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Die
vorliegende Erfindung betrifft hämatopoetische
Stammzellen und insbesondere ein Verfahren und eine Zusammensetzung
zur Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen
zu einer festgelegten Osteoklastenlinie in Abwesenheit von exogenen,
die Osteoklastogenese induzierenden Faktoren. Ferner betrifft die
vorliegende Erfindung genetisch modifizierte hämatopoetische Stammzellen in
Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen, so dass dann, wenn
die hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklasten differenzieren, die Osteoklasten zur
Expression des Produkts des transduzierten Gens befähigt sind.
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Hintergrund der Erfindung
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Osteoklasten
sind endgültig
differenzierte hämatopoetische
Zellen, die für
die physiologische Knochenresorption verantwortlich sind. Eine Funktionsstörung der
Differenzierung und/oder Aktivität
von Osteoklasten ist die Ursache einer Vielzahl von humanen metabolischen
Knochenkrankheiten, einschließlich
Osteoporose (bezüglich
eines Übersichtsartikels
wird verwiesen auf Teitelbaum et al., 1995). Osteoporose oder progressiver
Knochenverlust wird auf eine Verschiebung des kritischen Gleichgewichts
von Osteoklasten- und Osteoblastenaktivitäten, die für einen einwandfreien Skelettzustand
verantwortlich sind, zurückgeführt. Osteoblasten,
die Knochen bilden, sind eine endgültig differenzierte Linie,
die auf mesenchymale Stammzellen zurückgeht.
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Hämatopoetische
Progenitorzellen im Knochenmark werden unter dem Einfluss von lokalen
regulatorischen Faktoren zur Bildung der Osteoklasten-Zelllinie
gesteuert. Verschiedene Zelltypen, einschließlich stromale Zellen, die
aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) entstehen, sind im Knochenmark
vorhanden. Von stromalen Zellen wurde gezeigt, dass sie Faktoren
erzeugen, die die Osteoklasten-Physiologie regulieren (bezüglich eines Übersichtsartikels
wird verwiesen auf Mundy et al., 1995). Histologische Knochenbilder
zeigen eine enge Nähe
zwischen stromalen und hämatopoetischen
Zellen im Knochenmark. Ferner ist die Beziehung zwischen dem differenzierten
Zustand von stromalen Knochenmarkzellen und ihrem Potential zur
Regulierung von benachbarten Osteoklasten-Vorläuferzellen nur schlecht dokumentiert.
Die Bedeutung von heterotypischen Zell-Zell- Wechselwirkungen, die durch Cadherin-6
zwischen stromalen Zellen und Osteoklasten-Progenitorzellen bei
Verwendung eines Mäusemodells
der Osteoklastogenese vermittelt werden, wurde beschrieben (Mbalaviele
et al., 1998). Mehrere Studien haben belegt, dass für die Osteoklasten-Differenzierung die
Anwesenheit von Stroma/Osteoblastenzellen erforderlich ist (Takahashi
et al., 1988; Mbalaviele et al., 1995). Neuere Studien unter Verwendung
von Zellen, die von Nagetier-Knochenmark abgeleitet sind, haben
gezeigt, dass der an der Membran von stromalen Zellen exprimierte
Osteoprotogerin-Ligand (OPGL) einen Schlüsselfaktor der Osteoklastogenese
darstellt (Lacey et al., 1998; Kong et al. 1999). Es wurde jedoch
auch berichtet, dass Progenitorzellen in Gegenwart von Cocktails
von Cytokinen zu humanen Osteoklastenzellen differenzierten und dass
stromale Zellen nicht erforderlich waren (Matayoshi et al., 1996).
Die Bildung von humanen Osteoklastenzellen (Ocl), die eine knochenresorbierende
Aktivität
aufweisen, wurde beschrieben (Takahashi et al., 1995; James et al.,
1996; Sarma et al., 1996; Quinn et al., 1997), jedoch sind kritische
Ereignisse, die während
der Osteoklastogenese ablaufen, noch unklar.
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Ferner
haben Studien gezeigt, dass Osteoklasten in Cokulturen von Osteoblasten/Stromazellen
mit hämatopoetischen
Zellen erzeugt werden (Martin und Ng, Journal of Cellular Biochemistry,
Bd. 56 (1994), S. 357–366).
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Bei
Knochen handelt es sich um eine Verbundmatrix, die sowohl aus anorganischen
als auch aus organischen Elementen besteht. Die organische Phase
enthält
Proteine, während
die anorganische Komponente Calciumsalze enthält. Es ist bekannt, dass während der
osteoklastischen Knochenresorption eine Auflösung der anorganischen Phase
der Auflösung
der organischen Phase vorausgeht und dass hohe Konzentrationen an
Calcium (> 40 mM)
lokal aus der Knochenmatrix freigesetzt werden. Erhöhte Calciumkonzentrationen üben wiederum
eine negative Rückkoppelung
auf die Osteoklastenfunktion aus, wobei es sich um einen regulatorischen
Mechanismus zur Verhinderung einer übermäßigen Knochenresorption handelt.
Von Calcium ist bekannt, dass es die Expression mehrerer Gene reguliert.
Kürzlich
wurde ein Calcium-Reaktionselement, das die Expression des humanen
Keratin-1-Gens nach Einwirkung von extrazellulärem Calcium (0,6 mM) auf Keratinozyten
verstärkt,
charakterisiert.
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Osteoklasten
lassen sich aufgrund ihrer geringen in vivo-Zellzahl, ihrer Fragilität und ihrer
Tendenz zur Haftung an anderen Knochenzellen nicht leicht isolieren.
Somit besteht ein Bedürfnis
nach einem Verfahren zur wirksamen Erzeugung von großen Mengen
an Osteoklasten, um beispielsweise die Entwicklung von wirksamen
Therapeutika, die auf eine Verhinderung der abnormalen Osteolyse
abzielen, zu erleichtern.
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Demzufolge
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
eines wirksamen Verfahrens zur in vitro-Erzeugung von Osteoklasten.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines
Verfahrens zur in vitro-Herstellung und -Aufrechterhaltung von Osteoklasten
ohne die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren in ausreichender
Anzahl, um eine ständige
Quelle von Osteoklasten bereitzustellen, beispielsweise zur Verabreichung von
Osteoklasten an ein Individuum, das einen entsprechenden Bedarf
aufweist.
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Demzufolge
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Regulierung
der Differenzierung von hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklastenzellen in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren,
Cytokinen und Hormonen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung von Osteoklasten aus genetisch
modifizierten hämatopoetischen
Zellen, so dass dann, wenn die hämatopoetischen
Zellen zu Osteoklasten differenzieren, die Osteoklasten das Genprodukt
von Interesse exprimieren.
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Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen die Differenzierung
von hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklastenzellen unterstützen.
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Somit
wird gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Induktion der
in vitro-Differenzierung von hämatopoetischen
Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen bereitgestellt, das das gemeinsame
Züchten
der hämatopoetischen
Zellen mit humanen mesenchymalen Stammzellen umfasst.
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Wenn
hämatopoetische
Progenitorzellen gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet wurden,
differenzierten die hämatopoetischen
Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen, die durch die Expression
von Markern identifiziert wurden, die charakteristisch für Osteoklasten
sind, wozu die Mehrkernigkeit, die Calcitonin- und Vitronectin-Rezeptoren
und insbesondere die Knochenresorptionsaktivität gehören.
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Ferner
wurde festgestellt, dass die Differenzierung der hämatopoetischen
Stammzellen in Abwesenheit von exogenen (zugesetzten) Wachstumsfaktoren,
Cytokinen und Hormonen, von denen bekannt ist, dass sie für die Induktion
der Differenzierung von hämatopoetischen
Stammzellen erforderlich sind, erfolgte.
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Demgemäß wird gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung
von Osteoklasten bereitgestellt, das das gemeinsame Züchten von
mesenchymalen Stammzellen mit hämatopoetischen
Stammzellen umfasst. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
werden die Zellen gemeinsam im gleichen Kulturgefäß gezüchtet, so
dass physikalische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen den hämatopoetischen
Progenitorzellen und den mesenchymalen Stammzellen ablaufen.
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Ferner
wurde festgestellt, dass dann, wenn hämatopoetische Stammzellen,
die so modifiziert worden sind, dass sie exogenes genetisches Material
von Interesse tragen, gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet werden,
die transduzierten hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklasten differenzierten, die ebenfalls das neue
genetische Material trugen. Diese transduzierten Osteoklastenzellen
sind zur Expression des exogenen Genprodukts befähigt. Transduzierte Osteoklasten-Progenitorzellen
und die daraus differenzierten Osteoklasten können für Anwendungen eingesetzt werden,
bei denen sich eine Behandlung unter Verwendung von derartigen modifizierten
Osteoklasten als vorteilhaft erweist, z. B. bei der Linderung der
Auswirkungen von Osteoporose.
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Demzufolge
wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Gewinnung von genetisch modifizierten Osteoklasten bereitgestellt,
das das Transduzieren von hämatopoetischen
Progenitorzellen mit exogenem genetischem Material und das Einwirken
von Bedingungen auf die transduzierten hämatopoetischen Zellen, die
zur Differenzierung der hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklastenzellen, die das exogene genetische Material
enthalten, geeignet sind, umfasst.
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Gemäß einer
Ausführungsform
umfasst das Verfahren zur Herstellung von Osteoklasten das gemeinsame
Züchten
von transduzierten hämatopoetischen
Stammzellen mit mesenchymalen Stammzellen, so dass nach Differenzierung
der hämatopoetischen
Stammzellen zu Osteoklasten, die Osteoklasten ebenfalls das exogene
genetische Material enthalten.
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Die
Erfindung betrifft ferner hämatopoetische
Stammzellen, die mit einem Polynucleotid transduziert worden sind,
das für
ein Produkt kodiert, das die Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten
herunterreguliert, sowie deren Verwendung.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
reguliert das exprimierte Genprodukt die Differenzierung und/oder
Aktivität
von Osteoklasten herunter. Hämatopoetische
Stammzellen werden mit einem retroviralen Vektor transduziert, der
ein Tandem aus einem Calcium-Responsiven-Element,
den Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-Promotor (spezifisch in Osteoklasten
exprimiert) und eine Nucleinsäuresequenz, die
für einen
Antiosteoklasten-Aktivitätsfaktor
(z. B. eine antisense-Sequenz gegen M-CSF, IL1 oder IL6; einen Inhibitor,
wie einen intrazellulären
Antikörper
gegen IL6, gegen M-CSF, gegen GM-CSF, gegen IL1 oder gegen Leukämie-Inhibitorfaktor;
oder einen apoptotischen Faktor) kodiert, enthält. Die Expression dieser Sequenz wird
durch die lokale Zunahme der Calciumkonzentration aufgrund der osteoklastischen
Knochenresorption ausgelöst.
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Ferner
wurde festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen zwar positiv die
Differenzierung von CD34+-Progenitorzellen
zu Osteoklastenzellen regulierten, dass aber MSCs, bei denen die
Differenzierung zu osteoblastischen Zellen begonnen hatte, diesen
Vorgang hemmten. Es wurde festgestellt, dass in Gegenwart von osteogenen
mesenchymalen Stammzellen der Grad der OPGL-Expression abnahm und
die Expression von Osteoprotogerin (OPG) zunahm. Somit kommt es
ferner in Betracht, dass die Züchtung
von hämatopoetischen
Stammzellen in Gegenwart von differenzierten mesenchymalen Stammzellen
möglicherweise
die Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten herunterreguliert.
Demzufolge können
die erfindungsgemäßen, gemeinsam
gezüchteten
Zellpopulationen als Bestandteil einer Behandlung zur Linderung
der Symptome von Osteoporose herangezogen werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1A zeigt die TRAP-Färbung von CD34+-Zellen,
die in Abwesenheit von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) gezüchtet worden
sind.
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1B zeigt die TRAP-Färbung von CD34+-Zellen,
die in Gegenwart von MSCs gezüchtet
worden sind. Zahlreiche mehrkernige TRAP+-Zellen
(TRAP+MNCs) (Pfeil) sowie einkernige TRAP+-Zellen
wurden in Gegenwart von MSCs gebildet, die als eine konfluente Lage
von spindelförmigen
Zellen (Pfeilkopf) auftraten. Kleine Pfeile und der Stern zeigen
Cluster von Kernen.
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1C zeigt die Färbung von CD34+-Zellen,
die in Gegenwart von humanen Hautfibroblasten gezüchtet worden
sind (SK1087-Zellen; Pfeilkopf). Es wurden keine TRAF+MNCs gebildet.
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1D zeigt die Färbung von CD34+-Zellen,
die in Gegenwart von huamen Nierenzellen gezüchtet worden sind (293T; Pfeilkopf).
TRAP+MNCs wurden nicht gebildet.
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2A zeigt die immunocytochemische Färbung von
gemeinsamen Kulturen von CD34+ und MSCs mit
negativem Kontrollantikörper.
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2B zeigt die immunocytochemische Färbung von
gemeinsamen Kulturen von CD34+ und MSCs mit
Antikörper,
der den Vitronectin-Rezeptor erkennt.
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3 zeigt
die RT-PCR von RNA, die aus gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen (Bahnen 2–3) oder Kulturen von MSCs
ohne CD34+-Zellen (Bahnen 4–5) gereinigt worden sind.
Calcitonin-Rezeptoren (Bahnen 2 und 4) und TRAP (Bahnen 3 und 5)
wurden nur in Proben aus gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen nachgewiesen. Die konservierte und
ungespleißte
Region der Calcitonin-Rezeptorfamilie wurde zur Konstruktion von
Primern gewählt.
Bahn 1, 1 kb DNA-Leiter; Unterseite β2-Mikroglobulin.
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4A zeigt die Bildung von Löchern (Pits)
in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen
und MSCs (Pfeile).
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4B zeigt die Bildung von Löchern in
Kulturen von CD34+-Zellen ohne MSCs.
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Schnitte
wurden mit Toluidinblau gefärbt
und unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Vergrößerung 200-fach.
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4C zeigt die quantitative Bestimmung von
Löchern
in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen und
MSCs (ausgefüllter
Balken) oder in Kulturen von CD34+-Zellen
ohne MSCs (leerer Balken). *p < 0,01
gegenüber
Kulturen von CD34+-Zellen ohne MSCs.
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5A zeigt die Einflüsse von Zell-Zell-Wechselwirkungen
bei der Bildung von Osteoklastenzellen. CD34+-Zellen
und MSCs wurden gemeinsam in gleichen Kompartimenten (Kontakt-Cokulturen,
ausgefüllter Balken)
oder getrennt mittels 0,45 μm-Filtern
(Nichtkontakt-Cokulturen) gezüchtet:
MSCs oben und CD34+-Zellen unten, leerer
Balken; MSCs oben und CD34+-Zellen oben, schraffierter
Balken). *p < 0,01
gegenüber
Nichtkontakt-Cokulturen.
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5B zeigt die quantitative Bestimmung von
sezernierten Faktoren (IL-6, IL-11, LIF) in gemeinsamen Kulturen
von CD34+-Zellen mit MSCs. Die Konzentrationen
an IL-6 und LIF, jedoch nicht von IL-11, waren etwa 10-fach höher in gemeinsamen
Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen, verglichen
mit MSC-Kulturen ohne CD34+-Zellen.
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6A und 6B zeigen
die Hemmung von TRAP+MNCs durch osteogene MSCs. Die osteogene Differenzierung
von MSCs wurde durch Behandlung mit osteogenem Supplement (OS) für 2, 3,
4, 5, 10 oder 13 Tage vor Zugabe zu CD34+-Zellen
induziert. *p < 0,01
gegenüber
gemeinsamen Kulturen von OS-behandelten MSCs
und CD34+-Zellen.
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6C zeigt, dass gemeinsame Kulturen von
MSCs und CD34+-Zellen höhere Konzentrationen an IL-6,
IL-11 und LIF erzeugten, als gemeinsame Kulturen von osteogenen
MSCs und CD34+-Zellen.
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6D zeigt, dass die osteogene Differenzierung
von MSCs mit einer Abnahme der OPGL-mRNA-Expression (linkes Feld)
und einer Zunahme der OPG-mRNA-Expression
(rechtes Feld) verbunden ist.
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7A zeigt eine fließzytometrische Analyse von
CD34+-Zellen, die mit Kontrollvektoren transduziert sind.
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7B zeigt eine fließzytometrische Analyse von
CD34+-Zellen, die mit EGFP-Expressionsvektor transduziert
sind. Etwa 30% von CD34+-Zellen exprimierten
EGFP.
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7C zeigt gemeinsame Kulturen von MSCs
mit CD34+-Zellen, die mit EGFP-Expressionsvektor transduziert
sind. EGFP wurde durch Osteoklasten sowie durch mononukleare Zellen
exprimiert.
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7D zeigt gemeinsame Kulturen von MSCs
mit CD34+-Zellen bei Transduktion mit EGFP-Expressionsvektor
unter Färbung
auf TRAP. 7D zeigt die Lichtdarstellung
von 7C.
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8A zeigt die Expression des Vitronectin-Rezeptors
(ανβ3),
bei Nachweis durch ELISA. ανβ3-Antikörper: Vertiefungen
auf der linken Seite und ausgefüllter
Balken; Kontroll-IgG: Vertiefungen auf der rechten Seite und leerer
Balken.
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8B zeigt den zeitlichen Verlauf der Expression
von ανβ3.
Gemeinsame Kulturen von CD34+-Zellen und
MSCs (ausgefüllte
Balken) oder MSCs ohne CD34+-Zellen (leere
Balken).
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9A zeigt eine Strategie zur direkten Regulierung
der Osteoklastenaktivität.
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9B zeigt, dass die Zugabe von Calcium
zu gezüchteten
Zellen, die mit einem durch Calcium induzierbaren Expressionssystem
transfiziert worden waren, die Expression des Reportergens induzierte.
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10 zeigt
den Einfluss von Serum im Kulturmedium auf die Erzeugung von Osteoklasten
in gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen.
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10A zeigt die Osteoklastenzahlen in gemeinsamen
Kulturen von CD34+-Zellen und MSCs in DMEM
mit geringem Glucosegehalt und 10% FBS, leerer Balken; und in DMEM
mit hohem Glucosegehalt ohne Serum, ausgefüllter Balken.
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10B zeigt gemeinsame Kulturen von 293-Zellen
und CD34+-Zellen in DMEM mit hohem Glucosegehalt
und 10% FBS, ausgefüllter
Balken; und in DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Serum, schraffierter Balken.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von humanen
mesenchymalen Stammzellen zur Induktion der Differenzierung von
humanen CD34+-Zellen zu Osteoklastenzellen
sowie Zusammensetzungen, die humane CD34+-Zellen
und humane mesenchymale Stammzellen umfassen. Insbesondere haben
die Erfinder festgestellt, dass humane mesenchymale Stammzellen,
die in Verbindung mit CD34+-Zellen gezüchtet worden
sind, sich zur Induktion der Differenzierung von CD34+-Zellen
zu Osteoklasten eignen. Somit können
die CD34+-Zellen gehalten und als Quelle
für Osteoklasten
verwendet werden.
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Um
die vorliegenden humanen mesenchymalen Stammzellen für die hier
beschriebenen Verfahren zu erhalten, können mesenchymale Stammzellen
aus Knochenmark oder anderen Quellen für mesenchymale Stammzellen
gewonnen werden. Knochenmarkzellen lassen sich aus Darmbeinkamm,
Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen, Wirbeln, Rippen oder anderen
medulären
Räumen
erhalten. Zu weiteren Quellen für
humane mesenchymale Stammzellen gehören Plazenta, Nabelschnur,
Haut von Föten
und heranwachsenden Personen und Blut. Die Anwesenheit von mesenchymalen
Stammzellen in den Kulturkolonien kann durch spezifische Zelloberflächenmarker
verifiziert werden, die durch besondere monoklonale Antikörper identifiziert werden;
vergl. z. B.
US-Patent 5 486
359 . Diese isolierten mesenchymalen Zellpopulationen zeigen
epitope Charakteristika, die nur mit mesenchymalen Stammzellen assoziiert
sind; sie besitzen die Fähigkeit
zur Regeneration in Kultur ohne Differenzierung; und sie besitzen
die Fähigkeit
zur Differenzierung zu spezifischen mesenchymalen Linien, wenn sie
entweder in vitro oder in vivo an der Stelle des beschädigten Gewebes
induziert werden. Von humanen mesenchymalen Stammzellen ist es bekannt,
dass sie unter geeigneten Bedingungen einer Differenzierung zu mehrfachen
Zelllinien, einschließlich
Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten unterliegen (bezüglich eines Übersichtsartikels
wird verwiesen auf Caplan et al., 1997).
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Demzufolge
können
beliebige Verfahren, die sich zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus
humanem Gewebe eignen, eingesetzt werden, um eine Population von
Zellen zu erhalten, die in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichert
sind. Gemäß einem
Aspekt umfasst das Verfahren zum Isolieren von humanen mesenchymalen
Stammzellen folgende Stufen: das Bereitstellen einer Gewebeprobe,
die mesenchymale Stammzellen enthält, vorzugsweise Knochenmark;
das Isolieren der mesenchymalen Stammzellen aus der Probe, z. B.
durch Dichtezentrifugation; das Zugeben der isolierten Zellen zu
einem Medium, das Faktoren enthält,
die das Wachstum von mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung
stimulieren und das selektive Anhaften nur der mesenchymalen Stammzellen
an einer Substratoberfläche
in Kultur ermöglichen;
das Züchten
des Gemisches aus Probe und Medium; und das Entfernen der nicht-anhaftenden
Bestandteile von der Substratoberfläche.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können beliebige Verfahren, die
sich zur Gewinnung von hämatopoetischen
Stammzellen aus humanem Gewebe eignen, eingesetzt werden, wodurch man
eine Population von Zellen erhält,
die vorwiegend aus hämatopoetischen
Zellen besteht. Stammzellen lassen sich aus verschiedenen Gewebetypen
gewinnen, einschließlich
Knochenmark und Blut (unter Einschluss von peripherem Blut). Die
humanen hämatopoetischen
Stammzellen können
aus Knochenmark-Absaugungen oder peripherem Blut gewonnen und unter
Anwendung handelsüblicher
Antikörper
isoliert werden, die an hämatopoetische
Stammzellen-Oberflächenantigene,
z. B. CD34, binden, wobei man sich dem Fachmann bekannter Verfahren
bedient; vergl. beispielsweise
US-Patent
4 714 680 . Alternativ können
die hämatopoetischen
Stammzellen durch Depletion (Verarmung) gewonnen werden, d. h. durch
Selektion von Zellen, die an anderen Zellen auftretende Marker exprimieren.
Die für
diese Verfahren verwendeten Antikörper können mit magnetischen Perlen
konjugiert werden oder es können
immunogene Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Zelltyps herangezogen
werden.
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Die
humanen mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen Stammzellen
werden unter geeigneten Kulturbedingungen gemeinsam gezüchtet, so
dass die mesenchymalen Stammzellen an einer Substratoberfläche haften
und eine Monolager bilden. Die mesenchymalen Stammzellen werden
in einer Dichte im Bereich von etwa 3 × 103 bis
etwa 5 × 103 Zellen pro cm2 ausgestrichen.
Die CD34+-Zellen werden vorzugsweise in
einer Zelldichte von etwa 5 × 104 Zellen pro cm2 ausgestrichen.
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Nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden die isolierten mesenchymalen Stammzellen und die isolierten
hämatopoetischen
Progenitorzellen, vorzugsweise CD34+-Zellen,
jeweils in Kultur in geeigneten Medien expandiert, d. h. durch Verfahren
unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Bedingungen gezüchtet, die
das Zellwachstum und die Herstellung von homogenen Zellpopulationen
begünstigen.
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Die
beiden Zellpopulationen werden sodann gemeinsam in einem Medium
gezüchtet,
was das Wachstum von humanen mesenchymalen Stammzellen fördert und
die Aufrechterhaltung der hämatopoetischen Stammzellen
nicht beeinträchtigt.
Die Medien sollen auch die CD34
+-Zellpopulation
aufrechterhalten und die Induktion der Differenzierung von CD34
+-Zellen zu Osteoklastenzellen unterstützen. Geeignete
Medien sind beispielsweise im
US-Patent
5 486 359 beschrieben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die humanen mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen
Stammzellen gemeinsam in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit
geringem Glucosegehalt (DMEM-LG
#11885, Life Technologies, Gaithersburg, MD) gezüchtet. Das Medium enthält vorzugsweise
10% FBS. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die humanen
mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen Stammzellen
gemeinsam in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (DMEM-HG
#11995, Life Technologies, Gaithersburg, MD) ohne FBS gezüchtet.
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Die
nach dem hier beschriebenen Verfahren erzeugten hämatopoetischen
Stammzellen können
zur Bereitstellung einer zuverlässigen
und konstanten Quelle für
Osteoklastenzellen verwendet werden. Diese Osteoklasten können bei
der Bestimmung der Einflüsse
von osteotropen Faktoren auf die Entwicklung und Behandlung von
Osteoporose eingesetzt werden. Man nimmt an, dass die leichte Verfügbarkeit
von Osteoklasten für
Screeningtests für
die Entwicklung von kleinen Arzneistoffmolekülen, z. B. auf der Basis der
Expression von Integrin-ανβ3-Zelloberflächenrezeptor
durch Osteoklasten, wertvoll ist. Es wird angenommen, dass diese
Zellen, die nicht in vitro mit Wachstumsfaktoren behandelt worden
sind, Eigenschaften aufweisen, die in vivo auftretenden Osteoklasten ähnlicher
sind als bisher erhaltene Produkte.
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Nach
Differenzierung der hämatopoetischen
Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen gemäß den hier gemachten Angaben
kann das Gemisch aus hämatopoetischen
Progenitorzellen, Osteoklasten und mesenchymalen Stammzellen aufgetrennt
werden, um eine Population von Zellen zu erhalten, die weitgehend
aus Osteoklastenzellen besteht. Dies kann durch positive und/oder
negative Selektion von hämatopoetischen
Zellen unter Verwendung von Antikörpern zur Identifizierung von
hämatopoetischen
Zelloberflächenmarkern
oder anderen Zelltypmarkern erfolgen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Einführung von
fremden Genen in die hämatopoetischen
Progenitorzellen, so dass die Nachkommen der Zellen, die Osteoklasten,
das neue genetische Material tragen.
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Somit
können
gemäß diesem
Aspekt der Erfindung die hämatopoetischen
Progenitorzellen mit genetischem Material von Interesse modifiziert
werden. Die modifizierten CD34+-Zellen können sodann
in vitro gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet und
zur Differenzierung zu Osteoklastenzellen induziert werden. Die
Osteoklastenzellen sind zur Expression des Produkts der Genexpression
oder zur Sekretion des Expressionsprodukts in der Lage. Diese modifizierten
Zellen können
sodann an ein Zielgewebe, z. B. Knochenmark, verabreicht werden,
wo das exprimierte Produkt eine günstige Wirkung ausübt.
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Die
transduzierten hämatopoetischen
Progenitorzellen können
in vivo zur Differenzierung zu Osteoklasten, die das Genprodukt
exprimieren, induziert werden. Beispielsweise können die transduzierten hämatopoetischen
Progenitorzellen in Kombination mit mesenchymalen Stammzellen verabreicht
werden, um die Erzeugung von Osteoklasten mit dem transduzierten
Gen zu induzieren. Die Zellen können
sodann im Gemisch miteinander oder getrennt verabreicht werden und
an einem Zielbereich abgegeben werden.
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Somit
können
Gene in Zellen eingeführt
werden, die sodann wieder dem autologen Spender oder einem allogenen
Empfänger
zugeführt
werden, wo die Expression des Gens eine therapeutische Wirkung entfaltet.
Beispielsweise können
Osteoklasten gentechnisch so manipuliert werden, dass sie eine verringerte
in vivo-Aktivität
aufweisen. Geeignete Gene umfassen solche, die eine Rolle bei der
Regulation der Osteoporose, in Bereichen, wie der Reaktionsfähigkeit
auf Serumcalcium, der Östrogensekretion
und der Knochenresorption, ausüben.
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Die
hämatopoetischen
Stammzellen können
in Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen genetisch modifiziert
(transduziert, transformiert oder transfiziert) werden, wobei die
mesenchymalen Stammzellen den Wirkungsgrad der Gentransduktion der
hämatopoetischen
Stammzellen erhöhen.
Alternativ können
die hämatopoetischen
Stammzellen in Abwesenheit der humanen mesenchymalen Stammzellen transduziert
werden.
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Die
hämatopoetischen
Stammzellen können
genetisch durch Einverleibung von genetischem Material in die Zellen,
z. B. unter Anwendung von rekombinanten Expressionsvektoren, modifiziert
werden.
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Der
hier verwendete Ausdruck "rekombinanter
Expressionsvektor" bezieht
sich auf eine transkriptionelle Einheit, die eine Anordnung folgender
Bestandteile umfasst: (1) ein oder mehr genetische Elemente mit einer
regulatorischen Rolle bei der Genexpression, z. B. Promotoren oder
Enhancer, (2) eine strukturelle oder kodierende Sequenz, die in
mRNA transkribiert und zu einem Protein translatiert wird, und (3)
geeignete Sequenzen zur Initiation und Termination der Transkription.
Struktureinheiten, die zur Verwendung in eukaryontischen Expressionssystemen
vorgesehen sind, umfassen vorzugsweise eine Leadersequenz, die eine
extrazelluläre
Sekretion von translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht.
Alternativ können
die Struktureinheiten dann, wenn ein rekombinantes Protein ohne
eine Leader- oder
Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methioninrest
umfassen. Dieser Rest kann anschließend vom exprimierten rekombinanten Protein
abgespalten werden oder nicht, um ein Endprodukt bereitzustellen.
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Die
humanen hämatopoetischen
Progenitorzellen können
somit eine in chromosomale DNA in stabiler Weise integrierte rekombinante
transkriptionelle Einheit aufweisen oder die rekombinante transkriptionelle
Einheit als eine Komponente eines residenten Plasmids tragen. Zellen
können
beispielsweise ex vivo mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das
für ein
Polypeptid kodiert, gentechnisch behandelt werden. Zellen können gemäß dem Fachmann
geläufigen
Verfahren unter Verwendung eines retroviralen Teilchens, das für ein Polypeptid
kodierende RNA enthält,
manipuliert werden.
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Zu
Retroviren, aus denen die vorerwähnten
retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf)
murines Moloney-Leukämie-Virus,
Milz-Nekrose-Virus, Retroviren, wie Rous-Sarcoma-Virus, Harvey-Sarcoma
Virus, Vogel-Leukose-Virus, Gibbonaffen-Leukämie-Virus, humaner Immunschwächevirus,
Adenovirus, myeloproliferativer Sarcoma-Virus und Mamma-Tumor-Virus.
Gemäß einer
Ausführungsform
handelt es sich beim retroviralen Plasmidvektor um MGIN, der von
murinen embryonalen Stammzellen abgeleitet ist. Bezüglich allgemeiner
Ausführungen über den
retroviral vermittelten Gentransfer wird auf McLachlin et al. (1990)
verwiesen.
-
Die
für das
Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenz
steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Zu geeigneten
Promotoren, die verwendet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) der
TRAP-Promotor, adenovirale
Promotoren, wie der adenovirale späte Hauptpromotor (major late
promotor), der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, der Promotor des
respiratorischen Syncytial-Virus (RSV), induzierbare Promotoren,
wie der MMT-Promotor, der Metallothionein-Promotor, Hitzeschockpromotoren,
der Albumin-Promotor, der ApoAI-Promotor, humane Globin-Promotoren,
virale Thymidin-kinase-Promotoren, wie der Herpes-simplex-Thymidin-kinase-Promotor,
retrovirale LTRs, ITRs, der β-Actin-Promotor
und humane Wachstumshormon-Promotoren. Beim Promotor kann es sich
auch um den nativen Promotor handeln, der das für das Polypeptid kodierende
Gen steuert. Diese Vektoren ermöglichen
es, die Erzeugung des Polypeptids durch die gentechnisch manipulierten
Progenitorzellen zu regulieren. Beispielsweise kann für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung der Vektor ein Calcium-Responsives-Element
enthalten. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist für den Fachmann
ersichtlich.
-
Ferner
ist es möglich,
Vehikel, die sich von Retroviren unterscheiden, zu verwenden, um
die hämatopoetischen
Stammzellen genetisch zu manipulieren oder zu modifizieren. Genetische
Informationen von Interesse können
mittels eines beliebigen Virus eingeführt werden, das das neue genetische
Material in derartigen Zellen exprimiert. Beispielsweise können für diesen
Zweck SV40, Herpes-Virus, Adenovirus und humanes Papillomavirus
verwendet werden. Weitere Verfahren können zur Einführung von
klonierten eukaryontischen DNAs in gezüchtete Säugetierzellen herangezogen
werden, beispielsweise kann das auf Stammzellen zu übertragende
genetische Material in Form von viralen Nucleinsäuren vorliegen.
-
Ferner
können
die Expressionsvektoren einen oder mehrere selektierbare Markergene
enthalten, um ein phänotypisches
Merkmal für
die Auswahl von transformierten Zellen bereitzustellen, z. B. Dihydrofolatreductase
oder Neomycin-Resistenz.
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Die
hämatopoetischen
Progenitorzellen können
durch andere, aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen
transfiziert werden. Zu derartigen Maßnahmen gehören (ohne Beschränkung hierauf)
die durch Calciumphosphat oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion;
die durch das Polykation Polybrene vermittelte Transfektion; die
Protoplastenfusion; die Elektroporation; Liposomen, entweder durch
Einkapselung von DNA oder RNA in Liposomen, wonach sich die Fusion
der Liposomen in der Zellmembran anschließt, oder DNA, die mit einem
synthetischen kationischen Lipid beschichtet ist, kann in Zellen
durch Fusion eingeführt
werden.
-
Ferner
ist es möglich,
humane hämatopoetische
Progenitorzellen gentechnisch so zu manipulieren, dass sie in vitro
oder in vivo Osteoklasten erzeugen, die Polypeptide, Hormone und
Proteine erzeugen, die normalerweise nicht in humanen Osteoklasten
in biologisch signifikanten Mengen gebildet werden oder nur in geringen
Mengen gebildet werden und zwar in Situationen, bei denen die regulatorische
Expression einen therapeutischen Nutzen ergibt. Beispielsweise können die
hämatopoetischen
Stammzellen mit einem Gen manipuliert werden, das ein Molekül exprimiert,
das spezifisch die Knochenresorption hemmt, jedoch nicht anderweitig
Osteoklasten, die Knochen binden, stört. Alternativ können die
Zellen so modifiziert werden, dass ein Protein, das normalerweise
exprimiert wird, in wesentlich geringeren Konzentrationen exprimiert
wird. Diese Produkte werden sodann in das umgebende Medium sezerniert
oder aus den Zellen gereinigt. Die auf diese Weise gebildeten humanen
Osteoklastenzellen können
als ständige
Kurzzeit- oder Langzeit-Produktionssysteme
der exprimierten Substanz dienen.
-
Diese
Technik kann zur Erzeugung von zusätzlichen Kopien von essentiellen
Genen herangezogen werden, um eine verstärkte in vivo-Expression bestimmter
Genprodukte durch die Osteoklasten zu ermöglichen. Diese Gene können sich
beispielsweise auf Hormone, Matrixproteine, Zellmembranproteine,
Cytokine, Haftmoleküle
und "Aufbau"-Proteine, die bei
der Gewebereparatur von Bedeutung sind, beziehen. Die in vivo-Expression des exogenen
genetischen Materials wird häufig
als "Gentherapie" bezeichnet. Zu Krankheitszuständen und
Verfahren, bei denen derartige Behandlungen Anwendungen finden,
gehören
genetische Störungen
und Erkrankungen von Knochen und Immunsystem. Die Abgabe der transformierten
Zellen kann unter Anwendung verschiedener Verfahren erfolgen. Hierzu
gehören
die Infusion oder die direkte Depotinjektion in das Periosteum,
das Knochenmark und subkutane Stellen.
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Ferner
können,
wie vorstehend beschrieben, die transduzierten Zellen für die in
vitro-Erzeugung von einem oder mehreren erwünschten Proteinen verwendet
werden. Die transduzierten Zellen können ferner bei Screeningtests
zur Auffindung von Arzneistoffen verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die hämatopoetischen
Stammzellen mit einem retroviralen Vektor transduziert, der ein
Calcium-Responsives-Element,
einen Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-Promotor und eine
für einen
Antiosteoklastenfaktor kodierende cDNA enthält.
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Nach
Modifikation der hämatopoetischen
Zellen auf die hier beschriebene Weise und nach Induktion der Differenzierung
zu Osteoklasten kann das Gemisch aus hämatopoetischen Zellen, Osteoklasten
und mesenchymalen Stammzellen aufgetrennt werden, um eine Population
von Zellen zu erhalten, die weitgehend aus den transduzierten Osteoklasten
besteht. Dies kann durch positive und/oder negative Selektion von
transduzierten hämatopoetischen
Zellen unter Verwendung von Antikörpern zur Identifikation von
hämatopoetischen
Zelloberflächenmarkern
erreicht werden.
-
Die
vorstehende Beschreibung der Erfindung und die folgenden Beispiele
dienen lediglich der Erläuterung.
Weitere Abänderungen
und Praktiken der Erfindung ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres
bei Berücksichtigung
der vorstehenden Ausführungen
in Verbindung mit den beigefügten
Zeichnungen. Daher fallen derartige Abänderungen und Variationen unter
den Umfang der vorliegenden Erfindung.
-
Beispiele
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Statistische Analyse:
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Sämtliche
Daten wurden durch einen paarweisen t-Test analysiert. Proben wurden
in Dreifachversuchen bearbeitet. Bei den Daten handelt es sich um
Mittelwerte ± Standardabweichung
(SE).
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Beispiel 1
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Zellisolierung:
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Knochenmarkproben
wurden von gesunden humanen Spendern an der Johns Hopkins-Universität gemäß einem
vom Institutional Review Board gebilligten Verfahren gewonnen. Mesenchymale
Stammzellen (MSCs) wurden isoliert und gemäß bekannten Verfahren gezüchtet (Majumdar
et al., 1998). Nachdem die Kulturen 90% Konfluenz erreicht hatten,
wurden anhaftende Zellen durch Zugabe einer Lösung mit einem Gehalt an 0,25%
Trypsin-EDTA (Life Technologies) gewonnen und in einer Dichte von
1 × 106 Zellen pro 185 cm2-Kolben
als Passage 1-Zellen ausgestrichen.
-
CD34+-Zellen, die aus Knochenmark von gesunden
Patienten isoliert worden waren, wurden von der Fa. Poietic Technologies,
(Gaithersburg, MD) erhalten. Sie wurden einer Immunoreinigung auf
eine Reinheit von 95% unterzogen, wobei Antikörper gegen CD34, der an magnetische
Perlen konjugiert war, verwendet wurde (CD34+-Zelltrennsäule: Miltenyi
Biotec, Auburn, CA, Ab: QBEND.10). Anschließend wurde eine Kryokonservierung
durchgeführt.
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Gemeinsame Kulturen:
-
MSCs
einer frühen
Passage (2 bis 3) wurden in einer Dichte von 3 × 103 Zellen
pro cm2 ausgestrichen und bis zur Subkonfluenz
in DMEM-LG+10% FBS gezüchtet.
CD34+-Zellen wurden sodann in einer Dichte
von 5 × 104 Zellen pro cm2 zu
den MSC-Kulturen gegeben. Die Kulturen wurden 3 Wochen bei 37°C in einer
Atmosphäre
von 95% Luft/5% CO2 gehalten und alle 3
Tage mit Medium versorgt. Da der Großteil der CD34+-Zellen
nicht haften blieb, wurde die Hälfte
des Kulturmediums vorsichtig abgesaugt, ohne nicht-haftende Zellen zu
bewegen, und durch frisches Medium ersetzt.
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TRAP-Färbung:
-
Nach
3 Wochen wurden die Zellen in 60% Aceton in Citratpuffer (pH-Wert
5,4) 30 Sekunden fixiert, 2-mal mit destilliertem Wasser gewaschen,
an der Luft getrocknet und auf gegen Tartrat beständige saure Phosphatase
(TRAP), einem verbreiteten zytochemischen Marker für Mäuse-Osteoklasten
(Wijngaert und Burger, 1986) gefärbt,
wobei ein handelsübliches
Kit (Sigma, St. Louis, MO) verwendet wurde. Gefärbte Kulturen wurden unter
einem Lichtmikroskop in einer 200-fachen Vergrößerung geprüft. TRAP-positive (Rotfärbung),
mehrkernige (drei oder mehr Kerne) Osteoklasten in jeder Vertiefung
wurden durch manuelles Scanning über
die gesamte Vertiefung in systematischer Weise gezählt (Mbalaviele
et al., 1998).
-
CD34+-Zellen, die in Abwesenheit von MSCs oder
Cytokinen/Wachstumsfaktoren gezüchtet
worden waren, bildeten keine mehrkernigen Zellen, die gegen Tartrat
beständige
saure Phosphatase exprimierten (TRAP+MNCs) (1A).
MSCs unterstützten
die Differenzierung von gemeinsam gezüchteten CD34+-Zellen zu
Osteoklastenzellen (1B). Im Gegensatz
dazu bewirkten humane Hautfibroblasten (SK1087-Zellen) oder humane
Nierenzellen (293T) nicht die Untersützung der Bildung von TRAP+MNCs
(1C bzw. 1D).
Die Behandlung von CD34+-Zellen mit IL-1,
IL-3 und GM-CSF in Abwesenheit von MSCs führte zur Bildung von Osteoklastenzellen,
wobei die Anzahl dieser Zellen jedoch geringer waren als jene in
CD34+/MSCs-Cokulturen (Daten nicht aufgeführt).
-
Beispiel 2
-
Immunozytochemie:
-
CD34+-Zellen und MSCs, die gemeinsam 3 Wochen
gezüchtet
worden waren, wurden in einer frischen Lösung von 3,7% (Gew./Vol.) Formaldehyd
in PBS fixiert, mit 1,5% Pferdeserum blockiert, mit dem monoklonalen
Antikörper
gegen humanes Integrin ανβ3 (Dr.
Horton, The Rayne Institute, London, England) in einer 1:50-Verdünnung in
PBS mit einem Gehalt an 0,15% Pferdeserum inkubiert. Die Zellen
wurden sodann mit Glucose-oxidase-konjugiertem sekundärem Ziegen-Antikörper unter
Verwendung des Vectastain-ABC-GO-Kits (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA) inkubiert. Sämtliche
Inkubationen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach
sich 3 Waschvorgänge
mit PBS anschlossen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Osteoklastenzellen (schwarzer Pfeil) und ihre Vorläufer (Pfeilkopf)
wurden durch Vitronectin-Rezeptor-Antikörper, jedoch nicht durch den
Kontrollantikörper
gefärbt.
MSCs zeigten keinerlei Färbung
mit dem Rezeptor-Antikörper.
Mehrkernige Zellen, die geringe Konzentrationen an Vitronectin-Rezeptoren
exprimierten, waren in gemeinsamen Kulturen zu sehen (2B, weißer Pfeil).
-
RNA-Präparation
und RT-PCR:
-
Die
gesamte RNA wurde aus MSC-Kulturen oder Cokulturen von CD34+ und MSCs unter Verwendung des High Pure-RNA-Isolationskits der
Fa. Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) extrahiert. Die PCR wurde für 30 Zyklen
an revers transkribierter, einzelsträngiger cDNA aus Gesamt-RNA
(1 μg) unter
Anwendung des GeneAmp-RT-PCR-Verfahrens unter den vom Vertreiber
(Perkin Elmer, Foster City, CA) angegebenen Bedingungen mit den
folgenden Modifikationen durchgeführt: Denaturierung 20 Sekunden
bei 95°C,
Annealing 20 Sekunden bei 55°C,
Polymerisation 30 Sekunden bei 72°C
und Elongation 10 Minuten bei 72°C.
Die strangaufwärtigen
und strangabwärtigen
Primer wurden folgendermaßen
konstruiert: TRAP: 5'-CGATCACAATCTGCAGTACC-3' (SEQ ID NO: 1) und
5'-ACCCAGTGAGTCTTCAGTCC-3' (SEQ ID NO: 2),
PCR-Produktgröße = 150
bp; Calcitonin-Rezeptor (CTR): 5'-TTTCCAGGGCTTCTTTGTT-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-CTTGGTTGTTGGCTGGTTC-3' (SEQ ID NO: 4),
PCR-Produktgröße = 205
bp. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese an 1% Agarose
der Größenfraktionierung
unterworfen.
-
Die
RT-PCR-Analyse zeigte eine Expression von TRAP und Calcitonin-Rezeptoren durch
Zellen, die von CD34+-Zellen abgeleitet
waren, d. h. der Osteoklastenlinie (Bahnen 2 und 3 von 3).
-
Diese
Proteine wurden durch MSCs nicht exprimiert.
-
Beispiel 3
-
Test auf Bildung von Löchern:
-
Um
die Anwesenheit von Osteoklastenzellen in den Kulturen zusätzlich zu
bestätigen,
wurde die Fähigkeit
der in Cokulturen von CD34+-Zellen und MSCs
zur Bildung von Löchern
(Pits) (ein Hinweis auf die osteoklastische Knochenresorption) geprüft. Geglättete Scheiben
von Elephantenstoßzähnen wurden
mit "200-proof" Ethanol sterilisiert,
an der Luft getrocknet und mehrmals mit PBS gewaschen. MSCs wurden
in einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro cm2 auf
den Stoßzahnscheiben
(4 × 4 × 0,1 mm)
in Platten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen und 1 Woche in hMSC-Medium
vom pH-Wert 7,4 gezüchtet.
Sodann wurden CD34+-Zellen in einer Dichte
von 5 × 104 Zellen pro cm2 zugegeben.
Ein künstliches
Knochenanaloges, nämlich
osteologische Scheiben (Millenium Biologix Inc., Ontario, Kanada),
wurde zur Bestimmung der optimalen Testbedingungen verwendet. Am
Ende der 3-wöchigen
Züchtungsperiode
wurden Zellen auf den Scheiben auf TRAP gefärbt, gezählt, sodann mit 0,1 M NaOH
in Wasser entfernt und einer 2-minütigen Ultraschallbehandlung
unterzogen. Die Knochenscheiben wurden 5 Minuten mit 1% Toluidinblau,
das in destilliertem Wasser mit einem Gehalt an 1% Natriumborat
zubereitet worden war, gefärbt.
Die Anzahl der Löcher
wurde gemäß Literaturangaben
(Prallet et al., 1992) unter dem Lichtmikroskop gezählt. Authentische
Resorptionspits wurden sowohl am Knochenanalogen als auch an den
Elephanten-Stoßzahnscheiben
festgestellt, wenn CD34+-Zellen gemeinsam mit MSCs gezüchtet wurden
(4).
-
Beispiel 4
-
Einflüsse
von Zell-Zell-Wechselwirkungen:
-
CD34+-Zellen und MSCs wurden entweder im gleichen
Kompartiment (Kontakt-Cokulturen) oder in zwei verschiedenen Kompartimenten
(Nicht-Kontakt-Cokulturen) unter Trennung durch Kultur-Proof Inserts mit
einer porösen
0,45 μm-Membran
(Becton Dickinson, Redford, MA) gezüchtet, um physikalische Zell-Zell-Wechselwirkungen
zu untersuchen. Die in 5A dargestellten
Ergebnisse zeigten, dass Osteoklastenzellen in den Kontaktkulturen
gebildet worden waren und etwa zwei Drittel weniger Osteoklastenzellen
in den Nicht-Kontakt-Kulturen
gebildet worden waren, unabhängig
davon, in welchem Kompartiment (oben oder unten) die MSCs oder CD34+-Zellen überimpft
wurden.
-
Beispiel 5
-
Wechselwirkungen durch sezernierte Faktoren:
-
CD34+-Zellen wurden mit MSCs gemeinsam gezüchtet. Konditionierte
Medien wurden nach 2 Tagen aus MSCs, die in Abwesenheit oder Gegenwart
von CD34+-Zellen gezüchtet worden waren, gewonnen.
Die Proteinkonzentrationen der Cytokine IL-1α, IL6, IL-11, des Granulozyten/Makrophagen-Kolonienstimulationsfaktors
(GM-CSF) und des Leukämie-Hemmfaktors
(LIF), die in die Cokultur von hämatopoetischen
Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen sezerniert worden waren,
wurden unter Verwendung eines Quantikine-Kits (R & D Systems, Minneapolis,
MN) gemessen.
-
5B zeigt die Konzentrationen an IL-6,
IL-11 oder LIF in Cokulturen von CD34+-Zellen
und MSCs. Die Konzentrationen an IL-1α und GM-CSF waren nicht nachweisbar.
Die Konzentrationen von IL-6 und LIF waren in Cokulturen von MSCs
und CD34+-Zellen etwa 10-fach höher als
in MSC-Kulturen ohne CD34+-Zellen. Die Konzentrationen
an IL-1α und
GM-CSF waren nicht nachweisbar.
-
Referenzbeispiel 6
-
Einflüsse
von osteogenen MSCs (differenzierte MSCs):
-
Die
osteogene Differenzierung von MSCs wurde durch Behandlung von MSCs
mit osteogenem Supplement (OS) mit einem Gehalt an 100 mM Dexamethason,
10 mM β-Glycerophosphat und
50 μM L-Ascorbinsäure-2-phosphat
für 2,
3, 4, 5, 10 oder 13 Tage induziert. Bei der gemeinsamen Züchtung mit
CD34+-Zellen wurde das OS enthaltende Medium
durch Medium ohne OS ersetzt. Die 6A und 6B zeigen, dass osteogene MSCs die TRAP+MNC-Bildung
im Vergleich zu MSCs hemmten. 6C zeigt
die Konzentrationen an IL-6, IL-11 oder LIF in Cokultur. Die Konzentrationen
an IL-6, IL-11 und LIF waren in Cokulturen von MSCs mit CD34+-Zellen höher als in Cokulturen von osteogenen
MSCs und CD34+-Zellen.
-
RNA-Präparation
und RT-PCR:
-
Die
Isolierung der gesamten RNA und die RT-PCR-Analyse wurden gemäß den Angaben
von Beispiel 2 durchgeführt.
Es handelte sich um die folgenden stromaufwärtigen und stromabwärtigen Primer:
für OPG 5'-ACCACTACTACACAGACAGC-3' (SEQ ID NO: 5) und
5'-AGGAGACCAAAGACACTGCA-3' (SEQ ID NO: 6);
für OPGL
5'-TTCTATTTCAGAGCGCAGAT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-AGTCATGTTGGAGATCTTGG-3' (SEQ ID NO: 8).
-
6D zeigt, dass die Behandlung von MSCs
mit OS für
4, 8 oder 15 Tage die Expression von OPGL-mRNA verringerte. Im Gegensatz
dazu wurde durch eine Behandlung von MSCs mit OS für 4, 8 oder 15
Tage die Expression von OPG-mRNA erhöht.
-
Beispiel 7
-
Transduktion von CD34+-Zellen:
-
Die
Konstruktion des retroviralen Vektors MGIN, der das verstärkte grün fluoreszierende
Protein (EGFP)-Gen exprimiert und die Herstellung der retroviralen Überstände wurden
in der Literatur beschrieben (Cheng et al., 1997). Kurz zusammengefasst,
MGIN ist ein muriner, embryonaler Stammzellen-Virus-basierter Vektor
mit einem Gehalt an dem EGFP-Gen und der internen Ribosomeneingangsstelle
(IRES). Amphotrope Überstände, die
durch PA317-Verpackungszellen erzeugt worden waren, wurden von ausgewählten Erzeugern
nach Infektion durch BOSC23-ökotrope
virale Vorratsprodukte (viral stocks) hergestellt. Zur Transduktion wurden
vorher eingefrorene Vektorüberstände im Verhältnis von
1:1 mit Medium mit einem Gehalt an CD34+-Zellen
in Gegenwart von 8 μg/ml
Polybrene (Sigma, St. Louis, MO), Interleukin-3 (IL-3) und IL-6
(jeweils 10 ng/ml), Stammzellenfaktor (SCF) und Flk2 (FL) (jeweils
100 ng/ml) vermischt. Kontrollzellen wurden mit EGFP-nicht-exprimierendem
Vektor transduziert. Das Transduktionsgemisch wurde sodann bei 32–35°C mit 1800
g zentrifugiert. Nach 4-stündiger "Spinoculation" wurden die Zellen
1-mal gewaschen und 24 Stunden in Medium mit einem Gehalt an den
vorgenannten Wachstumsfaktoren gezüchtet. Anschließend wurde
die Transduktion 1-mal wiederholt. Eine Zellfraktion wurde durch
Fließzytometrie
zum Testen des Transduktionswirkungsgrads analysiert, während die
restlichen Zellen für
den Osteoklastogenese-Test verwendet wurden. Die transduzierten
CD34+-Zellen wurden 3 Wochen ohne zusätzliche
Faktoren der Cokultur unterzogen. Die Cokulturen wurden auf TRAP
gemäß den Angaben
in Beispiel 1 gefärbt.
Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis von
EGFP oder unter einem Lichtmikroskop zum Nachweis von TRAP sichtbar gemacht.
-
Die
Ergebnisse der fließzytometrischen
Analyse sind in 7 dargestellt. Die FACS-Analyse
zeigte, dass 30% der CD34+-Zellen, die mit
dem EGFP-Vektor transduziert worden waren, das Transgen exprimierten (7B). Cokulturen von transduzierten CD34+-Zellen mit MSCs ergaben Osteoklasten, die
sowohl EGFP (7C) als auch TRAP (7D) exprimierten.
-
Beispiel 8
-
Nachweis des Vitronectin-Rezeptors durch
ELISA:
-
MSCs
wurden in einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro cm2 ausgestrichen
und in hMSC-Medium bis zur Subkonfluenz gezüchtet. Sodann wurden CD34+-Zellen in einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen pro cm2 zu
den MSC-Kulturen gegeben. Die Kulturen wurden 1, 2 oder 3 Wochen
aufrechterhalten. Sodann wurden die Zellen mit 3,6% Formaldehyd
fixiert und 30 Minuten mit 10% Ziegenserum blockiert, wonach sich
eine Inkubation mit dem Antikörper
gegen den Vitronectin-Rezeptor (ανβ3)
anschloss. Unter gründlichem
Waschen zwischen den Zugaben wurde ein mit Biotin markierter sekundärer Antikörper zugegeben
(Ziegen-anti-Maus-IgG;
Pierce, Rockford, IL), wonach die Zugabe von mit Streptavidin konjugierter β-Galactosidase
(Gibco BRL) für
1 Stunde folgte. Das lösliche
Substrat Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid
(CPRG, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde sodann zugegeben.
Die Farbentwicklung wurde nach 30 Minuten bei 570 nm abgelesen.
Primäre Kontrollantikörper wurden
für jede
Behandlung ebenfalls mitgeführt.
Diese Hintergrundmessung wurde von den Ablesungen für die einzelnen
Vertiefungen subtrahiert. Die ELISA-Ergebnisse sind in 8 als
durchschnittliche Absorptionseinheiten nach Subtraktion des Hintergrunds
dargestellt. Der Vitronectin-Rezeptor (ανβ3)
wurde durch den spezifischen Antikörper, jedoch nicht durch den
Kontrollantikörper
nachgewiesen (8A). Die ανβ3-Expression
durch die Osteoklasten-Zelllinie wurde nach 1-wöchiger Cokultur induziert. Durch
MSCs erfolgte eine geringere Expression (8B).
-
Beispiel 9
-
Hämatopoetische
Stammzellen als therapeutische Ziele:
-
Hämatopoetische
Stammzellen (HSCs) wurden mit einem retroviralen Vektor, der ein
Calcium-Responsives-Element, den Tartrat-resistente saure Phosphatase
(TRAP)-Promotor und eine cDNA, die für den Antiosteoklastenfaktor
(antisense, Inhibitor, apoptotischer Faktor) kodierte, transduziert
(vergl. 8). Der TRAP-Promotor wurde
zum spezifischen Abzielen auf die Osteoklastenzellinie verwendet.
Transduzierte HSCs werden osteoporotischen Patienten infundiert.
Sie gelangen ins Knochenmark, nisten sich ein und differenzieren
zu Osteoklasten. Die Osteoklasten reagieren auf hohe lokale Calciumkonzentrationen,
die durch eine übermäßige Knochenresorption
entstehen (Stufe 1 und 2) durch Expression eines Antiosteoklastenfaktors
(Stufe 3), der die Osteoklastenaktivität stoppt (Stufe 4). Ein derartiger
Faktor ist Osteoprotegerin (OPG), von dem gezeigt wurde, dass er
bei Sekretion die Knochenresorption (Osteopetrose) verringert und
offensichtlich allgemein die Osteoklastogenese blockiert (Simonet,
1997).
-
Die
transduzierten hämatopoetischen
Zellen können
auch ex vivo zur Differenzierung zu Osteoklasten induziert und sodann
osteoporotischen Patienten infundiert werden.
-
Das
Calcium-Responsive-Element(CaRE) wurde unter der Kontrolle des CMV-Promotors
in den pGL3-Vektor kloniert, der Luciferase als Reportergen (Promega,
Madison WI) enthält,
wodurch man pGL3-CaRE erhielt. pGL3 oder pGL3-CaRE wurden in die
humane Nierenzellinie 293T unter Anwendung des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens
transfiziert. Die Zellen wurden sodann in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen
an Calcium gezüchtet.
Die Luciferase-Aktivität
wurde unter Verwendung des Dual-LuciferaseR-Reportertestsystems (Promega) bestimmt.
Die Daten zeigen, dass Calcium in einer geringen Konzentration von
0,1 mM die Luciferase-Aktivität in pGL3-CaRE,
jedoch nicht in pGL3 induziert (9B).
-
Beispiel 10
-
Einfluss von Serum im Kulturmedium:
-
Cokulturen
von MSCs und CD34+-Zellen wurden zur Bestimmung des Einflusses
von Serum auf die Erzeugung von Osteoklasten untersucht. Cokulturen
von CD34+-Zellen und MSCs wurden unter den
vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet, jedoch handelte es sich
bei dem getesteten Medium um DMEM mit geringem Glucosegehalt und
10% FBS und um DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Serum. Kontrollkulturen
enthielten Zellen der humanen Nierenzelllinie 293 in Cokultur mit
CD34+-Zellen
in DMEM mit hohem Glucosegehalt mit und ohne Serum. Die Kulturen
wurden nach 12 Tagen anstelle von 21 Tagen wie in den vorstehenden
Beispielen, beendet.
-
Die
in 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die gemeinsame
Züchtung
von MSCs und CD34+-Zellen in DMEM mit hohem
Glucosegehalt ohne FBS zu einer höheren Anzahl an Osteklasten
als eine Cokultur in üblichem
DMEM-LG mit einem Gehalt an 10% FBS führte.
-
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