DE69933205T2

DE69933205T2 - Identifizierung von genetischen zielen zur modulation durch oligonukleotide und herstellung von oligonukleotiden zur modulation von genen

Info

Publication number: DE69933205T2
Application number: DE69933205T
Authority: DE
Inventors: M. Lex San Mateo COWSERT; F. Brenda Carlsbad BAKER; John La Jolla MCNEIL; M. Susan San Diego FREIER; M. Henri Encinitas SASMOR; G. Douglas San Marcos BROOKS; Cara San Fransisco OHASHI; R. Jacqueline Encinitas WYATT; H. Alexander Encinitas BORCHERS; A. Timothy Oceanside VICKERS
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-04-13
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: AU762397B2; EP1071826B1; EP1071826A1; ATE339517T1; AU3965099A; EP1071826A4; CA2325013A1; JP2002511276A; DE69933205D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Erzeugung und Identifizierung von synthetischen Verbindungen mit definierten physikalischen, chemischen oder bioaktiven Eigenschaften. Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung die automatisierte Erzeugung von Oligonukleotidverbindungen, die gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz gerichtet sind, mittels computerbasierter iterativer maschineller Synthese von synthetischen Oligonukleotidverbindungen und maschineller oder maschinenunterstützter Analyse der Aktivitäten dieser Verbindungen. Die von Assays erhaltenen Informationen über diese Verbindungen werden zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen verwendet, die für eine Vielzahl von nukleotidsequenzbasierten Technologien eingesetzt werden können, z.B. die Entdeckung von Antisense-Medikamenten und Zielvalidierung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Oligonukleotid Technologie
Es ist bekannt, dass synthetische Oligonukleotide, die zu Zielsequenzen komplementär sind, mit bestimmten Zielnukleinsäuren in einer sequenzspezifischen Art und Weise hybridisieren. In einem Beispiel werden zum „Sense"-Nukleinsäurestrang komplementäre Verbindungen, die Polypeptide kodieren, als „Antisense-Oligonukleotide" bezeichnet. Eine Teilmenge dieser Verbindungen kann in der Lage seien, die Expression einer Zielnukleinsäure zu modulieren; solche synthetischen Verbindungen werden hier als „aktive Oligonukleotidverbindungen" beschrieben.
Oligonukleotidverbindungen werden für gewöhnlich in vitro als Forschungsreagenzien und diagnostische Hilfsmittel verwendet, und in vivo als therapeutische und bioaktive Wirkstoffe. Oligonukleotidverbindungen können ihre Wirkung durch eine Vielzahl von Wirkmechanismen ausüben. Ein solcher Mechanismus verwendet eine endogene Nuklease, so wie die RNase H in Eukaryonten oder die RNase P in Prokaryonten, um das DNA/RNA Hybrid, das zwischen der Oligonukleotidsequenz und mRNA gebildet wird, abzubauen (Chiang et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162; Forster et al., Science, 1990, 249, 783). Andere Mechanismen umfassen die kovalente Bindung eines synthetischen Rests mit Nuklease Aktivität an ein Oligonukleotid mit einer Antisense Sequenz. Dies beruht jedoch nicht auf der Verwendung einer endogenen Nuklease um die Zielaktivität zu modulieren. Synthetische Reste mit Nuklease-Aktivität umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, enzymatische RNAs, Lanthanid-Ionen-Komplexe und andere reaktive Arten. (Haseloff et al., Nature, 1988, 334, 585; Baker et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8749).
Trotz der erzielten Fortschritte in Anwendungsbereichen der Antisense Technologie ist es bis jetzt noch immer üblich, die für Antisense Technologie zugänglichen Zielsequenzen durch eine empirische Herangehensweise zu identifizieren (Szoka, Nature Biotechnology, 1997, 15, 509). Dementsprechend besteht ein Bedarf an Systemen und Verfahren zur effizienten und effektiven Identifizierung von Zielnukleotidsequenzen, welche für Antisense Modulierung geeignet sind. Die vorliegende Offenbarung entspricht diesem Bedarf durch Breitstellung von Vorrichtungen und Verfahren zur automatischen Identifizierung solcher Sequenzen durch in silico, Vollautomatisierung oder andere automatisierte Methoden.
2. Identifikation von Aktiven Oligonukleotidverbindungen
Herkömmlicherweise werden neue chemische Gebilde mit nützlichen Eigenschaften erzeugt durch (1) Identifizierung einer chemischen Verbindung (die so genannte „Leitsubstanz") mit einigen erwünschten Eigenschaften oder Aktivitäten, (2) Erzeugung von Varianten der Leitsubstanz und (3) Auswertung der Eigenschaften und Aktivitäten solcher Verbindungsvarianten. Dieser Vorgang wird „SAR" genannt, d.h. Structure Activity Relationship (Strukturaktivitätsverhältnis). Obwohl „SAR" und die entsprechende manuelle, rationelle Arzneistoffentwicklung mit einigem Erfolg angewandt worden ist, gibt es dafür eine Reihe von Einschränkungen bei der Herstellung von Leitsubstanzen, insbesondere, was die Entdeckung bioaktiver Oligonukleotidverbindungen betrifft. Bei dem Bemühen, SAR mit Oligonukleotiden zu benutzen, wurde festgestellt, dass die RNA-Struktur die Duplexbildung mit Antisense Verbindungen so sehr hemmen kann, dass eine „Verschiebung" der Zielnukleotidsequenz auch um wenige Basen die Aktivität solcher Verbindungen erheblich verringern kann (Lima et al., Biochemistry, 1992, 31, 12055).
Bis jetzt bestand die übliche Methode zur Suche von Antisense Leitsubstanzen in der manuellen Synthese und Analyse derartiger Verbindungen. Infolgedessen ist eine grundlegende Einschränkung der herkömmlichen Vorgehensweise ihre Abhängigkeit von der Verfügbarkeit, der Anzahl und den Kosten von Antisense Verbindungen, die manuell oder im besten Falle halbautomatisch hergestellt werden. Darüber hinaus wird der klassische Nachweis von derartigen Verbindungen mittels langwieriger manueller Techniken durchgeführt. Deshalb wird die herkömmliche Vorgehensweise zur Erzeugung aktiver Antisense Verbindungen durch die relativ hohen Kosten und den hohen Zeitbedarf zur Synthetisierung und aus Wahl einer relativ kleinen Anzahl von in Frage kommenden Antisense Verbindungen begrenzt.
Dementsprechend besteht das Bedürfnis nach Vorrichtungen und Verfahren zur effizienten und effektiven Erzeugung von neuen aktiven Antisense Verbindungen und anderen Oligonukleotidverbindungen, die spezifisch für Nukleinsäuresequenzen sind. Die vorliegende Offenbarung entspricht diesem Bedarf durch Breitstellung von Vorrichtungen und Verfahren zur automatischen Erzeugung und Auswahl von aktiven Antisense Verbindungen durch Vollautomatisierung oder andere automatisierte Methoden.
3. Analyse der Genfunktion
Die Bemühungen im Zusammenhang mit dem Humane Genome Project stellen eine enorme Anzahl von Nukleotidsequenzinformationen auf vielfältige Weise zur Verfügung, zum Beispiel Genomsequenzen, cDNAs, exprimierte Sequenz-TAGs (ESTs) und dergleichen. Die Fülle an Informationen hat einen Kommentator zu der Feststellung veranlasst, dass „Genom-Wissenschaftler mehr Gene produzieren, als sie ihnen eine Funktion zuordnen können" (Kahn, Science, 1995, 270, 369). Obwohl einige Lösungen für dieses Problem vorgeschlagen wurden, ist bis jetzt keine Lösung gefunden worden. Zum Beispiel liefern Verfahren zur Betrachtung der Genexpression bei verschiedenen Krankheitsstadien oder Entwicklungsstufen bestenfalls eine Verbindung zwischen einem Gen und einer Krankheit oder einer Entwicklungsstufe (Nowak, Science, 1995, 270, 368). Eine weiteres Konzept, bei dem die durch Gene kodierten Proteine untersucht werden, entwickelt sich gerade, aber „dieser Ansatz ist komplexer und große Hürden bleiben bestehen" (Kahn, Science, 1995, 270, 369). Des Weiteren erlaubt keine dieser Methoden die direkte Nutzung der Nukleotidsequenzinformation, um die Genfunktion zu analysieren.
Im Gegensatz dazu erlaubt die Antisense Technologie die direkte Nutzung der Nukleotidsequenzinformation zur Analyse der Genfunktion. Nachdem einmal eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt wurde, können Antisense Sequenzen, die an die Sequenz hybridisierbar sind, nach dem Stand der Technik erzeugt werden. Typischerweise werden eine große Anzahl von in Frage kommenden Antisense Oligonukleotiden mit Sequenzen synthetisiert, die mehr oder weniger zufällig über die Länge der Zielnukleinsäuresequenz verteilt sind (zum Beispiel ein „gene walk") und ihre Fähigkeit, die Expression der Zielnukleinsäure zu modulieren, wird getestet. Zellen oder Tiere können mit einem oder mehreren aktiven Antisense Oligonukleotiden behandelt und die sich daraus ergebenden Effekte bestimmt werden, um die Funktionen) der Zielgene zu bestimmen. Obwohl die Praktikabilität und der Wert dieses empirischen Ansatzes zur Bestimmung der Genfunktion im Stand der Technik bekannt ist, ist ebenso festgestellt worden, dass diese Vorgehensweise „außerhalb der Möglichkeiten der meisten Laboratorien liegt und mit einer Genfunktion nicht durchführbar ist, die neu identifiziert wurde, aber deren Funktion und therapeutischer Nutzen unbekannt ist" (Szoka, Nature Biotechnology, 1997, 15, 509).
Dementsprechend besteht ein Bedarf für Vorrichtungen und Verfahren zur effektiven Bestimmung der Funktion eines Gens, das mit Ausnahme seiner bekannten Nukleotidsequenz oder eines Teiles davon nicht charakterisiert wurde. Die vorliegende Offenbarung erfüllt diesen Bedarf und sieht Vorrichtungen und Verfahren zur automatischen Erzeugung von aktiven Antisense Verbindungen für eine Zielnukleotidsequenz durch automatisierte Hilfsmittel vor. Derartige aktive Antisense Verbindungen werden mit Zellen, zellfreien Extrakten, Geweben oder Tieren in Kontakt gebracht, die in der Lage sind, gewünschte Gene zu exprimieren, und danach werden biochemische oder biologische Parameter gemessen. Die Ergebnisse werden mit denen verglichen, die aus einer Kontrollzellen-Kultur, zellfreiem Extrakt, Gewebe oder einem Tier erhalten wurden, welche nicht mit einer aktiven Antisense Verbindung in Kontakt gebracht wurden, um die Funktionen des gewünschten Gens zu bestimmen.
4. Zielvalidierung
Die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Gens ist nicht länger das Ende, sondern vielmehr „der erste Schritt zum Ende hin". Der nächste kritische Schritt ist die Bewertung des Gens und seines Genprodukts als potentielles Zielmolekül für Arzneimittel" (Glasser, Genetic Engineering News, 1997, 17, 1). Dieser Prozess, das heißt, die Bestätigung, dass die Modulation von einem Gen, von dem man glaubt, dass es bei einer Krankheit oder Störung beteiligt ist, tatsächlich eine Wirkung hat, die mit einer Ursachenbeziehung zwischen dem Gen und der Krankheit oder Störung konsistent ist, heißt Zielvalidierung.
Projekte, wie zum Beispiel das Humane Genome Project, liefern eine riesige Anzahl von vollständigen oder partiellen Nukleotidsequenzen, von denen viele Zielsequenzen entsprechen oder Ziele kodieren, welche für die Entwicklung neuer Arzneimittel geeignet sein könnten. Die Herausforderung bei dieser Fülle von Informationen liegt darin, wie man die Nukleotidsequenzen benutzt, um tatsächliche Ziele für die Arzneimittelentwicklung zu bestimmen und zu bewerten. Die Antisense Technologie kann dabei ein Hilfsmittel sein, allerdings ist ihre Verwendung zur Zielvalidierung durch die größtenteils manuellen, labor- und kostenintensiven Verfahrensschritte bei der herkömmlichen Entwicklung von aktiven Antisense Verbindungen begrenzt worden (Szoka, Nature Biotechnology, 1997, 15, 509). Dennoch macht die große Zielspezifität, die für Antisense Verbindungen charakteristisch ist, sie zur idealen Wahl zur Zielvalidierung, insbesondere, wenn die funktionellen Aufgaben von Proteinen, die damit zusammen hängen, untersucht werden (Albert et al., Trends in Pharm. Sci., 1994, 15, 250).
Dementsprechend gibt es einen Bedarf für Vorrichtungen und Verfahren zur effizienten und effektiven Entwicklung von genmodulierenden Verbindungen, wobei derartige Verbindungen direkt aus der Nukleotidsequenzinformation entwickelt werden können. Derartige Komponenten werden benötigt, um zu bestätigen, dass die Modulation eines Gens, von dem man glaubt, dass es an einer Krankheit oder Störung beteiligt ist, tatsächlich einen in vitro oder in vivo Effekt auf den Ursprungs, die Entwicklung, die Verbreitung oder Entwicklung der Krankheit oder Störung hat.
Die vorliegende Offenbarung entspricht diesem Bedarf durch Breitstellung von Vorrichtungen und Verfahren zur automatischen Herstellung aktiver Oligonukleotide, insbesondere Antisense Verbindungen, für eine Zielnukleotidsequenz, mittels Vollautomatisierung oder anderer automatisierte Methoden. Derartige aktive Antisense Verbindungen werden mit einer Zellkultur, zellfreiem Extrakte, Gewebe oder einem Tier in Kontakt gebracht, die in der Lage sind, gewünschte Gene zu exprimieren, und dann nach werden biochemische oder biologische Parameter gemessen, die die Funktion des eventuellen Genprodukts anzeigen. Die Ergebnisse werden mit denen verglichen, die aus einem Kontrollzellsystem, zellfreiem Extrakt, Gewebe oder einem Tier erhalten wurden, welche nicht mit einer aktiven Antisense Verbindung in Kontakt gebracht wurden, um zu ermitteln, ob die Modulation des untersuchten Gens eine spezifische zelluläre Funktion beeinflusst. Die gefundenen, aktiven Antisense Verbindungen können als Positivkontrollen verwendet werden, wenn andere Wirkstoffe, die keine Antisense Wirkstoffe sind und gegen dieselbe Zielnukleinsäure oder gegen ihr Genprodukt gerichtet sind, untersucht werden sollen.
Das U.S. Patent 5,563,036 von Peterson et al. beschreibt Vorrichtungen und Verfahren zur Selektion von Verbindungen, die die Bindung eines Transkriptionsfaktors an eine Nukleinsäure inhibieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Verfahren ein Teil der Assays durch einen computergesteuerten Roboter durchgeführt.
Das U.S. Patent 5,708,158 von Hoey beschreibt Vorrichtungen und Verfahren zur Identifizierung von pharmakologischen Wirkstoffen zur Diagnose und Behandlung einer Krankheit, bei der ein Gen exprimiert wird, dass durch einen humanen Nuklearfaktor in aktivierten T-Zellen moduliert wird. Wie angegeben wird, sind die Verfahren besonders zur Selektion mit hohem Durchsatz geeignet, wobei einer oder mehrere Verfahrensschritte durch einen computergesteuerten Roboter durchgeführt werden.
Die U.S. Patente 5,693,463 und 5,716,780 von Edwards et al. beschreiben Vorrichtungen und Verfahren zur Identifizierung von nicht-Oligonukleotid-Molekülen, die spezifisch an ein DNA-Molekül binden, indem sie mit einem DNA-Bindungsprotein konkurrieren, dass DNA-Moleküle erkennt.
Die U.S. Patente 5,463,564 und 5,684,711 von Agrafiotis et al. beschreiben computergestützte iterative Abläufe zur Erzeugung chemischer Gebilde mit definierten physikalischen, chemischen und/oder bioaktiven Eigenschaften. Die WO 98/03533 beschreibt die Identifizierung von Antisense Oligonukleotiden unter Verwendung von computergestützten Hilfsmitteln und die Synthese derartiger Oligonukleotide durch eine automatisierte Oligonukleotid-Synthese.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft automatisierte Vorrichtungen und Verfahren zur Bestimmung von Gruppen von Oligonukleotiden, die die Expression von Zielnukleinsäuresequenzen modulieren, und die Erzeugung von Gruppen von Oligonukleotiden, die die Expression von Zielnukleinsäuresequenzen modulieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die der Antisense Bindung von Oligonukleotiden an diese Nukleinsäuresequenzen durch die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren zugänglich sind. Zum Zweck der Verdeutlichung ist die vorliegende Erfindung hier in Bezug auf die Herstellung und Identifizierung von aktiven Antisense Oligonukleotiden beschrieben, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Entsprechend der hier vorliegenden Erfindung ist das Verfahren nach Anspruch 1 vorgesehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft iterative Abläufe zur Bestimmung von Oligonukleotiden mit vorgeschriebenen physikalischen, chemischen und/oder biologischen Eigenschaften und betrifft Vorrichtungen zur Implementierung dieser Prozesse. Während jeder hier betrachteten Iteration ist eine Zielnukleinsäuresequenz vorgesehen oder wird ausgewählt und ein Datenbestand von (in Frage kommenden) virtuellen Verbindungen wird in silico (das heißt, in einer computerverwertbaren und sicheren Form) entsprechend dem hier definierten Kriterien erzeugt. Diese virtuellen Verbindungen werden bewertet und die Verbindungen mit vorhergesagten, besonders gewünschten Eigenschaften, werden ausgewählt. Die ausgewählten Verbindungen werden vollautomatisch, chargenweise synthetisiert und dann vollautomatisch auf gewünschte physikalische, chemische oder biologische Aktivität getestet, um Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften zu herauszufinden. Aktive Komponenten werden auf diese Weise hergestellt und gleichzeitig bevorzugte modulationsfähige Sequenzen und Bereiche der Zielnukleinsäure identifiziert.
In darauf folgenden Iterationsabläufen wird ein zweiter Datenbestand der in Frage kommenden Verbindungen erzeugt und/oder ausgewählt, um eine zweite Sammlung an virtuellen Verbindungen aufzubauen. Durch mehrfache Iterationsabläufe wird ein Datenbestand derjenigen Zielnukleinsäuresequenzen erzeugt, die durch Bindung dieser Verbindungen an Nukleinsäuresequenzen modulierende Eigenschaften haben. Eine derartige Modulation umfasst die Antisense Technologie, Genfunktionsanalyse und Zielvalidierung, ist aber nicht darauf beschränkt.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung, wie auch der Aufbau und die Bedienung von verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, sind im Einzelnen unten unter Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen beschrieben. Funktionsmäßig gleiche oder ähnliche Teile sind in den Zeichnungen mit denselben Bezugsziffern versehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 und 2 sind ein Flussdiagramm mit einem Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung und stellen die gesamte Verarbeitung der Daten und Materialien in verschiedenen Teilbereichen der Erfindung dar.
3 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 200 der 1 darstellt.
4 und 5 sind ein Flussdiagramm, dass die Verarbeitung und Materialien im Bereich von Schritt 300 der 1 darstellt.
6 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 306 der 4 darstellt.
7 ist ein anderes Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 306 der 4 darstellt.
8 ist ein anderes Flussdiagramm, dass die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 306 der 4 darstellt.
9 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 350 der 5 darstellt.
10 und 11 sind Flussdiagramme, die eine Logikanalyse der Daten und Materialien im Bereich von Schritt 400 der 1 darstellen.
12 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 400 der 1 darstellt.
13 und 14 sind Flussdiagramme, die die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 500 der 1 darstellen.
15 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 600 der 1 darstellt.
16 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 700 der 1 darstellt.
17 ist ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien im Bereich von Schritt 1100 der 2 darstellt.
18 ist ein Blockdiagramm, das den Zusammenhang von verschiedenen verwendeten Vorrichtungen in Verbindung mit einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
19 ist ein Flussdiagramm, das eine Darstellung der Datenspeicherung in einer verwendeten relationalen Datenbank in Verbindung mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
20 ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wie in Beispiel 14 erläutert, darstellt.
21 ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wie in Beispiel 15 erläutert, darstellt.
22 ein Flussdiagramm, das die Verarbeitung von Daten und Materialien bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wie in Beispiel 2 erläutert, darstellt.
23 ist eine bildliche Vorderansicht einer bevorzugten Vorrichtung, die zur automatischen Synthese von Oligonukleotiden verwendet wird, und
24 ist eine Draufsicht einer Vorrichtung, die zur automatischen Synthese von Oligonukleotiden verwendet wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bestimmte bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren werden nun unter Bezugnahme auf das Flussdiagramm der 1 und 2 beschrieben.
1. Auswahl der Zielnukleinsäure.
Der Prozess der Zielauswahl, Verfahrensschritt 100, sieht eine Zielnukleotidsequenz vor, die verwendet wird, um nachfolgende Verfahrensschritte zu erleichtern. Es wird allgemein angestrebt, die Expression der Zielnukleinsäure für eine Reihe von verschiedenen Zwecken zu modulieren, zum Beispiel Wirkstoffentwicklung, Zielvalidierung und/oder Genfunktionsanalyse.
Einer der wichtigsten Aufgaben der Zielauswahl, Schritt 100, ist es, die molekularen Ziele zu identifizieren, die signifikante therapeutische Möglichkeiten bieten, um neue und effiziente Hilfsmittel für die Arzneimittelentwicklung bereitzustellen und die Funktion von Genen zu bestimmen, die mit Ausnahme der Nukleotidsequenz nicht charakterisiert sind. Um diese Aufgaben zu lösen, werden die Gene nach bestimmten Selektionskriterien eingeordnet.
Eine solche Gruppe von Selektionskriterien betrifft die Quantität und Qualität der Zielnukleotidsequenz. Für die Oligonukleotid-Entwicklung muss eine ausreichende Information über die Zielnukleinsäuresequenz vorhanden sein. Weiterhin muss die Information eine hinreichende Qualität haben, damit in den Daten eine ausreichende Konsistenz erreicht wird, um die hier beschriebenen Methoden anzuwenden. Das bedeutet, dass die Daten nicht zu viele fehlende oder falsche Basenwerte haben dürfen. Im Fall einer Zielsequenz, die ein Polypeptid kodiert, können solche Fehler oft entdeckt werden, indem man alle drei Leserahmen des Sense-Stranges der Zielsequenz virtuell übersetzt und die Anwesenheit einer kontinuierlichen Polypeptid-Sequenz mit vorhersehbaren Eigenschaften überprüft, zum Beispiel die Kodierung eines Polypeptids bekannter Größe oder die Kodierung eines Polypeptids, das dieselbe Länge hat wie ein homologes Protein. In jedem Fall wird nur eine hohe Anzahl von Sequenzfehlern das erfindungsgemäße Verfahren stören; die meisten Oligonukleotide für die Zielsequenz werden keine solchen Fehler enthalten, solange die Fehler nicht häufiger innerhalb der gesamten Zielsequenz auftreten.
Ein anderes bevorzugtes Kriterium besteht darin, dass geeignete kultivierbare Zelllinien oder andere Quellen für eine reproduzierbare genetische Expression verfügbar sind. Solche Zelllinien exprimieren das die Zielnukleinsäuresequenz enthaltende Gen, oder sie können zur Expression induziert werden. Die Oligonukleotidverbindungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt werden, werden unter Verwendung solcher Zelllinien getestet und, wenn die Testung automatisch erfolgt, ist die Zelllinie vorzugsweise für die automatische Handhabung geeignet, wie zum Beispiel durch Wachstum in 96 Well-Platten. Dem Fachmann ist bekannt, dass, sofern eine geeignete Zelllinie nicht existiert, es dennoch möglich ist eine geeignete Zelllinie herzustellen. Zum Beispiel kann eine Zelllinie mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der das Zielgen enthält, um eine geeignete Zelllinie für Testungszwecke zu erzeugen.
Für die Analyse der Genfunktion ist es möglich, mit einem genetischen System zu arbeiten, für das Informationen hinsichtlich der biologischen Funktion(en) der Zielnukleinsäure oder Genprodukt(e) fehlen oder das diesbezüglich unvollständig charakterisiert ist. Dieses stellt ein mächtiges Hilfsmittel der Erfindung dar. Eine Zielnukleinsäure für die Analyse der Genfunktion kann vollständig uncharakterisiert sein oder eine vermutete Funktion haben, die auf minimalen Daten oder einer Homologie zu anderen Genen beruht. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für ein Ziel, können aktive Verbindungen entwickelt und in Zellen angewandt werden, die die Expression des Gens modulieren. Die erhaltenen zellulären, biochemischen oder molekularen biologischen Antworten werden beobachtet und der Fachmann verwendet diese Information, um die Funktion des Zielgens zu ermitteln.
Für die Zielvalidierung und Wirkstoffentdeckung ist ein anderes Auswahlkriterium die Zuordnung zur Krankheit. In Frage kommende Zielgene werden in verschiedene breite Kategorien von bekannten oder abgeleiteten Zuordnungen zur Krankheit eingeordnet. Diese Korrelation kann aus verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen kommen einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Epidemiologie, wobei Häufigkeiten von Gen-Abnormalitäten mit der Inzidenz von Krankheiten in Zusammenhang gebracht werden; Molekularbiologie, wobei die Genexpression und Funktion mit zellulären Vorgängen, die mit einer Krankheit korreliert sind, in Verbindung gebracht werden; und Biochemie, wobei die in vitro Aktivitäten eines Genprodukts mit Krankheitsparametern in Verbindung gebracht werden. Weil es gewichtige therapeutische Gründe dafür gibt, sich auf Level 1 Ziele zu konzentrieren, werden diese Ziele für die Wirkstoffentdeckung und/oder Zielvalidierung bevorzugt.
Level 2 Zielmoleküle sind Nukleinsäureziele, für die die kombinierte epidemiologische, molekularbiologische und/oder biochemische Korrelation mit der Krankheit nicht so klar ist, wie für Level 1. Level 3 Zielmoleküle sind Ziele, für die es wenig oder keine Daten gibt, die das Zielmolekül unmittelbar mit einem Krankheitsvorgang in Zusammenhang bringen, aber für die es indirekte Hinweise für einen derartigen Zusammenhang gibt, zum Beispiel eine Homologie mit einer Level 1 oder Level 2 Zielnukleinsäuresequenz oder mit dem Genprodukt davon. Um nicht den Zielauswahlprozess zu beeinträchtigen und sicherzustellen, dass die maximale Anzahl von Nukleinsäuren, die tatsächlich an der Ursache, Verstärkung, Verschlimmerung, Verbreitung, Dauer oder den Nachwirkungen von Krankheitszuständen beteiligt sind, untersucht werden, wird vorzugsweise eine ausgewogene Mischung der Level 1, 2 und 3 Nukleinsäuren untersucht.
Zur Wirkstoffentdeckung sollten experimentelle Systeme und Reagenzien verfügbar sein, um das therapeutische Potenzial der aktiven Verbindungen zu ermitteln, die durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise erzeugt werden. Solche Systeme können in vitro (zum Beispiel in vitro Modelle der Zelle:Zelle Assoziierung) oder in vivo (zum Beispiel Krankheitszustände in Tiermodellen) funktionieren. Es ist ebenfalls wünschenswert, aber nicht notwendig, dass Tiermodellsysteme verfügbar sind, die verwendet werden können, um die Wirkstoffpharmakologie zu beurteilen.
Die in Frage kommenden Zielnukleinsäuren können ebenso über biologische Vorgänge klassifiziert werden. Zum Beispiel hat sich herausgestellt, dass der programmierte Zelltod („Apoptose") ein wichtiger biologischer Vorgang ist, der durch eine große Anzahl von Krankheiten gestört wird. Dementsprechend werden Nukleinsäuren, die Faktoren kodieren, die eine Rolle in der Apoptose spielen, als in Frage kommende Ziele identifiziert. Desgleichen können potentielle Zielnukleinsäuren dahingehend klassifiziert werden, dass sie an Entzündungen, Autoimmunstörungen, Krebs oder anderen krankhaften oder dysfunktionellen Vorgängen beteiligt sind.
Weiterhin können Gene oft in Familien eingruppiert werden, die auf Sequenzhomologien und biologischer Funktion beruhen. Einzelne Familienmitglieder können redundant wirken oder Spezifität durch vielfältige Interaktionen mit nachgeordneten Effektoren aufweisen, oder durch Expression auf spezifische Zelltypen begrenzt sein. Wenn ein Mitglied einer Genfamilie mit einem Krankheitsvorgang assoziiert ist, besteht ein starkes Indiz dafür, dass andere Mitglieder derselben Familie Zielmoleküle darstellen. Daher sind die Mitglieder solcher Genfamilien bevorzugte Zielnukleinsäuren für die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen. Sicherlich macht die wirksame Spezifität von Antisense Verbindungen für verschiedene Genfamilienmitglieder die Erfindung besonders geeignet für solche Zielmoleküle (Albert et al., Trends Pharm. Sci., 1994, 15, 250). Den Fachleuten ist bekannt, dass eine teilweise oder vollständige Nukleotidsequenz von solchen Familienmitgliedern durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und „universelle" Primer, das heißt Primer, die für alle Mitglieder einer gegebenen Genfamilie entwickelt wurden, erhalten werden kann.
PCR Produkte, die mit universellen Primern erzeugt wurden, können unter Verwendung von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren kloniert und sequenziert oder direkt sequenziert werden. Obwohl Nukleotidsequenzen von klonierter DNA oder von komplementärer DNA (cDNA) aus mRNA in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, besteht daher keine Notwendigkeit, dass die Zielnukleotidsequenz aus einer klonierten Nukleinsäure isoliert wird. Jede Nukleotidsequenz, unabhängig davon, wie sie bestimmt wurde, von jeder Nukleinsäure, die isoliert oder auf jede Weise präpariert wurde, kann für das erfindungsgemäße Verfahren als Zielnukleinsäuren verwendet werden.
Obwohl Polypeptid-kodierende Nukleinsäuren als Zielnukleotidsequenz in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform vorgesehen sind, können zusätzlich andere Nukleinsäuren als Zielmoleküle dienen. Daher können zum Beispiel die Nukleotidsequenzen von struktureller oder enzymatischer RNA für die Wirkstoffentwicklung und/oder Zielvalidierung verwendet werden, wenn solche RNA mit einem Krankheitszustand assoziiert ist oder für die Genfunktionsanalyse, soweit ihre biologische Funktion nicht bekannt ist.
2. Assemblierung der Zielnukleotidsequenz
3 zeigt in einem Blockdiagramm im Detail die Verfahrensschritte der Assemblierung der Nukleotidsequenz, Verfahrensschritt 200 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung. Der Oligonukleotid-Entwicklungsvorgang, Verfahrensschritte 300, wird durch die Verfügbarkeit einer genauen Zielsequenzinformation ermöglicht. Wegen Beschränkungen in der automatischen Genomsequenzierungstechnologie werden Gensequenzen oft als Fragmente angesammelt. Weil einzelne Gene oft von unabhängigen Laboratorien unter Verwendung verschiedener Sequenzstrategien sequenziert werden, ist die Sequenzinformation für verschiedene Fragmente oft in unterschiedlichen Datenbanken abgelegt. Beim Vorgang der Assemblierung der Zielnukleinsäure nutzt man den Vorteil von computergestützten Homologiesuchalgorithmen und Sequenzfragmentassemblierungsalgorithmen, um verfügbare Datenbanken nach verwandten Sequenzinformationen und verfügbaren eingebauten Sequenzinformationen für die bestmögliche Darstellung des Zielnukleinsäuremoleküls, zum Beispiel ein RNA-Transkript, zu durchsuchen. Die Darstellung wird dann benutzt um Oligonukleotide herzustellen, Verfahrensschritt 300, welche auf biologische Aktivität in Verfahrensschritt 700 getestet werden können.
Im Falle von Genen, die die Synthese von multiplen Transkripten steuern, zum Beispiel durch alternatives Spleißen, ist jedes unterschiedliche Transkript eine einzige Zielnukleinsäure für den Verfahrenschritt 300. Wenn aktive Verbindungen für eine gegebene Transkript-Isoform benötigt werden, ist in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform die Zielnukleotidsequenz auf diejenigen Sequenzen beschränkt, die einzigartig für diese Transkript-Isoform sind. Wenn zwei oder mehr Transkript-Isoformen zusammen moduliert werden sollen, ist in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform die Zielnukleotidsequenz auf diejenigen Sequenzen beschränkt, die diesen zwei oder mehr Transkripte gemeinsam sind.
Im Falle einer Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure wird im Allgemeinen die cDNA in voller Länge im Verfahrensschritt 300 zur Oligonukleotid-Herstellung vorzugsweise verwendet (mit cDNA in voller Länge, die so definiert ist, dass sie von der 5'-Cap-Struktur zum Poly-A-Schwanz gelesen wird). Obwohl cDNA in voller Länge bevorzugt wird, ist es möglich, Oligonukleotide unter Verwendung einer Teilsequenzinformation herzustellen. Deshalb ist es für den Assemblierungsvorgang nicht notwendig, eine komplette cDNA-Sequenz zu erzeugen. Weiterhin kann es in einigen Fällen wünschenswert seien, Oligonukleotide herzustellen, die auf Introns zielen. In diesem Fall kann das Verfahren genutzt werden, um individuelle Introns bei Verfahrenschritt 220 zu identifizieren.
Das Verfahren kann eingeleitet werden, indem die Anfangssequenzinformation für ein ausgewähltes Zielmolekül bei Verfahrenschritt 205 eingegeben wird. In dem Falle einer Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure wird die cDNA Sequenz in voller Länge im Allgemeinen bevorzugt, um die Vorgehensweise für die Oligonukleotid-Herstellung bei Verfahrenschritt 300 durchzuführen. Der erste Schritt ist zu bestimmen, ob die Anfangssequenzinformation der cDNA in voller Länge entspricht, Entscheidungsschritt 210. In dem Falle, dass die cDNA-Sequenz in voller Länge zur Verfügung steht, geht das Verfahren direkt zum Herstellungsschritt 300 für die Oligonukleotide. Wenn die cDNA-Sequenz nicht in voller Länge zur Verfügung steht, werden im Verfahrenschritt 212 Datenbanken nach zusätzlichen Sequenzinformationen durchsucht.
Der in den Verfahrensschritten 212 und 230 vorzugsweise verwendete Algorithmus ist BLAST (Altschul, et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403) oder "Gapped BLAST" (Altschul et al., Nucl. Acids Res., 1997, 25, 3389). Diese sind auf Sequenzhomologien basierende Suchwerkzeuge zur Identifizierung von verwandten Sequenzen in Sequenz-Datenbanken. Die BLAST Suchparameter sind so eingestellt, um nur eng verwandte Sequenzen zu finden. Einige von BLAST durchsuchte bevorzugte Datenbanken sind eine Kombination von lizenzfreien und urheberrechtlich geschützten Datenbanken. Die Datenbanken, ihre Inhalte und Quellen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Datenbankquellen der Zielsequenzen
Wenn eine Genom-Sequenzinformationen bei Entscheidungsschritt 215 verfügbar ist, werden die Introns entfernt und Exons in die kontinuierliche Sequenz eingebaut, die die die cDNA Sequenz in Verfahrenschritt 220 repräsentiert. Die Exon-Assemblierung geschieht unter Verwendung des Programms Phragment Assembly Program "Phrap" (Copyright University of Washington Genome Center, Seattle, WA). Der Phrap Algorithmus analysiert Gruppen von überlappenden Sequenzen und baut sie in eine kontinuierliche Sequenz ein, die als „contig" bezeichnet wird. Die resultierende contig wird vorzugsweise benutzt, um Datenbanken nach zusätzlichen Sequenzinformationen bei Verfahrenschritt 230 zu durchsuchen. Wenn die genomische Information nicht verfügbar ist, werden die Ergebnisse des Verfahrenschritts 212 hinsichtlich individueller Exons bei Entscheidungsschritt 225 analysiert. Exons werden häufig einzeln in Datenbanken aufgenommen. Wenn mehrere vollständige Exons identifiziert werden, werden sie vorzugsweise in ein contig unter Verwendung von Phrap bei Verfahrenschritt 250 eingebaut. Wenn bei Entscheidungsschritt 225 nicht mehrere vollständige Exons identifiziert werden, dann können Gensequenzen als Teilsequenzinformationen in Entscheidungsschritt 228 analysiert werden. Wenn zusätzliche Teilinformationen nicht gefunden werden, dann geht das Verfahren nach Verfahrenschritt 230 bei Entscheidungsschritt 228. Wenn eine Teilsequenzinformation bei 212 gefunden wird, dann geht diese Information zu Verfahrenschritt 230 über Entscheidungsschritt 228.
Verfahrenschritt 230, Entscheidungsschritt 240, Entscheidungsschritt 260 und Verfahrenschritt 250 bilden eine Schleife, die iterativ die Menge an Sequenzinformation, die für das Zielmolekül zur Verfügung steht, erweitert. Am Ende jeder Iteration der Schleife werden die Ergebnisse in den Entscheidungsschritten 240 und 260 analysiert. Wenn keine neue Information gefunden wird, dann geht der Prozess bei Entscheidungsschritt 240 zu Verfahrenschritt 300. Wenn eine unerwartet große Sequenzinformationsmenge gefunden wurde, weil der Prozess sich außerhalb der Gengrenzen in die repetitiven Genomsequenzen bewegt hat, läuft das Verfahren vorzugsweise eine Iteration zurück und die Sequenz geht von Entscheidungsschritt 240 zu Verfahrenschritt 300. Wenn eine kleine Menge einer neuen Sequenzinformation identifiziert wurde, dann wiederholt sich die Schleife, indem 100 endständige 5'-Basen und 100 endständige 3'-Basen durch die BLAST Homologiesuche bei Verfahrensschritt 230 iteriert werden. Die neue Sequenzinformation wird zu dem vorhandenen contig bei Verfahrenschritt 250 hinzugefügt.
3. In Silico Erzeugung einer Gruppe von Nukleobasensequenzen und virtuellen Oligonukleotiden
Die folgenden Schritte 300 und 400 können in der Reihenfolge durchgeführt werden, wie unten beschrieben, das heißt 300 vor Schritt 400, oder in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, Schritt 400 vor Schritt 300. In dieser weiteren Ausführungsform wird jede Oligonukleotidchemie zuerst jeder Oligonukleotidsequenz zugeordnet. Dann wird jede Kombination von Oligonukleotidchemie und Sequenz entsprechend den Parametern von Verfahrenschritt 300 bewertet. Diese Ausführungsform hat das wünschenswerte Merkmal, das der Effekt von unterschiedlichen Oligonukleotidchemien auf diese Parameter berücksichtigt wird. Zum Beispiel kann die Substitution von 5-Methylcytosin (SMeC oder m5c) durch Cytosin in einer Antisense Verbindung die Stabilität eines Doppelstrangs vergrößern, der zwischen der Verbindung und seiner Zielnukleinsäure gebildet wird. Andere Oligonukleotidchemien die die Oligonukleotid:[Zielnukleinsäure]Duplexe vergrößern, sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4429). Den Fachleuten ist bekannt, dass verschiedene Oligonukleotidchemien für verschiedene Zielnukleinsäuren bevorzugt werden. Dies bedeutet, dass die optimale Oligonukleotidchemie für die Bindung an eine Ziel-DNA weniger geeignet für die Bindung an eine Ziel-RNA mit derselben Nukleotidsequenz sein kann.
1 zeigt, wie in dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem Schritt 300 vor dem Schritt 400 aus einer in Schritt 200 assemblierten Zielnukleinsäuresequenz eine Liste von Oligonukleotidsequenzen erzeugt wird, wie in dem Flussdiagramm in den
4 und 5 gezeigt wird. In Schritt 302 wird die gewünschte Länge des Oligonukleotids ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Oligonukleotidlänge zwischen etwa 8 bis etwa 30, in einer bevorzugteren Ausführungsform zwischen etwa 12 bis etwa 25 Nukleotiden. In Schritt 304 werden alle möglichen Oligonukleotidsequenzen mit der gewünschten Länge, die in der Lage sind, mit der Zielsequenz, die in Schritt 200 erhalten wurde, zu hybridisieren, erzeugt. In diesem Schritt wird eine Reihe von Oligonukleotidsequenzen erzeugt, indem einfach das häufigste mögliche 5'-Oligonukleotid bestimmt wird und die Zielsequenz in Schritten von einer Base „entlanggewandert" wird, bis das häufigste mögliche 3'-Oligonukleotid erreicht wird.
In Schritt 305 wird eine virtuelle Oligonukleotidchemie auf die Nukleobasensequenzen in Schritt 304 angewandt, um eine Gruppe von virtuellen Oligonukleotiden zu erhalten, die in silico bewertet werden können. Die standardmäßig verwendeten virtuellen Oligonukleotidchemien sind hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften gut charakterisiert, zum Beispiel 2'-Desoxyribonukleinsäure mit den natürlich vorkommenden Basen (A, T, C und G), unmodifizierte Zuckerreste und ein Phosphodiesterrückrat.
4. In Silico Bewertung der thermodynamischen Eigenschaften der virtuellen Oligonukleotiden
In Schritt 306 werden einer Reihe von thermodynamischen, Sequenz- und Homologieauswertungen vorzugsweise für jedes in Schritt 305 erhaltende, virtuelle Oligonukleotid berechnet. Die thermodynamischen Eigenschaften werden, wie in 6 dargestellt, berechnet. Es können so viele oder so wenige wie man will ausgewählt werden; wahlweise kann nichts ausgewählt werden. Die gewünschten Eigenschaften umfassen typischerweise die Berechnung der freien Energie der Zielstruktur, Schritt 309. Wenn das Oligonukleotid ein DNA-Molekül ist, werden die Schritte 310, 312 und 314 durchgeführt. Wenn das Oligonukleotid ein RNA-Molekül ist, dann werden die Schritte 311, 313 und 315 durchgeführt. In beiden Fällen entsprechen diese Schritte der Berechnung der freien Energie von intramolekularen Oligonukleotid-Wechselwirkungen, intermolekularen Wechselwirkungen und der Doppelstrangbildung. Vorzugsweise wird zusätzlich eine freie Energie der Oligonukleotid-Zielmolekülbindung bei Schritt 316 berechnet.
Andere thermodynamische und kinetische Eigenschaften können für die Oligonukleotide wie in Schritt 317 dargestellt, berechnet werden. Derartige andere thermodynamische und kinetische Eigenschaften können Schmelztemperaturen, Bindungskonstanten, Dissoziierungskonstanten oder jede andere Eigenschaft, die aus der Oligonukleotid-Aktivität vorhersagbar ist, umfassen.
Die freie Energie der Zielstruktur ist als diejenige freie Energie definiert, die notwendig ist, um eine Sekundärstruktur in der Zielbindungsstelle der Zielnukleinsäure aufzubrechen. Dieser Bereich umfasst Intra-Zielnukleotidbasenpaare, in die aufgebrochen werden müssen, damit ein Oligonukleotid an seine komplementäre Sequenz binden kann. Der Effekt dieses örtlichen Aufbrechens der Sekundärstruktur liegt im Zugänglichmachen für die Oligonukleotide. Derartige Strukturen umfassen Doppelhelices, ungepaarte oder unpassende Nukleotide am Ende, Schleifen einschließlich Haarnadelschleifen, Schleifen mit Ausbuchtungen, innere Schleifen und mehrfach verzweigte Schleifen (Serra et al., Methods in Enzymology, 1995, 259, 242).
Die intermolekularen freien Energien beziehen sich auf die inhärente Energie des stabilsten Komplexes, der durch zwei Oligonukleotide gebildet wird; solche Strukturen umfassen eine Dimerbildung. Die intermolekularen freien Energien sollten auch berücksichtigt werden, wenn z.B. zwei oder mehr Oligonukleotide mit unterschiedlicher Sequenz in denselben Assaybehälter gegeben werden.
Die intramolekularen freien Energien beziehen sich auf die Energie, die notwendig ist, um die stabilste Sekundärstruktur innerhalb eines einzelnen Oligonukleotids aufzubrechen. Derartige Strukturen umfassen z.B. Haarnadelschleifen, Schleifen mit Ausbuchtungen und innere Schleifen. Das Ausmaß der intramolekularen Basenpaarung ist ein Indikator für die Energie, die zum Aufbrechen der Basenpaarung benötigt wird.
Die freie Energie der Doppelstrangbildung ist die freie Energie des denaturierten Oligonukleotids, das an seine denaturierte Zielsequenz bindet. Die Oligonukleotid-Zielsequenz-Bindung ist die Gesamtbindungsenergie und umfasst die Energien zum Aufbrechen der intra- und intermolekularen Oligonukleotidstrukturen, der Zielmolekülstrukturen und der Doppelstrangbildung.
Die stabilste RNA-Struktur wird auf Basis der Nächster-Nachbar-Analyse durchgeführt (Xia, T., et al., Biochemistry, 1998, 37, 14719–14735; Serra et al., Methods in Enzymology, 1995, 259, 242). Diese Analyse basiert auf der Annahme, dass die Stabilität eines gegebenen Basenpaars durch die gegenüberliegenden Basenpaare bestimmt wird. Für jede mögliche Kombinationen des nächsten Nachbarn, sind thermodynamische Eigenschaften bestimmt worden. Für Doppelhelix-Bereiche müssen zwei zusätzliche Faktoren berücksichtigt werden, eine Entropieänderung zur Anregung einer Helix und eine Entropieänderung die nur mit selbstkomplementären Strängen zusammenhängt. Die freie Energie eines Doppelstranges kann unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden: ΔG°T = ΔH° – TΔS°wobei:

ΔG: die freie Energie der Doppelstrangbildung ist,
ΔH: die Enthalpieänderung für den nächsten Nachbarn ist,
ΔS: die Entropieänderung für den nächsten Nachbarn ist und T die Temperatur ist.

Die ΔH und ΔS sind für jede mögliche „Nächster-Nachbar"-Kombination experimentell bestimmt worden. Diese Werte werden oft in Tabellen veröffentlicht. Für endständige ungepaarte und nicht passende Nukleotide sind Enthalpie- und Entropiemessungen für jede mögliche Nukleotid-Kombination ebenso in veröffentlichten Tabellen verfügbar. Die Ergebnisse werden direkt zu den Werten addiert, die für die Doppelstrangbildung bestimmt wurden. Wenn die verfügbaren Daten nicht wie für die Basenpaarung vollständig oder genau sind, wird die freie Energie der Schleifenbildung durch ein bekanntes Modell als Summe der freien Energie ermittelt, basierend auf der Schleifengröße, dem schließenden Basenpaar, den Wechselwirkungen zwischen der ersten Fehlanpassung der Schleife mit dem schließenden Basenpaar und zusätzliche Faktoren, wie dem Schließen durch AU oder UA oder eine erste Fehlanpassung von GA oder UU. Diese Gleichung können auch für Oligoribonukleotid-Ziel-RNA Wechselwirkungen verwendet werden.
Die Stabilität der DNA-Doppelstränge wird im Falle von intra- oder intermolekularen Oligodesoxyribonukleotid-Wechselwirkungen verwendet. Die DNA-Doppelstrang- Stabilität wird mit ähnlichen Gleichungen wie die RNA-Stabilität berechnet, mit der Ausnahme, dass sich experimentell bestimmte Werte zwischen den „nächsten Nachbarn" in der Startphase der DNA- und RNA-Helixbildung unterscheiden und die Helixbildung mehr für die DNA als für die RNA geeignet scheint (Santa Lucia et al., Biochemistry, 1996, 35, 3555).
Weitere thermodynamische Parameter werden im Fall von RNA/DNA-Hybrid-Doppelsträngen verwendet. Die wäre der Fall für ein RNA-Ziel und Oligodesoxynukleotid. Derartige Parameter wurden durch Sugimoto et al. (Biochemistry, 1995, 34, 11211) bestimmt. Zusätzlich zu den Werten für die „nächsten Nachbarn" wurden Unterschiede für die Werte der Enthalpie beim Einsetzen der Helixbildung beobachtet.
5. In Silico Bewertung der Zielzugänglichkeit
Die Zielzugänglichkeit wird als wichtiger Faktor bei der Auswahl der Oligonukleotide betrachtet. Eine Zielstelle besitzt eine minimale Sekundärstruktur und benötigt deshalb eine geringe Energie zum Aufbrechen der Struktur. Außerdem ist die Sekundärstruktur, egal ob inter- oder intramolekular, wegen der benötigten Energie zum Aufbrechen der Strukturen nicht erwünscht. Die Oligonukleotid-Zielmolekülbindung hängt von beiden diesen Faktoren ab. Es ist deshalb auf Basis dieser Faktoren wünschenswert, den Beitrag der Sekundärstruktur zu vermindern. Der andere Beitrag an der Oligonukleotid-Zielmolekülbindung ist die Bindungsaffinität. Günstige Bindungsaktivitäten, die auf einer engeren Basenpaarung an der Zielstelle beruhen, sind erwünscht.
Nachdem die Berechnung der thermodynamischen Eigenschaften bei Schritt 317 abgeschlossen ist, werden die gewünschten Sequenzeigenschaften, die ausgewertet werden sollen, bei Schritt 324 ausgewählt. Es können so viel oder so wenig wie gewünscht ausgewählt werden; wahlweise wird nichts ausgewählt. Diese Eigenschaften umfassen die Anzahl von vier Guanosin-Resten in einer Reihe bei Schritt 325 oder drei Guanosine in einer Reihe bei Schritt 326, die Länge der längsten Adenosin-Kette bei Schritt 327, Cytidine bei Schritt 328 oder Uridine oder Thymidine bei Schritt 329, die Länge der längsten Purin-Kette bei Schritt 330 oder Pyrimidine bei Schritt 331, die prozentuale Zusammensetzung von Adenosin bei Schritt 332, Cytidin bei Schritt 333, Guanosin bei Schritt 334 oder Uridine oder Thymidine bei Schritt 335, die prozentuale Zusammensetzung von Purinen bei Schritt 336 oder Pyrimidinen bei Schritt 337, die Anzahl der CG-Dinukleotid-Wiederholungen bei Schritt 338, CA-Dinukleotid-Wiederholungen oder UA oder TA Dinukleotid-Wiederholungen bei Schritt 340. Zusätzlich können andere Sequenzeigenschaften verwendet werden, soweit sie relevant und für die Antisense Wirksamkeit prognostisch sind, wie in Schritt 341 dargestellt.
Diese Sequenzeigenschaften können für die Prognose der vorhandenen oder fehlenden Oligonukleotid-Aktivität wichtig sein. Zum Beispiel offenbart das U.S. Patent 5,523,389 Oligonukleotide, die drei oder vier Guanosin-Reste in einer Reihe haben. Oligonukleotide mit solchen Sequenzen können in einer sequenzunabhängigen Weise wirken. Für ein Antisense Verfahren ist ein solcher Mechanismus für gewöhnlich unerwünscht. Zudem können häufige Dinukleotid-Wiederholungen auf Bereiche mit geringer Komplexität hindeuten, die häufig bei nichtverwandten Genen vorhanden sein können. Ungleichmäßig verteilte Basenzusammensetzungen, z.B. 90% Adenosin, könnem ebenso unspezifische Effekte ergeben. Van einem praktischen Standpunkt aus betrachtet, kann es aus Syntheseerwägungen wünschenswert sein, Oligonukleotide zu verwerfen, die lange Strecken mit anderen Nukleotiden gemeinsam haben. Andere Sequenzeigenschaften, die entweder unten aufgeführt sind oder von denen man später herausfindet, dass sie einen prognostischen Wert haben, können verwendet werden, um Oligonukleotidsequenzen auszuwählen.
Nach dem Schritt 341 werden die Homologieauswertungen, die berechnet werden müssen, in Schritt 342 ausgewählt. Eine Homologie zu den Nukleinsäuren, die Protein-Isoformen des Zielmoleküls kodieren, wie in Schritt 343 dargestellt, kann erwünscht sein. Zum Beispiel können Oligonukleotide, die für eine Isoform von Proteinkinase C spezifisch sind, ausgewählt werden. Ebenso können Oligonukleotide ausgewählt werden, die auf mehrere Isoformen von solchen Genen abzielen. Eine Homologie für analoge Zielsequenzen, wie in Schritt 344 dargestellt, kann ebenso erwünscht sein. Zum Beispiel kann ein Oligonukleotid für eine Region ausgewählt werden, die sowohl beim Menschen als auch beim neuesten vorkommt, um das Oligonukleotid in beiden Spezies zu testen. Eine Homologie für Spleiß-Varianten der Zielnukleinsäuren, wie in Schritt 345 gezeigt, kann erwünscht sein. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die Homologie für andere Sequenzvarianten zu bestimmen, wie in Schritt 346 dargestellt.
Nach dem Schritt 346, bei dem Auswertungen für jeden ausgewählten Parameter erhalten wurden, wird ein gewünschter Bereich ausgewählt, um die vielversprechendsten Oligonukleotide auszuwählen, wie in Schritt 347 gezeigt. Typischerweise werden nur einzelne Parameter verwendet, um Oligonukleotidsequenzen auszuwählen. Soweit eine Strukturvorhersage das Ergebnis verbessert, können zusätzliche Parameter verwendet werden. Nachdem die gewünschten Auswertungsbereiche ausgewählt sind, wird eine Liste von allen Oligonukleotiden mit den Parametern, die in diese Bereiche fallen, erzeugt, wie in Schritt 348 dargestellt.
6. Ziel-Oligonukleotide für funktionelle Bereiche einer Nukleinsäure.
Es kann erwünscht sein, dass Oligonukleotidsequenzen auf spezifische funktionelle Bereiche der Zielnukleinsäure abzielen. Eine Entscheidung wird getroffen, ob auf solche Bereiche gezielt werden soll, wie in Entscheidungsschritt 349 dargestellt. Wenn auf solche funktionellen Bereiche gezielt werden soll, dann ereignet sich der Verfahrenschritt 350, wie man im Detail in 9 sieht. Wenn das nicht gewünscht ist, dann wird das Verfahren mit Schritt 375 fortgesetzt.
Wie man in 9 sieht, werden in Schritt 350 die gewünschten funktionellen Bereiche ausgewählt. Solche Bereiche umfassen die Stelle, wo die Transkription beginnt oder 5'-Cap bei Schritt 353, die nicht translatierte 5'-Region bei Schritt 354, das Startcodon bei Schritt 355, die kodierende Region bei Schritt 356, das Stopcodon bei Schritt 357, die nicht translatierte 3'-Region bei Schritt 358, die 5'-Spleißstellen bei Schritt 359 oder die 3'-Spleißstellen bei Schritt 360, spezifische Exons bei Schritt 361 oder spezifische Introns bei Schritt 362, das mRNA Stabilisierungssignal bei Schritt 363, das mRNA Destabilisierungssignal bei Schritt 364, das Polyadenylierungssignal bei Schritt 365, die Poly-A-Additionsstelle bei Schritt 366, der Poly-A-Schwanz bei Schritt 367, oder die Gensequenz der bekannten Prä-mRNA bei Schritt 368. Außerdem können zusätzliche funktionelle Stellen ausgewählt werden, wie bei Schritt 369 gezeigt.
Viele funktionelle Bereiche sind für die störungsfreie Funktion des Gens wichtig und sind attraktive Ziele für Antisense Methoden. Zum Beispiel ist das AUG-Startcodon gewöhnlich ein Ziel, weil es für die Einleitung der Translation notwendig ist.
Zusätzlich betrachtet man Spleißstellen als attraktive Ziele, weil diese Bereiche wichtig für die Verarbeitung der mRNA sind. Andere bekannte Stellen können wegen Wechselwirkungen mit Proteinfaktoren oder anderen regulatorischen Molekülen zugänglicher sein.
Nachdem die gewünschten funktionellen Bereiche ausgewählt und bestimmt wird, wird dann eine Untergruppe aller vorher ausgewählter Oligonukleotide ausgewählt, die auf der Hybridisierung nur dieser gewünschten funktionellen Bereiche beruht, wie in Schritt 370 dargestellt.
7. Einheitliche Verteilung der Oligonukleotide.
Ob funktionelle Stellen als Ziele gewünscht sind oder nicht, können sich bis hierher eine große Anzahl Oligonukleotidsequenzen aus dem Verfahren ergeben. Um die Anzahl der Oligonukleotidsequenzen auf eine handhabbare Anzahl zu reduzieren, wird eine Entscheidung getroffen, die ausgewählten Oligonukleotide entlang des Zielmoleküls gleichmäßig zu verteilen, wie in Schritt 375 dargestellt. Eine gleichmäßige Verteilung der Oligonukleotidsequenzen soll eine komplette Abdeckung über die gesamte Zielnukleinsäure oder die ausgewählten funktionellen Bereiche erzielen. Um die Verteilung der Sequenzen zu automatisieren, wird ein Computerprogramm verwendet, wie in Schritt 380 gezeigt. Ein derartiges Programm berücksichtigt Parameter, wie die Länge der Zielnukleinsäure, die Gesamtzahl der gewünschten Oligonukleotidsequenzen, die Oligonukleotidsequenzen pro Länge der Einheit und die Zahl der Oligonukleotidsequenzen pro funktionellem Bereich. Eine manuelle Auswahl der Oligonukleotidsequenzen ist ebenso in Schritt 385 vorgesehen. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, die Oligonukleotidsequenzen manuell auszuwählen. Sobald die gewünschte Anzahl der Oligonukleotidsequenzen entweder bei Schritt 380 oder Schritt 385 erhalten wurde, werden dann diese Oligonukleotidsequenzen an Schritt 400 des Verfahrens übergeben, wo die Oligonukleotidchemien zugeordnet werden.
8. Zuordnung der tatsächlichen Oligonukleotidchemie.
Sobald eine Gruppe der ausgewählten Nukleobasensequenzen entsprechend der vorhergehenden Verfahrens- und Entscheidungsschritte erzeugt worden ist, wird die tatsächliche Oligonukleotidchemie der Sequenz zugeordnet. Eine „tatsächliche Oligonukleotidchemie" oder einfach „Chemie" ist ein chemisches Muster, das bei einer bestimmten Gruppe von automatisch synthetisierten Oligonukleotidverbindungen gemeinsam vorhanden ist. Bevorzugte Chemien umfassen, aber sind darauf nicht beschränkt, Oligonukleotide, in denen jede Bindung eine Phosphorothioat-Bindung ist und chimäre Oligonukleotide, in denen eine bestimmte Anzahl von endständigen 5'- und/oder 3'-Resten eine 2'-Methoxyethoxy-Modifikation aufweist.
Chemien können die Nukleobasensequenzen während des allgemeinen Verfahrenschrittes 400 (1) zugewiesenen werden. Die logische Grundlage für die Chemiezuordnung ist in den 10 und 11 dargestellt und ein iterativer Programmablauf für den schrittweisen Oligonukleotid-Durchlauf von Nukleosid zu Nukleosid ist in 12 dargestellt. Die Chemiezuordnung kann durch direkte Zuordnung in einem Textverarbeitungsprogramm durchgeführt werden, mittels eines interaktiven Textverarbeitungsprogramms oder mittels automatisierter Programme und Vorrichtungen. Für jedes dieser Fälle wird für die Ausgabedatei ein Format gewählt, dass als Eingangs Datei für die automatisierten Synthesevorrichtungen dienen kann.
9. Oligonukleotidverbindungen.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird in Bezug auf die Oligonukleotide der Begriff „Oligonukleotide" verwendet, um ein Oligomer oder Polymer der Ribonukleinsäure (RNA) zu bezeichnen oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Abkömmlinge davon. Deshalb umfasst dieser Begriff Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosidbindungen (Rückrat) bestehen, ebenso wie Oligonukleotide mit nicht natürlich vorkommenden Anteilen, die ähnlich funktionieren. Solche modifizierten oder substituierten Oligonukleotide werden oft gegenüber den nativen Formen bevorzugt, zum Beispiel phosphodiestergebundene A, C, G, T und U Nukleoside, wegen gewünschter Eigenschaften wie zum Beispiel, erhöhte zelluläre Aufnahme, erhöhte Affinität für die Zielnukleinsäure und erhöhte Stabilität in der Gegenwart von Nukleasen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidverbindungen können verschiedene Längen in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern haben, einschließlich derjenigen, aber nicht darauf beschränkt, die oben unter Bezugnahme auf die Selektionskriterien des allgemeinen Arbeitsschrittes 300 diskutiert wurden. Die erfindungsgemäßen Antisense Oligonukleotidverbindungen haben vorzugsweise eine Länge von etwa 8 bis etwa 30 Nukleobasen (das heißt von etwa 8 bis etwa 30 verbundenen Nukleobasen).
Vorzugsweise weisen die Antisense Oligonukleotide etwa 12 bis etwa 25 Nukleobasen auf. Eine Besprechung der Antisense Oligonukleotide und einiger wünschenswerter Modifikationen kann in De Mesmaeker et al., Acc. Chem. Res., 1995, 28, 366 gefunden werden. Andere Längen für Oligonukleotide können für nicht Antisense Zielstrategien gewählt werden, zum Beispiel für die Verwendung der Oligonukleotide als Ribozyme. Solche Ribozyme erfordern normalerweise Oligonukleotide, die länger sind als nach dem Stand der Technik bekannt.
Ein Nukleosid ist eine Base-Zucker Verbindung. Der Basenanteil des Nukleosids ist normalerweise eine heterozyklische Base. Die gebräuchlichsten Klassen dieser heterozyklischen Basen sind die Purine und Pyrimidine. Nukleotide sind Nukleoside, die zusätzlich eine Phosphatgruppe haben, die kovalent an dem Zuckerteil des Nukleosids gebunden ist. Bei Nukleosiden mit einem normalen Pentofuranosyl-Zucker (wobei normal bedeutet das sie in RNA und DNA vorkommen) kann die Phosphatgruppe an die 2', 3' oder 5' Hydroxylgruppe des Zuckers gebunden sein. Bei der Bildung von Oligonukleotiden sind die Phosphatgruppen kovalent aneinander an benachbarte Nukleoside gebunden und bilden so eine lineare polymere Verbindung. Die jeweiligen Enden dieser linearen polymeren Struktur können verbunden sein und so eine kreisförmige Struktur bilden, aber lineare Strukturen werden im Allgemeinen bevorzugt. Vorzugsweise bilden die Phosphatgruppen innerhalb der Oligonukleotidstruktur das Rückgrat der Oligonukleotide. Die normale Bindung von RNA und DNA ist eine 3' nach 5' Phosphodiesterbindung.
Spezifische Beispiele von bevorzugten erfindungsgemäßen Oligonukleotiden umfassen Oligonukleotide mit modifiziertem Rückgrat und welche, die kein Phosphoratom im Rückgrat haben. Wie hier definiert wird, umfassen die Oligonukleotide mit modifiziertem Rückgrat solche, die ein Phosphoratom im Rückgrat behalten und solche die kein Phosphoratom im Rückgrat haben. Wie hier und manchmal auch im Stand der Technik definiert wird, können Oligonukleotide, die kein Phosphoratom in ihrem Internukleosidrückgrat haben, ebenfalls als Oligonukleoside bezeichnet werden.
10. Auswahl der Oligonukleotidchemien
Gemäß einem allgemeinen logischen Schema, das in den 10 und 11 dargestellt ist, wird der Benutzer oder eine automatische Vorrichtung zunächst ist zur Eingabe einer Base aufgefordert, danach zur Eingabe eines Zuckers, einer Bindung und schließlich eines Konjugats. Daher wird für jedes Nukleosid bei Verfahrenschritt 410 eine Base ausgewählt. Bei der Auswahl der Base kann eine Basenchemie bei Verfahrenschritt 412 ausgewählt werden oder eine oder mehrere alternative Basen werden bei den Prozessschritten 414, 416 und 418 ausgewählt. Nach der Basenauswahl wird der Zuckerteil des Nukleosids ausgewählt. Das heißt, für jedes Nukleosid wird bei Verfahrenschritt 420 ein Zucker ausgewählt, der zusammen mit der ausgewählten Base des Nukleosid vervollständigt. Bei der Auswahl des Zuckers kann eine Zuckerchemie bei Verfahrenschritt 422 ausgewählt werden oder eine oder mehrere alternative Zucker werden bei den Prozessschritten 424, 426 und 428 ausgewählt. Für jede benachbarte Nukleosideinheit wird bei Verfahrenschritt 430 der Internukleosidverbinder ausgewählt. Die Bindungschemie für den Internukleosidverbinder kann die in Verfahrenschritt 432 ausgewählte Bindungschemie 1 oder eine oder mehrere alternative Bindungschemien sein, die in den Verfahrensschritten 434, 436 und 438 ausgewählt werden.
Zusätzlich zu Base, Zucker und Internukleosidverbinder können für jede Nukleosid-Position eine oder mehrere konjugierte Gruppen durch Bindung an das Nukleosid oder Bindung an den Internukleosidverbinder an das Oligonukleotid gebunden werden. Die Addition einer konjugierten Gruppe ist in Verfahrenschritt 440 vorgesehen und die Zuordnung der konjugierten Gruppe wird in Verfahrenschritt 450 durchgeführt.
Zur erläuternden Darstellung sind in den 10 und 11 für jede der Basen, der Zucker, der Internukleosidverbinder oder der Konjugate die Chemien 1 bis n dargestellt. Wie in dieser Beschreibung beschrieben ist, versteht es sich, dass die Anzahl der alternativen Chemien zwischen Chemie 1 und der alternativen Chemie n für Jede der Basen, der Zucker, der Internukleosidverbinder oder der Konjugate variabel ist und jede der in dieser Beschreibung beschriebenen und nach dem Stand der Technik bekannten spezifischen alternativen Basen, Zucker, Internukleosidverbinder und Konjugate umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist. Unter Verwendung der beschriebenen Logik in Verbindung mit den 10 und 11 werden, wie in 12 gezeigt, im allgemeinen Ablauf 300 die Chemien einer Liste von Oligonukleotiden zugeordnet. Bei der Zuordnung der Chemien zu den Oligonukleotiden in dieser Liste kann bei Verfahrenschritt 452 ein Zeiger auf das erste Oligonukleotid in der Liste und bei Schritt 453 auf das erste Nukleotid dieses ersten Oligonukleotids gesetzt werden. Die Basenchemie wird bei Schritt 410 wie oben beschrieben ausgewählt, die Zuckerchemie wird wie oben beschrieben bei Schritt 420 ausgewählt, gefolgt von der Auswahl der Internukleosidbindung bei Schritt 430, ebenso wie oben beschrieben. Bei Entscheidung 440 verzweigt der Prozess in Abhängigkeit davon, ob ein Konjugat bei der momentanen Position des Nukleotids addiert wird. Wenn ein Konjugat gewünscht wird, wird das Konjugat bei Schritt 450 wie oben beschrieben ausgewählt.
Ob oder ob nicht ein Konjugat bei Entscheidungsschritt 450 addiert wurde, wird bei Entscheidungsschritt 454 abgefragt. Diese Abfrage fragt, ob der Zeiger beim letzten Nukleotid des aktuellen Oligonukleotids stehen bleibt. Wenn das Ergebnis bei Entscheidungsschritt 454 „Nein" ist, bewegt sich der Zeiger zum nächsten Nukleotid des aktuellen Oligonukleotids und die Schleife mit den Schritten 410, 420, 430, 440 und 454 wird wiederholt. Die Schleife wird wiederholt, bis das Ergebnis bei Entscheidungsschritt 454 „Ja" ist.
Wenn das Ergebnis bei Entscheidungsschritt 454 „Ja" ist, wird bei Entscheidungsschritt 460 betreffend des Ortes des Zeigers in der Liste der Oligonukleotide eine Abfrage gemacht. Wenn sich der Zeiger nicht beim letzten Oligonukleotid in der Liste befindet, folgt der „Nein" Weg bei Entscheidungsschritt 460 und der Zeiger wird auf das erste Nukleotid des nächsten Oligonukleotids in der Liste bei Verfahrenschritt 458 gesetzt. Mit dem auf das nächste Oligonukleotid gesetzten Zeiger wird die Schleife, die bei Verfahrenschritt 453 beginnt, wiederholt. Wenn das Ergebnis bei Entscheidungsschritt 460 „Ja" ist, ist die Chemie für alle Nukleotide in der Liste der Oligonukleotide zugeordnet worden.
11. Beschreibung der Oligonukleotidchemien
Wie in 10 gezeigt wird, umfasst Auswahl der Chemie für jedes Nukleosid eines Oligonukleotids die Auswahl einer nukleosidbildenden Base aus einer großen Palette von unterschiedlichen verfügbaren Baseneinheiten. Dies können „modifizierte" oder „natürliche" Basen (die hier als Nukleobasen bezeichnet werden) sein, einschließlich der natürlichen Purinbasen Adenin (A) and Guanin (G) und die natürlichen Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Sie können weiterhin die modifizierten Nukleobasen einschließlich anderer synthetischer und natürlicher Nukleobasen umfassen, wie 5-Methylcytosin (5-me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Propynyluracil und Cytosin, 6-Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, 8-Amino, 8-Thiol, 8-Thioalkyl, 8-Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halouracile und Cytosine, insbesondere 5-Bromo, 5-Trifluoromethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Weitere Nukleobasen umfassen die im US-Patent Nr. 3,687,808 beschriebenen, die in Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Seiten 858–859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, offenbarten, die durch Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, offenbarten und die durch Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Seiten 289–302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993 offenbarten. Einige von diesen Nukleobasen sind insbesondere für die Vergrößerung der Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen nützlich. Diese umfassen 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2, N-6 und O-6 substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5-Propynyluracil und 5-Propynylcytosine. Es wurde gezeigt, dass 5-Methylcytosinsubstitute die Stabilität des Nukleinsäuredoppelstrangs um 0.6–1.2°C erhöhen (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. und Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, Seiten 276–278) und deshalb gegenwärtig als ausgewählte Base bevorzugt werden. Diese sind insbesondere dann nützlich, wenn sie mit 2'-O-Methoxyethylzuckermodifikationen wie oben beschrieben kombiniert werden.
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation von bestimmten der oben genannten modifizierten Nukleobasen genauso wie von anderen modifizierten Nukleobasen lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, das oben genannte US-Patent 3,687,808, ebenso wie die US-Patente 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; und 5,681,941. es wird ebenso auf die US-Patentanmeldung 08/762,488 Bezug genommen, die am 10. Dezember 1996 eingereicht wurde und die dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehört.
Bei der Auswahl der Base für ein bestimmtes Nukleosid eines Oligonukleotids wird zunächst die Notwendigkeit einer Base für eine spezifische Hybridisierung an den gegenüberliegenden Strang eines bestimmten Zielmoleküls berücksichtigt. Wenn also eine Base „A" benötigt wird, kann Adenin ausgewählt werden, es können jedoch andere alternative Basen ausgewählt werden, die die Hybridisierung bewirken, indem sie eine Base „A" nachahmen, wie 2'-Aminoadenin, soweit zum Beispiel eine stärkere Hybridisierung (bezogen auf die Hybridisierung, die mit Adenin erreicht wird) gewünscht wird.
Wie in 10 gezeigt wird, umfasst die Auswahl der Chemie für jedes Nukleosid eines Oligonukleotids die Auswahl einer zuckerbildenden Base aus einer großen Palette von unterschiedlichen verfügbaren Zuckersurrogat- oder Zuckereinheiten. Dieses können modifizierte Zuckergruppen sein, zum Beispiel Zucker, die eine oder mehrere substituierte Gruppen enthalten. Bevorzugte substituierte Gruppen umfassen die folgenden in einer 2'-Position: OH; F; O-, S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; oder O, S- oder N-Alkynyl; wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkynyl ein substituiertes oder nicht substituiertes C₁ bis C₁₀ Alkyl oder C₂ bis C₁₀ Alkenyl und Alkynyl sein kann. Insbesondere sind bevorzugt O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, und O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, wobei n und m 1 bis etwa 10 sein können. Andere bevorzugte substituierte Gruppen umfassen die folgenden in einer 2'-Position: C₁ bis C₁₀ niedriges Alkyl, substituiertes niedriges Alkyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamin, Polyalkylamin, Substituiertes Silyl, eine RNA-Spaltergruppe, eine Reportergruppe, ein Intercalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine bevorzugte Modifikation umfasst 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH₂CH₂OCH₃, auch bekannt als 2'-O-(2-methoxyethyl), 2'-O-Methoxyethyl, oder 2'-MOE) (Martin et al., Heiv. Chim. Acta, 1995, 78, 486) d.h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere bevorzugte Modifikation umfasst 2'-Dimethylaminooxyethoxy, Das heißt eine O(CH₂)₂ON(CH₃)₂-Gruppe, auch bekannt als 2'-DMAOE, wie sie in der US Patentanmeldung Nummer 09/016,520 beschrieben ist, eingereicht am 30. Januar 1998, die die dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehört und unter Bezugnahme hier vollständig mit aufgenommen wird.
Andere bevorzugte Modifikationen umfassen 2'-Methoxy (2'-O-CH₃), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) und 2'-Fluoro (2'-F). Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen der Zuckergruppe gemacht werden, insbesondere an der 3'-Position des Zuckers am endständigen 3'-Nukleotid oder in 2'-5'-gebundenen Oligonukleotiden und in der 5'-Position des endständigen 5'-Nukleotids. Die Nukleoside der Oligonukleotide können auch Zuckernachahmer haben, wie Cyclobutylreste an Stelle der Pentofuranosyl-Zucker.
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation von solchen modifizierten Zuckerstrukturen lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; und 5,700,920, wobei bestimmte Patente davon dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehören zusammen mit der US-Patentanmeldung Nummer 08/468,037, eingereicht am 5. Juni 1995, die die dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehört.
Wie in 10 gezeigt wird, umfasst die Auswahl der Chemie für jedes benachbarte Paar von Nukleosiden eines Oligonukleotids die Auswahl einer Internukleosidbindung. Diese Internukleosidbindungen werden auch als Verbinder, Rückgrat oder Oligonukleotid-Rückgrat bezeichnet. Zur Bildung dieser Nukleosidverbindungen ist eine Palette von verschiedenen Internukleosidverbindungen oder Rückgraten verfügbar. Diese umfassen modifizierte Oligonukleotid-Rückgrate, zum Beispiel Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl und andere Alkylphosphonate einschließlich 3'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate einschließlich 3'-Aminophosphoramidate und Aminoalkylphosphoramidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalklyphosphotriester und Boranophosphate mit normalen 3'-5'-Bindungen, 2'-5'-gebundene Analoga davon und welche mit invertierter Polarität, wobei die benachbarten Paare von Nukleosideinheiten 3'-5' bis 5'-3' or 2'-5' bis 5'-2'gebunden sind. Dies schließt verschiedene Salze, gemischte Salze und freie Säuren ebenso ein.
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation von den obigen phosphorhaltigen Bindungen lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; und 5,697,248, wobei bestimmte Patente davon dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehören.
Bevorzugte Internukleosidbindungen für Oligonukleotide, die kein Phosphoratom enthalten, das heißt für Oligonukleoside, haben Rückgrate, die durch kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Interzuckerverbindungen gebildet werden, gemischte Heteroatom- und Alkyl- oder Cycloalkyl-Interzuckerverbindungen oder eine oder mehrere kurzkettige Heteroatom- oder heterozyklische Interzuckerverbindungen. Diese umfassen solche mit Morpholinoverbindungen (aus dem Zuckerteil eines Nukleosids gebildet werden); Siloxan-Rückgrate; Sulfide, Sulfoxid und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl und Thioformacetyl-Rückgrate; alkenhaltige Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methyleneimin und Methylenehydrazin-Rückgrate; Sulfonat und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate und andere mit gemischten N, O, S und CH₂ Bestandteilen.
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation der obigen Oligonukleotide lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; and 5,677,439, wobei bestimmte Patente davon dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehören.
In anderen bevorzugten Oligonukleotiden, das heißt Oligonukleotid-Nachahmern, sind sowohl der Zucker als auch die Interzuckerverbindung, das heißt das Rückgrat der Nukleotideinheiten, durch neue Gruppen ersetzt. Die Baseneinheiten werden zur Aufrechterhaltung der Hybridisierung mit einer geeigneten Zielnukleinsäurenverbindung beibehalten. Eine solche oligomere Verbindung, ein Oligonukleotid-Nachahmer mit nachgewiesenen exzellenten Hybridisierungseigenschaften, wird als Peptidnukleinsäure (PNA) bezeichnet. In PNA-Verbindungen wird das Zucker-Phosphat-Rückgrat eines Oligonukleotids mit einem amidhaltigem Rückgrat ersetzt, insbesondere mit einem Aminoethylglycin-Rückgrat. Die Nukleobasen werden beibehalten und direkt oder indirekt an Azastickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden. Beispielhafte US-Patente, die die Präparation der PNA-Verbindungen lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 5,539,082; 5,714,331; und 5,719,262. eine weitere Lehre zu PNA-Verbindungen findet sich in Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497.
Für die Internukleosidverbindungen sind die am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Oligonukleotide mit Phosphorothioat-Rückgraten und Oligonukleoside mit Heteroatom-Rückgraten und insbesondere -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- and -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂- (wobei das native Phosphodiester-Rückgrat -O-P-O-CH₂- ist) des oben genannten US-Patentes 5,489,677, und das Amid-Rückgrat des oben genannten US-Patentes 5,602,240. Ebenso sind Oligonukleotide mit Morpholino-Rückgratstrukturen des oben referenzierten U.S. Patents 5,034,506 bevorzugt.
Beim Anheften einer konjugierten Gruppe zu einer oder mehreren Nukleosiden oder Internukleosidverbindungen eines Oligonukleotids werden verschiedene Eigenschaften der Oligonukleotide modifiziert. Die Modifikation der erfindungsgemäßen Oligonukleotide zur chemischen Bindung einer oder mehrerer Reste oder Konjugate an die Oligonukleotide diente der Vergrößerung der Aktivität, der zellulären Verteilung oder der zellulären Aufnahme der Oligonukleotide. Solche Reste umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, Lipidreste wie ein Cholesterolrest (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553), Cholsäure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053), ein Thioether, zum Beispiel Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765), ein Thiocholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), eine aliphatische Kette, zum Beispiel Dodecandiol oder Undecyl Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), ein Phospholipid, zum Beispiel Di-Hexadecyl-rac-glycerol oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), ein Polyamin oder eine Polyethylenglycolkette (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), oder Adamantanacetylsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651), ein Palmitylrest (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), oder ein Octadecylamin oder Hexylaminocarbonyloxycholesterolrest (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923).
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation der obigen Oligonukleotidkonjugate lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 und 5,688,941, wobei bestimmte Patente davon dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehören.
12. Chimäre Verbindungen
Es ist nicht notwendig, dass alle Positionen in einer gegebenen Verbindung einheitlich modifiziert werden. In der Tat können mehr als eine der oben erwähnten Modifikationen in einer einzelnen Verbindung vorkommen oder sogar in einem einzelnen Nukleosid innerhalb eines Oligonukleotids. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Verbindungen, die chimäre Verbindungen sind. „Chimäre" Verbindungen oder „Chimären" im Sinne dieser Erfindung sind Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die zwei oder mehrere chemisch unterschiedliche Bereiche enthalten, welche jeweils aus einer monomeren Einheit bestehen, das heißt im Falle einer Oligonukleotidverbindung aus einem Nukleotid. Diese Oligonukleotide enthalten typischerweise mindestens eine Region, in der das Oligonukleotid modifiziert ist, um dem Oligonukleotid eine erhöhte Widerstandskraft gegen Nukleaseabbau zu verleihen, eine erhöhte zelluläre Aufnahme und/oder eine erhöhte Bindungsaffinität für die Zielnukleinsäure. Eine zusätzliche Region des Oligonukleotids kann als Substrat für Enzyme dienen, die RNA:DNA oder DNA:RNA Hybride spalten.
Zum Beispiel ist RNase H eine zelluläre Endonuklease, die den RNA-Strang eines RNA:DNA-Duplex spaltete. Die Aktivierung der RNase H bewirkt daher einen Abbau der Ziel-RNA und vergrößert daher erheblich die Wirksamkeit der Oligonukleotidinhibierung der Genexpression. Deshalb können vergleichbare Ergebnisse oft mit kürzeren Oligonukleotiden erhalten werden, wenn chimäre Oligonukleotide verwendet werden, verglichen mit Phosphorothioatdesoxyoligonukleotiden, die mit derselben Zielregion hybridisieren. Der Abbau der Ziel-RNA kann nach dem Stand der Technik routinemäßig durch Gelelektrophorese und wenn notwendig durch Nukleinsäurehybridisierungstechniken nachgewiesen werden. Erfindungsgemäße chimäre Antisense Verbindungen können als zusammengesetzte Strukturen gebildet werden, die aus zwei oder mehr Oligonukleotiden bestehen, aus modifizierten Oligonukleotiden, Oligonukleosiden und/oder Oligonukleotid-Nachahmern wie oben beschrieben. Solche Verbindungen sind im Stand der Technik auch als „Hybride" oder „Gapmer" bezeichnet worden.
Beispielhafte US-Patente, die die Präparation von solchen Hybridstrukturen lehren, umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, die US-Patente 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; and 5,700,922, wobei bestimmte Patente davon dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehören zusammen mit der US-Patentanmeldung Nummer 08/465,880, eingereicht am 6. Juni 1995, die dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung gehört.
13. Beschreibung der automatisierten Oligonukleotidsynthese.
Im nächsten Schritt des Gesamtvorgangs (dargestellt in den 1 und 2) werden die Oligonukleotide mit einem automatisierten Synthesizer synthetisiert. Obwohl viele Vorrichtungen zum Einsatz kommen, ist nicht der Synthesizer vorzugsweise eine Abwandlung des in den US-Patenten 5,472,672 und 5,529,756, die hier beide aufgenommen wurden, beschriebenen Synthesizers. Der in diesen Patenten beschriebene Synthesizer wurde so modifiziert, dass er eine Bewegung entlang der y-Achse zusätzlich zu einer Bewegung entlang der x-Achse ausführen kann. So modifiziert können Verbindungen in einer 96-Well-Anordnung durch den Synthesizer synthetisiert werden. Der Synthesizer hat weiterhin eine Temperaturkontrolle und die Fähigkeit, eine inerte Atmosphäre während der gesamten Phase der Synthese aufrechtzuerhalten. Die Zuführungsanordnung für das Reagenzfeld verwendet eine orthogonale x-Achsenbewegung für eine Matrixanordnung von Reaktionsbehältern und eine y-Achsenbewegung für ein Reagenzfeld. Jedes Reagenz hat sein eigenes Rohrleitungssystem, um die Möglichkeit von Kreuzkontaminationen der Reagenzien und der Leitungsspülung und/oder der Pipettensäuberung auszuschließen. Die Kombination mit einer Hochgeschwindigkeitszuführung und einer Reagenzzuordnung erlaubt eine extrem schnelle Zuführung der Reagenzien. Dadurch werden weiterhin lange und komplexe Reaktionssequenzen effizient und leicht durchführbar.
Die Software zum Betrieb des Synthesizers erlaubt eine einfache Programmierung der parallelen Synthese einer großen Anzahl von Verbindungen. Die Software verwendet eine allgemeine Syntheseprozedur in der Form einer Befehlsdatei (.cmd), die bestimmte Reagenzien abruft, um sie, mittels Nachschauen in einer Sequenzdatei (.seq), in bestimmte Wells zu geben. Die Flaschenposition, Flussrate und Konzentration von jedem Reagenz wird in einer Nachschlagetabellen-Datei (.tab) gespeichert. Nachdem also einmal ein synthetisches Verfahren festgelegt worden ist, werden Verbindungen auf einer Platte durch Umordnung einer Gruppe von Reagenzien erzeugt und das Ergebnis wird in eine Textdatei geschrieben. Diese Textdatei wird direkt in den Synthesizer eingegeben und für die Synthese der Platte mit den Verbindungen verwendet. Der Synthesizer ist an eine relationale Datenbank angeschlossen, die den im Zusammenhang mit den synthetisierten Komponenten entstehenden Datenoutput hocheffizient aufzeichnet.
Der Aufbau der .seq, .cmd und .tab Dateien ist in 13 dargestellt. Als Teil des allgemeinen Oligonukleotidsynthese-Ablaufes 500, wird für jede Verbinderchemie bei Verfahrenschritt 502 eine Synthesedatei, das heißt eine .cmd-Datei, bei Verfahrenschritt 504 erzeugt. Diese Datei kann neu erstellt werden, wenn eine völlig neue Gruppe von Maschinenbefehlen für eine Gruppe von chemischen Syntheseschritten erzeugt wird oder es kann eine vorhandene, bei Verfahrensschritt 504 gespeicherte Datei abgeändert werden, indem die gespeicherte Datei bei Verfahrensschritt 508 editiert wird. Die .cmd-Dateien werden mit einem Textverarbeitungsprogramm und einer Gruppe von Kommandobefehlen wie unten ausgeführt erstellt.
Es hervorzuheben, dass die Erstellung der Kontrollsoftware und der Datendateien innerhalb des Fachkönnens von Personen liegt, die für die Nukleotidsynthese ausgebildet sind. Dasselbe gilt für die eingesetzte Hardware, die eingesetzten Chemien und die von der Bedienperson ausgewählten Herstellungsanweisungen.
In gleicher Weise wie die .cmd-Dateien werden .tab-Dateien für die in dem automatischen Synthesizer verwendeten nötigen Reagenzien für die besonderen Chemien, die für die Bindungs-, Basen-, Zucker- und Konjugatchemien ausgewählt wurden, erstellt. Das heißt, dass für jede Gruppe dieser Chemien bei Verfahrenschritt 510 eine .tab-Datei bei Verfahrenschritt 512 erstellt. Wie die .cmd-Dateien kann eine vorhandene .tab-Datei bei Verfahrenschritt 516 editiert werden.
Sowohl die .cmd-Dateien als auch die .tab-Dateien können bei Verfahrenschritt 518 zusammengeführt werden und für eine spätere Verwendung in einer dazugehörigen Probendatenbank 520 gespeichert werden. Das Zusammenführen kann leicht durch Dateinamen erfolgen, um eine .cmd-Datei mit ihrer dazugehörigen .tab-Datei zu verknüpfen, zum Beispiel wird synthesis_1.cmd mit synthesis_1.tab durch Verwendung desselben Wortanfangs verbunden.
Der automatisierte parallele Array-Synthesizer mit mehreren Wells hat eine Zuführungsanordnung für das Reagenzfeld, bei dem jedes Reagenz ein einzeln zugeordnetes Leitungssystem verwendet. Wie man bei den 23 und 24 sehen kann, wird während aller Phasen einer Synthese eine inerte Atmosphäre 522 aufrechterhalten. Die Temperatur wird durch eine Hitzetransferplatte 524 gesteuert, die einen Spritzguss-Reaktionsblock 526 trägt. Die Reaktions-Plattenvorrichtung gleitet Richtung x-Achse, während zum Beispiel acht Düsensegmente (528, 530, 532, 534, 536, 538, 540 und 542), die die Reagenzleitungen halten, in Richtung y-Achse gleiten, was die extrem schnelle Zuführung der 64 Reagenzien zu den 96 Wells ermöglicht. Zusätzlich gibt es zum Beispiel sechs Bänke mit festen Düsensegmenten (544, 546, 548, 550, 552 und 554), die dasselbe Reagenz oder Lösungsmittel zu acht Wells es auf einmal zuführen, bei insgesamt 72 möglichen Reagenzien.
Bei der Synthese von Oligonukleotiden für die Selektion bewegt sich das Ziel-Reaktionsgefäß, eine 96-Well-Platte 556 (ein zweidimensionales Feld), in Richtung entlang der x-Achse, während sich die Anordnung von unabhängig gesteuerten Reagenzzuführungsdüsen (528, 530, 532, 534, 536, 538, 540 and 542) entlang der y-Achse relativ zum Reaktionsgefäß 558 bewegt. Da die Reaktionsplatte 556 und die Reagenzdüsen (528, 530, 532, 534, 536, 538, 540 and 542) zur gleichen Zeit unabhängig voneinander bewegt werden können, ermöglicht die Anordnung die extrem schnelle Zuführung von bis zu 72 Reagenzien unabhängig voneinander zu den 96 Reaktionsbehälter-Wells.
Die Systemsoftware erlaubt die schnelle Programmierung der Synthese einer großen Zahl von Verbindungen mittels einer allgemeinen Syntheseprozedur in Form der Befehlsdatei zum Abrufen bestimmter Reagenzien, die zu spezifischen Wells hinzugegeben werden, mittels Nachschauen in der Sequenzdatei mit der Flaschenposition, Flussrate und Konzentration von jedem Reagenz, welche in der separaten Reagenztabellendatei gespeichert sind. Verbindungen können in verschiedenen Mengen synthetisiert werden. Für Oligonukleotide wird typischerweise eine Menge von 200 nmol ausgewählt, während für andere Verbindungen größere Mengen verwendet werden können, zum Beispiel 10 μmol (3–5 mg). Die erhaltenen Rohverbindungen sind im Allgemeinen > 80% rein und werden direkt für die Untersuchungs-Assays mit hohem Durchsatz verwendet. Alternativ können die Platten vorher einer Qualitätskontrolle (siehe die allgemeine Prozedur 600 und Beispiel 9) unterzogen werden, um ihre genaue Reinheit zu überprüfen. Die Verwendung des Synthesizers ist ein sehr effizientes Mittel für die parallele Synthese der Verbindungen für die Selektion.
Die Softwareeingabe akzeptiert tabulatorgetrennte Textdateien (wie oben für Datei 504 und 512 erläutert) aus jedem Texteditor. Eine typische Befehlsdatei, eine .cmd-Datei, ist in Beispiel 3 der Tabelle 2 gezeigt. Typische Sequenzdateien, .seq-Dateien, sind in Beispiel 3 der Tabellen 3 and 4 gezeigt (.SEQ-Datei) und eine typische Reagenzdatei, eine .tab-Datei, ist in Beispiel 3 der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 3 zeigt die Sequenzdatei für ein Oligonukleotid mit 2'-Desoxynukleotiden an jeder Position mit einem durchgehenden Phosphorothioat-Rückgrat. Tabelle 4 zeigt die Sequenzdatei für ein Oligonukleotid, wiederum mit einem durchgehenden Phosphorothioat-Rückgrat, es werden jedoch bestimmte modifizierte Nukleoside in Teilen des Oligonukleotids verwendet. Wie in der Tabelle gezeigt, werden 2'-O-(2-methoxyethyl)-modifizierte Nukleoside in einer ersten Region (Wing) des Oligonukleotids verwendet, gefolgt von einer zweiten Region (Gap) von 2'-Desoxynukleotiden und schließlich einer dritten Region (weiterer Wing), die dieselbe Chemie hat wie die erste Region. Typischerweise können einige Wells der 96-Well-Platten 556 leer bleiben (in Abhängigkeit der Zahl der Oligonukleotiden die während einer einzelnen Synthese erzeugt werden) oder einige der Wells enthalten Oligonukleotide, die als Standard zum Gleich oder für analytische Zwecke dienen.
Vor dem Befüllen mit Reagenzien werden feuchtigkeitsempfindliche Reagenzleitungen für 20 Minuten mit Argon bei 522 gereinigt. Die Reagenzien werden auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und im Synthesizer eingerichtet. Es werden große Flaschen, in 23 (zeigt acht Zuführungsleitungen) gemeinsam als 558 bezeichnet, für Wasch-Lösungsmittel und die Zuführung von allgemeinen Aktivatoren, Tritylgruppen-Abbaureagenzien und anderen Reagenzien für die Verwendung in Wells während spezieller Synthesen verwendet. Kleine Septumflaschen, in 23 gemeinsam als 560 bezeichnet, werden für einzelne Nukleotidamiditprecursorverbindungen verwendet. Dieses lässt eine wasserfreie Präparation und eine effiziente Einrichtung von verschiedenen Reagenzien zu, indem die Flaschen mit Nadeln unter Druck gesetzt werden, und als Zuführungsweg. Nachdem alle Reagenzien eingerichtet sind, werden die Leitungen mit Reagenz gefüllt, die Flussrate gemessen und dann in die Reagenztabelle (.tab-Datei) eingetragen. Eine trockene Harzplatte wird aus dem Vakuum genommen und in der Maschine für die Synthese eingerichtet.
Die modifizierte 96-Well-Platte aus Polypropylen 556 wird als Reaktionsgefäß benutzt. Das Arbeitsvolumen in jedem Well beträgt ungefähr 700 μl. Der Boden von jedem Well hat eine eingepasste 20 μm Polypropylenfritte und einen langen Kapillarabfluss in eine niedrigere Sammelkammer wie in 5 des oben genannten US-Patentes 5,372,672 gezeigt. Der feste Träger zum Halten der wachsenden Oligonukleotide während der Synthese wird in die Wells der Syntheseplatte 556 gefüllt, indem das gewünschte Volumen einer Aufschlämmung des Trägers mit eingestellter Dichte in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert wird, typischerweise eine Acetonitril/Methylenchlorid Mischung. Die Reaktionen können mit verschiedenen Mengen ablaufen, zum Beispiel die oben erwähnten 200 nmol und 10 μmol Mengen. Für die Oligonukleotidsynthese wird vorzugsweise ein CPG-Träger verwendet, es können aber ebenso andere Polystyren-PEG-Träger zum Befüllen mit Medium verwendet werden, wie TENTAGEL^TM oder ARGOGEL^TM.
Wie man in 24 sehen kann, wird die Syntheseplatte in x-Richtung zurück und vorwärts transportiert, unter einer Matrix von acht beweglichen Bänken (530, 532, 534, 536, 538, 540, 542 und 544) mit acht Düsen (64 insgesamt) in der y-Richtung und sechs Bänken (544, 546, 548, 550, 552 and 554) mit 48 festen Düsen, so dass jeder Well die geeigneten Mengen an Reagenzien und/oder Lösungsmitteln von jedem Reservoir (große Flaschen oder kleinere Septumflaschen) erhalten kann. Ein gleitendes ballonähnliches Ventil 562 umgibt das Düsenfeld und verbindet es mit dem Kopfraum der Reaktionsplatte 564. Ein langsamer Durchzug an Stickstoff oder Argon 522 bei Umgebungsdruck um den Kopfraum der Platte stellt eine wasserfreie Umgebung sicher.
Die flüssigen Inhalte in jedem Well träufeln nicht heraus, solange nicht der Kopfraumdruck die Kapillarkräfte der Flüssigkeit in der Ausgangsdüse übersteigt. Ein leichter positiver Druck in der unteren Sammelkammer kann zusätzlich ein langsames restliches Auslaufen aus gefüllten Wells verhindern, oder sie können durch das Blasen mit inertem Gas umgerührt werden. Um den Well zu entleeren, wird das Kopfraum-Gasauslassventil geschlossen und der interne Druck auf etwa 2 psi erhöht. Normalerweise werden die flüssigen Inhalte direkte in den Abfall 566 geblasen. Es kann jedoch eine 96-Well-Microtiterplatte in die untere Kammer unterhalb der Syntheseplatte eingesetzt werden, um das einzelne Well-Eluens für spektrophotometrische Messungen hinsichtlich des Reaktionsfortschrittes und der Ausbeute zu überwachen (Trityl usw.).
Das Grundschema für das Leitungssystem der Maschine ist die Zuführung von Reagenzien unter Gasdruck. Jedes Reagenz wird durch eine dafür vorgesehene Versorgungsleitung, gemeinsam als 568 bezeichnet, zu der Syntheseplatte geführt, wobei die Magnetventile gemeinsam als 570 und die Düsen gemeinsam als 572 bezeichnet sind. Reagenzien kommen niemals miteinander in Kontakt, bevor sie das Reaktions-Well erreichen. Darum gibt es keine Notwendigkeit, die Leitungen vor dem nächsten Gebrauch zu waschen und es gibt keine Möglichkeit einer Kreuzkontamination der Reagenzien. Die Geschwindigkeit der Flüssigkeitszuführung ist groß genug, dass die Inhalte eines Well gründlich gemischt werden und eine homogene Lösung bilden, und zwar sogar dann, wenn die verwendeten Lösungen sehr große Dichteunterschiede aufweisen. Durch das Mischen liegen die Reaktionspartner in homogener Lösung vor und in die Diffusion befördert die einzelnen Komponenten in und aus der festen Trägermatrix, in der die gewünschte Reaktion stattfindet. Jeder Vorratsbehälter für Reagenzien kann entweder zu einer einzelnen Düse oder zu einer Kombination von bis zu acht Düsen führen. Für jede Düse ist ebenso ein konzentrischer Düsenreiniger vorgesehen, um die Düsen nach der Zuführung zu reinigen, um Probleme mit der Bildung von kristallisierenden Reagenzien wegen langsamer Evaporation von Lösungsmittel an den Spitzen der Düsen zu vermeiden. Die Düsen und Versorgungsleitungen können jederzeit in eine Anordnung von Dummy-Wells direkt zum Abfall führen.
Das gesamte Leitungssystem besteht aus Teflonrohren, und die Vorratsbehälter für Reagenzien sind mittels Spritzennadel/Septum oder direkte Verbindung zu den Flaschen mit größerem Fassungsvermögen zugänglich. Die Septumampullen 560 werden in entfernbaren Regalen mit acht Flaschen gehalten, um leichten Aufbau und Reinigung zu ermöglichen. Das Füllungsvolumen für jede Leitung liegt bei etwa 350 μl. Das minimale Zuführungsvolumen liegt bei etwa 2 μl und die Genauigkeit der Flussrate beträgt ±5%. Die tatsächliche Menge an zugeführter Substanz hängt von der zeitgesteuerten Flussrate der Flüssigkeit ab. Die Flussrate für ein bestimmtes Lösungsmittel hängt von seiner Viskosität und den Benetzungseigenschaften der Teflonröhre ab. Die Flussrate (typischerweise 200–350 μl pro Sekunde) wird experimentell bestimmt und die Information wird in der Reagenztabelle der Setupdatei eingetragen.
Heizen und Kühlen des Reaktionsblocks 526 erfolgt durch eine Umlauf-Wärmetauscherplatte 524, ähnlich wie man sie in PCR-Umlaufheizern findet, die mit der Polypropylen-Syntheseplatte 556 verbunden ist, um einen guten Wärmekontakt zu gewährleisten. Die flüssigen Inhalte in einem Well können mit etwa 10°C pro Minute in einem Bereich von +5 bis +80°C erhitzt oder gekühlt werden, da Polypropylen über 80°C weich wird und sich verformt. Für höhere Temperaturen kann eine nicht-Weckwert-Syntheseplatte aus Stahl oder Monelmetall mit entfernbaren Fritten verwendet werden.
Die Hardware-Steuereinheit kann in einem weiten Bereich sehr unterschiedlich sein, aber kann in geeigneter Weise einer Anordnung mit drei 1 MHz 86332 Chips sein. Das Steuergerät steuert den einzelnen x-Achsen- und die acht y-Achse-Schrittmotoren und regelt die Zeitsteuerung für insgesamt 154 Magnetventile. Jeder Schritt hat 16 bidirektionale Timer I/Os und acht Interrupts in seiner „Timer Processing Unit" (TPU). Diese erzeugen die Schritt- und Richtungssignale und lesen drei Kodiereingänge und zwei Begrenzungsschalter zur Steuerung von bis zu drei Motoren pro Schritt. Das Steuergerät kommuniziert mit dem Windows Software Interfaceprogramm, das auf einem PC mit einem seriellen Kanal mit 19.200 Hz läuft und verwendet eine elementare Befehlsmenge, um die Ventilnummer, Offenzeit, Motornummer und Positionsdaten (valve_number, time_open, motor_number und position_data) zu übermitteln.
Die drei Bestandteile des auf dem Synthesizer laufenden Softwareprogramms sind die allgemeine Prozedur- oder Befehlsdatei (.cmd), welche die auszuführenden Synthesebefehle enthält, die Sequenzdatei (.seq), welche die Reaktionsmenge und die Reihenfolge der variablen Gruppen enthält, die zu dem Basissynthon gegeben werden, und die Reagenztabellendatei (.tab), die den Namen einer Chemikalie, ihren Ort (Flaschennummer), die Flussrate und die verwendete Konzentration enthält, in Verbindung mit einer Basismenge an Kommandobefehlen.
Eine Basismenge an Kommandobefehlen kann sein:
Der ADD-Befehl hat zwei Formen und soll das Aussehen und die Handhabung einer chemischen Standardgleichung haben. Die Reagenzien werden durch Angabe ihrer zuzugebenden molaren Menge angegeben, wenn die Zahl auf den Namensbezeichner folgt, oder durch ein absolutes Volumen in Mikrolitern, wenn die Zahl auf den Bezeichner folgt. Die Zahl der zuzugebenden Reagenzien ist in einer geteilten Liste durch das „+" Zeichen getrennt. Bei variablen Reagenzbezeichnern bedeutet das Schlüsselwort <seq>, in der Sequenztabelle nach dem zuzugebenden Reagenz zu schauen, wobei das Schlüsselwort <act> bedeutet, das Reagenz zugegeben wird, das mit dem bestimmten <seq> zusammenhängt. Reagenzien werden in der Reihenfolge zugegeben, wie in der Liste festgelegt.
Folglich bedeutet:
ADD ACN 300
Gib 300 μl des Reagenz Acetonitril hinzu; ACN zu jedem Well, in dem aktiv synthetisiert wird
ADD <seq> 300
bedeutet: Wenn der Sequenzzeiger in der .seq-Datei auf ein Reagenz in der Reagenzliste zeigt, unabhängig von der Menge, gib 300 μl des bestimmten Reagenz zu, das für dieses Well bestimmt ist.
ADD 1.1 PYR + 1.0 <seq> + 1.1 <act1>
bedeutet: Wenn der Sequenzzeiger in der .seq-Datei auf ein Reagenz in der Säureliste der Klasse ACIDS_1 zeigt, und PYR der Name des Pyridins ist, und Ethylchlorformiat in der .tab-Datei definiert ist, die Klasse ACIDS_1 zu aktivieren, dann bedeutet dieser Befehl:
Gib 1.1 Äquivalente Pyridin hinzu
1.0 Äquivalente der für das Well bestimmten Säure und
1.1 Äquivalente des Aktivators, Ethylchlorformiat
Der IF Befehl ermöglicht die Abfrage, welches Reagenz in der <seq> Variablen festgelegt wurde, und der folgende Anweisungsblock wird abgearbeitet.
Folglich bedeutet:
Steuere die Wells, für die Reagenzien in der Klasse Acid_1 vorgesehen sind, WARTE 60 Sekunden, dann steuere die Wells, für die Reagenzien in der Klasse Acid 2 vorgesehen sind, dann WARTE 60 Sekunden länger, dann ENTLEERE die gesamte Platte. Beachte, dass die Acid_1 Gruppe insgesamt 120 Sekunden reagiert, während die Acid 2 Gruppe nur 60 Sekunden reagiert.
Der REPEAT Befehl führt auf einfache Weise den gleichen Anweisungsblock mehrere Male aus.
Folglich bedeutet:
Wiederhole die Acetonitrilzugabe- und Entleerungssequenz für jedes Well dreimal. Die PRIME Anweisung steuert entweder spezifisch benannte Reagenzien oder Düsen, die im nächsten damit zusammenhängenden <seq> Ablauf verwendet werden.
Der NOZZLE_WASH Befehl befreit die Düsen nach dem Reaktionsablauf von Resten wegen der Evaporation von Reagenzlösungsmittel und steuert entweder spezifisch benannte Reagenzien oder Düsen, die bei dem vorhergehenden zusammenhängenden <seq> Ablauf verwendet wurden. Die Maschine ist derart ausgebildet, dass, wenn irgendeine Düse in einem Block benutzt wurde, Verschmutzungen aller Düsen in diesem Block in den Füllanschluss gespült werden.
Die WAIT und DRAIN Kommandos werden in Sekunden angegeben, wobei die Entleerungsanweisung einen Gasdruck über der Oberfläche der Platte aufbaut, um die Wells zu entleeren.
Die LOAD und REMOVE Kommandos sind Anweisungen für die Maschine, um für einen Steuerungsvorgang zu pausieren.
Die NEXT_SEQUENCE Anweisung erhöht den Sequenzzeiger auf die nächste zuzugebende Substituentengruppe in der Sequenzdatei. Die allgemeine Form einer .seq-Datei Eingabe ist:
Well_No Well_ID Scale Sequence
Die Sequenzinformation wird durch eine Spaltenreihe übermittelt, wobei jede ein zuzugebendes variables Reagenz in einer bestimmten Position repräsentiert. Es ist eine Mengenvariable (μmol) vorhanden, so dass Reaktionen mit unterschiedlichen Mengen zur selben Zeit erfolgen können, wenn dies gewünscht ist. Die Reagenzien sind in einer Nachschlagetabelle (die .tab-Datei) gespeichert, die wie in den Sequenz- und Befehlsdateien den Reagenznamen, die Flussrate und Konzentration festlegt. Diese Information wird dann durch die Steuerungssoftware und -Hardware verwendet, um sowohl die geeignete Schiebebewegung zur Positionierung der Platte und der Schiebearme für die Zuführung eines spezifischen Reagenz zu steuern, als auch das spezifische Ventil und die Zeit, die zur Zuführung der dazugehörigen Reagenzien benötigt wird. Die geschickte Klassifikation von Reagenzien erlaubt die Verwendung von bedingten IF-Schleifen innerhalb einer Befehlsdatei, um die Zugabe von verschiedenen Reagenzien während eines „einzelnen Schrittes" gleichzeitig über die 96 Wells durchzuführen. Die besondere Klasse ACTIVATORS legt bestimmte Reagenzien fest, die immer mit einer bestimmten Reagenzklasse zugegeben werden (zum Beispiel Tetrazol während einer Phosphitylierungsreaktion beim Anfügen des nächsten Nukleotids an ein wachsendes Oligonukleotid).
Die allgemeine Form der .tab-Datei ist:
Class Bottle Reagent Name Flow_rate Conc.
Die LOOP_BEGIN und LOOP_END Anweisungen bezeichnen einen Anweisungsblock, der ständig weiterläuft, bis eine NEXT_SEQUENCE Anweisung auf das Ende der längsten Liste von Reaktanten in einem Well zeigt.
In der Anweisungsmenge ist ein MOVE Befehl nicht vorhanden. Für alle oben genannten Befehle gilt, dass, wenn eine Platten- oder Düsenbewegung ausgeführt werden muss, diese automatisch ausgeführt wird, um die gewünschte Lösungsmittel- oder Reagenzzufuhr durchzuführen. Dies wird durch die Steuerungssoftware und -Hardware bewerkstelligt, die die richtigen Düse(n) und Well(s) für eine jeweilige Reagenzzugabe bestimmt und dann vor der Reagenzzugabe die Position der erforderlichen Düse und Well abgleicht.
Ein MANUAL Modus kann ebenso verwendet werden, bei dem die Syntheseplatte und Düsenblocks in die Ruhestellung oder in jede Position durch den Bedienter gefahren, die Düsen gefüllt oder gereinigt, die verschiedenen Reagenzflaschen entlüftet oder mit Lösungsmittel gewaschen, die Kammer unter Druck gesetzt werden kann und so weiter. Der automatische COMMAND Modus kann an jedem Ablaufpunkt unterbrochen, MANUAL Befehle ausgeführt und der Ablauf an der zugehörigen Stelle fortgesetzt werden. Der Sequenzzeiger kann inkrementiert werden, um die Synthese überall innerhalb einer Befehlsdatei wiederaufzunehmen.
Unter Bezugnahme auf Figur für 10 kann die Liste der Oligonukleotide für die Synthese neu angeordnet oder gruppiert werden, um die Synthese zu optimieren. Dementsprechend werden bei Verfahrenschritt 574 die Oligonukleotide entsprechend einem Faktor gruppiert, auf dem die Optimierung der Synthese beruht. Bei der Verwendung des Amiditverfahrens zur Oligonukleotidsynthese wird ein Nukleotid mit einem 3'-Phosphoramidit wird zur 5'-Hydroxylgruppe einer wachsenden Nukleotid Kette gegeben. Das erste Nukleotid (am 3'-Ende vom Oligonukleotid – das 3'- nächste Nukleosid) wird zunächst mit einem festen Träger verbunden. Dies geschieht in der Regel für große Mengen chargenweise als Standardvorgehensweise bei der Oligonukleotidsynthese.
Solche festen Träger mit vorgefüllten Nukleosiden sind kommerziell erhältlich. Bei der Verwendung von Multi-Wells zur Oligonukleotidsynthese wird für jedes zu synthetisierende Oligonukleotid ein Aliquot eines festen Trägers mit dem dazugehörigen Nukleosid für die Synthese zum Well gegeben. Vor der Eingabe der zu synthetisierenden Oligonukleotidsequenzen in die .seq-Datei werden sie nach dem endständigen 3'-Nukleotid sortiert. Auf Basis dieser Sortierung werden alle Oligonukleotidsequenzen mit einem „A"-Nukleosid an ihrem 3'-Ende zusammen gruppiert, und die „C"-Nukleosid werden zusammen gruppiert genauso wie die „G"- oder „T"-Nukleoside. Beim Befüllen der festen Träger mit den Nukleosiden in die Synthese-Wells werden so Automatenbewegungen eingespart.
Die Oligonukleotide können entsprechend der oben beschriebenen Parameter gruppiert werden oder nach anderen Parametern, die die Synthese der Oligonukleotide erleichtern. So erfolgt in 14 die Sortierung durch einen Parameter vom Typ 1, was zum Beispiel das oben beschriebene 3'-Nukleotid betrifft, oder andere Arten von Parametern von Typ 2 bis Typ n bei Verfahrensschritt 576, 578 und 580. Weil die Synthese vom 3'-Ende der Oligonukleotide zum 5'-Ende, werden die Oligonukleotidsequenzen umgekehrt sortiert, damit sie von 3' nach 5' gelesen werden.
Nachdem sie nach Typen sortiert sind, wird die Position der Oligonukleotide auf der Syntheseplatte bei Verfahrensschritt 582 durch die oben beschriebene Erzeugung einer .seq-Datei festgelegt. Die .seq-Datei gehört zu den entsprechenden .cmd- und .tab-Dateien, die für die Synthese der einzelnen Chemien der Oligonukleotide bei Verfahrensschritt 584 durch Abfrage der Probendatenbank 520 nach den .cmd- und .tab-Dateien bei Verfahrensschritt 586 bestimmt wurden. Diese Dateien werden dann bei Verfahrensschritt 588 in den Multi-Well-Synthesizer für die Oligonukleotidsynthese eingegeben. Nachdem der realen Synthese tritt die Oligonukleotidliste in den allgemeinen Verfahrensablauf ein, wie in 1 gezeigt. Für den Versand, Lagerung oder andere Zwecke können die Platten an dieser Stelle wenn gewünscht lyophilisiert werden. Nach der Lyophilisierung enthält jeder Well die dort befindlichen Oligonukleotide als Trockenbestandteil.
14. Qualitätskontrolle
In einem wahlweisen Schritt wird eine Qualitätskontrolle für die Oligonukleotide bei Verfahrensschritt 600 durchgeführt, nachdem eine Entscheidung getroffen wurde (Entscheidungsschritt 550), ob die Qualitätskontrolle durchgeführt werden soll. Obwohl die Durchführung der Qualitätskontrolle wahlweise ist, kann sie erwünscht sein, wenn es einen Grund gibt, anzunehmen, dass ein Punkt des Syntheseverfahrensschrittes 500 gestört worden ist. Alternativ können Proben der Oligonukleotide in dem Falle genommen und gelagert werden, wenn die Ergebnisse der mit den Oligonukleotiden durchgeführten Assays widersprüchliche Ergebnisse oder weniger gute Daten liefern. Im letzteren Fall kann die Qualitätskontrolle nach dem Entscheidungsschritt 800 durchgeführt werden, wenn keine Oligonukleotide mit ausreichender Aktivität gefunden wurden. In jedem Fall folgt der Entscheidungsschritt 650 auf den Qualitätskontrolle-Verfahrensschritt 600. Wenn ein oder mehrere Oligonukleotide nicht die Qualitätskontrolle bestehen, kann der Verfahrensschritt 500 wiederholt werden, d.h. die Oligonukleotide werden ein zweites Mal synthetisiert.
Der Ablauf der allgemeinen Qualitätskontrollen-Systemprozedur 600 ist in 15 in den Schritten 610–660 detailliert beschrieben. Auf die in 18 gezeigten automatisierten Vorrichtungen und Geräteausstattungen wird in der folgenden Beschreibung Bezug genommen.
Während des Schrittes 610 (15) wird steriles, doppelt destilliertes Wasser durch eine automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) zu jedem Well einer Multi-Well-Platte geleitet, welche eine Gruppe von lyophilisierten Antisense Oligonukleotiden enthält. Die automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) liest die Barcodeplakette an der Multi-Well-Platte, um die Identifikationsnummer der Platte zu erhalten. Die automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung fragt dann die Probendatenbank 520 (die sich im Datenbankserver 2002 in 18 befindet) nach dem Anweisungssatz für diese Platte ab und führt die entsprechenden Schritte aus. Drei Qualitätskontrollprozesse sind dargestellt, es versteht sich jedoch, dass andere Qualitätskontrollprozesse oder Schritte anstelle der dargestellten Prozesse zusätzlich oder stattdessen durchgeführt werden können.
Der erste dargestellte Qualitätskontrollprozess (Schritte 622 bis 626) ermittelt die Oligonukleotidkonzentration in jedem Well. Wenn dieser Qualitätskontrollschritt durchgeführt wird, wird eine automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) angewiesen, ein Aliquot von jedem Well der Hauptplatte zu entnehmen und eine replizierte Tochterplatte für den Transport zum UV-Spektrophotometer (2016 in 18) zu erzeugen. Das UV-Spektrophotometer (2016 in 18) misst dann die optische Dichte von jedem Well bei einer Wellenlänge von 260 nm. Unter Verwendung von standardisierten Umrechnungsfaktoren berechnet ein Mikroprozessor innerhalb des UV-Spektrophotometers (2016 in 18) einen Konzentrationswert aus den gemessenen Absorptionswert für jeden Well und gibt die Ergebnisse an die Probendatenbank 520 ein.
Der zweite dargestellte Qualitätskontrollprozess (Schritte 632 bis 636) ermittelt die Prozente der gesamten Oligonukleotide mit voller Länge in jedem Well. Wenn dieser Qualitätskontrollschritt durchgeführt wird, wird eine automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) angewiesen, ein Aliquot von jedem Well der Hauptplatte zu entnehmen und eine replizierte Tochterplatte für den Transport zu der Mehrfachkanal-Kapillargelelektrophoresevorrichtung (2022 in 18) zu erzeugen. Die Vorrichtung löst elektrophoretisch im Kapillarröhrchengel das Oligonukleotidprodukt in jedem Well auf. Wenn das Produkt das entfernte Ende des Gels im Röhrchen während der Elektrophorese erreicht, wird durch ein Messfenster dynamisch die optische Dichte des vorbeilaufenden Produktes gemessen. Nach der Elektrophorese wird der Prozentwert des am Messfenster vorbeilaufenden Produktes unter Berücksichtigung der Zeit verwendet, um durch einen eingebauten Mikroprozessor die relative Größenverteilung des Oligonukleotidprodukts in jedem Well zu messen. Die Ergebnisse werden dann in die Probendatenbank (520) eingegeben.
Der dritte dargestellte Qualitätskontrollprozess (Schritte 632 bis 636) ermittelt die Masse der Oligonukleotide mit voller Länge in jedem Well. Wenn dieser Qualitätskontrollschritt durchgeführt wird, wird eine automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) angewiesen, ein Aliquot von jedem Well der Hauptplatte zu entnehmen und eine replizierte Tochterplatte für den Transport zu dem Mehrfachkanal-Massenspektometer (2018 in in 18) zu erzeugen. Die Vorrichtung verwendet die Elektrospraytechnologie, um das Oligonukleotidprodukt in das Massenspektometer zu indizieren. Ein eingebauter Mikroprozessor berechnet dann das Massenladungsverhältnis, um die Masse des Oligonukleotidprodukts in jedem Well zu erhalten. Die Ergebnisse werden dann in die Probendatenbank (520) eingegeben.
Nach Beendigung der gewählten Qualitätskontrolleprozesse werden die Ausgangsdaten manuell oder wird mit einem passenden Algorithmus überprüft und eine Entscheidung wird getroffen, ob oder nicht die Platte den „Bestanden"- oder „Fehlerhaft"-Status erhält. Das derzeitige Kriterium zum „Bestehen" für 18-mere Oligonukleotide ist, dass mindestens 85% der Oligonukleotide in einer Multi-Well-Platte zu 85% oder mehr ein Produkt in voller Länge sein müssen, wie dies sowohl durch Kapillargelelektrophorese als auch Massenspektometer gemessen wurde. Eine (manuelle oder automatische) Eingabe über den Bestanden/Fehlerhaft-Status der Platte wird dann in die Probendatenbank 520 gegeben. Wenn eine Platte durchfällt, läuft der Prozess zu Schritt 500 zurück und eine neue Platte mit denselben Oligonukleotiden wird automatisch in die Platten-Syntheseanforderungsschleife eingereiht (Prozess 554 in 15). Wenn eine Platte den „Bestanden"-Status erhält, wird eine automatisierte Flüssigkeitsvorrichtung (2040 in 18) angewiesen, ein Aliquot von jedem Well der Hauptplatte zu entnehmen und eine replizierte Tochterplatte zu erzeugen, bei der die Oligonukleotide in jedem Well eine 30 μmolare Konzentration haben. Die Platte bewegt sich dann zu Prozess 700 für die Bewertung der Oligonukleotid-Aktivität.
15. Zelllinien für die Messung der Oligonukleotid-Aktivität
Die Wirkung von Antisense Verbindungen auf die Expression von Zielnukleinsäure kann in einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen getestet werden, vorausgesetzt dass die Zielnukleinsäure oder ihr Genprodukt in messbaren Mengen vorhanden ist. Dies kann routinemäßig zum Beispiel mit PCR oder Northern-Blot-Analyse geschehen. Die folgenden vier Zelltypen werden zum Zwecke der Erläuterung beschrieben, es können aber andere Zelltypen routinemäßig verwendet werden.
T-24-Zellen: Die Blasenzellkarzinom-Zelllinie T-24 wird von der „American Type Culture Collection" (ATCC) (Manassas, VA) bezogen. T-24 Zellen wurden routinemäßig in einem vollständigen McCoy's 5A Basismedium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) kultiviert, dass 10% fetales Kälberserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 μg pro Milliliter Streptomycin enthält (alles von Life Technologies). Die Zellen durchlaufen routinemäßig eine Trypsinierung und Verdünnung, wenn sie eine Konfluenz von 90% erreichen. Die Zellen werden für die RT-PCR-Analyse routinemäßig in 96-Well-Platten (Falcon-Primaria #3872) bei einer Dichte von 7000 Zellen/Well ausgesät. Für Northernblotting oder andere Analysen werden die Zellen auf 100 mm oder andere Standard-Gewebekulturplatten ausgesät und unter Verwendung von entsprechenden Mengen an Medium und Oligonukleotiden ähnlich behandelt.
A549-Zellen: Die menschliche Lungenkarzinom-Zelllinie A549 wird von ATCC (Manassas, VA) bezogen. A549 werden routinemäßig in DMEM Basismedium (Life Technologies) bezogen, dass 10% fetales Kälberserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 μg pro Milliliter Streptomycin enthält (alles von Life Technologies). Die Zellen durchlaufen routinemäßig eine Trypsinierung und Verdünnung, wenn sie einen Verschmelzungsgrad von 90% erreichen.
NHDF-Zellen: Die neonatalen dermalen Fibroblasten (NHDF) wurden von der Clonetics Corporation (Walkersville, MD) bezogen. NHDFs wurden routinemäßig im Fibroblasten-Wachstumsmedium (Clonetics Corp.) des Herstellers gehalten. Wie vom Hersteller empfohlen, wurden die Zellen für bis zu 10 Durchläufe verwendet.
HEK-Zellen: Die menschlichen embryonalen Keratinozyten (HEK) wurden von der Clonetics Corp. bezogen. HEKs wurden routinemäßig im Keratinozyten-Wachstumsmedium (Clonetics Corp.) des Herstellers gehalten. Wie vom Hersteller empfohlen, wurden die Zellen für bis zu 10 Durchläufe verwendet.
16. Behandlung der Zellen mit in Frage kommenden Verbindungen:
Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80% erreichen, werden sie mit Oligonukleotiden behandelt. Zellen, die in 96-Well-Platten gewachsen sind, werden die Wells einmal mit 200 μl OPTI-MEM-1^TM reduziertem Serummedium (Life Technologies) gewaschen und dann mit 130 μl of OPTI-MEM-1^TM behandelt, das 3.75 μg/ml LIPOFECTIN^TM (Life Technologies) enthält. Nach einer vierstündigen Behandlungsdauer wird das Medium durch frisches Medium ersetzt. Nach 16 Stunden Behandlung mit Oligonukleotiden werden die Zellen geerntet.
In Zellen, die gegen Kationen vermittelte Transfektionen resistent sind, können alternativ Oligonukleotide durch Elektroporation eingebracht werden. Die Bedingungen für die Elektroporation müssen für jeden Zelttyp optimiert werden. Im Allgemeinen werden Oligonukleotide direkt in das vollständige Wachstumsmedium mit einer Endkonzentration von 1 bis 20 μmol gegeben. Die Zellen werden einem elektrischen Puls unter Verwendung eines BTX T820 ELECTRO SQUARE PORATOR^TM mit einer multikoaxialen 96-Well Elektrode (BT840) (BTX Corporation, San Diego, Kalifornien) ausgesetzt. Nach der Elektroporation kommen die Zellen für weitere 16 Stunden in den Inkubator.
17. Bestimmung der Oligonukleotid-Aktivität
Die Oligonukleotid vermittelte Modulation der Expression einer Ziel-Nukleinsäure kann mithilfe einer Reihe von nach dem Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden. Zum Beispiel können die Mengen der Ziel-RNA durch Northern-Blot-Analyse, kompetitive PCR oder Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bestimmt werden. Die RNA-Analyse kann mit völlig zellulärer RNA oder im Falle von Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuren mit vorzugsweise Poly(A)+ mRNA durchgeführt werden. Für RT-PCR wird Poly(A)+ mRNA bevorzugt. Verfahren der RNA-Isolierung werden zum Beispiel durch Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Seiten 4-1 bis 4–13, Greene Publishing Associates und John Wiley & Sons, New York, 1992) gelehrt. Northern-Blot-Analyse ist Stand der Technik (wie oben, Seiten 4–14 bis 4–29).
Alternativ kann die gesamte RNA aber aus kultivierten Zellen oder Gewebe unter Verwendung des QIAGEN RNeasy^®-96 Kits für die Präparation von großen Mengen RNA hergestellt werden (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). Wichtig ist, dass die Präparation nach den Anweisungen des Herstellers erfolgt. Wahlweise kann zusätzlich ein DNAse Schritt erfolgen, um restliche DNA vor der RT-PCR zu entfernen.
Um die Effizienz und Genauigkeit zu verbessern, wurden die sich wiederholenden Pipettier- und Eluationsschritte unter Verwendung eines QIAGEN Bio-Robot 9604 automatisiert. Nach dem Lysieren der mit Oligonukleotid behandelten Zellkulturen in situ, wird die Platte auf die Roboter-Plattform überführt, wo das Pipettieren, die DNAse-Behandlung und die Eluierung durchgeführt werden. Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) kann zweckmäßig unter Verwendung des kommerziell erhältlichen ABI PRISM^® 7700 Sequenz-Nachweissystems (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Andere PCR-Verfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Die Mengen an Zielprotein können durch eine Reihe von nach dem Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden, wie im Immunpräzipitation, Western Blot-Analyse, „Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) oder „Fluorescence activated cell sorting" (FACS). Antikörper, die gegen ein durch eine Zielnukleinsäure kodiertes Protein gerichtet sind, können nachgewiesen und durch eine Reihe von Quellen erhalten werden, wie den MSRS-Antikörperkatalog (Aerie Corporation, Birmingham, MI, oder über das Internet httpa/www.ANTIBODIES-PROBES.com/), oder sie können mit herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen, monospezifischen („Antipeptid") und monoklonalen Antiseren werden zum Beispiel durch Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Seiten 11-3 bis 11–54, Greene Publishing Associates und John Wiley & Sons, New York, 1992 gelehrt.
Verfahren zur Immunpräzipitation sind Stand der Technik und zum Beispiel bei Ausubel et al. (Id., pp. 10–57 bis 10–63) beschrieben. Die Western Blot-Analyse (Immunoblot) ist Stand der Technik (wie oben, Seiten 10–32 bis 10–10–35). Enzymelinked Immunosorbent Assays (ELISA) sind Stand der Technik (wie oben, Seiten 11-5 bis 11–17).
Weil die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise chargenweise getestet werden, das heißt parallel in einem automatisierten Syntheseprozess wie oben beschrieben, sind die Mittel zum Testen vorzugsweise für die Verwendung in 96-Well-Platten und für automatische Vorrichtungen geeignet. Dementsprechend werden für die Bestimmung der Zielnukleinsäurenmengen eine automatische RT-PCR und für die Bestimmung der Zielproteinmengen ein automatischer ELISA bevorzugt.
Der Testschritt, allgemeiner Verfahrenschritt 700, ist detailliert in 16 beschrieben. Nachdem eine entsprechende Zelllinie bei Verfahrenschritt 710 ausgewählt worden ist, wird bei Entscheidungsschritt 714 eine Entscheidung getroffen, ob die RT-PCR die einzige Methode zur Bewertung der Aktivität der Verbindungen ist. In einigen Fällen ist es wünschenswert, bei Verfahrenschritt 718 alternative Verfahren für Assays durchzuführen; wenn zum Beispiel sowohl die Menge an Ziel-Polypeptiden als auch an Ziel-RNA bestimmt werden soll, wird ein Immunoassay wie ELISA parallel mit den RT-PCR Assays durchgeführt. Vorzugsweise sind solche Assays durch halb- oder vollautomatische Vorrichtungen steuerbar.
Wenn die RT-PCR zur Bestimmung der Aktivität der Komponenten durchgeführt wird, werden Zellen in Multi-Well-Platten (typischerweise 96-Well-Platten) bei Verfahrenschritt 720 ausgestrichen und bei Verfahrenschritt 730 mit Test- oder Kontroll-Oligonukleotiden behandelt. Dann werden die Zellen bei Verfahrenschritt 740 geerntet und lysiert und die Lysate werden in die Vorrichtung gegeben, wo in Verfahrenschritt 750 die RT-PCR durchgeführt wird. Eine Datei mit Rohdaten wird erzeugt und die Daten bei Verfahrenschritt 760 heruntergeladen und kompiliert. Tabellenkalkulationsdateien mit Datenkurven werden bei Verfahrenschritt 770 erzeugt und die experimentellen Daten bei Verfahrenschritt 780 analysiert. Auf Grundlage der Ergebnisse wird eine Entscheidung bei Verfahrenschritt 785 getroffen, ob es notwendig ist, die Assays zu wiederholen und wenn das der Fall ist, beginnt der Vorgang wieder mit Schritt 720 neu. In jedem Falle werden die Daten von allen Assays für jedes Oligonukleotids bei Verfahrenschritt 790 kompiliert und automatisch statistische Parameter bestimmt.
18. Einstufung der Verbindungen nach ihrer Aktivität:
Nach dem Testen, allgemeiner Verfahrenschritt 700, werden die Oligonukleotidverbindungen nach einer oder mehreren gewünschten Eigenschaften eingeordnet. Typischerweise werden für die Verbindungen drei Klassen verwendet: aktive Verbindungen, die geringaktiven Verbindungen und inaktive Verbindungen. In einem gewissen Ausmaß variieren die Selektionskriterien für diese drei Klassen von Zielmolekül zu Zielmolekül und Mitglieder einer oder mehrerer dieser Klassen können für eine gegebene Gruppe von Oligonukleotiden nicht vorhanden sein.
Einige Kriterien sind jedoch gleichbleibend. Zum Beispiel werden inaktive Verbindungen typischerweise solche Verbindung umfassen, die die Expression des Zielmoleküls um 5% oder weniger hemmen (relativ zum Basiswert). Aktive Verbindungen bewirken typischerweise mindestens eine 30% Hemmung der Expression des Zielmoleküls, obwohl niedrigere Werte für die Hemmung in einigen Fällen annehmbar sind. Verbindungen mit geringer Aktivität haben Aktivitäten, die zwischen den aktiven und den inaktiven Verbindungen legen, wobei bevorzugte geringaktive Verbindungen eine Aktivität haben, die mehr der der aktiven Verbindungen entspricht.
19. Optimierung von Leitsubstanzen durch die Sequenz.
Eine Methode, mit der die Aktivität von Oligonukleotidverbindungen verbessert werden kann, ist die Veränderung ihrer Nukleobasensequenzen, so dass unterschiedliche Bereiche der Ziel-Nukleinsäure als Ziel dienen. Einige dieser Bereiche sind für Oligonukleotidverbindungen besser erreichbar als andere und ein „Verschieben" einer Nukleobasensequenz entlang einer Zielnukleinsäure um nur wenige Basen kann signifikante Effekte auf die Aktivität haben. Dementsprechend ist die Veränderung oder von erfindungsgemäßen Verbindungen ein Mittel, durch das weniger geeignete Verbindungen verbessert werden können oder durch das neue, aktive Verbindungen erzeugt werden können.
Der Vorgang 1100 der Genwanderung ist in den Schritten 11041113 der 17 gezeigt und wird im Folgenden detailliert beschrieben. Im hier verwendeten Sinne bedeutet Genwanderung der Vorgang, bei dem eine bestimmte Oligonukleotidsequenz x, die an die bestimmte Ziel-Nukleinsäurensequenz y bindet, als Referenzbereich verwendet wird, um welchen eine Reihe von neuen, mit der Ziel-Nukleinsäurensequenz y hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen erzeugt werden, die sequenzverschobene Erweiterungen der Oligonukleotidsequenz x sind. Eine Genwanderung kann „aufwärts" oder „abwärts" oder in beiden Richtungen eines bestimmten Oligonukleotids erfolgen.
Bei Schritt 1104 gibt der Nutzer manuell die Identifikationsnummer der Oligonukleotidsequenz, für die ein Genwanderungsvorgang 1100 durchgeführt werden soll, und den Namen der entsprechenden Ziel-Nukleinsäure ein. Der Nutzer gibt dann das Ziel der Genwanderung bei Schritt 1104 ein, d.h. die Zahl der Oligonukleotidsequenzen, die erzeugt werden sollen. Der Nutzer gibt dann bei Schritt 1108 einen positiven Integerwert für die Sequenzverschiebung ein. Nach Eingabe der Daten wird die Genwanderung durchgeführt. Dies veranlasst die Ausführung eines Unterprogramms, das automatisch die gewünschte Liste mit Sequenzen erzeugt, indem es die Zielsequenz entlang wandert. An dieser Stelle macht der Nutzer bei Prozess 400 weiter, um die Chemien den ausgewählten Oligonukleotiden zuzuordnen.
In Beispiel 16 wird unten eine Genwanderung detailliert beschrieben. In den nachfolgenden Schritten wird diese neue Gruppe mit Nukleobasensequenzen, die durch die Genwanderung erzeugt wurde, bei dem allgemeinen Verfahrensschritt 500 zur Steuerung der automatischen Synthese einer zweiten Gruppe mit in Frage kommenden Oligonukleotiden verwendet. Diese Verbindungen werden dann für nachfolgende Verfahrensschritte verwendet, um aktive Verbindungen zu erhalten, oder die Schritte werden wiederholt, um die Aktivität der Verbindungen zu optimieren.
20. Optimierung der Leitverbindungen mittels Chemie.
Eine weitere Methode, mit der die Aktivität der erfindungsgemäßen Oligonukleotidverbindungen verbessert werden kann, ist die Wiederholung von Teilen des erfindungsgemäßen Prozesses unter Verwendung von geringaktiven oder aktiven Verbindungen des ersten Durchlaufes und der Auswahl von zusätzlichen Chemien für deren Nukleobasensequenzen.
So wird beispielsweise im allgemeinen Verfahrensschritt 400 eine Oligonukleotidchemie zugeordnet, die sich von der der ersten Oligonukleotidgruppe unterscheidet. Die Nukleobasensequenzen von geringaktiven Verbindungen werden bei dem allgemeinen Verfahrensschritt 500 zur Steuerung der Synthese einer zweiten Gruppe mit Oligonukleotiden mit der zugeordneten zweiten Chemie verwendet. Die erhaltene zweite Oligonukleotidgruppe wird in der gleichen Weise wie die erste Gruppe bei Verfahrensschritt 700 getestet und die Ergebnisse werden bei Entscheidungsschritt 800 untersucht, um zu bestimmen, ob die erzeugten Verbindungen eine ausreichende Aktivität haben.
21. Identifizierung von geeigneten Bereichen für Antisense Technologien.
In einem ähnlichen Prozess wird bei Verfahrensschritt 400 der Nukleobasensequenz eine zweite Oligonukleotidchemie aller Oligonukleotide (oder zumindest aller aktiven und geringaktiven Verbindungen) zugeordnet und bei Verfahrenschritt 500 wird eine zweite Oligonukleotidgruppe mit denselben Nukleobasensequenzen wie in der ersten Gruppe mit Verbindungen synthetisiert. Die resultierende zweite Gruppe mit Oligonukleotidverbindungen wird nach dem gleichen Verfahren wie bei der ersten Gruppe bei Verfahrenschritt 700 getestet und aktive und geringaktive Verbindungen werden bei den Verfahrensschritten 800 und 1000 identifiziert.
Um die Stellen auf der Ziel Nukleinsäure zu identifizieren, die für Antisense Technologien geeignet sind, werden folgende mathematisch einfache Schritte durchgeführt. Die Sequenzen von aktiven und geringaktiven Verbindungen von zwei oder mehr so automatisierten Synthesen/Assays werden verglichen und eine Nukleobasensequenzgruppe, die aktiv oder geringaktiv ist, wird in beiden Gruppen mit Verbindungen identifiziert. Die reversen Komplemente von diesen Nukleobasensequenzen passen zu den Sequenzen der Ziel-Nukleinsäure, die durch Antisense- und andere sequenzbasierte Technologien gesteuert werden kann. Diese Antisense-empfindlichen Stellen werden unter Verwendung der Prozeduren, die für den Zusammenbau der Zielnukleotidsequenzen beschrieben wurden (bei Verfahrenschritt 200), in zusammenhängende Sequenzen (contigs) zusammengebaut.
22. Vorrichtungen für die Ausführung der bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren
Eine Ausführungsform des Computers, Netzwerks und Instrumenten zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist in 18 dargestellt. In dieser Ausführungsform sind vier Computerserver vorgesehen. Zuerst speichert ein großer Datenbank-Server 2002 alle chemischen Strukturen, Daten über die Proben und Genom, Assays, Qualitätskontrollen und Daten zum Programmstatus. Außerdem dient der Datenbank-Server als Plattform für ein Dokumentenmanagementsystem. Zweitens laufen in einer Datenverarbeitungseinheit 2004 Berechnungsprogramme für die RNA-Faltung, Oligonukleotid-Wanderung und Genomsuche. Drittens erlaubt ein Dateiserver 2006 die Speicherung von Rohdaten der Geräte und den Zugriff auf Automatisierungsanweisungen. Viertens ermöglicht ein Groupwareserver die Kommunikation der Mitarbeiter und die Prozess-Zeitsteuerung.
Ein redundantes Hochgeschwindigkeitsnetzwerk ist zwischen den Hauptservern und den Brücken 2026, 2028 und 2030 vorgesehen. Diese Brücken ermöglichen einen betriebssicheren Netzwerkzugang zu den vielen Workstations und Instrumenten, die für diesen Prozess eingesetzt werden. Bei dieser Ausführungsform ausgewählten Geräte sind alle so ausgelegt, dass sie Proben direkt aus den Standard-96 Well- Microtiterplatten entnehmen, wobei sie ein Messgerät für die optische Dichte 2016, ein kombiniertes Flüssigkeitschromatographie- und Massenspektometergerät 2018, ein bildgebendes System für Gel-Fluoreszenz und Szintillation, ein Kapillargelelektrophoresesystem 2022 und ein Echtzeit-PCR-System 2034 umfassen.
Die Handhabung der meisten Flüssigkeiten wird automatisch durch Roboter mit individuell steuerbaren automatischen Pipettierern 2038 und 2020 und einem 96-Well Pipettensystem zur Duplizierung der Platten durchgeführt. Für die Steuerung der Geräte, Analysen und Produktionsvorrichtungen werden Windows NT oder Macintosh-Workstations 2044, 2024 und 2036 eingesetzt.
23. Relationale Datenbank.
Die Daten werden in einer geeigneten Datenbank gespeichert. Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren wird eine relationale Datenbank bevorzugt. 19 zeigt die Datenstruktur einer relationalen Probendatenbank. Verschiedene Datenelemente sind innerhalb verbundener Speicherelemente der Datenbank gegliedert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung aber sollen diese nicht beschränken. Dem Fachmann werden von vornherein oder durch routinemäßige Versuche zahlreiche Äquivalente für die hier beschriebenen spezifischen Verfahren, Materialien und Geräte bekannt sein.
BEISPIEL 1: Auswahl von CD40 als Zielmolekül
Zell:Zell Wechselwirkungen sind ein Merkmal zahlreicher biologischer Vorgänge. Zum Beispiel ist bei der Aktivierung der Immunantwort bei einer normalen inflammatorischen Antwort einer der frühesten messbaren Ereignisse die Adhäsion von Leukozyten zum vaskulären Endothel, gefolgt von einer Wanderung der Leukozyten aus den Gefäßbereich zum Ort der Infektion oder Verletzung. Die Adhäsion der Leukozyten zum vaskulären Endothel ist ein notwendiger Schritt bei ihrer Wanderung aus den Gefäßbereich (siehe den Übersichtsartikel von Albelda et al., FASEB J., 1994, 8, 504). Nach dem Stand der Technik ist außerdem bekannt, dass Zelle-Zelle Wechselwirkungen ebenso entscheidend für die Wanderung von sowohl B-Lymphozyten als auch T-Lymphozyten sind, die eine stärkere humorale und zelluläre Immunantwort bewirken (siehe die Übersichtsartikel von Makgoba et al., Immunol. Today, 1989, 10, 417; Janeway, Sci. Amer., 1993, 269, 72).
CD40 wurde zuerst als Rezeptor charakterisiert, der durch B-Lymphozyten exprimiert wird. Später wurde entdeckt, dass die Wirkung von B-Zellen-CD40 mit durch aktivierte T-Zellen exprimiertem CD40L essentiell für die T-Zell-abhängige B-Zellen-Aktivierung ist (d.h. Proliferation, Immunoglobulinsekretion und Klassenwechsel) (siehe den Übersichtsartikel von Gruss et al. Leuk. Lymphoma, 1997, 24, 393). Es ist eine vollständige cDNA-Sequenz für CD40 verfügbar (GenBank Zugriffsnummer X60592, SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86 ist Protein).
Als das Interesse an CD40 anwuchs, wurde mit der Zeit festgestellt, das funktionales CD40 außer auf B-Zellen noch durch eine Reihe von anderen Zelltypen exprimiert wird, einschließlich Makrophagen dentritischen Zellen, Thymusepithelzellen, Langerhanssche Inseln und Endothelzellen. Die Versuche haben zu der derzeitigen Auffassung geführt, dass CD40 durch Steuerung der Wechselwirkung von T-Zellen mit anderen Zelltypen als B-Zellen eine weit umfassendere Rolle in der Immunregulation spielt, als bisher angenommen. Diese Auflassung wird dadurch unterstützt, dass gezeigt wurde, dass die Stimulation von CD40 in Makrophagen und dendritischen Zellen für die T-Zell-Aktivierung während der Antikörperpräsentation benötigt wird. Letzte Ergebnisse deuten ebenso auf einer Bedeutung von CD40 in der Inflammation von Gewebe hin. Es wurde gezeigt, dass die Produktion der inflammatorischen Mediatoren IL-12 und Stickstoffoxid durch Makrophagen CD40-abhängig ist (Buhlmann et al., J Clin. Immunol., 1996, 16, 83). Es wurde gefunden, dass die Stimulation von CD40 durch CD40L in Endothelzellen die Oberflächen-Exprimierung von E-Selektin, ICAM-1, und VCAM-1 induziert, was die Adhäsion von Leukozyten an Entzündungsstellen fördert (Buhlmann et al., J. Clin. Immunol, 1996, 16, 83; Gruss et al., Leuk Lymphoma, 1997, 24, 393). Schließlich wurde von einer CD40 Überexprimierung in epithelialen und hämatopoietischen Tumoren berichtet, was darauf hindeutet, dass CD40 auch eine Rolle beim Tumorwachstum und/oder der Angiogenese spielt (Gruss et al., Leuk Lymphoma, 1997, 24, 393–422; Kluth et al. Cancer Res, 1997, 57, 891).
Auf Grund der entscheidenden Rolle, die CD40 bei der humoralen Immunität spielt, besteht die Möglichkeit, dass therapeutische Strategien, die darauf abzielen, CD40 herunterzuregulieren, eine neuartige Klasse von Wirkstoffen hervorbringen könnten, die nützlich bei der Behandlung einer Reihe von Immunstörungen sind, einschließlich aber nicht darauf beschränkt, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, Abstoßung von Transplantaten und Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes und verschiedene Formen von Arthritis. Inhibitoren für CD40 könnten sich ebenfalls als nützliche antiinflammatorische Verbindungen erweisen und deshalb zur Behandlung einer Reihe von Krankheiten mit entzündlichem Mechanismus geeignet seien, wie zum Beispiel Asthma, rheumatoide Arthritis, Allograft Abstoßungen, entzündliche Darmerkrankungen und verschiedene Hautkrankheiten, wie z.B. Psoriasis. Schließlich ergeben sich neue Erkenntnisse über den Zusammenhang von der CD40 Überexprimierung und Tumorwachstum, Inhibitoren für CD40 könnten sich ebenfalls als nützliche Antitumorwirkstoffe erweisen.
Der Zeit sind keine therapeutischen Wirkstoffe bekannt, die die Synthese von CD40 wirksam hemmen. Bis heute zielen Strategien zur Hemmung der CD40 Funktion auf die Verwendung einer Reihe von Wirkstoffen, die die CD40/CD40L-Bindung stören. Diese umfassen monoklonale Antikörper, die sich gegen CD40 oder CD40L richten, lösliche Formen von CD40 und synthetische Peptide, die von einem zweiten CD40 Bindungsprotein, A20, abgeleitet sind. Die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern gegen CD40 und/oder CD40L in Tiermodellen haben Hinweise darauf gegeben, dass die Inhibierung der CD40-Stimulation einen therapeutischen Nutzen bei GVHD, Allograft Abstoßung, rheumatoide Arthritis, SLE, MS und B-Zell-Lymphom haben kann (Buhlmann et al., J. Clin. Immunol, 1996, 16, 83). Allerdings es gibt es wegen der Kosten, kurzen Halbwertszeit und Bioverfügbarkeitsproblemen im Zusammenhang mit großen Proteinen als therapeutische Wirkstoffe ein großes Bedürfnis nach zusätzlichen Wirkstoffen, die effektiv die Funktion von CD40 inhibieren. Oligonukleotidverbindungen vermeiden viele der Fallstricke, die mit den derzeitigen Wirkstoffen, die die CD40/CD40L Wechselwirkungen blockieren, verbunden sind und können daher einzigartige Möglichkeiten bei einer Reihe von therapeutischen Anwendungen bieten.
BEISPIEL 2: Erzeugung von gegen CD40 gerichteten virtuellen Oligonukleotiden
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um gegen CD40 gerichtete Oligonukleotide auszuwählen und eine Liste von Oligonukleotidsequenzen mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, wie in 22 gezeigt ist. Von der assemblierten CD40 Sequenz ausgehend, begann der Vorgang damit, die gewünschte Länge der Oligonukleotide auf 18 Nukleotide festzulegen, wie in Schritt 2500 dargestellt. Alle möglichen Oligonukleotide dieser Länge wurden mit Oligo 5.0^TM erzeugt, wie in Schritt 2504 dargestellt. Die gewünschten thermodynamischen Eigenschaften wurden in Schritt 2508 ausgewählt. Als Einzelparameter wurde festgelegt, dass Oligonukleotide mit einer Schmelztemperatur von weniger oder gleich 40°C verworfen wurden. In Schritt 2512 wurden die Oligonukleotid-Schmelztemperaturen mit Oligo 5.0^TM berechnet. Oligonukleotidsequenzen mit einer unerwünschten Bewertung wurden verworfen. Man nimmt an, dass Oligonukleotide mit Schmelztemperaturen nahe oder unterhalb von physiologischen Temperaturen und Zellkulturtemperaturen schlecht an Zielsequenzen binden. Alle übrigen Oligonukleotidsequenzen wurden in eine Tabellenkalkulation exportiert. In Schritt 2516 werden die gewünschten Sequenzeigenschaften ausgewählt. Diese schließen ein, dass Oligonukleotide mit mindestens einem Abschnitt von vier Guanosinen in einer Reihe und von sechs jedes möglichen anderen Nukleotids in einer Reihe verworfen werden. In Schritt 2520 entfernt ein Tabellenkalkulationsmakro alle Oligonukleotide, die die Zeichenfolge „GGGG" enthalten. In Schritt 2524 entfernt ein anderes Tabellenkalkulationsmakro alle Oligonukleotide, die die Zeichenfolgen „AAAAAA" oder „CCCCCC" oder „TTTTTT" enthalten. Von den verbleibenden Oligonukleotidsequenzen wurden 84 Sequenzen manuell ausgewählt, die das Kriterium einer gleichmäßigen Verteilung der Oligonukleotidsequenzen für die gesamte Zielsequenz erfüllen, wie in Schritt 2528 dargestellt. Diese Oligonukleotidsequenzen durchliefen dann den nächsten Verfahrensschritt, wo den Sequenzen spezifische Oligonukleotidchemien zugeordnet wurden.
BEISPIEL 3: Eingabedateien für die automatische Oligonukleotidsynthese-Befehlsdatei (.cmd-Datei)
Tabelle 2 ist eine Befehlsdatei für die Synthese eines Oligonukleotids mit 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Nukleosid-Bereichen und einem zentralen Bereich mit 2'- Desoxynukleosiden, welche jeweils über Phosphorothioat-Internukleotidbindungen verknüpft sind.
Tabelle 2
Sequenzdateien (.seq-Dateien)
Tabelle 2 ist eine (.seq-Datei) für Oligonukleotide mit 2'-Desoxynukleosiden, welche über Phosphorothioat-Internukleotidbindungen verknüpft sind.
Tabelle 3
Bedeutung der Spalten: Synthese Nr., Well, Menge, spezifische Nukleotidposition (bezeichnet durch das Kürzel der Base, gefolgt vom Kürzel des Rückgrates, wobei „s" für Phosphorothioat steht). Die Spalten brechen den Text auf die nächste Zeile um, wenn sie länger als eine Zeile sind.
Tabelle 4 ist eine .seq-Datei für Oligonukleotide mit 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Nukleosiden und einem zentralen Bereich mit 2'-Desoxynukleosiden, welche über Phosphorothioat-Internukleotidbindungen verknüpft sind.
Tabelle 4
Bedeutung der Spalten: Synthese Nr., Well, Menge, spezifische Nukleotidposition (bezeichnet durch das Kürzel der Base, gefolgt vom Kürzel des Rückgrates, wobei „s" für Phosphorothioat steht und „moe" ein 2'-O-(2-Methoxyethyl)-subsituiertes Nukleosid bezeichnet). Die Spalten brechen den Text auf die nächste Zeile um, wenn sie länger als eine Zeile sind.
Reagenzdatei (.tab-Datei)
Tabelle 5 ist eine .tab-Datei für Reagenzien, die zur Synthese eines Oligonukleotids mit 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Nukleosiden und 2'-Desoxynukleosiden notwendig sind.
Tabelle 5
Bedeutung der Spalten: GruppenName, FlaschenIdentifikation, Flussrate, Konzentration. Wobei der Reagenzname durch das Kürzel der Base bezeichnet ist, „moe" ein 2'-O-(2-Methoxyethyl)-subsituiertes Nukleosid und „cpg" ein festes Kontroll-Glasporenträgermedium bezeichnet. Die Spalten brechen den Text auf die nächste Zeile um, wenn sie länger als eine Zeile sind.
BEISPIEL 4: Oligonukleotidsynthese – 96-Well-Plattenformat
Oligonukleotide wurden mit einer Festphasen-P(III)-Phosphoramiditchemie mit einem automatischen Multi-Well Synthesizer unter Verwendung von Eingabedateien wie oben in BEISPIEL 3 beschrieben synthetisiert. Die Oligonukleotide wurden synthetisiert, in dem 96 Sequenzen in einem Standard 96-Well Format gleichzeitig assembliert wurden. Phosphodiester-Internukleotidbindungen wurden durch Oxidation mit Jodlösung ermöglicht. Die Phosphothioat-Internukleotidbindungen wurden durch Sulfurierung mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagenz) in wasserfreiem Acetonitril erzeugt. Basenschützende Standard-Beta-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite wurden von kommerziellen Herstellern bezogen (z.B. PE/ABI, Pharmacia). Nicht-Standard Nukleoside wurden nach in der Fachliteratur bekannten oder patentierten Methoden synthetisiert. Sie wurden als basengeschützte Beta-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite verwendet.
Nach der Synthese wurden die Oligonukleotide vom Träger abgespalten und die Schutzgruppen mit konzentrierter NH₄OH bei höherer Temperatur (55–60°C) für 12–16 Stunden entfernt und das erhaltene Produkt in vacuo getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde dann mit sterilem Wasser resuspendiert und auf eine Masterplatte aufgebracht, von der aus alle analytischen und Testplatten-Proben unter Verwendung der automatischen Pipettiervorrichtungen verdünnt wurden.
BEISPIEL 5: Alternative Oligonukleotidsynthese
Unsubstituierte und substituierte Phosphodiester-Oligonukleotide werden alternativ mit einem automatischen DNA-Synthesizer (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung der Standard-Phosphoramiditchemie durch Oxidation mit Jod synthetisiert.
Phosphodiester wurden wie Phosphodiester-Oligonukleotide synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Flasche mit dem Standard Oxidationsmittel durch eine 0,2 molare Lösung 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril zur stufenweisen Thiolmodifikation der Phosphitbindungen ersetzt wurde. Der Modifikationswarteschritt wurde auf 68 Sekunden erhöht, worauf ein Cappingschritt folgte. Nach Trennung von der CPG-Säule und Entschützen in konzentriertem Ammoniakhydroxid bei 55°C (18 Stunden) wurden die Oligonukleotide durch zweimaliges Ausfällen mit 2,5facher Menge Ethanol aus einer 0,5 M NaCl-Lösung aufgereinigt.
Posphinat-Oligonukleotide wurden wie in US-Patent 5,508,270 beschrieben hergestellt.
Alkylphosphonat-Oligonukleotides wurden wie in US-Patent 4,469,863 beschrieben hergestellt.
3'-Deoxy-3'-Methylenphosphonat-Oligonukleotide wurden wie in den US-Patenten 5,610,289 oder 5,625,050 beschrieben hergestellt.
Phosphoramidit-Oligonukleotide wurden jeweils wie in den US-Patenten 5,256,775 oder 5,366,878 beschrieben hergestellt.
Alkylphosphonothioat-Oligonukleotide wurden jeweils wie in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen PCT/US94/00902 und PCT/US93/06976 beschrieben hergestellt (Veröffentlichungsnummern WO 94/17093 und WO 94/02499).
3'-Deoxy-3'-Aminophosphoramidat-Oligonukleotide wurden wie in US-Patent 5,476,925 beschrieben hergestellt.
Phosphotriester-Oligonukleotide wurden wie in US-Patent 5,023,243 beschrieben hergestellt.
Boranophosphat-Oligonukleotide wurden jeweils wie in den US-Patenten 5,130,302 und 5,177,198 beschrieben hergestellt.
Methylenmethylimino-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als MMI-gebundene Oligonukleoside bezeichnet werden, Methylendimethylhydrazo-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als MDH-gebundene Oligonukleoside bezeichnet werden, und Methylencarbonylamino-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als 3-Amid-gebundene Oligonukleoside bezeichnet werden und Methylenaminocarbonyl-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als 4-Amid-gebundene Oligonukleoside bezeichnet werden, wie auch Verbindungen mit gemischten Rückgraten, die zum Beispiel alternierende MMI- und PO- oder PS-Bindungen haben, werden jeweils wie in den US-Patenten 5,378,825; 5,386,023; 5,489,677; 5,602,240 und 5,610,289 beschrieben hergestellt.
Formacetal- und Thioformacetal-verknüpfte Oligonukleotide wurden jeweils wie in den US-Patenten 5,264,562 und 5,264,564 beschrieben hergestellt.
Ethylenoxid-verknüpfte Oligonukleotide wurden wie in US-Patent 5,223,618 beschrieben hergestellt.
BEISPIEL 6: PNA-Synthese
Peptidnukleinsäuren (PNAs) werden entsprechend einem der zahlreichen Verfahren in „Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5 hergestellt. Sie können ebenso nach den US-Patenten 5,539,082; 5,700,922 und 5,719,262 hergestellt werden.
BEISPIEL 7: Chimäre Oligonukleotidsynthese
Chimäre Oligonukleotide, Oligonukleoside oder gemischte Oligonukleotide/Oligonukleoside gemäß der Erfindung können in verschiedenen Varianten vorliegen. Diese umfassen einen ersten Typ, bei dem sich das „gap"-Segment mit gebundenen Nukleosiden zwischen den 5'- und 3'-„Wing"-Segmenten mit gebundenen Nukleosiden befindet und einen zweiten Typ mit „offenem Ende", wobei sich das „gap"-Segment am 3'- oder 5'-Terminus der oligomeren Verbindung befindet. Oligonukleotide der ersten Variante werden nach dem Stand der Technik auch als „Gapmere" oder „unterbrochene Oligonukleotide" bezeichnet. Oligonukleotide der zweiten Variante werden nach dem Stand der Technik auch als „Hemimere" oder „Wingmere" bezeichnet.
A. [2'-O-Me]-[2'-deoxy]-[2'-O-Me] Chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide
Chimäre Oligonukleotide mit 2'-O-Alkylphosphorothioat- und 2'-Desoxyphosphorothioat-Oligonukleotidsegmenten werden unter Verwendung von 2'-Desoxy-5'-Dimethoxytrityl-3'-O-Phosphoramidit für den DNA-Teil und 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-Methyl-3'-O-Phosphoramidit für die 5'- und 3'-Wings synthetisiert. Der Standardsynthesezyklus wird durch Verlängerung der Wartezeit auf 600 Sekunden nach der Zuführung von Tetrazol und Base für DNA viermal wiederholt und zweimal für 2'-O-Methyl. Die vollständig geschützten Oligonukleotide wurden vom Träger abgespalten und die Phosphatgruppe in 3:1 Ammoniak/Ethanol bei Raumtemperatur über Nacht entschützt und dann bis zur Trockenheit lyophilisiert. Eine Behandlung mit methanolischem Ammoniak wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt, um alle Basen zu entschützen und die Proben wurden wieder bis zur Trockenheit lyophilisiert.
B. [2'-O-(2-Methoxyethyl)]-[2'-Desoxy]-[2'-O-(2-Methoxyethyl)] Chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide
[2'-O-(2-Methoxyethyl)]-[2'-Desoxy]-[2'-O-(2-Methoxyethyl)] chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide werden nach dem oben beschriebenen Verfahren für 2'-O-Methyl chimäre Oligonukleotide mit Substitution der 2'-O-Methylamidite durch 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Amidite hergestellt.
C. [2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester]-[2'-Desoxy-Phosphorothioat]-[2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester] Chimäre Oligonukleotide
[2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester]-[2'-Desoxy-Phosphorothioat]-[2'-O-(2-Methoxyethyl) Phosphodiester] chimäre Oligonukleotide nach dem oben beschriebenen Verfahren für 2'-O-Methyl chimäre Oligonukleotide mit Substitution der 2'-O-Methylamidite durch 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Amidite in den Wing-Abschnitten hergestellt.
Die Phosphorothioat-Internukleotidbindungen innerhalb der Wing-Abschnitte der chimären Strukturen wurden durch Sulfurierung mit 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagenz) erzeugt. Phosphodiester-Internukleotidbindungen für das zentrale Gap wurden durch Oxidation mit Jodlösung hergestellt.
Andere chimäre Oligonukleotide, chimäre Oligonukleoside und gemischte Oligonukleotide/Oligonukleoside wurden entsprechend dem US-Patent 5,623,065 hergestellt.
BEISPIEL 8: Ausgangs-Oligonukleotide der automatischen Oligonukleotidsynthese
Unter Verwendung der .seq-Dateien, .cmd-Dateien und .tab-Dateien von Beispiel 3 wurden Oligonukleotide nach dem Protokoll des 96-Well-Formats von Beispiel 4 hergestellt. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung der Phosphorothioatchemien hergestellt, um in einem Fall eine erste Sammlung von Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotiden zu erhalten. Die Oligonukleotide wurden in einem zweiten Fall als zweite Sammlung von hybriden Oligonukleotiden hergestellt, die Phosphorothioat-Rückgrate mit einer ersten und dritten „Flügel"-Region aus 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Nukleotiden an beiden Seiten einer zentralen Gap-Region der 2'-O-Desoxynukleotide. Die beiden Sammlungen enthielten dieselbe Gruppe mit Oligonukleotidsequenzen. Daher sind beide Sammlungen in Bezug auf die Sequenz redundant, aber hinsichtlich der Kombination von Sequenz und Chemie einzigartig. Weil die Sequenzen der zweiten Sammlung dieselbe wie die erste ist (wohingegen die Chemie unterschiedlich ist), ist die zweite Sammlung um der Kürze willen nicht gezeigt.
Zur Verdeutlichung zeigen die Tabellen 6-a und 6-b die Sequenzen einer anfänglichen ersten Sammlung, d.h. einer Sammlung von Phosphorothioat-Oligonukleotiden die auf ein CD40-Ziel gerichtet sind. Die Verbindungen in Tabelle 6-a zeigen die Elemente dieser Sammlung, die in Übereinstimmung mit der üblichen Regel für die Auflistung von Sequenzkennzahlen aufgelistet sind, d.h. in numerischer Ordnung der Sequenzkennzahlen.
Tabelle 6-a
Die in Tabelle 6-a oben und in Tabelle 6-b unten gezeigten Sequenzen sind in 5'- nach 3'-Richtung dargestellt. Diese sind im Verhältnis zur 3'- nach 5'-Richtung der in den .seq-Dateien von Beispiel 3 gezeigten Sequenzen umgedreht. Für Synthesezwecke werden die .seq-Dateien in 3'- nach 5'-Leserichtung erzeugt. Dadurch ist es möglich, alle endständigen 3'-„A"-Basen, 3'-„G"-Basen, 3'-„C"-Basen und 3'-„T"-Basen jeweils zusammen zu gruppieren. Wenn dann das erste Nukleosid jedes Oligonukleotids (das an dem festen Träger haftet) zu den Wells auf der Platte gegeben wird, wird auf diese Weise die Maschinenbewegung reduziert, weil sich die automatische Pipette linear eine Reihe abwärts und aufwärts entlang der 96-Well-Platte bewegen kann.
Die Position jedes Wells, das die einzelnen Oligonukleotide jeweils beinhaltet, wird durch eine Reihe und eine Spalte bezeichnet. Es gibt eine typische 96-Well-Platte acht mit A bis G bezeichnete Reihen und zwölf mit 1 bis 12 bezeichnete Spalten. Eine bestimmte Well-Position ist durch ihre „Well-Nr." bezeichnet, die eine Kombination der Reihe und der Spalte ist, zum Beispiel ist A08 der Well bei Reihe A, Spalte 8.
in der unten gezeigten Tabelle 6-b sind die Oligonukleotide entsprechend ihrer Well-Nr. auf der Synthese Platte geordnet. Die in Tabelle 6-b gezeigte Reihenfolge ist die tatsächliche Reihenfolge, mit der sie mit dem automatischen Synthesizer synthetisiert wurden, wobei sie nach der oben beschriebenen Anordnungsregel in der Reihenfolge ihres ersten Nukleosids gruppiert sind.
Tabelle 6-b:
BEISPIEL 9: Oligonukleotid-Analyse
A. Oligonukleotid-Analyse – 96-Well-Platten
Die Konzentration der Oligonukleotide in jedem Well wurde durch Verdünnung der Proben und UV Absorptionsspektroskopie bestimmt. Die Unversehrtheit die des einzelnen Produkts wurde durch Kapillarelektrophorese (CE) entweder im 96-Well-Format (Beckman MDQ) oder, für individuell hergestellte Proben, mit einem kommerziellen CE-Gerät durchgeführt (z.B. Beckman 5000, ABI 270). Die Basen- und Rückgratzusammensetzung wurden durch Massenbestimmung der Verbindungen mittels Elektrospray-Massenspektroskopie durchgeführt.
B. Alternative Oligonukleotid-Analyse
Nach der Abtrennung von dem Porenglasträger und dem Entschützen in konzentriertem Ammoniakhydroxid bei 55°C für 18 Stunden wurden die Oligonukleotide oder Oligonukleoside durch zweimaliges Ausfällen mit einer 0,5 M NaCl-Lösung mit 2,5facher Menge Ethanol aufgereinigt. Die synthetisierten Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in denaturierenden Gelen analysiert. Die Reinheit der Oligonukleotide wurde durch by ³¹P-Kernresonanzspektroskopie und/oder durch HPLC geprüft wie von Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162 beschrieben.
BEISPIEL 10: Automatischer Test der CD40 Oligonukleotid-Aktivität
A. Poly(A)+ mRNA Isolierung.
Poly(A)+ mRNA wurde nach Miura et al. (Clin. Chem, 1996, 42, 1758) isoliert. In Kürze beschrieben, wurde von den Zellen, die auf 96-Well-Platten gewachsen waren, das Wachstumsmedium entfernt und jeder Well mit 200 μl kaltem PBS gewaschen. Zu jedem Well wurde 60 μl Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.5% NP-40, 20 mM Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex) gegeben, die Plate wurde vorsichtig geschüttelt und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 55 μl des Lysats wurden auf Oligo d(T) beschichtete 96-Well-Platten gegeben (AGCT Inc., Irvine, CA). Die Platten wurden 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit 200 ml Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl) gewaschen. Nach dem letzten Waschen ließ man die Platte auf Papierhandtüchern abtropfen, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen und dann wurde sie für 5 Minuten an der Luft getrocknet. Zu jedem Well wurden 60 ml Elutionspuffer (5 mM Tris-HCl pH 7.6) gegeben, der vorher auf 70°C erhitzt worden war, die Platte wurde dann bei 90°C für 5 Minuten erhitzt und das Eluat wurde dann auf eine neue 96-Well-Platte gegeben. Zellen, die auf 100 mm-Platten und anderen Standardplatten gewachsen waren, wurden unter Verwendung entsprechender Lösungsmengen ähnlich behandelt.
B. Vollständige RNA Isolierung
Eine vollständige mRNA wurde unter Verwendung eines RNEASY 96^TM-Kits und Puffern von Qiagen Inc. (Valencia CA) nach den vom Herstellern empfohlenen Verfahren isoliert. In Kürze beschrieben, wurde von den Zellen, die auf 96-Well-Platten gewachsen waren, das Wachstumsmedium entfernt und jeder Well mit 200 ml kaltem PBS gewaschen. Zu jedem Well wurde 100 ml RLT-Puffer gegeben und die Platte kräftig für 20 Sekunden geschüttelt. Dann wurde zu jedem Well 100 ml 70-prozentiges Ethanol zugegeben und die Inhalte durch dreimaliges An- und Absaugen mit einer Pipette gemischt. Die Proben wurden dann auf die RNEASY 96^TM-Well-Platte gegeben, die mit einem QIAVAC^TM-Verteiler verbunden war, welcher einen Abfallsammelbehälter aufwies und an ein Vakuum angeschlossen war. Zu jedem Well der RNEASY 96^TM-Platte wurde 1 ml RW1-Puffer gegeben und danach wieder dem Vakuum ausgesetzt. Danach wurde 1 ml RPE-Puffer zu jedem Well der RNEASY 96^TM-Platte gegeben und für 15 Sekunden dem Vakuum ausgesetzt. Der Waschvorgang mit dem RPE-Puffer wurde wiederholt und für zusätzliche 10 Minuten das Vakuum angeschlossen. Die Platte wurde dann entfernt und erneut zum Trocknen auf Papierhandtüchern abgetropft. Die Platte wurde dann wieder mit dem QIAVAC^TM-Verteiler verbunden, der an einen Ständer mit 1,2 ml Sammelröhrchen angeschlossen war. Die RNA wurde dann durch Pipettieren von 60 ml Wasser in jedes Well eluiert, eine Minute inkubiert und dann für 30 Sekunden einem Vakuum ausgesetzt. Der Elutionsschritt wurde mit zusätzlichen 60 ml Wasser wiederholt.
C. RT-PCR Analyse der CD40 mRNA Mengen
Die CD40 mRNA Mengen wurde durch Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung des ABI PRISM^TM_7700 Sequenz-Nachweissystems (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Es handelt sich um ein nicht-gel-basiertes Fluoreszenz Nachweissystem mit geschlossenen Röhrchen, das eine Mengenbestimmung von Polymerase-Kettenreaktions-Produkten mit hohem Durchsatz in Echtzeit ermöglicht.
Im Gegensatz zur Standard-PCR, bei welcher die amplifizieren Produkte nach dem Ende der PCR bestimmt werden, erfolgt die Mengenbestimmung bei der RT-PCR bei der Bildung. Dies wird bei der PCR Reaktion durch eine Oligonukleotid-Sonde zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primern erreicht, wobei die Sonde zwei Fluoreszenzfarbstoffe enthält. Ein Reporterfarbstoff (zum Beispiel JOE oder FAM, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) wird an das 5'-Ende der Sonde und ein Quenchertarbstoff (zum Beispiel TAMRA, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) an das 3'-Ende der Sonde gebunden. Wenn die Sonde und die Farbstoffe intakt sind, wird die Emission des Reporterfarbstoffs durch die Nähe des Quencherfarbstoffs ausgelöscht. Während der Amplifikation entsteht durch die an die Zielsequenz angehängte Sonde ein Substrat, das durch die 5'-Exonucleaseaktivität der Tag-Polymerase abgespalten werden kann. Während der Erweiterungsphase des PCR-Amplifikationszyklus wird durch die Spaltung der Sonde durch die Tag-Polymerase der Reporterfarbstoff vom Rest der Sonde abgesondert (und dadurch vom Quencher) und es wird ein sequenzspezifisches Fluoreszenzsignal erzeugt.
Mit jedem Zyklus werden zusätzliche Reporterfarbstoffmoleküle von ihren entsprechenden Sonden abgespalten und die Fluoreszenzintensität wird in gleichmäßigen (6 Sekunden) Intervallen durch eine in das Sequenznachweissystem eingebaute Laseroptik gemessen. In jedem Assay erzeugt eine Reihe paralleler Reaktionen mit fortlaufenden Verdünnungen an mRNA aus unbehandelten Kontrollen eine Standardkurve, die zur Bestimmung der prozentualen Hemmung der mit Antisense Oligonukleotiden behandelten Testproben verwendet wird.
Die RT-PCR Reagenzien wurden von PE-Applied Biosystems, Foster City, CA bezogen. Die RT-PCR-Reaktionen wurden durch Zugabe von einem 25 ml PCR-Cocktail (1 × TAQMAN^TM Puffer A, 5,5 mM MgCl₂, jeweils 300 mM dATP, dCTP und dGTP, 600 mM dUTP, jeweils 100 nM Vorwärts-Primer, Rückwärts-Primer und Sonde, 20 Einheiten RNAse-Inhibitor, 1,25 Einheiten AMPLITAQ GOLD^TM und 12,5 Einheiten MuLV Reverse Transkriptase) zu den 96-Well-Platten mit 25 ml Poly(A)-mRNA-Lösung gegeben. Die RT-Reaktion wurde durch Inkubation für 30 Minuten bei 48°C durchgeführt. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei 95°C zur Aktivierung des AMPLITAQ GOLD^TM wurden 40 Zyklen eines zweistufigen PCR-Protokolles durchgeführt: 95°C für 15 Sekunden (Denaturierung), danach 60°C für 1,5 Minuten (Anhängen/Erweitern).
Für CD40 waren die PCR-Primer:
Vorwärts: 5' CAGAGTTCACTGAAACGGAATGC 3' (Sequenzkennzahl Nr. 87)
Rückwärts: 5' GGTGGCAGTGTGTCTCTCTGTTC 3' (Sequenzkennzahl Nr. 88) und
PCR-Sonde: 5' FAM-TTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCT-TAMRA 3'
(Sequenzkennzahl Nr. 89) wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenzreporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
Für GAPDH waren die PCR-Primer:
Vorwärts: 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3' (Sequenzkennzahl Nr. 90)
Rückwärts: 5' GAAGATGGTGATGGGATTTC 3' (Sequenzkennzahl Nr. 91) und
PCR-Sonde: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (Sequenzkennzahl Nr. 92)
wobei JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenzreporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quenchertarbstoff ist.
BEISPIEL 11: Hemmung der CD40 Expression durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von veröffentlichten Sequenzen (GenBank Zugriffsnummer X60592, Sequenzkennzahl Nr. 85) eine Gruppe von mit mRNA komplementären Oligonukleotiden hergestellt, die auf unterschiedliche Bereiche der menschlichen CD40 mRNA zielen. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 7 gezeigt. Die Zielstellen sind durch die anfänglichen Nukleotidzahlen bezeichnet, wie bei der Quelle der Sequenz angegeben (X60592), an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 7 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Daten sind aus drei Experimenten gemittelt.
Tabelle 7:
In Tabelle 7 zeigen die Sequenzkennzahlen Nr. 1, 2, 7, 47 und 82 eine mindestens 25-prozentige Hemmung der CD40-Expression und sind daher bevorzugte Verbindungen der Erfindung.
BEISPIEL 12: Hemmung CD40 Expression durch Phosphorothioat-2'-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung der veröffentlichten Sequenz X60592 eine zweite Gruppe von mit mRNA komplementären Oligonukleotiden hergestellt, die auf unterschiedliche Bereiche der menschlichen CD40 mRNA zielen. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 8 gezeigt. Die Zielstellen sind durch die anfänglichen Nukleotidzahlen bezeichnet, wie bei der Quelle der Sequenz angegeben (X60592), an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 8 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine. Die Daten sind aus drei Experimenten gemittelt.
Tabelle 8:
In Tabelle 8 zeigen die Sequenzkennzahlen Nr. 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 23, 25, 26, 27, 31, 32, 33, 35, 37, 40, 41, 46, 47, 49, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 65, 71, 73, 74, 77, 81 und 82 eine mindestens 50-prozentige Hemmung der CD40-Expression und sind daher bevorzugte Verbindungen der Erfindung.
BEISPIEL 13: Oligonukleotid-Sensitive Bereiche der C40-Ziel-Nukleinsäure
Wie die Daten in den vorherigen zwei Beispielen zeigen, gab es mehrere Sequenzen bei den bevorzugten Verbindungen mit zwei verschiedenen Oligonukleotidchemien. Insbesondere sind die Verbindungen mit den 1, 2, 7, 47 und 82 in beiden Fällen bevorzugt. Diese Verbindungen bilden verschiedene Bereiche des CD40 Transkripts ab, geben aber trotzdem zugängliche Stellen der Ziel-Nukleinsäure wieder.
Zum Beispiel überlappen sich die Sequenzkennzahlen Nr. 1 und 2 und beide bilden den nicht translatierten 5'-Bereich (5'-UTR) von CD40 ab. Dementsprechend ist dies eine besonders bevorzugte Region von CD40 für die Modulation durch sequenzbasierten Technologien. In ähnlicher Weise entsprechen die Sequenzkennzahlen Nr. 7 und 47 dem offenen Leserahmen von CD40, wohingegen die Sequenzkennzahl Nr. 82 den nicht translatierten 3'-Bereich (3'-UTR) abbildet. Das bedeutet, dass die ORF- und 3'-UTR-Bereiche von CD40 ebenso für sequenzbasierten Technologien geeignet sein könnten.
Die reversen Komplemente von aktiven CD40-Verbindungen können auf einfache Weise nach dem Stand der Technik bestimmt und assembliert werden, um Nukleotidsequenzen zu erzeugen, die zugänglichen Stellen auf der Zielnukleinsäure entsprechen. Zum Beispiel entspricht das assemblierte reverse Komplement von den Sequenzkennzahlen Nr. 1 und 2 der unten dargestellten Sequenzkennzahl Nr. 93:
Durch mehrere durch Läufe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden größere „Fußspuren" erzeugt. Es wird eine Informationssammlung zusammengestellt und kann durch die Fachleute für sequenzbasierten Technologien verwendet werden, um die molekularen und biologischen Funktionen von CD40 zu erforschen und seine Rolle bei verschiedenen Krankheiten und Störungen zu untersuchen oder zu bestätigen.
Beispiel 14: Programm zur Auswahl der Stellen
In einer in 20 dargestellten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Anwendung verwendet, die den Auswahlprozess für die Bestimmung der Zielorte oder „Stellen" der zu synthetisierenden Oligonukleotiden ermöglicht. Das Programm wurde als dreistufige, objektorientierte Anwendung geschrieben. Alle beschriebenen Merkmale hängen deshalb eng mit der relationalen Datenbank zusammen. Aus diesem Grund sind keine detaillierten Datenbank-Lese- und Schreib-Schritte gezeigt. Es wird vorausgesetzt, dass jeder beschriebene Schritt auch einen Datenbankzugriff umfasst. Die Beschreibung unten erläutert eine Möglichkeit, das Programm zu benutzen. Die derzeitige Schnittstelle erlaubt jedem Benutzer, je nach Wunsch und in jeder Reihenfolge von Prozess zu Prozess zu springen.
Vor dem Laufenlassen des Programms zur Auswahl der Stellen müssen alle wichtigen Eigenschaften des Zielmoleküls wie oben beschrieben und in Verfahrenschritt 2204 gezeigt, berechnet worden sein. Wenn das Programm zur Auswahl der Stellen bei Verfahrenschritt 2206 gestartet wird, werden dem Benutzer auf einer Bedienungsfläche Ziele gezeigt, die vorher ausgewählt und deren Eigenschaften berechnet wurden. Der Benutzer wählt bei Verfahrenschritt 2208 ein Zielmolekül aus, mit dem er arbeiten will und entscheidet bei Verfahrenschritt 2210, ob irgendwelche abgeleiteten Eigenschaften benötigt werden. Abgeleitete Eigenschaften werden berechnet, indem vorher berechnete Eigenschaften, die von dem Benutzer bei Verfahrenschritt 2212 festgelegt werden, durch mathematische Operationen kombiniert werden.
Die abgeleiteten Eigenschaften werden zusammen mit allen vorher berechneten Eigenschaften gleichwertig zur Verfügung gestellt. Der Benutzer wählt bei Verfahrenschritt 2214 eine der Eigenschaften aus, die gegen die Zielposition grafisch aufgetragen wird. Die Kurve ist oberhalb einer linearen Darstellung des Zielmoleküls dargestellt. Die horizontalen Achsen, beziehungsweise die Positionsachsen, von sowohl der Kurve als auch dem Zielmolekül sind miteinander verbunden und durch den Benutzer skalierbar. Der Zoombereich erlaubt die Darstellung des Zielmoleküls in voller Länge, bis zur Darstellung von einzelnen Zielbasen als Buchstaben und einzelnen Eigenschaftspunkten. Der Benutzer wählt bei Verfahrenschritt 2216 als nächstes einen Schwellenwert aus, über oder unter dem Stellen entfernt und zukünftig nicht mehr berücksichtigt werden. Der Benutzer entscheidet bei Verfahrenschritt 2218, ob weitere Stellen mit anderen Eigenschaften entfernt werden sollen. Wenn weitere Stellen entfernt werden sollen, geht es zurück zu Verfahrenschritt 2214, wo eine andere Eigenschaft angezeigt wird, und zum Schwellenwert bei Verfahrenschritt 2216.
Nach dem Entfernen der Stellen wählt der Benutzer aus der verbliebenen Liste eine Eigenschaft bei Verfahrenschritt 2220 aus und wählt dann ein manuelles oder automatisches Auswahlverfahren bei Verfahrenschritt 2222. Beim automatischen Auswahlverfahren entscheidet der Nutzer bei Verfahrenschritt 2224, ob die Stellen aus den Maxima oder Minima ausgewählt werden sollen und bestimmt die zu wählende Anzahl der Maxima oder Minima. Die Software findet automatisch die Punkte und wählt sie aus. Beim manuellen Auswählen muss der Benutzer entscheiden, ob der Höchstwert bei Verfahrenschritt 2226 automatisch gefunden werden soll. Wenn der Benutzer das automatische Finden des Höchstwertes vorwählt, dann muss Benutzer die graphisch dargestellte Eigenschaft mit der Maus bei Verfahrenschritt 2236 anklicken. Die nächsten Maxima oder Minima werden in Abhängigkeit von der gedrückten Modifizierungstaste zum vorgewählten Punkt als Stelle ausgewählt. Ohne die automatische Bestimmung des Höchstwertes muss der Benutzer eine Stelle bei Verfahrensschritt 2238 auswählen, indem er auf dessen Position in der linearen Darstellung des Zielmoleküls klickt.
Jedes Mal, wenn eine Stelle oder eine Gruppe von Stellen ausgewählt wird, wird bei Verfahrensschritt 2230 eine dynamische Eigenschaft für alle möglichen (nicht schon entfernten) Stellen errechnet. Diese Eigenschaft zeigt die Nähe der Stelle zu einer ausgewählten Stelle an, wobei der Benutzer basierend auf der Abdeckung des Zielmoleküls Stellen in den folgenden Durchläufen auswählen kann. Nachdem neue Stellen ausgewählt worden sind, legt der Benutzer fest, ob die gewünschte Anzahl an Stellen ausgewählt worden ist. Wenn zu wenig Stellen ausgewählt worden sind, geht der Benutzer zu Schritt 2220 zurück, um mehr auszuwählen. Wenn zu viele Stellen ausgewählt worden sind, kann der Benutzer sie entfernen, indem er sie auf der Zielmolekülanzeige an Verfahrensschritt 2234 vorwählt und löscht. Wenn die richtige Anzahl an Stellen ausgewählt worden ist und der Benutzer mit der Gruppe der ausgewählten Stellen zufrieden ist, trägt der Benutzer diese Stellen zusammen mit ihrem Namen, der Notizbuchzahl und der Seitenzahl in die Datenbank bei Verfahrensschritt 2238 ein. Die Datenbank versieht diesen Eintrag mit einer Zeitangabe.
BEISPIEL 15: Programm zur Auswahl der Stellen
In einer in 21 dargestellten, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Anwendung verwendet, die die Zuordnung einer spezifischen chemischen Struktur zu der Komplementärsequenz der vorher ausgewählten Stellen und den Eintrag und die Anforderung von diesen, nunmehr vollständig bestimmten Antisense Verbindungen ermöglicht. Das Programm ist als dreistufige, objektorientierte Anwendung geschrieben. Alle beschriebenen Merkmale hängen deshalb eng mit der relationalen Datenbank zusammen. Aus diesem Grund sind keine detaillierten Datenbank-Lese- und Schreib-Schritte gezeigt und es wird vorausgesetzt, dass jeder beschriebene Schritt auch einen entsprechenden Lese-/Schreibzugriff umfasst.
Um das Programm zur Zuordnung der Oligonukleotidchemien laufen zu lassen, wird es bei Verfahrenschritt vom Benutzer 2302 gestartet. Der Benutzer trifft dann bei Verfahrenschritt 2304 aus den vorher ausgewählten Oligonukleotidgruppen, die bei der Stellenwahl bei Verfahrenschritt 2238 in die Datenbank eingegeben wurden, eine Auswahl. Als nächstes muss er bei Verfahrenschritt 2210 entscheiden, ob der Chemie nacheinander manuell eine Base zugewiesen werden soll oder ob die Stellen durch eine Schablone laufen gelassen werden sollen. Wenn der Benutzer beschließt, eine Schablone zu benutzen, muss bestimmt werden, ob eine geeignete Schablone bei Verfahrenschritt 2308 vorhanden ist. Wenn eine Schablone mit den gewünschten Änderungen der Chemie und der richtigen Länge nicht vorhanden ist, kann sie der Benutzer bei Verfahrenschritt 2314 definieren.
Um eine Schablone zu definieren, muss der Benutzer die Länge des Oligonukleotids vorwählen, für die die Schablone zu definieren ist. Dieses Oligonukleotid wird dann als Balken mit auswählbaren Regionen dargestellt. Der Benutzer stellt die Zahl Bereiche auf dem Oligonukleotid und die Positionen und die Längen dieser Regionen ein, indem er sie auf dem Balken hin und her Stab zieht. Jede Region wird durch eine andere Farbe dargestellt.
Für jede Region definiert der Benutzer die Chemiemodifikationen für den Zucker, die Bindungen und die Heterozyklen für jede Basenposition des Bereiches. Es müssen mindestens vier Heterozyklenchemien eingegeben werden, eine für jede der vier möglichen Basenarten (A, G, C oder T oder U) in der Reihenfolge der Stellen, in der die Schablone angewendet wird. Um diese Chemien auszuwählen, ist eine Benutzerschnittstelle vorgesehen, die die molekulare Struktur jeder gewählten Verbindung und den Namen ihrer Modifikation zeigt. Der Benutzer kann aus einem Auswahlmenü in der Nähe der Graphiken die auswählbaren Strukturen und Namen auswählen und platzieren. Zum Beispiel wird der Heterozyklus, das die Basetyp G darstellt, als zweidimensionales Strukturdiagramm gezeigt. Wenn der Benutzer das Auswahlmenü anklickt, werden eine Reihe anderer möglicher Strukturen und Namen angezeigt. Der Benutzer zieht die Maus zur gewünschten Chemie und lässt sie los. Jetzt wird das eben vorgewählte Molekül als Auswahl für die G-Typ Heterozyklenmodifikation angezeigt.
Sobald der Benutzer eine Schablone erzeugt oder eine Bestehende ausgewählt hat, verwendet die Software die Schablone bei Verfahrensschritt 2312 für jede der Komplemente der Stellen in der Liste. Wenn Schablonen verwendet werden, ist es möglich, dass eine Chemie definiert wird, die nicht mit den chemischen Vorstufen zu erzeugen ist, die momentan auf dem automatischen Synthesizer benutzt werden. Um dieses zu überprüfen, ist eine Datenbank mit allen vorher definierten Vorstufen und ihrer Verwendbarkeit für die automatisierte Synthese vorgesehen. Wenn Schablonen verwendet werden, werden die entworfenen Moleküle bei Verfahrensschritt 2316 mit der Datenbank überprüft, um festzustellen, ob sie sofort synthetisiert werden können.
Wenn ein Molekül nicht sofort synthetisiert werden kann, wird es zu einer Liste hinzugefügt, die der Benutzer überprüft. Bei Verfahrensschritt 2318 entscheidet der Benutzer, ob die Chemie modifiziert wird, um sie mit der momentanen Liste mit verfügbaren Chemien kompatibel zu machen oder ob sie verworfen wird. Um eine Chemie zu modifizieren, muss der Benutzer die Schnittstelle bei Verfahrensschritt 2322 zur Auswahl einer jeweiligen Base verwenden. Der Benutzer kann auch direkt zu diesem Schritt gehen und alle Schablonen bei Verfahrensschritt 2306 überspringen.
Die Schnittstelle bei Verfahrensschritt 2322 ist dem Schabloneneditor bei Verfahrensschritt 2314 sehr ähnlich, mit dem Unterschied, dass statt der Chemien für Bereiche jeweils eine Base festgelegt wird. Diese Schnittstelle unterscheidet sich auch dadurch, dass sie dynamisch prüft, ob das, was der Benutzer eingibt, sofort synthetisiert werden kann. Das heißt, jede getroffene Auswahl begrenzt die Wahlmöglichkeiten, die die Software in ihrem Auswahlmenü anbietet. Für diese Funktion wird im Auswahlmenü die zusätzliche Auswahl „nicht definiert" angeboten. Dies erlaubt dem Benutzer zum Beispiel, zu verhindern, dass durch Auswahl der Bindung die Auswahlmöglichkeiten für die angebotenen Zucker eingeschränkt werden, indem die Bindung auf „nicht definiert" gesetzt wird. Der Benutzer würde dann den Zucker auswählen, und darauf von den übrig gebliebenen den verfügbaren Verbinder auswählen.
Nachdem allen Stellen auf der Liste Chemien zugewiesen oder sie verworfen wurden, werden sie bei Verfahrensschritt 2324 in eine kommerzielle Datenbank für chemische Strukturen eingegeben. Bei der Eingabe in die Datenbank wird überprüft, ob die Struktur einzigartig ist; ist dies der Fall, wird ihr ein neuer Bezeichner zugewiesen, um so die künftige Suche nach Strukturen und Substrukturen durch die Erzeugung verschiedener Hashtabellen zu ermöglichen. Die Verbindung wird bei Verfahrensschritt 2326 in verschiedenen Hashtabellen gespeichert, die als Chemie-/Positionstabellen gekennzeichnet sind. Diese erlauben die Suche nach Antisense Verbindungen und deren Einordnung auf Grundlage der Sequenzen der modifizierten Oligonukleotidchemien und entsprechenden Basensequenzen.
Die Ergebnisse der Datenbankeingaben werden bei Verfahrensschritt 2328 mit den neuen Sequenzkennzahlen angezeigt, wenn sie neue Verbindungen sind und mit den alten Sequenzkennzahlen, wenn sie bekannt sind. Der Benutzer gibt dann bei Verfahrensschritt 2330 vor, welche der Verbindungen für die Synthese verarbeitet werden soll und gibt eine Auftragsliste bei Verfahrensschritt 2332 unter Angabe der Namen der Wissenschaftler, Notizbuchnummer und Seitenzahl ein. Die Datenbank versieht die Eingabe mit einer Zeitangabe. Der Benutzer kann bei Verfahrensschritt 2334 dann wählen, ob das Programm bei Verfahrensschritt 2338 beendet werden soll, ob es zurück zum Anfang gehen und eine neue Liste mit Stellen bei Verfahrensschritt 2304 bearbeitet werden soll, oder ob bei Verfahrensschritt 2336 die Schnittstelle zur Anforderung der Oligonukleotide gestartet werden soll.
BEISPIEL 16: Genwanderung zur Optimierung der Oligonukleotidsequenz
Mit einem CD40 Antisense Oligonukleotid mit der Sequenzkennzahl Nr. 15 (5'-CTGGCACAAAGAACAGCA-3') wird eine Genwanderung durchgeführt. Bei der Genwanderung werden folgende Parameter verwendet:
Nach Eingabe dieser Werte und Durchführung der Genwanderung für die Sequenzkennzahl werden die folgenden neuen Oligonukleotide erzeugt:
Tabelle 9:
Die oben gezeigte Liste enthält 20 neue Oligonukleotidsequenzen, die gegen die CD40-Nukleinsäuresequenz gerichtet sind. Sie sind nach der Position der CD40-Sequenz geordnet, bei der das 5'-Ende von jedem Oligonukleotid hybridisiert ist. Das heißt, dass die ersten zehn Oligonukleotide Sequenzen mit einem jeweils um eine einzelne Base aufwärts verschobenen Rahmen der Verbindung mit der Sequenzkennzahl Nr. 15 sind, welche gegen die CD40-Sequenz gerichtet sind und die letzen zehn Oligonukleotide Sequenzen mit einem jeweils um eine einzelne Base abwärts verschobenen Rahmen der Verbindung mit der Sequenzkennzahl Nr. 15 sind, die gegen die CD40-Sequenz gerichtet sind.
BEISPIEL 17: Automatisierter Assay der RhoC Oligonukleotid-Aktivität
RhoC gehört zur Rho-Unterfamilie der kleinen GTPasen und ist ein Protein, von dem nachgewiesen wurde, dass es in verschiedener Weise an Signalwegen, einschließlich der entscheidenden Regelung des dynamischen Aufbaus des Zytoskeletts, beteiligt ist.
Die Oligonukleotide wurden entworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert, wie in den Beispielen 3 bis 8 beschrieben, analysiert, wie im Beispiel 9 beschrieben und mit Ausnahme zielspezifischer Primer und Sonden getestet, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die RhoC-Sonden und Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer L25081 Sequenzkennzahl Nr. 114; Sequenzkennzahl Nr. 115 ist das Protein) so hergestellt, dass sie mit der menschlichen RhoC-Sequenz hybridisieren.
Die PCR-Primer für RhoC waren:
Vorwärtsprimer: TGATGTCATCCTCATGTGCTTCT (Sequenzkennzahl Nr. 116)
Rückwärtsprimer: CCAGGATGATGGGCACGTT (Sequenzkennzahl Nr. 117) und die PCR-Sonde war: FAM-CGACAGCCCTGACAGCCTGGAAA-TAMRA
(Sequenzkennzahl Nr. 118), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
BEISPIEL 18: Antisense Hemmung der Expression von RhoC durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer L25081, Sequenzkennzahl Nr. 113) eine Reihe von Oligonukleotiden so hergestellt, dass sie auf verschiedene Regionen der menschlichen RhoC-RNA abzielen. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer L25081) und an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 10 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Menge an RhoC-mRNA durch quantitative Echtzeit- PCR getestet, wie in den obigen Beispielen beschrieben. Die Daten sind aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 10
BEISPIEL 19: Antisense Hemmung der RhoC Expression durch Phosphorothioat-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine zweite Gruppe von gegen menschliches RhoC gerichteten Oligonukleotiden synthetisiert. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 11 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer L25081) und an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 2 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine.
Die Daten wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durch quantitative Echtzeit-PCR erhalten und aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 11
BEISPIEL 20: Automatischer Test der Oligonukleotid-Aktivität für die Expression des Zellulären Apoptose-2-Inhibitors
Der Zelluläre Apoptose-2-Inhibitor (der auch als c-IAP-2, Apoptose Inhibitor 2, API-2, hIAP-1 und MIHC bezeichnet wird) gehört zur Familie der Apoptose Inhibitoren (IAP), welche antiapoptotische Proteine sind, die die Übermittlung von intrazellulären Todessignalen stören.
Die Oligonukleotide wurden entworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert, wie in den Beispielen 3 bis 8 beschrieben, analysiert, wie im Beispiel 9 beschrieben und mit Ausnahme zielspezifischer Primer und Sonden getestet, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die Apotose-2-Sonden und Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer U37546 Sequenzkennzahl Nr. 159; Sequenzkennzahl Nr. 160 ist das Protein) so hergestellt, dass sie mit der menschlichen Apoptose-2-Inhibitor-Sequenz hybridisieren.
Die PCR-Primer für den zellulären Apoptose-2-Inhibitor waren:
Vorwärtsprimer: GGACTCAGGTGTTGGGAATCTG (Sequenzkennzahl Nr. 161)
Rückwärtsprimer: CAAGTACTCACACCTTGGAAACCA (Sequenzkennzahl Nr. 162)
und die PCR-Sonde war: FAM-AGATGATCCATGGGTTCAACATGCCAA-TAMRA (Sequenzkennzahl Nr. 163), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
BEISPIEL 21: Antisense Hemmung der Expression des Zellulären Apoptose-2-Inhibitors durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von veröffentlichten Sequenzen (GenBank Zugriffsnummer U37546, Sequenzkennzahl Nr. 159) eine Gruppe von Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen verschiedene Bereiche der menschlichen Apoptose-2-Inhibitor-RNA gerichtet waren. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 12 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer U37546) und an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 12 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf Apoptose-2-Inhibitor-mRNA durch quantitative Echtzeit-PCR wie in den obigen Beispielen beschrieben getestet. Daten aus drei Experimenten wurden gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 12
BEISPIEL 22: Antisense Hemmung der Apoptose-2-Inhibitor-mRNA durch Phosphorothioat-2'-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine zweite Gruppe mit Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschlichen Zellulären Apoptose-2-Inhibitor gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 13 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer 037546) und an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 13 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine.
Die Daten wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durch quantitative Echtzeit-PCR erhalten und aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 13
BEISPIEL 23: Automatischer Assay der ELK-1 Oligonukleotid-Aktivität
ELK-1 (das auch als p62TCF bezeichnet wird) gehört zur Unterfamilie der ternären Komplexfaktoren (TCF) aus Ets-Domänenproteinen und verwenden einen zweiteiligen Erkennungsmechanismus, bei dem sowohl Protein-DNA als auch Protein-Protein Wechselwirkungen beteiligt sind. Dieses ermöglicht die Genregulation nicht nur durch direkte DNA-Bindung, sondern auch indirekt durch Beteiligung anderer Faktoren (Rao et al., Science, 1989, 244, 66–70). Die Entstehung ternärer Komplexe mit Proteinanordnungen erlaubt eine unterschiedliche Regulation von vielen Genen. ELK-1 steuert unterschiedliche Signalübertragungswege durch einen Mechanismus, bei dem die Aktivität der Egr-1, Pip92, Nur77 und c-Fos-Promotoren durch Bindung an SRF (Serum Response Element, SRE) als Antwort auf extrazelluläre Reize wie Wachstumsfaktoren, mitogene und onkogene Produkte reguliert wird (Sharrocks et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 1997, 29, 1371–1387). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass ELK-1 andere Funktionen in der Zelle einschließlich der Apoptose steuert.
Die Oligonukleotide wurden entworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert, wie in den Beispielen 3 bis 8 beschrieben, analysiert, wie im Beispiel 9 beschrieben und mit Ausnahme zielspezifischer Primer und Sonden getestet, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die ELK-1-Sonden und Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer M25269 Sequenzkennzahl Nr. 204; Sequenzkennzahl Nr. 205 ist das Protein) so hergestellt, dass sie mit der menschlichen ELK-1-Sequenz hybridisieren.
Die PCR-Primer für ELK-1 waren:
Vorwärtsprimer: GGACTCAGGTGTTGGGAATCTG (Sequenzkennzahl Nr. 206)
Rückwärtsprimer: CTCCTCTGCATCCACCAGCTT (Sequenzkennzahl Nr. 207) und die PCR-Sonde war: FAM-TCTCCTGGACTTCACGGGATGGTGGT-TAMRA
(Sequenzkennzahl Nr. 208), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
BEISPIEL 24: Antisense Hemmung der Expression von ELK-1 durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von veröffentlichten Sequenzen (GenBank Zugriffsnummer M25269, Sequenzkennzahl Nr. 204) eine Gruppe von Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen verschiedene Bereiche der menschlichen ELK-1-RNA gerichtet waren. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 14 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer M25269) und an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 14 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf ELK-1-mRNA durch quantitative Echtzeit-PCR wie in den obigen Beispielen beschrieben getestet. Daten aus drei Experimenten wurden gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 14
BEISPIEL 25: Antisense Hemmung der ELK-1 Expression durch Phosphorothioat-2'-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine zweite Gruppe mit Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschliches ELK-1 gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 15 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer M25269) und an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 15 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine.
Die Daten wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durch quantitative Echtzeit-PCR erhalten und aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 15
BEISPIEL 26: Automatischer Assay der Gi-alpha Protein Oligonukleotid-Aktivität
G-alpha-11 gehört zur Gq-Unterfamilie der G-Proteine, deren wichtigste Aufgabe ist, PLC-b-Isoformen zu aktivieren, die sekundäre Botenstoffe produzieren und die intrazellulären Kalziumspeicher beeinflussen.
Die Oligonukleotide wurden entworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert, wie in den Beispielen 3 bis 8 beschrieben, analysiert, wie im Beispiel 9 beschrieben und mit Ausnahme zielspezifischer Primer und Sonden getestet, wie in Beispiel 10 beschrieben. G-alpha-11-Sonden und Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer AF011497 Sequenzkennzahl Nr. 249; Sequenzkennzahl Nr. 250 ist das Protein) so hergestellt, dass sie mit der menschlichen G-alpha-11-Sequenz hybridisieren. Die PCR-Primer für ELK-1 waren: Vorwärtsprimer: TGACCACCTTCGAGCATCAG (Sequenzkennzahl Nr. 251). Rückwärtsprimer: CGGTCGTAGCATTCCTGGAT (Sequenzkennzahl Nr. 252) und die PCR-Sonde war: FAM-TCAGTGCCATCAAGACCCTGTGGGAG-TAMRA (Sequenzkennzahl Nr. 253), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
BEISPIEL 27: Antisense Hemmung der G-alpha-11 Expression durch Phosphorothioat-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen (Genbank Zugriffsnummer AF011497, Sequenzkennzahl Nr. 249) eine Reihe von Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschliche G-alpha-11-RNA gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 16 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer AF011497) und an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 16 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf G-alpha-11-mRNA durch quantitative Echtzeit-PCR wie in den obigen Beispielen beschrieben getestet. Daten aus drei Experimenten wurden gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 16
BEISPIEL 28: Antisense Hemmung der G-alpha-11 Expression durch Phosphorothioat-2'-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine zweite Gruppe mit Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschliches G-alpha-11 gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 17 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer AF011497) und an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 17 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine.
Die Daten wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durch quantitative Echtzeit-PCR erhalten und aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 17
BEISPIEL 29: Automatischer Assay der AKT-1 Oligonukleotid-Aktivität
AKT-1 (auch als PKB-alpha oder RAc-PK-alpha bekannt) gehört zur AKT/PKB-Familie der Serin/Threonin-Kinasen und ist an verschiedenen Signalwegen beteiligt.
Die Oligonukleotide wurden entworfen, wie im Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert, wie in den Beispielen 3 bis 8 beschrieben, analysiert, wie im Beispiel 9 beschrieben und mit Ausnahme zielspezifischer Primer und Sonden getestet, wie in Beispiel 10 beschrieben. AKT-1-Sonden und Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank Zugriffsnummer M63167 Sequenzkennzahl Nr. 334; Sequenzkennzahl Nr. 335 ist das Protein) so hergestellt, dass sie mit der menschlichen G-alpha-11-Sequenz hybridisieren. Die PCR-Primer für AKT-1 waren: Vorwärtsprimer: CGTGACCATGAACGAGTTTGA (Sequenzkennzahl Nr. 336). Rückwärtsprimer: CAGGATCACCTTGCCGAAA (Sequenzkennzahl Nr. 337) und die PCR-Sonde war: FAM-CTGAAGCTGCTGGGCAAGGGCA-TAMRA (Sequenzkennzahl Nr. 338), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Fluoreszenz-Reporterfarbstoff und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencherfarbstoff ist.
BEISPIEL 30: Antisense Hemmung der AKT-1 Expression durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen (Genbank Zugriffsnummer M63167, Sequenzkennzahl Nr. 334) eine Reihe von Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschliche AKT-1-RNA gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 18 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer M63167) und an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 18 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioat-Rückgraten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf AKT-1-mRNA durch quantitative Echtzeit-PCR wie in den obigen Beispielen beschrieben getestet. Daten aus drei Experimenten wurden gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 18
BEISPIEL 31: Antisense Hemmung der AKT-1 Expression durch Phosphorothioat-2'-MOE-Gapmer-Oligonukleotide
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine zweite Gruppe mit Oligonukleotiden synthetisiert, die gegen menschliches AKT-1 gerichtet war. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 19 gezeigt. Die Zielstellen sind durch diejenigen Nukleotidzahlen bezeichnet, die in der Quelle der Sequenz angegeben sind (Genbank Zugriffsnummer M63167) und an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in Tabelle 19 sind chimäre, 18 Nukleotide lange Oligonukleotide („Gapmere"), die aus einer zentralen, aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzten „Gap"-Region bestehen, welche an beiden Seiten (5'- und 3'-Richtungen) durch „Wings" mit vier Nukleotiden begrenzt wird. Die Wings bestehen aus 2'-Methoxyethyl-(2'-MOE) Nukleotiden. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrate) sind durchgängige Phosphorothioate (P=S) der Oligonukleotide. Die Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Metylcytidine.
Die Daten wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durch quantitative Echtzeit-PCR erhalten und aus drei Experimenten gemittelt. Soweit vorhanden, bedeutet „N.D." „keine Daten".
Tabelle 19
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein automatisiertes Verfahren zur Erzeugung einer Reihe von Oligonukleotiden, welche die Expression einer Ziel-Nukleinsäuresequenz durch Bindung von genannten Oligonukleotiden an die genannte Ziel-Nukleinsäuresequenz modulieren, umfassend die folgenden Schritte: (a) Erzeugung einer Sammlung von Nukleinbasesequenzen in silico gemäß definierter Kriterien, wobei die genannten definierten Kriterien eine thermodynamische Eigenschaft und mindestens ein weiteres Kriterium sind, welches von verfügbaren für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist, wobei es auf funktionale Bereiche der genannten Ziel-Nukleinsäuresequenz und Gleichverteilung über die genannte Ziel-Nukleinsäuresequenz gerichtet ist, und genannte Sammlung von Nukleinbasesequenzen als Daten in einer Datenbank gespeichert sind; (b) Verwendung genannter Daten zur automatisierten Herstellung einer Vielzahl synthetischer Oligonukleotide, welche mindestens einige der genannten Nukleinbasensequenzen aufweisen, und die Speicherung von auf die genannten synthetischen Oligonukleotide bezogenen Kriterien als zusätzliche Daten in der genannten Datenbank; (c) automatisierte Testung der genannten synthetischen Oligonukleotide zur Modulierung der Expression der genannten Ziel-Nukleinsäuresequenz, und die Speicherung von auf den genannten Test bezogenen Kriterien als weitere zusätzliche Daten in der genannten Datenbank; und (d) Verwendung von Resultaten von Schritt (c) als Eingabe für Schritt (a) in mindestens einer weiteren Iteration der Schritte (a), (b) und (c).
Das Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Verfahrensschritt der Auswahl einer Oligonukleotidchemie zwischen den Schritten (a) und (b) aufweist, und wobei der genannte Syntheseschritt (b) eine automatisierte Synthese einer Reihe von synthetischen Oligonukleotiden umfasst, welche die genannten Nukleinbasensequenzen von Schritt (a) und die ausgewählte Oligonukleotidchemie aufweisen.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die genannte Ziel-Nukleinsäuresequenz die einer genomischen DNA, einer cDNA, eines Produkts einer Polymerase-Kettenreaktion, eines exprimierten Sequenz-Tags, einer mRNA oder einer strukturellen RNA ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die genannte Ziel-Nukleinsäuresequenz eine humane Nukleinsäuresequenz ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, welches den zusätzlichen Schritt der Auswahl einer Untermenge der genannten Reihe von synthetischen Oligonukleotiden aufweist, welche einen erwünschten Grad an Modulierung der Expression der genannten Ziel-Nukleinsäuresequenz haben.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei im Schritt (c) die genannte Vielzahl der synthetischen Oligonukleotide durch eine computergesteuerte Polymerase-Kettenreaktion oder durch einen computergesteuerten Enzyme-linked Immunosorbent Assay getestet wird.
Das Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–6 zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die für Antisense-Bindung von Oligonukleotiden geeignet sind.