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I. Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Analyse
und Sortierung von Teilchen zum Beispiel in einem Durchflusszytometer.
Auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie ist es üblich, einen Strom von Hüllfluid
mit einem Strom von in diesem Hüllfluid
gelösten
Teilchenstrom aufzubauen. Dieser Strom kann dann derart gestört werden,
dass sich Tröpfchen
bilden und Teilchen in den Tröpfchen
enthalten sind, wenn sie sich vom Ende des zusammenhängenden
Stroms lösen.
Die Tröpfchen
können
dann wie gewünscht sortiert
werden, indem gewünschte
Teilchen detektiert werden und eine auf einem individuellen Tröpfchen aufgebaut
wird, kurz bevor es sich von dem zusammenhängenden Teil des Stroms löst. Das
Tröpfchen,
das das erwünschte
Teilchen enthält,
kann dann mit einem elektrischen Feld in einen Sammelbehälter abgelenkt
werden. Als Teil dieses Verfahrens ist es optimal, zu wissen, wann
ein Tröpfchen,
das ein gewünschtes
Teilchen enthält,
die Ladestelle erreicht, so dass dieses bestimmte Tröpfchen geladen
werden kann, wobei Tröpfchen so
wenige Nachbartröpfchen
wie nötig
laden. Das ermöglicht
es, dass das Tröpfchen,
die das erwünschte
Teilchen enthalten und möglicherweise
wenige Tröpfchen
auf jeder Seite des Tröpfchens,
das das Teilchen enthält,
in einen separaten Behälter
abgelenkt und aus dem Strom aussortiert werden.
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Als
Bestandteil dieses Verfahrens ist es notwendig gewesen, ein Durchflusszytometer
täglich
einzurichten, und es zu ermöglichen,
dass sich dort das Durchflusszytometer, wo das Durchflusszytometer
aufgestellt ist, an die Umgebungsbedingungen anpassen kann. Das
dauert etwa ein bis eineinhalb Stunden nur für das Anpassungsverfahren des
Durchflusszytometers. Dann ist typischerweise eine weitere halbe
Stunde nötig,
um den Tröpfchenverzögerungszeitablauf
des Durchflusszytometers nach Ablauf der Anpasszeit zu kalibrieren.
Deshalb sind täglich
volle ein bis zwei Stunden nötig,
nur um das Durchflusszytometer einzurichten. Das ist Zeit, die eher
für die
Erbringung von Resultaten vom Durchflusszytometer genutzt werden
könnte,
um Ergebnisse des Durchflusszytometers zu erzeugen, als sie als
Einrichtzeit zu verschwenden. Deshalb besteht Bedarf an einem Durchflusszytometer,
das diese ein bis zwei Stunden Einrichtzeit nicht benötigt und
das schnell ohne die Notwendigkeit von Anpassung und Kalibrierung
implementiert werden kann.
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Ein
weiterer Nachteil des aktuellen Standes der Durchflusszytometrie
ist das Fehlen eines automatischen Mittels zur Kompensation einer Änderung
einer der Parametern des Durchflusszytometer – am wichtigsten, die Tröpfchenverzögerungszeit.
Beispielsweise ist es derzeit nötig,
dass ein Techniker ein sortierendes Durchflusszytometer während des
Sortierverfahrens überwacht.
Der Techniker muss während
der Durchführung
der Sortierung im Raum bleiben für
den Fall, dass sich beim Durchflusszytometer ein katastrophaler
Fehler ereignen könnte.
In einem solchen Fall könnte
der Techniker dann so schnell wie möglich die Sortierung unterbrechen
und zum Beispiel die Verunreinigung jeglicher angesammelter Proben
von Zellen während
eines katastrophalen Fehlers verhindern. Dies könnte zum Beispiel passieren,
wenn sich eine Düse
verstopft und der Strom von der Düsenspitze weg zu einem der
Probenbehälter
hin abgelenkt wird. Selbst bei einem Techniker im Raum, der das
stattfindende Sortieren beobachtet, würde es möglicherweise immer noch zwei
bis drei Sekunden dauern, um das Durchflusszytometer anzuhalten.
Bei einigen Sortierarten würde
jedoch sogar diese Zeitspanne von zwei oder drei Sekunden zu lang
sein, um die Sortierung zu retten. Deshalb müßte das Verfahren erneut gestartet
und noch einmal durchgeführt
werden. Dies kann sehr frustrierend sein – insbesondere, wenn die Sortierung
kurz vor dem Abschluss stand.
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Darüber hinaus
scheint derzeit kein Warnsystem zu existieren, wenn ein Parameter
des Durchflusszytometers auf falsche Weise eingestellt worden ist.
Zum Beispiel, wenn eine falsche Düsengröße an den Durchflusszytometer
herangebracht wurde, scheint kein Hersteller eine Warnung auszugeben,
die dazu verwendet werden kann, den Techniker darauf hinzuweisen,
dass die falsche Düsengröße eingebaut
ist. Dies kann aber zu einer unnötigen
Zeitdauer seitens des Technikers führen, der versucht das Problem
bei der Einstellungen des Durchflusszytometers festzustellen.
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Ein
weiterer Nachteil des aktuellen Standes der Technik der Durchflusszytometrie
ist, die Unfähigkeit die
Tröpfchenverzögerungszeit
eines Teilchens im erwünschten
Genauigkeitsgrad zu ermitteln. Derzeit besteht ein benutztes verfahren
darin, den Strom aufzubauen und den Strom mit einer Lichtquelle
abzutasten, so dass man den Strom dann auf einem Bildschirm betrachten
kann, um zu erkennen, ob die Tröpfchenabrisstelle des
Stroms ihre Position ändert.
Wenn sich die Abrisstelle verschiebt, dann kann der Strom zur Einstellung
der Tröpfchenverzögerungszeit
eines Teilchens rekalibriert werden. Dies ist jedoch trügerisch,
weil eine Änderung der
Wellenlänge
des Stroms ohne eine resultierende Änderung der Tröpfchenabrisstelle
erfolgen könnte.
Infolge dessen würde
sich die Tröpfchenverzögerungszeit
eines Teilchens ändern – da eine Änderung
der Wellenlänge
eine Geschwindigkeitsänderung
des Fluidflusses anzeigen würde.
Dies würde
jedoch von einem Techniker, der sich auf die Position des Tröpfchenabrisspunktes
verlassen hat, unbemerkt bleiben. Es wird auch angenommen, dass
die Hydrodynamik des Stroms konstant ist, wenn der Strom der Düse des Durchflusszytometers
verlässt,
und deshalb davon ausgegangen wird, dass die Stromgeschwindigkeit
konstant bleibt.
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II. Hintergrund
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Frühere Arbeiten
auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie zur Lösung dieser Probleme sind offensichtlich
nicht erfolgreich gewesen. Des weiteren haben sie sich eher darauf
konzentriert, die Tröpfchenabrisstelle
beizubehalten – steht
die Fähigkeit
zur Ermittlung der Tröpfchenverzögerungszeit
eines Teilchens anzuerkennen. Zum Beispiel versucht das US-Patent
4,691,829 von Robert E. Auer, einen auf den Strom von die Tröpfchenabrisstelle
gerichteten Laserstrahl zu verwenden.
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Basierend
auf lichtbrechenden Eigenschaften des Stroms wurde dann versucht,
Oberflächenänderungen
des Stroms zu detektieren. Eine Welligkeitsänderung auf der Oberfläche könnte dann
dazu verwendet werden, zu ermitteln, ob sich der Abrisstelle verschoben
hat. Dieses Verfahren ermittelte jedoch nicht tatsächlich eine
Tröpfchenverzögerungszeit
für ein
im Strom entdecktes Teilchen. Es versuchte nur, die Tröpfchenabrisstelle
an der gleichen Position zu halten. Darüber hinaus benötigte es
sehr empfindliche Ausrüstung,
um die Welligkeitsänderung
der Oberfläche
zu detektieren, und wurde offensichtlich seit der Erteilung des
Patentes 1987 nie in einem kommerziellen Produkt verwirklicht.
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Ein
früherer
Ansatz zu versuchen, die Tröpfchenabrisstelle
zu kontrollieren, kann im US-Patent 3,761,941 gesehen werden. In
diesem Patent wurde eine Testprobe durch das Zytometer befördert, um
eine Ladung auf einem Tröpfchen
zu detektieren. Eine theoretische Ladung, von der erwartet wurde,
dass sie an das Tröpfchen
angelegt worden ist, wurde dann mit der tatsächlichen Ladung des Tröpfchens
verglichen. Die Amplitude der tröpfchenstimulierenden
Störung
wurde dann angepasst, bis die tatsächliche Ladung die theoretische
erreicht hat. Auf diese Weise konnte der Strom auf den für Ladungszwecke
richtigen Punkt eingestellt werden.
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1982
behandelte das US-Patent 4,361,400 die Verwendung eines Fernsehbildschirmes,
um die Abrisstelle des Zytometers zu beobachten. Es war jedoch ebenfalls
eine Bedienperson nötig,
die die Einstellungen des Zytometers basierend auf der beobachteten
Abrisstelle manuell einstellte. wenn dieses Verfahren verwendet
wurde, war die Anpassung des Zytometers deshalb wahrscheinlich immer
noch eine ein- bis eineinhalbstündige
Prozedur.
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1997
behandelte das US-Patent 5,700,692 die Verwendung eines Kamera-/Bildschirmsystems,
um es einem Anwender zu ermöglichen,
den Abstand zwischen Tröpfchen
in einem Zytometer einzustellen. Es hatte jedoch nicht die Fähigkeit
eines Überwa chungssystems,
eine Fülle
von anderen Kenngrößen eines
Stroms zu ermitteln, und dadurch für eine automatische Rückkopplung
zu dem Durchflusszytometer zu sorgen. Statt dessen konzentrierte
es sich auf die Ermittlung eines Zentrums einer Anhäufung von
Tröpfchen
und nahm eine konstante Geschwindigkeit des Fluidstroms an. Durch
die Fokussierung auf das zentrum der Anhäufung von Tröpfchen übersah es
offensichtlich komplett wichtige Informationen, die aus dem Strom
bestimmt werden könnten – einschließlich einer
automatischen Regulierung der Tröpfchenverzögerungszeit.
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Folglich
besteht noch immer Bedarf an einem Durchflusszytometer, das einen
Strom des Zytometers überwachen
und eine Tröpfchenverzögerungszeit
auf der Grundlage der besonderen Charakteristika des Stroms zu einem
speziellen Zeitpunkt detektieren kann. Es besteht hier eher ein
Bedarf für
ein Zytometer, das die Tröpfchenverzögerungszeit
unter den speziellen Bedingungen des Stroms für ein bestimmtes Teilchen,
das im Begriff ist, aussortiert zu werden ermitteln kann, als auf
eine erwartete konstante Zustandsbedingung, wie eine konstante Gewschwindigkeit
des Stroms, zu vertrauen. Darüber
hinaus besteht ein Bedarf an einem Durchflusszytometer, das die
Tröpfchenverzögerungszeit
am Tagesbeginn einstellen kann, wenn sich das Durchflusszytometer
noch auf die Umgebungsbedingungen, wie zum Beispiel die Raumtemperatur,
einstellt. Auf diese Weise kann das Durchflusszytometer für nützliche
Sortierungen während
der ersten ein bis zwei Stunden verwendet werden, die vorher für die Anpassung
an die Umgebungsbedingungen und die Kalibrierung des Durchflusszytometers,
wie zum Beispiel die Kalibrierung der Tröpfchenverzögerungszeit mittels einer Standardtestprobe,
benötigt
wurden. Es besteht also nach wie vor Bedarf an einem Durchflusszytometer,
das entdecken kann, wenn ein katastrophales Ereignis auftritt, das
zu der Zerstörung
einer nahezu fertiggestellten Sortierung führen könnte – zum Beispiel eine fünf- bis
sechsstündigen
Sortierung, die verunreinigt wird, wenn eine Düse blockiert ist und der Strom
unabsichtlich in den Probensammelbehälter abgelenkt wurde. Des weiteren
besteht nach wie vor Be darf an einem automatischen Unterbrecher,
der den Strom ablenken oder blockieren kann oder des Sortiereraspekt
des Stroms bei Eintritt eines Ereignisses, zum Beispiel eines katastrophaler
Fehler, automatisch abschaltet. Auf diese Weise könnte die
gesammelte Probe schnellstmöglich
gesichert werden, insbesondere schneller als die zwei bis drei Sekunden,
die benötigt
würden,
wenn eine Bedienperson dies manuell tun würde – wie es offensichtlich bei
derzeitigen Zytometern der Fall ist.
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Darüber hinaus
besteht Bedarf daran, die Charakteristika der Geschwindigkeit des
Stroms zu verstehen, der vom Durchflusszytometer ausgestoßen wird – insbesondere
augehend von dmr Zeitpunkt, an dem der Strom vom Durchflusszytometer
ausgestoßen
wird, bis zum Punkt, wo ein Tröpfchen
geladen wird, so dass eine Ladung auf das Tröpfchen übertragen werden kann, wenn
das Tröpfchen
die Laderegion erreicht. Früher ist
angenommen worden, dass die Geschwindigkeit konstant war. Da sich
jedoch der Durchsatz erhöht
hat und sich die Teilchen im Strom näherkommen, ist es noch kritischer,
die Geschwindigkeit der Stromtröpfchenverzögerungszeit
so genau wie möglich
ermitteln zu können;
somit ist es vielmehr genauso kritisch, die Charakteristika des
Stroms zu ermitteln, als einfach den Strom mit konstanter Geschwindigkeit
abzuschätzen.
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In
dieser Hinsicht zeigt, K. Asano et al., Journal of Electrostatics,
Band 42, 1997, Seiten 17–23,
dass die Stromgeschwindigkeit exponentiell abnimmt.
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III. Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist darauf ausgerichtet, die bekannten Probleme
mit einem Verfahren gemäß Anspruch
1 und einer Vorrichtung gemäß Anspruch
9 zu lösen.
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein neues Verfahren zum Kompensieren
von Änderungen
in einem Durchflusszytometer und genauen Ermitteln einer Tröpfchenverzögerungszeit
eines be stimmten Teilchens in dem Strom. Ein detektiertes Tröpfchen kann
basierend auf der Tröpfchenverzögerungszeit
geladen werden, die basierend auf einer Messung der Fluidgeschwindigkeit
in dem Strom berechnet wird. Somit erlaubt die Kenntniss der Tröpfchenladeposition
und der Geschwindigkeitscharakteristika des Stroms dem Zytometer
das Teilchen enthaltende Tröpfchen
an der Tröpfchenladeposition
genauer zu laden.
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Darüber hinaus
ermöglicht
es weitere Ausführungen
der Erfindung, ein Bild des Stroms zu erkennen, um Informationen über das
Durchflusszytometer zu ermitteln. Beispielsweise kann ein Bild des
Stroms dazu verwendet werden, die Breite des Stroms an einer vorgegebenen
Stelle zu ermitteln und dies mit der von dem Zytometer verwendeten
Düsengröße zu korrelieren.
Auf diese Weise kann bestimmt werden, ob die korrekte Düsengröße verwendet
wird. Andere Parameter werden genauso auf diese Weise bestimmt.
Beispielsweise wird eine Geschwindigkeit des Stroms an verschiedenen
Stellen entlang des Stroms bestimmt. Eine Geschwindigkeit des Stroms
kann durch Messung einer Wellenlänge
einer Oberflächenwelle
des Stroms und der Kenntnis der Oszillationsfrequenz berechnet werden,
die von der mechanischen Vorrichtung verwendet wird, die den Strom
stört,
um die Geschwindigkeit des Stroms an dieser Stelle zu berechnen;
Oder Tröpfchen,
die unter dem Tröpfchenabrisstelle
auftreten, können
abgebildet und ein Abstand zwischen den zwei Tröpfchen bestimmt werden, um
die Geschwindigkeit des Stroms an der Tröpfchenabrisstelle zu ermitteln.
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Darüber hinaus
wird ein exponentiell abnehmendes Modell verwendet, um die Änderung
der Geschwindigkeit des Stroms unterhalb des Düsenaustrittsstelle zu modellieren – insbesondere
zwischen der Düsenaustrittsstelle
und der Tröpfchenabrisstelle
des Fluidstroms. Dieses Modell wird dann dazu verwendet, eine exaktere
Tröpfchenverzögerungszeit
für ein
in dem Strom detektiertes Teilchen zu ermitteln.
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Zusätzlich kann
das Bildüberwachungssystem
dazu verwendet werden, die Tröpfchenabrisstelle
aufzunehmen, um eine Positi on der Tröpfchenabrisstelle sowie eine Änderung
der Position der Tröpfchenabrisstelle
zu ermitteln. Ferner kann das System dazu verwendet werden, ein
Rückkopplungssignal
an das Durchflusszytometer zu liefern, so dass die Tröpfchenabrisstelle
wiederhergestellt oder an der gewünschten Position beibehalten
wird.
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Auch
kann das Bildüberwachungssystem
dazu verwendet werden, den Effekt eines geladenen Tröpfchens
auf ein oder mehrere nachfolgende Tröpfchen zu ermitteln. Dies kann
durch Überwachen
der Trajektorie eines Tröpfchens
in Echtzeit und Laden des nachfolgenden Tröpfchens mit einer geringen
Ladung erreicht werden, die es ermöglicht, dass es in Reihe mit
anderen Tröpfchen,
die keine Teilchen enthalten, fällt.
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Das
bildgebende Verfahren kann auch in ähnlicher Weise dazu verwendet
werden, die stabilste Position des Stroms bei einem vorgegebenen
Druck und Schwingung zu ermitteln. Auf diese Weise kann die bevorzugte
Resonanzfrequenz für
einen Strom gewählt
und der resultierende Strom in einer stabilen Position aufgebaut
werden, die keine Oszillation zwischen Positionen erfordert.
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Die
Erfindung kann auch dazu verwendet werden, eine Bedienperson des
Durchflusszytometers zu warnen, dass bei der Einstellung oder Betrieb
des Durchflusszytometers eine Anomalie vorliegt. Auf diese Weise
kann das Zytometer sowwohl während
der Einstellung als auch während
des Betriebs einen Selbsttest durchführen. Zum Beispiel könnte eine
Ermittlung der Stromgeschwindigkeit dazu verwendet werden, um zu ermitteln,
ob der richtige Hydraulikdruck für
das Durchflusszytometer verwendet wird. Oder es könnte eine Warnung
an die Betriebsperson ausgegeben werden, um abzufragen, ob zum Beispiel
basierend auf einer Breite des Stroms eine andere Düsengröße vorgesehen
ist. Gleichermaßen
könnte
eine Positionsverschiebung des Stroms dazu verwendet werden, um
zu ermitteln, ob die Düse
verstopft wurde oder ob andere Anomalien bei dem Zytometer vorliegen.
Wenn darüber
hinaus entdeckt wird, dass der Strom komplett verschwunden ist,
könnte
das Zytometer die Betriebsperson warnen, dass ein katastrophales
Ereignis, das die Sortierung beschädigen würde, eingetreten ist. Diese
Warnung könnte
entweder an ein Fernüberwachungsgerät, eine Funkrufvorrichtung,
eine Alarmapparatur oder sogar eine E-Mail-Nachricht ausgegeben werden.
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Statt
einfach eine Warnung an die Betriebsperson auszugeben, kann ferner
ein mechanischer Eingriff dazu verwendet werden, den Strom automatisch
oder manuell umzulenken und ihn davon abzuhalten, die gesammelte
Probe zu verunreinigen. Dies könnte
entweder durch eine Rinne oder einen Ablenker erreicht werden. Alternativ
oder gleichzeitig kann die Sortierung entweder manuell oder automatisch
abgeschaltet werden, indem das Laden des Stroms und/oder die Ablenkkraft
abgeschaltet werden, die typischer weise ein geladenes Teilchen
ablenkt, abgeschaltet werden.
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Die
Erfindung bedient sich auch bildgebender Verfahren, um elektrisches
Rauschen von den erfassten Bildern zu entfernen. Beispielsweise
kann ein Bild des Stroms erfasst und umrissen werden, um ein erstes
Hintergrundbild des Stroms zu ermitteln und um es dann als Vorlage
für Vergleiche
mit nachfolgenden Bildern des Stroms zu verwenden. Auf diese Weise
können
elektrisches Rauschen bei nachfolgenden Bildern entfernt und die
Umrisse von den Bildern verglichen werden, um zu sehen, ob eine Änderung
der Charakteristika des Stroms aufgetreten ist.
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IV. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung einer Ausführung der
vorliegenden Erfindung;
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2 ist
ein alternatives Diagramm einer Nahaufnahme eines Durchflusszytometerstroms;
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3 ist
eine von einer Kamera erfasste und auf einem Bildschirm mit pixelbasiertem
Display dargestellte Ansicht eines Stroms;
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4 ist
eine erste Alternative eines Durchflusszytometers mit einem mechanischen
Unterbrecher;
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5 ist
eine zweite Alternative mit einem mechanischen Unterbrecher für ein Durchflusszytometer.
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V. Beste Methode zur Ausführung der
Erfindung
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In
Bezug auf 1 ist im Einzelnen eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ersichtlich. Das Durchflusszytometer (20)
kann eine Quelle für
Stromfluid (24) nutzen, um Stromfluid zuzuführen, um
ein Hüllfluid
aufzubauen, in dem Teilchen (32) aufgelöst werden können. Die Teilchenquelle (28)
kann die Teilchen von Zeit und Zeit einbringen, so dass sie in dem
Stromfluid aufgelöst
und im Strom hydrodynamisch fokussiert werden. Ein Strom (36),
der das Stromfluid (40) und die Teilchen (32)
aufweist, kann dann unterhalb der Düse (64) des Durchflusszytometers
aufgebaut werden. Der Strom kann in einer konstanten Zustandsbedingung
eingerichtet werden, so dass sich Tröpfchen (44) bilden
und von einem kontinuierlichen Teil des Stroms abreißen. Wenn
der Strom in dieser konstanten Zustandsweise aufgebaut ist, kann
eine stabile Abrisstelle (48) aufgebaut werden. Dieser
Strom kann mit einem Stroboskop abgetastet werden, um den stabilen
Strom zu beleuchten. Der Strom zerfällt an der Abrisstelle in Tröpfchen,
wobei sich die Tröpfchen
um die Abrisstelle zentrieren. Die Tröpfchenabrisstelle ist die Stelle
in einem Strom, wo sich ein Tröpfchen
von dem zusammenhängenden Stromfluss
trennt. Für
Referenzzwecke wird die Mitte des Tröpfchens als Tröpfchenabrisstelle
betrachtet, wenn es nötig
ist die Stelle in einer derart genauen Weise festzulegen. Unterhalb
der Tröpfchenabrisstelle
(48) kann sich eine Freifallzone (52) befinden.
Diese Freifallzone verkörpert
den Bereich, wo sich die Tröpfchen
bewegen, wenn sie von dem zusammenhängenden Teil des Stroms abreissen.
An der Unterseite der Düse
(64) ist eine Stromauslasstelle (56) angebracht.
Die Auslasstelle ist die Stelle im Raum, wo der Strom aus dem Durchflusszytometer
austritt. Zum Beispiel würde
sich die Austrittsstelle bei einem Durchflusszytometer mit Düse dort
befinden, wo der Strom die Düse
verläßt. An dieser
Stelle tritt der Strom im Wesentlichen aus oder wird von dem Durchflusszytometer
ausgestoßen.
Eine Tröpfchenladeposition
(60) kann an einer Stelle entlang des Stroms vorhanden
sein. Diese Tröpfchenladeposition
(60) kann zum Beispiel an der Tröpfchenabrisstelle (48),
wie in 2 zu sehen, vorhanden sein. Als mögliche Alternative
kann ein Ladering verwendet werden und unter der Tröpfchenabrisstelle
positioniert sein, so dass einzelne Tröpfchen geladen werden können. Ein Oszillator
(68) wie in 1 gezeigt, kann dazu verwendet
werden, den Strom zu stören
und eine statische Oszillation des Stroms aufzubauen. Es ist bevorzugt,
einen piezoelektrischen Kristall zu verwenden, um diese Störung des
Stroms zu erreichen. Der Oszillator (68) kann eine einstellbare
Oszillationsfrequenz haben, die darauf eingestellt werden kann,
den Strom bei verschiedenen Frequenzen zu stören, so dass mit verschiedenen
Raten Tröpfchen
erzeugt werden. Darüber
hinaus kann er in Verbindung mit dem Stromdruck verwendet werden,
um die Geschwindigkeit der Tröpfchenbildung
festzulegen.
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Ein
Detektor (72), wie zum Beispiel ein Laser und einen Empfänger in
Kombination, kann, wie in 1 ersichtlich,
dazu verwendet werden, den Strom hinsichtlich eines Teilchens zu überwachen.
Der Detektor kann das Teilchen in dem Strom detektieren, wenn das
Teilchen zum Beispiel einen kohärenten
Lichtstrahl durchläuft,
mit dem der Detektor auf den Strom zielt. Wenn der kohärente Lichtstrahl
ein Teilchen in dem Strom auffängt,
können
Fluoreszenz oder gestreute Lichtstrahlen, wie in 2 ersichtlich,
an einen Empfänger
des Detektors emittiert bzw. Zu diesem abgelenkt werden. Alternative
Verfahren der Detektion sind auch von Fachleuten auf dem Gebiet
gut nachvollziehbar.
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Da
die Tröpfchen
in die Freifallzone fallen, können
sie einen Sortierkraftgenerator (80), wie zum Beispiel
in 1 gezeigte, elektrostatische Platten durchlaufen.
Wenn die Tröpfchen
mit einer positiven oder negativen Ladung geladen worden sind, wird
ein zwischen diesen elektrostatischen Platten aufgeladenes elektrisches
Feld die Tröpfchen
ablenken, so dass die Trajektative der Tröpfchen gändert wird. Wie in 1 ersichtlich,
können
diese Tröpfchen
dann in einen Behälter
(76) abgelenkt werden, der als ein Probensammler dient.
In gleicher Weise können
die jenigen Tröpfchen,
die neutral geladen sind, in den mittleren Behälter fallen, wie in 1 gezeigt,
und die, die entgegen gesetzt geladen sind, fallen in einen dritten
Behälter.
Darüber
hinaus können
alternative Verfahren wie zum Beispiel die Anwendung verschiedener
Ladungsmengen, dazu verwendet werden, eine noch größere Ablenkung
zu erreichen.
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Um
die Ladung der Tröpfchen
zu erreichen, kann eine Ladeverrichtung (84) dazu verwendet
werden, das Stromfluid zu laden. Folglich, wenn ein Teilchen detektiert
ist und bekannt ist, dass es die Tröpfchenabrisstelle erreicht
hat, kann der Strom geladen werden, so dass, wenn das Tröpfchen,
wenn es vom Strom abreißt,
es eine Solladung enthält.
Eine Solladung sollte entweder als eine positive, negative oder
sogar neutrale Solladung verstanden werden. Dann kann die Ladevorrichtung
ausgeschaltet oder sogar dazu konfiguriert werden, eine entgegengesetzte
Ladung zu produzieren, so dass nachfolgende Tröpfchen, die von den Teilchen
enthaltenden Tröpfchen
mit Ladung induziert worden sind, entgegenwirkend zurück zu dem
statischen Ladezustand des Stroms geladen werden – typischer
Weise eine neutrale Ladung.
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Ein
Sensor (88) kann dazu verwendet werden, viele der Verfahren
der vorliegenden Erfindung auszuführen. Zunächst kann der Sensor (88)
eine Eigenschaft des Durchflusszytometers messen, die auf einem
von dem Fluidstrom erfassten Bild basiert. Eine solche Eigenschaft,
die der Sensor messen kann, ist die Geschwindigkeit des Stromes
an einer Stelle entlang des Stroms.
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Zwei
Stellen von besonderem Interesse sind die Geschwindigkeit des Stroms
in dem Bereich direkt unter der Austrittstelle des Stroms aus der
Düse und
in etwa bei der Tröpfchenabrissposition
des Stroms.
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Der
Sensor (88) kann ausgerichtet sein, um eine Wellenlänge (92)
des Stroms, wie in 2 gezeigt, zu messen. Digitale
Bildverarbeitungsroutinen können
auf die Wellenform angewendet werden, um beispielsweise die Länge einer
stehenden Welle zu messen. Darüber
hinaus kann der Sensor ausgerichtet sein, einen Abstand zwischen
Tröpfchen
des Stroms zu messen, so dass der Abstand und die Schwingungsfrequenz
des Oszillators dazu verwendet werden können, die Geschwindigkeit des
Tröpfchens
an dieser Stelle entlang des Stroms zu berechnen. Der Sensor (88)
kann eine Kamera (102) mit einer Weitwinkellinse, die einen
großen Bereich
des Stroms erfassen kann, oder mehrere Kameras nutzen, wie die in 2 erkennbaren,
eine Kamera (96) ein Bild des Stroms an der Austrittsstelle
erfasst und Kamera 98 ein Bild am Tröpfchenabrisspunkt des Stroms
erfasst. Auf diese Weise können
die Kamera (96) und die Kamera (98) als ein erster
Sensor bzw. zweiter Sensor zum Ermitteln von Geschwindigkeiten an
verschiedenen Stellen entlang des Stroms dienen. Die Kamera (102),
wie in 1 gezeigt, kann ein Bild (106) des Stroms
erfassen und es auf einem Bildschirm (114) anzeigen.
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Die
Kamera (102) kann so ausgerichtet sein, dass verschiedene
Eigenschaften des Stroms erfasst werden. Zum Beispiel kann die Kamera
so ausgerichtet sein, dass sie die Breite (110) des Stroms,
wie in 3 dargestellt. erfasst. Die Kamera kann alternativ
oder zusätzlich
ausgerichtet sein, ein Bild zu ermitteln, das eine Ermittlung einer
Geschwindigkeit des Stroms erlaubt. Wie oben diskutiert kann dies
durch Messen der Wellenlänge
des Stroms oder durch Messen eines Abstandes zwischen zwei Tröpfchen und
Verwendung der bekannten Oszillationsfrequenz erreicht werden, um
eine Geschwindigkeit für
den Strom an diesen zwei Stellen zu berechnen. Das Produkt der Oszillationsfrequenz
und des Abstandes zwischen Tröpfchen (oder
die Stromwellenlänge)
würde nämlich eine
Stromgeschwindigkeit an dieser Stelle ergeben.
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Zusätzlich können die
Kamera oder der Sensor ausgerichtet sein, um ein Bild zu erfassen,
das die Ermittlung einer Änderung
der Stromposition erlaubt. Dies kann durch Überwachungen einer ersten Position
des Stroms, Aufzeichnen dieser Position und dann Überwachen
des Stroms über
die Zeit erfolgen, um zu sehen, ob sich der Strom von dieser vorher
ermittelten Position wegbewegt. Die Kamera kann ein Bild des Stroms
an der Abrisstelle sowie an der Stromaustrittsstelle erfassen, wo
der Strom des Zytometer verläuft.
Die Kamera kann im Wesentlichen in verschiedene Ausrichtungen ausgerichtet
sein, um viele Ansichten zu erfassen, um Informationen über den
Strom zu erfassen, was folglich dem Sensor ermöglicht, Informationen über die
Charakteristika des Zytometers zu ermitteln. Die verschiedenen Kameras
können
zur Erfassung der Bilder des Stroms verwendet werden, es ist jedoch
bevorzugt, eine Kamera zu verwenden, die eine digitale Wiedergabe für ein Bild
des Stroms erstellt, und insbesondere eine solche Kamera, die eine
ladungsgekoppelte Vorrichtung oder CCD verwendet. Eine CCD kann
als Ergebnis eine Folge von analogen Spannungspulsen erzeugen, die jeweils
einer von einem CCD-Pixel empfangen Lichtintensität entsprechen.
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Wenn
der Sensor (88) ein Bild des Stroms erfasst, kann das auf
dem Bildschirm (114) angezeigt werden. Der Bildschirm kann
dem Anwender dann ein Bild des Stroms anzeigen. Typischer Weise
weist ein Bildschirm (114) auch einzelne Pixelelemente
(118) auf, eine digitale Ausführungform des von dem CCD erhaltenen
Bildes betreffen. Die Pixelelemente der CCD (sowie die Bildschirmausführung) können mit
einem physikalischen Abstand korreliert werden, um eine genaue Ermittlung
einer tatsächlichen
Abmessungen des Stroms zu erreichen. Der Bildschirm (114)
kann an dem Durchflusszytometer positioniert sein oder, wenn es
erwünscht ist,
das Durchflusszytometer an einer entfernten Position zu überwachen,
kann der Bildschirm (114) an einer solchen entfernten Position
angeordnet sein.
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Eine
Speichervorrichtung (122) kann verwendet werden, um mindestens
einen Parameter für
das Durchflusszytometer zu speichern. Wenn ein Bild von der Kamera
(102) erfasst wird, kann die Speichervorrichtung auch dazu
dienen, eine Wiedergabe des Stroms, insbesondere eine digitale Wiedergabe
des Stroms, zu speichern. Ein bildgebendes Mittel (126)
kann vom Sender dazu verwendet werden, eine digitale Wiedergabe
des Stroms zu erzeugen. Insbesondere kann ein Mittel zur Umrisserzeugung
(130) verwendet werden, einen Umriss des Stroms (134)
zu erzeugen, wie in der Wiedergabe des Stroms in 3 gezeigt.
Ebenso kann dieses Mittel zur Umrisserzeugung (130) dazu
verwendet werden, einen Umriss eines einzelnen Tröpfchens (138)
zu erstellen. Digitale Wiedergabe ist als eine Wiedergabe des Objektes
gemeint. Für
dieses Patent wird sie auch als Wiedergabe aufgefasst, wenn nur
ein Teil oder ein Umriss der Begrenzung statt des ganzen Objekts
verwendet wird. Das Mittel zur Umrissbildung kann ein übliches
digitales Bildverarbeitungsprogramm oder einen digitalen Videoprozessor,
der ein Bild bearbeiten kann, um das tatsächliche Signal gegenüber dem Rauschen
in dem Signal zu detektieren. Solche digitalen Bildverarbeitungsprogramme
können
ersichtlich sein durch Bezugnahme auf: Digital Imaging Processing
von Kenneth R. Castleman, Prentice Hall, 1. Dezember 1995; The Imaging
Processing Handhook von John C. Russ, CRC Pr. Januar 1995; Digital
Image Processing von Raphael C. Gonzalez, Addison-Wesley, 1. April
1992; und Algorithmus for Image Processing von James R. Parker,
John Whiley & Sons,
1. November 1996, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Darüber
hinaus behandelt das US-Patent 5,700,692 Bildgebungsverfahren und
ist hiermit durch Bezugnahme hinsichtlich der offenbarten Bildgebungsverfahren
aufgenommen.
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Ein
Analysator (142) kann dazu verwendet werden, ein Bild des
Stroms zu analysieren, um Informationen über das Durchflusszytometer
zu ermitteln. Zum Beispiel kann der Analysator einen Abstand zwischen Objekten
ermitteln. Ferner kann der Analysator basierend auf der Tröpfchenposition
in dem Bild und der statischen Position des ungeladenen Stroms eine
Ablenkung eines geladenen Tröpfchens
von der Mittelachse des Stroms ermitteln. Dies kann einfach durch
Messung des Abstandes des Tröpfchens
vom statischen Strom mit einem üblichen
digitalen Bildverarbeitungsprogramm erreicht werden.
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Der
Analysator (142) kann auch eine Ladung auf dem Tröpfchen ermitteln.
Wenn man zum Beispiel wissen möchte,
ob die richtige Ladung auf ein Tröpfchen übertragen wurde, kann der Analysator
dazu verwendet werden, die verglichen mit der erwarteten Ladung
auf dem Tröpfchen
tatsächliche
Ladung zu ermitteln. Dies kann erreicht werden, indem die Ablenkung
des geladenen Tröpfchens
vom Strom aufgezeichnet wird, die Tröpfchengröße basierend auf dem Bild aufgezeichnet
wird, die Masse des Tröpfchens
aufgezeichnet wird, die eine Funktion der Tröpfchengröße und der Masse des bekannten
Fluids und des bekannten elektrischen Feldes ist, das von den Ablenkungsplatten
aufgebaut wird. Auf diese Weise kann die tatsächliche Ablenkung dazu verwendet
werden, die Ladung auf dem Tröpfchen
abzuleiten, und daher kann diese tatsächliche Ladung mit der erwarteten
verglichen werden, um zu bestätigen,
ob das Ladeverfahren die Tröpfchen
tatsächlich
auf die richtige Ladung lädt.
Darüber
hinaus können
eine Tröpfchengröße an der
Abrisstelle und die Ladestelle detektiert werden, die eingestellt
ist, um die Tröpfchen
zu laden, so dass sie nun die durch ihre Größe vorgegebene, richtige Distanz
abgelenkt werden.
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Der
Analysator kann auch dazu verwendet werden, die beste "Auffächerungsladung" (engl.: "defanning" charge) basierend
auf der Ablenkung (oder Ladung) eines vorhergehenden Tröpfchens
zu berechnen. Wenn zum Beispiel ein sehr konstanter Strom von ungeladenen
Tröpfchen
aufgebaut werden soll, d. h. es soll ein Strom von ungeladenen Teilchen
vermieden werden, was den Strom so erscheinen lässt, als ob er sich vor und
zurück
auffächert,
ist es oft notwendig, eine Teilladung auf Tröpfchen zu übertragen, die geladenen Tröpfchen benachbart
sind. Das liegt daran, dass die geladenen Tröpfchen eine La dung in benachbarte
Tröpfchen induzieren.
Indem Tröpfchen,
die nach einem geladenen Tröpfchen
auftreten, schwach geladen werden, kann der von dem geladenen Tröpfchen verursachten
induzierten Ladung auf dem nachfolgenden Tröpfchen entgegengewirkt werden.
Wenn zum Beispiel von einem positiv geladenen Tröpfchen zu erwarten ist, dass
es eine negative Ladung in ein nachfolgendes Tröpfchen induziert, kann das
nachfolgende Tröpfchen
geringfügig
positiv geladen werden, um dem induzierenden Effekt entgegen zu
wirken.
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Der
Analysator kann auch dazu verwendet werden, die Breite eines Stroms
zu messen, was eine Ermittlung einer Düsengröße erlaubt. Zum Beispiel kann
die Strombreite von 60 Mikron (oder 25 Pixel bei einem 480×512 Pixelbild)
dazu festgelegt werden, eine Düsengröße von 70
Mikron anzuzeigen. Ferner kann der Analysator dazu verwendet werden,
die beste Resonanzfrequenz für
das Zytometer zu ermitteln. Zum Beispiel kann das Bild analysiert
werden, um zu sehen, wo der Strom die kürzeste Abrisstelle aufbaut,
und die Oszillationsfrequenz des Oszillators kann eingestellt werden,
um dieser Stelle zu entsprechen. Typischerweise wird dies eine Funktion
der Düsengröße und Geschwindigkeit
sein.
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Darüber hinaus
kann der Analysator dazu verwendet werden, die Geschwindigkeit des
Stroms zu ermitteln, die auf in dem Bild ermittelten Abständen und
der bekannten Frequenz des Oszillators basiert. Um diesen Analyseprozess
durchzuführen,
kann der Analysator (142) einen Computer (146)
verwenden. Der Computer (146) kann die abgeschätzte Geschwindigkeit
des Stroms an einer ersten Position und die ungefähre Stromgeschwindigkeit
an einer zweiten Position entlang des Stroms dazu verwenden, um
eine Stromcharakteristika zu ermitteln, indem die Geschwindigkeit
des Stroms in einem Bereich, der, zwischen der Stromaustrittsstelle
und der Tröpfchenabrisstelle
auftritt, als sich bezogen auf den Abstand näherungsweise exponentiell abnehmend
modelliert wird.
-
Darüber hinaus
kann der Analysator ein Mittel zur Bestimmung einer Änderung
der Tröpfchenabrissposition
(150) verwenden, um festzustellen, wenn sich die Abrissposition
des Stroms ändert.
Dies kann erreicht werden, indem eine Tröpfchenabrissposition aufgezeichnet
und diese Position mit nachfolgenden Abrisspositionen, die in nachfolgenden
Bildern festgehalten sind, verglichen werden. Ein einfaches Computerprogramm kann
dazu verwendet werden, das Mittel zur Bestimmung einer Änderung
der Tröpfchenabrissposition
zu erreichen, indem eine Wiedergabe der Tröpfchenabrissposition gespeichert
wird, eine zweite digitale Wiedergabe erfasst wird und dann die
zwei Wiedergaben verglichen werden, um zu sehen, ob sie übereinstimmen.
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Der
Analysator kann auch ein Mittel zur Bestimmung einer Tröpfchenverzögerung (154)
verwenden, die mit einem detektierten Teilchen zugeordnet ist. Eine
Tröpfchenverzögerung (oder
Tröpfchenverzögerungszeit)
wird als Zeitverzögerung
zwischen Detektion eines Teilchens in dem Strom und Wirkung auf
das Tröpfchen
aufgefasst, in dem das Teilchen enthalten ist, um eine Aussortierung
des Teilchens auszuführen.
Zum Beispiel wird in einem typischen Durchflusszytometer ein Teilchen
von einem Detektor detektiert und die Charakteristika des Teilchens
werden basierend auf einer Fluoreszenzlicht vom Teilchen bestimmt.
Basierend auf der Charakteristik wird das Tröpfchen, in dem sich das Teilchen
befindet, kurz bevor es vom Strom abreißt, geladen und von einem elektrostatischen
Sortierer aussortiert. Die Tröpfchenverzögerung kann
in diesem Fall als Zeit zwischen Detektion des Teilchens und Laden
des Tröpfchens
aufgefasst werden. In einer anderen Ausführung könnte man wählen, alle Tröpfchen zu
Laden, das elektrostatische Feld jedoch nur auf das auszusortierende
Teilchen/Tröpfchen
angelegt wird. In diesem Fall wäre
die Tröpfchenverzögerung die
Zeit zwischen der Detektion des Teilchens und dem Vorgang, das elektrostatische
Feld anzulegen. In gleicher weise könnte die Tröpfchenverzögerung zu einem Zeitpunkt nach
der ersten Detektion des Teilchens beginnen, zum Beispiel der Zeitpunkt,
wann das Teilchen fluoresziert. In diesem Fall könnte die Tröpfchenverzögerung als Zeit zwischen Detektion
von Fluoreszenz und des Zeitpunktes, an dem das Teilchen die Ladezone
erreicht. Für
Ausführungen,
die einen Ladering zum Laden eines Tröpfchens vom Strom getrennt
verwenden, könnte
die Tröpfchenverzögerung in
gleicher Weise ausgehend von der Stelle der Teilchendetektion zu
der Stelle berechnet werden, wo das Laden stattfindet. Die Ermittlung
der Tröpfchenverzögerungszeit
kann mit einem einfachen Softwareprogramm erreicht werden, indem
zum Beispiel eine Geschwindigkeit des Fluidstroms an einer bestimmten
Position ermittelt wird und die Geschwindigkeit des Stroms basierend
auf einer in Bezug auf den Abstand exponentiell abnehmenden Geschwindigkeit
modelliert wird. Die Softwareroutine könnte die Geschwindigkeitsänderung
des Stroms über
eine Strecke berücksichtigt
und eine Zeit für
das Teilchen zum Durchlaufen dieser Strecke, um an der Ladungszone
anzukommen, ableiten. Zum Beispiel kann ein Komparator (158)
dazu verwendet werden, über
den Strom ermittelte Informationen zu vergleichen, zum Beispiel
eine gemessene Eigenschaft des Durchflusszytometers mit einem Parameter
des Durchflusszytometers. Im Sinn dieser Anwendung ist ein Parameter
ein vorbestimmter oder erwarteter Wert für eine Charakteristik einer
Sache, wie zum Beispiel eine erwartete Breite eines Stroms in einem
Durchflusszytometer, eine erwartete Düsengröße, eine erwartete Abrissposition,
eine erwartete Stromstelle, usw. Andererseits und wiederum im Sinn
dieser Anwendung ist eine "Eigenschaft", eine Qualität, ein Merkmal
oder ein für
eine Sache repräsentativer
quantitativer Wert, wie zum Beispiel die gemessene Breite des Durchflusszytometerstroms,
der gemessene Druck des Stroms, der gemessene Abstand von einer
Düsenspitze
zur Tröpfchenabrisstelle,
die gemessene Temperatur des Stroms, die tatsächliche Masse des für den Strom
verwendeten Fluids, usw. Das Mittel zur Bestimmung der Tröpfchenverzögerung kann
einen Kompensator (162) dazu verwenden, um eine Änderung
der Geschwindigkeit des Stroms zu kompensieren, nachdem der Strom
an der Austrittsstelle des Durchflusszytometers austritt. Im Wesentlichen
kann dieser Kompensator eine Softwareroutine umfassengebildet werden,
die die Geschwindigkeit des Fluids als expo nentiell abnehmend modelliert,
wie dies ein Fachmann einfach verstehen würde.
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Ein
Zeitverzögerungsgenerator
(164) kann vom Durchflusszytometer (20) dazu verwendet
werden, eine Verzögerung
beim Laden des Tröpfchens
zur Verfügung
zu stellen, das das detektierte Teilchen enthält, wenn das Teilchen im Strom
detektiert wurde. Basierend auf den Ergebnissen eines Analysators
kann der Zeitverzögerungsgenerator
zur Steuerung des Tröpfchenladevorrichtung
(84) eingestellt und verwendet werden. Ein Signalgenerator
(168) kann von dem Analysator dazu verwendet werden, ein
Signal für
das Durchflusszytometer oder externe Anzeigevorrichtungen basierend
auf den ermittelten Informationen über den Strom zu erzeugen.
Der Signalgenerator kann zum Beispiel ein Signal erzeugen, das verwendet
wird, um die Tröpfchenabrissposition
wiederherzustellen. Darüber
hinaus kann der Signalgenerator eine Fehlerwarnung für das Durchflusszytometer
basierend auf den ermittelten Informationen über den Strom ausgeben. Zusätzlich kann
der Signalgenerator dazu verwendet werden, ein Signal für das Durchflusszytometer
auf der Grundlage des Vegleichs der ersten digitalen Wiedergabe
und einer zweiten digitalen Wiedergabe des Stroms, wie oben erklärt, zu erzeugen.
-
1 zeigt
eine entfernte Paging-Vorrichtung (172), die bei einer
Bedienperson des Durchflusszytometers angeordnet sein kann, wenn
die Bedienperson den Bereich, wo sich das Durchflusszytometer befindet, verläßt. Angesichts
der Verbesserungen der vorliegenden Erfindung, die es dem Durchflusszytometer
erlauben, katastrophale Ereignisse zu detektieren, ist es für eine Bedienperson
möglich,
das Durchflusszytometer unbeaufsichtigt zu lassen und Arbeiten an
anderer Stelle durchführen.
Die entfernte Paging-Vorrichtung kann dazu verwendet werden, die
Bedienperson zu warnen, dass sich zum Beispiel ein katastrophales
Ereignis ereignet hat, d. h. ein Ereignis, das eine Beendigung des
Sortiervorgangs verlangt, wie zum Beispiel ein totaler Verlust des
Stroms, verstopfte Röhren
oder Düse
oder Luft in der Zytometerkammer, so dass die Bedienperson zum Durchflusszytometer
zurückkehren
und jegliches Problem, das existieren könnte, bearbeiten kann. Ein entfernter
Computerbildschirm (176) kann auch mit dem Durchflusszytometer
verwendet werden, um eine ähnliche
Warnung zu liefern. Zum Beispiel könnte das Durchflusszytometer
mit einer Windows NT-Plattform verbunden sein, so dass eine Pop-Up-Nachricht auf einem
Endgerät
der Bedienperson angezeigt werden kann, die den Abschluss einer
Sortierung oder ein Problem bei dem Durchflusszytometer angibt.
In gleicher Weise kann das Durchflusszytometer mit einem E-Mail-System
verbunden sein, so dass eine E-Mail-Nachricht automatisch an einen
Benutzer oder einen interessierten Beteiligten geleitet werden kann.
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Eine
Alarmschaltkreisanorndung (180) kann dazu verwendet werden,
eine Alarmbedingung anzuzeigen. Eine derartige Schaltkreisanordnung
kann einen Alarm (184) aufweisen, der eine Vielfalt an
Konfigurationen annehmen kann, wie zum Beispiel eine dargestellte
Nachricht, ein blinkendes Licht, einen Summer oder andere allgemein
verwendete Vorrichtungen.
-
Eine
Eigenschaft der Vorrichtung ist die Verwendung eines mechanischen
Unterbrechers (188), der zum Abfangen und/oder Unterbrechen
des Stroms verwendet werden kann. Der mechanische Unterbrecher (188)
kann zum Beispiel verwendet werden, nachdem der Strom die Austrittsstelle
des Durchflusszytometers verlässt,
so dass der Strom unterbrochen und von seinem normalen Verlauf oder
dem nicht normalen Verlauf ab- oder umgelenkt werden kann, der aufgrund
eines Problems beim Durchflusszytometer verursacht wird. Der mechanische
Unterbrecher kann verwendet werden, um den Strom basierend auf einer
vom Sensor durchgeführten
Ermittlung zu unterbrechen. Auf diese Weise kann er automatisch
arbeiten. Eine mögliche
Ausführung des
mechanischen Unterbrechers kann, wie in 4 gezeigt,
eine Rinne (192) verwenden, die den Strom weg zu einem
Abfallbehälter
leitet, nachdem die Rinne schwenkt, um den Strom abzufangen. Alternativ
kann eine Ablenkvorrichtung (196) dazu verwendet werden,
in Position zu schwenken, so dass der Strom weg zu dem Abfallbehälter abgelenkt
wird. Vorzugsweise befinden sich diese mechanischen Ablenker nahe
an der Austrittsstelle des Stroms, so dass der Strom so früh wie möglich abgelenkt
werden kann, um eine Verunreinigung der gesammelten Proben zu vermeiden.
Beide können
entweder manuell oder automatisch schwenken oder gleiten.
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Mit
einem Hintergrundwissen über
die Vorrrichtung der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Verwendung
der Vorrichtung zum Erreichen vielfältiger Ausführungen der Erfindung nun besser
verstanden werden. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst
insbesondere die Verwendung eines bildgebenden Systems, um Bilder
des Stroms zu erfassen. Insbesondere kann die Tröpfchenabrisstelle des Stroms
als Bild erfasst werden, so dass eine Geschwindigkeit des Stroms
ermittelt werden kann. Dies kann erreicht werden, indem der Strom
abgebildet wird und die Tröpfchen,
die sich unterhalb der Tröpfchenabrisstelle
bilden, identifiziert werden und ein Abstand zwischen nachfolgenden
Tröpfchen
unter Verwendung bildgebender Verfahren ermittelt wird. Diese Tröpfchen bewegen
sich mit einer Geschwindigkeit sehr nahe der Geschwindigkeit des Tröpfchens,
das sich an der Tröpfchenabrisstelle
befindet. Das Bild des Stroms kann als digitales Bild in einem Speicher,
z. B. RAM, des Zytometers gespeichert werden.
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Bildgebungsverfahren
können
dazu verwendet werden, den Strom zu analysieren. Zum Beispiel kann elektrisches
Rauschen von einem erfassten Bild entfernt werden. Dies kann einschließen, ein
erstes Bild des Stroms an einer Stelle entlang des Stroms zu erfassen
und eine erste digitale Wiedergabe des Stroms basierend auf dem
ersten Bild zu erzeugen. Zum Beispiel könnte ein Umriss des Stroms
erzeugt werden. Dann kann diese digitale Wiedergabe des Stroms in
einem Speicher abgelegt werden. Zum Beispiel kann der Umriss in einem
Speicher gespeichert werden. Zusätzlich
kann ein Umriss von einem Tröpfchen
des Stroms erzeugt und ebenfalls im Speicher gespeichert werden.
Als nächstes
kann ein zweites Bild des Stroms an der gleichen Stelle erfasst
und eine zweite digitale Wiedergabe erzeugt werden. Die zweite digitale
Wiedergabe des Stroms kann auf dem zweiten erfassten Bild basieren.
Dann können
die zwei digitalen Wiedergaben des Stroms verglichen und basierend
auf dem Vergleich der ersten digitalen Wiedergabe mit der zweiten
Wiedergabe eine Ermittlung durchgeführt werden, ob sich eine Eigenschaft
des Stroms geändert
hat. Standardverfahren der digitalen Signalverarbeitung können dazu
verwendet werden, dies durchzuführen,
wie es ein Fachmann nachvollziehen würde.
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Darüber hinaus
kann eine Ausführungsform
der Erfindung basierend auf einem erfassten Bild Informationen über das
Durchflusszytometer ermitteln. Zum Beispiel könnte dies erreicht werden,
indem eine Eigenschaft des Durchflusszytometers basierend auf dem
erfassten Bild gemessen wird. Solche Eigenschaften könnten die
Breite des Stroms, die Geschwindigkeit des Stroms, den Druck des
Fluids, die Wellenlänge
einer Welle auf dem Strom, die die Stromgeschwindigkeit angibt,
oder andere Charakteristika umfassen. Darüber hinaus können Informationen über das
Durchflusszytometer ermittelt werden, indem ein physikalischer Abstand
einem digitalen Bildblock oder einer Pixelabmessung zugeordnet wird.
Ein tatsächlicher
physikalischer Abstand kann basierend auf der Anzahl an Blöcken oder
Pixeln bestimmt werden, die dazu verwendet werden, diesen Abstand
auf dem erfassten Bild anzugeben.
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Das
erfasste Bild kann auch zur Ermittlung einer Geschwindigkeit des
Stroms verwendet werden. Dies kann durch Messen einer Wellenlänge des
Stroms an einer Position entlang des Stroms erreicht werden. Darüber hinaus
kann die Oszillationsfrequenz des Oszillators in Verbindung mit
der gemessenen Wellenlänge dazu
verwendet werden, eine ungefähre
Geschwindigkeit des Stroms zu berechnen. Eine Geschwindigkeit des
Stroms kann an einer ungefähren
Austrittsstelle, wo der Strom das Durchflusszytometer verlässt, ermittelt werden,
indem dort eine Wellenlänge
erfasst und die bekannte Oszillatorfrequenz verwendet wird. Zudem kann
die ungefähre
Geschwindigkeit des Stroms an der beim Tröpfchenabrisstelle gemessen
werden, indem Tröpfchen
abgebildet werden und der Abstand zwischen den aufeinander folgenden
Tröpfchen
gemessen wird. Durch Verwenden der Oszillationsfrequenz zum Ermitteln
der Zeitspanne zwischen aufeinander folgenden Tröpfchen und in Anbetracht des
gemessenen Abstandes kann eine ungefähre Geschwindigkeit für die Tröpfchenabrisstelle
berechnet werden.
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Das
erfasste Bild kann auch zum Ermitteln einer Tröpfchenverzögerungszeit für ein Teilchen
im Strom verwendet werden. Dies kann erreicht werden, indem eine
ungefähre
erste Geschwindigkeit des Stroms an einer Stelle entlang des Stroms
und dann eine ungefähre
zweite Geschwindigkeit des Stroms an einer Stelle entlang des Stroms
ermittelt wird. Vorzugsweise würde
eine Geschwindigkeit nahe der Teilchendetektionsstelle für die erste
Geschwindigkeit des Stroms verwendet werden und eine Messung für die Stromgeschwindigkeit ungefähr bei der
Tröpfchenabrisstelle
für die
zweite Geschwindigkeit des Stroms erfolgen. Diese zwei Geschwindigkeiten
können
dann als Teile eines Models zum Zweck der Modellierung der Stromgeschwindigkeit verwendet
werden. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die Geschwindigkeit
des Stroms näherungsweise ausgehend
von der Stelle, wo er vom Durchflusszytometer ausgestoßen wird,
bis zu einer typischen Tröpfchenabrisstelle
exponentiell abnehmen wird. Eine geeignete Funktion der Geschwindigkeit
könnte
jedoch einfach für
den Strom bestimmt werden, indem Kalibrierdaten für den Strom,
sobald er aufgebaut ist, erzeugt werden und eine reele Funktion
für die
Geschwindigkeitsänderung
dieses Stroms für
die tatsächlichen
Bedingungen abgeleitet wird. Eine typische Geschwindigkeit des Stroms
an der Austrittsstelle wird bei einer Ausführungsform der Erfindung typischerweise
27 Meter pro Sekunde erreichen, wobei die Geschwindigkeit an der Abrisstelle
auf 25 Meter pro Sekunde abgenommen haben wird. Es wird angenommen,
dass dies aufgrund hydrodynamischer Relaxation des Stroms über die
Strecke von der Austrittsstelle bis zu der Tröpfchenabrisstelle so ist. Bei
früheren
Versuchen von anderen, eine geeignete Tröpfchenverzögerungszeit zu ermitteln, verwendeten
diese früheren
Versuche für
den ganzen Bereich des Stroms eine konstante Geschwindigkeit. Dies
führte
daher mög licherweise
zu einer weniger genauen Tröpfchenverzögerungszeit
und infolgedessen zu einem schlechteren Ergebnis beim Laden eines
gewünschten
Tröpfchens.
Wenn die erste Geschwindigkeit des Stroms und die zweite Geschwindigkeit
des Stroms gemessen werden, kann folglich die Stromgeschwindigkeit – wie experimentelle
Daten andeuten – im
Bereich zwischen der Austrittsstelle und der Tröpfchenabrisstelle als näherungsweise
exponentiell abnehmend modelliert werden. Mit der Stelle, wo ein
Teilchen detektiert wird, und einem bekannten Abstand zu einer Ladestelle
für das
das Teilchen enthaltende Tröpfchen
(oder sogar durch Ermittlung dieses Abstandes durch Abbildung des
Stroms, indem die momentane Tröpfchenabrisstelle
ermittelt wird, wenn das Teilchen entdeckt oder eine Verschiebung
dieser Tröpfchenabrisstelle überwacht
wird, wenn sie das Teilchen in dem Strom nach unten bewegt), kann
dann das Durchflusszytometer aufgrund der exponentiellen Abnahme
der Geschwindigkeit des Stroms in dem Bereich die Geschwindigkeitsänderung
kompensieren. Basierend auf dieser Modellierung der Stromgeschwindigkeit
und der Kompensation der Geschwindigkeitsänderung kann dann das Durchflusszytometer
eine Zeit für
das Teilchen ermitteln, in der es über die Distanz zu der Ladestelle
strömt.
Auf diese weise können
die ungefähre
Geschwindigkeit des Stroms an der ersten Position entlang des Stroms
und die ungefähre
Geschwindigkeit des Stroms an der zweiten Position entlang des Stroms
dazu verwendet werden, die Stromcharakteristika zu ermitteln, und
zwar bei diesem Beispiel eine Tröpfchenverzögerungszeit
für den
Strom.
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Wenn
eine Tröpfchenverzögerungszeit
berechnet worden ist, kann diese Tröpfchenverzögerungszeit verwendet werden,
um zu berechnen, wann das Teilchen eine Tröpfchenladestelle erreichen
wird, zum Beispiel basierend auf dem bekannten Zeitpunkt, als das
das Teilchen entdeckt wurde. Das Durchflusszytometer kann dann das
Teilchen enthaltende Tröpfchen
laden, wenn es die Ladezone erreicht, zum Beispiel durch Laden des
Stroms oder durch Verwenden eines Laderinges.
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Wie
vorher festgestellt, kann eine vorliegende Ausführungsform der Erfindung dazu
verwendet werden, Eigenschaften des Durchflusszytometers zu messen,
um Warnungen über
das Durchflusszytometer zu erzeugen. Dies kann einschließen zumindest
einen Parameter für
das Durchflusszytometer zu definieren, und diesen Parameter mit
einer gemessenen Eigenschaft oder Charakteristika des Durchflusszytometers
zu vergleichen. Hinsichtlich dieses Vergleiches kann das Durchflusszytometer
dann ermitteln, wann der Betrieb des Durchflusszytometer zumindest
einen für
das Durchflusszytometer definierten Parameter nicht erfüllt.
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Zum
Beispiel kann eine Warnung nach der Ermittlung, dass eine Positionsänderung
der Tröpfchenabrisstelle
aufgetreten ist, erzeugt werden. Bei früheren Aufbauten haben andere
auf einen Techniker vertraut, der ständig ein Bild des Stroms beobachtet,
um zu sehen, ob sich die Position der Tröpfchenarisstelle verschiebt.
Mit den vorliegenden Bildgebungsverfahren, die einen Vergleich vorheriger
Tröpfchenabrisstellen
mit nachfolgenden Tröpfchenabrisstellen
ermöglichen,
kann dieses Verfahren automatisiert werden, so dass ein Warnsignal
für eine
Bedienperson des Durchflusszytometer erzeugt wird.
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Als
weiteres Beispiel erlaubt das Durchflusszytometer die Einstellung
einer Tröpfchenverzögerungszeit,
um ein Tröpfchen
an der Tröpfchenabrisstelle
richtig zu laden. Dies kann beinhalten, die Geschwindigkeit und
die momentan bekannten Tröpfchenabrisstelle
zu einem Zeitpunkt zu detektieren, an dem das Teilchen detektiert
wurde, und dann die Tröpfchenverzögerungszeit
für dieses
spezielle Teilchen zu berechnen oder sogar diese Tröpfchenverzögerungszeit
wiederum einzustellen, wenn eine Tröpfchenabrisstellenveränderung nach
der Teilchendetektion erfasst wird.
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Darüber hinaus
ist eine Vorrichtung ausgelegt, ständig die Position der Tröpfchenabrisstelle
(oder Bezugsabrisstelle) (
48) des Stroms zu überwachen
und wiederherzustellen. Die Vorrichtung ermöglicht es, die Ermittlung der
Position der Tröpfchenabrisstelle
relativ zu der ortsfesten Stelle der Detektion des Teilchens in dem
Strom durch das Teilchendetektionssystem oder Detektor oder Laser
und Empfänger
(
72) zu überprüfen. Diese
Beurteilung der Position kann erreicht, indem hochauflösende Abtastungen
oder Bilder mit einer Kamera oder einem Bildschirm (
102)
sequentiell erfasst werden, die mit der Abtastphase und der Tröpfchenladephase (
84)
synchronisiert sind, um ein Bild von sequentiellen Tröpfchen aufzunehmen,
wenn sie die Abrisstelle von dem Strom erreichen. Die Bilder der
Tröpfchen
an der Position des Abrisses werden digitalisiert (
126)
und in einer Speichervorrichtung (
122) gespeichert. Digitalisierte
Daten, die die Position der Tröpfchenabrisstelle
betreffen, werden dann elektronisch verglichen. Der Abstand zwischen
Tröpfchenabrisstelle
kann mittels des digitalen Bildverarbeitungsprogrammes bestimmt
werden. Wenn die Tröpfchenabrisstelle
beginnt, sich in eine Richtung zu verschieben, kann dann ein Rückkopplungssignal
erzeugt werden, um die Amplitude der Oszillationen des Oszillator
(
68) entweder zu vergrößern oder
zu verkleinern, um die Tröpfchenabrisstelle
auf seiner früheren
Position wiederherzustellen. Die Position der Tröpfchenabrisstelle kann auf
diese Weise wiederhergestellt werden, weil der Abstand, in dem der
Tröpfchenabriss
vom Strom auftritt, eine Funktion der Stromgeschwindigkeit (Vb),
der Störungsamplitude
und einer Zeitkonstante ist, die eine Funktion der Oberflächenspannung,
Fluiddichte, Düsendurchmesser
(d
j)
j und Wellenlänge ist.
Die Störungsamplitude
(Va) ist durch eine Kopplungskonstante (Cc) proportional zu der
Oszillatorspannung des Oszillators (
68). Eine Tröpfchenabrissdistanz
(Xb), die relativ zu einer ortsfesten Position aufgrund von Fluktuation
der Stromgeschwindigkeit schwankt, kann somit durch Änderung
der Störungsamplitude
konstant gehalten werden, während
Wellenlänge,
Fluiddichte, Oberflächenspannung
und Düsendurchmesser
konstant gehalten werden. Diese Beziehungen werden in der folgenden
Gleichung zusammengefasst:
Xb = Vb·Te(Vb,d) – Vb·log(Cc·Va)/γ wobei
Te eine Verzögerungkorrektur
aufgrund des ungleichmäßigen Geschwindigkeitsprofils
des Stroms ist, wobei
Te = k/Vb = 332,0/Vb, und
γ definiert
wird durch eine Rayleigh Analyse wobei
und wobei
ξ = π·dj·f/Vb, wobei
zum Beispiel standardisierte Rayleigh Parameter verwendet werden.
-
Diese
funktionalen Zusammenhänge
werden in Verbindung mit Computersoftware und -hardware verwendet,
um eine Oszillationssteuerungsvorrichtung zu erstellen, die ein
Signal erzeugt, das die Spannung für den Oszillator einstellt,
was die Oszillation für
den Strom in Antwort auf die Positionsänderung der Bezugsabrisstelle
variiert. Die Variation der Oszillation für den Strom hält dabei
die Position der Bezugsabrisstelle aufrecht. Ein Fehler, die Bezugsabrisstelle
beizubehalten, kann zu einer computergesteuerten automatischen Aussetzung
der Sortiertätigkeit
führen.
-
Bei
einer anderer Vorrichtung kann ein Alarm oder eine Warnung basierend
auf der Information in dem erfassten Bild oder von daraus ermittelter
erzeugt werden. Ein derartiger Alarm oder Warnung können auf
einem Vergleich der ermittelten Informationen über das Durchflusszytometer
mit einer erwarteten Charakteristika des Durchflusszytometers basieren.
Dies könnte
umfassen eine Fehlerwarnung über
das Durchflusszytometer basierend auf einem Vergleich der ermittelten
Informationen und der erwarteten Charakteristika auszugeben.
-
Die
Typenmarkierungen, die von dem Durchflusszytometer ausgegeben werden
können,
können durch
die folgenden Beispiele ersichtlich werden. Zum Beispiel könnte es
erwünscht
sein, eine erwartete Strombreite, wie zum Beispiel die in 3 gezeigte
Strombreite (110) mit einer vorbestimmten Strombreite zu vergleichen,
die zur Verwendung bei einem besonderen Auf bau oder für ein besonderes
zu sortierendes Teilchen erwartet wird. Wenn eine erwartete Strombreite
erwartet und eine andere Strombreite gemessen wird, kann auf diese
Weise eine Warnung für
den Benutzer oder die Bedienperson erzeugt werden, die anzeigt,
dass eine falsche Düsengröße mit dem
Durchflusszytometer verbunden sein kann. In gleicher Weise könnte die Fehlerwarnung
anzeigen, dass ein ungeeigneter Druck verwendet wird. Wie vorher
beschrieben, kann das Bildgebungsverfahren ferner dazu verwendet
werden, eine Geschwindigkeit des Stroms zu ermitteln und diese Ermittlung
der Stromgeschwindigkeit könnte
dazu verwendet werden, eine Warnung über den Druck des Stroms auszugeben.
Wenn ein erwarteter Stromdruck eine vorbestimmte Stromgeschwindigkeit
erzeugen würde
und sich eine gemessene Stromgeschwindigkeit von dieser vorgegebenen
Stromgeschwindigkeit unterscheidet, dann könnte eine Fehlerwarnung angebracht
sein. Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist deren
Fähigkeit,
auf einen katastrophalen Fehler des Zytometers zu reagieren. Dies
könnte
durch eine erhebliche Positionsänderung
des Stroms aufgrund von Verstopfung der Düse am deutlichsten werden.
Die Abbildung des Stroms würde
es ermöglichen,
einen stationären
Zustand des Stroms aufzuzeichnen und mit nachfolgenden Bildern des
Stroms zu vergleichen. Wenn die verstopfte Düse zum Beispiel den Strom schräg ablenkt,
würde das
Bildgebungsverfahren zum Vergleich nachfolgender Bilder mit einem
stationären
Bild dem Durchflusszytometer erlauben, festzustellen, dass sich
ein katastrophales Ereignis ereignet hat, und eine Warnung an den
Benutzer auszugeben oder sogar automatisch das Sortierverfahren
zu unterbrechen, um die vorher sortierten Proben zu abzuschließen. Die
Warnung kann auf verschiedene Arten erzeugt werden. Eine derartige
Art könnte
darin bestehen, eine Warnung an einem entfernten Computerbildschirm
anzuzeigen, wo eine Bedienperson arbeitet. Darüber hinaus könnte eine
Warnung an eine Funkrufvorrichtung ausgegeben werden.
-
Eine
weitere bedeutsame Vorrichtung erlaubt es dem Durchflusszytometer,
basierend auf Informationen, die aus einem erfassten Bild ermittelt
wurden, die Quelle abzuschalten. Zum Beispiel bei einem katastrophalen
Fehler, der aufgrund einer Ablenkung des Stroms oder sogar einem
vollständigen
Verlust des Stroms detektiert wurde, kann das Durchflusszytometer
durch mechanisches Unterbrechen der Sortierung reagieren. Dies kann
erreicht, indem eine Rinne, wie in 4 dargestellt,
automatische bewegt, geschwenkt oder verschoben wird, um den Strom
abzufangen und den Strom dann in der Rinne zu einer Abfallaufnahmen
abzuleiten. Alternativ kann diese mechanische Unterbrechung durch
automatisches Bewegen, Gleiten oder Schwenken einer Ablenkvorrichtung,
zum Beispiel eine Platte, bewirkt werden, um den Strom weg von der
gesammelten Probe abzulenken, die schon vom Durchflusszytometer
produziert wurde. Dort, wo der Strom noch vorhanden ist, kann das
Durchflusszytometer alternativ oder vielleicht sogar zusätzlich arbeiten,
um die Ladevorrichtung oder die Ablenkungsquelle automatisch abzuschalten,
so dass die geladenen Teilchen nicht in die gesammelte Probe abgelenkt
werden.
-
Schließlich kann
eine Vorrichtung dazu verwendet werden, automatisch ein Alarmsignal
auszugeben. Auf diese weise kann eine Bedienperson benachrichtigt
werden, dass das Durchflusszytometer einen Alarmzustand, zum Beispiel
einen abnormen Zustand, aufweist. Solche Alarmsignale könnten entweder
einen akustischen oder visuellen Alarm verwenden.
-
Die
vorangegangene Diskussion und die folgenden Ansprüche beschreiben
die bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung. Darüber
hinaus versteht sich, dass die Verwendung des Wortes "umfassen" (engl.: "comprising") vielmehr eine einschließende Bedeutung
als eine ausschließende
Bedeutung haben soll. Im Ausland, wie zum Beispiel Australien, wo
diese Anmeldung als Prioritätsdokument
verwendet werden kann, soll die Bedeutung des Wortes "umfassen" (engl. "comprising") eine einschließende Bedeutung
haben.
-
Die
in dieser Anwendung enthaltene Erörterung ist dazu gedacht, als
eine grundlegende Beschreibung zu dienen. Der Leser sollte erkennen,
dass die spezifische Erörterung
nicht alle möglichen
Ausführungsformen explizit
beschreiben kann; viele Alternativen sind implizit. Der Markt und
die Herstellungsüberlegungen
können die
entsprechenden Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung vorgeben. Insbesondere im Bezug auf die Erörterung
soll es sich verstehen, dass eine Anzahl an Änderungen durchgeführt werden
kann, ohne sich dabei vom Wesentlichen der vorliegenden Erfindung
zu entfernen. Änderungen – die in
ihrem Ausmaß im
Wesentlichen die gleichen Resultate im wesentlichen auf die gleiche
Weise erreichen – fallen
in den Umfang der beigefügten
Ansprüche.
Sie kann auch die generische Beschaffenheit der Erfindung nicht
vollständig
erklären und
nicht explizit zeigen, wie jedes Merkmal oder Element für eine breite
Funktion oder in einer großen
Vielfalt von Alternativen oder äquivalenten
Elementen tatscählich
repräsentativ
sein kann. Nochmals, diese sind implizit in dieser Offenbarung enthalten.
Dort, wo die Erfindung mit Vorrichtungs-orientierten Fachausdrücken beschrieben
wird, übt
jedes Element der Vorrichtung implizit eine Funktion aus. Vorrichtungsdiskussionen
oder -ansprüche
können
nicht nur für
das beschriebene System aufgenommen sein, sondern es können auch
Verfahrens- und Prozessansprüche
aufgenommen werden, um die Funktionen zu behandeln, die die Erfindung und
jedes Element ausführt.
Als ein Beispiel dieses Aspekts sollte die Offenbarung eines "Sensors" verstanden werden,
dass auch die Offenbarung des Vorgangs des "Erfassens"- ob explizit erörtert oder nicht – umfasst
ist, und umgekehrt, wo es nur die Offenbarung des Vorgangs "Erfassen" gibt, sollte eine
solche Offenbarung so verstanden werden, dass die Offenbarung eines "Sensors" umfasst ist. Obwohl
die Verfahren, die das System betreffen, in verschiedenen Details
berücksichtigt
wurden, ist nur eine anfängliche
Erörterung,
die den Biosensor betrifft, aufgenommen worden. Selbstverständlich könnte diese
Erörterung
Anwendungen auf die vielen anderen Verfahren und Aspekte finden
könnte,
die überall
in der Offenbarung erörtert
wurden.
