DE69933739T2

DE69933739T2 - Biosensor mit drei Elektroden zur Kontrolle der Messverfälschungen durch interferierende Substanzen

Info

Publication number: DE69933739T2
Application number: DE69933739T
Authority: DE
Inventors: Shin Katano-shi Ikeda; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: CN1246614A; EP0984069A3; CN1134659C; JP2000065778A; EP0984069A2; DE69933739D1; EP0984069B1; JP3267936B2; US6212417B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor für die rasche und vereinfachte Mengenbestimmung eines Substrats in einer Probe mit hoher Genauigkeit.
Herkömmlicherweise sind Verfahren unter Verwendung der Polarimetrie, Colorimetrie, Reduktometrie, einer Vielfalt von Chromatographie- und dergleichen Verfahren entwickelt worden als Maß für eine quantitative Analyse von Zuckern, wie etwa Sucrose, Glukose und dergleichen. Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch sämtliche unzureichend spezifisch für Zucker und besitzen damit eine unzureichende Genauigkeit. Von den Genannten ist die Polarimetrie einfach bezüglich der Manipulation, jedoch stark beeinträchtigt durch die Temperatur bei der Manipulation. Dieses Verfahren ist deshalb nicht geeignet für eine einfache Quantifizierung bzw. Mengenbestimmung des Zuckerpegels im Heimeinsatz durch normale Leute.
Andererseits ist eine Vielzahl von Biosensoren vor kurzem entwickelt worden, welche eine spezifische katalytische Wirkung von Enzymen vorteilhaft nutzt.
Im Folgenden wird ein Verfahren für eine quantitative Analyse von Glukose als Beispiel des Verfahrens zur Mengenbestimmung eines Substrats in einer Probenlösung erläutert. Bei einer herkömmlich bekannten elektrochemischen Quantifizierung von Glukose handelt es sich um ein Verfahren zur Verwendung einer Kombination aus Glukoseoxidase (EC 1.1.3.4; nachfolgend abge kürzt als "GOD" bezeichnet) mit einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode (siehe "Biosensor", herausgegeben durch Shuichi Suzuki, Kodansha beispielsweise).
GOD oxidiert selektiv ein β-D-Glukose-Substrat in D-Glucono-δ-Lacton unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenmediator. Sauerstoff wird durch Wasserstoffperoxid während der Oxidationsreaktion durch GOD in Anwesenheit von Sauerstoff reduziert. Ein verringertes Sauerstoffvolumen wird durch die Sauerstoffelektrode gemessen oder ein erhöhtes Wasserstoffperoxidvolumen wird durch die Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Das verringerte Sauerstoffvolumen oder anderweitig das erhöhte Wasserstoffperoxidvolumen ist proportional zum Glukosegehalt in der Probenlösung. Die Glukosekonzentration in der Probenlösung kann deshalb mengenmäßig bestimmt werden auf Grundlage des verringerten Sauerstoffvolumens bzw. des erhöhten Wasserstoffperoxidvolumens.
Wie aus der Oxidationsreaktion durch GOD spekulativ angenommen, ist dieses Verfahren gemäß dem Stand der Technik jedoch mit dem Nachteil eines starken Einflusses auf das Messergebnis der Sauerstoffkonzentration in der Probenlösung behaftet. In dem Fall, dass Sauerstoff in der Probenlösung nicht vorliegt, erlaubt dieses Verfahren selbst keine Messung.
Unter diesen Umständen ist ein Glukosesensor neuen Typs entwickelt worden, der als Elektronenmediator eine organische Verbindung bzw. einen Methankomplex nutzt, wie etwa Kaliumferricyanid, Ferrocenderivat, Quinondericat etc. anstelle von Sauerstoff in der Probenlösung. Dieser Sensor reoxidiert eine reduzierte Form eines Elektronenmediators, der aus der Enzymreaktion herrührt, um die Glukoseskonzentration in der Probenlö sung auf Grundlage einer Oxidationsstroms zu messen, welche durch die Reoxidationreaktion erzeugt wird. Die Verwendung einer derartigen organischen Verbindung bzw. eines Metallkomplexes als Elektronenmediator anstelle von Sauerstoff gewährleistet eine präzise Platzierung einer bekannten GOD-Menge zusammen mit dem Elektronenmediator in ihrem stabilen Zustand auf dem Elektrodensystem bei der Bildung einer Reagenzschicht auf dem Elektrodensystem. Zu diesem Zeitpunkt kann die Reagenzschicht mit dem Elektrodensystem integriert werden, während die Erstgenannte in nahezu trockenem Zustand gehalten wird. Ein wegwerfbarer Glukosesensor auf Grundlage dieser Technologie ist deshalb kürzlich auf starkes Interesse gestoßen. Dieser wegwerfbare Glukosesensor erleichtert eine Messung der Glukosekonzentration unter Verwendung eines Messgerätes ausschließlich an dem Sensor durch einfache Einführung einer Probelösung in den Sensor, welcher mit dem Messgerät lösbar verbunden ist. Die Anwendung dieser Technik ist nicht auf die Glukosequantifizierung bzw. -mengenermittlung beschränkt, sondern kann auf die Mengenermittlung eines beliebigen anderen Substrats ausgedehnt werden, das in der Probenlösung vorliegt.
Eine Messung unter Verwendung des vorstehend genannten Sensors führt zu einer Ermittlung der Substratkonzentration in einer Probe auf Grundlage eines Oxidationsstroms, der bei einer Oxidation einer reduzierten Form eines Elektronenmediators auf eine Arbeitselektrode fließt. Wenn es sich bei der Probe um Blut, Fruchtsaft oder dergleichen handelt, wird jede leicht oxidierbare Substanz, wie etwa Ascorbinsäure, Urinsäure und dergleichen in der Probe auf der Arbeitselektrode zusammen mit der reduzierten Form des Elektronenmediators oxidiert. Diese Oxidation einer leicht oxidierbaren Substanz beeinträchtigt mitunter das Messergebnis.
Die Messung unter Verwendung des vorstehend genannten Sensors ist mit dem weiteren Problem einer gleichzeitigen Entwicklung der Reduktion des Elektronenmediators verbunden, der auf der Reagenzschicht getragen ist, zusammen mit der Erzeugung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung von aufgelöstem Sauerstoff in der Probe als Elektronenmediator. Das derart erzeugte Wasserstoffperoxid wirkt dahingehend, die reduzierte Form des Elektronenmediators zu reoxidieren. Dies führt mitunter zur Erzeugung von Messverfälschungen in den Messergebnissen durch den aufgelösten Sauerstoff, wenn die Substratkonzentration auf Grundlage des Oxidationsstroms der reduzierten Form des Elektronenmediators ermittelt werden muss.
Ein Biosensor der im Oberbegriff des Anspruchs 1 festgelegten Art ist aus der EP-A-0 732 406 und aus der EP-A-0 537 761 bekannt.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um das vorstehend genannte Problem der Biosensoren gemäß dem Stand der Technik zu überwinden, besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Biosensors, wie er im Anspruch 1 festgelegt ist.
Die normale Positionsbeziehung zwischen der Reagenzschicht und der dritten Elektrode ist derart, dass die Reaktionsschicht stromabwärts von der dritten Elektrode innerhalb des Probenlösungszufuhrpfads zu liegen kommt.
Die Reaktionsschicht ist bevorzugt in Kontakt mit der dritten Elektrode, der Arbeitselektrode und/oder der Gegenelektrode gegenüber liegenden Elektrode gebildet. Es ist sogar stets erforderlich, eine Reagenzschicht stromabwärts von der dritten Elektrode zu bilden, wenn die Probenlösung, welche in den Sensor eingeführt worden ist, die Reagenzschicht doch noch nicht aufgelöst hat, mit anderen Worten, wenn sie frei von einer reduzierten Form des Elektronenmediators ist, irgendetwas durch die dritte Elektrode Oxidierbares enthält, und wobei ein Oxidationsstrom zum Oxidieren dieser oxidierbaren Substanz gemessen werden kann, bevor die Probenlösung, welche die Reaktionsschicht auflöst und damit den reduzierten Elektronenmediator durch die Enzymreaktion enthält, an der dritten Elektrode anlangt.
Es ist bevorzugt, eine Schicht im Wesentlichen Lecithin enthaltend in einer vorbestimmten Position an einer Stelle getrennte von der dritten Elektrode, bevorzugt in einer Position im Kontakt mit der Reaktionsschicht enthält.
Bevorzugt enthält die Reagenzschicht ferner ein hydrophiles Polymer.
Währen die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den anliegenden Ansprüchen ausgeführt sind, lässt sich die Erfindung sowohl hinsichtlich ihres Aufbaus wie ihres Inhalts besser verstehen und würdigen zusammen mit weiteren Aufgaben und Merkmalen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER MEHREREN ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
1 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors gemäß einem Beispiel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen ist.
2 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors gemäß einem weiteren Beispiel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen ist.
3 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors vor noch einem weiteren Beispiel gemäß der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung stellt eine Modifikation eines Biosensors gemäß dem Stand der Technik dar, enthaltend ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, eine Reagenzschicht, welche eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält, und mit einer elektrisch isolierenden Basisplatte zum Tragen des Elektrodensystems und der Reagenzschicht, wobei eine Probenlösung der Reagenzschicht hinzugeführt wird, um eine Enzymreaktion hervorzurufen, um den Elektronenmediator zu reduzieren, wobei der resultierende Elektronenmediator reduzierter Form auf der Arbeitselektrode reoxidiert wird, um eine Substratkonzentration in der Probenlösung aus dem Oxidationsstrom zu ermitteln, welche durch die Reoxidationsreaktion fließt. Die vorliegende Offenbarung fügt dem vorstehend genannten Biosensor eine zusätzliche dritte Elektrode zu, welche die doppelte Funktion als interferierende Substanzermittlungselektrode hat, welche in einer Position in Gegenüberlage zu mindest entweder der Arbeitselektrode oder Gegenelektrode angeordnet ist und unter Anordnung der Reagenzschicht in einer vorstehenden Position entfernt von der dritten Elektrode.
In der vorliegenden Offenbarung umfasst der Biosensor eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein elektrisch isolierendes Abdeckelement zum Bilden eines Probenlösungszufuhrpfads zwischen dem Abdeckelement und der Basisplatte, und ein Elektrodensystem sowie eine Reagenzschicht, die beide auf der Basisplatte bzw. dem Abdeckelement derart gebildet sind, dass sie dem Probenlösungszufuhrpfad ausgesetzt sind, wobei die dritte Elektrode in einer gegenüberliegenden Position, wie nachfolgend festgelegt, zu zumindest entweder der Arbeitselektrode oder der Gegenelektrode angeordnet ist, wobei die Reagenzschicht in einer Position in einer bestimmten Position entfernt von der dritten Elektrode innerhalb des Probenlösungszufuhrpfads angeordnet ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung besteht das Abdeckelement aus einer elektrisch isolierten Basisplatte und einem Abstandhalter, der einen Schlitz zur Bildung des Probenlösungszufuhrpfads aufweist. Mehr im Einzelnen besteht der Biosensor aus zwei Schichten bzw. Lagen mit einer elektrisch isolierten Basisplatte und einem Abstandhalter. In dem Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gilt folgendes:

a) die Arbeits- und Gegenelektroden 2, 4 sind entweder auf der Basisplatte 1 oder dem Abdeckelement 11 gebildet, während die dritte Elektrode 7 auf dem andere Teil, der Basisplatte bzw. dem Abdeckelement gebildet ist;
b) ausschließlich die Arbeitselektrode 2 ist entweder auf der Basisplatte 1 oder dem Abdeckelement 11 gebildet, während die Gegen- und dritten Elektroden 4, 7 auf dem anderen Teil, der Basisplatte bzw. dem Abdeckelement gebildet sind;
c) die Arbeits- und dritten Elektroden 2, 7 sind entweder auf der Basisplatte oder dem Abdeckelement 11 gebildet, während die Gegenelektrode 4 auf dem anderen Teil, der Basisplatte oder dem Abdeckelement gebildet ist,

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Es ist bevorzugt, die Reagenzschicht in einer Position in Kontakt mit derjenigen Elektrode zu bilden, die sich in Gegenüberlage zu der Elektrode befindet. Die vorliegende Offenbarung ist jedoch nicht auf diese Anordnung beschränkt; vielmehr kann die Reagenzschicht in einer alternativen Position derart angeordnet sein, dass eine rohe Probenlösung an der dritten Elektrode zu einer bestimmten Zeit vor Ankunft an der dritten Elektrode eines Produkts der Enzymreaktion anlernen kann aufgrund der Auflösung der Reagenzschicht in der Probenlösung, welche auf dem Weg des Probenlösungszufuhrpfads zugeführt wird.
Wenn die Probenlösung eine leicht oxidierbare Substanz enthält, spiegelt der Oxidationsstrom in Übereinstimmung mit der Struktur des Biosensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, welcher Oxidationsstrom über die dritten und Gegenelektroden in einem anfänglichen Zustand der Messung nach der Probenzufuhr fließt, mit anderen Worten, vor Ankunft der reduzierten Form des Elektronenmediators als Produkt der Enzymreaktion an der dritten Elektrode, ausschließlich die Konzentration der leicht oxidierbaren Substanz. Die nachfolgende Messung des Oxidationsstroms über die Arbeits- und Gegenelektroden nach Ablauf von ausreichend Zeit, reflektiert den Strom, der erzeugt wird durch die Oxidationsreaktion der leicht oxidierbaren Substanz in der Probenlösung und der Oxidationsreaktion der reduzierten Form des Elektronenmediators, der aus der Enzymreaktion resultiert.
Eine Korrektur des Oxidationsstromwerts, der durch die nachfolgende Messung erhalten wird, und zwar durch diejenige, die durch die anfängliche Messung erhalten wird, ergibt deshalb eine präzise Konzentration des Substrats in der Probe.
Wenn die zugeführte Probe Sauerstoff enthält, ermöglicht die Anlegung eines geeigneten Potenzials an die dritte Elektrode in einer anfänglichen Stufe der Messung nach der Probenzufuhr, wie vorstehend angeführt, eine Messung des Oxidationsstroms, der die Konzentration des aufgelösten Sauerstoffs in der Probe reflektiert. Wenn die Substratkonzentration in der Probe aus dem Oxidationsstrom ermittelt wird, der zur Reoxidation der reduzierten Form des Elektronenmediators aufgrund der Enzymreaktion erforderlich ist, versagt der aufgelöste Sauerstoff in der Probe negative Fehler der gemessenen Werte. Eine ähnliche Korrektur bezüglich des Messwerts durch den Oxidationsstrom, der den aufgelösten Sauerstoff reflektiert, ergibt eine präzise Substratkonzentration, aus welcher jeglicher Einfluss des aufgelösten Sauerstoffs ausgeschlossen ist.
In der vorliegenden Erfindung wird die Oxidoreduktase, die in der Reagenzschicht enthalten sein soll, so ausgewählt, dass sie für den Typ des Substrats in der Probenlösung passt. Beispielhafte Oxidoreduktasen umfassen Fructosedehydrogenase, Glucoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Cholesteroloxidase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase und dergleichen.
Beispiele des Elektronenmediators umfassen Kaliumferricyanid, p-benzoquinon, Phenzinmethosulfat, Methylen blau, Ferrocenderivate. Diese Elektronenmediatoren werden einzeln oder in Kombinationen aus zwei oder mehr genutzt.
Das vorstehend genannte Enzym und der vorstehend genannte Elektronenmediator können in der Probenlösung aufgelöst werden bzw. sein. Anderweitig kann verhindert werden, dass sie in der Probenlösung aufgelöst werden, und zwar durch Fixieren der Reagenzschicht an der Basisplatte oder anderen Teilen. Wenn die zuletzt genannte Basisplatte zum Einsatz kommt, ist es bevorzugt, dass die Reagenzschicht außerdem eines der nachfolgend genannten hydrophilen Polymere enthält.
Eine Vielzahl von hydrophilen Polymeren sind auf der Reagenzschicht anwendbar. Beispielhafte hydrophile Polymere für diesen Zweck umfassen Carboxymethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose, Carboxymethylethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren, wie etwa Polylysol, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate, ein Polymer der Acrylsäure oder ein Acrylat, ein Polymer der Methacrylsäuren oder ein Methacrylat, Stärke und ihre Derivate, ein Polymer von Maleinanhydrid oder ein Maleat und dergleichen. Von diesen sind Carboxymethylzellulose, Hydroxye thylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose und Carboxymethylethylzellulose bevorzugt.
Obwohl in den nachstehend genannten Beispielen ein Potenzial von 500 mV oder von –1,300 mV an die dritte Elektrode angelegt wird, um die Zufuhr der Probenlösung zu erfassen, und um die existierende Askorbinsäure oder Sauerstoff in der Probenlösung zu ermitteln, wobei diese für die vorstehend genannten Beispiele gilt, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Potenzialwerte beschränkt. Obwohl ein Potenzial von 500 mV an die Arbeitselektrode angelegt wird, um einen Reaktionsstrom zu erhalten, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diesen Wert beschränkt; vielmehr kann ein beliebiger Potenzialwert, mit welchem die reduzierte Form des Elektronenmediators als Produkt einer Reaktionsreihe reoxidiert werden kann, verwendet werden. Der Messzeitpunkt für den Stromwert ist nicht auf die spezifische, in dem nachfolgend genannten Beispiel genannten Werte, beschränkt.
In den nachstehend genannten Beispielen sind einige Beispiele des Elektrodensystems gezeigt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele in Bezug auf die Elektrodenform, die Anordnung der Elektroden und ihrer Leitungen beschränkt und ebenso wenig auf einfache ??? zum Kombinieren mit anderen Sensorelementen. Die vorliegende Erfindung ist in den anliegenden Ansprüchen festgelegt.
Obwohl Kohlenstoff als Material für die dritte Elektrode in den nachfolgend genannten Beispielen verwendet, ist die vorliegende Erfindung nicht auf Kohlenstoff beschränkt; vielmehr kann ein anderes leitfähiges Material in ähnlicher Weise ver wendet werden, wie beispielsweise eine Silberelektrode bzw. eine Silberchloridelektrode.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand konkreter Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Ein Glukosesensor wird nunmehr als Beispiel eines Biosensors erläutert. 1 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors gemäß dem Beispiel 1 unter Weglassung der Reagenzschicht.
Eine Arbeitselektrode 2 und eine Gegenelektrode 4 sind auf einer elektrisch isolierten Basisplatte 1 zusammen mit Leitungsanschlüssen 3 und 5 gebildet, welche elektrisch mit den Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 verbunden sind. Eine dritte Elektrode 7 ist auf einer weiteren elektrisch isolierten Basisplatte 11 zusammen mit einem Leitungsanschluss 8 gebildet, der elektrisch mit der dritten Elektrode 7 verbunden ist. Eine (nicht gezeigte) kreisförmige Reagenzschicht wird auf der Basisplatte 1 derart gebildet, dass die Peripherie der Reagenzschicht entlang der Peripherie der Gegenelektrode 4 zu liegen kommt, um sowohl die Arbeitselektrode 2 wie die Gegenelektrode 4 abzudecken. Die Bezugsziffern 6 und 9 in der Figur bezeichnen Isolationsschichten.
Der Glukosesensor gemäß dem Beispiel 1 wird zusammengebaut unter Verwendung von zwei Schichten aus einer elektrisch isolierten Basisplatte 1 und einer solchen Platte 11, die hergestellt sind aus Polyethylenterephtalat, und unter Verwendung eines Abstandhalters 12, der sandwichartig zwischen den beiden Basisplatten 1 und 11 angeordnet wird. Diese Elemente sind aneinander in eine Positionsbeziehung geklebt, wie in 1 gestrichelt gezeigt, wodurch ein Glukosesensor gewonnen wird.
Der Abstandhalter 12 ist mit einem Schlitz 13 zur Bildung eines Probenlösungszufuhrpfads versehen. Die elektrisch isolierende Basisplatte 11 ist mit einem Belüftungsloch 10 versehen. Die Basisplatten 1 und 11 sind aneinander laminiert und geklebt, wobei der Abstandhalter 12 dazwischen angeordnet ist. Hierdurch kann ein Raum (nicht gezeigt) durch die Basisplatten 1, 11 und den Abstandhalter 12 gebildet werden, der als Probenlösungszufuhrpfad dient. Ein offenes Ende 14 des Schlitzes, welches eine Startseite des Raums festlegt, bildet eine Probenlösungszufuhröffnung bzw. einen -anschluss und eine Abschlussseite des Raums steht mit der Luftbohrung bzw. dem Luftloch 10 in Verbindung.
Eine Kombination aus Basisplatte 11 und Abstandhalter 12 entspricht dem vorstehend genannten Abdeckelement. Das Abdeckelement dieses Biosensors besteht aus zwei Elementen. Es kann jedoch aus ausschließlich einem Element mit einer Nut entsprechend dem Schlitz 13 des Abstandhalters 12 gebildet sein.
Der Glukosesensor des Beispiels 1 wird wie folgt hergestellt.
Eine Silberpaste wurde auf die elektrisch isolierende Platte 1 gedruckt, die aus Polyethylenterephtalat besteht, und zwar unter Verwendung eines bekannten Siebdruckverfahrens zur Bildung der Leitungsanschlüsse 3 und 5. Eine identische Silberpaste wurde auf die andere elektrisch isolierende Basisplatte 11 in derselben Weise gebildet, um den Leitungsanschluss 8 zu bilden. Daraufhin wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste, enthal tend ein Harzbindemittel, auf die Basisplatte 1 gedruckt, um darauf die Arbeitselektrode 2 zu bilden. Die dritte Elektrode 7 wurde auf der Basisplatte 11 in derselben Weise gebildet. Die Arbeitselektrode 2 und die dritte Elektrode 7 wurden elektrisch mit den Leitungsanschlüssen 3 und 8 verbunden.
Als nächstes wurde eine isolierende Paste auf die beiden Basisplatten 1 und 11 gedruckt, um eine isolierende Schicht auf der Basisplatte 1 und eine isolierende Schicht 9 auf der Basisplatte 11 zu bilden.
Die isolierende Schicht 6 deckt die Peripherie der Arbeitselektrode 2 ab und die isolierende Schicht 9 deckt die Peripherie der dritten Elektrode 7 ab, wodurch der freiliegende Bereich bzw. die freiliegende Fläche von sowohl der Arbeitselektrode wie der dritten Elektrode 7 konstant gehalten werden könnten. Die isolierenden Schichten 6 und 9 decken außerdem die Leitungsanschlüsse 3 und 5 und teilweise den Leitungsanschluss 8 ab.
Daraufhin wurde eine identische leitfähige Kohlenstoffpaste, enthaltend ein Harzbindemittel auf die Basisplatte 1 gedruckt, um darauf die Gegenelektrode 4 zu bilden. Die Gegenelektrode 4 wurde elektrisch mit den Leitungsanschlüssen 5 verbunden.
Ein GOD als Oxidoreduktase enthaltende wässrige Lösung und Natriumferricyanid als Elektronenmediator wurden auf die Arbeitselektrode 2 und die Gegenelektrode 4 tropfenweise aufgetragen und getrocknet, um die Reagenzschicht zu bilden.
Um eine gleichmäßige Zufuhr der Probenlösung zu der Reagenzschicht zu fördern, wurde daraufhin eine Lecithinschicht auf der Reagenzschicht gebildet durch Verteilen bzw. Auftragen eines organischen Lecithinlösungsmittels, beispielsweise einer Toluollecithinlösung ausgehend von der Probenlösungszufuhröffnung 14 in Richtung auf die Reagenzschicht, woraufhin sie getrocknet wurde.
Zu diesem Zeitpunkt vergrößert die Einordnung der Lecithinschicht in einer Position in Kontakt mit der Zwischenschicht 7 Schwankungen der Sensorreaktion. Dies kann auf der Ausbildung einer Änderung auf der Oberfläche der dritten Elektrode aufgrund der Lecithinschicht der Fall sein.
Schließlich wurden die Basisplatte 1 und 11 und der Abstandhalter 7 in einer in 1 gestrichelt gezeigten Positionsbeziehung aneinander geklebt, um den Glukosesensor des Beispiels 1 zu gewinnen.
Wenn bei der Herstellung die dritte Elektrode 7, die Arbeitselektrode 2 und die Gegenelektrode 4 in derselben Ebene angeordnet werden, deckt die Reaktionsschicht die dritte Elektrode 7 teilweise ab, was zu einem Fehler im Messergebnis führt. In dem vorstehend beispielhaft genannten Sensor ist die dritte Elektrode 7 in einer Position in Gegenüberlage zur Arbeitselektrode 2 und der Gegenelektrode angeordnet. Diese Anordnung der dritten Elektrode verringert drastisch Fehler der Messergebnisse, die durch die Lecithinschicht eingeführt werden, wie vorstehend angeführt.
Der derart hergestellte Glucosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet, welches speziell für den Sensor bestimmt ist. Daraufhin wurde ein Potenzial von 500 mV an die dritte Elektrode 7 und Nutzung der Gegenelektrode 4 als Referenz bzw. Bezugs punkt angelegt. Während das Potenzial angelegt wird, wurden drei μl der wässrigen Glukoselösung, enthaltend Ascorbinsäure als interferierende Substanz, dem Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die Probenlösung bewegt sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den Raum und löst die Reagenzschicht auf den Elektrodensystem auf.
Bei Zufuhr der Probenlösung wurde das System zum Ermitteln der Zufuhr der Probe auf Grundlage einer elektrischen Änderung zwischen der dritten Elektrode 7 und der Gegenelektrode 4 betätigt, das heißt, auf Grundlage der Flüssigkeitsverhinderung zwischen den vorstehend genannten beiden Elektroden auf Grundlage der Probenlösung und der Zeitgeber, der mit der Messeinrichtung versehen ist, wurde in Betrieb gesetzt. Während in diesem Zeitpunkt das Potenzial an der dritten Elektrode 7 und der Gegenelektrode 4 angelegt gehalten wurde, wurde der über die beiden Elektroden fließende Strom nach Ablauf einer bestimmten Zeit ausgehend von der Ermittelung der Zufuhr der Probenlösung gemessen. Der gewonnene Stromwert, der aus der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure abgeleitet wurde, die in der Probenlösung enthalten ist, und zwar als interferierende Substanz, war proportional zur Konzentration der Ascorbinsäure. Nach einer Messung des Stromwerts über die dritten und Gegenelekroden 7 und 4 wurde die Potenzialanlegung an die beiden Elektroden unterbrochen bzw. beendet.
Wie vorstehend angesprochen, ist die dritte Elektrode 7 in eine Position in Gegenüberlage zu der Arbeitselektrode 2 und der Gegenelektrode 4 gebildet und entfernt von der Reaktionsschicht angeordnet. Es dauert deshalb eine bestimmte Zeit bis zur Ankunft des Ferrocyanidions an der dritten Elektrode 7 als Produkt der Enzymreaktion der Reagenzschicht. Mit anderen Wor ten vermag der Stromwert über den dritten und Gegenelektroden 7 und 4 bis zu Ankunft des Ferrocyanidions an der dritten Elektrode die Konzentration ausschließlich von Ascorbinsäure zu reflektieren.
Ein Potenzial von 500 mV wurde an die Arbeitselektrode 2 unter Verwendung der Gegenelektrode 4 als Referenz 25 Sekunden nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung angelegt und der Stromwert über die Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 wurde nach 5 Sekunden gemessen.
Wenn die Reagenzschicht in der Probenlösung aufgelöst wird, entwickelt eine Reaktion von Glukose, GOD und des Ferricyanidions eine resultierende Mischlösung, um eine Oxidation von Glukose in Glukonolacton und eine Reaktion des Ferricyanidions in ein Ferrocyanidion zu erzeugen. Die Konzentration des Ferrocyanidions ist proportional zur Konzentration von Glukose. Der Strom über die Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 30 Sekunden nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung beruht auf einer Oxidationsreaktion zwischen dem Ferrocyanidion und der vorab vorliegenden Ascorbinsäure. Dies bedeutet, dass die vorab vorliegende Ascorbinsäure einen positiven Fehler des Messergebnisses hervorruft. Wie vorstehend angesprochen, reflektiert jedoch der Strom über die dritten und Gegenelektroden 7 und 4 die Konzentration von ausschließlich Ascorbinsäure. Eine Korrektur des nachfolgenden Messwerts auf Grundlage des Oxidationsstroms der Ascorbinsäure ergibt deshalb eine präzise Konzentration der Glukose, aus welcher jeglicher Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen ist.
Beispiel 2
Ein Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme hergestellt, dass Carboxymethylcellulose (nachfolgend abgekürzt "CMC" genannt) in der Reaktionsschicht angeschlossen bzw. enthalten ist. Daraufhin wurde der Sensor in derselben Weise wie in Beispiel 1 getestet.
Zunächst wurde eine wässrige CMC-Lösung auf die Arbeitselektrode 2 und die Gegenelektrode 4 auf der Basisplatte 1 tropfenweise aufgetragen und getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Daraufhin wurde eine gemischte wässrige Lösung aus dem Enzym und dem Elektronenmediator tropfenweise auf der CMC-Schicht aufgetragen. Dies ist Anlass für eine vorübergehende Auflösung der CMC-Schicht und eine darauf folgende Trocknung führt zu einer Reagenzschicht, in welchem das Enzym, der Elektronenmediator und CMC gemischt sind. Wenn die CMC-Schicht aufgelöst wird, würden jedoch das Enzym, der Elektronenmediator und CMC nicht vollständig gemischt, weil die gemischte wässrige Lösung zum Aufösen der CMC-Schicht nicht gerührt worden war. Hierdurch würde die Oberfläche des Elektrodensystems ausschließlich mit CMC abgedeckt. Da die Oberfläche des Elektrodensystems vor einem Kontakt mit dem Enzym und dem Elektronenmediator geschützt worden war, konnte eine Absorption von Protein auf der Oberfläche des Elektrodensystems verhindert werden.
Diese Struktur verringert Schwankungen der Sensorreaktion.
Beispiel 3
2 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors von Beispiel 3 unter Weglassung der Reagenzschicht.
Die Arbeitselektrode 2 wurde auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 zusammen mit einer Kohlenstoffschicht 15 gebildet, und die dritte Elektrode 7 sowie die Gegenelektrode 4 wurden auf der anderen elektrisch isolierenden Platte 11 gemäß dem im Beispiel 1 verwendeten Verfahren gebildet. Daraufhin wurden die Reagenzschicht und die Lecithinschicht auf der Arbeitselektrode 2 gebildet und die Kohlenstoffschicht 15 wurde gemäß dem in Beispiel 2 verwendeten Verfahren gebildet. Obwohl in dieser Schicht die Kohlenstoffschicht 15 nicht als Elektrode diente, erleichterte die Anordnung der Kohlenstoffschicht 15 und die Arbeitselektrode 2 die Bildung der Reagenzschicht. Ein Verkleben der Basisplatten 1 und 11 mit dem Abstandhalter 12, der dazwischen angeordnet ist, erfolgte wie im Beispiel 1 und ergab den Glukosesensor des Beispiels 2.
Ähnlich dem Beispiel 1 wurde eine wässrige Glukoselösung, gemischt mit Ascorbinsäure verwendet, um die Glukosekonzentration durch den Glukosesensor zu messen. Das Ergebnis zeigt eine präzise Glukosekonzentration, aus welcher der Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen war.
Wenn die Glukosekonzentration hoch ist (etwa 1000 mg/dl oder mehr beträgt), nimmt der über die Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 fließende Strom zu. Insbesondere erzeugt die hohe Glukosekonzentration eine starke Erhöhung der Nebenproduktmenge auf der Gegenelektrode 4. Eine Anordnung der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode kann mitunter dazu führen, dass das Nebenprodukt ungünstigen Einfluss auf die Sensorreaktion nimmt. Die Anordnung der Arbeits- und Gegenelektroden gemäß dem vorliegenden Beispiel verhindert optimal diese ungünstigen Einflüsse.
Beispiel 4
3 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors des Beispiels 4 unter Weglassung der Reagenzschicht.
Die Arbeitselektrode 2 und die dritte Elektrode 7 wurden auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 gebildet und eine Gegenelektrode 4d wurde auf der anderen elektrisch isolierenden Platte 11 gemäß dem Verfahren gebildet, das im Beispiel 1 zum Einsatz kommt. Daraufhin wurden die Reaktionsschicht und die Lecithinschicht auf der Gegenelektrode 4d gemäß dem in Beispiel 2 verwendeten Verfahren gebildet. Ähnlich wie in Beispiel 1 wurden schließlich die Basisplatten 1 und 11 miteinander verklebt, wobei ein Abstandhalter 12 dazwischen angeordnet war, um den Glukosesensor des Beispiels 4 fertig zu stellen.
Ähnlich wie in Beispiel 1 wurde eine wässrige Glukoselösung, gemischt mit Ascorbinsäure verwendet, um die Glukosekonzentration durch den Glukosesensor zu messen. Das Ergebnis zeigte eine präzise Glukosekonzentration, aus welcher der Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen war.
Die mit diesem Beispiel erzielbaren Wirkungen sind folgende: eine größere Oberfläche kann für die Gegenelektrode 4d im Vergleich zu den Arbeits- und dritten Elektroden 2 und 7 beibehalten werden, und das ReferenzPotenzial, welches bei Anliegen eines Potenzials genutzt wird, kann stärker stabilisiert werden aufgrund einer Positionierung der Reagenzschicht auf der Gegenelektrode 4d.
Die vorstehend genannten Effekte führen zu einer Verringerung der Schwankungen der Sensorreaktion.
Beispiel 5
Ein Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
Der derart hergestellte Glukosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet, das speziell für den Sensor bereitgestellt war. Daraufhin wurde ein Potenzial von –1300 mV an der dritten Elektrode 7 unter Nutzung der Gegenelektrode 4 als Referenz angelegt. Während das Potenzial angelegt wurde, wurden drei μl einer luftgesättigten wässrigen Glukoselösung dem Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die Probenlösung bewegte sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den Raum und führte zu einer Auflösung der Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem.
Bei Zufuhr der Probenlösung wurde das System zur Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung auf Grundlage einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 und der Zeitgeber betätigt, der in dem Messgerät vorgesehen war, wurde ausgelöst. Während das Potenzial über der Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 angelegt gehalten wurde, wurde zu diesem Zeitpunkt der über die beiden Elektroden fließende Strom nach Ablauf einer bestimmten Zeit ausgehend von der Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung ermittelt.
Der erhaltene Stromwert wird normalerweise abgeleitet aus der Reduktionsreaktion des aufgelösten Sauerstoffs in der Probenlösung; die Zufuhr einer Glukoselösung, die keine Luft enthielt, mit Argon führte jedoch zu einer drastischen Verringe rung des Reduktionsstroms.
Nachdem der Strom über die Gegenelektrode 4 und die dritten Elektrode 7 gemessen worden war, wurde die Potenzialanlegung an den beiden Elektroden gestoppt.
Wie vorstehend angesprochen, wurde die Reagenzschicht auf der dritten Elektrode 7 weggelassen. Es dauert deshalb einige Zeit bis zur Ankunft nahe an der dritten Elektrode des Ferrocyanidions, welches in der Reagenzschicht enthalten ist. Mit anderen Worten vermag der Stromwert über den Gegen- und dritten Elektroden 4 und 7 vor Ankunft des Ferrocyanidions nahe an der dritten Elektrode die Konzentration von ausschließlich dem aufgelösten Sauerstoff zu reflektieren.
Daraufhin wurde ein Potenzial von 500 mV an die Arbeitselektrode 2 unter Verwendung der dritten Elektrode 7 als Referenz 25 Sekunden nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung angelegt und der Stromwert über den Gegen- und Arbeitselektroden 4 und 2 wurde nach 5 Sekunden gemessen.
Wenn die Reagenzschicht in der Probenlösung aufgelöst wird, entwickelt eine Reaktion von Glukose, von GOD und des Ferricyanidions eine resultierende gemischte Lösung, um eine Glukoseoxidation zugunsten Glukonolaceton sowie eine Reduktion des Ferricyanidions in einem Ferrocyanidion hervorzurufen. Zu diesem Zeitpunkt schreitet die Enzymreaktion als Reaktion im Wettbewerb zu der vorstehend genannten Oxidation und Reaktion fort, um Gluconolaceton und Wasserstoffperoxid unter Verwendung des aufgelösten Sauerstoffs als Elektronenmediator zu erzeugen. Das Wasserstoffperoxid, welches durch die Enzymreaktion erzeugt wird, wirkt dahingehend, das Ferrocyanidion in ein Ferricyanidion zu reoxidieren. Der aufgelöste Sauerstoff erzeugt deshalb einen negativen Fehler im Messergebnis, wenn die Glukosekonzentration aus dem Oxidationsstrom abgeleitet wird, der erforderlich ist, das Ferrocyanidion zu oxidieren.
Wie vorstehend erläutert, spiegelt jedoch der Strom über der Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 die Konzentration ausschließlich Sauerstoff. Eine Korrektur des Messergebnisses mit der Sauerstoffkonzentration ergibt deshalb eine präzise Glukosekonzentration, aus welcher der Einfluss des aufgelösten Sauerstoffs ausgeschlossen ist.
Beispiel 6
Ein Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
Der derart hergestellte Glukosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet, das speziell für den Sensor ausgelegt war. Daraufhin wurde in Potenzial von 500 mV an die dritte Elektrode 7 unter Verwendung der Gegenelektrode 4 als Referenz angelegt. Während das Potenzial angelegt wird, wurden 3 μl einer luftgesättigten wässrigen Glukoselösung, enthaltend Ascorbinsäure, dem Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die Probenlösung bewegte sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den Raum und führte zu einer Auflösung der Reaktionsschicht auf den Elektrodensystem.
Bei Zufuhr der Probenlösung wurde das System zum Ermitteln der Zufuhr der Probenlösung auf Grundlage einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 4 und dritten Elektrode 7 des Elektrodensystems betätigt und der in dem Messgerät vorgesehen Zeitgeber wurde betätigt bzw. ausgelöst. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Potenzial über der Gegenelektrode 4 und dritten Elektrode 7 angelegt gehalten.
2 Sekunden nach Ermittelung der Zufuhr der Probenlösung wurde das an die dritte Elektrode 7 anzulegende Potenzial auf –1300 mV geändert. Der Strom über den Gegenelektroden und dritten Elektroden 4 und 7 wurde in zwei Punkten unmittelbar vor sowie 3 Sekunden nach einer Änderung des Potenzialwerts auf –1300 mV gelassen.
Der Strom unmittelbar vor der Potenzialänderung hängt hauptsächlich von der Ascorbinsäurekonzentration ab. Andererseits hängt der Strom 3 Sekunden nach der Potenzialänderung auf tatsächlich von dem aufgelösten Sauerstoff ab.
Nach einer Messung des Stroms über den beiden Elektroden 2 Sekunden und 5 Sekunden nach Zufuhr eben dieser Lösung wurde die Potenzialanlegung gestoppt.
25 Sekunden nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung wurde daraufhin ein Potenzial von 500 mV an die Arbeitselektrode 2 unter Nutzung der dritten Elektrode 7 als Referenz angelegt und der zwischen der Gegenelektrode 4 und der Arbeitselektrode 2 fließende Strom wurde nach 5 Sekunden gemessen.
Wie vorstehend angeführt, spiegelt der Strom über den Gegenelektroden und dritten Elektroden 4 und 7 die Konzentration der vorliegenden Ascorbinsäure und des Sauerstoffs. Eine Korrektur des Messergebnisses durch die Konzentration der Ascorbinsäure und des Sauerstoffs ergibt eine präzise Glukosekonzentration, aus welcher der Einfluss dieser Substanzen ausge schlossen ist.
Wie vorstehend angesprochen, ist die vorliegende Erfindung dazu geeignet, einen hochgradig zuverlässigen Biosensor bereitzustellen, bei der ungünstige Einflüsse einer anderen Substanz als der Substanz in der Probe ausschließen kann.

Claims

Biosensor, aufweisend: eine elektrisch isolierende Basisplatte (1), ein elektrisch isolierendes Abdeckelement (11) zur Bildung eines Probenlösungszufuhrpfads zwischen dem Abdeckelement (11) und der Basisplatte (1), ein Elektrodensystem, aufweisend eine Arbeitselektrode (2), eine Gegenelektrode (4) und eine dritte Elektrode (7) sowie eine Reaktionsschicht, wobei das Elektrodensystem und die Reagenzschicht derart gebildet sind, dass sie zu dem Probenlösungszufuhrpfad freiliegen, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Elektrode (7) als interferierende Substanzermittlungselektrode vorgesehen ist, wobei die Änderung der Elektroden in folgenden Alternativen vorliegt: a) die Arbeits- und Gegenelektroden (2, 4) sind entweder auf der Basisplatte (1) oder dem Abdeckelement (11) gebildet, während die dritte Elektrode (7) auf dem anderen Teil gebildet ist; b) ausschließlich die Arbeitselektrode (2) ist entweder auf der Basisplatte oder dem Abdeckelement gebildet, während die Gegenelektroden und dritten Elektroden (4, 7) auf dem anderen Teil gebildet sind; c) die Arbeitselektroden und dritten Elektroden (2, 7) sind entweder auf den Basisplatten 1 oder dem Abdeckelement (11) gebildet, während die Gegenelektrode (4) auf dem anderen Teil gebildet ist, wobei die Reagenzschicht in einer Position in Kontakt mit der Elektrode gebildet ist, die sich in Gegenüberlage zur dritten Elektrode (7) befindet.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Reagenzschicht zumindest eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält.
Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lecithin enthaltende Schicht in einer vorbestimmten Position angeordnet ist, wodurch sich die dritte Elektrode erübrigt.
Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reagenzschicht außerdem ein hydrophiles Polymer enthält.