DE69937347T2 - Regulierung der hämatopoietischen stammzelldifferenzierung durch verwendung von menschlichen mesenchymalen stammzellen - Google Patents

Regulierung der hämatopoietischen stammzelldifferenzierung durch verwendung von menschlichen mesenchymalen stammzellen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft hämatopoetische Stammzellen und insbesondere ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen zu einer festgelegten Osteoklastenlinie in Abwesenheit von exogenen, die Osteoklastogenese induzierenden Faktoren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung genetisch modifizierte hämatopoetische Stammzellen in Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen, so dass dann, wenn die hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklasten differenzieren, die Osteoklasten zur Expression des Produkts des transduzierten Gens befähigt sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Osteoklasten sind endgültig differenzierte hämatopoetische Zellen, die für die physiologische Knochenresorption verantwortlich sind. Eine Funktionsstörung der Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten ist die Ursache einer Vielzahl von humanen metabolischen Knochenkrankheiten, einschließlich Osteoporose (bezüglich eines Übersichtsartikels wird verwiesen auf Teitelbaum et al., 1995). Osteoporose oder progressiver Knochenverlust wird auf eine Verschiebung des kritischen Gleichgewichts von Osteoklasten- und Osteoblastenaktivitäten, die für einen einwandfreien Skelettzustand verantwortlich sind, zurückgeführt. Osteoblasten, die Knochen bilden, sind eine endgültig differenzierte Linie, die auf mesenchymale Stammzellen zurückgeht.
  • Hämatopoetische Progenitorzellen im Knochenmark werden unter dem Einfluss von lokalen regulatorischen Faktoren zur Bildung der Osteoklasten-Zelllinie gesteuert. Verschiedene Zelltypen, einschließlich stromale Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) entstehen, sind im Knochenmark vorhanden. Von stromalen Zellen wurde gezeigt, dass sie Faktoren erzeugen, die die Osteoklasten-Physiologie regulieren (bezüglich eines Übersichtsartikels wird verwiesen auf Mundy et al., 1995). Histologische Knochenbilder zeigen eine enge Nähe zwischen stromalen und hämatopoetischen Zellen im Knochenmark. Ferner ist die Beziehung zwischen dem differenzierten Zustand von stromalen Knochenmarkzellen und ihrem Potential zur Regulierung von benachbarten Osteoklasten-Vorläuferzellen nur schlecht dokumentiert. Die Bedeutung von heterotypischen Zell-Zell- Wechselwirkungen, die durch Cadherin-6 zwischen stromalen Zellen und Osteoklasten-Progenitorzellen bei Verwendung eines Mäusemodells der Osteoklastogenese vermittelt werden, wurde beschrieben (Mbalaviele et al., 1998). Mehrere Studien haben belegt, dass für die Osteoklasten-Differenzierung die Anwesenheit von Stroma/Osteoblastenzellen erforderlich ist (Takahashi et al., 1988; Mbalaviele et al., 1995). Neuere Studien unter Verwendung von Zellen, die von Nagetier-Knochenmark abgeleitet sind, haben gezeigt, dass der an der Membran von stromalen Zellen exprimierte Osteoprotogerin-Ligand (OPGL) einen Schlüsselfaktor der Osteoklastogenese darstellt (Lacey et al., 1998; Kong et al. 1999). Es wurde jedoch auch berichtet, dass Progenitorzellen in Gegenwart von Cocktails von Cytokinen zu humanen Osteoklastenzellen differenzierten und dass stromale Zellen nicht erforderlich waren (Matayoshi et al., 1996). Die Bildung von humanen Osteoklastenzellen (Ocl), die eine knochenresorbierende Aktivität aufweisen, wurde beschrieben (Takahashi et al., 1995; James et al., 1996; Sarma et al., 1996; Quinn et al., 1997), jedoch sind kritische Ereignisse, die während der Osteoklastogenese ablaufen, noch unklar.
  • Ferner haben Studien gezeigt, dass Osteoklasten in Cokulturen von Osteoblasten/Stromazellen mit hämatopoetischen Zellen erzeugt werden (Martin und Ng, Journal of Cellular Biochemistry, Bd. 56 (1994), S. 357–366).
  • Bei Knochen handelt es sich um eine Verbundmatrix, die sowohl aus anorganischen als auch aus organischen Elementen besteht. Die organische Phase enthält Proteine, während die anorganische Komponente Calciumsalze enthält. Es ist bekannt, dass während der osteoklastischen Knochenresorption eine Auflösung der anorganischen Phase der Auflösung der organischen Phase vorausgeht und dass hohe Konzentrationen an Calcium (> 40 mM) lokal aus der Knochenmatrix freigesetzt werden. Erhöhte Calciumkonzentrationen üben wiederum eine negative Rückkoppelung auf die Osteoklastenfunktion aus, wobei es sich um einen regulatorischen Mechanismus zur Verhinderung einer übermäßigen Knochenresorption handelt. Von Calcium ist bekannt, dass es die Expression mehrerer Gene reguliert. Kürzlich wurde ein Calcium-Reaktionselement, das die Expression des humanen Keratin-1-Gens nach Einwirkung von extrazellulärem Calcium (0,6 mM) auf Keratinozyten verstärkt, charakterisiert.
  • Osteoklasten lassen sich aufgrund ihrer geringen in vivo-Zellzahl, ihrer Fragilität und ihrer Tendenz zur Haftung an anderen Knochenzellen nicht leicht isolieren. Somit besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur wirksamen Erzeugung von großen Mengen an Osteoklasten, um beispielsweise die Entwicklung von wirksamen Therapeutika, die auf eine Verhinderung der abnormalen Osteolyse abzielen, zu erleichtern.
  • Demzufolge besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens zur in vitro-Erzeugung von Osteoklasten.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur in vitro-Herstellung und -Aufrechterhaltung von Osteoklasten ohne die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren in ausreichender Anzahl, um eine ständige Quelle von Osteoklasten bereitzustellen, beispielsweise zur Verabreichung von Osteoklasten an ein Individuum, das einen entsprechenden Bedarf aufweist.
  • Demzufolge besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Regulierung der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklastenzellen in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Hormonen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Osteoklasten aus genetisch modifizierten hämatopoetischen Zellen, so dass dann, wenn die hämatopoetischen Zellen zu Osteoklasten differenzieren, die Osteoklasten das Genprodukt von Interesse exprimieren.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklastenzellen unterstützen.
  • Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Induktion der in vitro-Differenzierung von hämatopoetischen Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen bereitgestellt, das das gemeinsame Züchten der hämatopoetischen Zellen mit humanen mesenchymalen Stammzellen umfasst.
  • Wenn hämatopoetische Progenitorzellen gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet wurden, differenzierten die hämatopoetischen Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen, die durch die Expression von Markern identifiziert wurden, die charakteristisch für Osteoklasten sind, wozu die Mehrkernigkeit, die Calcitonin- und Vitronectin-Rezeptoren und insbesondere die Knochenresorptionsaktivität gehören.
  • Ferner wurde festgestellt, dass die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen in Abwesenheit von exogenen (zugesetzten) Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Hormonen, von denen bekannt ist, dass sie für die Induktion der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen erforderlich sind, erfolgte.
  • Demgemäß wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung von Osteoklasten bereitgestellt, das das gemeinsame Züchten von mesenchymalen Stammzellen mit hämatopoetischen Stammzellen umfasst. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen gemeinsam im gleichen Kulturgefäß gezüchtet, so dass physikalische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen den hämatopoetischen Progenitorzellen und den mesenchymalen Stammzellen ablaufen.
  • Ferner wurde festgestellt, dass dann, wenn hämatopoetische Stammzellen, die so modifiziert worden sind, dass sie exogenes genetisches Material von Interesse tragen, gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet werden, die transduzierten hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklasten differenzierten, die ebenfalls das neue genetische Material trugen. Diese transduzierten Osteoklastenzellen sind zur Expression des exogenen Genprodukts befähigt. Transduzierte Osteoklasten-Progenitorzellen und die daraus differenzierten Osteoklasten können für Anwendungen eingesetzt werden, bei denen sich eine Behandlung unter Verwendung von derartigen modifizierten Osteoklasten als vorteilhaft erweist, z. B. bei der Linderung der Auswirkungen von Osteoporose.
  • Demzufolge wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Gewinnung von genetisch modifizierten Osteoklasten bereitgestellt, das das Transduzieren von hämatopoetischen Progenitorzellen mit exogenem genetischem Material und das Einwirken von Bedingungen auf die transduzierten hämatopoetischen Zellen, die zur Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklastenzellen, die das exogene genetische Material enthalten, geeignet sind, umfasst.
  • Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Osteoklasten das gemeinsame Züchten von transduzierten hämatopoetischen Stammzellen mit mesenchymalen Stammzellen, so dass nach Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen zu Osteoklasten, die Osteoklasten ebenfalls das exogene genetische Material enthalten.
  • Die Erfindung betrifft ferner hämatopoetische Stammzellen, die mit einem Polynucleotid transduziert worden sind, das für ein Produkt kodiert, das die Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten herunterreguliert, sowie deren Verwendung.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform reguliert das exprimierte Genprodukt die Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten herunter. Hämatopoetische Stammzellen werden mit einem retroviralen Vektor transduziert, der ein Tandem aus einem Calcium-Responsiven-Element, den Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-Promotor (spezifisch in Osteoklasten exprimiert) und eine Nucleinsäuresequenz, die für einen Antiosteoklasten-Aktivitätsfaktor (z. B. eine antisense-Sequenz gegen M-CSF, IL1 oder IL6; einen Inhibitor, wie einen intrazellulären Antikörper gegen IL6, gegen M-CSF, gegen GM-CSF, gegen IL1 oder gegen Leukämie-Inhibitorfaktor; oder einen apoptotischen Faktor) kodiert, enthält. Die Expression dieser Sequenz wird durch die lokale Zunahme der Calciumkonzentration aufgrund der osteoklastischen Knochenresorption ausgelöst.
  • Ferner wurde festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen zwar positiv die Differenzierung von CD34+-Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen regulierten, dass aber MSCs, bei denen die Differenzierung zu osteoblastischen Zellen begonnen hatte, diesen Vorgang hemmten. Es wurde festgestellt, dass in Gegenwart von osteogenen mesenchymalen Stammzellen der Grad der OPGL-Expression abnahm und die Expression von Osteoprotogerin (OPG) zunahm. Somit kommt es ferner in Betracht, dass die Züchtung von hämatopoetischen Stammzellen in Gegenwart von differenzierten mesenchymalen Stammzellen möglicherweise die Differenzierung und/oder Aktivität von Osteoklasten herunterreguliert. Demzufolge können die erfindungsgemäßen, gemeinsam gezüchteten Zellpopulationen als Bestandteil einer Behandlung zur Linderung der Symptome von Osteoporose herangezogen werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A zeigt die TRAP-Färbung von CD34+-Zellen, die in Abwesenheit von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) gezüchtet worden sind.
  • 1B zeigt die TRAP-Färbung von CD34+-Zellen, die in Gegenwart von MSCs gezüchtet worden sind. Zahlreiche mehrkernige TRAP+-Zellen (TRAP+MNCs) (Pfeil) sowie einkernige TRAP+-Zellen wurden in Gegenwart von MSCs gebildet, die als eine konfluente Lage von spindelförmigen Zellen (Pfeilkopf) auftraten. Kleine Pfeile und der Stern zeigen Cluster von Kernen.
  • 1C zeigt die Färbung von CD34+-Zellen, die in Gegenwart von humanen Hautfibroblasten gezüchtet worden sind (SK1087-Zellen; Pfeilkopf). Es wurden keine TRAF+MNCs gebildet.
  • 1D zeigt die Färbung von CD34+-Zellen, die in Gegenwart von huamen Nierenzellen gezüchtet worden sind (293T; Pfeilkopf). TRAP+MNCs wurden nicht gebildet.
  • 2A zeigt die immunocytochemische Färbung von gemeinsamen Kulturen von CD34+ und MSCs mit negativem Kontrollantikörper.
  • 2B zeigt die immunocytochemische Färbung von gemeinsamen Kulturen von CD34+ und MSCs mit Antikörper, der den Vitronectin-Rezeptor erkennt.
  • 3 zeigt die RT-PCR von RNA, die aus gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen (Bahnen 2–3) oder Kulturen von MSCs ohne CD34+-Zellen (Bahnen 4–5) gereinigt worden sind. Calcitonin-Rezeptoren (Bahnen 2 und 4) und TRAP (Bahnen 3 und 5) wurden nur in Proben aus gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen nachgewiesen. Die konservierte und ungespleißte Region der Calcitonin-Rezeptorfamilie wurde zur Konstruktion von Primern gewählt. Bahn 1, 1 kb DNA-Leiter; Unterseite β2-Mikroglobulin.
  • 4A zeigt die Bildung von Löchern (Pits) in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen und MSCs (Pfeile).
  • 4B zeigt die Bildung von Löchern in Kulturen von CD34+-Zellen ohne MSCs.
  • Schnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt und unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Vergrößerung 200-fach.
  • 4C zeigt die quantitative Bestimmung von Löchern in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen und MSCs (ausgefüllter Balken) oder in Kulturen von CD34+-Zellen ohne MSCs (leerer Balken). *p < 0,01 gegenüber Kulturen von CD34+-Zellen ohne MSCs.
  • 5A zeigt die Einflüsse von Zell-Zell-Wechselwirkungen bei der Bildung von Osteoklastenzellen. CD34+-Zellen und MSCs wurden gemeinsam in gleichen Kompartimenten (Kontakt-Cokulturen, ausgefüllter Balken) oder getrennt mittels 0,45 μm-Filtern (Nichtkontakt-Cokulturen) gezüchtet: MSCs oben und CD34+-Zellen unten, leerer Balken; MSCs oben und CD34+-Zellen oben, schraffierter Balken). *p < 0,01 gegenüber Nichtkontakt-Cokulturen.
  • 5B zeigt die quantitative Bestimmung von sezernierten Faktoren (IL-6, IL-11, LIF) in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen mit MSCs. Die Konzentrationen an IL-6 und LIF, jedoch nicht von IL-11, waren etwa 10-fach höher in gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen, verglichen mit MSC-Kulturen ohne CD34+-Zellen.
  • 6A und 6B zeigen die Hemmung von TRAP+MNCs durch osteogene MSCs. Die osteogene Differenzierung von MSCs wurde durch Behandlung mit osteogenem Supplement (OS) für 2, 3, 4, 5, 10 oder 13 Tage vor Zugabe zu CD34+-Zellen induziert. *p < 0,01 gegenüber gemeinsamen Kulturen von OS-behandelten MSCs und CD34+-Zellen.
  • 6C zeigt, dass gemeinsame Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen höhere Konzentrationen an IL-6, IL-11 und LIF erzeugten, als gemeinsame Kulturen von osteogenen MSCs und CD34+-Zellen.
  • 6D zeigt, dass die osteogene Differenzierung von MSCs mit einer Abnahme der OPGL-mRNA-Expression (linkes Feld) und einer Zunahme der OPG-mRNA-Expression (rechtes Feld) verbunden ist.
  • 7A zeigt eine fließzytometrische Analyse von CD34+-Zellen, die mit Kontrollvektoren transduziert sind.
  • 7B zeigt eine fließzytometrische Analyse von CD34+-Zellen, die mit EGFP-Expressionsvektor transduziert sind. Etwa 30% von CD34+-Zellen exprimierten EGFP.
  • 7C zeigt gemeinsame Kulturen von MSCs mit CD34+-Zellen, die mit EGFP-Expressionsvektor transduziert sind. EGFP wurde durch Osteoklasten sowie durch mononukleare Zellen exprimiert.
  • 7D zeigt gemeinsame Kulturen von MSCs mit CD34+-Zellen bei Transduktion mit EGFP-Expressionsvektor unter Färbung auf TRAP. 7D zeigt die Lichtdarstellung von 7C.
  • 8A zeigt die Expression des Vitronectin-Rezeptors (ανβ3), bei Nachweis durch ELISA. ανβ3-Antikörper: Vertiefungen auf der linken Seite und ausgefüllter Balken; Kontroll-IgG: Vertiefungen auf der rechten Seite und leerer Balken.
  • 8B zeigt den zeitlichen Verlauf der Expression von ανβ3. Gemeinsame Kulturen von CD34+-Zellen und MSCs (ausgefüllte Balken) oder MSCs ohne CD34+-Zellen (leere Balken).
  • 9A zeigt eine Strategie zur direkten Regulierung der Osteoklastenaktivität.
  • 9B zeigt, dass die Zugabe von Calcium zu gezüchteten Zellen, die mit einem durch Calcium induzierbaren Expressionssystem transfiziert worden waren, die Expression des Reportergens induzierte.
  • 10 zeigt den Einfluss von Serum im Kulturmedium auf die Erzeugung von Osteoklasten in gemeinsamen Kulturen von MSCs und CD34+-Zellen.
  • 10A zeigt die Osteoklastenzahlen in gemeinsamen Kulturen von CD34+-Zellen und MSCs in DMEM mit geringem Glucosegehalt und 10% FBS, leerer Balken; und in DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Serum, ausgefüllter Balken.
  • 10B zeigt gemeinsame Kulturen von 293-Zellen und CD34+-Zellen in DMEM mit hohem Glucosegehalt und 10% FBS, ausgefüllter Balken; und in DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Serum, schraffierter Balken.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen zur Induktion der Differenzierung von humanen CD34+-Zellen zu Osteoklastenzellen sowie Zusammensetzungen, die humane CD34+-Zellen und humane mesenchymale Stammzellen umfassen. Insbesondere haben die Erfinder festgestellt, dass humane mesenchymale Stammzellen, die in Verbindung mit CD34+-Zellen gezüchtet worden sind, sich zur Induktion der Differenzierung von CD34+-Zellen zu Osteoklasten eignen. Somit können die CD34+-Zellen gehalten und als Quelle für Osteoklasten verwendet werden.
  • Um die vorliegenden humanen mesenchymalen Stammzellen für die hier beschriebenen Verfahren zu erhalten, können mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark oder anderen Quellen für mesenchymale Stammzellen gewonnen werden. Knochenmarkzellen lassen sich aus Darmbeinkamm, Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen, Wirbeln, Rippen oder anderen medulären Räumen erhalten. Zu weiteren Quellen für humane mesenchymale Stammzellen gehören Plazenta, Nabelschnur, Haut von Föten und heranwachsenden Personen und Blut. Die Anwesenheit von mesenchymalen Stammzellen in den Kulturkolonien kann durch spezifische Zelloberflächenmarker verifiziert werden, die durch besondere monoklonale Antikörper identifiziert werden; vergl. z. B. US-Patent 5 486 359 . Diese isolierten mesenchymalen Zellpopulationen zeigen epitope Charakteristika, die nur mit mesenchymalen Stammzellen assoziiert sind; sie besitzen die Fähigkeit zur Regeneration in Kultur ohne Differenzierung; und sie besitzen die Fähigkeit zur Differenzierung zu spezifischen mesenchymalen Linien, wenn sie entweder in vitro oder in vivo an der Stelle des beschädigten Gewebes induziert werden. Von humanen mesenchymalen Stammzellen ist es bekannt, dass sie unter geeigneten Bedingungen einer Differenzierung zu mehrfachen Zelllinien, einschließlich Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten unterliegen (bezüglich eines Übersichtsartikels wird verwiesen auf Caplan et al., 1997).
  • Demzufolge können beliebige Verfahren, die sich zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus humanem Gewebe eignen, eingesetzt werden, um eine Population von Zellen zu erhalten, die in Bezug auf mesenchymale Stammzellen angereichert sind. Gemäß einem Aspekt umfasst das Verfahren zum Isolieren von humanen mesenchymalen Stammzellen folgende Stufen: das Bereitstellen einer Gewebeprobe, die mesenchymale Stammzellen enthält, vorzugsweise Knochenmark; das Isolieren der mesenchymalen Stammzellen aus der Probe, z. B. durch Dichtezentrifugation; das Zugeben der isolierten Zellen zu einem Medium, das Faktoren enthält, die das Wachstum von mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung stimulieren und das selektive Anhaften nur der mesenchymalen Stammzellen an einer Substratoberfläche in Kultur ermöglichen; das Züchten des Gemisches aus Probe und Medium; und das Entfernen der nicht-anhaftenden Bestandteile von der Substratoberfläche.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können beliebige Verfahren, die sich zur Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen aus humanem Gewebe eignen, eingesetzt werden, wodurch man eine Population von Zellen erhält, die vorwiegend aus hämatopoetischen Zellen besteht. Stammzellen lassen sich aus verschiedenen Gewebetypen gewinnen, einschließlich Knochenmark und Blut (unter Einschluss von peripherem Blut). Die humanen hämatopoetischen Stammzellen können aus Knochenmark-Absaugungen oder peripherem Blut gewonnen und unter Anwendung handelsüblicher Antikörper isoliert werden, die an hämatopoetische Stammzellen-Oberflächenantigene, z. B. CD34, binden, wobei man sich dem Fachmann bekannter Verfahren bedient; vergl. beispielsweise US-Patent 4 714 680 . Alternativ können die hämatopoetischen Stammzellen durch Depletion (Verarmung) gewonnen werden, d. h. durch Selektion von Zellen, die an anderen Zellen auftretende Marker exprimieren. Die für diese Verfahren verwendeten Antikörper können mit magnetischen Perlen konjugiert werden oder es können immunogene Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Zelltyps herangezogen werden.
  • Die humanen mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen Stammzellen werden unter geeigneten Kulturbedingungen gemeinsam gezüchtet, so dass die mesenchymalen Stammzellen an einer Substratoberfläche haften und eine Monolager bilden. Die mesenchymalen Stammzellen werden in einer Dichte im Bereich von etwa 3 × 103 bis etwa 5 × 103 Zellen pro cm2 ausgestrichen. Die CD34+-Zellen werden vorzugsweise in einer Zelldichte von etwa 5 × 104 Zellen pro cm2 ausgestrichen.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die isolierten mesenchymalen Stammzellen und die isolierten hämatopoetischen Progenitorzellen, vorzugsweise CD34+-Zellen, jeweils in Kultur in geeigneten Medien expandiert, d. h. durch Verfahren unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Bedingungen gezüchtet, die das Zellwachstum und die Herstellung von homogenen Zellpopulationen begünstigen.
  • Die beiden Zellpopulationen werden sodann gemeinsam in einem Medium gezüchtet, was das Wachstum von humanen mesenchymalen Stammzellen fördert und die Aufrechterhaltung der hämatopoetischen Stammzellen nicht beeinträchtigt. Die Medien sollen auch die CD34+-Zellpopulation aufrechterhalten und die Induktion der Differenzierung von CD34+-Zellen zu Osteoklastenzellen unterstützen. Geeignete Medien sind beispielsweise im US-Patent 5 486 359 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die humanen mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen Stammzellen gemeinsam in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit geringem Glucosegehalt (DMEM-LG #11885, Life Technologies, Gaithersburg, MD) gezüchtet. Das Medium enthält vorzugsweise 10% FBS. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die humanen mesenchymalen Stammzellen und die hämatopoetischen Stammzellen gemeinsam in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (DMEM-HG #11995, Life Technologies, Gaithersburg, MD) ohne FBS gezüchtet.
  • Die nach dem hier beschriebenen Verfahren erzeugten hämatopoetischen Stammzellen können zur Bereitstellung einer zuverlässigen und konstanten Quelle für Osteoklastenzellen verwendet werden. Diese Osteoklasten können bei der Bestimmung der Einflüsse von osteotropen Faktoren auf die Entwicklung und Behandlung von Osteoporose eingesetzt werden. Man nimmt an, dass die leichte Verfügbarkeit von Osteoklasten für Screeningtests für die Entwicklung von kleinen Arzneistoffmolekülen, z. B. auf der Basis der Expression von Integrin-ανβ3-Zelloberflächenrezeptor durch Osteoklasten, wertvoll ist. Es wird angenommen, dass diese Zellen, die nicht in vitro mit Wachstumsfaktoren behandelt worden sind, Eigenschaften aufweisen, die in vivo auftretenden Osteoklasten ähnlicher sind als bisher erhaltene Produkte.
  • Nach Differenzierung der hämatopoetischen Progenitorzellen zu Osteoklastenzellen gemäß den hier gemachten Angaben kann das Gemisch aus hämatopoetischen Progenitorzellen, Osteoklasten und mesenchymalen Stammzellen aufgetrennt werden, um eine Population von Zellen zu erhalten, die weitgehend aus Osteoklastenzellen besteht. Dies kann durch positive und/oder negative Selektion von hämatopoetischen Zellen unter Verwendung von Antikörpern zur Identifizierung von hämatopoetischen Zelloberflächenmarkern oder anderen Zelltypmarkern erfolgen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Einführung von fremden Genen in die hämatopoetischen Progenitorzellen, so dass die Nachkommen der Zellen, die Osteoklasten, das neue genetische Material tragen.
  • Somit können gemäß diesem Aspekt der Erfindung die hämatopoetischen Progenitorzellen mit genetischem Material von Interesse modifiziert werden. Die modifizierten CD34+-Zellen können sodann in vitro gemeinsam mit mesenchymalen Stammzellen gezüchtet und zur Differenzierung zu Osteoklastenzellen induziert werden. Die Osteoklastenzellen sind zur Expression des Produkts der Genexpression oder zur Sekretion des Expressionsprodukts in der Lage. Diese modifizierten Zellen können sodann an ein Zielgewebe, z. B. Knochenmark, verabreicht werden, wo das exprimierte Produkt eine günstige Wirkung ausübt.
  • Die transduzierten hämatopoetischen Progenitorzellen können in vivo zur Differenzierung zu Osteoklasten, die das Genprodukt exprimieren, induziert werden. Beispielsweise können die transduzierten hämatopoetischen Progenitorzellen in Kombination mit mesenchymalen Stammzellen verabreicht werden, um die Erzeugung von Osteoklasten mit dem transduzierten Gen zu induzieren. Die Zellen können sodann im Gemisch miteinander oder getrennt verabreicht werden und an einem Zielbereich abgegeben werden.
  • Somit können Gene in Zellen eingeführt werden, die sodann wieder dem autologen Spender oder einem allogenen Empfänger zugeführt werden, wo die Expression des Gens eine therapeutische Wirkung entfaltet. Beispielsweise können Osteoklasten gentechnisch so manipuliert werden, dass sie eine verringerte in vivo-Aktivität aufweisen. Geeignete Gene umfassen solche, die eine Rolle bei der Regulation der Osteoporose, in Bereichen, wie der Reaktionsfähigkeit auf Serumcalcium, der Östrogensekretion und der Knochenresorption, ausüben.
  • Die hämatopoetischen Stammzellen können in Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen genetisch modifiziert (transduziert, transformiert oder transfiziert) werden, wobei die mesenchymalen Stammzellen den Wirkungsgrad der Gentransduktion der hämatopoetischen Stammzellen erhöhen. Alternativ können die hämatopoetischen Stammzellen in Abwesenheit der humanen mesenchymalen Stammzellen transduziert werden.
  • Die hämatopoetischen Stammzellen können genetisch durch Einverleibung von genetischem Material in die Zellen, z. B. unter Anwendung von rekombinanten Expressionsvektoren, modifiziert werden.
  • Der hier verwendete Ausdruck "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf eine transkriptionelle Einheit, die eine Anordnung folgender Bestandteile umfasst: (1) ein oder mehr genetische Elemente mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, z. B. Promotoren oder Enhancer, (2) eine strukturelle oder kodierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und zu einem Protein translatiert wird, und (3) geeignete Sequenzen zur Initiation und Termination der Transkription. Struktureinheiten, die zur Verwendung in eukaryontischen Expressionssystemen vorgesehen sind, umfassen vorzugsweise eine Leadersequenz, die eine extrazelluläre Sekretion von translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht. Alternativ können die Struktureinheiten dann, wenn ein rekombinantes Protein ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methioninrest umfassen. Dieser Rest kann anschließend vom exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden oder nicht, um ein Endprodukt bereitzustellen.
  • Die humanen hämatopoetischen Progenitorzellen können somit eine in chromosomale DNA in stabiler Weise integrierte rekombinante transkriptionelle Einheit aufweisen oder die rekombinante transkriptionelle Einheit als eine Komponente eines residenten Plasmids tragen. Zellen können beispielsweise ex vivo mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das für ein Polypeptid kodiert, gentechnisch behandelt werden. Zellen können gemäß dem Fachmann geläufigen Verfahren unter Verwendung eines retroviralen Teilchens, das für ein Polypeptid kodierende RNA enthält, manipuliert werden.
  • Zu Retroviren, aus denen die vorerwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) murines Moloney-Leukämie-Virus, Milz-Nekrose-Virus, Retroviren, wie Rous-Sarcoma-Virus, Harvey-Sarcoma Virus, Vogel-Leukose-Virus, Gibbonaffen-Leukämie-Virus, humaner Immunschwächevirus, Adenovirus, myeloproliferativer Sarcoma-Virus und Mamma-Tumor-Virus. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich beim retroviralen Plasmidvektor um MGIN, der von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitet ist. Bezüglich allgemeiner Ausführungen über den retroviral vermittelten Gentransfer wird auf McLachlin et al. (1990) verwiesen.
  • Die für das Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenz steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Zu geeigneten Promotoren, die verwendet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) der TRAP-Promotor, adenovirale Promotoren, wie der adenovirale späte Hauptpromotor (major late promotor), der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, der Promotor des respiratorischen Syncytial-Virus (RSV), induzierbare Promotoren, wie der MMT-Promotor, der Metallothionein-Promotor, Hitzeschockpromotoren, der Albumin-Promotor, der ApoAI-Promotor, humane Globin-Promotoren, virale Thymidin-kinase-Promotoren, wie der Herpes-simplex-Thymidin-kinase-Promotor, retrovirale LTRs, ITRs, der β-Actin-Promotor und humane Wachstumshormon-Promotoren. Beim Promotor kann es sich auch um den nativen Promotor handeln, der das für das Polypeptid kodierende Gen steuert. Diese Vektoren ermöglichen es, die Erzeugung des Polypeptids durch die gentechnisch manipulierten Progenitorzellen zu regulieren. Beispielsweise kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Vektor ein Calcium-Responsives-Element enthalten. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist für den Fachmann ersichtlich.
  • Ferner ist es möglich, Vehikel, die sich von Retroviren unterscheiden, zu verwenden, um die hämatopoetischen Stammzellen genetisch zu manipulieren oder zu modifizieren. Genetische Informationen von Interesse können mittels eines beliebigen Virus eingeführt werden, das das neue genetische Material in derartigen Zellen exprimiert. Beispielsweise können für diesen Zweck SV40, Herpes-Virus, Adenovirus und humanes Papillomavirus verwendet werden. Weitere Verfahren können zur Einführung von klonierten eukaryontischen DNAs in gezüchtete Säugetierzellen herangezogen werden, beispielsweise kann das auf Stammzellen zu übertragende genetische Material in Form von viralen Nucleinsäuren vorliegen.
  • Ferner können die Expressionsvektoren einen oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, um ein phänotypisches Merkmal für die Auswahl von transformierten Zellen bereitzustellen, z. B. Dihydrofolatreductase oder Neomycin-Resistenz.
  • Die hämatopoetischen Progenitorzellen können durch andere, aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen transfiziert werden. Zu derartigen Maßnahmen gehören (ohne Beschränkung hierauf) die durch Calciumphosphat oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion; die durch das Polykation Polybrene vermittelte Transfektion; die Protoplastenfusion; die Elektroporation; Liposomen, entweder durch Einkapselung von DNA oder RNA in Liposomen, wonach sich die Fusion der Liposomen in der Zellmembran anschließt, oder DNA, die mit einem synthetischen kationischen Lipid beschichtet ist, kann in Zellen durch Fusion eingeführt werden.
  • Ferner ist es möglich, humane hämatopoetische Progenitorzellen gentechnisch so zu manipulieren, dass sie in vitro oder in vivo Osteoklasten erzeugen, die Polypeptide, Hormone und Proteine erzeugen, die normalerweise nicht in humanen Osteoklasten in biologisch signifikanten Mengen gebildet werden oder nur in geringen Mengen gebildet werden und zwar in Situationen, bei denen die regulatorische Expression einen therapeutischen Nutzen ergibt. Beispielsweise können die hämatopoetischen Stammzellen mit einem Gen manipuliert werden, das ein Molekül exprimiert, das spezifisch die Knochenresorption hemmt, jedoch nicht anderweitig Osteoklasten, die Knochen binden, stört. Alternativ können die Zellen so modifiziert werden, dass ein Protein, das normalerweise exprimiert wird, in wesentlich geringeren Konzentrationen exprimiert wird. Diese Produkte werden sodann in das umgebende Medium sezerniert oder aus den Zellen gereinigt. Die auf diese Weise gebildeten humanen Osteoklastenzellen können als ständige Kurzzeit- oder Langzeit-Produktionssysteme der exprimierten Substanz dienen.
  • Diese Technik kann zur Erzeugung von zusätzlichen Kopien von essentiellen Genen herangezogen werden, um eine verstärkte in vivo-Expression bestimmter Genprodukte durch die Osteoklasten zu ermöglichen. Diese Gene können sich beispielsweise auf Hormone, Matrixproteine, Zellmembranproteine, Cytokine, Haftmoleküle und "Aufbau"-Proteine, die bei der Gewebereparatur von Bedeutung sind, beziehen. Die in vivo-Expression des exogenen genetischen Materials wird häufig als "Gentherapie" bezeichnet. Zu Krankheitszuständen und Verfahren, bei denen derartige Behandlungen Anwendungen finden, gehören genetische Störungen und Erkrankungen von Knochen und Immunsystem. Die Abgabe der transformierten Zellen kann unter Anwendung verschiedener Verfahren erfolgen. Hierzu gehören die Infusion oder die direkte Depotinjektion in das Periosteum, das Knochenmark und subkutane Stellen.
  • Ferner können, wie vorstehend beschrieben, die transduzierten Zellen für die in vitro-Erzeugung von einem oder mehreren erwünschten Proteinen verwendet werden. Die transduzierten Zellen können ferner bei Screeningtests zur Auffindung von Arzneistoffen verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hämatopoetischen Stammzellen mit einem retroviralen Vektor transduziert, der ein Calcium-Responsives-Element, einen Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-Promotor und eine für einen Antiosteoklastenfaktor kodierende cDNA enthält.
  • Nach Modifikation der hämatopoetischen Zellen auf die hier beschriebene Weise und nach Induktion der Differenzierung zu Osteoklasten kann das Gemisch aus hämatopoetischen Zellen, Osteoklasten und mesenchymalen Stammzellen aufgetrennt werden, um eine Population von Zellen zu erhalten, die weitgehend aus den transduzierten Osteoklasten besteht. Dies kann durch positive und/oder negative Selektion von transduzierten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung von Antikörpern zur Identifikation von hämatopoetischen Zelloberflächenmarkern erreicht werden.
  • Die vorstehende Beschreibung der Erfindung und die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung. Weitere Abänderungen und Praktiken der Erfindung ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres bei Berücksichtigung der vorstehenden Ausführungen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen. Daher fallen derartige Abänderungen und Variationen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiele
  • Statistische Analyse:
  • Sämtliche Daten wurden durch einen paarweisen t-Test analysiert. Proben wurden in Dreifachversuchen bearbeitet. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (SE).
  • Beispiel 1
  • Zellisolierung:
  • Knochenmarkproben wurden von gesunden humanen Spendern an der Johns Hopkins-Universität gemäß einem vom Institutional Review Board gebilligten Verfahren gewonnen. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden isoliert und gemäß bekannten Verfahren gezüchtet (Majumdar et al., 1998). Nachdem die Kulturen 90% Konfluenz erreicht hatten, wurden anhaftende Zellen durch Zugabe einer Lösung mit einem Gehalt an 0,25% Trypsin-EDTA (Life Technologies) gewonnen und in einer Dichte von 1 × 106 Zellen pro 185 cm2-Kolben als Passage 1-Zellen ausgestrichen.
  • CD34+-Zellen, die aus Knochenmark von gesunden Patienten isoliert worden waren, wurden von der Fa. Poietic Technologies, (Gaithersburg, MD) erhalten. Sie wurden einer Immunoreinigung auf eine Reinheit von 95% unterzogen, wobei Antikörper gegen CD34, der an magnetische Perlen konjugiert war, verwendet wurde (CD34+-Zelltrennsäule: Miltenyi Biotec, Auburn, CA, Ab: QBEND.10). Anschließend wurde eine Kryokonservierung durchgeführt.
  • Gemeinsame Kulturen:
  • MSCs einer frühen Passage (2 bis 3) wurden in einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro cm2 ausgestrichen und bis zur Subkonfluenz in DMEM-LG+10% FBS gezüchtet. CD34+-Zellen wurden sodann in einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro cm2 zu den MSC-Kulturen gegeben. Die Kulturen wurden 3 Wochen bei 37°C in einer Atmosphäre von 95% Luft/5% CO2 gehalten und alle 3 Tage mit Medium versorgt. Da der Großteil der CD34+-Zellen nicht haften blieb, wurde die Hälfte des Kulturmediums vorsichtig abgesaugt, ohne nicht-haftende Zellen zu bewegen, und durch frisches Medium ersetzt.
  • TRAP-Färbung:
  • Nach 3 Wochen wurden die Zellen in 60% Aceton in Citratpuffer (pH-Wert 5,4) 30 Sekunden fixiert, 2-mal mit destilliertem Wasser gewaschen, an der Luft getrocknet und auf gegen Tartrat beständige saure Phosphatase (TRAP), einem verbreiteten zytochemischen Marker für Mäuse-Osteoklasten (Wijngaert und Burger, 1986) gefärbt, wobei ein handelsübliches Kit (Sigma, St. Louis, MO) verwendet wurde. Gefärbte Kulturen wurden unter einem Lichtmikroskop in einer 200-fachen Vergrößerung geprüft. TRAP-positive (Rotfärbung), mehrkernige (drei oder mehr Kerne) Osteoklasten in jeder Vertiefung wurden durch manuelles Scanning über die gesamte Vertiefung in systematischer Weise gezählt (Mbalaviele et al., 1998).
  • CD34+-Zellen, die in Abwesenheit von MSCs oder Cytokinen/Wachstumsfaktoren gezüchtet worden waren, bildeten keine mehrkernigen Zellen, die gegen Tartrat beständige saure Phosphatase exprimierten (TRAP+MNCs) (1A). MSCs unterstützten die Differenzierung von gemeinsam gezüchteten CD34+-Zellen zu Osteoklastenzellen (1B). Im Gegensatz dazu bewirkten humane Hautfibroblasten (SK1087-Zellen) oder humane Nierenzellen (293T) nicht die Untersützung der Bildung von TRAP+MNCs (1C bzw. 1D). Die Behandlung von CD34+-Zellen mit IL-1, IL-3 und GM-CSF in Abwesenheit von MSCs führte zur Bildung von Osteoklastenzellen, wobei die Anzahl dieser Zellen jedoch geringer waren als jene in CD34+/MSCs-Cokulturen (Daten nicht aufgeführt).
  • Beispiel 2
  • Immunozytochemie:
  • CD34+-Zellen und MSCs, die gemeinsam 3 Wochen gezüchtet worden waren, wurden in einer frischen Lösung von 3,7% (Gew./Vol.) Formaldehyd in PBS fixiert, mit 1,5% Pferdeserum blockiert, mit dem monoklonalen Antikörper gegen humanes Integrin ανβ3 (Dr. Horton, The Rayne Institute, London, England) in einer 1:50-Verdünnung in PBS mit einem Gehalt an 0,15% Pferdeserum inkubiert. Die Zellen wurden sodann mit Glucose-oxidase-konjugiertem sekundärem Ziegen-Antikörper unter Verwendung des Vectastain-ABC-GO-Kits (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) inkubiert. Sämtliche Inkubationen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach sich 3 Waschvorgänge mit PBS anschlossen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Osteoklastenzellen (schwarzer Pfeil) und ihre Vorläufer (Pfeilkopf) wurden durch Vitronectin-Rezeptor-Antikörper, jedoch nicht durch den Kontrollantikörper gefärbt. MSCs zeigten keinerlei Färbung mit dem Rezeptor-Antikörper. Mehrkernige Zellen, die geringe Konzentrationen an Vitronectin-Rezeptoren exprimierten, waren in gemeinsamen Kulturen zu sehen (2B, weißer Pfeil).
  • RNA-Präparation und RT-PCR:
  • Die gesamte RNA wurde aus MSC-Kulturen oder Cokulturen von CD34+ und MSCs unter Verwendung des High Pure-RNA-Isolationskits der Fa. Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) extrahiert. Die PCR wurde für 30 Zyklen an revers transkribierter, einzelsträngiger cDNA aus Gesamt-RNA (1 μg) unter Anwendung des GeneAmp-RT-PCR-Verfahrens unter den vom Vertreiber (Perkin Elmer, Foster City, CA) angegebenen Bedingungen mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Denaturierung 20 Sekunden bei 95°C, Annealing 20 Sekunden bei 55°C, Polymerisation 30 Sekunden bei 72°C und Elongation 10 Minuten bei 72°C. Die strangaufwärtigen und strangabwärtigen Primer wurden folgendermaßen konstruiert: TRAP: 5'-CGATCACAATCTGCAGTACC-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-ACCCAGTGAGTCTTCAGTCC-3' (SEQ ID NO: 2), PCR-Produktgröße = 150 bp; Calcitonin-Rezeptor (CTR): 5'-TTTCCAGGGCTTCTTTGTT-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-CTTGGTTGTTGGCTGGTTC-3' (SEQ ID NO: 4), PCR-Produktgröße = 205 bp. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese an 1% Agarose der Größenfraktionierung unterworfen.
  • Die RT-PCR-Analyse zeigte eine Expression von TRAP und Calcitonin-Rezeptoren durch Zellen, die von CD34+-Zellen abgeleitet waren, d. h. der Osteoklastenlinie (Bahnen 2 und 3 von 3).
  • Diese Proteine wurden durch MSCs nicht exprimiert.
  • Beispiel 3
  • Test auf Bildung von Löchern:
  • Um die Anwesenheit von Osteoklastenzellen in den Kulturen zusätzlich zu bestätigen, wurde die Fähigkeit der in Cokulturen von CD34+-Zellen und MSCs zur Bildung von Löchern (Pits) (ein Hinweis auf die osteoklastische Knochenresorption) geprüft. Geglättete Scheiben von Elephantenstoßzähnen wurden mit "200-proof" Ethanol sterilisiert, an der Luft getrocknet und mehrmals mit PBS gewaschen. MSCs wurden in einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro cm2 auf den Stoßzahnscheiben (4 × 4 × 0,1 mm) in Platten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen und 1 Woche in hMSC-Medium vom pH-Wert 7,4 gezüchtet. Sodann wurden CD34+-Zellen in einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro cm2 zugegeben. Ein künstliches Knochenanaloges, nämlich osteologische Scheiben (Millenium Biologix Inc., Ontario, Kanada), wurde zur Bestimmung der optimalen Testbedingungen verwendet. Am Ende der 3-wöchigen Züchtungsperiode wurden Zellen auf den Scheiben auf TRAP gefärbt, gezählt, sodann mit 0,1 M NaOH in Wasser entfernt und einer 2-minütigen Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Knochenscheiben wurden 5 Minuten mit 1% Toluidinblau, das in destilliertem Wasser mit einem Gehalt an 1% Natriumborat zubereitet worden war, gefärbt. Die Anzahl der Löcher wurde gemäß Literaturangaben (Prallet et al., 1992) unter dem Lichtmikroskop gezählt. Authentische Resorptionspits wurden sowohl am Knochenanalogen als auch an den Elephanten-Stoßzahnscheiben festgestellt, wenn CD34+-Zellen gemeinsam mit MSCs gezüchtet wurden (4).
  • Beispiel 4
  • Einflüsse von Zell-Zell-Wechselwirkungen:
  • CD34+-Zellen und MSCs wurden entweder im gleichen Kompartiment (Kontakt-Cokulturen) oder in zwei verschiedenen Kompartimenten (Nicht-Kontakt-Cokulturen) unter Trennung durch Kultur-Proof Inserts mit einer porösen 0,45 μm-Membran (Becton Dickinson, Redford, MA) gezüchtet, um physikalische Zell-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die in 5A dargestellten Ergebnisse zeigten, dass Osteoklastenzellen in den Kontaktkulturen gebildet worden waren und etwa zwei Drittel weniger Osteoklastenzellen in den Nicht-Kontakt-Kulturen gebildet worden waren, unabhängig davon, in welchem Kompartiment (oben oder unten) die MSCs oder CD34+-Zellen überimpft wurden.
  • Beispiel 5
  • Wechselwirkungen durch sezernierte Faktoren:
  • CD34+-Zellen wurden mit MSCs gemeinsam gezüchtet. Konditionierte Medien wurden nach 2 Tagen aus MSCs, die in Abwesenheit oder Gegenwart von CD34+-Zellen gezüchtet worden waren, gewonnen. Die Proteinkonzentrationen der Cytokine IL-1α, IL6, IL-11, des Granulozyten/Makrophagen-Kolonienstimulationsfaktors (GM-CSF) und des Leukämie-Hemmfaktors (LIF), die in die Cokultur von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen sezerniert worden waren, wurden unter Verwendung eines Quantikine-Kits (R & D Systems, Minneapolis, MN) gemessen.
  • 5B zeigt die Konzentrationen an IL-6, IL-11 oder LIF in Cokulturen von CD34+-Zellen und MSCs. Die Konzentrationen an IL-1α und GM-CSF waren nicht nachweisbar. Die Konzentrationen von IL-6 und LIF waren in Cokulturen von MSCs und CD34+-Zellen etwa 10-fach höher als in MSC-Kulturen ohne CD34+-Zellen. Die Konzentrationen an IL-1α und GM-CSF waren nicht nachweisbar.
  • Referenzbeispiel 6
  • Einflüsse von osteogenen MSCs (differenzierte MSCs):
  • Die osteogene Differenzierung von MSCs wurde durch Behandlung von MSCs mit osteogenem Supplement (OS) mit einem Gehalt an 100 mM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat und 50 μM L-Ascorbinsäure-2-phosphat für 2, 3, 4, 5, 10 oder 13 Tage induziert. Bei der gemeinsamen Züchtung mit CD34+-Zellen wurde das OS enthaltende Medium durch Medium ohne OS ersetzt. Die 6A und 6B zeigen, dass osteogene MSCs die TRAP+MNC-Bildung im Vergleich zu MSCs hemmten. 6C zeigt die Konzentrationen an IL-6, IL-11 oder LIF in Cokultur. Die Konzentrationen an IL-6, IL-11 und LIF waren in Cokulturen von MSCs mit CD34+-Zellen höher als in Cokulturen von osteogenen MSCs und CD34+-Zellen.
  • RNA-Präparation und RT-PCR:
  • Die Isolierung der gesamten RNA und die RT-PCR-Analyse wurden gemäß den Angaben von Beispiel 2 durchgeführt. Es handelte sich um die folgenden stromaufwärtigen und stromabwärtigen Primer: für OPG 5'-ACCACTACTACACAGACAGC-3' (SEQ ID NO: 5) und 5'-AGGAGACCAAAGACACTGCA-3' (SEQ ID NO: 6); für OPGL 5'-TTCTATTTCAGAGCGCAGAT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-AGTCATGTTGGAGATCTTGG-3' (SEQ ID NO: 8).
  • 6D zeigt, dass die Behandlung von MSCs mit OS für 4, 8 oder 15 Tage die Expression von OPGL-mRNA verringerte. Im Gegensatz dazu wurde durch eine Behandlung von MSCs mit OS für 4, 8 oder 15 Tage die Expression von OPG-mRNA erhöht.
  • Beispiel 7
  • Transduktion von CD34+-Zellen:
  • Die Konstruktion des retroviralen Vektors MGIN, der das verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP)-Gen exprimiert und die Herstellung der retroviralen Überstände wurden in der Literatur beschrieben (Cheng et al., 1997). Kurz zusammengefasst, MGIN ist ein muriner, embryonaler Stammzellen-Virus-basierter Vektor mit einem Gehalt an dem EGFP-Gen und der internen Ribosomeneingangsstelle (IRES). Amphotrope Überstände, die durch PA317-Verpackungszellen erzeugt worden waren, wurden von ausgewählten Erzeugern nach Infektion durch BOSC23-ökotrope virale Vorratsprodukte (viral stocks) hergestellt. Zur Transduktion wurden vorher eingefrorene Vektorüberstände im Verhältnis von 1:1 mit Medium mit einem Gehalt an CD34+-Zellen in Gegenwart von 8 μg/ml Polybrene (Sigma, St. Louis, MO), Interleukin-3 (IL-3) und IL-6 (jeweils 10 ng/ml), Stammzellenfaktor (SCF) und Flk2 (FL) (jeweils 100 ng/ml) vermischt. Kontrollzellen wurden mit EGFP-nicht-exprimierendem Vektor transduziert. Das Transduktionsgemisch wurde sodann bei 32–35°C mit 1800 g zentrifugiert. Nach 4-stündiger "Spinoculation" wurden die Zellen 1-mal gewaschen und 24 Stunden in Medium mit einem Gehalt an den vorgenannten Wachstumsfaktoren gezüchtet. Anschließend wurde die Transduktion 1-mal wiederholt. Eine Zellfraktion wurde durch Fließzytometrie zum Testen des Transduktionswirkungsgrads analysiert, während die restlichen Zellen für den Osteoklastogenese-Test verwendet wurden. Die transduzierten CD34+-Zellen wurden 3 Wochen ohne zusätzliche Faktoren der Cokultur unterzogen. Die Cokulturen wurden auf TRAP gemäß den Angaben in Beispiel 1 gefärbt. Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis von EGFP oder unter einem Lichtmikroskop zum Nachweis von TRAP sichtbar gemacht.
  • Die Ergebnisse der fließzytometrischen Analyse sind in 7 dargestellt. Die FACS-Analyse zeigte, dass 30% der CD34+-Zellen, die mit dem EGFP-Vektor transduziert worden waren, das Transgen exprimierten (7B). Cokulturen von transduzierten CD34+-Zellen mit MSCs ergaben Osteoklasten, die sowohl EGFP (7C) als auch TRAP (7D) exprimierten.
  • Beispiel 8
  • Nachweis des Vitronectin-Rezeptors durch ELISA:
  • MSCs wurden in einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro cm2 ausgestrichen und in hMSC-Medium bis zur Subkonfluenz gezüchtet. Sodann wurden CD34+-Zellen in einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen pro cm2 zu den MSC-Kulturen gegeben. Die Kulturen wurden 1, 2 oder 3 Wochen aufrechterhalten. Sodann wurden die Zellen mit 3,6% Formaldehyd fixiert und 30 Minuten mit 10% Ziegenserum blockiert, wonach sich eine Inkubation mit dem Antikörper gegen den Vitronectin-Rezeptor (ανβ3) anschloss. Unter gründlichem Waschen zwischen den Zugaben wurde ein mit Biotin markierter sekundärer Antikörper zugegeben (Ziegen-anti-Maus-IgG; Pierce, Rockford, IL), wonach die Zugabe von mit Streptavidin konjugierter β-Galactosidase (Gibco BRL) für 1 Stunde folgte. Das lösliche Substrat Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid (CPRG, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde sodann zugegeben. Die Farbentwicklung wurde nach 30 Minuten bei 570 nm abgelesen. Primäre Kontrollantikörper wurden für jede Behandlung ebenfalls mitgeführt. Diese Hintergrundmessung wurde von den Ablesungen für die einzelnen Vertiefungen subtrahiert. Die ELISA-Ergebnisse sind in 8 als durchschnittliche Absorptionseinheiten nach Subtraktion des Hintergrunds dargestellt. Der Vitronectin-Rezeptor (ανβ3) wurde durch den spezifischen Antikörper, jedoch nicht durch den Kontrollantikörper nachgewiesen (8A). Die ανβ3-Expression durch die Osteoklasten-Zelllinie wurde nach 1-wöchiger Cokultur induziert. Durch MSCs erfolgte eine geringere Expression (8B).
  • Beispiel 9
  • Hämatopoetische Stammzellen als therapeutische Ziele:
  • Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) wurden mit einem retroviralen Vektor, der ein Calcium-Responsives-Element, den Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-Promotor und eine cDNA, die für den Antiosteoklastenfaktor (antisense, Inhibitor, apoptotischer Faktor) kodierte, transduziert (vergl. 8). Der TRAP-Promotor wurde zum spezifischen Abzielen auf die Osteoklastenzellinie verwendet. Transduzierte HSCs werden osteoporotischen Patienten infundiert. Sie gelangen ins Knochenmark, nisten sich ein und differenzieren zu Osteoklasten. Die Osteoklasten reagieren auf hohe lokale Calciumkonzentrationen, die durch eine übermäßige Knochenresorption entstehen (Stufe 1 und 2) durch Expression eines Antiosteoklastenfaktors (Stufe 3), der die Osteoklastenaktivität stoppt (Stufe 4). Ein derartiger Faktor ist Osteoprotegerin (OPG), von dem gezeigt wurde, dass er bei Sekretion die Knochenresorption (Osteopetrose) verringert und offensichtlich allgemein die Osteoklastogenese blockiert (Simonet, 1997).
  • Die transduzierten hämatopoetischen Zellen können auch ex vivo zur Differenzierung zu Osteoklasten induziert und sodann osteoporotischen Patienten infundiert werden.
  • Das Calcium-Responsive-Element(CaRE) wurde unter der Kontrolle des CMV-Promotors in den pGL3-Vektor kloniert, der Luciferase als Reportergen (Promega, Madison WI) enthält, wodurch man pGL3-CaRE erhielt. pGL3 oder pGL3-CaRE wurden in die humane Nierenzellinie 293T unter Anwendung des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens transfiziert. Die Zellen wurden sodann in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen an Calcium gezüchtet. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual-LuciferaseR-Reportertestsystems (Promega) bestimmt. Die Daten zeigen, dass Calcium in einer geringen Konzentration von 0,1 mM die Luciferase-Aktivität in pGL3-CaRE, jedoch nicht in pGL3 induziert (9B).
  • Beispiel 10
  • Einfluss von Serum im Kulturmedium:
  • Cokulturen von MSCs und CD34+-Zellen wurden zur Bestimmung des Einflusses von Serum auf die Erzeugung von Osteoklasten untersucht. Cokulturen von CD34+-Zellen und MSCs wurden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet, jedoch handelte es sich bei dem getesteten Medium um DMEM mit geringem Glucosegehalt und 10% FBS und um DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne Serum. Kontrollkulturen enthielten Zellen der humanen Nierenzelllinie 293 in Cokultur mit CD34+-Zellen in DMEM mit hohem Glucosegehalt mit und ohne Serum. Die Kulturen wurden nach 12 Tagen anstelle von 21 Tagen wie in den vorstehenden Beispielen, beendet.
  • Die in 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die gemeinsame Züchtung von MSCs und CD34+-Zellen in DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne FBS zu einer höheren Anzahl an Osteklasten als eine Cokultur in üblichem DMEM-LG mit einem Gehalt an 10% FBS führte.
  • Literaturverzeichnis
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    • Cheng L, Du C, Murray D, Tong X, Zhang YA, Chef BP, Hawley RG: A GFP reporter system to assess gene transfer and expression in human hematopoietic progenitor cells. Gene Therapy 4: 1013 (1997)
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  • Sequenzprotokoll
    Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001

Claims (7)

  1. Verfahren zur in vitro-Herstellung von Osteoklasten, umfassend das gemeinsame Züchten von mesenchymalen Stammzellen mit hämatopoetischen Stammzellen, so dass die hämatopoetischen Stammzellen Osteoklasten erzeugen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gemeinsame Züchtung in Abwesenheit von exogenen Cytokinen durchgeführt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hämatopoetischen Stammzellen CD34+-Zellen sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hämatopoetischen Stammzellen und die mesenchymalen Stammzellen sich in Kontakt miteinander befinden.
  5. Verfahren zur Erzeugung von genetisch modifizierten Osteoklasten, umfassend das Transduzieren von hämatopoetischen Progenitorzellen mit exogenem genetischem Material; und das in vitro-Züchten der transduzierten hämatopoetischen Zellen in Gegenwart von mesenchymalen Stammzellen, um die Differenzierung der transduzierten hämatopoetischen Zellen zu Osteoklasten, die das exogene genetische Material enthalten, zu induzieren.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die transduzierten hämatopoetischen Stammzellen zur in vitro-Differenzierung befähigt sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die transduzierten hämatopoetischen Stammzellen zur in vivo-Differenzierung befähigt sind.
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