Lumineszenzblitz ~100 ms, was der Dauer des Blitzes in vivo entspricht. In Lösung hängen die Kinetiken von der Verdünnung ab, wie bei jeder sonstigen enzymatischen Reaktion. Bei pH 8 ist das Luciferin an ein Protein gebunden (Luciferin-Bindendungsprotein), das die Reaktion des Luciferins mit der Luciferase verhindert. Bei pH 6 wird das Luciferin jedoch freigesetzt und ist frei für die Reaktion mit dem Enzym.
  • (2) Systeme von Mollusken, wie Latia und Pholas
  • Die Mollusken Latia neritoides und Arten von Pholas sind biolumineszierende Tiere. Das Luciferin hat die Struktur
    Figure 01030001
    und ist synthetisiert worden (siehe z. B. Shimomura et al. (1968) Biochemistry 7: 1734–1738; Shimomura et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 2086–2089). Zusätzlich zu einer Luciferase und Luciferin hat die Reaktion eine dritte Komponente, ein "Purpurprotein". Die Reaktion, die durch ein exogenes Reduktionsmittel gestartet werden kann, wird durch das folgende Schema dargestellt:
    Figure 01030002
    XH2 ist ein Reduktionsmittel
  • Für die Anwendung hier benötigt die Reaktion das Purpurprotein sowie ein Reduktionsmittel.
  • (3) Erdwürmer und andere Ringelwürmer
  • Erdwurmarten wie Diplocardia longa, Chaetopterus und Harmothoe, zeigen Biolumineszenz. Das Luciferin hat die Struktur
    Figure 01040001
  • Die Reaktion benötigt Wasserstoffperoxid zusätzlich zum Luciferin und zur Luciferase. Die Luciferase ist ein Photoprotein.
  • (4) Glühwürmchen
  • Das Luciferase/Luciferin-System der Glühwürmchen, die in Großbritannien und in Australien und Neuseeland in Höhlen gefunden werden, sind ebenfalls für eine Anwendung vorgesehen.
  • (5) Marine Polycheatwurmsysteme
  • Marine Polycheatwurm-Biolumineszenz-erzeugende Systeme wie Phrixotrix und Chaetopterus, werden hier ebenfalls für eine Verwendung in Betracht gezogen.
  • (6) Südamerikanischer Eisenbahnwurm
  • Das Biolumineszenz-erzeugende System des Südamerikanischen Eisenbahnwurms ("railway beetle") ist ebenfalls für die Verwendung hier vorgesehen.
  • (7) Fische
  • Von Interesse sind hier die Luciferasen und die Biolumineszenz-erzeugenden Systeme, die rotes Licht erzeugen. Diese schließen die Luciferasen ein, die in Arten von Aristostomias, wie A. scintillans (siehe z. B. O'Day et al. (1974) Vision Res. 14: 545–550), Pachystomias, Malacosteus, wie M. niger, gefunden werden.
  • Blau/grün-Emitter schließen Cyclthon, Mycophiden, Silberpfeilfische (Agyropelecus), Vinciguerria, Howella, Florenciella und Chauliodus ein.
  • g. Fluoreszierende Proteine
  • Das GFP von Aequorea und das der Seenadel Renilla reniformis haben den gleichen Chromophor, allerdings hat das Aequorea-GFP zwei Absorptionspeaks bei 395 und 475 nm, während das Renilla-GFP einen einzigen Absorptionspeak bei 498 nm hat, mit etwa 5,5-fach größerem Monomerextinktionskoeffizenten als der Hauptpeak des Aequorea-Proteins bei 395 nm (Ward, W. W. in Bioluminescence and Chemiluminescence (Hrsg. DeLuca, M. A. & McElroy, W. D.) 235–242 (Academic Press, New York, 1981)]. Die Spektren des isolierten Chromophors und von denaturiertem Protein bei neutralem pH-Wert stimmen nicht mit den Spektren beider nativen Proteine überein (Cody, C. W. et al. (1993) Biochemistry 32: 1212–1218).
  • (1) Grün und blau fluoreszierende Proteine
  • Wie hier beschrieben wird blaues Licht bei Verwendung der Renilla-Luciferase oder des Aequorea-Photoproteins in Gegenwart von Ca2+ und des Coelenterazins Luciferin oder eines Analogons davon erzeugt. Dieses Licht kann in grünes Licht umgewandelt werden, wenn ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu der Reaktion gegeben wird. Grün fluoreszierende Proteine, die gereinigt worden sind (siehe z. B. Prasher et al. (1992) Gene 111: 229–233) und auch kloniert worden sind (siehe z. B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/07463 , die auf der U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/119,678 und der U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/192,274 basiert, werden von Cnidarianen (Nesseltiere) als Energietransferakzeptoren verwendet. GFPs fluoreszieren in vivo bei der Aufnahme von Energie von einem Luciferase-Oxyluciferin-Komplex im angeregten Zustand oder von einem Ca2+.aktivierten Photoprotein. Der Chromophor ist modifizierte Aminosäurereste in dem Polypeptid. Die am besten charakterisierten GFPs sind diejenigen von Aequorea und Renilla (siehe z. B. Prasher et al. (1992) Gene 111: 229–233; Hart et al., (1979) Biochemistry 18: 2204–2210). Beispielsweise enthält ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) von Aequorea victoria 238 Aminosäuren, absorbiert blaues Licht und emittiert grünes Licht. Der Einschluß dieses Proteins in eine Zusammensetzung, die das Aequroin-Photoprotein enthält, beladen mit Coelenterazin und Sauerstoff, kann in Gegenwart von Calcium zur Erzeugung von grünem Licht führen. Es wird daher ins Auge gefasst, dass GFPs in die Biolumineszenz-erzeugenden Reaktionen eingeschlossen werden können, die die Aequorin- oder die Renilla-Luciferase oder eine andere geeignete Luciferase enthalten, um die Farbe der resultierenden Biolumineszenz zu verstärken oder zu ändern.
  • GFPs werden durch blaues Licht zur Emission von grünem Licht angeregt und können daher in Abwesenheit von Luciferase und in Verbindung mit einer äußeren Lichtquelle bei Novitäten verwendet werden, wie dies hier beschrieben wird. Ähnlich können blau fluoreszierende Proteine (BFs), wie von Vibrio fischeri, Vibrio harveyi oder Photobacterium phosphoreum, in Verbindung mit einer äußeren Lichtquelle mit einer geeigneten Wellenlänge verwendet werden, um blaues Licht zu erzeugen. (siehe beispielsweise Karatani et al., "A blue fluorescent Protein from a yellow-emitting luminous bacterium", Photochem. Photobiol. 55(2): 293–299 (1992); Lee et al., "Purification of a bluefluorescent Protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum" Methods Enzymol. (Biolumin. Chemilumin.) 57: 226–234 (1978); und Gast et al. "Separation of a blue fluorescence Protein from bacterial luciferase" Biochem. Biophys. Res. Commun. 80(1): 14–21 (1978), wobei jedes dieser Dokumente sowie die darin angegebenen Literaturstellen hier durch die Bezugnahme vollständig aufgenommen werden). GFPs und/oder BFPs oder andere derartige fluoreszierende Proteine können vor allem in den Getränk- und/oder Nahrungsmittel-Kombinationen, die hier beschrieben werden, verwendet werden und in Räumen serviert werden, die mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet werden, um die fluoreszierenden Proteine zum Fluoreszieren zu bringen.
  • GFPs und/oder BFPs oder andere derartige fluoreszierende Proteine können in jeder beliebigen Novität und in den Kombinationen, die hier beschrieben werden, verwendet werden, wie in Getränken und Spielzeugen, eingeschlossen blasenerzeugenden Spielzeugen, vor allem blasenerzeugenden Zusammensetzungen und Gemischen. Von besonderem Interesse ist ebenfalls die Verwendung dieser Proteine in Kosmetika, vor allem in Gesichtsfarben oder Make-ups, Haarfärbemitteln oder Haarkonditioniermitteln, Schäumen oder anderen derartigen Produkten. Derartige Systeme sind von besonderem Interesse, da keine Luciferase benötigt wird, um das Photoprotein zu aktivieren und weil die Proteine nicht toxisch und sicher bei der Anwendung auf der Haut, den Haaren, den Augen und beim Verzehr sind. Diese fluoreszierenden Proteine können auch zusätzlich zu Biolumineszenz-erzeugenden Systemen verwendet werden, um ein Array verschiedener Farben zu verstärken oder zu bilden.
  • Diese Proteine können einzeln oder in Kombination mit Biolumineszenz-erzeugenden Systemen verwendet werden, um ein Array von Farben zu erzeugen. Sie können in solchen Kombinationen verwendet werden, dass sich die Farbe beispielsweise von Getränken mit der Zeit ändert oder Schichten mit verschiedenen Farben einschließt.
  • (2) Phycobili-Proteine
  • Phycobili-Proteine sind wasserlösliche fluoreszierende Proteine, die von Cyanobakterien und eukaryotischen Algen abgeleitet werden (siehe z. B. Apt et al. (1995) J. Mol. Biol. 238: 79–96; Glazer (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36: 173–198; und Fairchild et al. (1994) J. of Biol. Chem. 269: 8686–8694). Diese Proteine sind als fluoreszierende Marker in Immunosassays verwendet worden (siehe Kronick (1986) J. of Immunolog. Meth. 92: 1–13), die Proteine wurden isoliert und die DNA, die sie codiert, steht ebenfalls im Handel zur Verfügung (siehe z. B. Pilot et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6983–6987; Lui et al. (1993) Plant Physiol 103: 293–294; und Houmard et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5512–5521; die Proteine sind im Handel beispielsweise von ProZyme Inc., San Leandro, CA, verfügbar).
  • In diesen Organismen sind die Phycobili-Proteine in subzellulären Strukturen, die als Phycobilisomen bezeichnet werden, angeordnet, und sie haben die Funktion von akzessorischen Pigmenten, die an Photosynthesereaktionen teilnehmen, indem sie sichtbares Licht absorbieren und die abgeleitete Energie über einen direkten Fluoreszenzenergie-Transfermechanismus auf das Chlorophyll übertragen.
  • Zwei Klassen von Phycobili-Proteinen sind auf der Basis ihrer Farbe bekannt: Phycoerythrine (rot) und Phycocyanine (blau), über die berichtet wurde, dass sie Absorptionsmaxima zwischen 490 und 570 nm bzw. zwischen 610 und 665 nm haben.
  • Phycoerythrine und Phycocyanine sind heterogene Komplexe, die in unterschiedlichen Verhältnissen aus dem α-Monomer und dem β-Monomer zusammengesetzt sind, an die eine oder mehrere Klassen linearer Tetrapyrrol-Chromophore kovalent gebunden sind. Spezielle Phycobili-Proteine können auch eine dritte γ-Untereinheit enthalten, die oft mit aggregierten (αβ)6-Proteinen assoziiert.
  • Alle Phycobili-Proteine enthalten entweder das Phycothrombilin- oder das Phycoerythobilin-Chromophor, und sie können außerdem andere Biline, Phycourobilin, Cryptoviolin oder das 697-nm-Bilin enthalten. Die γ-Untereinheit ist kovalent mit Phycourobilin verbunden, was zu dem Absorptionspeak des B- und des R-Phycoerythrins bei 495–500 nm führt. Die spektralen Eigenschaften der Phycobiliprotein können demnach durch die Kombination der verschiedenen Chromophore, die Zusammensetzung der Untereinheiten der Apophycobili-Proteine und/oder die lokale Umgebung, die die tertiäre und quartäre Struktur der Phycobiliproteine hervorrufen, beeinflusst werden.
  • Wie oben für die GFPs und die BFPs beschrieben werden auch die Phycobili-Proteine durch sichtbares Licht mit der geeigneten Wellenlänge aktiviert und können demnach in Abwesenheit von Luciferase und in Verbindung mit einer äußeren Lichtquelle verwendet werden, um Neoplasien und Spezialgewebe wie hier beschrieben zu beleuchten. Weiterhin ist die Befestigung der Phycobili-Proteine an festen Trägermatrizes bekannt (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 4,714,682 ; 4,767,206 ; 4,774,189 und 4,867,908 ). Wie oben erwähnt können diese Proteine in Kombination mit anderen fluoreszierenden Proteinen und/oder Biolumineszenz-erzeugenden Systemen verwendet werden, um ein Array von Farben zu erzeugen oder zeitabhängig verschiedene Farben bereitzustellen.
  • Wie weiter oben beschrieben ist die Befestigung von Phycobili-Proteinen auf festen Trägermatrizes bekannt (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 4,714,682 ; 4,767,206 ; 4,774,189 und 4,867,908 ). Daher können Phycobili-Proteine an Mikroträger gekoppelt werden, die an eine oder mehrere Komponenten der Biolumineszenzreaktion, vorzugsweise eine Luciferase, gekoppelt sind, um die Wellenlänge des durch die Biolumineszenzreaktion erzeugten Lichts umzuwandeln. Mikroträger, die an ein oder mehrere Phycobiliproteine gekoppelt sind, können in jedem der hier beschriebenen Verfahren verwendet werden.
  • Die Umwandlung von blauem oder grünem Licht in Licht mit einer längeren Wellenlänge, d. h. in rotes Licht oder Licht im nahen Infrarot, ist für die Sichtbarmachung von tiefen Neoplasien oder tiefem Spezialgewebe unter Verwendung eines Laparoskops oder eines Computertomogramm-Bildgebungssystems wie hier beschrieben besonders bevorzugt.
  • Wenn demnach eine Änderung der Frequenz des emittierten Lichts erwünscht ist, kann das Phycobili-Protein in die Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten einbezogen werden.
  • C. ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON NUCLEINSÄUREN, DIE LUCIFERASEN UND GFPs codieren
  • Nucleinsäuren und Biolumineszenzproteine, die zwei neue grün fluoreszierende Proteine (GFPs) und drei Coelenterazin-verwendende Luciferasen einschließen, werden beschrieben. Ein Vorteil der Coelenterazin-verwendenden Luciferasen besteht in vielen Anwendungen, vor allem analytischen Anwendungen, darin, dass nur das lichtemittierende Luciferin und molekularer Sauerstoff benötigt werden; Cofaktoren wie ATP oder Ca2+ sind nicht erforderlich.
  • Die Nucleinsäuren, die diese Luciferasen und GFPs codieren, können auch verwendet werden, um verwandte Nucleinsäuren von verwandten Arten zu isolieren. Ebenfalls beschrieben werden hier Verfahren zum Isolieren von zusätzlichen Genen, die Luciferasen und vor allem GFPs codieren, aus verwandten Arten, für die es sich bislang gezeigt hat, dass die Isolierung schwierig ist.
  • Nucleinsäuren, die die Luciferasen von Renilla mulleri, Pleuromamma, Gaussia und Ptilosarcus codieren, sind isoliert worden. Diese Nucleinsäuren sind in Plasmide und Expressionsvektoren und in geeignete Wirtszellen eingeführt worden oder können darin eingeführt werden. Die Wirtszellen sind verwendet worden und können verwendet werden, um das codierte Protein herzustellen, das für jede der hier beschriebenen oder dem Fachmann bekannten Anwendungen verwendet werden kann.
  • Die klonierten DNA-Fragmente können in Bakterienzellen, vorzugsweise in E. coli, repliziert werden. Ein bevorzugtes DNA-Fragment schließt auch einen bakteriellen Replikationsursprung ein, um das Fortbestehen des DNA-Fragments von Generation zu Generation der Bakterien zu gewährleisten. Auf diese Weise können große Mengen des DNA-Fragments durch die Replikation in Bakterien erzeugt werden. Bevorzugte bakterielle Replikationsursprünge schließen nicht einschränkend den f1-ori- und den co1-E1-Replikationsursprung ein. Bevorzugte Wirte enthalten chromosomale Kopien der DNA, die die T7-RNA-Polymerase codiert, funktionsfähig verbunden mit einem induzierbaren Promotor, wie dem lacUV-Promotor (siehe U.S.-Patent Nr. 4,952,496 ). Derartige Wirte schließen nicht einschränkend die lysogenen E. coli-Stämme HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) und BL21(DE3) ein. Der Stamm BL21(DE3) ist bevorzugt. Die pLys-Stämme liefern niedrige Konzentrationen an T7-Lysozym, einem natürlichen Inhibitor der T7-RNA-Polymerase.
  • Für die Expression und für die Herstellung von mutierten Proteinen, wie temperaturempfindlichen mutierten Proteinen, sind eukaryotische Zellen, darunter Hefezellen, wie Saccharomyces, bevorzugt.
  • Fusionsproteine aus den Luciferasen und den GFPs werden ebenfalls bereitgestellt. Verfahren für deren Verwendung werden ebenfalls beschrieben.
  • Die Verfahren werden in Bezug auf die Nucleinsäuren und die Proteine von Renilla und Gaussia beschrieben. Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um die Nucleinsäuren und Proteine von Ptilosarcus und Pleuromamma zu identifizieren und isolieren, die hier bereitgestellt werden.
  • Das GFP, das aus Renilla mulleri kloniert wurde, hat spektrale Eigenschaften, die es besonders nützlich machen. Zu diesen Eigenschaften gehören eine sehr hohe Quantenausbeute, ein hohes molares Absorptionsvermögen und eine effiziente Verwendung mit den allgemein verfügbaren Fluorescein-Filtern (z. B. Endo-GFP-Filterset, von Chroma im Handel erhältlich). Es ist bekannt, dass Renilla reniformis-GFP sechsfach heller als das Wildtyp-Aequorea-GFP ist, auf einer molaren Basis, und dreifach bis vierfach heller als die hellste Mutante. Das Renillia mulleri-GFP, das durch die Nucleinsäureklone codiert wird, die hier bereitgestellt werden, zeigt ähnliche funktionelle Charakteristika, und die Spektren erscheinen identisch mit den Spektren des nativen reniformis-GFPs.
  • Auf der Basis der Form der Anregungskurve und der Form der Emissionskurve hat das hier bereitgestellte Ptilosarcus-GFP ein molares Absorptionsvermögen, das sogar größer als das molare Absorptions vermögen des R. mulleri-GFPs ist, und es sollte daher sogar noch heller sein.
  • Die Gaussia-Luciferase und die Pleuromama-Luciferase sind die ersten beiden Copepod-Luciferasen, die kloniert wurden; beide werden ausgeschieden und sollten so effektive Marker für sezernierte Proteine sein. Die Gaussia-Luciferase ist die kleinste Luciferase, die bislang gefunden wurde (MG 19900). Alle Luciferasen zeigen das typische Ausgabespektrum der Coelenterazin-verwendenden Luciferasen. Alle zeigen eine starke Abhängigkeit von der Kationenkonzentration, benötigen aber keine zweiwertigen Kationen (Daten nicht gezeigt). Keine der Luciferasen hat eine erhebliche Homologie mit den Luciferasen, die aus anderen Arten isoliert wurden.
  • Es gibt jedoch eine beträchtliche Homologie zwischen dem Ptilosarcus-GFP und dem R. mulleri-GFP (~80%), jedoch nur ein geringe Homologie mit dem A. victoria-GFP (~25%). Unabhängig hiervon haben alle drei Proteine eine Länge von 238 AS, was darauf schließen lässt, dass die Strukturen der drei Proteine ähnlich sind. Der Sequenzvergleich zwischen den GFPs, die aus Aequorea victoria, Renilla mulleri und Ptilosarcus isoliert wurden, zeigt, dass die Chromophor-Sequenzen von R. mulleri und Ptilosarcus identisch sind und von der von A. victoria abweichen. Diese Sequenzunterschiede weisen auf Proteinstellen hin, die verändert werden können, ohne dass die wesentlichen Fluoreszenzeigenschaften beeinträchtigt werden, und sie stellen auch einen Weg für die Identifizierung von Resten dar, die diese Eigenschaften verändern.
  • ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG EINER NUCLEINSÄURE, DIE EINE Gaussia-LUCIFERASE CODIERT
  • 1. Isolierung von Proben aus der Gattung Gaussia
  • Proben von Gaussia sind leicht aus den Weltmeeren erhältich, eingeschlossen der Golf von Mexiko, der Pazifische Ozean und der Atlantische Ozean. Die Arten, die hier für die Isolierung der beispielhaften Nucleinsäure verwendet werden, wurden aus dem Pazifischen Ozean vor der Küste Südkaliforniens im San Pedro- und San Clemente-Becken isoliert. Die Lebewesen werden durch das Sieben von Meerwasserproben im Dunkeln und das Auswählen der leuchtenden Copepoden identifiziert. Nach dem Einfangen werden die Proben sorgfältig gewaschen und können auch seziert werden, um eine Anreicherung in Bezug auf lichtemittierende Gewebe zu erhalten. Die unversehrten Organismen oder die sezierten Gewebe werden dann schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
  • Wie in den folgenden Beispielen detailliert beschrieben wurden unversehrte Gaussia als Quelle für die Isolierung von Nucleinsäuren verwendet, die eine Gaussia-Luciferase codieren (siehe z. B. SEQ ID NO: 19).
  • 2. Herstellung einer Gaussia-cDNA-Expressionsbank
  • Gaussia-cDNA-Expressionsbanken können aus intakter RNA gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder durch andere dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.; U.S.-Patent Nr. 5,292,658 ).
  • Die Herstellung von cDNA-Banken schließt typischerweise die Isolierung der polyadenylierten RNA aus dem ausgewählten Organismus ein, auf die die Einzelstrang-DNA-Synthese unter Verwendung von Reverser Transkriptase, der Verdau des RNA-Strangs des DNA/RNA-Hybrids und die nachfolgende Umwandlung der einzelsträngigen DNA in doppelsträngige cDNA folgen.
  • a. RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
  • Vollständige Gaussia wurde als Quelle für die gesamte cytoplasmische RNA für die Herstellung der Gaussia-cDNA verwendet. Die gesamte intakte RNA kann unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Nach dem Isolieren der kompletten zellulären RNA werden dann die polyadenylierten RNA-Moleküle leicht von den nicht polyadenylierten Molekülen unter Verwendung der Affinitätschromatographie auf Oligodeoxythymidylat-Cellulose-Säulen getrennt (wie z. B. von Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408 beschrieben).
  • Die gereinigte Gaussia-polyA-mRNA wird dann einer cDNA-Synthesereaktion unterzogen, um aus der vollständigen polyA-mRNA eine cDNA-Genbank zu erzeugen. Kurz gesagt wird eine Reverse Transkriptase verwendet, um einen angelagerten polydT-Primer zu verlängern, um ein RNA/DNA-Duplex zu erzeugen. Der RNA-Strang wird dann unter Verwendung einer RNase, z. B. der RNase H, verdaut, und nach der Synthese des zweiten Stranges werden bei den cDNA-Molekülen mit S1-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease glatte Enden erzeugt. Die resultierenden doppelsträngigen cDNA-Fragmente können direkt in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden, alternativ können Oligonucleotid-Linker, die Restrikti onsendonucleasestellen codieren, mit dem 5'-Ende der cDNA-Moleküle verknüpft werden, um die Klonierung der cDNA-Moleküle zu erleichtern.
  • b. Konstruktion der cDNA-Expressionsbanken
  • Die am besten charakterisiertetn Vektoren für die Konstruktion der cDNA-Expressionsbanken sind Lambda-Vektoren. Vektoren auf Lambda-Basis tolerieren cDNA-Insertionen von etwa 12 kb und bieten eine größere Einfachheit beim Durchmustern der Genbank, bei der Amplifikation und der Lagerung, verglichen mit standardmäßigen Plasmidvektoren. Derzeit bevorzugte Vektoren für die Herstellung der Gaussia-cDNA-Expressionsbanken (und der anderen hier angegebenen Genbanken) sind die Vektoren Lambda, Uni-Zap, Lambda-Zap II oder Lambda-ZAP Express/EcoRI/XhoI, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,128,256 ), die auch im Handel erhältlich sind (Stratagene, La Jolla, CA).
  • Allgemein kombinieren die Lambda-Zap-Vektoren die hohe Effizienz eines Bakteriophagen-Lambda-Vektorsystems mit der Vielseitigkeit eines Plasmidsystems. Fragmente, die in diese Vektoren kloniert werden, können automatisch unter Verwendung eines Helfer-Phagen herausgeschnitten werden und wieder in die Ringform gebracht werden, um Subklone in dem pBK-abgeleiteten Phagemid zu erzeugen. Das pBK-Phagemid trägt das Ampicillin-Resistenzgen (AMP®) für die Selektion in Bakterien und die G418-Selektion in eukaryotischen Zellen oder kann das β-Lactamase-Resistenzgen enthalten. Die Expression des rekombinanten Polypeptids erfolgt unter der Kontrolle des lacZ-Promotors in Bakterien und des CMV-Promotors in Eukaryoten.
  • Genauer sind diese Vektoren auf Lambda-Basis aus einer Initiator-Terminator-Kassette zusammengesetzt, die das Plasmidsystem, z. B. das wohlbekannte pBK-Bluescript-Derivate (erhältlich von Stratagene), eingeklammert vom rechten und linken Arm des Bakteriophagen Lambda, enthält. Die Lambda-Arme ermöglichen das effiziente Verpacken von replizierter DNA, während die herausschneidbare Initiator-Terminator-Kassette die einfache Klonierung der cDNA-Fragmente und die Erzeugung einer Plasmid-Bank ohne das Erfordernis der zusätzlichen Subklonierung ermöglicht.
  • Wenn sie hier verwendet werden, werden die cDNA-Fragmente in die multiple Klonierungsstelle insertiert, die innerhalb der Initiator-Terminator-Kassette des Lambda-Zap-Vektors enthalten ist, um einen Satz von cDNA-Expressionsvektoren zu erzeugen. Mit dem Satz von cDNA-Expressionsvektoren infiziert man geeignete E. coli-Zellen, gefolgt von der Coinfektion mit einem filamentösen Helfer-Phagen. Innerhalb der Zelle erkennen transwirkende Proteine, die von dem Helfer-Phagen codiert werden, z. B. das Gen II-Protein von M13, zwei getrennte Domänen, die innerhalb der Lambda-Arme des Vektors positioniert sind, und führen einzelsträngige Nicks ein, die die Initiator-Terminator-Kassette flankieren. Bei einer nachfolgenden Runde der DNA-Synthese wird ein neuer DNA-Strang synthetisiert, der den vorhandenen Nick-Strang ersetzt unter Freisetzung der Initiator-Terminator-Kassette. Der ersetzte Strang wird dann ringförmig gemacht, von den Helferproteinen als filamentöser Phage verpackt und aus der Zelle abgesondert. Das BK-Plasmid, das die cDNA enthält, wird durch die Infektion eines F'-Stammes von E. coli und die Plattierung der infizierten Zellen auf festem Medium, das für die Selektion von pBK-haltigen Zellen mit Ampicillin ergänzt ist, gewonnen.
  • Die Gaussia-cDNA-Expressionsbank kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgemustert werden. Die Identifizierung der Gaussia-Luciferase kann beispielsweise unter Verwendung eines funktionellen Durchmuste rungsverfahrens durch die visuelle Beobachtung der Kolonien im Hinblick auf die Emission von blauem Licht oder durch die Beobachtung der Lichtemission unter Verwendung eines oder mehrerer Bandpassfilter erreicht werden.
  • 3. Isolierung und Identifizierung von DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert
  • Eine DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert, kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren oder von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Wie weiter unten detailliert beschrieben, wurde eine Gaussia-λ-Uni-Zap-cDNA-Expressionsplasmid-Bank hergestellt, in kompetente E. coli-Zellen transformiert und auf modifizierte L-Broth-Platten plattiert, die Ruß enthielten, um die Hintergrundfluoreszenz zu absorbieren (siehe z. B. die BEISPIELE).
  • Die Transformanten wurden mit einer Lösung besprüht, die IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid; siehe z. B. Nakamura et al. (1979) Cell 18: 1109–1117) enthielt, um die Expression der rekombinanten Gaussia-Luciferase durch die heterologe DNA hervorzurufen. Andere Induktionssysteme können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Promotorregionen sind diejenigen, die in E. coli induzierbar und funktionsfähig sind, oder frühe Gene in Vektoren viraler Herkunft. Beispiele für geeignete induzierbare Promotoren und Promotorregionen schließen nicht einschränkend ein: den E. coli-lac-Operator, der auf Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid reagiert (IPTG; siehe z. B. Nakamura et al. (1979) Cell 18: 1109–1117), den Metallothionein-Promotor, Metall-regulatorische Elemente, die auf eine Induktion durch Schwermetalle (z. B. Zink) reagieren (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,870,009 von Evans et al.); den Phagen-T7-lac-Promotor, der auf IPTG reagiert (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,952,496 ; und Studier et al. (1990) Meth. Enzymol. 185: 60–89) und den TAC-Promotor. Andere Promotoren schließen nicht einschränkend den T7-Phagen-Promotor und andere T7-artige Phagen-Promotoren, wie den T3-, T5- und SP6-Promotor, den trp-, lpp- und lac-Promotor, wie den lacUV5-Promotor von E. coli; den P10- oder Polyhedrin-Gen-Promotor von Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystemen (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,243,041 , 5,242,687 , 5,266,317 , 4,745,051 und 5,169,784 ) und induzierbare Promotoren anderer eukaryotischer Expressionssystemen ein.
  • Besonders bevorzugte Plasmide für die Transformation von E. coli-Zellen schließen die pET-Expressionsvektoren ein (siehe U.S.-Patent 4,952,496 ; im Handel erhältlich von NOVAGEN, Madison, WI; siehe auch die Literatur, die von Novagen veröffentlicht wurde, die das System beschreibt). Derartige Plasmide schließen ein: pET 34 (siehe 1), pET 11a, das den T7-lac-Promotor, T7-Terminator, den induzierbaren E. coli-lac-Operator und das lac-Regressorgen enthält; pET 12a-c, das den T7-Promotor, den T7-Terminator, und das E. coliompT-Sekretionssignal enthält; und pET 15b (NOVAGEN, Madison, WI), das eine His-TagTM-Leadersequenz zur Verwendung bei der Reinigung mit einer His-Säule und einer Thrombinspaltungsstelle, die die Spaltung nach der Reinigung über die Säule ermöglicht; die T7-lac-Promotorregion und den T7-Terminator enthält. Das Plasmid pET34 enthält weiterhin die CBD, die bei der Reinigung hilft.
  • Besonders bevorzugte Plasmide für die Transformation von E. coli-Zellen schließen die pET-Expressionsvektoren ein (siehe U.S.-Patent 4,952,496 ; im Handel von NOVAGEN, Madison, WI, erhältlich). Das Plasmid pET34-LIC ist beispielsweise ein prokaryotischer Expressionsvektor, der eine multiple Klonierungsstelle für die Insertion von heterologen DNA-Templates stromabwärts eines Bakteriophagen-T7-Promotors enthält. Die Transformation in einen bakteriellen Wirt, der die T7-RNA-Polymerase exprimiert, z. B. in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) führt zu einer starken rekombinanten Expression des heterologen Proteins. DNA, die die Gaussia-Luciferase codiert, wurde in den pET34-Vektor in Form einer Fusion mit der Cellulose-Bindungsdomäne insertiert (CBD; siehe SEQ ID NO: 21 und 22) und in E. coli-Wirtszellen exprimiert.
  • Über 120 verschiedene CBD-Sequenzen sind identifiziert worden und auf der Basis von Sequenzähnlichkeiten in mindestens 10 Klassen eingeteilt worden (Tomme et al. (1995) in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides; Saddler, J. M., und Penner, M., Hrsg.; American Chemical Society, Washington D. C.; S. 142–161). Die CBD-clos-Tag-Sequenz wird von dem Cellulose-Bindendungsprotein A (CbpA) von Clostridium cellulovorans (Goldstein et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 5762–5768) abgeleitet und hat eine hohe Affinität für kristalline Cellulose.
  • Um Luciferase-exprimierende Klone zu identifizieren, wurden die Transformanten, die auf schwarzem Agar gezüchtet wurden, mit Coelenterazin besprüht wurden.
  • Die Expression war offensichtlich auf Grund der Kolonien, die ein intensives blau-grünes Licht emittierten. Die leuchtenden Kolonien wurden ausgewählt. Die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion eines blau-grün emittierenden Transformanten wurde ermittelt (siehe z. B. SEQ ID NO: 19). Wie hier beschrieben codiert die 765-DNA-Insertion ein Polypeptid aus 185 Aminosäuren.
  • ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON NUCLEINSÄUREN, DIE Renilla-PROTEINE CODIEREN
  • 1. Isolierung von Proben aus der Gattung Renilla
  • Exemplare von Renilla sind einfach aus den Weltmeeren einschließlich dem Golf von Mexiko, dem Pazifik und dem Atlantik verfügbar. Renilla lebt typischerweise auf dem Meeresboden in einer Tiefe von 30 bis 100 Fuß und kann durch Losreißen gesammelt werden. Exemplare von R. kollikeri können beispielsweise vor der Küste von Kalifornien oder Baja, Mexiko, erhalten werden. Lebende Exemplare von Renilla können alternativ von einem kommerziellen Anbieter erworben werden (z. B. Gulf Marine Incorporated, Panacea, Fla). Beim Ergreifen oder beim Erhalt werden die Exemplare sorgfältig gewaschen und können auch seziert werden im Hinblick auf eine Anreicherung der lichtemittierenden Gewebe. Die vollständigen Organismen oder die sezierten Gewebe werden dann schockgefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
  • Wie in den Beispielen weiter unten detailliert beschrieben, wurden die gefrorenen Gewebe als Quelle verwendet, um Nucleinsäuren zu isolieren, die das Renilla mulleri-GFP und die Renilla mulleri-Luciferase codieren (siehe z. B. SEQ ID NO: 15 bzw. SEQ NO: 17).
  • 2. Herstellung von Renilla-cDNA-Expressionsbanken
  • Renilla-cDNA-Expressionsbanken können aus intakter RNA gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt werden (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.; U.S.-Patent Nr. 5,292,658 ).
  • Die Herstellung der cDNA-Banken schließt typischerweise die Isolierung von polyadenylierter RNA aus dem ausgewählten Organismus ein, auf die die Einzelstrang-DNA-Synthese unter Verwendung der Reversen Transkriptase, der Verdau des RNA-Stranges des DNA/RNA-Hybrids und die nachfolgende Umwandlung der einzelsträngigen DNA in doppelsträngige cDNA folgen.
  • a. RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
  • Vollständige Renilla oder herausgeschnittene Renilla-Gewebe können als Quelle für die vollständige cytoplasmische RNA für die Herstellung von Renilla-cDNA verwendet werden. Vollständige intakte RNA kann aus zerkleinertem Renilla-Gewebe isoliert werden, beispielsweise unter Verwendung einer Abwandlung der Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind (siehe z. B. Chirgwin et al. (1970) Biochemistry 18: 5294–5299). Nach dem Isolieren der vollständigen zellulären RNA werden dann die polyadenylierten RNA-Moleküle problemlos unter Verwendung der Affinitätschromatographie auf Oligodeoxythymidylat-Cellulose-Säulen von den nicht polyadenylierten Molekülen getrennt (z. B. wie von Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408 beschrieben).
  • Die gereinigte Renilla-polyA-mRNA wird dann einer cDNA-Synthesereaktion unterzogen, um eine cDNA-Bank aus der vollständigen polyA-mRNA zu erzeugen. Kurz gesagt wird Reverse Transkriptase verwendet, um einen angelagerten polydT-Primer zu verlängern, um ein RNA/DNA-Duplex zu erzeugen. Der RNA-Strang wird dann unter Verwendung einer RNase, z. B. RNase H, verdaut, und nach der Synthese des zweiten Strangs werden die cDNA-Moleküle mit Hilfe von S1-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease mit glatten Enden versehen. Die resultierenden doppelsträngigen cDNA-Fragmente können dann direkt in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden, oder alternativ können Oligonucleotid-Linker, die Restriktionsendonucleasestellen codieren, mit den 5'-Enden der cDNA-Moleküle verknüpft werden, um die Klonierung der cDNA-Fragmente zu erleichtern.
  • b. Konstruktion von cDNA-Expressionsbanken
  • Die am besten charakterisierten Vektoren für die Konstruktion von cDNA-Expressionsbanken sind Lambda-Vektoren. Vektoren auf Lambda-Basis vertragen cDNA-Insertionen von etwa 12 kb und bieten eine größere Einfachheit bei der Durchmusterung der Bank, der Amplifikation und der Lagerung, verglichen mit standardisierten Plasmidvektoren. Derzeit bevorzugte Vektoren für die Herstellung von Renilla-cDNA-Expressionsbanken sind der Lambda-, Uni-Zap-, Lambda-Zap II- oder Lambda-ZAP Express/EcoRI/XhoI-Vektor, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,128,256 ) und die auch im Handel erhältlich sind (Stratagene, La Jolla, CA).
  • Allgemein kombinieren die Lambda-Zap-Vektoren die hohe Effizienz eines Bakteriophagen-Lambda-Vektor-Systems mit der Vielseitigkeit eines Plasmidsystems. Fragmente, die in diese Vektoren kloniert wurden, können automatisch unter Verwendung eines Helfer-Phagen herausgeschnitten werden und wieder in die Ringform übergeführt werden, um Subklone in dem pBK-abgeleiteten Phagemid zu erzeugen. Das pBK-Phagemid trägt das Neomycin-Resistengen für die Selektion in Bakterien und die G418-Selektion in eukaryotischen Zellen oder kann das β-Lactamase-Resistenzgen tragen. Die Expression des rekombinanten Polypeptids erfolgt in Bakterien unter der Kontrolle des lacZ-Promotors und in Eukaryoten unter der Kontrolle des CMV-Promotors.
  • Genauer sind diese Vektoren auf Lambda-Basis aus einer Initiator-Terminator-Kassette, die das Plasmidsystem enthält, z. B. ein pBK-Bluescript-Derivat (Stratagene, San Diego), das vom rechten und linken Arm des Bakteriophagen Lambda eingeklammert wird, zusammengesetzt. Die Lambda-Arme ermöglichen das effiziente Verpacken der replizierten DNA, während die herausschneidbare Initiator-Terminator-Kassette das leichte Klonieren der cDNA-Fragmente und die Erzeugung einer Plasmidbank ohne die Notwendigkeit einer zusätzlichen Subklonierung ermöglicht.
  • Wenn hier verwendet, werden die cDNA-Fragmente in die multiple Klonierungsstelle insertiert, die innerhalb der Initiator-Terminator-Kassette des Lambda-Zap-Vektors enthalten ist, um einen Satz cDNA-Expressionsvektoren zu erzeugen. Mit dem Satz cDNA-Expressionsvektoren werden geeignete E. coli-Zellen infiziert, gefolgt von der Coinfektion mit einem filamentösen Helfer-Pphagen. Innerhalb der Zelle erkennen trans-wirkende Proteine, die von dem Helferphagen codiert werden, z. B. das Gen II-Protein von M13, zwei getrennte Domänen, die innerhalb der Lambdaarme des Vektors positioniert sind, und führen einzelsträngige Nicks ein, die die Initiator-Terminator-Kassette flankieren. Bei einer darauf folgenden Runde der DNA-Synthese wird ein neuer DNA-Strang synthetisiert, der den vorhandenen Nickstrang unter Freisetzung der Initiator-Terminator-Kassette ersetzt. Der ersetzte Strang wird dann in die Ringform gebracht, durch die Helferproteine als filamentöser Phage verpackt und aus der Zelle abgesondert. Das BK-Plasmid, das die cDNA enthält, wird durch die Infektion eines F'-Stammes von E. coli und die Plattierung der infizierten Zellen auf festes Medium, das für die Selektion der pBK-haltige Zellen mit Kanamycin ergänzt ist, gewonnen.
  • Die Renilla-cDNA-Expressionsbank kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, durchgemustert werden. Die Identifizierung des Renilla-GFPs kann beispielsweise unter Verwendung eines funktionellen Durchmusterungsverfahrens, bei dem blaues Licht eingesetzt wird, und Beobachtung der Kolonien mit dem bloßen Auge im Hinblick auf die Emission von grünem Fluoreszenzlicht oder durch die Beobachtung der Lichtemission unter Verwendung eines oder mehrerer Bandpassfilter erreicht werden.
  • 3. Isolierung und Identifizierung von DNA, die Renilla-GFP codiert
  • Eine DNA, die ein Renilla-GFP codiert, kann unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren oder unter Anwendung anderer dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Wie weiter unten detailliert beschrieben, wurde eine R.-mulleri-λ-Uni-Zap-cDNA-Expressionsplasmid-Bank hergestellt, in kompetente E. coli-Zellen transformiert und auf modifizierte L-Broth-Platten plattiert, die Ruß enthielten, um die Hintergrundfluoreszenz zu absorbieren (siehe z. B. BEISPIEL 4). Die Transformanten wurden mit einer Lösung besprüht, die IPTG enthielt, um die Expression des rekombinanten Renilla-GFP durch die heterologe cDNA zu induzieren. Für die Identifizierung der GFP-exprimierenden Klone wurden die Transformanten in blauem Licht, vorzugsweise Licht von 470 bis 490 nm, angeordnet, und die Kolonien, die eine grüne Fluoreszenz emittieren, wurden isoliert und in Reinkultur gezüchtet.
  • Die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion eines grün fluoreszierenden Transformanten wurde bestimmt (siehe z. B. SEQ ID NO: 15). Wie in BEISPIEL 4 beschrieben, codiert die 1079-cDNA-Insertion ein Polypeptid aus 238 Aminosäuren, das nur zu 23,5% identisch mit dem A. victoria-GFP ist, dem einzigen anderen GFP, das auf molekularer Ebenen charakterisiert worden ist. Das rekombinante Protein zeigt ein Anregungs- und ein Emissionsspektrum, die den Spektren ähneln, über die für lebende Renilla-Arten berichtet wurde.
  • 4. Isolierung und Identifizierung von DNA, die eine Renilla-Luciferase codiert
  • Die oben beschriebene R. mulleri-cDNA-Expressionsbank wurde auch verwendet, um DNA zu klonieren, die eine R. mulleri-Luciferase codiert (siehe z. B. BEISPIEL 5). Einzelkolonie-Transformanten wurden auf modifizierten L-Broth-Platten gezüchtet, die Ruß enthielten, und die Expression der heterologen DNA wurde im Wesentlichen wie oben beschrieben mit IPTG induziert. Nachdem man Zeit für die Expression hat vergehen lassen, wurden die Transformanten mit Coelenterazin besprüht und im Hinblick auf die Kolonien durchgemustert, die blaues Licht emittieren. Die lichtemittierenden Kolonien wurden isoliert und in Reinkultur gezüchtet.
  • Die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion, die in dem lichtemittierenden Transformanten enthalten war, wurde bestimmt. Wie in BEISPIEL 5 beschrieben, codiert die 1217-cDNA-Insertion ein Polypeptid aus 311 Aminosäuren. Das rekombinante Protein zeigt ein Anregungs- und ein Emissionsspektrum, die den Spektren ähneln, über die für lebende Renilla-Arten berichtet wurde.
  • D. NUCLEINSÄURESONDEN UND VERFAHREN FÜR DIE ISOLIERUNG UND KLONIERUNG VON LUCIFERASE- UND GFP-CODIERENDEN NUCLEINSÄUREN ANDERER ARTEN
  • Gaussia
  • Die Nucleinsäure, die hier als Beispiel dient, die die Gaussia-Luciferase codiert, kann als eine Bezugsquelle für Sonden für die Isolie rung der Luciferasen von anderen Gaussia-Arten verwendet werden. Jede geeignete Sonde, die auf der beispielhaften Nucleotidsequenz basiert, kann in jedem Verfahren verwendet werden. Eine derartige Sonde sollte unter den Bedingungen einer zumindest geringen Stringenz, bevorzugter unter mittleren Stringenzbedingungen und am bevorzugtesten unter hohen Stringenzbedingungen mit verwandten Nucleinsäuren in einer geeigneten Gaussia-Bank hybridisieren.
  • Ebenfalls beschrieben werden hier spezifische Nucleinsäuresonden für die Isolierung und die Klonierung der Luciferase-codierenden Nucleinsäure von anderen Gaussia-Arten. Typischerweise sind die Nucleinsäuresonden entartete Sonden, die dann als Hybridisierungssonden für die Durchmusterung von cDNA-Banken verwendet werden, die von den ausgewählten Gaussia-Arten hergestellt wurden, um einen DNA-Klon zu erhalten, der eine Gaussia-Luciferase mit der vollen Länge codiert.
  • Bevorzugte Nucleinsäuresonden werden so ausgeführt, dass sie entartete Sonden aus mindestens 14 Nucleotiden, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotiden, sind, die auf diesen konservierten Aminosäurepositionen basieren. Besonders bevorzugte Regionen für die Entwicklung von Sonden basieren beispielsweise auf den Aminosäuren 1 bis 185, die in SEQ ID NO: 20 offenbart werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Nucleinsäuresonden, die die oben beschriebenen bevorzugten Aminosäureregionen codieren, aus der Nucleotidsequenz ausgewählt, die diese Regionen codiert, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird.
  • Alternativ können Peptide, die diesen Aminosäurepositionen entsprechen, unter Verwendung der Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), hergestellt und als Immunogene für die Immunisierung von Tieren verwendet werden, die dann Luciferase-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugen. Die Antikörper können verwendet werden, um cDNA-Expressionsbanken durchzumustern, wie diejenigen, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden, um Klone zu identifizieren, die partielle Klone oder Klone mit der vollen Länge exprimieren.
  • NUCLEINSÄURESONDEN UND VERFAHREN FÜR DIE ISOLIERUNG UND KLONIERUNG VON GFP-CODIERENDEN NUCLEINSÄUREN ANDERER Renilla-ARTEN
  • Die hier als Beispiel dienende Nucleinsäure, die das Renilla mulleri-GFP codiert, kann als eine Quelle für Sonden für die Isolierung der GFPs von anderen Renilla-Arten verwendet werden. Jede geeignete Sonde, die auf der beispielhaften Nucleotidsequenz basiert, kann in jedem Verfahren verwendet werden. Eine derartige Sonde sollte unter den Bedingungen einer niedrigen Stringenz mit verwandten Nucleinsäuren in einer geeigneten Renilla-Bank hybridisieren.
  • Ebenfalls hier beschrieben werden spezifische Nucleinsäuresonden für die Isolierung und Klonierung der GFP-codierenden Nucleinsäure von anderen Renilla-Arten. Diese Sonden basieren auf Regionen des Renilla-GFP-Proteins, die die verschiedenen Mitglieder aus der Gattung Renilla gemeinsam haben (siehe 1). Die Nucleinsäuresonden sind typischerweise entartete Sonden, die dann als Hybridisierungssonden für die Durchmusterung von cDNA-Banken verwendet werden, die von ausgewählten Renilla-Arten hergestellt wurden, um einen DNA-Klon zu erhalten, der ein Renilla-GFP mit der vollen Länge codiert.
  • Für die Aufklärung der Regionen des GFPs, die die Renilla-Arten gemeinsam haben, wurde gereinigtes Renilla reniformis-GFP einem spezifischen chemischen und proteolytischen Abbau, z. B. mit Trypsin und Proteinase Q, unterzogen, um eine Vielzahl kurzer Peptide für die Analyse zu erzeugen, wonach die Aminosäuresequenz der Renillareniformis-Peptide ermittelt wurde.
  • 1 zeigt eine Anordnung der abgeleiteten Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Renilla mulleri und die Aminosäuresequenz, die für die isolierten Renilla reniformis-GFP-Peptide ermittelt wurde. Obwohl die beiden Arten nahe verwandt sind, sind die Aminosäuresequenzen der Renilla-GFPs verschieden. Der Unterschied kann jedoch ausgenutzt werden, um spezifische Sonden zu konstruieren, da es hoch konservierte Regionen gibt. Die R. mulleri- und die R. reniformis-Sequenz sind bei 103 von 187 Resten identisch, die in Peptiden mit einer ausreichenden Länge vorhanden sind, für die zufriedenstellende Ausrichtungen erhalten werden.
  • Bestimmte Regionen der Aminosäuresequenzen sind in einem hohen Maß konserviert. Beispielsweise sind 18 von 19 Aminosäuren, die den Positionen 51 bis 69 der Renilla mulleri-Sequenz entsprechen, zwischen den beiden Renilla-GFPs identisch, eingeschlossen ein zusammenhängender Abschnitt von 16 identischen Aminosäureresten, der den Aminosäurepositionen 51 bis 65 entspricht. Ebenfalls wie in 1 gezeigt, hat das Renilla reniformis-GFP (siehe z. B. SEQ ID NO: 20) einen relativ hohen Grad an Sequenzähnlichkeit mit den Aminosäureresten, die den Aminosäuren 81 bis 106 der R. mulleri-Sequenz entsprechen (60,9%; 18 von 26 Aminosäuren sind identisch). Diese Regionen stellen daher die Sequenz für die Konstruktion von Sonden bereit.
  • Bevorzugte Nucleinsäuresonden werden so entworfen, dass sie entartete Sonden aus mindestens 14 Nucleotiden, vorzugsweise 16 bis 30 Nucleotiden, sind, die auf diesen konservierten Aminosäurepositionen basieren. Besonders bevorzugte Regionen für die Entwicklung von Sonden basieren beispielsweise auf den Aminosäuren 51 bis 68, 82 bis 98 und 198 bis 208, die in SEQ ID NO: 16 offenbart sind, auf der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 offenbart ist, den Aminosäuren 9–20, die in SEQ ID NO: 21 offenbart sind, und den Aminosäuren 39–53, die in SEQ ID NO: 23 offenbart sind. In anderen Ausführungsformen werden die Nucleinsäuresonden, die die oben beschriebenen bevorzugten Aminosäureregionen codieren, aus der Nucleotidsequenz ausgewählt, die diese Regionen codiert, die in SEQ ID NO: 15 offenbart wird. Diese entarteten Nucleinsäuresonden können als Hybridisierungssonden für die Isolierung und Klonierung der GFP-codierenden DNA in Renilla reniformis und in anderen Arten verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich können diese Sonden als Primer in Nucleinsäureamplifikationsreaktionen verwendet werden.
  • Alternativ können Peptide, die diesen Aminosäurepositionen entsprechen, unter Verwendung der Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), hergestellt und als Immunogene für die Immunisierung von Tieren verwendet werden, die dann Renilla-GFP-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugen. Die Antikörper können verwendet werden, um cDNA-Expressionsbanken durchzumustern, wie diejenigen, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden, um Klone zu identifizieren, die einen partiellen Klon oder einen Klon mit der vollen Länge exprimieren, der alle Aminosäurereste 51 bis 69 des Renilla mulleri-GFPs oder einen Teil davon exprimiert (siehe z. B. 1; SEQ ID NO: 15 und 16).
  • Andere Arten
  • Ähnliche Verfahren können mit den hier beschriebenen Nucleinsäuren verwendet werden, die die Ptilosarcus- und die Pleuromamma-Proteine codieren.
  • E. REKOMBINANTE EXPRESSION VON PROTEINEN
  • Gaussia
  • 1. DNA, die Gaussia-Proteine codiert
  • Wie weiter oben beschrieben kann DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert, aus natürlichen Quellen isoliert werden, auf der Basis der Gaussia-Nucleinsäuresequenzen, die hier bereitgestellt werden, synthetisiert werden oder unter Verwendung einer Anzahl an rekombinanten DNA-Klonierungs- und Amplifikationstechniken, z. B. der Polymerasekettenreaktion (PCR), erzeugt werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen hat das DNA-Fragment, das eine Gaussia-Luciferase codiert, die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird. In bevorzugteren Ausführungsformen codiert das DNA-Fragment die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotide 37–591 der Nucleotidsequenz codiert wird, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird.
  • 2. DNA-Konstrukte für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen
  • DNA wird in ein Plasmid für die Expression in einem gewünschten Wirt eingeführt. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Wirt ein bakterieller Wirt. Die Nucleotidsequenzen in den Plasmiden, die regulatorische Regionen, wie Promotoren und Operatoren, sind, werden funktionsfähig für die Transkription der Nucleotidsequenz miteinander kombiniert, die eine Gaussia-Luciferase codiert. Die Nucleotidsequenz, die die Gaussia-Luciferase codiert, kann auch eine DNA einschließen, die ein Sekretionssignal codiert, wobei dann das resultierende Peptid ein Vorläufer der Gaussia-Luciferase ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen schließen die DNA-Plasmide auch eine Transkriptionsterminationssequenz ein. Die Promotorregionen und Transkriptionsterminatoren werden unabhängig voneinander vom gleichen oder von verschiedenen Genen ausgesucht.
  • Eine große Vielzahl von Vielzweckvektoren, die für die Expression von heterologen Proteinen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich. Expressionsvektoren, die induzierbare Promotoren oder konstitutive Promotoren enthalten, die mit regulatorischen Regionen verknüpft sind, sind bevorzugt. Derartige Promotoren schließen nicht einschränkend den T7-Phagen-Promotor und andere T7-artige Phagen-Promotoren, wie den T3-, den T5- und den SP6-Promotor, den trp-, lpp-, tet- und den lac-Promotor, wie den lac-UV5-Promotor von E. coli; den SV40-Promotor, den P10- oder Polyeder-Gen-Promotor des Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystems, retrovirale LTRs (long-terminal repeats) und induzierbare Promotoren anderer eukaryotischer Expressionssysteme ein.
  • 3. Wirtsorganismen für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen
  • Wirtsorganismen schließen die Organismen ein, in denen die rekombinante Erzeugung heterologer Proteine durchgeführt worden ist, wie z. B. nicht einschränkend Bakterien (zum Beispiel E. coli), Hefe (zum Beispiels Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris), Pilze, Baculovirus/Insekten- Systeme, Amphibienzellen, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen. Die bevorzugtesten Wirtsorganismen sind die Stämme von E. coli oder Saccharomyces cerevisiae.
  • 4. Verfahren für die rekombinante Erzeugung von Gaussia-Proteinen
  • Die DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert, wird in ein Plasmid in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem geeigneten Promotor für die Expression von Polypeptiden in einem ausgewählten Wirtsorganismus eingeführt. Das DNA-Fragment, das die Gaussia-Luciferase codiert, kann auch ein Proteinsekretionssignal einschließen, das in dem ausgewählten Wirt die Funktion hat, das reife Polypeptid in das Periplasma oder das Kulturmedium zu lenken. Die resultierende Luciferase kann durch Verfahren gereinigt werden, die auf dem Fachgebiet routinemäßig eingesetzt werden, eingeschlossen die Verfahren, die im Folgenden in den Beispielen beschrieben werden.
  • Verfahren für die Transformation geeigneter Wirtszellen, vorzugsweise von Bakterienzellen und noch bevorzugter E. coli-Zellen, sowie Verfahren, die für die Kultivierung dieser Zellen, die ein Gen enthalten, das ein heterologes Protein codiert, sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
  • Sobald das Gaussia-codierende Nucleinsäuremolekül in die Wirtszelle eingeführt worden ist, wird das gewünschte Protein erzeugt, indem die Wirtszelle den Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen der Promotor induziert wird, wodurch die funktionsfähig verknüpfte DNA transkribiert wird. Die zellulären Extrakte der lysierten Zellen, die das Protein enthalten, können hergestellt werden, und die resultierenden "geklärten Lysate" können als Quelle für die Luciferase eingesetzt werden. Alternativ kann das Lysat zusätzlichen Reinigungsschritten unterzogen werden (z. B. Ionenaustauschchromatographie oder Immunaffinitätschromatographie), um das Lysat weiter anzureichern oder um eine homogene Quelle für das gereinigte Enzym bereitzustellen (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155 ).
  • Renilla
  • 1. DNA, die Renilla-Proteine codiert
  • Wie oben beschrieben kann eine DNA, die ein Renilla-GFP oder eine Renilla-Luciferase codiert, aus natürlichen Quellen isoliert werden, auf der Basis von Renilla-Sequenzen synthetisiert werden, die hier beschrieben werden, oder unter Verwendung einer Anzahl an rekombinanten DNA-Klonierungs- und DNA-Amplifikationstechniken, z. B. Polymerasekettenreaktion (PCR), kloniert werden.
  • Das DNA-Fragment, das ein Renilla-GFP codiert, kann die Aminosäuresequenz haben, die in SEQ ID NO: 16 offenbart wird. Das DNA-Fragment codiert die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotide 259–972 der Nucleotidsequenz codiert wird, die in SEQ ID NO: 15 offenbart wird.
  • Das DNA-Fragment, das eine Renilla-Luciferase codiert, kann die Aminosäuresequenz haben, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird. Das DNA-Fragment codiert die Aminosäuresequenz, die von den Nucleotiden 31–963 der Nucleotidsequenz codiert wird, die in SEQ ID NO: 17 offenbart wird.
  • 2. DNA-Konstrukte für die rekombinante Erzeugung von Renilla-Proteinen
  • DNA wird für die Expression in einem gewünschten Wirt in ein Plasmid eingeführt. Es wird ins Auge gefasst, dass der Wirt ein bakterieller Wirt ist. Die Nucleotidsequenzen in den Plasmiden, die regulatorische Sequenzen sind, wie Promotoren und Operatoren, werden funktionsfähig miteinander für die Transkription der Nucleotidsequenz kombiniert, die ein Renilla-GFP oder eine Renilla-Luciferase codiert. Die Nucleotidsequenz, die das mutierte FGF-Protein codiert, kann auch DNA einschließen, die ein Sekretionssignal codiert, wobei dann das resultierende Peptid ein Vorläufer des Renilla-GFPs ist.
  • Die DNA-Plasmide schließen vorzugsweise auch eine Transkriptionsterminatorsequenz ein. Die Promotorregionen und die Transkriptionsterminatoren werden unabhängig voneinander vom gleichen Gen oder von verschiedenen Genen ausgewählt.
  • Eine große Vielzahl von Vielzweckvektoren, die für die Expression von heterologen Proteinen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich. Expressionsvektoren, die induzierbare Promotoren oder konstitutive Promotoren enthalten, die mit regulatorischen Regionen verknüpft sind, sind bevorzugt. Derartige Promotoren schließen nicht einschränkend den T7-Phagen-Promotor und andere T7-artige Phagen-Promotoren, wie den T3-, T5- und SP6-Promotor, den trp-, lpp-, tet- und lac-Promotor, wie den lacUV5-Promotor von E. coli; den SV40-Promotor; den P10- oder Polyreder-Gen-Promotor von Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystemen, retrovirale LTRs (long-terminal repeats) und induzierbare Promotoren anderer eukaryotischer Expressionssysteme ein.
  • Besonders bevorzugte Vektoren für die rekombinante Expression von Renilla mulleri in prokaryotischen Organismen sind die Vektoren auf lac- und T7-Promotorbasis, wie die wohlbekannten Bluescript-Vektoren, die im Handel erhältlich sind (Stratagene, La Jolla, CA).
  • 3. Wirtsorganismen für die rekombinante Erzeugung von Renilla-Proteinen
  • Die Wirtsorganismen schließen die Organismen ein, in denen die rekombinante Erzeugung heterologer Proteine durchgeführt worden ist, wie z. B. nicht einschränkend Bakterien (zum Beispiel E. coli), Hefe (zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris), Pilze, Baculovirus/Insekten-Systeme, Amphibienzellen, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen. Die bevorzugtesten Wirtsorganismen sind die Stämme von E. coli oder Saccharomyces cerevisiae.
  • 4. Verfahren für die rekombinante Erzeugung von Renilla-Proteinen
  • Die DNA, die eine Renilla-GFP oder eine Renilla mulleri-Luciferase codiert, wird in ein Plasmid in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem geeigneten Promotor für die Expression von Polypeptiden in einem ausgewählten Wirtsorganismus eingeführt. Das DNA-Fragment, das das Renilla-GFP oder die Renilla-Luciferase codiert, kann auch ein Proteinsekretionssignal einschließen, das in dem ausgewählten Wirt die Funktion hat, das reife Polypeptid in das Periplasma oder das Kulturmedium zu lenken. Das resultierende Renilla-GFP oder die resultierende Renilla-Luciferase kann durch Verfahren gereinigt werden, die auf dem Fachgebiet routinemäßig eingesetzt werden, eingeschlossen die Verfahren, die im Folgenden in den Beispielen beschrieben werden.
  • Verfahren für die Transformation geeigneter Wirtszellen, vorzugsweise Bakterienzellen und noch bevorzugter E. coli-Zellen, sowie Verfahren, die für die Kultivierung der Zellen, die ein Gen enthalten, das ein heterologes Protein codiert, sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
  • Sobald das Renilla-codierende Nucleinsäuremolekül in die Wirtszelle eingeführt worden ist, wird das gewünschte Renilla-GFP erzeugt, indem die Wirtszelle den Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen der Promotor induziert wird, wodurch die funktionsfähig verknüpfte DNA transkribiert wird. Die zellulären Extrakte der lysierten Zellen, die das Protein enthalten, können hergestellt werden, und das resultierende "geklärte Lysat" wurde als Quelle für das rekombinante Renilla-GFP oder die rekombinante Renilla mulleri-Luciferase eingesetzt. Alternativ kann das Lysat zusätzlichen Reinigungsschritten unterzogen werden (z. B. Ionenaustauschchromatographie oder Immunaffinitätschromatographie), um das Lysat weiter anzureichern oder um eine homogene Quelle für das gereinigte Enzym bereitzustellen (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155 ).
  • F. REKOMBINANTE ZELLEN, DIE HETEROLOGE NUCLEINSÄUREN EXPRIMIEREN, DIE LUCIFERASEN UND GFPs CODIEREN
  • Diese Zellen, Vektoren und Verfahren werden beispielhaft unter Bezugnahme auf Renilla und Gaussia dargestellt. Die gleichen Zellen, Vektoren und Verfahren können für die Expression der Proteine von Pleuromamma und Ptilosarcus verwendet werden.
  • Gaussia
  • Rekombinante Zellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die eine Gaussia-Luciferase codiert, werden bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen exprimieren die rekombinanten Zellen die codierte Gaussia-Luciferase, die funktionsfähig und für die Zelle nicht toxisch ist. In noch bevorzugteren Ausführungsformen enthält die Gaussia-Luciferase die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die rekombinanten Zellen auch eine heterologe Nucleinsäure einschließen, die eine oder mehrere Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, vorzugsweise ein fluoreszierendes Protein, codiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nucleinsäure, die die Komponente(n) des Biolumineszenz-erzeugenden Systems codiert, aus den Arten von Aequorea, Vargula oder Renilla isoliert. In bevorzugteren Ausführungsformen ist die zusätzliche Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems ein Renilla mulleri- oder Renilla reniformis-GFP.
  • Das Renilla-GFP und die Renilla-Peptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle isoliert werden, die mit einer Nucleinsäure, wie den obigen Nucleinsäuren, transfiziert ist, die das Renilla-GFP und/oder die GFP-Peptide codiert.
  • Beispielhafte Zellen schließen Bakterien (z. B. E. coli), Pflanzenzellen, von Säugetieren stammende Zellen (z. B. COS-Zellen, Mäuse-L-Zellen, CHO-Zellen (Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster), HEK-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen), GMK-Zellen (African green monkey cells) und andere derartige Zellen, die dem Fachmann bekannt sind, Amphibienzellen (z. B. Xenopus laevis oocytes), Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) und dergleichen ein. Beispielhafte Zellen für die Expression injizierter RNA-Transkripte schließen Xenopus laevis-Oocyten ein. Eukaryotische Zellen, die für die Transfektion von DNA bevorzugt sind, sind dem Fachmann bekannt oder können empirisch identifiziert werden und schließen HEK293-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CRL 1573 erhältlich sind); Ltk-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CCL1.3 erhältlich sind); COS-7-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CRL 1651 erhältlich sind); und DG44-Zellen (dhfr CHO-Zellen; siehe z. B. Urlaub et al. (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555) ein. Derzeit bevorzugte Zellen schließen Stämme von Bakterien und Hefe ein.
  • Die rekombinanten Zellen, die die heterologe DNA enthalten, die die Gaussia-Luciferase codiert, werden durch die Transfektion mit einer DNA, die eine Gaussia-Luciferase codiert, oder durch das Einführen von RNA-Transkripten von DNA, die ein Gaussia-Protein codiert, unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt. Die DNA kann als ein lineares DNA-Fragment eingeführt werden oder kann in einen Expressionsvektor für die stabile oder transiente Expression der codierenden DNA eingeschlossen werden.
  • Die heterologe DNA kann als episomales Element in der Zelle gehalten werden, oder sie kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resultierenden rekombinanten Zellen können dann von einer derartigen Kultur oder Subkultur kultiviert oder subkultiviert werden (oder im Fall von Säugetierzellen einer Passage unterzogen werden). Die DNA kann auch stabil in Zellen eingebracht werden, oder sie kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, transient exprimiert werden.
  • Die rekombinanten Zellen können in einer großen Vielzahl von Assayverfahren auf der Basis von Zellen verwendet werden, wie denjenigen Verfahren, die für Zellen beschrieben werden, die Wildtyp-GFPs oder modifizierte A. victoria-GFPs oder GFP-Fusionsproteine exprimieren (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ; Internationale Patentanmeldungen, Veröffentlichungsnummern WO 95/21191 ; WO 96/23810 ; WO 96/27675 ; WO 97/26333 ; WO 97/28261 ; WO 97/41228 ; und WO 98/02571 ).
  • REKOMBINANTE ZELLEN, DIE HETEROLOGE NUCLEINSÄUREN EXPRIMIEREN, DIE EIN GRÜN FLUORESZIERENDES PROTEIN VON Renilla UND/ODER EINE Renilla-LUCIFERASE CODIEREN
  • Rekombinante Zellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die ein Renilla-GFP codiert, werden beschrieben. Die rekombinanten Zellen exprimieren das codierte Renilla-GFP, das funktionsfähig und für die Zelle nicht toxisch ist.
  • Die rekombinanten Zellen können auch eine heterologe Nucleinsäure einschließen, die eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, vorzugsweise ein Photoprotein oder eine Luciferase, codiert. Die Nucleinsäure, die die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems codiert, wird vorzugsweise aus den Arten von Aequorea, Vargula oder Renilla isoliert. Die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems ist vorzugsweise eine Renilla mulleri-Luciferase, die die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird.
  • Rekombinante Wirtszellen, die eine heterologe Nucleinsäure enthalten, die eine Renilla mulleri-Luciferase codiert, werden ebenfalls beschrieben. Die heterologe Nucleinsäure codiert vorzugsweise die Ami nosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird. Noch bevorzugter codiert die heterologe Nucleinsäure die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 17 offenbart wird.
  • Beispielhafte Zellen schließen Bakterien (z. B. E. coli), Pflanzenzellen, von Säugetieren stammende Zellen (z. B. COS-Zellen, Mäuse-L-Zellen, CHO-Zellen (Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster), HEK-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen), GMK-Zellen (African green monkey cells) und andere derartige Zellen, die dem Fachmann bekannt sind, Amphibienzellen (z. B. Xenopus laevis oocytes), Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) und dergleichen ein. Beispielhafte Zellen für die Expression injizierter RNA-Transkripte schließen Xenopus laevis-Oocyten ein. Eukaryotische Zellen, die für die Transfektion von DNA bevorzugt sind, sind dem Fachmann bekannt oder können empirisch identifiziert werden und schließen HEK293-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CRL 1573 erhältlich sind); Ltk-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CCL1.3 erhältlich sind); COS-7-Zellen (die von ATCC unter der Zugangsnummer #CRL 1651 erhältlich sind); und DG44-Zellen (dhfr CHO-Zellen; siehe z. B. Urlaub et al. (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555) ein. Derzeit bevorzugte Zellen schließen Stämme von Bakterien und Hefe ein.
  • Die rekombinanten Zellen, die die heterologe DNA enthalten, die das Renilla-GFP codiert, werden durch die Transfektion mit einer DNA, die ein Renilla-GFP oder eine Renilla-Luciferase codiert, oder durch das Einführen von RNA-Transkripten von DNA, die ein Renilla-Protein codiert, unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt. Die DNA kann als ein lineares DNA-Fragment eingeführt werden oder kann in einen Expressionsvektor für die stabile oder transiente Expression der codierenden DNA eingeschlossen werden.
  • Die heterologe DNA kann als episomales Element in der Zelle gehalten werden, oder sie kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resultierenden rekombinanten Zellen können dann von einer derartigen Kultur oder einer Subkultur davon kultiviert oder subkultiviert werden (oder im Fall von Säugetierzellen einer Passage unterzogen werden). Die DNA kann auch stabil in Zellen eingebracht werden, oder sie kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, transient exprimiert werden.
  • Die rekombinanten Zellen können in einer großen Vielzahl von Assayverfahren auf der Basis von Zellen verwendet werden, wie denjenigen Verfahren, die für Zellen beschrieben werden, die Wildtyp-GFPs oder modifizierte A. victoria-GFPs oder GFP-Fusionsproteine exprimieren (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ; Internationale Patentanmeldungen Veröffentlichungsnummern WO 95/21191 ; WO 96/23810 ; WO 96/27675 ; WO 97/26333 ; WO 97/28261 ; WO 97/41228 ; und WO 98/02571 ).
  • G. Luciferasen
  • Gereinigte Gaussia-Luciferase und Gaussia-Luciferase-Peptide werden bereitgestellt. Pleuromamma- und Renilla mulleri-Luciferasen werden beschrieben. Die Luciferase wird durch die Expression des Proteins in ausgewählten Wirtszellen und das Isolieren der resultierenden Luciferase erzeugt.
  • Eine Nucleinsäure, die eine Renilla mulleri-Luciferase codiert, wird ebenfalls beschrieben. Die derzeit bevorzugte Renilla mulleri-Luciferase zur Verwendung in Zusammensetzungen, Kombinationen und Verfahren hat die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird. Die Luciferase kann für Zusammensetzungen und Kombinatio nen formuliert werden, die eine große Vielzahl von Endanwendungen haben, wie diejenigen, die hier beschrieben werden.
  • H. Renilla- und Ptilosarcus-GFPs
  • Gereinigte Renilla-GFPs, vor allem Renilla mulleri-GFP, und gereinigte Renilla reniformis-GFP-Peptide, werden beschrieben. Das derzeit bevorzugte Renilla-GFP zur Verwendung in den Zusammensetzungen hier ist das Renilla mulleri-GFP, das die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 16 offenbart wird. Derzeit bevorzugte Renilla reniformis-GFP-Peptide sind diejenigen, die die GFP-Peptide enthalten, die unter den Aminosäuresequenzen ausgewählt werden, die in den SEQ ID NO: 19–23 offenbart werden.
  • Das Renilla-GFP und die Renilla-GFP-Peptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden, oder sie können aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen isoliert werden, die mit einer Nucleinsäure transfiziert sind, die das Renilla-GFP und/oder die Renilla-GFP-Peptide codiert, wie denjenigen, die in dem obigen Abschnitt F beschrieben werden.
  • I. ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Wie weiter oben werden die Zusammensetzungen und Konjugate und Anwendungsverfahren unter Bezugnahme auf Gaussia- und Renilla-Proteine und Gaussia- und Renilla-Nucleinsäuren beschrieben. Die gleichen Zusammensetzungen und Herstellungsverfahren und Verwendungen davon sind für die Anwendung mit Pleuromamma- und Ptilosarcus-Proteinen und Pleuromamma- und Ptilosarcus-Nucleinsäuren vorgesehen.
  • 1. Gaussia-Luciferase-Zusammensetzungen
  • Zusammensetzungen, die eine Gaussia-Luciferase enthalten, werden bereitgestellt. Die Zusammensetzungen können auch ein Renilla-GFP oder Renilla-GFP-Peptid enthalten. Die Zusammensetzungen können eine beliebige Zahl von Formen einnehmen in Abhängigkeit von dem dafür vorgesehenen Anwendungsverfahren. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen für die Verwendung in biolumineszierenden Novitäten (neuartigen Gegenständen), Immunoassays oder FREI- und FET-Assays hergestellt. Die Zusammensetzungen können auch in Verbindung mit Multi-Vertiefungen-Assayvorrichtungen, die integrierte Photodetektoren enthalten (siehe z. B. die gleichzeitig anhängige U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/990,103), für den Nachweis von Tumoren (siehe z. B. die U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/908,909) oder in biolumineszierenden Novitäten (siehe U.S.-Anmeldungen Seriennummern 08/597,274 und 08/757,046) verwendet werden.
  • Diese Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Verfahren und Systemen verwendet werden, wie in Verbindung mit diagnostischen Systemen für den in vivo-Nachweis von neoplastischen Geweben und anderer Gewebe, und in denjenigen Verfahren, die weiter unten detailliert beschrieben werden. Diese Verfahren und Produkte schließen alle Verfahren und Produkte ein, die dem Fachmann bekannt sind, in denen eine Luciferase verwendet wird, eingeschlossen in nicht einschränkender Weise: U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/757,046, 08/597,274 und 08/990,103, U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ; Internationale Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern WO 95/21191 ; WO 96/23810 ; WO 96/27676 ; WO 97/26333 ; WO 97/28261 ; WO 97/41228 ; und WO 98/02571 ).
  • 2. Renilla-Luciferase-Zusammensetzungen
  • Die DNA, die die Renilla mulleri-Luciferase codiert, wird verwendet, um die codierte Luciferase herzustellen, die diagnostische Anwendungen wie auch die Verwendung als eine Komponente der hier beschriebenen Biolumineszenz-erzeugenden Systeme, wie in Getränken, in Verfahren für die Diagnose von Neoplasien und in diagnostischen Chips, die hier beschrieben werden, findet. Diese Verfahren und Produkte schließen alle dem Fachmann bekannten Verfahren und Produkte ein, in denen Luciferase verwendet wird, wobei nicht einschränkend eingeschlossen sind: U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/757,046, 08/597,274 und 08/990,103, U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ; Internationale Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern WO 95/21191 ; WO 96/23810 ; WO 96/27676 ; WO 97/26333 ; WO 97/28261 ; WO 97/41228 ; und WO 98/02571 ).
  • Die Renilla mulleri-Luciferase und die übrigen Komponenten können als getrennte Zusammensetzungen verpackt werden, die beim Vermischen leuchten. Beispielsweise kann eine Zusammensetzung, die Renilla mulleri-Luciferase enthält, getrennt von und zur Verwendung mit einer getrennten Zusammensetzung bereitgestellt werden, die ein Biolumineszenz-Substrat und einen Biolumineszenz-Aktivator enthält. In einem anderen Fall können die Luciferase- und Luciferin-Zusammensetzungen getrennt bereitgestellt werden, und der Biolumineszenz-Aktivator kann nach dem oder gleichzeitig mit dem Vermischen der beiden Zusammensetzungen zugegeben werden.
  • 3. Renilla-GFP-Zusammensetzungen
  • Zusammensetzungen, die ein Renilla-GFP oder ein Renilla-GFP-Peptid enthalten, werden beschrieben. Die Zusammensetzungen können eine beliebige Form aus einer Vielzahl von Formen einnehmen in Abhängigkeit von dem dafür vorgesehenen Anwendungsverfahren. Die Zusammensetzungen enthalten beispielsweise ein Renilla-GFP oder ein Renilla-GFP-Peptid, vorzugsweise ein Renilla mulleri-GFP oder ein Renilla reniformis-GFP-Peptid, das für die Verwendung in biolumineszierenden Novitäten, Immunoassays oder FREI- und FET-Assays formuliert wird. Die Zusammensetzungen können auch in Verbindung mit Multi-Vertiefungen-Assayvorrichtungen, die integrierte Photodetektoren enthalten, verwendet werden, wie denjenigen, die hier beschrieben werden.
  • Zusammensetzungen, die ein Renilla mulleri-GFP oder Renilla mulleri-GFP-Peptid und mindestens eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, vorzugsweise eine Luciferase, ein Luciferin oder eine Luciferase und ein Luciferin enthalten, werden beschrieben. Das Luciferase/Luciferin-Biolumineszenz-erzeugende System wird vorzugsweise unter den Systemen ausgewählt, die isoliert werden aus: einem Insektensystem, einem Coelenteratsystem, einem Ctenophorsystem, einem bakteriellen System, einem Molluskensytem, einem Crustaceensystem, einem Fischsystem, einem Ringelwurmsystem, einem Erdwurmsystem. Derzeit bevorzugte Biolumineszenz-erzeugende Systeme sind diejenigen, die aus Renilla, Aequorea und Vargula isoliert werden.
  • Noch bevorzugter ist die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems eine Renilla mulleri-Luciferase, die die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird. Diese Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Verfahren und Systemen verwendet werden, wie z. B. in Verbindung mit diagnostischen Systemen für den in vivo-Nachweis von neoplastischen Geweben und anderer Gewebe, und in denjenigen Verfahren, die weiter unten detailliert beschrieben werden.
  • Diese Verfahren und Produkte schließen alle Verfahren und Produkte ein, die dem Fachmann bekannt sind, in denen Luciferase verwendet wird, eingeschlossen in nicht einschränkender Weise: U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/757,046, 08/597,274 und 08/990,103, U.S.-Patent Nr. 5,625,048 ; Internationale Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern WO 95/21191 ; WO 96/23810 ; WO 96/27676 ; WO 97/26333 ; WO 97/28261 ; WO 97/41228 ; und WO 98/02571 ).
  • 4. Konjugate
  • Die Konjugate, die hier beschrieben werden, enthalten ein Ansteuerungsmittel, wie einen gewebespezifischen oder tumorspezifischen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das entweder direkt oder über einen Linker mit einer ausgerichteten Substanz, einem Renilla-GFP, einer Renilla mulleri- oder Gaussia-Luciferase und anderen Luciferasen (eingeschlossen Photoproteine oder Luciferase-Enzyme) oder einem Luciferin verknüpft ist. Die ausgerichtete Substanz kann auch an einen Mikroträger gekoppelt sein. Die Verknüpfung wird entweder chemisch, durch die rekombinante Expression eines Fusionsproteins in Fällen, in denen die ausgerichtete Substanz ein Protein ist, oder durch die Kombination von chemischer Verknüpfung und rekombinanter Expression, herbeigeführt. Das Ansteuerungsmittel ist ein Stoff, der vorzugsweise an einen ausgewählten Gewebe- oder Zelltyp bindet, wie ein Tumorzellenoberflächenantigen oder ein anderes gewebespezifisches Antigen.
  • Verfahren für die Herstellung von Konjugaten sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind ein Aequorin, das für die Konjugation entwickelt wurde, und Konjugate, die ein derartiges Aequorin enthalten, hergestellt worden (siehe z. B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18342 ; siehe auch Smith et al. (1995) in American Biotechno logy Laboratory). Aequorin ist mit Hilfe eines Sulfhydryl-reagierenden Bindungsmittel an ein Antikörpermolekül konjugiert worden (Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433–1442). Derartige Verfahren können an eine Verwendung für die Erzeugung der Luciferase, die an ein Protein oder andere derartige Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind, angepasst werden. Vargula-Luciferase ist ebenfalls mit anderen Molekülen verknüpft worden (siehe z. B. Japanische Anmeldung Nr. JP 5064583 , 19. März 1993). Derartige Verfahren können hier an eine Verwendung für die Erzeugung einer Luciferase, die an Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind, angepasst werden.
  • Die Konjugate können eingesetzt werden, um das Vorhandensein oder die Menge eines speziellen Antigens in einer biologischen Probe durch die direkte Korrelation mit dem Licht, das bei der Biolumineszenzreaktion emittiert wird, nachzuweisen.
  • Als eine Alternative kann eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems für die Verknüpfung modifiziert werden, wie durch die Hinzufügung von Aminosäureresten, die besonders geeignet sind für die Anbindung an den ausgewählten Träger. Dies kann leicht bewirkt werden, indem die DNA modifiziert wird und eine derartige modifizierte DNA exprimiert wird, wodurch eine Luciferase mit zusätzlichen Resten am N- oder C-Terminus erzeugt wird.
  • Verfahren für die Herstellung von Konjugaten sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind ein Aequorin, das für die Konjugation entwickelt wurde, und Konjugate, die ein derartiges Aequorin enthalten, hergestellt worden (siehe z. B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18342 ; siehe auch Smith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratory). Aequorin ist mit Hilfe eines Sulfhydryl-reagierenden Bindungsmittel an ein Antikörpermolekül konjugiert worden (Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433–1442). Derartige Verfahren können an eine Verwendung hier für die Erzeugung der Luciferase, die an ein Protein oder andere derartige Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind, angepasst werden. Vargula-Luciferase ist ebenfalls mit anderen Molekülen verknüpft worden (siehe z. B. Japanische Anmeldung Nr. JP 5064583 , 19. März 1993). Derartige Verfahren können hier an eine Verwendung für die Erzeugung eines Aequorins, das an ein Protein oder andere derartige Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind, angepasst werden.
  • Aequorin-Antikörper-Konjugate sind eingesetzt worden, um das Vorhandensein oder die Menge eines bestimmten Antigens in einer biologischen Probe durch die direkte Korrelation mit dem Licht, das bei der Biolumineszenzreaktion emittiert wird, nachzuweisen.
  • Die Auswahl des Systems hängt von Faktoren wie der gewünschten Farbe und gewünschten Dauer der Biolumineszenz sowie dem speziellen Gegenstand ab. Die Auswahl des Ansteuerungsmittels hängt primär vom Typ und den Charakteristika der Neoplasie oder des Gewebes, die/das sichtbar gemacht werden soll, und der Situation, in der das Sichtbarmachen durchgeführt wird, ab. Die Luciferase, die aus Aristostomias isoliert wird, emittiert beispielsweise rotes Licht, das besonders nützlich für die präoperative Diagnose ist, weil das rote Licht unter Verwendung eines Photomultipliers durch Gewebe nachweisbar ist.
  • a. Linker
  • Jeder dem Fachmann bekannte Linker kann hier verwendet werden. Andere Linker sind für den Einbau in chemisch erzeugte Konjugate geeignet. Linker, die für chemisch verknüpfte Konjugate geeignet sind, schließen Disulfidbindungen, Thioesterbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie Amino- und Thiolgruppen, ein. Diese Bindungen werden unter Verwendung von heterobifunktionellen Reagenzien erzeugt, mit denen reaktive Thiolgruppen auf einem oder beiden Polypeptiden erzeugt werden, wonach die Thiolgruppen auf dem einen Polypeptid mit reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen, an die reaktive Maleimidogruppen oder Thiolgruppen angebunden werden können, auf dem anderen umgesetzt werden. Andere Linker schließen säurespaltbare Linker, wie Bismaleimideothoxypropan, säurelabile Transferrin-Konjugate und Adipinsäuredihydrazid, die in stärker sauren intrazellulären Kompartimenten gespalten werden; Verbindende Vernetzungsmittel, die bei Belichtung mit UV-Licht oder sichtbarem Licht gespalten werden, und Linker, wie die verschiedenen Domänen, wie CH1, CH2 und CH3 aus der konstanten Region von humanem IgG1, ein (siehe Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379–386). In einigen Ausführungsformen können mehrere Linker eingeschlossen werden, um sich die gewünschten Eigenschaften eines jeden Linkers zunutze zu machen.
  • Chemische Linker und Peptid-Linker können durch die kovalente Kopplung des Linkers mit dem Ansteuerungsmittel und der ausgerichteten Substanz eingesetzt werden. Die weiter unten beschriebenen heterobifunktionellen Mittel können verwendet werden, um eine derartige kovalente Kopplung zu bewirken. Peptid-Linker können auch verbunden werden, indem eine DNA exprimiert wird, die den Linker und das TA, den Linker und die ausgerichtete Substanz oder den Linker, die ausgerichtete Substanz und das Ansteuerungsmittel als ein Fusionsprotein codiert.
  • Flexible Linker und Linker, die die Löslichkeit der Konjugate erhöhen, werden für die Verwendung in Betracht gezogen, sie werden hier entweder allein oder mit anderen Linker in Betracht gezogen.
  • Zahlreiche heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, die verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen Aminogruppen und Thiolgruppen zu bilden und um Thiolgruppen in Proteine einzuführen, sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. den PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992–1993, der die Herstellung von Verwendung derartiger Reagenzien beschreibt und eine kommerzielle Quelle für derartige Reagenzien bereitstellt; siehe auch z. B. Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3: 397–401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924–5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 308–312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2: 191–197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723–737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163–170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361–366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589). Diese Reagenzien können verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen dem Ansteuerungsmittel und der ausgerichteten Substanz zu bilden. Diese Reagenzien schließen nicht einschränkend ein: N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP; Disulfid-Linker); Sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-Pyridyldithio)propionamido]hexanoat (Sulfo-LC-SPDP); Succinimidyloxycarbonyl-α-methylbenzylthiosulfat (SMBT, gehinderter Disulfat-Linker); Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]-hexanoat (LC-SPDP); Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC); Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat (SPDB; gehinderter Disulfidbindungs-Linker); Sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAED); Sulfosuccinimidyl-7-azi do-4-methylcumarin-3-acetat (SAMCA); Sulfosuccinimidyl-6-(alphamethyl-alpha-(2-pyridyldithio)toluolamido)hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); 1,4-Di-[3'-(2'-pyridyldithio)propionamido]butan (DPDPB); 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridylthio)toluol (SMPT, gehinderter Disulfat-Linker); Sulfosuccinimidyl-6-(α-methyl-α-(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester (Sulfo-MBS); N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB; Thioether-Linker); Sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)-aminobenzoat (Sulfo-SIAB); Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat (SMPB), Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat (Sulfo-SMPB); Azidobenzoylhydrazid (ABH).
  • Säurespaltbare Linker, photospaltbare und wärmeempfindliche Linker können auch verwendet werden, vor allem dort, wo es erforderlich sein kann, die ausgerichtete Substanz zu spalten, um es ihr zu ermöglichen, leichter für die Umsetzung zugänglich zu sein.
  • Säurespaltbare Linker schließen nicht einschränkend ein: Bismaleimideothoxypropan; und Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z. B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589) und säurelabile Transferrin-Konjugate, die einen ausreichend großen Anteil an Transferrin enthalten, um den Eintritt in den intrazellulären Transferrin-Kreislaufweg einzuführen (siehe z. B. Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309–4314).
  • Photospaltbare Linker sind Linker, die gespalten werden, wenn sie Licht ausgesetzt werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Biocqonj. Chem. 3: 104–107), wodurch die ausgerichtete Substanz bei der Belichtung mit Licht freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, die bei der Belichtung mit Licht gespalten werden, sind bekannt (siehe z. B. Hazum et al. (1981) in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 16th, Brunfeldt, K. (Hrsg.), S. 105–110, worin die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als eine photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschrieben wird; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69–82, worin wasserlösliche photospaltbare Copolymere einschließlich Hydroxypropylmethacrylamid-Copolymer, Glycincopolymer, Fluoresceincopolymer und Methylrhodamincopolymer beschrieben werden.; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107, worin ein Vernetzungsmittel und Reagens beschrieben wird, das bei der Belichtung mit nahem UV-Licht (350 nm) einen photolytischen Abbau durchmacht; und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231–237, worin Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Vernetzungsmittel beschrieben werden, die photospaltbare Bindungen erzeugen, wodurch die ausgerichtete Substanz bei Belichtung mit Licht freigesetzt wird. Derartige Linker können eine spezielle Anwendung bei der Behandlung von dermatologischen oder ophthalmischen Zuständen finden, die Licht unter Verwendung einer Faseroptik ausgesetzt werden können. Nach der Verabreichung des Konjugats kann das Auge oder die Haut oder ein sonstiges Körperteil dem Licht ausgesetzt werden, was zur Freisetzung der ausgerichteten Einheit aus dem Konjugat führt. Derartige photospaltbare Linker sind in Verbindung mit diagnostischen Protokollen brauchbar, in denen es wünschenswert ist, das Ansteuerungsmittel zu entfernen, um eine schnelle Ausscheidung aus dem Tierkörper zu ermöglichen.
  • b. Ansteuerungsmittel
  • Ansteuerungsmittel schließen alle Substanzen ein, die mit Zellen in einem Tumor oder einem spezialisierten Gewebe (dem anvisierten Gewebe) in Wechselwirkung treten und die ausgerichtete Substanz bei Zellen in dem Tumor oder Gewebe lokalisieren. Derartige Mittel schließen alle Substanzen ein, die spezifisch mit einem Zelloberflächenprotein oder einem Rezeptor in Wechselwirkung tritt, das/der in ausreichend höheren Konzentrationen oder Mengen auf dem anvisier ten Gewebe vorhanden ist, so dass Licht erzeugt wird, wenn es mit einem geeigneten Biolumineszenz-erzeugenden Reagens und Aktivatoren in Kontakt gebracht wird. Diese Substanzen schließen nicht einschränkend Wachstumsfaktoren, die vorzugsweise so modifiziert sind, dass sie nicht internalisiert werden, Methotrexat und Antikörper, vor allem Antikörper, die gegen tumorspezifische Antigene gerichtet sind, ein. Ein Unmenge tumorspezifischer Antigene wurde bei einer Vielzahl humaner Neoplasmen identifiziert.
  • Anti-Tumorantigen-Antikörper
  • Polyklonale und monoklonale Antikörper können gegen ausgewählte Antigene erzeugt werden. Alternativ sind viele derartige Antikörper derzeitig erhältlich. Eine beispielhafte Liste von Antikörpern und des Tumorantigens, gegen das jeder dieser Antikörper gerichtet ist, wird in der U.S.-Anmeldung Seriennummer bereitgestellt. Es wird in Betracht gezogen, dass jeder aufgezählte Antikörper mit einer Biolumineszenz-erzeugenden Komponente gemäß den hier bereitgestellten Verfahren konjugiert werden kann.
  • Zu den bevorzugten Antikörpern zur Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren gehören diejenigen, die vom Menschen stammen, noch bevorzugter die humanisierten monoklonalen Antikörper. Diese sind für die diagnostische Untersuchung von Menschen bevorzugt.
  • Herstellung der Konjugate
  • Jedes beliebige Verfahren für die Verbindung von Proteinen kann verwendet werden. Beispielsweise werden in dem U.S.-Patent Nr. 5,486,455 Verfahren für die Anbindung einer Luciferase an einen Antikörper beschrieben. Wie oben festgestellt können das Ansteue rungsmittel und das Luciferin oder die Luciferase direkt verbunden werden, wie über kovalente Bindungen, d. h. Sulfhydryl-Bindungen oder andere geeignete Bindungen, oder sie können über einen Linker miteinander verbunden werden. Es kann mehr als eine Luciferase oder ein Luciferin pro Ansteuerungsmittel oder mehr als ein Ansteuerungsmittel pro Luciferase oder Luciferin vorhanden sein.
  • Alternativ kann ein Antikörper oder ein F(Ab)2-Antigen-bindendes Fragment davon oder ein anderes Protein-Ansteuerungsmittel mit der Luciferase unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie verbunden werden (direkt oder über ein Verbindungspeptid). Beispielsweise kann die DNA, die einen beliebigen Antikörper von den Antitumor-Antikörpern in Tabelle 3 codiert, in dem gleichen Translationsleserahmen mit DNA, die eine der oben beschriebenen Luciferasen, z. B. SEQ ID NO: 1–14, codiert, verknüpft werden und in einen Expressionsvektor insertiert werden. Die DNA, die die rekombinante Antikörper-Luciferase-Fusion codiert, kann in einen geeigneten Wirt, wie Bakterien oder Hefe, für die Expression eingeführt werden.
  • 5. Formulierung der Zusammensetzungen für die Verwendung in den diagnostischen Systemen
  • In den meisten Ausführungsformen werden die Renilla-GFPs und die Komponenten der hier beschriebenen diagnostischen Systeme, wie die Renilla mulleri-Luciferase, in zwei Zusammensetzungen formuliert: in einer ersten Zusammensetzung, die das Konjugat enthält; und in einer zweiten Zusammensetzung, die die übrigen Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält. Die Zusammensetzungen werden in jeder beliebigen Weise für die Verabreichung beim Tier, vor allem Säuger, und noch spezieller beim Menschen, formuliert. Derartige Formulierungen schließen diejenigen Formulierungen ein, die für topische, lokale, enterale, parenterale, intracystale, intrakutane, intravitreale, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung geeignet sind.
  • Beispielsweise werden die Konjugate, die vorzugsweise ein Ansteuerungsmittel sind, das mit einer Luciferase (oder einem Photoprotein) verbunden ist, für die systemische oder lokale Verabreichung formuliert. Die übrigen Komponenten sind in einer getrennten zweiten Zusammensetzung für die topische oder lokale Anwendung formuliert. Die zweite Zusammensetzung enthält typischerweise alle anderen Substanzen, wie Spektralverschieber, die an der Reaktion beteiligt sind. Es ist bevorzugt, dass die Komponenten der zweiten Zusammensetzung in einer Formulierung mit Depot- oder Retardwirkung oder in einer sonstigen Weise formuliert sind, die den Abbau und/oder die Wechselwirkung mit Blutbestandteilen verhindert.
  • a. Die erste Zusammensetzung: Formulierung der Konjugate
  • Wie weiter oben angegeben enthalten die Konjugate entweder eine Luciferase oder ein Luciferin und ein Ansteuerungsmittel. Die bevorzugten Konjugate werden zwischen einem Ansteuerungsmittel und einer Luciferase, vor allem der Gaussia-, Renilla mulleri- oder Pleuromamma-Luciferase gebildet. Die Konjugate können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die für die topische, lokale, intravenöse und systemische Anwendung geeignet sind. Effektive Konzentrationen eines oder mehrerer Konjugate werden mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger oder Vehikel vermischt. Die Konzentrationen oder Mengen der Konjugate, die effektiv sind, entsprechen der Zufuhr einer Menge bei der Verabreichung, die zu einer ausreichenden Menge der ausgerichteten Einheit führt, die mit den anvisierten Zellen oder dem anvisierten Gewebe verbunden ist, wodurch die Zellen oder das Gewebe während des chirurgischen Verfah rens sichtbar gemacht werden können/kann. Die Zusammensetzungen werden typischerweise für eine Verabreichung in einer Einzeldosis formuliert. Effektive Konzentrationen und Mengen können empirisch durch das Testen der Konjugate in bekannten in vitro- und in vivo-Systemen, wie denjenigen, die hier beschrieben werden, ermittelt werden; Dosierungen für Menschen oder andere Tiere können dann davon extrapoliert werden.
  • Beim Vermischen mit oder bei der Zugabe des oder der Konjugate zu dem Vehikel kann das resultierende Gemisch eine Lösung, Suspension, Emulsion oder dergleichen sein. Die Form des resultierenden Gemischs hängt von einer Anzahl an Faktoren ab, eingeschlossen die beabsichtigte Art der Verabreichung und die Löslichkeit des Konjugats in dem ausgewählten Träger oder Vehikel. Die effektive Konzentration ist ausreichend für die Ausrichtung einer ausreichenden Menge der ausgerichteten Substanz auf die interessierende Stelle, wodurch die Stelle, wenn die Substanz während des chirurgischen Verfahrens mit den übrigen Reagenzien kombiniert wird, leuchtet. Eine derartige Konzentration oder Menge kann auf der Basis von in vitro- und/oder in vivo-Daten, wie den Daten vom Maus-Heterotransplantat-Modell für Tumoren oder vom Kaninchen-Modell am Auge, ermittelt werden. Erforderlichenfalls können pharmazeutisch akzeptable Salze oder andere Derivate der Konjugate hergestellt werden.
  • Pharmazeutische Träger oder Vehikel, die für die Verabreichung der hier beschriebenen Konjugate geeignet sind, schließen all diejenigen Träger ein, von denen der Fachmann weiß, dass sie für die spezielle Art der Verabreichung geeignet sind. Zusätzlich können die Konjugate als der einzige pharmazeutische Bestandteil in der Zusammensetzung formuliert werden, oder sie können mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden.
  • Die Konjugate können auf jedem beliebigen geeigneten Weg verabreicht werden, zum Beispiel oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch, in flüssiger, halbflüssiger oder fester Form, und sie werden in einer Weise formuliert, die für jeden Verabreichungsweg geeignet ist. Die intravenöse oder lokale Verabreichung ist derzeit bevorzugt. Tumore und Störungen bei der Gefäßbildung werden typischerweise durch die systemischen, intradermalen oder intramuskulären Verabreichungsformen sichtbar gemacht.
  • Das Konjugat wird in den pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer Menge eingeschlossen, die ausreichend ist, um ein nachweisbares Gewebe zu erzeugen, und die nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen beim Patienten oder dem Tier führt. Offenbar hängen die Anzahl und das Ausmaß der Nebenwirkungen von dem Zustand ab, auf Grund dessen die Konjugate verabreicht werden. Beispielsweise werden bestimmte toxische und unerwünschte Nebenwirkungen toleriert, wenn versucht wird, lebensbedrohliche Krankheiten, wie Tumore, zu diagnostizieren, die nicht toleriert würden, wenn Störungen mit weniger Konsequenzen diagnostiziert werden.
  • Die Konzentration des Konjugats in der Zusammensetzung hängt von der Absorption-, Inaktivierungs- und Ausscheidungsgeschwindigkeit des Konjugats, dem Dosierungszeitplan und der verabreichten Menge sowie anderen Faktoren ab, die dem Fachmann bekannt sind. Typischerweise sollte eine effektive Dosis eine Serumkonzentration des Wirkstoffs von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 50–1000 μg/ml, vorzugsweise 50–100 μg/ml, hervorrufen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sollten typischerweise eine Dosis von etwa 0,01 mg bis etwa 100–2000 mg Konjugat, abhängig von dem ausgewählten Konjugat, pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liefern. Typischerweise sollte für die intravenöse Verabreichung eine Dosis von etwa 0,05 bis 1 mg/kg ausreichend sein. Die lokale Anwendung sollte, wie für das Sichtbarmachen von ophthalmischen Geweben oder die lokale Injektion in Gelenke, für 1 ng bis zu 1000 μg, vorzugsweise etwa 1 μg bis etwa 100 μg, pro verabreichter Einzeldosis sorgen. Selbstverständlich hängt die zu verabreichende Menge von dem ausgewählten Konjugat, der Indikation und möglicherweise den Nebenwirkungen, die toleriert werden, ab. Die Dosierungen können unter Anwendung der anerkannten Modelle empirisch ermittelt werden.
  • Der Wirkstoff kann auf einmal verabreicht werden, oder er kann in einen Anzahl kleinerer Dosen unterteilt werden, die in Zeitabständen zu verabreichen sind. Ganz offensichtlich hängen die genaue Dosis und die Dauer der Verabreichung von dem Krankheitszustand ab, der diagnostiziert wird, und sie können empirisch unter Verwendung bekannter Testprotokolle oder durch die Extrapolation von in vivo- oder in vitro-Testdaten bestimmt werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Konzentrationen und die Dosierungswerte auch mit der Schwere des Zustands variieren können, der gelindert werden soll. Es ist weiterhin offensichtlich, dass für jedes individuelle Subjekt die spezifischen Dosierungspläne mit der Zeit gemäß den individuellen Bedürfnissen und der professionellen Einschätzung durch die Person, die die Zusammensetzungen verabreicht oder die die Verabreichung überwacht, angepasst werden sollen, und dass die Konzentrationsbereiche, die hier offenbart werden, nur beispielhaft sind und nicht dafür gedacht sind, den Gegenstand oder die Anwendung der beanspruchten Zusammensetzungen einzuschränken.
  • Lösungen oder Suspensionen, die für die parenterale, intradermale, subkutane oder topische Anwendung verwendet werden, können beliebige der folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser für die Injektion, eine Salzlösung, ein fettes Öl, Polyethylenglycol, Glycerin, Propylenglycol oder ein anderes synthetisches Lösemittel; antimikrobielle Mittel, wie Benzylalkohol und die Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure und Natriumhydrogensulfit; Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Puffer, wie Acetate, Citrate und Phosphate; und Mittel für die Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Parenterale Zubereitungen können in Ampullen, Wegwerfspritzen oder Vials für mehrere Dosen, die aus Glas, Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material hergestellt sind, verpackt sein.
  • Im Fall der intravenösen Verabreichung schließen geeignete Träger eine physiologische Salzlösung oder eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und Lösungen, die Verdickungsmittel und Solubilisierungsmittel, wie Glucose, Polyethylenglycol, und Propylenglycol und Gemische davon enthalten, ein. Liposomale Suspensionen können auch als pharmazeutisch akzeptable Träger geeignet sein. Diese können gemäß den Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Die Konjugate können mit Trägern hergestellt werden, die sie vor der schnellen Ausscheidung aus dem Körper schützen, wie in Formulierungen mit oder Überzügen für eine protrahierte Freisetzung (Depot- oder Retardarzneiformen). Derartige Träger schließen Formulierungen für die kontrollierte Freisetzung, wie nicht einschränkend Implantate und mikroverkapselte Zufuhrsysteme und biologisch abbaubare, biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Polyorthoester, Polymilchsäure und dergleichen, ein.
  • Die Konjugate können für die lokale oder topische Anwendung, wie für die topische Anwendung auf den Haut- und Schleimhautmembranen, wie im Auge, in der Form von Gelen, Cremes und Lotionen, und für die Anwendung am Auge oder für die intracisternale oder intraspinale Anwendung formuliert werden. Derartige Lösungen, vor allem diejenigen, die für die ophthalmische Verwendung vorgesehen sind, können als 0,01%ige bis 10%ige isotonische Lösungen, pH etwa 5–7, mit geeigneten Sahen formuliert werden. Die ophthalmischen Zusammensetzungen können auch zusätzliche Komponenten einschließen, wie Hyaluronsäure. Die Konjugate können als Aerosole für die topische Anwendung formuliert werden (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 4,044,126 , 4,414,209 und 4,364,923 ).
  • Außerdem können die Zusammensetzungen für die in vivo-Aktivierung des Konjugats während der chirurgischen Verfahren als ein Aerosol formuliert werden. Diese Zusammensetzungen enthalten die Aktivatoren und weiterhin die übrige Biolumineszenz-erzeugende Substanz, wie Luciferin, wenn das Konjugat eine Luciferase adressiert, oder eine Luciferase, wenn das Konjugat ein Luciferin, wie Coelenterazin, an sein Ziel adressiert.
  • Wenn die orale Verabreichung erwünscht ist, sollte das Konjugat in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die es vor der sauren Umgebung des Magens schützt. Die Zusammensetzung kann beispielsweise in einem enterischen Überzug formuliert sein, der im Magen unversehrt bleibt und die wirksame Verbindung im Darm freisetzt. Orale Zusammensetzungen enthalten allgemein ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger und können zu Tabletten gepresst oder in Gelatinekapseln eingeschlossen werden. Für den Zweck der oralen Verabreichung kann die wirksame Verbindung oder können die wirksamen Verbindungen mit Exzipientien eingebracht werden und in der Form von Tabletten, Kapseln oder Pastillen verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und Hilfsstoffe können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen werden.
  • Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dgl. können jeden der folgenden Bestandteile oder Verbindungen von einer ähnlichen Be schaffenheit enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Traganthgummi und Gelatine; ein Exzipiens, wie Stärke und Lactose, ein Sprengmittel wie nicht einschränkend Alginsäure und Maisstärke; ein Schmiermittel wie nicht einschränkend Magnesiumstearat; ein Gleitmittel wie nicht einschränkend kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel wie Saccharose oder Saccharin; und einen Aromastoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat und Fruchtaroma.
  • Wenn die Dosiereinheit die Form einer Kapsel hat, kann sie zusätzlich zu dem Material vom obigen Typ einen flüssigen Träger wie ein Fettöl enthalten. Zusätzlich können Dosiereinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosiereinheit verändern, zum Beispiel Überzüge aus Zucker und anderen enterischen Mitteln. Die Konjugate können auch als Komponente eines Elixirs, einer Suspension, eines Sirups, einer Oblate, eines Kaugummis oder dgl. verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den wirksamen Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Farbmittel und Aromastoffe enthalten.
  • Die Wirkstoffe können auch mit anderen Wirkstoffen vermischt werden, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen, oder mit Materialien, die die gewünschte Wirkung ergänzen, wie cis-Platin für die Behandlung von Tumoren.
  • Schließlich können die Verbindungen als Herstellungsgegenstände verpackt werden, die ein Verpackungsmaterial, ein oder mehrere Konjugate oder Zusammensetzungen, wie sie hier bereitgestellt werden, innerhalb des Verpackungsmaterials, und ein Etikett, das die Indikation angibt, für die das Konjugat bereitgestellt wird, enthalten.
  • b. Die zweite Zusammensetzung
  • Die zweite Zusammensetzung enthält die übrigen Komponenten der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion. Wenn diese Komponenten systemisch verabreicht werden, schließen die übrigen Komponenten vorzugsweise das Luciferin oder Substrat und optional zusätzliche Substanzen ein, wie eine Spektralverschieber, vor allem die hier beschriebenen GFPs. Diese Komponenten, wie das Luciferin, können wie oben für die Konjugate beschrieben formuliert werden. In einigen Fällen wird das Luciferin oder die Luciferase in dieser Zusammensetzung an einen Proteinträger oder einen anderen Träger gebunden, um den Abbau oder das Auflösen in Blutzellen oder andere zelluläre Komponenten hinein zu vermeiden.
  • In Fälle, in denen die zweite Zusammensetzung lokal oder topisch angewendet wird, kann sie in einem Spray oder einem Aerosol oder sonstigen geeigneten Mitteln für die topische Anwendung formuliert werden.
  • In bestimmten hier beschriebenen Fällen werden alle Komponenten mit Ausnahme eines Aktivators zusammen formuliert, wie durch die Verkapselung in einer Formulierung für die protrahierte Freisetzung (Retard-Formulierung), die gezielt auf das Gewebe gerichtet ist. Bei der Freisetzung ist die Zusammensetzung an der gewünschten Stelle lokalisiert und beginnt zu leuchten.
  • In der Praxis können die beiden Zusammensetzungen gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden. Typischerweise wird die erste Zusammensetzung, die das Konjugat enthält, als erste verabreicht, im Allgemeinen eine Stunde oder zwei Stunden vor der Operation, und die zweite Zusammensetzung wird dann verabreicht, entweder präoperativ oder während des chirurgischen Eingriffs.
  • Die Konjugate, die hier beschrieben werden, enthalten ein Ansteuerungsmittel, wie einen gewebespezifischen oder tumorspezifischen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das entweder direkt oder über einen Linker mit einer ausgerichteten Substanz verknüpft wird, eine Luciferase (eingeschlossen Photoproteine oder Luciferase-Enzyme) oder ein Luciferin. Die ausgerichtete Substanz kann an einen Mikroträger gebunden sein. Die Verbindung erfolgt entweder chemisch, durch die rekombinante Expression eines Fusionsproteins in Fällen, in denen die ausgerichtete Substanz ein Protein ist, und durch Kombinationen von chemischer Verbindung und rekombinanter Expression. Das Ansteuerungsmittel ist eine Substanz, die vorzugsweise an einen ausgewählten Gewebe- oder Zelltyp bindet, wie ein Tumorzelloberflächenantigen oder ein anderes gewebespezifisches Antigen.
  • Verfahren für die Herstellung der Konjugate sind dem Fachmann bekannt. Ein Aequorin, das für die Konjugation entworfen wurde, und Konjugate, die ein derartiges Aequorin enthalten, sind beispielsweise hergestellt worden (siehe z. B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18342 ; siehe auch Smith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratory). Aequorin ist mit Hilfe eines Sulfhydryl-reagierenden Bindungsmittel an ein Antikörpermolekül konjugiert worden (Stultz et al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli. Biochemistry 31, 1433–1442). Diese Verfahren können an eine Verwendung hier angepasst werden, um ein Aequorin zu erzeugen, das an ein Protein oder andere derartige Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind. Vargula-Luciferase ist ebenfalls mit anderen Molekülen verknüpft worden (siehe z. B. Japanische Patentanmeldung Nr. JP 5064583 , 19. März 1993). Derartige Verfahren können an die Verwendung hier angepasst werden, um ein Aequorin zu erzeugen, das an ein Protein oder andere derartige Moleküle gekoppelt ist, die als Ansteuerungsmittel brauchbar sind.
  • Aequorin-Antikörper-Konjugate sind eingesetzt worden, um das Vorhandensein eines speziellen Antigens in einer biologischen Probe nachzuweisen oder um dessen Menge durch die direkte Korrelation mit dem Licht, das bei der Biolumineszenz-Reaktion emittiert wird, zu quantifizieren.
  • Alternativ kann das Renilla-GFP oder die Renilla mulleri- oder die Gaussia-Luciferase oder eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems für die Verknüpfung mit dem ausgewählten Träger modifiziert werden, wie durch die Addition von Aminosäureresten, die für die Verknüpfung mit dem ausgewählten Substrat besonders geeignet sind. Dies kann leicht durchgeführt werden, indem die DNA modifiziert wird und die so modifizierte DNA exprimiert wird, um eine Luciferase mit den zusätzlichen Resten am N- oder C-Terminus zu erzeugen.
  • Die Auswahl des Systems hängt von Faktoren wie der gewünschten Farbe und der gewünschten Dauer der Biolumineszenz sowie dem speziellen Gegenstand ab. Die Auswahl des Ansteuerungsmittels hängt primär vom Typ und den Eigenschaften der Neoplasie oder des Gewebes, die/das sichtbar gemacht werden soll, und dem Aufbau, in dem die Sichtbarmachung durchgeführt wird, ab.
  • c. Anwendung der Reaktionen in Kombination mit Ansteuerungsmitteln
  • Die spezielle Weise, in der jedes Biolumineszenzsystem mit einem ausgewählten Ansteuerungsmittel kombiniert wird, hängt von dem Mittel und der Neoplasie oder dem Gewebe ab, die/das sichtbar ge macht werden soll. Im Allgemeinen wird jedoch ein Luciferin, ein Renilla-GFP, eine Renilla mulleri-, Pleuromamma- oder Gaussia-Luciferase oder eine andere Luciferase der Reaktion mit dem Ansteuerungsmittel konjugiert und dem Tier vor dem chirurgischen Eingriff verabreicht. Während der Operation werden die interessierenden Gewebe mit der oder den übrigen Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems in Kontakt gebracht. Jedes Gewebe, auf das oder mit dem das Ansteuerungsmittel reagiert, leuchtet dann.
  • Jede Farbe des sichtbaren Lichtes, das durch ein Biolumineszenz-erzeugendes System erzeugt wird, wird für die Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren in Betracht gezogen. Das sichtbare Licht ist vorzugsweise eine Kombination aus blauem, grünem und/oder rotem Licht mit variierenden Intensitäten und Wellenlängen. Für das Sichtbarmachen von Neoplasien und speziellen Geweben durch Säugetiergewebe oder von Tumoren, die tief ins Gewebe eingebettet sind, sind längere Wellenlängen des sichtbaren Lichts, d. h. rotes Licht und nahes Infrarot-Licht, bevorzugt, weil für die Wellenlängen des nahen Infrarotlichts von etwa 700–1300 nm bekannt ist, dass sie Weichgewebe und Knochen durchdringen (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,281,645 ).
  • Das Konjugat kann während der Operation auf die Gewebe aufgebracht werden, wie durch Versprühen einer sterilen Lösung über den Geweben, gefolgt vom Aufbringen der übrigen Komponenten. Gewebe, die das anvisierte Antigen exprimieren, leuchten dann.
  • Die Reagenzien können in Zusammensetzungen, wie Suspensionen, Pulvern, Pasten oder in jeder sonstigen sterilen Form bereitgestellt werden. Sie können als Sprays, Aerosole oder in jeder sonstigen geeigneten Form bereitgestellt werden. Die Reagenzien können mit einer Matrix, vor allem Mikrokügelchen, die für die in vivo-Verwendung ge eignet sind und eine solche Größe haben, dass sie durch die Kapillare passen, verknüpft werden. Typischerweise werden alle Komponenten bis auf eine oder mehrere Komponenten, vorzugsweise alle Komponenten bis auf eine Komponente, die für die Reaktion erforderlich sind, vermischt und zusammen bereitgestellt; die Reaktion wird ausgelöst, indem die gemischte(n) Komponente(n) mit der oder den übrigen Komponente(n) vermischt werden, wie durch die Zugabe von Ca2+, FMN mit Reduktase, FMNH2, ATP, Luft oder Sauerstoff.
  • Die Luciferase oder Luciferase/Luciferin werden vorzugsweise in Kombination mit dem Ansteuerungsmittel bereitgestellt, bevor sie dem Patienten verabreicht werden. Das Ansteuerungsmittel-Konjugat wird dann in vivo mit den übrigen Komponenten in Kontakt gebracht. Wie es sich hier im offensichtlicher Weise ergibt, gibt es eine Vielzahl von Wegen, auf denen jedes System mit einem ausgewählten Ansteuerungsmittel kombiniert werden kann.
  • J. KOMBINATIONEN
  • Zusätzlich können die oben beschriebenen Pleuromamma-, Gaussia- oder Renilla-Luciferasen und/oder Renilla- und Ptilosarcus-GFPs in Kombination mit Herstellungsgegenständen verwendet werden, um Novitäten (neuartige Produkte) zu erzeugen. Derartige Gegenstände und Herstellungsverfahren werden detailliert in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldung mit den Seriennummern 08/597,274 und 08/757,046 beschrieben. Die Luciferasen und/oder GFPs, die hier bereitgestellt werden, können in den Verfahren und Gegenständen, die in den gleichzeitig anhängigen Anmeldungen bereitgestellt werden, verwendet werden. Diese Novitäten, die Herstellungsgegenstände sind, werden für die Unterhaltung, die Freizeit und den Zeitvertreib gestaltet und schließen nicht einschränkend ein: Spielzeuge, vor allem Wasserspritzpistolen, Spielzeugzigaretten, Spielzeug-"Halloween"- Eier, Jonglierbälle vom Typ "Footbag" und Brettspiele/Kartenspiele; Fingerfarben und andere Farben, Spielzeuge aus glibberigen Materialien; Textilien, vor allem Kleidung, wie Hemden, Hüte und Sportbekleidungsanzüge, Zwirne und Garne; Luftblasen in blasenerzeugenden Spielzeugen und anderen Spielzeugen, die Blasen erzeugen; Ballons; Figürchen; Artikel für den persönlichen Gebrauch, wie Badepulver, Körperlotionen, Gele, Puder und Cremes, Nagelpolituren, Kosmetika, eingeschlossen Make-up, Zahnpasten und andere Zahnputzmittel, Seifen, Körperfarben und Schaumbäder; Artikel wie Tinten, Papier; Nahrungsmittel, wie Gelatinen, Kuchenglasuren und Zuckerguss; Fischfutter, das Luciferine enthält und transgene Fische, vor allem transgene Fische, die eine Luciferase exprimieren; Pflanzennahrung, die ein Luciferin oder eine Luciferase enthält, vorzugsweise ein Luciferin zur Verwendung mit transgenen Pflanzen, die Luciferase exprimieren; und Getränke, wie Bier, Wein, Sekt, Erfrischungsgetränke und Eiswürfel sowie Eis in anderen Gestaltungen; Springbrunnen, eingeschlossen flüssiges "Feuerwerk", und andere, wie Strahlen oder Sprühnebel oder Aerosole von Zusammensetzungen, die Lösungen, Gemische, Suspensionen, Puder, Pasten, Partikel oder andere geeignete Formen sind.
  • Jeder Herstellungsgegenstand, der mit einem Biolumineszenz-erzeugenden System kombiniert werden kann, wie es hier bereitgestellt wird, und der so für die Unterhaltung, die Freizeitgestaltung und/oder den Zeitvertreib sorgen kann, eingeschlossen die Verwendung der Gegenstände für Freizeit und Erholung oder für das Erregen von Aufmerksamkeit, wie zum Bewerben von Waren und/oder Dienstleistungen, was mit einem Logo oder einer Marke zusammenhängt, wird hier ins Auge gefasst. Derartige Verwendungen können ein Zusatz zur oder in Verbindung mit der oder anstelle der gewöhnlichen oder normalen Verwendung derartiger Gegenstände sein. Als Ergebnis der Kombination leuchten die Gegenstände oder erzeugen, wie im Fall von Wasserpistolen und Springbrunnen, eine leuchtende Flüssigkeit oder einen leuchtenden Sprühnebel einer Flüssigkeit oder von Partikeln.
  • K. Verwendungsverfahren
  • 1. Verfahren für die Diagnose von Neoplasmen und anderer Gewebe
  • Verfahren für die Diagnose und das Sichtbarmachen von Geweben in vivo oder in situ, vorzugsweise von neoplastischem Gewebe, unter Verwendung der Zusammensetzungen, die ein Renilla mulleri-GFP oder ein Ptilosarcus-GFP und/oder eine Renilla mulleri-, Pleuromamma- oder Gaussia-Luciferase enthalten, werden beschrieben. Beispielsweise kann das Renilla mulleri-GFP-Protein in Verbindung mit diagnostischen Systemen verwendet werden, die auf Biolumineszenz für das in situ-Sichtbarmachen von Geweben basieren, wie denjenigen, die in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 08/908,909 beschrieben werden. Die Systeme sind besonders nützlich für das Sichtbarmachen und Nachweisen eines neoplastischen Gewebes und von Spezialgewebe, wie während nicht invasiver und invasiver Verfahren. Die Systeme schließen Zusammensetzungen ein, die Konjugate enthalten, die ein gewebespezifisches, vor allem tumorspezifisches Ansteuerungsmittel einschließen, das mit einer ausgerichteten Substanz, wie einem Renilla mulleri-GFP, einer Luciferase oder einem Luciferin, verknüpft ist. Die Systeme schließen auch eine zweite Zusammensetzung ein, die die übrigen Komponenten einer Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion und/oder das GFP enthält. In einigen Fällen sind mit Ausnahme der Aktivatoren, die in situ bereitgestellt werden oder die in dem Körper oder dem Gewebe vorhanden sind, alle Komponenten in einer einzigen Zusammensetzung enthalten.
  • Die diagnostischen Systeme schließen vor allem zwei Zusammensetzungen ein: Eine erste Zusammensetzung, die Konjugate enthält, die in bevorzugten Fällen Antikörper einschließen, die gegen Tumorantigene gerichtet sind, die an eine Komponente der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion, eine Luciferase oder ein Luciferin, vorzugsweise eine Luciferase, konjugiert sind, wird bereitgestellt. In bestimmten Fällen werden Konjugate, die tumorspezifische Ansteuerungsmittel enthalten, mit Luciferasen oder Luciferinen verknüpft. In anderen Fällen werden tumorspezifische Ansteuerungsmittel mit Mikroträgern verknüpft, die mit vorzugsweise mehr als einer der Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten, vorzugsweise mehr als einem Luciferase-Molekül, gekoppelt sind.
  • Die zweite Zusammensetzung enthält die übrigen Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems, typischerweise das Luciferin oder das Luciferase-Substrat. In einigen Fällen sind diese Komponenten, vor allem das Luciferin, mit einem Protein, wie einem Serumalbumin, oder einem anderen Proteinträger verbunden. Der Träger und die Retardformulierungen (Formulierungen mit protrahierter Freisetzung) ermöglichen es systemisch verabreichten Komponenten, sich ohne eine Wechselwirkung mit Blutzellbestandteilen, wie Hämoglobin, die das Luciferin oder die Luciferase deaktivieren, zu dem anvisierten Gewebe zu bewegen.
  • 2. Verfahren für die Diagnose von Krankheiten
  • Verfahren für die Diagnose von Krankheiten, vor allem infektiöser Krankheiten, unter Verwendung der Chip-Methodik, eines Luciferase/Luciferin-Biolumineszenz-erzeugenden Systems, eingeschlossen eine Gaussia-, Pleuromamma- oder Renilla mulleri-Luciferase und/oder ein Ptilosarcus- oder Renilla mulleri-GFP, werden beschrie ben. Der Chip enthält vor allem einen integrierten Photodetektor, der die Photonen nachweist, die von dem Biolumineszenz-erzeugenden System und/oder dem GFP emittiert werden.
  • In einem Fall wird der Chip unter Verwendung eines integrierten Schaltkreises mit einem Array, wie einem X-Y-Array, und von Photodektoren erzeugt, wie demjenigen, der in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/990,103 beschrieben wird. Die Oberfläche des Schaltkreises ist so behandelt, dass sie unter den Bedingungen des diagnostischen Assays, für den der Chip vorgesehen ist, inert ist, und sie ist, wie z. B. durch eine Derivatisierung, für die Anbindung von Molekülen, wie Antikörpern, angepasst. Ein ausgewählter Antikörper oder ein Panel von Antikörpern, wie ein Antikörper, der spezifisch für ein spezielles bakterielles Antigen ist, wird auf der Oberfläche des Chips oberhalb eines jeden Photodetektors befestigt. Nach dem Inkontaktbringen des Chips mit einer Testprobe wird der Chip mit einem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht, der mit dem GFP verknüpft ist, wie dem Renilla-GFP, um ein chimäres Antikörper-GFP-Fusionsprotein oder einen Antikörper, der mit einer Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems verbunden ist, wie einer Pleuromamma-, Gaussia- oder R. mulleri-Luciferase, zu bilden. Der Antikörper ist spezifisch für das Antigen. Die übrigen Komponenten der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion werden zugegeben, und falls einer der Antikörper, der mit einer Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems verbunden ist, auf dem Chip vorhanden ist, wird Licht erzeugt und durch den benachbarten Photodetektor nachgewiesen. Der Photodetektor ist betriebsbereit mit einem Computer verbunden, der mit Informationen für die Identifizierung der angebundenen Antikörper programmiert ist, der das Ereignis aufzeichnet und dadurch die Antigene, die in der Testprobe enthalten sind, identifiziert.
  • 3. Verfahren für die Erzeugung chimärer Renilla- oder Ptilosarcus-GFP- Renilla mulleri-Luciferase-, Pleuromamma-Luciferase- und Gaussia-Luciferase-Fusionsproteine
  • Verfahren für die Erzeugung chimärer GFP- und Luciferase-Fusionsproteine werden beschrieben. Die Verfahren schließen das Verbinden einer DNA, die ein interessierendes Gen codiert, oder eines Teils davon, mit DNA, die ein GFP oder eine Luciferase codiert, die hier breitgestellt wird, im gleichen Translationsleserahmen ein. Das interessierende codierte Protein kann innerhalb des Rahmens mit dem Amino-Terminus oder dem Carboxy-Terminus des GFPs oder der Luciferase verbunden sein. Die DNA, die das chimäre Protein codiert, wird dann in einer funktionsfähigen Assoziierung mit einem Promotorelement eines geeigneten Expressionsvektors verbunden. Alternativ kann das Promotorelement direkt von dem interessierenden anvisierten Gen erhalten werden, und das promotorhaltige Fragment wird stromaufwärts der GFP- oder Luciferase-codierenden Sequenz verknüpft, um die chimären GFP-Proteine zu erzeugen.
  • Es wird beispielsweise eine chimäre Fusion bereitgestellt, die die DNA enthält die die Gaussia-Luciferase codiert, die mit dem N-terminalen Bereich einer Cellulose-Bindungsdomäne verbunden ist (siehe SEQ ID NO: 21 und 22).
  • 4. Assays auf Zellbasis für die Identifizierung von Verbindungen
  • Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen unter Verwendung von rekombinanten Zellen, die eine heterologe DNA, die ein Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFP codiert, unter der Kontrolle eines Promotorelements eines interessierenden Gens exprimieren, werden beschrieben. Die rekombinanten Zellen können verwendet werden, um Verbindungen oder Liganden zu identifizieren, die das Transkriptionsniveau eines interessierenden Promotors modulieren, indem die GFP-vermittelte Fluoreszenz gemessen wird. Rekombinante Zellen, die chimäre GFPs modulieren, können ebenfalls verwendet werden, um die Genexpression oder den Proteintransport zu überwachen oder um die zelluläre Lokalisierung des Zielproteins zu ermitteln, indem örtlich begrenzte Regionen mit GFP-vermittelter Fluoreszenz innerhalb der rekombinanten Zelle identifiziert werden.
  • L. KITS
  • Es können Kits hergestellt werden, die die Gaussia-, Pleuromamma- oder Renilla mulleri-Luciferase oder das Renilla- oder das Ptilosarcus-GFP enthalten, die in diagnostischen Verfahren und Immunassayverfahren und mit Novitäten, eingeschlossen diejenigen, die hier beschrieben werden, verwendet werden.
  • In einem Fall enthalten die Kits die passenden Reagenzien und einen Herstellungsgegenstand für die Erzeugung der Biolumineszenz in Kombination mit einem Gegenstand. Diese Kits, können beispielsweise mit einem Blasen ausblasenden oder erzeugenden Spielzeug oder mit einer Spritzpistole verwendet werden. Diese Kits können auch eine nachladende oder aufladende Kartusche einschließen.
  • In einem anderen Fall werden die Kits für den Nachweis und das Sichtbarmachen eines neoplastischen Gewebes und anderer Gewebe verwendet und schließen eine erste Zusammensetzung, die die Luciferase und/oder das Renilla mulleri- oder Ptilosarcus-GFP und mindestens eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält, und eine zweite Zusammensetzung ein, die die aktivierende Zusammensetzung enthält, die die übrigen Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems und alle erforderlichen aktivierenden Stoffe enthält.
  • In anderen Fällen werden die Kits für den Nachweis und die Identifizierung von Krankheiten, vor allem infektiöser Krankheiten, verwendet unter Verwendung von Multivertiefungen-Assayvorrichtungen und schließen ein: eine Multivertiefungen-Assayvorrichtung, die eine Vielzahl von Vertiefungen aufweist, von denen jede einen integrierten Photodetektor aufweist, an denen ein Antikörper oder ein Panel von Antikörpern, die für ein oder mehrere infektiöse Stoffe spezifisch sind, befestigt sind, und eine Zusammensetzung, die einen zweiten Antikörper enthält, wie einen Antikörper, der spezifisch für den infektiösen Stoff ist, der beispielsweise an ein Renilla mulleri-GFP-Protein, ein chimäres Antikörper-Renilla mulleri-GFP-Fusionsprotein, ein F(Ab)2-Antikörperfragment-Renilla mulleri-GFP-Fusionsprotein oder an solche Konjugate gebunden ist, die beispielsweise die Gaussia- oder Renilla mulleri-Luciferase enthalten, und eine zweite Zusammensetzung, die die übrigen Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthält, wie eines Systems, das eine Lichtwellenlänge innerhalb des Anregungsbereichs des GFPs emittiert, wie von den Arten von Renilla oder Aequorea, für die Anregung der Renilla mulleri-Luciferase, die grünes Licht erzeugt, das durch den Photodetektor der Vorrichtung nachgewiesen wird, wodurch auf das Vorhandensein des Stoffes hingewiesen wird.
  • In weiteren Fällen enthalten die Kits die Komponenten der diagnostischen Systeme. Die Kits umfassen Zusammensetzungen, die die Konjugate, vorzugsweise mit Renilla- oder Ptilosarcus-GFP oder Gaussia- oder Pleuromamma- oder Renilla mulleri-Luciferase und die übrigen Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems enthalten. Die erste Zusammensetzung in dem Kit enthält typischerweise das Ansteuerungsmittel konjugiert an ein GFP oder eine Luciferase. Die zweite Zusammensetzung enthält mindestens das Luciferin (Substrat) und/oder die Luciferase. Beide Zusammensetzungen sind für die systemische, lokale oder topische Anwendung bei einem Säugetier formuliert. In alternativen Fällen enthält die erste Zusammensetzung das Luciferin, verbunden mit einem Ansteuerungsmittel, und die zweite Zusammensetzung enthält die Luciferase oder die Luciferase und ein GFP.
  • Im Allgemeinen ist die Verpackung nicht reaktiv mit den darin enthaltenen Zusammensetzungen, und wo erforderlich sollten sie Wasser und/oder Luft in dem Maß ausschließen, in dem diese Substanzen für den Ablauf der Lumineszenzreaktion erforderlich sind.
  • Diagnostische Anwendungen können spezielle Verpackungen erforderlich machen. Die Biolumineszenz-erzeugenden Reagenzien können in Pellets, eingekapselt als Mikro- oder Makrokapseln, verbunden mit Matrizes, vorzugsweise biokompatiblen Matrizes, noch bevorzugter biologisch abbaubaren Matrizes, und eingeschlossen in oder auf Herstellungsgegenständen oder als Gemische in Kammern innerhalb eines Herstellungsgegenstands oder in einer anderen Konfiguration bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung, die das Luciferase-Konjugat enthält, wird beispielsweise getrennt von und zur Verwendung mit einer getrennten Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Biolumineszenz-Substrat und einen Biolumineszenz-Aktivator enthält.
  • Ähnlich kann das Renilla- oder Ptilosarcus-GFP, die Pleuromamma-, Renilla mulleri- oder Gaussia-Luciferase oder das Luciferin in einer Zusammensetzung, die ein Gemisch, eine Suspension, eine Lösung, ein Pulver, eine Paste oder eine andere geeignete Zusammensetzung ist, getrennt von oder in Kombination mit den übrigen Komponenten, jedoch in Abwesenheit einer aktivierenden Komponente, bereitgestellt werden. Beim Inkontaktbringen des Konjugats, das auf ein ausge wähltes Gewebe ausgerichtet (targeted) worden ist, mit dieser Zusammensetzung setzt die Reaktion ein, und das Gewebe leuchtet. Das Gewebe leuchtet vorzugsweise grün unter Emission von Licht nahe 510 nm. Die Luciferase, das GFP und das Biolumineszenz-Substrat werden beispielsweise so verpackt, dass Wasser und/oder Luft, der Biolumineszenz-Aktivator, ausgeschlossen ist. Bei der Verabreichung und Freisetzung an der anvisierten Stelle aktiviert die Reaktion mit Salzen oder anderen Komponenten an der Stelle, eingeschlossen die Luft im Fall von chirurgischen Eingriffen, die Komponenten.
  • 1. Ausgabe- und Verpackungsvorrichtung für die Kombination mit dem GFP und den Komponenten des Biolumineszenz-Systems
  • Die Biolumineszenz-Systeme, die hier detailliert beschrieben werden, schließen mindestens drei Komponenten ein: ein Biolumineszenz-Substrat (z. B. ein Luciferin), eine Luciferase (z. B. eine Luciferase oder ein Photoprotein), vorzugsweise Gaussia-, Pleuromamma- oder Renilla mulleri-Luciferase, und einen oder mehrere Biolumineszenz-Aktivatoren (z. B. molekularen Sauerstoff oder Ca2+), und optional ein Renilla- oder Ptilosarcus-GFP. Die Ausgabe- und Verpackungsvorrichtungen sind so gestaltet, dass mindestens eine der Komponenten von den übrigen Komponenten getrennt bleibt, bis die Erzeugung der Biolumineszenz erwünscht ist. Detaillierte Beschreibungen derartiger Vorrichtungen finden sich in den gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldungen mit den Seriennummern 08/757,046 und 08/597,274 des gleichen Inhabers.
  • 2. Kapseln, Pellets, Liposomen, Endosomen, Vakuolen, mikronisierte Partikel
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das Maskieren der Komponenten von einer der Zusammensetzungen gegenüber der Umgebung vor der Verwendung oder das Vorsehen der Komponenten in Partikelform, wie in Form von Mikropartikeln, erforderlich sein. Beispiele für geeignete Mittel für eine derartige Verwendung schließen das Verkapseln von Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems in einem oder mehreren Mikropartikeln (Größe bis zu etwa 100 μm) oder Makropartikeln (größer als 100 μm) eines Materials ein, das die Freisetzung des Inhalts erlaubt, z. B. durch Diffusion oder durch das Auflösen des verkapselnden Materials. Mikropartikel, an die eine Vielzahl von Konjugaten gebunden werden können, gehören zu den bevorzugten Ausführungsformen. Die Mikropartikel sind biokompatibel und haben vorzugsweise eine solche Größe, dass sie durch Kapillarwände hindurchtreten können.
  • Liposomen und andere verkapselnde Vehikel (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,525,306 , in dem die Verkapselung von Verbindungen in Gelatine beschrieben wird; die U.S.-Patente Nr. 4,021,364 , 4,225,581 , 4,269,821 , 4,322,311 , 4,324,683 , 4,329,332 , 4,525,306 , 4,963,368 beschreiben die Verkapselung von biologisch aktiven Materialien in verschiedenen Polymeren) sind dem Fachmann bekannt, eingeschlossen diejenigen, die hier diskutiert werden und die dem Fachmann bekannt sind (wie lösliches Papier, siehe U.S.-Patent Nr. 3,859,125 ).
  • a. Verkapselungsvehikel im Allgemeinen
  • Die Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems können mit Ausnahme des Sauerstoffs oder des Wassers oder von Ca2+ in Abhängigkeit vom ausgewählten System in ein verkapselndes Materi al, wie Liposomen, eingebracht werden, die den Inhalt von der Umgebung schützen, bis er in Bedingungen gebracht wird, die die Freisetzung des Inhalts in die Umgebung verursachen. Verkapselungsmaterialien, die hier für eine Verwendung ins Auge gefasst werden, schließen Liposomen und andere derartige Materialien ein, die für die Verkapselung von Chemikalien verwendet werden, wie Vehikel für die Zufuhr von Arzneimitteln, ein.
  • b. Verkapselungsvehikel – Liposomen
  • Liposomen, die sich auflösen und die Komponenten langsam in das Medium, wie das Blut, freisetzen, das gelösten Sauerstoff oder Ca2+ oder sogar ATP für das Luciferase-System enthält, werden hier beispielsweise ins Auge gefasst. Sie können in Zusammensetzungen, wie Lösungen, Suspensionen, Gels, Lotionen, Cremes und Salben, für topische Anwendungen, wie Verfahren für die Diagnose oder das Sichtbarmachen von Melanomen, formuliert werden. Liposomen und andere Verkapselungszusammensetzungen für die langsame Freisetzung sind wohlbekannt und können an die Verwendung für die Zufuhr unter langsamer Freisetzung der Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten angepasst werden. Typischerweise werden das GFP, das Luciferin und/oder die Luciferase in Abwesenheit von Sauerstoff oder Ca2+ oder ATP oder anderer aktivierender Komponenten verkapselt. Bei der Freisetzung in die Umgebung oder das Medium, das diese Komponente in einer geeigneten Konzentration enthält, findet die Reaktion statt und wird ein Leuchten erzeugt. Ganz allgemein sollten die Konzentrationen der verkapselten Komponenten relativ hoch sein, etwa 0,1 bis 1 mg/ml oder darüber, um für eine Sichtbarkeit ausreichend hohe lokale Konzentrationen bei der Freisetzung zu gewährleisten.
  • Liposomen oder ein anderes Zufuhrsystem für die anhaltende Freisetzung, die in einer Salbe oder einem topischen Vehikel für die anhaltende Freisetzung formuliert sind, wären zum Beispiel für die Verwendung in einer Körperfarbe, einer Lotion geeignet. Diejenigen, die als eine Suspension formuliert werden, wären als Spray brauchbar. Zahlreiche Salben und geeignete Liposomenformulierungen sind bekannt (siehe z. B. Liposome Technology, Targeted Drug Delivery and Biological Interaction, Bd. III, G. Gregoriadis Hrsg., CRC Press, Inc., 1984; U.S.-Patente Nr. 5,470,881 ; 5,366,881 ; 5,296,231 ; 5,272,079 ; 5,225,212 ; 5,190,762 ; 5,188,837 ; 5,188,837 ; 4,921,757 ; 4,522,811 ). Ein geeignetes Salbenvehikel würde beispielsweise Petrolatum, ein Mineralöl und/oder wasserfreies flüssiges Lanolin enthalten. Vehikel für die anhaltende Freisetzung, wie Liposomen, Membran- oder Kontaktlinsenzufuhrsysteme oder gelbildende Kunststoffpolymere, wären ebenfalls geeignete Zufuhrvehikel. Liposomen für die topische Zufuhr sind wohlbekannt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,296,231 ; Mezei et al. (1980) "Liposomes – A selective drug delivery system for the topical route of administration, I. lotion dosage forms" Life Sciences 26: 1473–1477; Mezei et al. (1981) "Liposomes – A selective drug delivery system for the topical route of administration: gel dosage form" Journal of Pharmacy and Pharmacology 34: 473–474; Gesztes et al. (1988) "Topical anaesthesia of the skin by liposome – encapsulated tetracaine" Anesthesia and Analgesia 67: 1079–1081; Patel (1985) "Liposomes as a controlled-release system", Biochemical Soc. Trans. 13: 513–516; Wohlrab et al. (1987) "Penetration kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin" Dermatologica 174: 18–22).
  • Liposomen sind Mikrokapseln (Durchmesser typischerweise in der Größenordnung von weniger als 0,1 bis 20 μm), die ausgewählte Gemische enthalten und ihren Inhalt langsam in einer anhaltenden Weise freisetzen. Ausgerichtete Liposomen oder andere Kapseln, vor allem mit einem Überzug für die verlängerte Freisetzung, die sich auf lösen, wenn sie Sauerstoff, Luft, Feuchtigkeit, sichtbarem Licht oder Ultraviolettlicht (UV) oder einem bestimmten pH-Wert oder einer bestimmten Temperatur ausgesetzt werden, können verwendet werden (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,882,165 ; Kusumi et al. (1989) Chem. Lett. Nr. 3 433–436; Koch Troels et al. (1990) Bioconjugate Chem. 4: 296–304; U.S.-Patent Nr. 5,482,719 ; U.S.-Patent Nr. 5,411,730 ; U.S.-Patent Nr. 4,891,043 ; Straubinger et al. (1983) Cell 32: 1069–1079; und Straubinger et al. (1985) FEBS Lttrs. 179: 148–154; und Duzgunes et al. in Kapitel 11 des Buches CELL FUSION; Hrsg. A. E. Sowers; Ellens et al. (1984) Biochemistry 23: 1532–1538; Yatvin et al. (1987) Methods in Enzymology 149: 77–87). Liposomenformulierungen zur Verwendung beim Backen stehen zur Verfügung (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,999,208 ). Sie setzen ihren Inhalt frei, wenn sie gegessen oder erhitzt werden. Derartige Liposomen können für die intravenöse oder lokale Verabreichung geeignet sein.
  • Liposomen werden durch Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. Kimm et al. (1983) Bioch. Bioph. Acta 728: 339–398; Assil et al. (1987) Arch Ophthalmol. 105: 400; und U.S.-Patent Nr. 4,522,811 , und andere Literaturangaben darin und sind dem Fachmann bekannt).
  • Liposomen, die gegenüber einem niedrigen pH-Wert empfindlich sind (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,352,448 , 5296,231 ; 5,283,122 ; 5,277,913 , 4,789,633 ) sind besonders gut geeignet für die Verwendung mit alkalischen Mitteln. Beim Kontakt mit der Tensid- oder Seifenzusammensetzung mit dem niedrigem pH-Wert oder einer Zusammensetzung mit einem hohen pH-Wert wird der Inhalt der Liposomen freigesetzt. Andere Komponenten, vor allem Ca2+, oder das Vorhandensein von gelöstem O2 in dem Wasser führt dazu, dass die Komponenten leuchten, wenn sie freigesetzt werden. Temperatur empfindliche Liposomen sind ebenfalls für die Verwendung in Badepulvern für die Freisetzung in das warme Badewasser geeignet.
  • c. Verkapselungsvehikel – Gelatine und polymere Vehikel
  • Makro- oder Mikrokapseln, die aus Gelatine oder einem anderen derartigen Polymer bestehen, die sich auflösen oder ihren Inhalt beim Kontakt mit der Luft oder Licht oder Temperaturänderungen freisetzen, können ebenfalls verwendet werden, um Komponenten der Biolumineszenz-erzeugenden Systeme zu verkapseln.
  • Derartige Mikrokapseln oder Makrokapseln können auch an ein Ansteuerungsmittel, z. B. einen Antikörper, konjugiert werden, so dass das GFP oder die Luciferase und die Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten durch den Antikörper dem Ziel zugeführt werden, wo die Komponenten unter Erzeugung eines Leuchtens freigesetzt werden.
  • Das Aequorin-System ist für diese Anwendung besonders gut geeignet. Es kann in Suspension oder Lösung oder als eine Paste, oder in einer anderen geeigneten Form, in einem Puffer mit ausreichend Chelatbildner, wie EDTA, verkapselt werden, um das Einsetzen der Biolumineszenz zu verhindern. Wenn die Kapsel (Mikrokapsel oder Makrokapsel) Feuchtigkeit ausgesetzt wird, die Ca2+ enthält, wie in einem Puffer oder im Blut, fangen die freigesetzten Komponenten an zu leuchten.
  • Die verkapselten Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten können demnach in Kombination mit einer Vielzahl von Ansteuerungsmitteln verwendet werden und dadurch die Luciferase/das Luciferin, wie das Renilla mulleri-, Pleuromamma-, Ptilosarcus- oder Gaussia-System, freisetzen, das leuchtet, wenn es der Luft ausgesetzt wird.
  • Andere Verkapselungsbehälter oder -vehikel zur Verwendung mit den Biolumineszenz-Systemen sind diejenigen, die sich in Wasser genügend auflösen und dadurch ihren Inhalt freisetzen, oder diejenigen, die sich leicht öffnen, wenn sie in der Hand zusammengedrückt werden, oder aus denen der Inhalt diffundiert, wenn sie mit einem wässrigen Gemisch vermischt werden. Diese Behälter können so hergestellt werden, dass Wasser ausgeschlossen ist, so dass die Komponenten des Biolumineszenz-Systems getrocknet und darin eingebracht werden können. Wenn das Vehikel Wasser ausgesetzt wird, wie in einer wässrigen Zusammensetzungslösung oder in der Atmosphäre, löst es sich auf oder setzt den Inhalt auf andere Weise frei, und die Komponenten reagieren und leuchten. Ähnlich können etwas weniger als alle Komponenten des Biolumineszenz-Systems in Pelletform hergestellt werden. Es können beispielsweise eine oder mehrere Komponenten mit Gelatine oder ähnlichen Härtungsmitteln vermischt werden, falls erforderlich in eine Form gegossen werden und zu einem harten, wasserlöslichen Pellet getrocknet werden. Die Verkapselungsbehälter oder -vehikel können aus Gelatine oder einem ähnlichen wasserlöslichen Material, das biokompatibel ist, hergestellt werden.
  • d. Endosome und Vakuolen
  • Vehikel können unter Verwendung von Endosomen oder Vakuolen von rekombinanten Wirtszellen hergestellt werden, in denen die Renilla-GFPs oder Ptilosarcus-GFPs oder die Renilla mulleri-, Pleuromamma- oder Gaussia-Luciferase unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, exprimiert werden (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,284,646 , 5,342,607 , 5,352,432 , 5,484,598 , 5,192,679 , 5,206,161 und 5,360,726 ). Beispielsweise kann Aequorin, das durch die Expression in einem Wirt, wie E. coli, erzeugt wird, nach der Proteinsynthese innerhalb von Vesikeln, wie Endosomen oder Vakuolen, isoliert werden. Unter Verwendung von Routineverfahren werden die Zellen lysiert, und die Vesikeln werden mit intaktem Inhalt freigesetzt. Die Vesikeln dienen als Zufuhrvehikel. Wenn sie verwendet werden, werden sie mit einem Luciferin, wie einem Coelenterazin, und gelöstem Sauerstoff, wie durch Diffusion unter Druck oder auf andere geeignete Weise, beladen.
  • e. Mikronisierte Partikel
  • Die Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems, die für eine Lyophilisierung geeignet sind, wie das Aequorin-Photoprotein, das Renilla-System, die Ptilosarcus-, Pleuromamma- und die Gaussia-Systeme, können unter Erzeugung eines feinen Pulvers mikronisiert werden und unter Trocknungsbedingungen, wie mit einem Trockenmittel, gelagert werden. Der Kontakt mit gelöstem Sauerstoff oder Ca2+ an der Luft oder in einem Nebel, die zugeführt werden können, oder in einer zugegebenen Lösung führen dazu, dass sich die Partikel auflösen und leuchten.
  • 3. Immobilisierte Systeme
  • a. Matrixmaterialien
  • In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, mindestens die GFPs oder eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems gebunden an einen Matrixträger bereitzustellen, der dann lokal oder systemisch verabreicht werden kann. Der Matrixträger ist biokompatibel. Wenn erwünscht wird ein Gemisch oder werden Gemische, das/die die übrigen Komponenten enthält/enthalten, typischerweise ein flüssiges Gemisch, durch Gießen oder Versprühen auf den Matrixträger aufgebracht, wodurch das Leuchten erzeugt wird. Das Aequorin-Photoprotein, eingeschlossen Coelenterazin und Sauerstoff, wird beispielsweise an den Träger gebunden. Wenn erwünscht wird eine Flüssigkeit wie Leitungswasser, die Ca2+ enthält, oder vorzugsweise ein flüssiges Gemisch, das das Ca2+ in einem geeigneten Puffer enthält, beispielsweise durch Sprühen mit der Matrix mit der angebundenen Luciferase in Kontakt gebracht. Beim Inkontaktbringen in Gegenwart eines GFPs leuchtet das Material grün.
  • In anderen Ausführungsformen wird das Renilla-GFP, die Renilla mulleri- oder Gaussia-, Pleuromamma-Luciferase oder eine andere Luciferase, wie eine Vargula-Luciferase, mit dem Trägermaterial verbunden und mit einem flüssigen Gemisch in Kontakt gebracht, das das Luciferin in einem geeigneten Puffer enthält. Das Inkontaktbringen kann durch Besprühen oder Gießen oder einem sonstigen geeigneten Weg erfolgen. Das Matrixmaterial wird in einen Herstellungsgegenstand eingebracht, auf diesen Gegenstand aufgebracht oder zu diesem Gegenstand geformt, wie einem chirurgischen Schwamm oder als Teil einer Mikrokugel.
  • Es ist offensichtlich, dass die exakten Komponenten und optimalen Mittel für die Anwendung oder die Lagerung vom ausgewählten Biolumineszenz-System abhängen. Die Konzentrationen der Komponenten, die empirisch ermittelt werden können, sind nicht kritisch, müssen aber so hoch sein, dass ein sichtbares Leuchten erzeugt wird, wenn sie kombiniert werden. Typische Konzentrationen können bis herunter in den Nanomol/Liter-Bereich reichen und liegen vorzugsweise im Milligramm/Liter-Bereich oder darüber. Die Konzentration auf dem Träger ist diejenige, die erzeugt wird, wenn eine Zusammensetzung, die eine derartige typische Konzentration enthält, auf das Material aufgebracht wird. Es wird nochmals darauf hingewiesen, dass derartige ideale Konzentrationen einfach empirisch ermittelt werden können, indem die erste Zusammensetzung angewendet wird, man sie trocknen lässt und dann die zweite Zusammensetzung aufgesprüht und das Ergebnis beobachtet wird.
  • Die Matrixmaterialträger, die hier in Betracht gezogen werden, sind im Allgemeinen unlösliche Materialien, die verwendet werden, um Liganden und andere Moleküle zu immobilisieren, und es sind diejenigen Materialien, die in vielen chemischen Synthesen und Trennungen verwendet werden. Derartige Matrizes werden vorzugsweise aus biokompatiblen, noch bevorzugter aus biologisch abbaubaren Materialien hergestellt. Derartige Träger, die auch als Matrizes bezeichnet werden, werden beispielsweise bei der Affinitätschromatographie, der Immobilisierung biologisch aktiver Materialien und im Laufe von chemischen Synthesen von Biomolekülen eingeschlossen Proteine und Aminosäuren, und von anderen organischen Molekülen und Polymeren verwendet. Die Herstellung und die Verwendung der Matrizen sind dem Fachmann wohlbekannt; es sind viele derartige Materialien und Verfahren für ihre Herstellung bekannt. Beispielsweise können natürlich vorkommende Matrixmaterialien, wie Agarose und Cellulose, aus ihren jeweiligen Quellen isoliert werden und gemäß den bekannten Protokollen aufbereitet werden. Andere verwendbare Matrizes können Proteine, zum Beispiel Trägermoleküle, wie Albumin, umfassen.
  • Die Trägermatrizes sind typischerweise unlösliche Materialien, die fest, porös, verformbar oder hart sind und die eine beliebige erforderliche Struktur und Geometrie haben, die nicht einschränkend einschließen: Kügelchen, Pellets, Scheiben, Kapillare, Hohlfasern, Nadeln, feste Fasern, Zufallsformen, dünne Filme und Membranen. Der Gegenstand kann demnach aus dem Matrixmaterial hergestellt oder damit kombiniert werden, zum Beispiel durch das Beschichten der gesamten Oberfläche oder eines Teiles davon oder durch das Imprägnieren der Partikel.
  • Wenn die Matrix partikelförmig ist, haben die Partikel typischerweise eine Größe von 10–2000 μm, sie können aber je nach der ausgewählten Anwendung kleiner oder größer sein. Die Auswahl der Matrizes wird mindestens teilweise durch ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie Löslichkeit, funktionelle Gruppen, mechanische Stabilität, Oberfläche, Neigung zum Quellen, hydrophobe oder hydrophile Eigenschaften, und die beabsichtigte Verwendung beeinflusst. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Matrizes vorzugsweise biokompatible, noch bevorzugter biologisch abbaubare Matrizes.
  • Falls erforderlich kann das Trägermatrixmaterial so behandelt werden, dass es einen geeigneten reaktiven Rest enthält, oder in einigen Fällen kann es im Handel erworben werden und den reaktiven Rest bereits enthalten und kann so als der Matrixträger dienen, auf dem die Moleküle angebunden werden. Materialien, die reaktive Oberflächenreste aufweisen, wie Amino-Silan-Bindungen, Hydroxybindungen oder Carboxysilan-Bindungen, können durch gut eingeführte Techniken der Oberflächenchemie, an denen Silanisierungsreaktionen oder dergleichen beteiligt sind, hergestellt werden. Beispiele für diese Materialien sind diejenigen, die Oberflächensiliciumoxidreste aufweisen, die kovalent mit γ-Aminopropylsilan und anderen organischen Resten; N-[3-(Triethyloxysilyl)propyl)phthalamidsäure; und Bis-(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan, verbunden sind. Beispielhaft für einfach verfügbare Materialien, die reaktive Aminogruppen enthalten, schließen nicht einschränkend p-Aminophenyltriethyloxysilan ein. Derivatisierte Polystyrole und andere derartige Polymere sind ebenfalls wohlbekannt und dem Fachmann einfach verfügbar (z. B. sind die Tentagel®-Harze mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen erhältlich und von Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland, im Handel erhältlich; siehe U.S.-Patent Nr. 4,908,405 und U.S.-Patent Nr. 5,292,814 ; siehe auch Butz et al. (1994) Peptide Res. 7: 20–23; Kleine et al. (1994) Immunobiol. 190: 53–66).
  • Diese Matrixmaterialien schließen alle Materialien ein, die als Trägermatrix für die Befestigung der interessierenden Moleküle wirken können. Derartige Materialien sind dem Fachmann bekannt und schließen die Materialien ein, die als Trägermatrix verwendet werden. Diese Materialien schließen nicht einschränkend anorganische, natürliche Polymere und synthetische Polymere ein, die nicht einschränkend einschließen: Cellulose, Cellulosederivate, Acrylharze, Glas, Kieselsäuregele, Polystyrol, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Copolymere von Vinyl- und Acrylamid, Polystyrol vernetzt mit Divinylbenzol oder dergleichen (siehe Merrifield (1964) Biochemistry 3: 1385–1390), Polyacrylamide, Latexgele, Polystyrol, Dextran, Polyacrylamide, Kautschuk, Silicon, Kunststoffe, Nitrocellulose, Cellulosen, natürliche Schwämme. Von besonderem Interesse sind hier hoch poröse Gläser (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,244,721 ) und andere Materialien, die durch das Vermischen eines Borsilikats, von Alkohol und Wasser hergestellt werden.
  • Synthetische Matrizes schließen nicht einschränkend ein: Acrylamide, Dextran-Derivate und Dextran-Copolymere, Agarose-Polyacrylamid-Mischungen, andere Polymere und Copolymere mit verschiedenen funktionellen Gruppen, Methacrylatderivate und -Copolymere, Polystyrol und Polystyrol-Copolymere, (siehe z. B. Merrifield (1964) Biochemistry 3: 1385–1390; Berg et al. (1990) in Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., 1. Int. Symp., Epton Roger (Hrsg.) S. 453–459; Berg et al. (1989) in Pept., 20. Proc. Eur. Pept. Symp., Jung, G. et al. (Hrsg.) S. 196–198; Berg et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 8024–8026; Kent et al. (1979) Isr. J. Chem. 17: 243–247; Kent et al. (1978) J. Org. Chem. 43: 2845–2852; Mitchell et al. (1976) Tetrahedron Lett. 42: 3795–3798; U.S.-Patent Nr. 4,507,230 ; U.S.-Patent Nr. 4,006,117 ; und U.S.-Patent Nr. 5,389,449 ). Verfahren zur Herstellung derartiger Matrizes sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Synthetische Matrizes schließen diejenigen ein, die aus Polymeren und Copolymeren erzeugt werden, wie Polyvinylalkoholen, Acrylaten und Acrylsäuren, wie Polyethylen-co-acrylsäure, Polyethylen-co-methacrylsäure, Polyethylen-co-ethylacrylat, Polyethylen-co-methacrylat, Polypropylen-co-acrylsäure, Polypropylen-co-methacrylsäure, Polypropylen-co-ethylacrylat, Polypropylen-co-methylacrylat, Polyethylen-co-vinylacetat, Polypropylen-co-vinylacetat und diejenigen, die Säureanhydridgruppen enthalten, wie Polyethylen-co-maleinsäureanhydrid, Polypropylen-co-maleinsäureanhydrid und dergleichen. Liposomen sind ebenfalls als feste Träger für Affinitätsreinigungen verwendet worden (Powell et al. (1989) Biotechnol. Bioeng. 33: 173).
  • In dem U.S.-Patent Nr. 5,403,750 wird beispielsweise die Herstellung von Polymeren auf Polyurethanbasis beschrieben. In dem U.S.-Patent Nr. 4,241,537 wird ein Pflanzenwachstumsmedium beschrieben, das eine hydrophile Polyurethangelzusammensetzung enthält, die aus kettenverlängerten Polyolen hergestellt wird; die Random-Copolymerisation ist bevorzugt mit bis zu 50% Propylenoxideinheiten, damit das Prepolymer bei Raumtemperatur flüssig ist. In dem U.S.-Patent Nr. 3,939,123 werden schwach vernetzte Polyurethanpolymere von Prepolymeren mit endständigem Isocyanat beschrieben, die Poly(ethylenoxy)glycole mit bis zu 35% Polypropylenoxy)glycol oder Po1y(butylenoxy)glycol enthalten. Bei der Herstellung dieser Polymere wird ein organisches Polyamin als ein Vernetzungsmittel verwendet. Andere Matrizes und deren Herstellung werden in den U.S.-Patenten Nr. 4,177,038 , 4,175,183 , 4,439,585 , 4,485,227 , 4,569,981 , 5,092,992 , 5,334,640 , 5,328,603 beschrieben.
  • In dem U.S.-Patent Nr. 4,162,355 wird ein Polymer beschrieben, das für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie geeignet ist, das ein Polymer aus einem Aminimid und einer Vinylverbindung ist, das mindestens eine seitenständige Halogenmethylgruppe aufweist. Ein Aminligand, der Stellen für die Bindung in der Affinitätschromatographie liefert, ist durch die Umsetzung mit einem Teil der seitenständigen Halogenmethylgruppen an das Polymer gekoppelt, und die restlichen seitenständigen Halogenmethylgruppen werden mit einem Amin umgesetzt, das eine seitenständige hydrophile Gruppe enthält. Ein Verfahren zur Beschichtung eines Trägers mit diesem Polymer wird ebenfalls beschrieben. Ein beispielhaftes Aminimid ist das 1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxyoctyl)amidmetharylimid, und eine Vinylverbindung ist ein Chlormethylstyrol.
  • In dem U.S.-Patent Nr. 4,171,412 werden spezielle Matrizes beschrieben, die Matrizes auf der Basis hydrophiler polymerer Gele sind, vorzugsweise mit einem makroporösen Charakter, die kovalent angebundene D-Aminosäuren oder Peptide tragen, die D-Aminosäureeinheiten enthalten. Der Grundträger wird durch die Copolymerisation von Hydroxyalkylestern oder Hydroxyalkylamiden von Acryl- und Methacrylsäure mit vernetzenden Acrylat- oder Methacrylatcomonomeren hergestellt, die durch die Umsetzung mit Diaminen, Aminosäuren oder Dicarbonsäuren modifiziert werden, und die resultierenden carboxyterminalen oder aminoterminalen Gruppen werden mit D-Analoga von Aminosäuren oder Peptiden kondensiert. Die Peptide, die D-Aminosäuren enthalten, können auch schrittweise auf der Oberfläche des Trägers synthetisiert werden.
  • In dem U.S.-Patent Nr. 4,178,439 wird ein kationischer Ionenaustauscher und ein Verfahren für dessen Herstellung beschrieben. In dem U.S.-Patent Nr. 4,180,524 werden chemische Synthesen auf einem Kieselsäureträger beschrieben.
  • Immobilisierte künstliche Membranen (Immobilized Artificial Membranes = IAMs, siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 4,931,498 und 4,927,879 ) können ebenfalls verwendet werden. IAMs imitieren Zellmembranumgebungen und können verwendet werden, um Moleküle zu binden, die vorzugsweise mit Zellmembranen assoziieren (siehe z. B. Pidgeon et al. (1990) Enzyme Microb. Technol. 12: 149).
  • Diese Materialien sind auch für die Herstellung von Herstellungsgegenständen, chirurgischen Schwämmen, Seifen und anderer Gegenstände verwendet worden und sind demnach für die Anbindung von Molekülen, entweder der Luciferase, des Luciferins oder von Gemischen davon, zugänglich. Matrixpartikel können beispielsweise in Gegenstände hinein imprägniert werden, die dann mit einem Aktivator in Kontakt gebracht werden.
  • Kits, die den Gegenstand, der das Matrixmaterial mit oder ohne die Beschichtung aus den GFPs oder den Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten einschließt, und Zusammensetzungen enthalten, die die übrigen Komponenten enthalten, werden beschrieben.
  • b. Immobilisierung und Aktivierung
  • Es sind zahlreiche Verfahren für die Immobilisierung von Proteinen und anderer Biomoleküle auf unlöslichen oder flüssigen Trägern entwickelt worden (siehe z. B. Mosbach (1976) Methods in Enymology 44; Weetall (1975) Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides; und Kennedy et al. (1983) Solid Phase Biochemistry, Ana lytical and Synthetic Aspects, Scouten, Hrsg. S. 253–391; siehe allgemein Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B. Methods in Enymology, Bd. 34, Hrsg. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974); Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Adavances in Experimental Medicine and Biology, Bd. 42, Hrsg. R. Dunlap, Plenum Press, N.Y. (1974)).
  • Zu dem am häufigsten angewendeten Verfahren gehören die Absorption und die Adsorption oder die kovalente Anbindung auf dem Träger, entweder direkt oder über einen Linker, wie die zahlreichen Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, gehinderten Disulfidbindungen, und kovalenten Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie Amin- und Thiolgruppen, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. den PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992–1993, in dem die Herstellung und die Verwendung derartiger Reagenzien beschrieben wird und eine kommerzielle Quelle für derartige Reagenzien angegeben wird; und Wong (1993) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press; siehe auch De-Witt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Zuckermann et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 10646; Kurth et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2661; Ellman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 4708; Sucholeiki (1994) Tetrahedron Lttrs. 35: 7307; und Su-Sun Wang (1976) J. Org. Chem. 41: 3258; Padwa et al. (1971) J. Org. Chem. 41: 3550 und Vedejs et al. (1984) J. Org. Chem. 49: 575, worin photosensitive Linker beschrieben werden).
  • Für die Durchführung der Immobilisierung wird eine Lösung des Proteins oder eines anderen Biomoleküls mit einem Trägermaterial, wie Aluminiumoxid, Kohlenstoff, ein Ionenaustauscherharz, Cellulose, Glas oder ein Keramikmaterial, in Kontakt gebracht. Fluorkohlenstoffpolymere sind als Träger verwendet worden, an denen Biomoleküle durch Adsorption befestigt wurden (siehe U.S.-Patent Nr. 3,843,443 ; Veröffentlichte Internationale PCT-Anmeldung WO/86 03840 ). Für die Zwecke hier ist das Trägermaterial biokompatibel (d. h. für die Verwendung im Körper geeignet).
  • Es ist eine große Vielzahl von Verfahren für die Befestigung biologischer Moleküle, eingeschlossen Proteine und Nucleinsäuren, auf festen Trägern bekannt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5451683 ). In dem U.S.-Patent Nr. 4,681,870 wird beispielsweise ein Verfahren für das Aufbringen freier Amino- oder Carboxygruppen auf eine Kieselsäurematrix beschrieben. Diese Gruppen können anschließend in Gegenwart eines Carbodiimids kovalent mit anderen Gruppen verbunden werden, wie einem Protein oder einem anderen Anti-Liganden. Alternativ kann eine Kieselsäurematrix durch die Behandlung mit einem Cyanogenhalogenid unter alkalischen Bedingungen aktiviert werden. Der Anti-Ligand wird beim Aufbringen auf die aktivierte Oberfläche kovalent auf der Oberfläche befestigt. Ein anderes Verfahren schließt die Veränderung einer Polymeroberfläche durch das aufeinanderfolgende Auftragen von mehren Schichten von Biotin, Avidin und Verlängerern (Extender) ein (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,282,287 ); andere Verfahren schließen die Photoaktivierung ein, bei der eine Polypeptidkette durch das Einbringen einer lichtempfindlichen Gruppe aus einer nicht natürlichen Aminosäuregruppe in die Polypeptidkette und das Belichten des Produkts mit Ultraviolettlicht von geringer Energie auf einem festen Träger befestigt wird (siehe z. B. U.S-Patent Nr. 4,762,881 ). Oligonucleotide sind ebenfalls befestigt worden unter Verwendung von photochemisch aktiven Reagenzien, wie einer Psoralen-Verbindung, und eines Kupplungsmittels, das das Photoreagens auf dem Träger befestigt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,542,102 und U.S.-Patent Nr. 4,562,157 ). Die Photoaktivierung des Photoreagens bindet ein Nucleinsäuremolekül an den Träger unter Erhalt einer oberflächengebundenen Sonde.
  • Die kovalente Anbindung des Proteins oder eines anderen Biomoleküls oder organischen Moleküls oder biologischen Partikels an einen chemisch aktivierten festen Matrixträger, wie Glas, synthetische Polymere, und vernetzte Polysaccharide, ist eine häufiger verwendete Immobilisierungstechnik. Das Molekül oder das biologische Partikel kann direkt an den Matrixträger gebunden werden oder über einen Linker, wie ein Metall, angebunden werden (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,179,402 ; und Smith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in Enz. 4: 73–78). Ein Beispiel für dieses Verfahren ist die Cyanogenbromid-Aktivierung von Polysaccharid-Trägern, wie Agarose. Die Verwendung von Trägern auf Perfluorkohlenstoffpolymer-Basis für die Enzymimmobilisierung und die Affinitätschromatographie wird in dem U.S.-Patent Nr. 4,885,250 beschrieben. In diesem Verfahren wird das Biomolekül zunächst durch die Umsetzung mit einem Perfluoralkylierungsmittel, wie Perfluoroctylpropylisocyanat, das in dem U.S.-Patent Nr. 4,954,444 beschrieben wird, modifiziert. Anschließend wird das modifizierte Protein auf den Fluorkohlenstoffträger adsorbiert, wo es zur Immobilisierung kommt.
  • Die Aktivierung und die Verwendung der Matrizes sind wohlbekannt und können unter Anwendung jedes beliebigen bekannten Verfahrens erfolgen (siehe z. B. Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc., San Diego). Die Kopplung der Aminosäuren kann beispielsweise durch Techniken erreicht werden, die dem Fachmann geläufig sind und die beispielsweise in Stewart and Young, 1984; Solid Phase Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, zur Verfügung gestellt werden.
  • Andere geeignete Verfahren für die Anbindung von Molekülen auf festen Trägern sind dem Fachmann wohlbekannt (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,416,193 ). Diese Verfahren schließen Linker ein, die für das chemische Verbinden von Molekülen, wie Proteinen, mit Trägern geeignet sind, die nicht einschränkend Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie Amin- und Thiolgruppen, einschließen. Diese Bindungen können unter Verwendung von heterobifunktionellen Reagenzien erzeugt werden, die reaktive Thiolgruppen auf einem oder beiden Resten bilden, wonach die Thiolgruppen auf einem Rest mit reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen umgesetzt werden, woran reaktive Maleimidogruppen oder Thiolgruppen an dem anderen Rest gebunden werden können. Andere Linker schließen säurespaltbare Linker, wie Bismaleimidoethoxypropan, säurelabile Transferrinkonjugate und Adipinsäuredihydrazid ein, die in stärker sauren intrazellulären Kompartimenten gespalten werden; Vernetzungsmittel, die bei der Belichtung mit UV-Licht oder sichtbarem Licht gespalten werden, und Linker wie die verschiedenen Domänen, wie CH1, CH2 und CH3, der konstanten Region von humanem IgG1 ein (siehe Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379–386). Die derzeit bevorzugten Bindungen sind die direkten Bindungen, die durch die Adsorption des Moleküls auf der Oberfläche der Matrix entstehen. Andere Bindungen sind photospaltbare Bindungen, die aktiviert werden können, indem sie Licht ausgesetzt werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107. Der photospaltbare Linker wird so ausgewählt, dass die spaltende Wellenlänge die verbundenen Reste nicht beschädigt. Photospaltbare Linker sind Linker, die gespalten werden, wenn sie Licht ausgesetzt werden (siehe z. B. Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16., Brunfeldt, K. (Hrsg.), S. 105–110, worin die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschrieben wird; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69–82, worin wasserlösliche photospaltbare Copolymere, eingeschlossen Hydroxypropylmethacrylamidcopolymer, Glycincopolymer, Fluoresceincopolmer und Methylrhodamincopolymer, beschrieben werden; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107, worin ein Vernetzungsmittel und Reagens beschrieben wird, das einen photolytischen Abbau erleidet, wenn es nahem UV-Licht (350 nm) ausgesetzt wird; und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42: 231–237, worin Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Vernetzungsmittelreagenzien beschrieben werden, die photospaltbare Bindungen erzeugen). Der ausgewählte Linker hängt von der speziellen Anwendung ab und kann erforderlichenfalls empirisch ausgewählt werden.
  • Diese Verfahren für die Verbindung von Molekülen mit Trägern können an eine Verwendung für die Verbindung der Ansteuerungsmittel mit den ausgerichteten Mitteln angepasst werden.
  • M. Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer-System (BRET-System)
  • In der Natur emittieren Luciferasen, die Coelenterazin verwenden, breitbandiges blaugrünes Licht (Max. ~480 nm). Der Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) ist ein natürliches Phänomen, auf das erstmals bei Untersuchungen der Hydrozoa Obelia (Morin & Hastings (1971) J. Cell Physiol. 77: 313–318) geschlossen wurde, bei denen für die grüne Biolumineszenzemission, die in vivo beobachtet wurde, gezeigt wurde, dass sie das Ergebnis der strahlungslosen Übertragung von Energie auf ein akzessorisches grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist. Der BRET wurde kurz darauf in der Hydrozoa Aequorea victoria und der Anthozoa Renilla reniformis beobachtet. Auch wenn der Energietransfer in vitro zwischen gereinigter Luciferase und GFP in Aequorea-Systemen (Morise et al. (1974), Biochemistry 13: 2656–62) und Renilla-Systemen (Ward & Cormier (1976) J. Phys. Chem. 80: 2289–91) nachgewiesen worden ist, besteht ein Schlüsselunterschied darin, dass in Lösung ein effizienter strahlungsloser Energietransfer nur in Renilla stattfindet, ganz offensichtlich auf Grund der Vorassoziation eines Luciferase-Moleküls mit einem GFP- Homodimer (Ward & Cormier (1978) Photochem. Photobiol. 27: 389–96). Die blaue (486 nm) Lumineszenzemission der Renilla-Luciferase kann bei Zugabe geeigneter Mengen Renilla-GFP vollständig in eine schmalbandige grüne Emission (508 nm) umgewandelt werden (Ward & Cormier (1976) J. Phys. Chem. 80: 2289–91). Die GFPs nehmen Energie von den angeregten Zuständen der Luciferase-Substrat-Komplexe auf und emittieren das Licht wieder als schmalbandiges grünes Licht (~510 nm). Auf Grund des nicht strahlenden Energietransfers wird die Quantenausbeute der Luciferase erhöht.
  • Luciferasen und fluoreszierende Proteine haben viele gut entwickelte und nützliche Anwendungen als Protein-Tags und Transkriptionsreporter; BRET hat das Potential, die Empfindlichkeit und den Umfang dieser Anwendungen zu vergrößern. Ein GFP erhöht die Empfindlichkeit des Luciferase-Reporters, indem es die Quantenausbeute erhöht. Eine einzige Luciferase, die mit mehreren spektral verschiedenen GFPs vereinigt ist, ermöglicht die gleichzeitige Verwendung mehrerer Luciferase-Reporter, die durch die Zugabe eines einzigen Luciferins aktiviert werden. Durch die Herstellung von zwei Fusionsproteinen, von denen jedes ein GFP enthält, das eine andere Emissionswellenlänge hat, wobei jedes GFP mit einer identischen Luciferase verbunden ist, können zwei oder mehr als zwei Reporter mit einer einzigen Substratzugabe verwendet werden. Somit können mehrere Ereignisse überwacht werden oder können mehrere Assays unter Verwendung einer einzigen Reagenszugabe durchgeführt werden. Ein derartiges Reportersystem ist selbstrationierend, wenn die Verteilung des Luciferins homogen oder reproduzierbar ist.
  • Die Möglichkeit, verschiedenen simultane makromolekulare Ereignisse innerhalb einer Zelle bequem überwachen zu können, stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber der derzeitigen Biolumineszenztechnologie dar. BRET ermöglicht auch völlig neue Arten des Repor tings durch das Ausnützen von Änderungen in der Assoziierung oder der Orientierung der Luciferase und des fluoreszierenden Proteins. Durch die Herstellung von Fusionsproteinen kann das Luciferase-GFP-Akzeptorpaar dazu gebracht werden, auf Änderungen in der Assoziation oder der Konformation zwischen den verbundenen Resten zu antworten, es dient somit als ein Sensor.
  • Über den Energietransfer zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen (FREI) als physiologische Reporter ist berichtet worden (Miyawaki et al. (1997) Nature 338: 882–7), worin zwei verschiedene GFPs mit dem Carboxy- und dem Amino-Terminus von Calmodulin verbunden wurden. Änderungen in der Calciumionenkonzentration verursachten eine ausreichende Änderung der Konformation im Calmodulin, wodurch das Ausmaß des Energietransfers zwischen den GFP-Resten verändert wurde. Die beobachtete Änderung der Donoremission betrug ~10%, während die Änderung des Quotienten ~1,8 betrug.
  • Die ähnliche Verwendung eines Luciferase-GFP-Paares in Gegenwart des Substrats Luciferin, wie sie hier bereitgestellt wird, bringt wesentliche Vorteile mit sich. Erstens gibt es keinen Hintergrund und keine Anregung des Akzeptors durch das primär anregende Licht. Zweitens fällt der Hintergrund durch die Donoremission geringer aus und ist das Signal des Akzeptors relativ größer, weil die Quantenausbeute der Luciferase durch den nicht strahlenden Transfer auf das GFP beträchtlich erhöht wird. Drittens ist die Wellenlängenverschiebung der Peakemission der Luciferase (~480 nm) zu der Peakemission des GFPs (typischerweise 508–510 nm) groß, wodurch die Signalüberlappung minimiert wird. Alle drei Faktoren kombinieren zu einer Erhöhung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses. Die Konzentration des GFP-Akzeptors kann unabhängig unter Verwendung der Fluoreszenz ermittelt werden.
  • Für einige Anwendungen werden in vitro vernetzte oder anders in vitro veränderte Versionen der nativen Proteine ins Auge gefasst. Die genetisch codierten Fusionsproteine haben viele große Vorteile: A) bei der in vivo-Verwendung können die Fusionsproteine anders als die auf chemischen Molekülen basierenden Lumineszenzassays oder die Assays auf der Basis von Radioaktivität genetisch in lebende Zellen oder vollständige Organismen eingeführt werden. Hierdurch wird der Bereich der möglichen Anwendungen deutlich erhöht. B) Flexible und genaue Änderung – viele verschiedene, die Antwort modifizierende Elemente können reproduzierbar und quantitativ in ein gegebenes Luciferase-GFP-Paar eingebracht werden; C) Einfache Reinigung – nur ein Reagens muss gereinigt werden, und seine Reinigung kann mit Hilfe des fluoreszierenden Proteinrestes überwacht werden. Liganden-bindende Einheiten können eingebracht werden, um die Affinitätsreinigungsverfahren zu vereinfachen.
  • 1. Gestaltung von Sensoren auf der Basis von BRET
  • Der Resonanzenergietransfer zwischen zwei Chromophoren ist ein quantenmechanischer Vorgang, der außerordentlich empfindlich auf den Abstand zwischen dem Donor- und dem Akzeptorchromophor und ihrer relativen Anordnung im Raum reagiert (Wu & Brand (1994) Anal. Biochem. 218 1–13). Die Effizienz des Energietransfers ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Chromophorabstands. In der Praxis liegt der brauchbare Abstandsbereich bei etwa 10 bis etwa 100 Å, was den Resonanzenergietransfer zu einer sehr brauchbaren Technik für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen biologischen Makromolekülen gemacht hat. Eine Vielzahl von FRET-Biosensoren auf Fluoreszenzbasis ist konstruiert worden, in denen anfänglich chemische Fluorophore eingesetzt wurden, die an Proteine oder Membrankomponenten konjugiert waren, und seit kurzem Paare von spektral verschiedenen GFP-Mutanten verwendet werden (Giu liano & Taylor (1998) Trends Biotech. 16: 99–146: Tsien (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 509–44).
  • Auch wenn diese Biosensoren auf der Basis der Biolumineszenz von genetisch codiertem GFP Vorteile gegenüber den weniger bequemen und weniger genauen Biosensoren auf der Basis chemischer Konjugate haben, weisen sie alle eine Beschränkung in ihrer Gestaltung auf: es ist ganz allgemein schwierig, einen Biosensor zu konstruieren, in dem der Energietransfer quantitativ ist, wenn sich die Chromophore in nächster Gegenüberstellung befinden. Es ist nahezu unmöglich, die komplexe Stereochemie von Proteinen beliebig so zu beeinflussen, dass konjugierte oder intrinsische Chromophore stabil mit einem minimalen Abstand und einer optimalen Orientierung positioniert sind. Die Effizienz derartiger Biosensoren wird häufig auch durch stöchiometrische Ungleichgewichte zwischen dem Resonanzenergiedonor und dem Akzeptor eingeschränkt; das Donor- und das Akzeptormakromolekül müssen quantitativ komplexiert sein, um ein Hintergrundsignal zu vermeiden, das aus nicht komplexierten Chromophoren hervorgeht. Diese Einschränkungen in der allgemeinen Gestaltung werden wichtig, wenn die Biosensoren robust, bequem und billig sein müssen. Bei der Entwicklung von Technologien, wie der Durchmusterung mit hohem Durchsatz auf Arzneimittelkandidaten (unter Verwendung von Durchmusterungsprotokollen mit hohem Durchsatz (HTS = high throughput screening)), würden Biochips und Systeme zur Umweltüberwachung stark von modularen Biosensoren profitieren, bei denen das Signal eines seltenen Ziel-"Treffers" (z. B. der Komplexbildung zwischen zwei Polypeptiden) (statistisch) eindeutig unterscheidbar ist von dem hohen Überschuss der "Nicht-Treffer". Derzeitige genetisch codierte FREI-Biosensoren und Biosensoren auf Biolumineszenzbasis zeigen die Treffersignale an, die sehr oft weniger als zweimal größer und bestenfalls mehrfach größer als Nicht-Treffer- Signale sind (Xu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 151–156; Miyawaki et al. (1997) Nature 388: 882–7).
  • Für die Lösung dieser Probleme können die Anthozoan-GFPs, wie die Renilla-GFPs, die hier bereitgestellt werden, in Kombination mit ihren verwandten Luciferasen verwendet werden. Anthozoan-Luciferase-GFP-Komplexe liefern ein "Gerüst", auf dem Proteindomänen, die die biologischen Eigenschaften liefern, die für einen gegebenen Sensor spezifisch sind, angebunden werden können. Obwohl man viele brauchbare Zweikomponenten-Biosensoren auf der Basis dieses Gerüsts konstruieren kann, werden in einem hier ins Auge gefassten Biosensor unabhängige Proteindomänen, die potentiell miteinander komplexieren, jeweils mit der Luciferase und dem GFP verbunden.
  • Isoliert emittiert eine Anthozoan-Luciferase blaues Licht aus dem Coelenterazin-abgeleiteten Chromophor (A), und ein Anthozoan-GFP, das mit blaugrünem Licht angeregt wird, emittiert grünes Licht aus seinem vollständigen Fluorophor (B) auf Peptidbasis. Wenn die Luciferase und das GFP in vivo oder in vitro zu einem Komplex assoziieren, überträgt die Luciferase nicht strahlend ihre Reaktionsenergie auf den GFP-Fluorophor, der dann das grüne Licht (C) emittiert. Demnach kann jede molekulare Wechselwirkung, die den Luciferase-GFP-Komplex aufbricht, quantitativ überwacht werden, indem das Verhältnis von blauem zu grünem Licht (D) beobachtet wird.
  • Zu diesem Thema gibt es viele mögliche Variationen. In einem Dreikomponentensystem kann beispielsweise entweder die Luciferase oder das Luciferin an eine Liganden-bindende Domäne eines interessierenden Proteins oder eines anderen Zielpeptids oder einen anderen interessierenden Rest gebunden werden. Wenn die Gestaltung des Fusionsproteins korrekt ist, verhindert dann das Anbinden eines kleinen Moleküls oder eines Proteinliganden die Luciferase-GFP- Assoziation, und somit hat man einen Biosensor auf BRET-Basis. Komplexere Proteinfusionen können entwickelt werden, um Zweikomponenten- und sogar Einkomponenten-BRET-Biosensoren für eine Vielzahl von Anwendungen zu entwickeln.
  • 11 veranschaulicht das dem Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) zugrundeliegende Prinzip und seine Anwendung als Sensor: A) im isolierten Zustand emittiert eine Luciferase, vorzugsweise eine Anthozoan-Luciferase, blaues Licht von dem Coelenterazin-abgeleiteten Chromophor; B) im isolierten Zustand emittiert ein GFP, vorzugsweise ein Anthozoan-GFP, das an die Luciferase bindet, das mit blaugrünem Licht angeregt wird, grünes Licht aus seinem vollständigen Fluorophor auf Peptidbasis; C) wenn die Luciferase und das GFP in vivo oder in vitro zu einem Komplex assoziieren, überträgt die Luciferase nicht strahlend ihre Reaktionsenergie auf das GFP-Fluorophor, das dann das grüne Licht emittiert. D) jede molekulare Wechselwirkung, die den Luciferase-GFP-Komplex aufbricht, kann quantitativ untersucht. werden, indem die spektrale Verschiebung vom grünen Licht zum blauen Licht beobachtet wird.
  • Die Nucleinsäuren und die Konstrukte und Plasmide, die hier offenbart werden, ermöglichen die Herstellung einer Vielzahl von Konfigurationen von Fusionsproteinen, die ein Anthozoan-GFP, wie Renilla-GFP, mit seiner verwandten Anthozoan-Luciferase einschließen. Die Nucleinsäure, die das GFP codiert, kann benachbart zu der Nucleinsäure, die die Luciferase codiert, oder davon durch die Insertion einer Nucleinsäure getrennt, die beispielsweise eine Liganden-bindende Domäne eines interessierenden Proteins codiert, angebunden werden. Das GFP und die Luciferase werden gebunden. Bei der Wechselwirkung der Liganden-bindenden Domäne mit einer Testverbindung oder einem anderen Rest wird die Wechselwirkung des GFPs mit der Luciferase verändert, wodurch das Emissionssignal des Komplexes verändert wird. Falls erforderlich können das GFP und die Luciferase verändert werden, um die Wechselwirkung fein einzustellen, um das System empfindlicher für Änderungen der Konformation oder der Temperatur oder anderer Parameter zu machen.
  • 2. Vorteile von BRET-Sensoren
  • Die hier beschriebenen BRET-Sensoren bringen viele Vorteile mit sich. BRET-Sensoren sind beispielsweise selbstrationierend. Der Reporter und das Ziel sind in ein einziges Polypeptid integriert. Dies gewährleistet eine 1:1:1-Stöchiometrie zwischen der Luciferase, dem GFP und dem Ziel (oder eine 1:N:1-Stöchiometrie, wenn mehr als ein GFP, typischerweise ein GFP-Homodimer, an eine Luciferase gebunden werden kann). Die GFP-Fluoreszenz erlaubt die absolute Quantifizierung des Sensors. Der Nullzustand gibt ein Signal, das die Funktionsfähigkeit des Sensors nachweist. Ein quantifizierbarer Nullzustand vereinfacht die DBRET-Sensoren ("Disruption-of-BRET sensors). BRET-Sensoren haben ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis als GFP-FRET-Sensoren, weil es hier keine zelluläre Autofluoreszenz, keine Anregung des Akzeptors durch das primär anregende Licht gibt und weil die Quantenausbeute der Luciferase durch die nicht strahlende Energieübertragung auf das GFP deutlich erhöht wird und weil es nur eine minimale Signalüberlappung zwischen der Emission der Luciferase und der Emission des GFPs gibt. Außerdem haben Anthozoan-GFPs 6-fach höhere Extinktionskoeffizienten als das Aequorea-GFP.
  • Die BRET-Sensoren können für die Treffer-Identifizierung und die Stromabwärts-Beurteilung in in vitro-Durchmusterungsassays in vitro oder in vivo oder in situ, eingeschlossen in kultivierten Zellen und Geweben und Tieren, verwendet werden. Die BRET-Sensoren können durch die thermische Endpunkt-Selektion erzeugt werden, die für DBRET (Discruption-of-BRET) geeignet ist und bei der die Notwendigkeit der Kenntnis der Ziel-3D-Struktur und der funktionellen Dynamiken geringer ist. Existierende Durchmusterungsautomaten für die Optimierung der Biosensoren. BRET-Sensoren profitieren von der großen genetischen Vielfalt. Anthozoane haben effiziente Luciferase-GFP-Energietransfer-Systeme hervorgebracht, und die Komponenten können vermischt und aufeinander abgestimmt werden. Hoch effiziente heterologe Luciferasen können weniger aktive Luciferasen ersetzen. Es kann beispielsweise eine aktive Stelle einer Copepod-Luciferase mit einer Anthozoan-Luciferase-GFP-Bindungsdomäne verbunden werden. Es gibt viele verschiedene Coelenterazin-verwendende Luciferasen.
  • BRET-Sensoren sind modular, so dass ein optimiertes Sensorgerüst für verschiedene Ziele verwendet werden kann. Der BRET-Akzeptor kann ebenfalls variiert werden, um verschobene Emissionen zu erhalten, was das mehrfache gleichzeitige Auslesen vereinfacht. Die Anthozoan-GFPs können mutiert werden. GFPs oder andere Proteine können mit verschiedenen chemischen Fluoren modifiziert werden, Fluor-modifizierte FRET-Akzeptoren für die Durchmusterung mit hohem Durchsatz (HTS high throughput screening) können angepasst werden, der BRET-Donor (Luciferase) kann variiert werden, zum Beispiel indem ein Aequorin-Photoprotein (Ca2+-aktiviert) oder eine Leuchtkäfer-Luciferase (benötigt ATP und ein Leuchtkäfer-Luciferin) verwendet wird, um eine einer Bedingung unterliegende Aktivierung zu erhalten. Das Sensorgerüst kann in eine Vielzahl von Immobilisierungseinheiten, eingeschlossen Platten mit freiem Format, die die Reagenzvolumina verringern können, wiederverwendbare Mikrotiterplatten, Miniatursäulen und Biochips eingegliedert werden. Schließlich sind BRET-Sensoren preiswerte und reproduzierbare Reagenzien, weil sie durch eine standardisierte Proteinerzeugung hergestellt werden können und weil sie Reinigungs-Tags einschließen können. Ge netisch codierte Reporter sind besser reproduzierbar als chemisch modifizierte Reporter. Die lineare Translation von BRET-Modulen gewährleistet die Sensor-Tag.
  • Die folgenden Beispiele sind nur für den Zweck der Veranschaulichung beigefügt.
  • BEISPIEL 1
  • Es wird darauf hingewiesen, dass die Gaussia-Luciferase den Gegenstand der vorliegende Erfindung bildet, während die Renilla mulleri-Luciferase und die Pleuromamma-Luciferase und auch das Renilla-GFP und das Ptilosarcus-GFP nur als Vergleichsbeispiele offenbart sind.
  • I. TOXIKOLOGIE
  • 1. Löslichkeit des Coelenterazins
  • Coelenterazin ist in nicht reizenden Vehikeln nicht besonders gut löslich. Coelenterazin ist in einer 2%igen Lösung (G/V) von PEG 400, das etwa 0,8% NaCL enthält, bis zu einer Konzentration von mindestens 200 μg/ml löslich. Obwohl diese Lösung leicht hypertonisch ist, ist sie für die Zwecke als Vehikel nicht reizend.
  • 2. Toxikologie des Coelenterazins
  • A. Topische Verabreichung
  • Für die Untersuchung der Toxikologie der oben beschriebenen Coelenterazin-Lösung wurde die Lösung in die Augen von narkotisierten Kaninchen unter Befolgung von Standardverfahren verabreicht, und die Reizung der Bindehaut wurde gemessen. Die Tiere wurden mit Diazepam (etwa 2 mg/kg) sediert, und 100 μl der Coelenterazinhaltigen PEG-Lösung wurden in ein Auge geträufelt, während in das andere Auge nur das PEG-Vehikel geträufelt wurde. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 30 min beobachtet, und anschließend wurden die Tiere sorgfältig im Hinblick auf eine Reizung der Bindehaut sowie jede sonstige Geschwürbildung auf der Hornhaut untersucht. Die Untersuchung wurde unter Verwendung einer Schlitzlampe durchgeführt, um das Auge gut sichtbar zu machen. In beiden Augen wurde eine nur geringe Reizung der Bindehaut durch das Vehikel beobachtet (n = 3). Demnach verursachte die direkte Verabreichung von etwa 20 μg Coelenterazin in dieser Lösung am Auge keine Reizung, Geschwürbildung oder andere Anzeichen einer Toxizität in diesem topischen Assay.
  • B. Intravenöse Verabreichung
  • In einem zweiten Experiment wird Mäusen das Coelenterazin (n = 6) in einer Konzentration von 1 mg/kg i. p. oder das Vehikel (n = 6) über einen Zeitraum von sieben Tagen verabreicht. Die Mäuse werden im Verlauf der Studie im Hinblick auf alle größeren Anzeichen einer Toxizität, wie sie sich aus ihrem Verhalten ergibt, untersucht.
  • Am Ende des einwöchigen Zeitraums wird Blut durch Herzpunktur unmittelbar vor dem Töten der Tiere gesammelt. Die Tiere werden getötet, und zehn verschiedene Gewebeproben werden post mortem von jedem Tier entnommen. Die isolierten Gewebe werden fixiert, gefärbt, blockiert und unterteilt. Der pathologische Zustand der Gewebeproben wird analysiert, und die toxikologischen Daten werden zusammengestellt. Die tägliche Verabreichung des Coelenterazins über drei Tage führte zu keinen größeren Verhaltensänderungen in den Testtieren.
  • C. Stabilität des Coelenterazins
  • Die Stabilität des Coelenterazins kann durch die Analyse biologischer Proben im Hinblick auf das Vorhandensein von Coelenterazin und davon abstammende metabolische Produkt ermittelt werden. In diesem Experiment wird das Blut gesammelt und das Serum aufbereitet, und dieses Serum kann auf Coelenterazin und seine Metaboliten untersucht werden. Wenig Störung durch das Serum (Maus) wurde bei der für das Coelenterazin notwendigen Emissionswellenlänge beobachtet.
  • Alternativ kann ein Leberlappen von jedem Tier herausgeschnitten werden und getrennt aufbewahrt, fixiert, in kaltem saurem Aceton homogenisiert und im Hinblick auf Coelenterazin und seine Metaboliten durch standardisierte biochemische Analysen untersucht werden.
  • D. Coelenterazin-Assays
  • Die Coelenterazin-Konzentration kann unter Verwendung seiner inhärenten Fluoreszenzeigenschaften bestimmt werden. Das Coelenterazin kann beispielsweise in einer alkoholischen Lösung durch Messung der Fluoreszenz bei einer spezifischen Wellenlänge gemessen werden. Bislang liegt die Nachweisgrenze bei weniger als 10 ng/ml. Unter Berücksichtigung der hier ins Auge gefassten Dosierungen sollte dieses Empfindlichkeitsniveau für die genaue Messung ausreichend sein.
  • Die Coelenterazin-Konzentration kann auch durch die Verwendung der HPLC in Kombination mit einem Fluoreszenznachweis bestimmt werden. Zusätzlich zu dem Nachweissystem auf HPLC-Basis können das Coelenterazin und seine Metaboliten durch Gaschromatographie-(GC) oder Massenspektrophotometrie-Analyse identifiziert werden. Die abschließende Bestätigung der Identität des Coelenterazins und seiner Metaboliten kann mit kernmagnetischer Resonanz (NMR) durchgeführt werden.
  • Verfahren zur Herstellung der Photoprotein-Konjugate:
  • Ein Verfahren für die Herstellung der Photoprotein-Konjugate, die die Biolumineszenaktivität behalten, ist beschrieben worden (siehe U.S.-Patent Nr. 5,486,455 ). Im Allgemeinen werden zusätzliche Sulfhydrylgruppen durch die Behandlung des Photoproteins mit Trauts-Reagens (2-Iminothiolan) in das Photoprotein eingebracht, um ein Sulfhydryl-aktiviertes Photoprotein zu erzeugen. Das Sulfhydryl-aktivierte Photoprotein wird an ein Sulfhydryl-reaktives Bindungsreagens konjugiert (z. B. ein Makromolekül, das chemisch mit einem heterobifunktionellen Linker modifiziert worden ist, der zur Sulfhydryl-Vernetzung imstande ist, wie Maleimido- oder Sulfo-SMCC, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidiomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat). Das konjugierte Photoprotein kann in Rohform verwendet werden, oder es kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie, weiter gereinigt werden.
  • BEISPIEL 2
  • Nagetiermodell
  • Ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein humanes Tumorantigen (z. b. Lewis-Antigen oder karzinoembryonales Antigen (CEA)) oder ein humanisiertes Derivat davon gerichtet ist, wird an ein Photoprotein, vorzugsweise Aequorin, oder die Vargula-Luciferase über das Sulfhydryl-Bindungsverfahren konjugiert (siehe U.S.-Patent Nr. 5,486,455 ), wonach das Konjugat gereinigt wird. Etwa 10–100 μg des Antikörper-Photoprotein-Konjugats werden i. v. in die Schwanzvene einer transgenen Maus, injiziert, die ein humanes Tumorantigen exprimiert. Die Injektion sollte von dem Tier gut toleriert werden.
  • Nachdem eine ausreichende Zeit für das Anbinden des Antikörpers gegeben wurde (2–48 h), wird etwa 1 μg Coelenterazin oder werden 10 μl Rohlysat, das die übrigen Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten enthält, i. p. direkt in den Bereich des vorgeschlagenen Neoplasmas injiziert. Alternativ werden 10 μl Lysat oder wird 1 μg Coelenterazin i. p. injiziert, wonach man dem Coelenterazin Zeit gibt, in die Zielregion zu zirkulieren (25 min bis 2 Tage).
  • Die Maus wird dann narkotisiert, und die Region, die das Neoplasma enthält, wird in einer Dunkelkammer exponiert. Regionen, die Lichtemittieren, was mit einem Photometer oder mit dem bloßen menschlichen Auge ermittelt wird, bilden das Ziel für das chirurgische Abtragen. Alternativ kann die interessierende Region durch das Einführen eines Laparoskops in der Nähe der Stelle des Neoplasmas und die nachfolgende Positionierung der bildgebenden Kamera in einer Position zur Beobachtung des Lichts sichtbar gemacht werden.
  • BEISPIEL 3
  • ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER DNA, DIE DAS Renilla mulleri-GFP CODIERT
  • 1. Herstellung einer R. mulleri-cDNA-Expressionsbank
  • Eine R. mulleri-cDNA-Expressionsbank wurde unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Lambda-UniZap-XR-Vektor-Kits (Stratagene) gemäß der bereitgestellten Gebrauchsanleitung hergestellt. Kurz gesagt wurden EcoRI- und XhoI-Adaptoren mit dem 5'-Ende der cDNA-Fragmente verbunden, und die verbundenen cDNA-Fragmente wurden von den verbleibenden nicht verbundenen Adaptoren gereinigt. Die gereinigten cDNAs wurden in EcoRI- und XhoI-verdauten λ-Uni-ZAP-XR-Vektor ligiert, in kompetente E. coli-XL-1-Blue-Zellen transformiert, und die resultierende DNA wurde unter Verwendung von λ-Phagen-Helferextrakten in Viruspartikel verpackt (Gigapak Plus Kit, Stratagene). Die verpackte lambda-Genbank wurde in E. coli-XL-1-Blue-Zellen titriert, und für die Sequenzkomplexität der Renilla mulleri-cDNA-Expressionsbank wurde berechnet, dass sie etwa 1,73 × 106 unabhängige Plaques betrug.
  • Durch das Herausschneiden der Initiator-Terminator-Kassette, die die klonierte Renilla-cDNA beherbergt, wurde eine Plasmidbank aus der lambda-cDNA-Expressionsbank abgeleitet. Etwa 2 × 108 unabhängige Plaque-Isolate wurden zusammengefasst und verwendet, um E. coli-SOLR-Zellen (Stratagene) zu infizieren, die dann mit einem filamentösen Helferphagen VCSM13, R408 oder ExAssist-Helferphagen (Stratagene) coinfiziert wurden. Die cDNA-haltigen Plasmide wurden durch Plattieren der infizierten Zellen auf festes Medium gewonnen, das mit 200 μg/ml Ampicillin für die Selektion der Zellen ergänzt war, die herausgeschnittenes pBK-Plasmid enthalten.
  • In E. coli-XL-1-Blue-Zellen erfolgt die Expression des Renilla mulleri-GFPs in dem pBK-Plasmid unter der Kontrolle des lacZ-Promotors, dessen Transkription durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactopyranosid (IPTG) zu dem Kulturmedium leicht ausgelöst werden kann, wobei das IPTG auch direkt in Sprayform oder in Form von anderen Aerosolen zu den Kolonien gegeben werden kann.
  • 2. cDNA-Bank-Durchmusterung
  • Für die Identifizierung der Klone, die ein Renilla-GFP exprimieren, wurde ein funktionelles Durchmusterungsverfahren verwendet, bei dem blaues Licht, z. B. 490 nm, eingesetzt wird, um fluoreszierende GFP-Transformanten, die ein Renilla-GFP exprimieren, zu identifizieren. Die Renilla-cDNA-Expressionsplasmidbank wurde durchgemustert, indem kompetente E. coli-XL-1-Blue-Zellen transformiert wurden und ein Teil des Transformationsgemischs auf L-Broth-Platten (LB-Platten) plattiert wurde, wobei das Medium mit 200 μg/ml Ampicillin ergänzt war, die Ruß enthielten, der zugegeben wurde, um die Hintergrundfluoreszenz (z. B. vom Agar) vollständig zu absorbieren. Die Platten wurden mit Licht mit einer geringen Bandbreite das um 490 nm zentriert war, beleuchtet und durch einen schmalbandigen 510 nm-Bandpassfilter unter Verwendung der Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, beobachtet (siehe z. B. Ward et al. (1978) J. Biol. Chem. 254: 781–788).
  • Etwa 3–4 × 106 einzelne Kolonien wurden durchgemustert, und etwa drei lichtemittierende Kolonien wurden identifiziert. Um zu bestätigen, dass der oben beschriebene Stamm ein Plasmid beherbergte, das ein GFP codiert, wurden die spektralen Eigenschaften des Plasmid-codierten Proteins unter Verwendung von Zelllysaten und teilweise gereinigten Zellextrakten (siehe z. B. BEISPIEL 4) untersucht. Das Fluoreszenzanregungsspektrum für teilweise gereinigtes rekombinantes Renilla mulleri-GFP war ähnlich denjenigen Spektren, über die für andere Renilla-Arten (Maximum nahe 498 nm) berichtet wurde; allerdings hat das Emissionsspektrum von rekombinantem R. mulleri-GFP ein Wellenlängenmaximum nahe 506 nm, was ein etwas kurzwelligeres Wellenlängenmaximum als beim in vitro- und in vivo-Emissionsspektrum ist, das für natürlich vorkommendes Renilla-GFP erhalten wird (z. B. 590 nm; siehe Wampler et al. (1973) Biochem. Biophys. Acta 314: 104–109).
  • 3. Bestimmung und Charakterisierung der Nucleotidsequenz der DNA, die das Renilla mulleri-GFP codiert
  • Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen eines fluoreszierenden Transformanten gereinigt, und die Nucleotidsequenz der Renilla-cDNA-Plasmidinsertion wurde unter Verwendung der Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, ermittelt (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sanger et al. () Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.).
  • Die Nucleotidsequenz einer cDNA, die ein Renilla mulleri-GFP voller Länge codiert, ist in SEQ ID NO: 15 offenbart. Das cDNA-Fragment, das das Renilla mulleri-GFP codiert, hat eine Länge von 1079 nt, eingeschlossen eine 5'-nicht codierende Sequenz von 258 nt, ein offener Leserahmen von 714 nm, der ein Polypeptid aus 238 Aminosäuren codiert, und eine 3'-nicht codierende Sequenz von 107 nt.
  • Die Nucleotidsequenz der cDNA, die das Renilla-GFP codiert, wurde mit der Nucleotidsequenz des A. victoria-GFPs verglichen, dem einzigen sonstigen GFP, dessen vollständige Nucleotidsequenz bekannt ist (siehe z. B. SEQ ID NO: 1). Die Nucleinsäuren, die von den beiden Organismen isoliert wurden, codieren Proteine von identischer Länge, die Nucleotidsequenz, die die 136 Amino-terminalen Aminosäurereste des Renilla mulleri-GFPs codiert, ist jedoch nur zu 48,8% identisch, verglichen mit A. victoria. Weiterhin weicht die Nucleotidsequenz, die die 102 Carboxy-terminalen Aminosäurereste des Renilla mulleri-GFPs codiert, noch stärker ab, die nur zu 31,4% identisch ist.
  • Ein Vergleich der hergeleiteten Aminosäuresequenzen des Renilla mulleri-GFPs und des A. victoria-GFPs ergab, dass die Proteinsequenzen ebenfalls hochgradig voneinander abweichend sind. Nur 56 von 238 Aminosäureresten sind zwischen den hergeleiteten Aminosäuresequenzen identisch (d. h. 23,5% direkte Aminosäureidentität). Weiterhin ist die hergeleitete Sequenz des vermuteten Hexapeptid-Chromophors in R. mulleri (FQYGNR) ziemlich verschieden von dem Chromophor von A. victoria (FSYGVQ), zwischen denen nur 3 von 6 Aminosäureresten identisch sind. Der R. mulleri-Chromophor ist auch an einer etwas anderen Stelle in der Polypeptidkette lokalisiert, verglichen mit dem A. victoria-GFP. Der R. mulleri-Chromophor wird durch die Aminosäurereste 68–73 codiert, während der A. victoria-Chromophor durch die Aminosäurereste 64–69 codiert wird. Die etwas verschiedene Positionen und die veränderten Chromophorsequenzen tragen wahrscheinlich zu den unterschiedlichen spektralen Eigenschaften bei, die die beiden Proteine zeigten.
  • BEISPIEL 4
  • Identifizierung und Isolierung DER DNA, die eine Renilla mulleri-LUCIFERASE codiert
  • Die R. mulleri-cDNA-Plasmidbank, die in BEISPIEL 3 beschrieben wird, wurde in E. coli-XL-1-Blue-Zellen transformiert, und einzelne Kolonien wurden erhalten, indem ein Teil des Transformationsge mischs auf L-Broth-Platten plattiert wurde, die mit 200 μg/ml Ampicillin ergänzt waren und die auch mit Ruß für die Absorption der Hintergrundfluoreszenz ergänzt waren. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Ampicillin-resistenten Transformanten wurden mit 1 mM IPTG-Lösung besprüht, um die Luciferase-Expression auszulösen. Nachdem den Zellen Zeit gelassen wurde, die Luciferase zu exprimieren, wurde die Oberfläche der Platten mit einer Lösung besprüht, die 20 mM Coelenterazin enthielt, und die Kolonien, die blaues Licht emittierten, wurden unter Verwendung eines blauen Bandbreitefilters sichtbar gemacht. Die Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen der biolumineszierenden Transformanten isoliert, und die Nucleotidsequenz einer cDNA-Insertion eines positiven Klons wurde ermittelt. Die Nucleotidsequenz der DNA, die eine Renilla mulleri-Luciferase voller Länge codiert, und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz werden in SEQ ID NO: 17 offenbart. Das cDNA-Fragment, das die Renilla mulleri-Luciferase codiert, hat eine Länge von 1217 nt eingeschlossen eine 5'-nicht codierende Region von 30 nt, ein offener Leserahmen von 933 nt, der ein Polypeptid aus 311 Aminosäuren codiert, und eine 3'-nicht codierende Sequenz von 254 nt.
  • BEISPIEL 5
  • REKOMBINANTE ERZEUGUNG VON Renilla-LUCIFERASE
  • 1. Rekombinante Erzeugung von Renilla reniformis-Luciferase
  • Das Phagemid pTZ18R (Pharmacia) ist ein Vielzweck-DNA-Vektor, der für in vitro-Trankriptionen entwickelt wurde und der für die Expression von rekombinanten Proteinen in bakteriellen Wirten brauchbar ist. Der Vektor enthält das bla-Gen, das die Selektion der Transformanten über die Ampicillinresistenz ermöglicht, und eine Polylinker-Stelle benachbart zu dem lacZ'-Gen. Das interessierende heterologe Gen wird in den Polylinker insertiert und vom lac-Promotor durch die Induktion beispielweise mit Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) transkribiert.
  • Die DNA, die die Renilla reniformis-Luciferase codiert, ist kloniert worden (siehe z. B. die U.S.-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155 ). Das Plasmid pTZRLuc-1 codiert die Renilla-Luciferase auf einem 2,2 Kbp EcoRI-bis-Sst1-DNA-Fragment, das in die EcoRI- und Sst1-Stellen von pTZ18R insertiert wird (die Plasmidkonstruktion wird in den U.S.-Patenten Nr. 5,292,658 und 5,418,155 beschrieben, siehe auch Lorenz et al. (1991) Isolation and Expression of cDNA encoding Renilla reniformis Luciferase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 4438–4442). Die Initiierung der Transkription der Renilla-Luciferase-cDNA erfolgt unter der Kontrolle durch den lacZ'-Promotor. E. coli-Stämme, die das Plasmid pTZRLuc-1 beherbergen, exprimieren eine Renilla-Luciferase, die in Biolumineszenz-Assays funktionsfähig ist und weiterhin die Eigenschaften das nativen Enzyms hat (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155 ).
  • Ein Derivat von pTZRLuc-1, pTZRLuc-3.6, erzeugt etwa 7-fach höhere Konzentrationen der rekombinanten Renilla-Luciferase als pTZR-Luc-1, wenn es in den gleichen E. coli-Wirt transformiert wird. Der kompetente E. coli-Stamm XL-1 wurde unter Verwendung von gereinigtem pTZRLuc-3.6 gemäß der Gebrauchsanleitung, die vom Hersteller geliefert wird, gereinigt (XL-1 Supercompetent cells and protocol; Stratagene, Inc:, La Jolla, CA). Die Transfektanten wurden durch die Plattierung auf Luria-Both-Platten (LB), die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt waren, selektiert.
  • Einzelne Ampicillin-resistente Kolonien wurden in LB-Medium, das mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt war, bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines kontinuierlichen Schüttelns gezüchtet, bis das Zellwachstum die mid-log-Phase erreicht hatte (d. h. die Zellkultur erreicht eine O.D.500nm = 0,6–0,8 Einheiten). Die Transkription vom lac-Promotor wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG ausgelöst, und die Zellkultur wurde bei Umgebungstemperatur zusätzliche 8 Stunden geschüttelt.
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 10000 × g geerntet und bei –20°C eingefroren. Das Zellpellet wurde aufgetaut und erneut in einer 1:5-Verhältnis (G/G) in einer Lösung von 10 mM EDTA, pH 8,0, die 4 mg/ml Lysozym enthielt (Sigma Chemical Corp.), suspendiert. Die Zellen wurden 30 min in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 25°C gehalten und dann über 1 Stunde in Eis gelagert. Die Zellen wurden mit Ultraschall bei 0°C unter Verwendung eines einmütigen Pulses von einem Ultrasonics, Inc. Zellzerkleiner lysiert.
  • Die lysierten Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren bei 30000 × g über 3 h entfernt, und der Überstand wurde dekantiert und behalten. Das Pellet wurde erneut in einem 1:5-Verhältnis in den oben beschriebenen Lösungen suspendiert, und die nachfolgenden Inkubationen, Lyse- und Zentrifugierschritte wurden wiederholt. Die beiden Überstände wurden kombiniert und bei –70°C gelagert. Das resultierende "geklärte Lysat" wurde als eine Quelle für rekombinante Luciferase eingesetzt. Alternativ kann das Lysat zusätzlichen Reinigungsschritten unterzogen werden (z. B. Ionenaustauschchromatographie oder Immunaffinitätschromatographie), um das Lysat weiter anzureichern oder um eine homogene Quelle für das gereinigte Enzym bereitzustellen (siehe z. B. U.S.-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155 ).
  • Alternativ kann die rekombinante Renilla mulleri-Luciferase durch die Substitution der DNA, die die R. reniformis-Luciferase codiert, durch die DNA, die eine R. mulleri-Luciferase codiert, wie die DNA, die die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 18 offenbart wird, exprimiert werden.
  • BEISPIEL 6
  • NACHWEIS VON KREBSZELLEN
  • Das Biolumineszenz-Nachweisverfahren auf Luciferase-Basis findet breite Anwendung bei der Sichtbarmachung und der genauen Lokalisierung von Krebszellen. In derartigen Anwendungen kann das Renilla-GFP, die Renilla mulleri-Luciferase oder das Luciferin-Molekül an ein Ansteuerungsmittel konjugiert werden, wie einen Antitumorantigen-Antikörper, der spezifisch bestimmte Krebszellen erkennt, die das Antigen exprimieren. Alternativ ist die Luciferase an einen Mikroträger gekoppelt, und das Ansteuerungsmittel ist an die Luciferase und/oder den Mikroträger konjugiert. Das Konjugat wird in ein Subjekt eingebracht, zum Beispiel durch intravenöse, intraperitoneale oder subkutane Injektion oder durch die topische Anwendung oder die direkte Anwendung während einer Operation unter Verwendung eines Laparoskops oder eine Kanüle (Trokar). Durch die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes wird die Luciferase oder das Luciferin mit den Zielkrebszellen verbunden und steht dann für die Wechselwirkung mit dem Luciferin-Substrat (falls das Konjugat eine Luciferase enthält) oder dem Luciferase-Enzym (falls das Konjugat das Luciferin enthält) zur Verfügung. Demnach wird das Substrat oder das Enzym dann in das Subjekt eingebracht, z. B. durch die Injektion oder das Auftragen, und man lässt es mit dem Partnermolekül reagieren, das in dem Antikörperkonjugat enthalten ist, wodurch die einfach nachweisbare Lichtemission nur in den genauen Gebieten erhalten wird, wo das Konjugat stabil als Antikörper-Antigen-Komplex vorhanden ist.
  • Die Empfindlichkeit und Biokompatibilität dieses Biolumineszenz-Nachweissystems ermöglicht es, Krebs in seinen frühen Stadien zu entdecken, zum Beispiel kleine Anzahlen an Krebszellen, im Gegensatz zu anderen weniger empfindlichen Verfahren, die imstande sind, Krebszellen erst dann nachzuweisen, wenn sich das Neoplasma in ein weiter vorgeschrittenes und potentiell lebensbedrohliches Stadium entwickelt hat. Zusätzlich können die hier offenbarten diagnostischen Verfahren in Abwesenheit von invasiven chirurgischen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können auch chirurgische Beobachtungsgeräte, Computertomogramme oder chirurgische Beobachtungsgeräte in Miniaturform, siehe weiter oben, die so modifiziert worden sind, dass sie geringe Intensitätsniveaus an sichtbarem roten Licht und nahem Infrarot-Licht nachweisen, das durch die Gewebe des Patienten emittiert wird, ebenfalls verwendet werden, um den Chirurgen zu unterstützen, wie diejenigen, die in der gleichzeitig anhängigen, dem gleichen Inhaber gehörenden U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/990,103 beschrieben werden.
  • Das Biolumineszenz-Nachweissystem ist vor allem in chirurgischen Verfahren anwendbar, in denen kanzeröse Läsionen entfernt werden. Das gezielte Ausrichten eines Renilla-GFPs, einer Renilla mulleri-Luciferase und/oder von Luciferin z. B. auf einen Tumor führt zur genauen Darstellung der Grenzen der Läsion und erleichtert so ein exakteres Herausschneiden und die vollständige Eradikation des Krebses ohne das Entfernen von umgebendem gesundem Gewebe. Dies ist von kritischer Wichtigkeit beim Herausschneiden von kanzerösen Läsionen in komplexen, vitalen Geweben, wie Nervengewebe. Die Empfindlichkeit des Biolumineszenz-erzeugenden Systems macht es auch gut geeignet für die Untersuchungen nach der Operation und die Identifizierung von Metastasen, bei der die Fähigkeit zum Nachweis einer kleinen Zahl von verbleibenden Krebszellen eine akkurate re Beurteilung der Effektivität des Verfahrens bei der Eradikation des Krebses ermöglicht.
  • Das Biolumineszenz-erzeugende System findet weiterhin Anwendung bei der Überwachung des Fortschreitens und der Ausbreitung von Krebs. Derartige Informationen sind von unschätzbarem Wert bei der Beurteilung der Effektivität von Therapien, wie einer Chemotherapie und einer Strahlentherapie, sowie der Effizienz von Therapien auf Arzneimittelbasis zur Behandlung von Krebspatienten.
  • Nachweis von Gebärmutterhalskrebs
  • Ein Biolumineszenz-Nachweissystem auf Luciferase-Basis kann beim Nachweis von Gebärmutterhalskrebs verwendet werden. Luciferin oder Luciferase kann beispielsweise direkt oder über einen Linker oder einen Mikroträger an Antikörper konjugiert werden, die spezifisch für Zellantigene von Gebärmutterhalskrebs sind (siehe z. B. Tabelle 3). Das Konjugat wird dann direkt in einer geeigneten Formulierung auf das Gebärmutterhalsgewebe aufgetragen, das dann abgewaschen wird, um nicht gebundenes Konjugat zu entfernen. Die übrigen Komponenten der Biolumineszenzreaktion, d. h. Luciferin, falls das Konjugat Luciferase enthält, oder Luciferase, falls das Konjugat Luciferin enthält, wird dann zusammen mit allen erforderlichen Aktivatoren auf das Gebärmutterhalsgewebe aufgetragen, wo man sie mit dem gebundenen Konjugat in Wechselwirkung treten lässt. Die Lichtemission wird dann beobachtet. Das emittierte Licht kann eine beliebige sichtbare, mit dem menschlichen Auge wahrnehmbare Wellenlänge haben. Wenn Krebszellen, die das erkannte Antigen präsentieren, in dem Gewebe vorhanden sind, leuchten diese Zellen und werden dadurch sichtbar gemacht. Die Biolumineszenz dient einer genaueren Lokalisierung des Krebses, die den Chirurgen beim Entfernen der kanzerösen Läsion leitet.
  • Nachweis des Karzinoembryonalen Antigens (CEA)
  • Ein Biolumineszenz-Nachweissystem kann auch für den Nachweis von neoplastischen Zellen verwendet werden, die CEA präsentieren, wie z. B. die kanzeröse Zellen, die in kolorektalen Krebsformen vorhanden sind (siehe z. B. Tabelle 3). In dieser Anwendung wird die Luciferase oder das Luciferin direkt oder indirekt an einen Antikörper konjugiert, der für CEA spezifisch ist, und der Nachweis erfolgt wie weiter oben für den Nachweis von Gebärmutterhalskrebs beschrieben wurde. Die Wanderung von CEA-tragenden Krebszellen, zum Beispiel in die Wand des Dickdarms und weiter in die Lymphbahnen, kann mit diesem Nachweissystem ebenfalls beobachtet werden. Das modifizierte Laparoskop, das sichtbares Licht von geringer Intensität nachweist, kann weiterhin eingesetzt werden, um den Nachweis und das Sichtbarmachen der CEA-tragenden Krebszellen zu verstärken.
  • Nachweis von Harnblasenkrebs
  • Für den Nachweis von Harnblasenkrebs wird die Luciferase oder das Luciferin an ein Ansteuerungsmittel konjugiert, z. B. einen Antikörper, der Antigene erkennt, die auf Blasenkrebszellen präsentiert werden, der dazu dient, das Konjugat an die kanzerösen Läsionen zu binden. Das Konjugat wird in die Blase eingebracht, zum Beispiel durch einen Katheter, und die Läsionen werden beim nachfolgenden Einbringen der übrigen Komponenten der Biolumineszenzreaktion in die Blase sichtbar gemacht. Diese Technik ist besonders nützlich für Formen des Harnblasenkrebses, die derzeit operativ durch transurethrales Verbrennen des Tumors, der in der Blasenwand lokalisiert ist, unter Verwendung einer Elektrokauterisierung entfernt werden. Diese Technik minimiert die Verbrennung von gesundem Blasenge webe, identifiziert mögliche Gebiete von Metastasen und gewährleistet die vollständige chirurgische Entfernung des Zieles.
  • Der Ort und die Ränder von neoplastischem Blasengewebe können mit größerer Genauigkeit definiert werden, indem das Vorhandensein des Tumors mit dem Ansteuerungsmittel, das an die Luciferase-gebundenen Mikropartikel gekoppelt ist, nachgewiesen wird. Nach der Verabreichung des Ansteuerungsmittel-Konjugats wird die Biolumineszenzreaktion gestartet (d. h. durch die Zugabe eines Luciferins und/oder aller Aktivatoren). Ein zweiter GFP-gebundener Mikropartikel wird kovalent an ein Ansteuerungsmittel gebunden, das gegen benachbartes umgebendes Gewebe gerichtet ist oder das vorzugsweise auf identisches, nicht tumoröses Gewebe abzielt. Das GFP-Konjugat wird dem Patienten verabreicht. Folglich leuchtet das neoplastische Gewebe beispielsweise unter Emission von blauem Licht, z. B. bei Verwendung von Aequorin oder eines Renilla-Luciferase-Ansteuerungsmittel-Konjugats, während das GFP-gebundene umgebende Gewebe das blaue Licht absorbieren wurde und grünes Licht emittieren würde, wodurch für einen zusätzlichen Kontrast für die eindeutige Festlegung der Ränder des Gewebes, das chirurgisch entfernt werden soll, gesorgt wird.
  • Nachweis der Verbreitung von Wandernden Krebszellen
  • Die Infiltration des lymphatischen Systems durch wandernde Krebszellen, wie von Hautmelanomen, tiefen Brusttumoren und Lebermetastasen, die ihren Ursprung in Darmkrebs haben, können einfach unter Verwendung des Biolumineszenz-Nachweissystems nachgewiesen werden. Die Luciferase oder das Luciferin, die/das an ein Ansteuerungsmittel konjugiert ist, wie einen Antikörper, der ein Krebszellenantigen erkennt, komplexiert spezifisch mit den Zellen, unabhängig davon, wo sie sich im Wanderungsprozess befinden. Die übri gen Biolumineszenz-erzeugenden Komponenten lässt man durch den Körper zirkulieren, wo sie nur mit den Zellen in Wechselwirkung treten, an die das Konjugat gebunden ist. In Fällen, in denen die Krebszellen in die Epithelgewebe auf der Hautoberfläche oder in der Nähe der Hautoberfläche eingedrungen sind, kann das Konjugat und/oder das Partnermolekül topisch angewendet werden, und die resultierende Lichtemission kann einfach mit dem bloßen menschlichen Auge ohne invasive Verfahren nachgewiesen werden. Zusätzlich kann auch ein Photomultiplier oder können chirurgische Beobachtungsinstrumente verwendet werden, um die durch die Haut abgegebene Lichtmenge zu verstärken. In dieser Weise kann es möglich sein, die lymphatische Wanderung von Tumorzellen zu verfolgen, bevor eine Operation versucht wird.
  • Nachweis von Brustkrebs
  • Die Nutzen eines frühen Nachweises von Brustkrebs, z. B. erhöhte Überlebensrate und mehr Optionen für die Behandlung, sind zahlreich und gut dokumentiert. Das Biolumineszenz-Nachweissystem bietet ein empfindliches Verfahren, durch das die frühe Diagnose der verschiedenen Formen von Brustkrebs erleichtert wird. In derartigen Anwendungen kann die Luciferase oder das Luciferin beispielsweise an Anti-Östrogen- oder Anti-Progesteron-Rezeptor-Antikörper konjugiert werden, die auf Moleküle abzielen, die in Brustkrebsgewebe in einer deutlich erhöhten Anzahl vorkommen, verglichen mit normalem Brustgewebe. In diesem im Wesentlichen quantitativen Assaysystem hängt die Diagnose von der Stärke der nachgewiesen Lumineszenz, beispielsweise in einem durch Biopsie erhaltenen Brustgewebe, ab. Die Stärke der Lumineszenz kann unter Verwendung eines Photometers, eines Photomultipliers oder anderer geeigneter Einrichtungen quantifiziert werden.
  • Alternativ kann das Ansteuerungsmittel direkt oder indirekt an die Luciferase gekoppelt werden, die aus Aristostomias, Malacosteus oder Pachystomias isoliert wurde, die rotes Licht emittiert (siehe z. B. Widder et al. (1984) Science 225: 512–514). Besonders bevorzugt sind die Biolumineszenz-Komponenten, die aus den Arten Aristostomias scintillans und Malacosteus niger isoliert werden. In dieser Anwendung wird das Luciferase-haltige Ansteuerungsmittel dem Patienten verabreicht, gefolgt von den übrigen Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems (z. B. ein Luciferin und/oder Aktivatoren). Die Lichtemissionen bei dieser Wellenlänge werden direkt durch das Gewebe ohne ein invasives chirurgisches Verfahren unter Verwendung eines Photomultipliers, eines Computertomographen oder unter Verwendung eines chirurgischen Beobachtungsgeräts, das hochempfindlich für rotes Licht ist, nachgewiesen. Alternativ kann ein chirurgisches Beobachtungsgerät verwendet werden, in dem die optische Detektoreinrichtung einen CCD-Bildgeber oder einen Bildverstärker enthält, der für rote Lichtemissionen besonders empfindlich ist.
  • BEISPIEL 7
  • VERSTÄRKUNG DER FLUORESZENZEMISSIONEN UNTER VERWENDUNG VON RENILLA-GFP
  • In Gegenwart von Renilla-GFP wird die Quantenausbeute der Biolumineszenz der Renilla-Luciferase-Coelenterazin-Reaktion von 6,9% auf 13% erhöht, eine Verstärkung um nahezu den Faktor 2. Derivate von Coelenterazin, in denen eine oder mehrere Gruppen der Coelenterazin-Struktur ersetzt worden sind, sind bekannt (siehe z. B. Hart et al. (1979) Biochemistry 18: 2004). Von besonderem Interesse ist hier das Coelenterazin der Formel (V), das weiter oben diskutiert wird:
    Figure 02230001
  • Wie erwähnt wird durch die Reaktion dieser Verbindung in Gegenwart von Renilla-Luciferase Ultraviolettlicht, λ-Maximum bei 390 nm, erzeugt, und die Quantenausbeute der Biolumineszenz ist relativ niedrig (etwa 0,012%). Bei der Zugabe von GFP emittiert der Renilla-Luciferase/GFP-Komplex jedoch grünes Licht, und die Quantenausbeute der Biolumineszenz-Reaktion wird auf 2,3% erhöht. Die Zugabe des GFPs führt daher zu einer ca. 200-fachen Erhöhung der durch die Renilla-Luciferase emittierten Lichtmenge. Weiterhin können durch die Verwendung eines Bandpassfilters mit einer Ausschlussgrenze von weniger als 470 nm nur diejenigen Lichtwellenlängen oberhalb von 470 nm beobachtet werden. Unter diesen Bedingungen hängt die Sichtbarmachung der Lichtemissionen direkt von der Gegenwart eines GFPs ab, durch das die blauen Lichtphotonen zu Photonen mit einer Wellenlänge oberhalb von 470 nm verschoben werden (z. B. grünes Licht mit λ = 510 nm).
  • Die Verwendung eines Renilla-GFPs in Kombination mit einer Luciferase, die blaues Licht emittiert, und dieses Coelenterazin-Derivats und des Bandpassfilters erlaubt die Entwicklung von Immunoassays, in denen eine nachweisbares Lichterzeugung vom Vorhandensein eines GFPs abhängt. Eine Anzahl an Konfigurationen für derartige Immunoassays ist möglich, und ein beispielhafter Immunoassay für eine Anwendung, in der die Reaktion auf einem festen Träger durchge führt wird, wie ein Mikrotiterarray-Format, sieht folgendermaßen aus:
    Figure 02240001
  • Wenn hier verwendet, wird eine Testprobe, von der vermutet wird, dass sie das oder die Zielantigene enthält, zu einer Mikrotiterplatte gegeben, die eine Vielzahl von Antikörpern enthält, die spezifisch für das oder die anvisierten Antigene ist, die einzeln in den Vertiefungen befestigt werden. Nach der Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes wird ein Antikörper-Konjugat, das einen zweiten Antikörper, der spezifisch für das Antigen ist, oder ein F(Ab)2-Fragment davon enthält, das mit einem Renilla-GFP verknüpft ist, wie denjenigen, die hier beschrieben werden, zugegeben. Der spezifisch gebundene zweite Antikörper wird durch die Zugabe einer Luciferase, vorzugsweise einer Renilla reniformis- oder Renilla mulleri-Luciferase, und der Verbindung der Formel (V) nachgewiesen, und die Lichterzeugung wird unter Verwendung eines 470 nm-Bandpassfilters beobachtet. Die Lichtintensität sollte ein Maß für die Menge an vorhandenem GFP-Ab2 sein, die wiederum ein Maß für die Menge an Antigen ist, die an AB1 gebunden ist.
  • Bei Verwendung dieses Systems wird das Vorhandensein des Antigens in der Probe durch den Nachweis des Lichts für die einzelnen Vertiefungen, für die der Antikörper spezifisch ist, bestätigt. Wenn man die Spezifität des Antikörpers kennt, kann das spezifische Antigen, das in der Probe vorhanden ist, identifiziert werden. Es sollte demnach möglich sein, Immunoassays durchzuführen, die vor der Luciferin/Luciferase keinen aus einem Waschen bestehenden Zwischenschritt Zugabe benötigen.
  • BEISPIEL 8
  • IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG VON DNA, DIE EINE Gaussia mulleri-LUCIFERASE CODIERT
  • 1. Herstellung einer Gaussia-DNA-Expressionsbank
  • Eine Gaussia-cDNA-Expressionsbank wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen Lambda-UniZap-XR-Vektor-Kits (Stratagene) gemäß der bereitgestellten Gebrauchsanleitung hergestellt. Kurz gesagt wurden EcoRI- und XhoI-Adaptoren mit dem 5'-Ende der cDNA-Fragmente verknüpft und die verknüpften cDNA-Fragmente wurden von den verbleibenden nicht verknüpften Adaptoren gereinigt. Die gereinigten cDNAs wurden in EcoRI- und XhoI-verdauten λ-Uni-ZAP-XR-Vektor ligiert, in kompetente E. coli-CL-1-Blue-Zellen transformiert, und die resultierende DNA wurde unter Verwendung von λ-Phagen-Helferextrakten (Gigapak Plus Kit, Stratagene) in Viruspartikel verpackt. Die verpackte Lambda-Bank wurde in E. coli-XL-1-Blue-Zellen titriert, und die Sequenzkomplexität der cDNA-Expressionsbücherei wurde berechnet.
  • Eine Plasmidbank wurde durch das Herausschneiden der Initiator-Terminator-Kassette, die die klonierte Gaussia-Luciferase-codierende DNA beherbergt, von der Lambda-cDNA-Expressionsbank abgeleitet. Etwa 2 × 108 unabhängige Plaque-Isolate wurden gesammelt und für die Infektion von E. coli-SOLR-Zellen (Stratagene) verwendet, die dann mit einem filamentösen Helferphagen VCSM13, R408 oder ExAssist-Helpherhagen (Stratagene) coinfiziert wurden. Die cDNA-haltigen Plasmide wurden durch die Plattierung der infizierten Zellen auf festem Medium gewonnen, das für die Selektion der Zellen, die herausgeschnittenes pBK-Plasmid enthalten, mit 200 μg/ml Ampillicin ergänzt war.
  • In E. coli-XL-1-Blue-Zellen erfolgt die Expression der DNA, die die Luciferase in dem pBK-Plasmid codiert, unter der Kontrolle des lacZ-Promotors, dessen Transkription leicht durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactopyranosid (IPTG) zu dem Kulturmedium induziert wird oder das den Kolonien direkt in Sprayform oder in Form von anderen Aerosolen zugeführt werden kann.
  • 2. Durchmusterung der cDNA-Bank
  • Für die Identifizierung der Klone, die eine Gaussia-Luciferase exprimieren, wurde ein funktionelles Durchmusterungsverfahren verwendet. Die cDNA-Plasmidbank, die in E. coli-XL-1 Blue-Zellen transformiert wurde, und einzelne Kolonien wurden durch die Plattierung eines Teils des Transformationsgemischs auf L-Broth-Platten erhalten, die mit 200 μg/ml Ampicillin und außerdem mit Ruß ergänzt waren, der die Hintergrundfluoreszenz absorbiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Ampicillin-Resistenz-Transformanten wurden mit einer 1 mM-IPTG-Lösung besprüht, um die Expression der Luciferase zu induzieren. Nachdem den Zellen Zeit gelassen worden war, die Luciferase zu exprimieren, wurde die Oberfläche der Platten mit einer Lösung besprüht, die 20 mM Coelenterazin enthielt, und die Kolonien, die blaues Licht emittieren, wurden unter Verwendung eines blauen Bandbreitefilters sichtbar gemacht.
  • Die Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen der biolumineszierenden Transformanten isoliert, und die Nucleotidsequenz einer cDNA-Insertionen eines positiven Klons wurde ermittelt. Die Nucleotidsesquenz der DNA, die eine Gaussia-Luciferase voller Länge codiert, und die Aminosäuresequenz werden in SEQ ID NO: 19 und 20 offenbart. Das cDNA-Fragment, das die Gaussia-Luciferase codiert, hat eine Länge von 765 nt, eingeschlossen die 5'-nicht-codierende Region, ein offener Leserahmen von 455 nt, der ein Polypeptid aus 185 Aminosäuren codiert, und die 3'-nicht codierende Sequenz.
  • BEISPIEL 9
  • KLONIERUNG ZUSÄTZLICHER LUCIFERASE- UND GFP-PROTEINE
  • Unter Verwendung der in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verfahren wurden eine Nucleinsäure erhalten, die ein GFP einer Ptilosarcus-Art (eine Seefeder, die aus der Cortez-See erhalten wurde) und eine Luciferase einer Pleurmamma-Art (ein Copepod) codiert. Die Sequenzen werden in SEQ ID NO: 28–32 offenbart. Die Pleuromamma-Luciferase wurde aus einer gemischten Copepod-Genbank von Gaussia- und Pleuromamma ("Riesen"-Calenoidcopepoden, ~6 mm bzw. 3 mm) kloniert. Die Pleuromamma-Luciferase wurde durch ihre grünere in vivo-Emission identifiziert.
  • Die Emissionsspektren und pH- und Salzkurven der codierten Proteine werden in den 4–6 und 8–10 bereitgestellt.
  • BEISPIEL 10
  • Gaussia-, Renilla mulleri- und Pleuromamma-Luciferase und Renilla mulleri- und Ptilosarcus-GFP sind kloniert worden. Verschiedene Nucleinsäurekonstrukte und Plasmide, die eine Nucleinsäure enthalten, die diese Proteine codiert, sind hergestellt worden und sind für die Expression der codierten Proteine für die Verwendung in Diagnostika, in analytischen Verfahren und in Novitäten, wie sie hier beschrieben wurden, verwendet worden.
  • Konstrukte
  • A. Renilla mulleri-Luciferase und GFP-codierende Konstrukte und Plasmide
  • Das Wirtsplasmid ist ein pBluescript SK(–)-Phagemid (Stratagene). Das gezeigte Konstrukt ist ein Konstrukt, das durch die funktionelle Durchmusterung einer großen Population von Phagemiden isoliert wurde, die von einer Massenexcision einer amplifizierten Lambda-Zap-cDNA-Bank (Strategene) stammen. Alle hier beschriebenen klonierten Biolumineszenz-Gene wurden in einem ähnlichen Phagemid als eine Insertion zwischen der EcoRI-Stelle und der XhoI-Stelle der multiplen Klonierungsstelle (MCS) isoliert. Jede Insertion schließt DNA ein, die die gesamte codierende Region (CDS) des funktionellen Proteins sowie eine variable Zahl von Nucleotiden 5' und 3' der codierenden Region umfasst. Zusätzlich zu den Aminosäuren des nativen Proteins können die Polypeptide, die in den funktional durchgemusterten Isolaten exprimiert werden (hier die lacZ-Renilla mulleri-Luciferase-cDNA-Fusions-CDS oder die lacZ-Renilla mulleri-GFP-cDNA-Fusions-CDS), zusätzliche N-terminale Reste enthalten.
  • 1) Renilla mulleri-Luciferase in pBluescript SK-(r) (4147 bp)
  • Eine lacZ-Renilla mulleri-Luciferase-CDS-Fusion (CDS = codierende Domänensequenz) wurde in das pBluescript SK-(r) (Stratagene) kloniert. Dieser wohlbekannte, im Handel erhältliche Vektor enthält unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Ampicillin), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), T3-Primersequenz, T3-20-mer-Sequenz, NIH-Oligo-0495-Sequenz, T3-Promotor, SK-Primersequenz, T7-Promotor, KS-Primersequenz, T7-Primersequenz, T7-22-mer-Sequenz, NIH-oligo-0436-Sequenz, Phagen-Plasmid-PCR1-Se quenz, Phagen-Plasmid-PCR2-Sequenz, Phagen-Plasmid-PCR2(b)-Sequenz und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen. Die Expression des lacZ-Renilla mullieri-Luciferase-Fusionsproteins erfolgt unter der Kontrolle des lacZ-Promotors.
  • 2) Renilla mulleri-Luciferase in pBluescript SK (4147 bp)
  • Eine lacZ-Renilla mulleqri-Luciferase-CDS-Fusion (CDS = codierende Domänensequenz) wurde in das pBluescript SK-(r) (Stratagene) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Ampicillin), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), T3-Primersequenz, T3-Promotor, SK-Primersequenz, T7-Promotor, KS-Primersequenz, T7-Primersequenz und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des lacZ-Renilla mullieri-Luciferase-Fusionsproteins erfolgt unter der Kontrolle des lacZ-Promotors.
  • B. Plasmide für die Expression von nativem Renilla mulleri-GFP und nativer Renilla mulleri-Luciferase in Säugetierzellen
  • Die Renilla mulleri-GFP- oder Renilla mulleri-Luciferase-codierende Region wurde durch die Nucleinsäureamplifikation (PCR) amplifiziert, wobei eine EcoRI-Stelle und eine XhoI-Stelle unmittelbar 5' und 3' zur codierenden Sequenz beigefügt wird. Das PCR-Produkt wurde zwischen den EcoRI-XhoI-Stellen in den Polylinker von pcDNA3.1(+) (Invitrogen) insertiert und in Bakterien (z. B. XLI-Blue-Stamm, Stratagene) für den Zweck der Erzeugung großer Mengen von Plasmid-DNA transformiert. Diese Plasmide enthalten den CMV-Promotor (Pcmv), um die Expression in Säugetierzellen anzutreiben.
  • 1) Renilla mulleri-GFP in pcDNA3.1(+) (6122 bp)
  • Eine Renilla mulleri-GFP-CDS wurde in das pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Amp), einen Säugetier-selektierbaren Marker (Neo), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), einen viralen Replikationsursprung (SV40-Ursprung) und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des Renilla mulleri-GFPs erfolgt unter der Kontrolle des CMV-Promotors.
  • 2) Renilla mulleri-Luciferase in pcDNA3.1(+) (6341 bp)
  • Eine Renilla mulleri-Luciferase-CDS wurde in das pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Amp), einen Säugetier-selektierbaren Marker (Neo), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), einen viralen Replikationsursprung (SV40-Ursprung) und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der Renilla-mulleri-Luciferase erfolgt unter der Kontrolle durch den CMV-Promotor.
  • 4. Plasmide, die für die Expression von nativem Renilla mulleri-GFP und von Renilla mulleri-Luciferase in Hefezellen verwendet werden.
  • Das Renilla mulleri-GFP oder die Renilla mulleri-Luciferase wurde PCR-amplifiziert und zwischen den Polylinker-EcoRI-XhoI-Stellen von pYES2 (Invitrogen) insertiert. Diese Plasmide sind für die Galactose-induzierbare Expression in Hefe unter der Regulation durch den GAL1-Promotor entwickelt worden.
  • 1) Renilla mulleri-GFP in pYES2 (6547 bp)
  • Eine Renilla mulleri-GFP-CDS wurde in das Hefeexpressionsplasmid pYES2 (Invitrogen, San Diego) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung) einen bakteriellen selektierbaren Marker (Amp), einen Hefereplikationsursprung (2-Mikron-Ursprung), einen Hefe-selektierbaren Marker (URA3), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung) und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des Renilla mulleri-GFPs erfolgt unter der Kontrolle von Hefe-GAL1. Dieser Vektor ist für die Expression in Saccharomyces cerevisiae-Zellen konzipiert.
  • 2) Renilla mulleri-Luciferase in pYES2 (6766 bp)
  • Eine Renilla mulleri-Luciferase-CDS wurde in pYES2 (Invitrogen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Amp), einen Hefereplikationsursprung (2-Mikron-Ursprung), einen Hefeselektierbaren Marker (URA3), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung) und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der Renilla mulleri-Luciferase erfolgt unter der Kontrolle durch Hefe-GAL1.
  • D. Plasmide, die für die Expression von nativem Renilla mulleri-GFP oder von Renilla mulleri-Luciferase in Bakterienzellen verwendet werden.
  • Unter Verwendung des pET-34 CBD-Renilla mulleri-Luciferase-Plasmids oder des pET-34-CBD-Renilla mulleri-GFP-Plasmids als Template wurde die inverse High-Fidelity-PCR angewendet, um die CBD und alle anderen codierenden Sequenzen 5' zu der nativen Renilla mulleri-Luciferase oder zum GFP-Startcodon präzise zu entfer nen. Die Plasmide wurden wieder ringförmig gemacht und in BL21 (DE3)-Zellen eingeführt (Novagen, Madison, WI). Diese Plasmide sind so konzipiert, dass sie bei der Induktion mit IPTG große Mengen an Polypeptid mit natürlicher Länge exprimieren. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des exprimierten Polypeptids kann sich das Protein korrekt falten und sich in einer funktionsfähigen Form in dem Cytosol befinden oder in das Kulturmedium freigesetzt werden. Wenn in dieser Weise exprimiert, wird für alle biolumineszierenden Proteine, die hier beschrieben werden, eine beträchtliche funktionale Aktivität beobachtet. Die Gaussia-Luciferase wird in das Kulturmedium freigesetzt.
  • 1) Natives Ptilosarcus-GFP in pET-34 (6014 bp)
  • Eine Ptilosarcus-GFP-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, Ribosomenbindungssequenz (rbs), LIC-Stelle (ligation independent cloning), 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des Ptilosarcus-GFPs erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 2) Natives Renilla mulleri-GFP in pET-34 (6014 bp)
  • Eine Renilla mulleri-GFP-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His- tag-CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des Renilla mulleri-GFPs erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 3) Native Gaussia-Luciferase in pET-34 (5855 bp)
  • Eine Gaussia-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der Gaussia-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 4) Native Pleuromamma-Luciferase in pET-34 (5894 bp)
  • Eine Pleuromamma-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der Pleuromamma-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 5) Native Renilla mulleri-Luciferase in pET-34 (6233 bp)
  • Eine Renilla mulleri-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag-CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der Renilla mulleri-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 5. Plasmide, verwendet für die Reinigung eines Cellulose-Bindungsdomäne-Renilla mulleri-Luciferase-Fusionsproteins oder Cellulose-Bindungsdomäne-Renilla mulleri-GFP-Fusionsproteins aus Bakterienzellen
  • Die codierende Region der Renilla mulleri-Luciferase oder des Renilla mulleri-GFPs wurde mit einer High Fidelity-Polymerase (Pfu turbo, Stratagene) unter Verwendung des klonierten pBluescript-Phagemids als Template amplifiziert und unter Verwendung einer Ligationsunabhängigen Klonierungsstelle (ligation independent clonig site – LIC-Stelle) in den pET-34-LIC-Vektor (Novagen) insertiert. Das resultierende CBD-Luciferase-Fusionsprotein (CBD = Cellulose-Bindungsdomäne) oder CBD-GFP-Fusionsprotein kann in hohem Ausmaß in BLI(DE3)-Zellen (Novagen) nach der Induktion mit IPTG exprimiert werden. Auf Grund der Beschaffenheit von CBD-clos bleibt der überwiegende Anteil des exprimierten Proteins in den unlöslichen Einschlusskörpern. Die Einschlusskörper können in halbreinem Zustand isoliert werden, und funktionsfähige CBD-Fusionsproteine können durch die Renaturierung zurückgewonnen werden. Der Einschluss der Thrombin- und der Enterokinase-(EK)-Spaltungsstelle in das Fusionsprotein erlaubt die Isolierung von hoch gereinigten nativen oder nahezu nativen Proteinen für die Zwecke der strengen Analyse.
  • 1) CBD-Renilla mulleri-Luciferase in pET-34 (6824 bp)
  • Eine CBD-Renilla mulleri-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (fI-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag-CDS, His-tag-Sequenz, T7-Terminator, die Thrombinspaltungsstelle, RNase-S-peptid-Tag (S Tag) CDS-Sequenz, EK-Spaltungsstelle und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der CBD-Renilla mulleri-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 2) CBD-Gaussia-Luciferase in pET 34-(6446 bp)
  • Eine CBD-Gaussia-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-Tag-CDS, His-Tag-Sequenz, T7-Terminator, die Thrombinspaltungsstelle, S-Tag-CDS-Sequenz, die EK-Spaltungsstelle und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der CBD-Gaussia-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 3) CBD-Pleuromamma-Luciferase in pET-34 (6485 bp)
  • Eine CBD-Pleuromamma-Luciferase-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs-Sequenz, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-Tag-CDS, His-Tag-Sequenz, T7-Terminator, die Thrombinspaltungsstelle, S-Tag-CDS-Sequenz, EK-Spaltungsstelle und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression der CBD-Pleuromamma-Luciferase erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 4) CBD-Ptilosarcus-GFP in pET-34 (6605 bp)
  • Eine CBD-Ptilosarcus-GFP-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs-Sequenz, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-tag-CDS, His-Tag-Sequenz, T7-Terminator, Thrombinspaltungsstelle, S-Tag-CDS-Sequenz, EK-Spaltungsstelle und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des CBD-Ptilosarcus-GFPs erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • 5) CBD-Renilla mulleri-GFP in pET-34 (6605 bp)
  • Eine CBD-Renilla mulleri-GFP-CDS wurde in pET-34 (Novagen) kloniert, das unter anderem einen bakteriellen Replikationsursprung (CoIE1-Ursprung), einen bakteriellen selektierbaren Marker (Kan), einen Phagenreplikationsursprung (f1-Ursprung), lacI-Sequenz, T7-Promotor, lac-Operator, rbs-Sequenz, LIC-Stelle, 3'-LIC-Überlappungssequenz, His-Tag-CDS, His-Tag-Sequenz, T7-Terminator, Thrombinspaltungsstelle, S-Tag-CDS-Sequenz, EK-Spaltungsstelle und verschiedene Restriktionsklonierungsstellen enthält. Die Expression des CBD-Renilla mulleri-GFPs erfolgt unter der gemeinsamen Kontrolle durch den lac-Operator und den T7-Promotor, der durch IPTG induzierbar ist.
  • F. Plasmid für die Expression eines Renilla mulleri-Luciferase-GFP-Fusionsproteins
  • Wie in 7 anschaulich dargestellt wurde das Renilla mulleri-GFP in die LIC-Stelle (LIC = ligation independet cloning) des pET-34-Vektors (Novagen) insertiert. Die CBD (Cellulose-Bindungsdomäne), die normalerweise in pET-34 vorhanden ist, wurde unter Verwendung der inversen PCR entfernt. Um die Optimierung des resultierenden Fusionsproteins für die analytischen Verwendungen (wie für BRET) zu erleichtern, wurden zusätzliche Restriktionsstellen (nicht gezeigte) in die Linkerregion eingeführt, was die Insertion gewünschter Verbindungsproteine und Zielproteine oder -Reste ermöglicht. Unter Verwendung von zwei dieser Stellen wurde die Renilla mulleri-Luciferase-CDS in die Standardposition der CBD insertiert. In diesem Plasmid oder in ähnlichen Konstrukten, die die CBD beibehalten, kann nahezu natives und natives GFP vom Fusionsprotein durch die Behandlung mit Thrombin bzw. Enterokinase (EK) abgespalten werden. Das RNase-S-Peptid-Tag (S-Tag CDS) erleichtert die Reinigung des GFPs oder des Fusionsproteins durch Immunaffinität und ermöglicht die Quantifizierung dieser Proteine in Rohextrakten unter Verwendung eines kommerziellen RNase-Assays (Novagen). Falls die Luciferase getrennt in einem zweiten getrennten Plasmid mit dem S-Tag vereinigt wird, erzeugt die Assoziation oder die Coexpression von S-Protein/Luciferase und S-Protein/GFP über die RNase-Domäne ein Testsystem für den intermolekularen BRET.
  • G. Funktionsfähige Expression des Renilla mulleri-GFPs in Säugetierzellen
  • HeLa-Zellen wurden mit dem Plasmid pcDNA3.1(+) transfiziert, das das Renilla mulleri-GFP unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (Konstrukt Nr. B(1) wie weiter oben beschrieben) enthält. HeLa-Zellen wurden mit 1,5 μg pcDNA3.1 pro Platte unter Verwendung des LipofectAMINE-plus-Kits (Gibco) "burst"-transfiziert.
  • Wenn HeLa-Zellen mit 30 μg pcDNA-Renilla mulleri-GFP-DNA "burst"-transfiziert und 8 h bei 37°C gezüchtet wurden, wurde eine Subpopulation von Zellen beobachtet, die eine starke Fluoreszenz zeigte. Die Fluoreszenz wurde bei Paaren von Zellen lokalisiert, die dabei waren, sich zu teilen oder die sich offensichtlich gerade einmal geteilt hatten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass natives Renilla mulleri-GFP in Säugetierzellen korrekt exprimiert, gefaltet und mit dem Chromophor komplexiert werden kann und dass es seine Funktion, grünes Fluoreszenzlicht zu erzeugen, in Säugetierzellen behält. Dies ist anders als beim Aequorea-GFP, das unter den physiologischen Bedingungen ineffizient in die funktionsfähige Form gefaltet wird.
  • Die Filter (470/40-Anregungsfilter, dichroitischer 495-Anregungsfilter und 525/50-Emissionsfilter, die für das Sichtbarmachen der R. mulleri-GFP-Fluoreszenz in HeLa-Zellen verwendet wurden, gehörten zum Endo-GFP-Filtersatz, der von Chroma im Handel erhältlich ist.
  • Zusammenfassung des Sequenzprotokolls
    • 1. SEQ ID NO: 1 Renilla reniformis-Luciferase [ U.S.-Patent Nr. 5,418,155 ]
    • 2. SEQ ID NO: 2 Cypridina hilgendorfii-Luciferase [ EP 0 387 355 ]
    • 3. SEQ ID NO: 3 modifizierte Luciola cruciata-Luciferase [Leuchtkäfer; U.S.-Patent Nr. 4,968,613 ]
    • 4. SEQ ID NO: 4 Vargula (Cypridina)-Luciferase [Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6567–6571 und aus JP3-30678 Osaka
    • 5. SEQ ID NO: 5 Apoaequorin-codierendes Gen [ U.S.-Patent Nr. 5,093,240 , PAQ440]
    • 6. SEQ ID NO: 6 codiertes Aequorin AEQ1 [Prasher et al. (1987) "Sequence Comparisons of CDNAs Encoding for Aequorin Isotypes," Biochemistry 26: 1326–1332]
    • 7. SEQ ID NO: 7 codiertes Aequorin AEQ2 [Prasher et al. (1987)]
    • 8. SEQ ID NO: 8 codiertes Aequorin AEQ3 [Prasher et al. (1987)]
    • 9. SEQ ID NO: 9 Aequorin-Photoprotein [Charbonneau et al. (1985) "Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin," Biochemistry 24: 6762–6771]
    • 10. SEQ ID NO: 10 Aequorin-Mutante mit erhöhter Biolumineszenz-Aktivität [ U.S.-Patent Nr. 5,360,728 , Asp 124 ersetzt durch Ser]
    • 11. SEQ ID NO: 11 Aequorin-Mutante mit erhöhter Biolumineszenz-Aktivität [ U.S.-Patent Nr. 5,360,728 , Glu 135 ersetzt durch Ser]
    • 12. SEQ ID NO: 12 Aequorin-Mutante mit erhöhter Biolumineszenz-Aktivität [ U.S.-Patent Nr. 5,360,728 , Gly 129 ersetzt durch Ala]
    • 13. SEQ ID NO: 13 codiertes Apoaequorin [im Handel erhältlich von Sealite, Sciences, Bogart, GA als AQUALITE®, wenn rekonstituiert Bildung von Aequorin].
    • 14. SEQ ID NO: 14 Vibrio fisheri-Flavinreduktase [ U.S.-Patent Nr. 5,484,723 ]
    • 15. SEQ ID NO: 15 Nucleinsäure, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Renilla mulleri codiert
    • 16. SEQ ID NO: 16 codiertes grün fluoreszierendes Protein (GFP) von Renilla mulleri
    • 17. SEQ ID NO: 17 Nucleinsäure, die Renilla mulleri-Luciferase codiert
    • 18. SEQ ID NO: 18 codierte Renilla mulleri-Luciferase
    • 19. SEQ ID NO: 19 Nucleinsäure, die eine Gaussia-Luciferase codiert
    • 20. SEQ ID NO: 20 Codierte Gaussia-Luciferase
    • 21. SEQ ID NO: 21 Nucleinsäure, die ein Gaussia-Luciferase-Fusionsprotein codiert
    • 22. SEQ ID NO: 22 Codiertes Gaussia-Luciferase-Fusionsprotein
    • 23. SEQ ID NO: 23 Renilla reniformis-GFP-Peptid, das Aminosäuresequenzen in der Nähe des Amino-Terminus des R. mulleri-GFPs entspricht
    • 24. SEQ ID NO: 24 Renilla reniformis-GFP-Peptid, das Aminosäuresequenzen in der Nähe des Amino-Terminus des R. mulleri-GFPs entspricht
    • 25. SEQ ID NO: 25 Renilla reniformis-GFP-Peptid, das Aminosäuresequenzen in der Nähe der Mitte des R. mulleri-GFPs entspricht
    • 26. SEQ ID NO: 26 Renilla reniformis-GFP-Peptid, das Aminosäuresequenzen in der Nähe der Mitte des R. mulleri-GFPs entspricht
    • 27. SEQ ID NO: 27 Renilla reniformis-GFP-Peptid, das Aminosäuresequenzen in der Nähe des Carboxy-Terminus des Renilla mulleri-GFPs entspricht
    • 28. SEQ ID NO: 28 Pleuromamma-Luciferase\Insertion 861 bp
    • 29. SEQ ID NO: 29 codierte Pleuromamma-Luciferase 198 AS
    • 30. SEQ ID NO: 30 Ptilosarcus-GFP\Insertion A\1104 bp
    • 31. SEQ ID NO: 31 Ptilosarcus-GFP\Insertion B\1279 bp
    • 32. SEQ ID NO: 32 Ptilosarcus-GFP 238 AS
  • SEQUENZLISTE
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (54)

  1. Isoliertes Nucleinsäurefragment, das eine Luciferase codiert und das die Nucleotidsequenz umfasst, die unter – einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird; – einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird; und – einer Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz zeigt, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird, ausgewählt wird.
  2. Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure eine DNA ist.
  3. Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure eine RNA ist.
  4. Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure für die Expression in Tierzellen, Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und/oder Insektenzellen optimiert ist.
  5. Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure für die Expression in Humanzellen optimiert ist.
  6. Nucleinsäuresonde oder Primer, die/der mindestens 14 aufeinander folgende Nucleotide umfasst, die aus der Nucleotidsequenz ausgewählt werden, die in dem codierenden Bereich von SEQ ID NO: 19 offenbart wird.
  7. Nucleinsäuresonde oder Primer nach Anspruch 6, die/der mindestens 16 aufeinander folgende Nucleotide umfasst, die aus der Nucleotidsequenz ausgewählt werden, die in dem codierenden Bereich von SEQ ID NO: 19 offenbart wird.
  8. Nucleinsäuresonde oder Primer nach Anspruch 6, die/der mindestens 30 aufeinander folgende Nucleotide umfasst, die aus der Nucleotidsequenz ausgewählt werden, die in dem codierenden Bereich von SEQ ID NO: 19 offenbart wird.
  9. Plasmid, das das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 umfasst.
  10. Plasmid nach Anspruch 9, das ein Expressionsvektor ist.
  11. Plasmid nach Anspruch 10, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die – einen Promotorbereich, – eine Gaussia-Luciferase der SEQ ID NO: 19 und – einen selektierbaren Marker codiert, wobei die Nucleotidsequenz, die die Luciferase codiert, funktionsfähig mit dem Promotor verknüpft ist, wodurch die Luciferase exprimiert wird.
  12. Plasmid nach Anspruch 10, das weiterhin eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) codiert.
  13. Rekombinante Wirtszelle, die das Plasmid nach Anspruch 10 umfasst.
  14. Zelle nach Anspruch 13, wobei die Zelle unter einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Pilzzelle, einer Pflanzenzelle, einer Insektenzelle und einer Tierzelle ausgewählt wird.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Gaussia-Luciferase-Proteins, das das Züchten der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei das Luciferase-Protein durch die Zelle exprimiert wird, und das Gewinnen des exprimierten Luciferase-Proteins umfasst.
  16. Isoliertes gereinigtes Gaussia-Luciferase-Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird.
  17. Kombination, die umfasst: – einen Produktionsgegenstand; und – ein Biolumineszenz-erzeugendes System, wobei das Biolumineszenz-erzeugende System eine Luciferase umfasst, die durch die Nucleinsäure nach Anspruch 1 codiert wird.
  18. Kombination nach Anspruch 17, die weiterhin ein Luciferin umfasst.
  19. Kombination nach Anspruch 17, die weiterhin ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) umfasst.
  20. Kombination nach Anspruch 19, wobei das GFP ein Renilla-GFP oder ein Ptilosarcus-GFP ist.
  21. Kombination nach Anspruch 17, wobei der Produktionsgegenstand unter Spielzeugen, Kosmetika, Springbrunnen, persönlichen Pflegegegenständen, Glitterpuder wie "fairy dust", Getränken, Erfrischungsgetränken, Nahrungsmitteln, Textilwaren, Schaumblasen, Ballons, Artikeln für den persönlichen Gebrauch, Zahnpasten, Seifen, Körperfarben, Schaumbädern, Tinte- und Papierprodukten ausgewählt wird.
  22. Kombination nach Anspruch 21, die ein Spielzeuggewehr ist.
  23. Kombination nach Anspruch 21, die ein Nahrungsmittel ist.
  24. Kombination nach Anspruch 21, die ein Getränk ist.
  25. Kombination nach Anspruch 21, die ein Kosmetikprodukt ist.
  26. Kombination nach Anspruch 17, wobei der Produktionsgegenstand unter Wasserspritzpistolen, Spielzeugwaffen vom Typ der Soft-Air-Waffen (sog. "pellet guns"), Fingerfarben, Jonglierbällen vom Typ "Footbag", Grußkarten, Spielzeugen aus glibberigen Materialien, Kleidung, blasenerzeugenden Spielzeugen, Badpulvern, Kosmetika, Körperlotionen, Gelen, Körperpudern, Körpercremes, Zahnpasten, Mundwassern, Seifen, Körperfarben, Schaumbädern, Tinten, Einpackpapier, Gelatinen, Kuchenglasuren, Zuckerguss, Grußkarten, Bier, Wein, Sekt, Erfrischungsgetränken, Eiswürfeln, Eis, Trockeneis und Springbrunnen ausgewählt wird.
  27. Kombination nach Anspruch 26, die ein Spielzeuggewehr ist.
  28. Kombination nach Anspruch 26, die ein Nahrungsmittel ist.
  29. Kombination nach Anspruch 26, die ein Getränk ist.
  30. Kombination nach Anspruch 26, die ein Kosmetikprodukt ist.
  31. Antikörper, der immunspezifisch eine Gaussia-Luciferase bindet, oder Fragment oder Derivat dieses Antikörpers, das die Bindungsdomäne davon enthält.
  32. Antikörper nach Anspruch 31, der ein monoklonaler Antikörper ist.
  33. Antikörper nach einem der Ansprüche 30 oder 31, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
  34. Nucleinsäurekonstrukt, das eine Nucleotidsequenz, die eine Luciferase codiert, und eine Nucleotidsequenz, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) codiert, umfasst, wobei die Luciferase durch: – eine Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird; – eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird; und – eine Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz zeigt, die in SEQ ID NO: 19 offenbart wird, codiert wird.
  35. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei das GFP ein Renilla-grün-fluoreszierendes-Protein (Renilla-GFP) oder ein Ptilosarcus-GFP ist.
  36. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 35, wobei das Renilla-GFP ein Renilla-reniformis-, Renilla-kollokeri- oder Renilla-mulleri-GFP ist.
  37. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei das GFP durch – eine Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 31 offenbart wird, – eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 32 offenbart wird, und – eine Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit der Nucleotidsequenz zeigt, die in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 31 offenbart wird, codiert wird.
  38. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei die Nucleotidsequenzen, die die Luciferase und das GFP codieren, unmittelbar aneinander grenzend miteinander verknüpft sind.
  39. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, bei dem es sich um eine DNA handelt.
  40. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, bei dem es sich um eine RNA handelt.
  41. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei das Nucleinsäurekonstrukt für die Expression in Tierzellen, Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und/oder Insektenzellen optimiert ist.
  42. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei das Nucleinsäurekonstrukt für die Expression in Humanzellen optimiert ist.
  43. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34, wobei die Nucleotidsequenzen, die die Luciferase und das GFP codieren, nicht unmittelbar aneinander grenzen.
  44. Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 43, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine Liganden-bindende Domäne eines Zielproteins codiert.
  45. Plasmid, das das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 34 umfasst.
  46. Plasmid nach Anspruch 45, das weiterhin eine Nucleotidsequenz umfasst, die – ein Promotorelement; – einen selektierbaren Marker; codiert, wobei die Nucleotidsequenz, die die Luciferase und das GFP codiert, funktionsfähig mit dem Promotorelement verknüpft ist, so dass ein Fusionsprotein der Luciferase und des GFPs exprimiert wird.
  47. Plasmid nach einem der Ansprüche 9 bis 12, 45 oder 46, wobei das Plasmid für die Expression in Tierzellen, Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen und/oder Insektenzellen optimiert ist.
  48. Plasmid nach einem der Ansprüche 9 bis 12, 45 oder 46, wobei das Plasmid für die Expression in Humanzellen optimiert ist.
  49. Rekombinante Wirtszelle, die das Plasmid nach Anspruch 45 umfasst.
  50. Zelle nach Anspruch 49, wobei die Zelle unter einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Pilzzelle, einer Pflanzenzelle, einer Insektenzelle und einer Tierzelle ausgewählt wird.
  51. Isoliertes, im Wesentlichen gereinigtes Fusionsprotein von Gaussia-Luciferase und GFP, wobei die Luciferase die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 20 offenbart wird.
  52. Zusammensetzung, die das Fusionsprotein nach Anspruch 51 umfasst.
  53. Zusammensetzung nach Anspruch 52, die weiterhin mindestens eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems umfasst.
  54. Zusammensetzung nach Anspruch 53, wobei es sich bei der Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems um Luciferin handelt.
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