DE69931376T2

DE69931376T2 - Häm-oxygenase 1 zur hemmung der glatten muskelzellenmigration

Info

Publication number: DE69931376T2
Application number: DE69931376T
Authority: DE
Inventors: J. Gary Washington NABEL; G. Elizabeth Ann Arbor NABEL
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1999-08-21
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2019-08-22
Also published as: WO2000010613A2; EP1109914B1; CA2343575A1; EP1109914A2; US6203991B1; WO2000010613A3; DE69931376D1; CA2343575C; AU5687799A

Description

Ausgangspunkt der Erfindung
Die Rolle induzierbarer Second-Messenger-Gase wie Kohlenmonoxid (CO) in der Pathophysiologie kardiovaskulärer Erkrankungen ist bis heute nicht klar (Wever, et al. Circulation 97, 108-112, 1998; Cooke und Dzau, Circulation 96, 379-382, 1997; Moncada, et al., Pharmacol. Rev. 43, 109-142, 1997; Loscalzo und Welch, Progress in Cardiovascular Diseases 38, 87-104, 1995). Das Heme- bzw. Häm-Oxygenasesystem, das CO erzeugt, besteht aus drei Isoenzymen, die bis jetzt identifiziert wurden: die induzierbare Häm-Oxygenase I (HO-1), die konstitutiv exprimierten HO-2 und HO-3 (Moncada, et al., Pharmacol. Rev. 43, 109-142, 1997; McCoubrey et al., Eur. J. Biochem. 247, 725-732, 1997; Maines, et al., J. Biol. Chem. 261, 411-419, 1986; Shibahara et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 240, 7865-7869, 1985; Rotenberg et al., J. Biol. Chem. 265, 7501-7506, 1990), die alle die Oxidation von Häm zu den biologisch aktiven Molekülen Eisen, Biliverdin und CO katalysieren.
Die weit verbreitete Expression der Häm-Oxygenasen führte zu der Hypothese, dass das CO-System andere Rollen als die Aufrechterhaltung der Häm-Homöostase spielt, und zeigen, dass CO als bedeutendes biologisches Molekül in einer Second-Messenger-Kapazität fungieren kann. Tatsächlich wurde gezeigt, dass CO Guanylylcyclyse aktiviert, indem das Eisen aus der Ebene des Porphyrin-Ringes des Häm-Proteins verdrängt wird. Das gebildete cGMP aktiviert dann cGMP-abhängige Kinasen. Kürzliche Studien zeigen nunmehr, dass HO-abgeleitetes Kohlenmonoxid eine physiologische Rolle bei der Regulation des vaskulären Glatten-Muskel-Tonus und der Blutplättchenfunktion durch die Aktivierung löslicher Guanylylcyclase spielt.
Daher kann die Dysregulation des CO-Systems eine eminente Rolle bei der Pathogenese von proliferativen Gefäßerkrankungen wie Arteriosklerose und Restenose spielen. Die Glatte-Muskelzell-Proliferation und -Migration in eine Gefäßverletzung spielen eine Schlüsselrolle in der Pathogenese dieser okklusiven vaskulären proliferativen Störungen bzw. Erkrankungen, die die Hauptbeschränkung für die Langzeiterfolgsrate von perkutanen (koronaren) transluminalen Verfahren darstellt, ebenso wie für arterielle und venöse Bypass-Transplantationen.
Die physikalischen und thrombotischen Ereignisse, die PTCA- und CABG-Verfahren begleiten, haben eine Kaskade der Mitogen-, chemotaktischen-Faktor- und inflammatorischen Cytokin-Freisetzung zur Folge, die alle die Rekrutierung lokaler vaskulärer glatter Muskelzellen und immunkompetenter Zellen fördern und ein Wiedereintreten und ein Fortschreiten durch den Zellzyklus hindurch fördern. Aktivierte mediale glatte Muskelzellen proliferieren und migrieren in die geschädigte Intima und synthetisieren extrazelluläre Matrix, einschließlich Fibrin und Collagen, was zum (Wieder-)Verschluss des Gefäßes führt. Pharmakologische Eingriffe, um diesen Prozess einer anormalen Gefäßzellproliferation und -migration zu umgehen, sind weitestgehend unbelohnt geblieben.
Es besteht deswegen ein Bedarf nach sicheren, effektiven Verfahren zur Hemmung einer Glatten-Gefäßmuskelzell-Proliferation und -migration in das Lumen des Blutgefäßes im Anschluss an eine Verletzung des Blutgefäßes.
Eine Transfektion mit einem rekombinanten replikationsdefizienten humanen Adenovirus HO-1 cDNA (Adv-HHO)-Konstrukt in corneale Kaninchen-Epithelzellen in Kultur hatte die funktionelle Expression des humanen HO-1-Gens zur Folge. Zusätzlich wurde humane HO-1 mRNA in cornealem Endothel, Iris, Linse und Retina nach Mikroinjektion des Adv-HO-1-Konstruktes in Kaninchenaugengewebe nachgewiesen (Abraham et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, Bd. 36, Nr. 11, Seiten 2202-2210 (1995)). Die Autoren schlagen den gewebsselektiven funktionellen Transfer des HO-1-Gens in vivo als Schutzmechanismus gegen oxidativen Stress vor, der zur Pathogenese von Augenkrankheiten wie beispielsweise Katarakt, nicht-induzierter Verletzung, altersbezogener Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie beiträgt.
Eine überschüssige vaskuläre Glatte-Muskelzell-(VSMC)-Proliferation und Kontraktilität sind Schlüsselereignisse in der Pathologie vaskulärer Störungen, die durch Hypoxie induziert sind (Morita et al. Journal of Biological Chemistry, Bd. 272, Nr. 52, Seiten 32804-32809 (1997)). Unter Hypoxie ist VSMC-abgeleitetes CO ein bedeutender Regulator der VSMC-Proliferation. Eine Hemmung der CO-Produktion oder ein Einfangen von CO erhöht die VSMC-Proliferation in Reaktion auf Serum oder auf Mitogene wie beispielsweise Endothelin.
Eine Zunahme der CO-Produktion und eine Exposition von Zellen gegenüber exogenem CO führt zu einer attenuierten VSMC-Wachstumsreaktion. Die antiproliferativen Wirkungen von CO auf VSMCs schließen Endothelzell-unabhängige, direkte Wirkungen ein.
Nabel et al. schlagen den Transfer gentechnisch veränderter Endothelzellen in vivo vor, um die Einbringung von Proteinen von therapeutischem Wert in die Behandlung der kardiovaskulären Erkrankung zu ermöglichen (Nabel et al., Science, Bd. 244, Seiten 1342-1344 (1989)). Die direkte Einbringung von DNA unter Verwendung eines retroviralen Vektors oder eines Liposomen-Transportes wird ebenfalls vorgeschlagen (Nabel et al., Science, Bd. 249, Seiten 1285-1288 (1990)).
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben entdeckt, dass das CO-erzeugende System eine bedeutende Rolle bei einer Gefäßverletzung und bei einem reaktiven Vasospasmus spielt. Die Wiederherstellung der HO1-Expression und daher der CO-Produktion stellt den Verlust von konstitutiv exprimierten Endothel-abgeleiteten inhibitorischen Faktoren wieder her, die den lokalen Gefäß-Tonus, die Zellproliferation und -migration und die Blutplättchen und -immunzelladhäsion kontrollieren, was die Hemmung einer Gefäßverletzungsbildung und eine normalisierte Vasoreaktivität zur Folge hat.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Folgendes bereit:

(i) ein in vitro Verfahren zur Hemmung der Glatten-Gefäßmuskelzell-Proliferation, umfassend das In-Berührung-Bringen der Zelle mit einer isolierten Nucleinsäure, die ein Häm-Oxygenase-1-Gen oder eine funktionell äquivalente Mutante hiervon codiert; und
(ii) Verwendung einer isolierten Nucleinsäure, die ein Häm-Oxygenase-1-Gen oder eine funktionell äquivalente Mutante hiervon codiert, in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung, gekennzeichnet durch eine Abnormalität der Glatten-Gefäßmuskelzell-Proliferation.

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Expressionskonstrukte, die einen Promotor umfassen, der in eukaryontischen Zellen funktionell ist, und eine Nucleinsäure, die HO1 codiert, wobei die Nucleinsäure unter transkriptioneller Kontrolle des Promotors steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Expressionskonstrukte weiterhin ein Polyadenylierungssignal. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Konstrukte weiterhin einen selektierbaren Marker. In einer weiteren Ausführungsform ist das Expressionskonstrukt ein Adenovirus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Expressionskonstrukt ein Adenovirus, dem zumindest ein Teil der-E1-Region fehlt.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure eine cDNA. In anderen Ausführungsformen ist die Nucleinsäure genomische DNA. Noch weitere Ausführungsformen schließen eine Kombination von cDNA und genomischer DNA ein, beispielsweise ein Mini-Genkonstrukt. In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Nucleinsäure in einer Sense-Orientierung bezüglich des Promotors angeordnet.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die ein Expressionskonstrukt umfassen, mit einem Promotor, der in eukaryontischen Zellen funktionell ist, und einer Nucleinsäure, die HO1 codiert, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Puffer, Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel. In bestimmten Ausführungsformen sind das Expressionskonstrukt und der pharmazeutisch verträgliche Puffer, Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel in einem Kit vorgesehen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Hemmung der Glatten-Gefäßmuskelzell-Proliferation nach einer Ballon-Verletzung eines Blutgefäßes in einem Säugetier, durch Einführen einer DNA-Sequenz in das Blutgefäß durch Katheter-Instillation am Ort der Ballon-Verletzung nach der Ballon-Verletzung, wobei die DNA-Sequenz ein Häm-Oxygenase-I-Gen umfasst; und Exprimieren des Häm-Oxygenase-I-Genes zur Erzeugung von Häm-Oxygenase-I-Protein in glatten Muskelzellen des Blutgefäßes, wodurch die proliferierenden Zellen getötet werden.
Die hier präsentierten Daten zeigen zum ersten Mal, dass HO1 die Zellproliferation in vivo unterdrückt. Somit kommt die vorliegende Erfindung dem Bedarf nach einer verbesserten Therapie der Restenose und anderen Erkrankungen entgegen, die mit einer erhöhten Zellproliferation in Verbindung stehen. Insbesondere kann ein Expressionskonstrukt, das zum Exprimieren eines funktionellen HO1-Produktes in der Lage ist, dazu verwendet werden, die Zellproliferation zu hemmen.
Es besteht ebenfalls ein Beweis dafür, dass HO1-fokussierte Behandlungen therapeutische Implikationen in einem anti-angiogenetischen Ansatz aufweisen werden. Es existieren viele Erkrankungen, bei denen eine Abnahme der Gefäßbildung wünschenswert ist. Zusätzlich können HO1-Behandlungen sich als vorteilhaft bezüglich anderer hyperproliferativer Störungen wie beispielsweise Krebs erweisen.
Abkürzungen
Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet:

vsmc: glatte Gefäßmuskelzelle
HO1: Häm-Oxygenase 1
Ad: Adenovirus
Ad-ntLacZ: rekombinantes Adenovirus, das für Kern-markierte β-Galactosidase codiert
ΔE1A-Ad: Sham-Adenovirus, der eine Deletion der E1A- und E3-Region trägt
EC: Endothelzelle
PDGF: Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor
FCS: fötales Kalbserum
BSA: Rinderserumalbumin
NOS: Stickoxidsynthetase
NO⁰: Stickoxid

HO1 und HO1-verwandte Nucleinsäuren
Die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, die HO1 codieren, sind in der Technik bekannt (siehe Shibahara S., et al., „Cloning and expression of cDNA for rat heme oxygenase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Dez. 1985, 82 (23): 7865-7869; Yoshida et al., „Human heme oxyge nase cDNA and induction of its mRNA by hemin.", Eur. J. Biochem., Feb. 1, 1988, 171 (3): 457-461).
Die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein gesamtes HO1-Gen, eine funktionelle HO1-Proteindomäne oder irgendein HO1-Polypeptid, Peptid oder Fragment codieren, das ausreichend ist, um eine Hemmung der Zellproliferation zu bewirken. Die HO1-Nucleinsäure kann aus genomischer DNA abgeleitet sein, d. h. kann direkt aus dem Genom eines speziellen Organismus kloniert werden. In bevorzugten Ausführungsformen jedoch würde die Nucleinsäure, die HO1 codiert, komplementäre DNA (cDNA) oder cDNA plus einem Intron umfassen, d. h. ein Mini-Gen.
Der Begriff „cDNA" soll eine DNA betreffen, die unter Verwendung von Messenger-RNA (mRNA) als Matrize hergestellt wird. Der Vorteil der Verwendung einer cDNA im Vergleich zu genomischer DNA oder DNA, die aus einer genomischen, nicht- oder teilweise prozessierten RNA-Matrize polymerisiert wurde, besteht darin, dass cDNA in erster Linie die codierende Region des entsprechenden Proteins enthält und ihm Introns und andere nicht-codierende Bereiche fehlen, die in der genomischen DNA zu finden sind.
In der gesamten Anmeldung wird der Begriff „HO1" in erster Linie dazu verwendet, humane Häm-Oxygenase I zu bezeichnen, obwohl andere HO1-Homologe aus anderen Species ebenfalls dazu verwendet werden können, die Erfindung auszuüben.
Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass ein vorgegebenes HO1 durch natürliche Varianten repräsentiert werden kann, die eine geringfügig unterschiedliche Primärsequenz aufweisen, die jedoch nichtsdestoweniger biologisch funktionelle Äquivalente voneinander sind (siehe unten). Damit es gemäß der vorliegenden Erfindung funktioniert, ist alles, was erforderlich ist, dass HO1 die Zellproliferation unterdrückt. Um bezüglich einer solchen Wirkung zu testen, ist es eine einfache Möglichkeit, eine Zellzyklus-Progressionsanalyse durch Durchflusscytometrie und [³H]Thymidin-Einbau, wie unten im Abschnitt Beispiele beschrieben, durchzuführen.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, betrifft der Begriff „Nucleinsäure, die ein HO1 codiert", ein Nucleinsäuremolekül, das frei von Ganzzellnucleinsäure isoliert wurde. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine Nucleinsäuresequenz, die im Wesentlichen wie in SEQ ID NO:1 dargelegt ist, d. h., dass die Nucleinsäuresequenz im Wesentlichen einem Teil von SEQ ID NO:1 entspricht und relativ wenige Kodone aufweist, die den Kodonen von SEQ ID NO:1 nicht identisch oder funktionell äquivalent sind. Der Begriff „funktionell äquivalente Kodone" wird hierin verwendet, um Kodone zu bezeichnen, die entweder dieselbe Aminosäure codieren (aufgrund der Degeneration des genetischen Codes) oder biologisch äquivalente Aminosäuren codieren.
Unter Zulassung der Degeneration des genetischen Codes werden Sequenzen, die zwischen ungefähr 50 % und ungefähr 75 %; oder besonders bevorzugt zwischen ungefähr 76 % und ungefähr 99 % der Nucleotide aufweisen, die mit den Nucleotiden von SEQ ID NO:1 identisch sind, Sequenzen sein, die „in SEQ ID NO:1 dargelegt sind". Sequenzen, die im Wesentlichen dieselben sind wie solche, die in SEQ ID NO:1 dargelegt sind, können ebenfalls funktionell als Sequenzen definiert werden, die dazu in der Lage sind, an ein Nucleinsäuresegment zu hybridisieren, das das Komplement von SEQ ID NO:1 enthält, unter Standard-Hybridisierungsbedingungen. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind für den Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Beispielsweise könnten mittel-stringente Bedingungen von ungefähr 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 37°C bis ungefähr 55°C bereitgestellt werden.
Natürlicherweise umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls DNA-Segmente, die komplementär oder im Wesentlichen komplementär zu der Sequenz sind, die in SEQ ID NO:1 dargestellt ist. Nucleinsäuresequenzen, die „komplementär" sind, sind solche, die dazu in der Lage sind, eine Basenpaarung gemäß der Standard-Watson-Crick-Komplementaritäts-Regeln durchzuführen. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „komplementäre Sequenzen" Nucleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen komplementär sind, wie es durch denselben Nucleotid-Vergleich, der oben dargelegt wurde, festgestellt werden kann, oder wie es durch die Möglichkeit der Hybridisierung an ein Nucleinsäuresegment von SEQ ID NO:1 unter relativ stringenten Bedingungen, wie beispielsweise den hierin beschriebenen, definiert ist. Solche Sequenzen können das gesamte HO1-Molekül oder funktionelle Fragmente hiervon codieren.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die biologisch funktionelle Äquivalente HO1-Proteine und -Peptide codieren. Solche Sequenzen können sich als Folge einer Kodon-Redundanz und einer funktionellen Äquivalenz ergeben, von denen be kannt ist, dass sie natürlicherweise innerhalb von Nucleinsäuren auftreten und innerhalb der so codierten Proteine. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide über die Anwendung der DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt werden, bei der Veränderungen in der Proteinstruktur technisch hergestellt werden können, auf Grundlage von Erwägungen der Eigenschaften der Aminosäuren, die ausgetauscht werden. Veränderungen, die durch den Menschen vorgenommen werden, können durch Anwendung einer ortsgerichteten Mutagenesetechnik eingebracht werden oder können zufallsbedingt eingebracht und danach bezüglich der erwünschten Funktion gescreent werden.
Falls erwünscht, kann man ebenfalls Fusionsproteine und -peptide herstellen, beispielsweise bei denen HO1-codierende Regionen mit codierenden Regionen für andere Proteine oder Peptide fusioniert werden, und die die erwünschten Funktionen aufweisen, wie beispielsweise Aufreinigung, Immundetektion, Stabilisierung oder Targeting-Zwecke. Darüber hinaus können diese Fusionsproteine oder Fusionspeptide eine intrazelluläre Targeting-Sequenz enthalten, die ihren Transport an ausgewählte zelluläre Kompartimente richten würde, insbesondere den Kern. Diese Fusionsproteine oder Fusionspeptide können aus einem DNA-Konstrukt exprimiert werden, das an Tierzellen abgegeben wurde.
Es wird ebenfalls verständlich sein, dass Aminosäuren- und Nucleinsäuresequenzen zusätzliche Reste einschließen können, wie zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Sequenzen und nach wie vor essentiell sind, wie es in einer der hierin offenbarten Sequenzen dargelegt ist, solange als die Sequenz den Kriterien entspricht, die oben dargelegt wurden, einschließlich der Aufrechterhaltung einer biologischen Proteinaktivität, soweit es die Proteinexpression angeht. Der Zusatz von terminalen Sequenzen ist insbesondere auf codierende Nucleinsäuresequenzen anwendbar, die beispielsweise verschiedene nicht-codierende Sequenzen einschließen können, die entweder die 5'- oder 3'-Anteile der codierenden Region flankieren, wie beispielsweise Promotoren.
Wie oben erwähnt können Modifikationen und Veränderungen in der Primärstruktur von HO1 durchgeführt werden, und nach wie vor ein Molekül zur Folge haben, das die gleichen oder andere erwünschte Eigenschaften aufweist. Beispielsweise können bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur ersetzt werden, ohne einen merklichen Verlust der interaktiven Bindungskapazität mit Strukturen, wie beispielsweise Antigenbindenden Regionen von Antikörpern der Bindungsorten auf Substratmolekülen, Rezeptoren oder Signaltransduktion. Weil es die interaktive Kapazität und Natur eines Proteins ist, die die biologische funktionelle Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen in einer Proteinsequenz durchgeführt werden (oder natürlich seiner entsprechenden DNA, die die Sequenz codiert) und nichtsdestotrotz ein Protein mit ähnlichen (agonistischen) Eigenschaften erzielen. Desgleichen können dieselben Erwägungen dazu verwendet werden, ein Protein oder Polypeptid mit gegenläufigen (beispielsweise antagonistischen) Eigenschaften zu erzeugen. Es wird somit von den Erfindern ins Auge gefasst, dass verschiedene Veränderungen in der Sequenz von HO1-Proteinen oder -Peptiden (oder darunterliegender DNA) durchgeführt werden können, ohne merklichen Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität.
Es wird ebenfalls vom Fachmann auf dem Gebiet gut verstanden, dass, eingeschlossen in der Definition eines biologisch funktionellen äquivalenten Proteins oder Peptids, es das Konzept ist, dass keine Begrenzung der Anzahl der Veränderungen vorliegt, die innerhalb eines definierten Anteils des Moleküls vorgenommen werden können und nach wie vor ein Molekül zur Folge haben, das ein akzeptables Niveau einer äquivalenten biologischen Aktivität aufweist. Biologisch funktionelle äquivalente Peptide sind somit hierin als solche Peptide definiert, bei denen bestimmte, nicht die meisten oder alle der Aminosäuren substituiert sein können. Insbesondere, wo der N-Terminus des HO1-Proteins betroffen ist, wird ins Auge gefasst, dass nur ungefähr 10 oder besonders bevorzugt ungefähr 5 Aminosäuren innerhalb eines vorgegebenen Peptids ausgetauscht werden können. Natürlich kann eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine/Peptide mit unterschiedlichen Substitutionen einfach hergestellt werden und gemäß der Erfindung verwendet werden.
Aminosäure-Substitutionen basieren im Allgemeinen auf einer relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseiten-Kettensubstituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Eine Analyse der Größe, Form und Art der Aminosäureseiten-Kettensubstituenten zeigt, dass Arginin, Lysin und Histidin alle positiv geladene Reste sind; dass Alanin, Glycin und Serin alle eine ähnliche Größe aufweisen; und dass Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin alle eine im Allgemeinen ähnliche Form aufweisen. Deswegen werden auf Grundlage dieser Erwägungen Arginin, Lysin und Histidin; Alanin, Glycin und Serin; und Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin als biologisch funktionelle Äquivalente hierin definiert.
Bei der Durchführung von Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren in Erwägung gezogen werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex in der Verleihung einer interaktiven biologischen Funktion eines Proteins ist in der Technik allgemein verstanden worden (Kyte und Doolittle, „A simple method for displaying the hydropathic character of a protein", J. Mol. Biol., 1982, 157 (1): 105-132). Es ist bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert werden können, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Scoring aufweisen und nach wie vor eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten. Bei der Durchführung von Veränderungen aufgrund des hydropathischen Index wird die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indices innerhalb ± 2 liegen, bevorzugt, solche, die innerhalb ± 1 liegen, besonders bevorzugt, und solche, die innerhalb ± 0,5 liegen, sind besonders stark bevorzugt.
Es ist klar, dass eine Aminosäure durch eine andere mit einem ähnlichen Hydrophilie-Wert ersetzt werden kann und nach wie vor ein biologisch äquivalentes Protein ist. Hydrophilie-Werte wurden den natürlich codierten Aminosäureresten zugeordnet, wie es im US-Patent Nr. 4554101 ausführlich beschrieben ist. Beider Durchführung von Austauschen auf Grundlage ähnlicher Hydrophilie-Werte wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte innerhalb ± 2 liegen, bevorzugt, solche, die innerhalb von ± 1 liegen, besonders bevorzugt, und solche innerhalb von ± 0,5 sehr stark bevorzugt.
Expressionskonstrukte
In dieser gesamten Anmeldung soll der Begriff „Expressionskonstrukt" jeglichen Typ von Genkonstrukt einschließen, der eine Nucleinsäure enthält, die für ein Genprodukt codiert, wobei ein Teil oder die gesamte Nucleinsäure, die die Sequenz codiert, dazu in der Lage ist, transkribiert und in ein Protein translatiert zu werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure, die ein HO1-abgeleitetes Produkt codiert, unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" betrifft eine DNA-Sequenz, die von einer synthetischen Maschinerie der Zelle erkannt wird oder eine eingeführte synthetische Maschine, die dazu erforderlich ist, die spezifische Transkription eines Gens zu beginnen. Der Satz „unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor am rechten Ort und in der rechten Orientierung bezüglich der Nucleinsäure vorliegt, um eine RNA-Polymerase-Initiation oder die Expression des Genes zu steuern.
Der Begriff Promotor wird hierin verwendet, und soll sich auf eine Gruppe von Transkriptions-Kontrollmodulen beziehen, die um den Initiationsort für die RNA-Polymerase II herum angehäuft angeordnet sind. Geeignete Promotoren sind aus ungefähr 7 bis 20 bp DNA zusammengesetzt und enthalten ein oder mehrere Erkennungsorte für Transkriptionsaktivator- und Repressorproteine.
Zumindest ein Modul in jedem Promotor funktioniert an der Position der Startstelle für die RNA-Synthese. Das am besten bekannte Beispiel ist die TATA-Box, jedoch hilft bei einigen Promotoren, denen einen TATA-Box fehlt, wie beispielsweise der Promotor aus dem Säugetier-terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase-Gen, und der Promotor für die späten SV40-Gene ein diskretes bzw. getrenntes Element, das die Startstelle selbst überlagert und dazu Hilfe leistet, den Ort der Initiation zu fixieren. Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz der Transkriptionsinitiation. Typischerweise sind diese im Bereich 30 bis 110 bp stromaufwärts der Startstelle angeordnet, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass mehrere Promotoren funktionelle Elemente stromabwärts der Startstelle ebenso enthalten. Die Beabstandung zwischen den Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, wenn die Elemente invertiert oder bezüglich einander bewegt werden. Im tk-Promotor kann die Beabstandung zwischen den Promotorelementen bis auf 50 bp erhöht werden, bis die Aktivität abzunehmen beginnt. Abhängig vom Promotor erscheint es, dass individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig zur Aktivierung der Transkription funktionieren können.
Der spezielle Promotor, der zur Kontrolle der Expression einer Nucleinsäure verwendet wird, die ein HO1 codiert, ist nicht als besonders bedeutend angesehen worden, solange er dazu in der Lage ist, die Nucleinsäure in der Zielzelle zu exprimieren. Somit, wenn eine menschliche Zelle das Ziel ist, wird es bevorzugt, die Nucleinsäure codierende Region benachbart zu oder unter der Kontrolle eines Promotors anzuordnen, der dazu in der Lage ist, in einer humanen Zelle exprimiert zu werden. Allgemein gesprochen, schließt ein solcher Promotor entweder einen humanen oder einen viralen Promotor ein.
In verschiedenen Ausführungsformen kann der humane Zytomegalievirus-(CMV)-Immediate-Early-Gen-Promotor, der SV40-Early-Promotor und der Rous-sarcoma-Virus lange terminale Wiederholung (long terminal repeat) dazu verwendet werden, eine Expression von HO1 auf hohem Niveau zu erreichen. Die Verwendung anderer viraler oder Säugetier-zellulärer oder bakterieller Phagen-Promotoren, die in der Technik wohl bekannt sind, insofern als eine Expression von HO1 erreicht wird, werden ebenfalls in Erwägung gezogen, vorausgesetzt, dass die Expressionsstärke für einen vorgegebenen Zweck ausreichend ist.
Durch Verwendung eines Promotors mit wohlbekannten Eigenschaften kann das Niveau bzw. die Konzentration und das Muster der Expression eines HO1 im Anschluss an eine Transfektion optimiert werden. Beispielsweise kann eine Selektion eines Promotors, die in Reaktion auf spezifisch physiologische Signale reguliert wird, eine induzierbare Expression von HO1 erlauben. Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription von einem Promotor erhöhten, der sich in einer beabstandeten Position vom selben Molekül der DNA befand. Diese Fähigkeit, über eine große Distanz zu wirken, hatte in klassischen Studien der prokaryontischen transkriptionellen Regulation kaum einen Präzedenzfall. Anschließende Arbeiten zeigten, dass Bereiche der DNA mit einer Enhanceraktivität sehr wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, sie sind aus vielen individuellen Elementen zusammengesetzt, von denen jedes an eine oder mehrere Transkriptionsproteine bindet. Der grundlegende Unterschied zwischen Enhancern und Promotoren ist operationell. Eine Enhancer-Region als Ganzes muss dazu in der Lage sein, die Transkription in einer Distanz zu stimulieren; dieser Bedarf ist für eine Promotor-Region und seine Komponenten-Elemente nicht wahr. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation der RNA-Synthese an einem speziellen Ort und in einer speziellen Orientierung ausrichten, wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Promotoren und Enhancer überlappen sich oftmals und sind benachbart und scheinen oftmals eine sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen.
Irgendeine Promotor/Enhancer-Kombination (wie durch die eukaryontische Promotor-Database EPDB) kann dazu verwendet werden, die Expression eines HO1 zu steuern. Die Verwendung eins T3, T7 oder SP6 cytoplasmischen Expressionssystems ist eine weitere mögliche Ausführungsform. Eukaryontische Zellen können die cytoplasmatische Transkription aus bestimmten bakteriellen oder viralen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle oder virale Polymerase bereitgestellt wird, entweder als Teil des Abgabekomplexes oder als zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
Wo ein cDNA-Insert verwendet wird, wird man typischerweise wünschen, ein Polyadenylierungssignal einzuschließen, um eine geeignete Polyadenylierung des HO1-Transkriptes zu bewirken. Die Art des Polyadenylierungssignals ist für die erfolgreiche Ausübung der Erfindung nicht entscheidend und viele derartige Sequenzen können verwendet werden. Genauso als ein Element der Expressionskassette ins Auge gefasst wird ein Terminator. Diese Elemente können dazu dienen, Message- bzw. Botschafts-Niveaus zu erhöhen und die Ablesung aus die Kassette in andere Sequenzen zu minimieren.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Expressionskonstrukt einen Virus oder ein gentechnisch verändertes Konstrukt, das aus einem viralen Genom abgeleitet ist. Die Fähigkeit bestimmter Viren, Zellen über Rezeptor-vermittelte Endocytose aufzunehmen und in das Wirtszellgenom zu integrieren und virale Gene stabil und effizient zu exprimieren, haben diese zu attraktiven Kandidaten für den Transfer von Fremdgenen in Säugetierzellen gemacht.
Die Retroviren sind eine Gruppe einsträngiger RNA-Viren, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, ihre RNA in doppelsträngige DNA in einer transfizierten Zelle durch den Prozess der reversen Transkription umzuwandeln. Die sich ergebende DNA integriert sich dann stabil in die zellulären Chromosome als Provirus und lenken die Synthese von viralen Proteinen. Die Integration hat die Zurückhaltung der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihrer Nachkommen zur Folge. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env, die capsiale Proteine, das Polymerase-Enzym und Hüllbestandteile codieren. Eine Sequenz, die typischerweise stromaufwärts des gag-Gens zu finden ist, bezeichnet als ψ, dient als Signal zur Verpackung des Genoms in den Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungen (LTR) Sequenzen sind an den 5'- und 3'-Enden des Provirus vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancer-Sequenzen und sind ebenfalls zur Integration in das Genom der Wirtszelle erforderlich (Coffin, „Retroviridae and their replication", In: Fields B. N., Knipe D. M. Hgs., Virology. New York: Raven Press, 1990, Seiten 1437-1500).
Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine Nucleinsäure, die ein HO1 codiert, in das virale Genom anstelle bestimmter viraler Sequenzen angeordnet, um einen Virus zu erzeugen, der replikationsdefektiv ist. Um Virionen zu erzeugen, wird eine Verpackungszelllinie, die die gag-, pol- und env-Gene enthält, jedoch ohne das LTR- und die ψ-Komponenten konstruiert. Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine humane cDNA enthält, zusammen mit dem retroviralen LTR und der ψ-Sequenz in diese Zelllinie eingebracht wird (durch Calciumphosphat-Fällung beispielsweise), ermöglicht die ψ-Sequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Teilchen verpackt wird, die dann in Zellkulturmedien abgesondert werden. Die Medien, die rekombinante Retroviren enthalten, werden dann gesammelt, wahlweise konzentriert und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind dazu in der Lage, eine breite Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Die Integration und stabile Expression erfordert die Teilung der Wirtszellen. Jedoch bestehen Hinweise darauf, dass einige der Viren einschließlich HIV- und Lentiviren, dazu in der Lage sind, sich in ruhenden Zellen zu integrieren und exprimiert zu werden.
Die in vivo Transformation von Zellen mit retroviralen Vektoren zeigt eine begrenzte Fähigkeit, retrovirale Vektortiter zu erzeugen, die mehr als 10⁶ infektiöse Einheiten/ml betragen. Obwohl Titer von 10 bis 1000fach höher in in vivo Anwendungen erwünscht sind, ist die Transformation mit retroviralen Vektoren nach wie vor möglich.
Die Kenntnis der genetischen Organisation des Adenovirus, einem 36 kB, linearen und doppelsträngigen DNA-Virus, ermöglicht die Substitution eines großen Teils der adenoviralen DNA durch Fremdsequenzen bis zu 7 kB (Grunhaus und Horwitz, „Adenovirus as cloning vector", Seminar in Virology, 3: 237-252, 1992). Im Gegensatz zu Retroviren hat die Infektion von adenoviraler DNA in Wirtszellen keine chromosomale Integration zur Folge, weil sich die adenovirale DNA in einer episomalen Art und Weise ohne potentielle Gentoxizität repliziert. Ebenfalls sind Adenoviren strukturell stabil, und keine genomische Umordnung wurde nach umfassender Amplifikation nachgewiesen. Adenoviren können tatsächlich alle Epithelzellen unabhängig von ihrem Zellzyklus-Stadium infizieren.
Ein Adenovirus ist insbesondere zur Verwendung eines Gentransfervektor wegen seines mittelgroßen Genoms, der Einfachheit der Manipulation, des hohen Titers, des breiten Zielzellbereichs und der hohen Infektiösität geeignet. Beide Enden des viralen Genoms enthalten 100 bis 200 Basenpaare (Bp) invertierte terminale Wiederholungen (ITRs), die cis-Elemente sind, die für die Replikation und Verpackung der viralen DNA notwendig sind. Die frühen (E) und späten (L) Regionen des Genoms enthalten unterschiedliche Transkriptionseinheiten, die durch Beginn der viralen DNA-Replikation geteilt werden. Die E1-Region (E1A und E1B) codiert Proteine, die zur Regulation der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) hat die Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation zur Folge. Diese Proteine sind in die DNA-Replikation, die späte Genexpression und die Blockierung der Wirtszelle involviert. Die Produkte der späten Gene einschließlich der Mehrzahl der viralen Capsid-Proteine werden nur nach signifikanter Prozessierung eines einzelnen Primärtranskripts exprimiert, das vom Haupt-späten-Promotor (Major Late Promoter = MLP) stammt. Der MLP (befindlich bei 16,8 m.u.) ist während der späten Phase der Infektion besonders effizient und alle mRNAs, die von diesem Promotor abstammen, besitzen eine 5' Tripartite Leader (TL) Sequenz, was diese zu bevorzugten mRANs für die Translation macht.
Im vorliegenden System wird ein rekombinanter Adenovirus aus einer homologen Rekombination zwischen einem Shuttlevektor und einem Provirusvektor erzeugt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren kann Wildtyp-Adenovirus aus diesem Verfahren erzeugt werden. Es ist deswegen entscheidend, einen einzelnen Virus-Klon aus einer individuellen Plaque zu isolieren und seine genomische Struktur zu überprüfen. Die Verwendung des YAC-Systems ist ein alternativer Ansatz für die Erzeugung rekombinanter Adenoviren.
Die Erzeugung und Vermehrung der gegenwärtigen Adenovirus-Vektoren, die replikationsdefizient ist, hängen von einer einzigen Helferzelllinie ab, die als 293 bezeichnet wird, die aus humanen embryonalen Nierenzellen durch Ad4-DNA-Fragmente transformiert wurde und die E1-Proteine konstitutiv exprimiert (Graham et al., „Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus typ 5", J. Gen. Virol., 1977, 36: 59-72). Weil der E3-Bereich aus dem Adenovirus-Genom entbehrlich ist, tragen die gegenwärtigen Adenovirus-Vektoren mit Hilfe von 293 Zellen Fremd-DNA in entweder den E1 den E3 oder beiden Regionen (Graham und Prevec, „Manipulation of adenovirus vector", In: E. J. Murray (Hsg.), Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocol, Clifton, N. J. L Humana Press, 1991, 7: 109-128).
Helferzelllinien können von humanen Zellen wie beispielsweise humanen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen, hämatopoietischen Zellen oder anderen humanen mesenchymalen oder Epithelzellen abgeleitet werden bzw. gewonnen werden. Alternativ können die Helferzellen aus den Zellen anderer Säugetierspezies gewonnen werden, die bezüglich eines humanen Adenovirus permissiv sind. Derartige Zellen schließen beispielsweise Verozellen oder andere mesenchymale oder epithel- Affenembryonenzellen ein. Wie oben festgestellt, ist die bevorzugte Helferzelllinie 293.
Abgesehen von dem Erfordernis, dass der Adenovirus-Vektor replikationsdefektiv ist oder zumindest konditionell defektiv ist, ist die Art des Adenovirus-Vektor nicht für die erfolgreiche Ausübung der Erfindung entscheidend. Der Adenovirus kann irgendeinen von 42 bekannten unterschiedlichen Serotypen oder Untergruppen A bis F aufweisen. Adenovirus Typ 5 von Untergruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditionellen replikationsdefektiven Adenovirus-Vektor zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung zu gewinnen. Dies deswegen, weil Adenovirus Typ 5 ein humaner Adenovirus ist, von dem eine große Menge von biochemischen und genetischen Informationen bekannt ist und historisch für die meisten Konstruktionen verwendet wurde, die einen Adenovirus als Vektor verwenden.
Wie oben festgestellt, ist der typische Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung replikationsdefektiv und wird keine Adenovirus-E1-Region aufweisen. Es wäre somit am bequemsten, die Nucleinsäure, die HO1 codiert, in der Position einzubringen, aus der die E1-codierenden Sequenzen entfernt wurden. Jedoch ist die Position der Einfügung der HO1-codierenden Region innerhalb der Adenovirus-Sequenzen für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Die Nucleinsäure, die eine HO1-Transkriptionseinheit codiert, kann ebenfalls anstelle der deletierten E3-Region oder der E4-Region eingefügt werden, wobei eine Helferzelllinie oder ein Helper-Virus den E4-Defekt komplementiert.
Ein Adenovirus ist einfach zu züchten und einfach zu manipulieren und zeigt in vitro und in vivo einen breiten Wirtsbereich. Diese Gruppe von Viren kann in hohen Titern, beispielsweise 10⁹ bis 10¹¹ Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/ml gewonnen werden, und sie sind in hohem Maße infektiös. Der Lebenszyklus eines Adenovirus bedarf nicht der Integration in das Wirtszellgenom. Die Fremdgene, die durch Adenovirus-Vektoren geliefert werden, sind episomal und weisen deswegen eine geringe Gentoxizität gegenüber Wirtszellen auf. Keine Nebenwirkungen wurden in Studien mit einer Vaccinierung mit Wildtyp-Adenoviren berichtet, was ihre Sicherheit und therapeutisches Potential als in vivo Gentransfervektoren demonstriert.
Adenovirus-Vektoren wurden in der eukaryontischen Genexpression verwendet (Levrero et al., „Defective and nondefective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo", Gene 1991, 101: 195-202; Gomez-Foix et al., „Adenovirus-mediated transfer of the muscle glycogen phosphorylase gene into hepatocytes confers altered regulation of glycogen", J. Biol. Chem. 1992, 267: 25129-25134). Kürzlich legten Tierstudien nahe, dass rekombinante Adenoviren zur Gentherapie verwendet werden könnten (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, „Gene transfer into animals: the promise of adenovirus", S. 51-61, In: Human Gene Transfer, Hgs., O. Cohen-Haguenauer und M. Boiron, Editions John Libbey Eurotex, Frankreich, 1991; Stratford-Perricaudet et al., „Evaluation of the transfer and expression in mice on an enzyme-encoding gene using a human adenovirus vector", Hum. Gene Ther., 1990, 1: 241-256; Rich et al., „Development and analysis of recombinant adenoviruses for gene therapy of cystic fibrosis", Hum. Gene Ther., 1993, 4: 461-476).
Weitere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vektoren, die von Viren wie beispielsweise Vaccinia-Viren abgeleitet sind (Ridgeway, „Mammalian expression vectors", In: Rodriguez R. L., Denhardt D. T. Hgs., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth, Seiten 467-492, 1988; Baichwal und Sugden, „Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes", In. Kucherlapati R., Hsg., Gene transfer. New York: Plenum Press, Seiten 117-148, 1986; Coupar et al., „A general method for the construction of recombinante vaccinia virus expressing multiple foreign genes", Gene, 68: 1-10, 1988), Adeno-assoziierte Viren (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat und Muzycska", Use of adenoassociated virus as a mammalian DNA cloning vector: Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells", Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81: 6466-6470) und Herpesviren wurden verwendet. Sie eröffnen mehrere attraktive Merkmale für verschiedene Säugetierzellen (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., „Synthesis of hepadinavirus particles that contain replication-defective duck hepatitis B virus genomes in cultured HuH7 cells", J. Virol., 1990, 64: 642-650; Friedmann, „Progress toward human gene therapy", Science, 1989, 244: 1275-1281). Replikationsdefektive Vektoren, abgeleitet von Papillomaviren, Parvoviren, Lentiviren etc. können ebenfalls verwendet werden.
Verfahren zur Genübertragung
Um eine Expression der HO1-Konstrukte zu bewirken, muss das Expressionskonstrukt in eine Zelle geliefert werden. Diese Lieferung bzw. Transport kann in vitro als In-Labor-Verfahren zur Transformierung von Zelllinien erreicht werden, oder in vivo oder ex vivo, wie bei der Behandlung bestimmter Erkrankungszustände. Der bevorzugte Mechanismus zum Transport erfolgt über die in vivo Abgabe eines viralen Vektors, vorzugsweise eines adenoviralen Vektors.
Virale Vektoren
Die Abgabe und der Eintritt von rekombinantem Material in Zielzellen wird durch Verwendung von Vektoren erleichtert. DNA kann direkt auf somatische Zielzellen durch virale Vektoren übertragen werden, wie beispielsweise Retroviren und Adenoviren, und durch nicht-virale Methoden, wie beispielsweise kationische Liposomen, Liposom-Virus-Konjugate und Polymere.
Viren infizieren natürlicherweise Säugetierzellen und bringen ihre virale DNA ein, um den Biosyntheseweg des Wirtes zur Erzeugung viraler DNA, RNA und Protein umzuwandeln. Molekularbiologen waren dazu in der Lage, diese Viren so zu modifizieren, dass sie Fremd-DNA an die Zielzelle liefern, sich jedoch in der Wirtszelle nicht replizieren können, noch virale Proteine exprimieren, die zur Verkapselung notwendig sind. Im Allgemeinen wurden Frühreaktions-Virussequenzen, die in die virale Transkription, Translokation oder Capsid-Synthese involviert sind, aus dem Virusgenom entfernt und wurden durch das Fremd-Gen von Interesse ersetzt.
Deswegen können sich die rekombinanten Viren nur in spezifischen Verpackungszelllinien vermehren, die die deletierten viralen Proteine exprimieren. Replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und adenovirale Konjugate werden nunmehr in Gentransfertechniken verwendet.
Retroviren sind RNA-Viren, die eine Vektorintegration in das Wirtsgenom zur Expression des Transgenes erfordern, was ihre Verwendung auf sich teilende Zellen beschränkt. Weil der größte Teil der vaskulären und myokardialen zellulären Bestandteile nicht-replizierende Zellen sind, sind Retroviren im kardiovaskulären Gentransfer von eingeschränkter Anwendbarkeit. Zusätzlich kann die Integration an zufallsbedingten Orten zu einer Insertions- Mutagenese und -Transformation führen. Es wurde bisher jedoch nicht von Kurz- oder Langzeittoxizität berichtet, die mit ihrer Verwendung in humanen Gentherapie-Versuchen assoziiert waren. Ein Retrovirus-vermittelter Gentransfer wurde für den Zell-vermittelten Gentransfer unter Verwendung von Endothelzellen und für den direkten Gentransfer in Schweine-Arterien verwendet. Die Langzeit-, Hoch-Niveauexpression macht retrovirale Vektoren insbesondere zum ex vivo Zell-vermittelten Gentransfer ideal.
Beim Zell-vermittelten Gentransfer können Endothelzellen oder vaskuläre glatte Muskelzellen isoliert, expandiert und im Labor transduziert werden und in vivo auf eine Arterie erneut ausgebracht werden. Die Technik des ex vivo Gentransfers ist jedoch ziemlich mühsam, weil sie eine Zellexpansion erfordert. Jedoch kann der ex vivo Gentransfer von Endothelzellen und glatten Muskelzellen bei der Beimpfung von Stents, Transplantaten oder verletzten Arterien während vaskulärer Verfahren zur Behandlung thrombotischer Störungen oder eine Transplantat-Hyperplasie von Nutzen sein.
Rekombinant entkernte Lentiviren können einen attraktive Alternative zu Retroviren darstellen. Lentiviren waren nicht in irgendeine Malignität verwickelt und, im Gegensatz zu retroviral basierten Vektorsystemen, wurde gezeigt, dass humane, Affen- und bovine Immundefizientvirus-(HIV, BIV, SIV)-Vektorsysteme dazu geeignet sind, eine stabilen Gentransfer in terminalen differenzierten Neuronen und Makrophagen in Kultur zu vermitteln. In vivo wird eine Transgen-Expression für bis zu 5 Monaten in Leber-, Muskel- und Retina-Gewebe und im Gehirn von immunkompetenten Ratten in vivo nachgewiesen und scheint keine Immunreaktion oder lokale Entzündung hervorzurufen, was eine wiederholte Virusgabe erlaubt.
Rekombinante Adenoviren transfizieren effizient die proliferierenden und nicht-proliferierenden Zellen, es fehlt ihnen jedoch die Mutagenität, weil das transgene Genom nicht in das Wirtschromosom integriert wird, sondern episomal bleibt. Deletionen von E1A-, E1B-, E2- und E3-Regionen des Virusgenoms verhindern die Virus-Replikation in transfizierten Zellen, reduzieren die Expression von Frühreaktionvirus-Proteinen und begrenzen daher zelluläre Entzündungen. Rekombinante Adenoviren wurden erfolgreich zum in vivo Gentransfer in Carotis- und Jugularvenen, Ratten- und Kaninchen-Myocard und Kaninchen-Peripherarterien verwendet. Der in vivo Adenovirus-vermittelte Gentransfer unter Verwendung von biologisch aktiven Genprodukten zeigte ebenfalls Effekte in vaskulären Erkrankungen. Weil die Immunogenität bei adenoviralen Vektoren begrenzt bleibt, können adenovirale Vektoren, die bezüglich des beinahe gesamten adenoviralen Genoms entkernt wurden, sich bei der Umgehung der schädlichen Immunreaktion vorteilhaft erweisen.
Rekombinante adenoassoziierte Viren (rAAV) sind vielversprechende Vektoren, die die Möglichkeit eröffnen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren, was eine stabile transgene Expression und ein Fehlen einer Immunogenität aufgrund des Fehlens von viralen Genen im Vektor, der Oberflächenproteine exprimiert zur Folge hat. rAAV-Vektoren sind im US-Patent Nr. 5139941 beschrieben. rAAV wurde bis jetzt nicht mit einer Erkrankung in irgendeinem Wirt in Beziehung gebracht und war nicht mit Malignitäten trotz der Integration des Transgens in das Wirtsgenom assoziiert. rAAV integriert virale und transgene DNA vorzugsweise, jedoch nicht ausschließlich, am Chromosom 19q-Ort. Adenoassoziierte Viren sind nicht zu einer Replikation in der Lage und hängen von einer Co-Infektion mit Adenoviren oder einem Herpesvirus zur Replikation ab. Eine Langzeitexpression von β-Galaktosidase und Tyrosinhydroxylase in vivo wurde in nicht-teilenden Neuronen im Ratten-CNS durch rAAV erreicht, und eine intravenöse Abgabe von rAAV, das humanen Blutgerinnungsfaktor IX codierte, hatte eine In-Transduktion von 3 % aller Hepatocyten über einen Beobachtungszeitraum von 5 Minuten zur Folge. Auch hat eine intraluminale und periadventitiale vaskuläre Abgabe von rAAV in artheriosklerotischen Carotis-Arterien von Cynomolgus-Affen eine ineffiziente transgene Expression zur Folge. Jedoch ist im Gegensatz zu Retroviren und Adenoviren die transgene Expression in erster Linie in adventitialen Endothelzellen von Mikrogefäßen zu finden.
Weitere virale Vektoren, die zur Gentherapie verwendet werden können, schließen Herpes simplex Viren (U.S. Pat. No. 5,288,641) und Cytomegalieviren (Miller 1992) ein.
Nicht-virale Vektoren
Wegen Sicherheitsbedenken bezüglich viraler Vektoren entstand ein Interesse an der Entwicklung eines synthetischen Transportsystems, das die infektiösen Komplikationen vermeidet, die von der ersten Generation viraler Vektoren gezeigt wurden. Ein nicht-viraler Gentransfer kann durch Mikroinjektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Liposomen Teilchen-vermittelten Gentransfer (d. h. die Einbringung von DNA-beschichteten Teilchen) durchgeführt werden.
Die üblichsten nicht-viralen Gentransfer-Vektoren sind DNA-Liposomen. Kationische Liposomen kondensieren und fangen die DNA durch elektrostatische Wechselwirkung ein. Sie werden durch Beschallung hergestellt und bleiben in wässriger Lösung für Monate stabil. Der positiv geladene Liposomenkomplex fusioniert mit der negativ geladenen Zelloberfläche, und setzt so die DNA in das Cytoplasma von Zielzellen frei, und umgeht das lysosomale Kompartiment und einen Abbau durch das Serum. Es wird postuliert, dass Plasmid-DNA anschließend in den Kern als Episom eingebaut wird. Das relativ sichere Profil der Liposome, das Fehlen der Vektorgröße oder Einschränkungen der Zielzelle ebenso wie die relative Einfachheit der Liposomen-DNA-Komplexzubereitung favorisiert diese Gentransfertechnik.
Präklinische Studien unter Verwendung unterschiedlicher Formen dieser Lipide (DOTMA, DC-Chol, DMRIE und DLRIE) haben sich für die effiziente in vivo Transfektion als viel versprechend erwiesen. Eine Lipofektion-vermittelter Gentransfer unter Verwendung entweder Katheter-basierter Abgabe oder direkter Injektion hat die ortsspezifische Expression von fremden rekombinanten Genen in vaskulären endothelen und glatten Muskelzellen zur Folge und verändert die Biologie der Gefäßwand. Kationische Liposomen werden in vivo gut toleriert und induzieren keine biochemischen, hämodynamischen oder kardialen Intoxikationen.
Zusätzliche Vorteile der Lipidchemie sind die Entwicklung neuerer Generationen kationischer Liposomen, die eine höhere Transfektion mit minimaler Toxizität ermöglichen. Die Transfektionseffizienz und Spezifität der Lipofektion kann weiter durch Koppeln von Liganden oder viralen Teilchen (Ad, HVJ, VSVG) an die Liposomen gefördert werden. Insbesondere wurden HVJ-beschichtete Liposomen erfolgreich dazu verwendet, venöse Bypass-Transplantate ex vivo und in vivo zu transduzieren.
In bestimmten Ausführungsformen kann Plasmid-DNA oder -RNA direkt in das Gewebe wie beispielsweise Skelettmuskel oder Myokard injiziert werden. In weiteren Ausführungsformen werden Antisens-Oligonucleotide zur Gentherapie verwendet (Morishita et al., 1993). Antisens-Oligonucleotide erfordern keinen Vektor zur Zelltransduktion und können direkt in das Zielgewebe injiziert werden. Antisens-Oligonucleotide sind kurze DNA-Sequenzen, die zu der RNA-Message von Interesse komplementär sind, die chemisch modifiziert sind, so dass sie einem Nuclease-Abbau widerstehen. Das Oligonucleotid kann am 5'-Ende modifiziert sein, um einen Nuclease-Abbau zu vermeiden, oder kann aus Ribonucleotid-Basen bestehen, die an das Peptid-Grundgerüst gebunden sind (Proteinnucleinsäure).
Verschiedene Tier- und Zellkulturstudien haben gezeigt, dass Antisens-Oligonucleotide dazu in der Lage sind, die intrazelluläre Expression von Faktoren effizient zu modifizieren, die in die Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen und Endothelzellen involviert sind, einschließlich durch Verwendung von Antisens-Oligonucleotiden gegen c-myc, c-myb, cdc2 und PCNA. Die Nucleotidsequenz hybridisiert an Target-RNA, was eine Translation von RNA vermeidet, zielt auf die Botschaft zum Abbau durch Ribonuclease H ab und stört die cytosolische Translokation.
Gentransfer im kardiovaskulären System
Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird eine Gentherapie dazu verwendet, die Zellproliferation zu behandeln oder dieser vorzubeugen. Vorzugsweise wird eine vaskuläre Zellproliferation wie diejenige, die mit einer Restenose oder Arteriosklerose verbunden ist, unter Verwendung einer Gentherapie vermieden. Es wird ins Auge gefasst, dass ein Gentherapie-Vektor oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem Tiermodell getestet werden können. Studien in Tiermodellen kardiovaskulärer Erkrankungen haben demonstriert, dass Transgene in hohen Konzentrationen an lokalen Orten im Gefäßsystem exprimiert werden können.
Lokale Abgabe an das Gefäßsystem
Ein attraktives Merkmal des kardiovaskulären Gentransfers besteht darin, dass rekombinante Gene an lokale Orte im Gefäßsystem durch eine medizinische Vorrichtung geliefert werden können. Medizinische Vorrichtungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen bekannte Vorrichtungen zur lokalisierten Abgabe therapeutischer Mittel ein. Derartige Vorrichtungen schließen beispielsweise Katheter wie beispielsweise Injektionskatheter, Ballonkatheter, Doppelballonkatheter, mikroporöse Ballonkatheter, Kanalballonkatheter, Infusionskatheter, Perfusionskatheter etc. ein, die beispielsweise mit dem therapeutischen Mittel beschichtet sind oder durch die die Mittel verabreicht werden können; Nadelinjektionsvorrichtungen wie beispielsweise hypoderme Nadeln und Nadelinjektionskatheter, nadellose Injektionsvorrichtungen wie beispielsweise Jet-Injektoren; beschichtete Stents, gegabelte Stents, Gefäßtransplantate, Stent-Transplantate etc. ein; und beschichtete vaso-okklusive Vorrichtungen wie beispielsweise Drahtrollen.
Beispielhafte Vorrichtungen sind in US-Patent Nr. 5935114; 5908413; 5792105; 5693014; 5674192; 5876445; 5913894; 5,868719; 5851228; 5843089; 5800519; 5800508; 5800391; 5354308; 5755722; 5733303; 5866561; 5857998; 5843003; und 5933145 beschrieben; der Gesamtinhalt hiervon wird durch Bezugnahme mit aufgenommen. Beispielhafte Stents, die kommerziell erhältlich sind und die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen RADIUS^TM (Scimed Life Systems, Inc.), SYMPHONY^® (Boston Scientific Corporation), Wallstent (Schneider Inc.), the Precedent II^TM (Boston Scientific Corporation) und NIR^TM (Medinol Inc.) ein. Solche Vorrichtungen werden an Zielorte innerhalb des Körpers durch bekannte Techniken abgegeben und/oder implantiert.
Der Doppelballonkatheter war der anfängliche Katheter, der in Tiermodellstudien verwendet wurde, und war nützlich, um die Grundprinzipien des Gentransfer zu demonstrieren. Der Katheter besteht aus zwei Ballons, die ungefähr 1,5 cm voneinander mit einem Innenschutzraum angeordnet sind. Der gentechnische Vektor wird in das isolierte arterielle Segment zwischen den Ballons eingeträufelt. Eine adenoviral vermittelte rekombinante Genexpression wird in Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Adventitialzellen für mehrere Wochen im Anschluss an die Infektion nachgewiesen und wird stromabwärts des arteriellen Segments oder in anderen Geweben durch PCR nicht nachgewiesen. Eine retroviral vermittelte Genexpression kann für bis zu 6 Monate nachgewiesen werden. Ein Nachteil dieses Katheters ist die Möglichkeit einer distalen Ischämie aufgrund der Okklusion des Blutstroms. Alternative Abgabevorrichtungen ermöglichen eine Strömung distal zum isolierten Segment, was eine verlängerte Einträufelzeitspanne ohne Verschlechterung der distalen Perfusion ermöglicht.
Poröse und mikroporöse Ballons infundieren den Vektor direkt in die juxtapositionierte Arterienwand durch kleine Poren im Katheter. Die Tiefe der Abgabe ist direkt mit dem Perfusionsdruck in Beziehung. Die Kanalballon-Katheter kombinieren zwei getrennte aufblasbare Kompartimente für die Ballon-Angioplastie und Arzneistoffinfusion und ermöglichen eine getrennte Kontrolle des Ballonaufblas-Drucks zur Positionierung und einen Arzneistoffinfusions-Druck. Ein Hydrogel-beschichteter Ballonkatheter weist eine hydrophile Polyacrylsäure-Polymerbeschichtung des Ballons auf. Dieses Polymer absorbiert die DNA-Suspension und, wenn der Ballon aufgeblasen wird, wird die DNA-Beschichtung gegen die Gefäßwand gedrückt. Der iontophoretische Ballon verwendet einen lokalen Strom zwischen dem Ballon und der Haut des Subjektes, um die negativ geladene DNA in die Arterienwand zu verbringen.
Weitere Abgabevorrichtungen schließen Stents ein, die mit einem DNA-imprägnierten Polymer oder Zellen beschichtet sind, die eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfassen (ex vivo Gentransfer) in arteriellen und venösen Transplantaten. Weiterhin kann das Gewebe selektiv zur Gentherapie durch Verwendung von gewebsspezifischen Promotoren und Enhancern zielgerichtet angewendet werden.
Myokardiale Abgabe
Im Kontext der vorliegenden Erfindung können Nucleinsäure- oder Proteinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in das Myokard eingebracht werden. Der myokardiale Gentransfer erfordert eine Transfektion von terminal differenzierten Myocyten. Adenoviraler Gentransfer durch intrakoronare oder intramyokardiale Abgabe hat eine vorübergehende Genexpression für mehrere Wochen in einer begrenzten Anzahl von Zellen zur Folge. Es wurde gezeigt, dass adenoassoziierte Virusvektoren stabil eine Transgen-Expression bis zu 50 % der murinen, Ratten- und porcinen Kardiomyocyten nach ex vivo intrakoronarer Infusion und myokardialen Injektionen für zumindest 6 Monate induzieren. Diese Vektoren können zur Genabgabe zur Behandlung humaner myokardialer Erkrankungen nützlich sein.
Vaskuläre Erkrankungen
Viele vaskuläre Erkrankungen sind durch Abnormalitäten der Zellproliferation gekennzeichnet. Ein Ansatz für Therapien besteht darin, Gene zu exprimieren, die die Zellproliferation innerhalb von vaskulären Verletzungen bzw. Läsionen hemmen, beispielsweise nach einer Angioplastie oder in einem Bypass-Transplantat. Die meisten Ansätze regulieren den Zellzyklus in vaskulären glatten Muskel-, Endothel- oder Makrophagen-Zellen.
Ein Fortschreiten durch den Zellzyklus wird durch die Assemblierung und Phosphorylierung von Cyclin/Cyclin-abhängigen Kinasekomplexen (CDKs) reguliert. Endogene Inhibitoren der Cyclin-CDKs, genannt die Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren (CKIs), haben einen anhaltenden Zellzyklus und eine Beendigung der Zellproliferation zur Folge.
Genetische Strategien zur Beendigung der vaskulären Läsions-Bildung haben sich auf regulatorische Genprodukte fokussiert, die mit der DNA-Synthese, Zellzyklus-Progression und Zelllebensfähigkeit interferieren. Genprodukte, die mit der DNA- und RNA-Replikation interferieren, wurden bezüglich ihrer Kapazität zur Blockierung der Glatten-Muskelzell-Proliferation und zur Reduzierung der vaskulären Läsionsbildung evaluiert. Prodrug-Enzymtherapien unter Verwendung von Thymidinkinase oder Cytosindeaminase stellen eine Form einer lokalen Therapie bereit, bei der ein Enzym lokal exprimiert wird, das ein Prodrug in seine aktive Form umwandelt. Ein Gentransfer von der DNA, die diese umwandelnden Enzyme codiert, zur verletzten Arterienwand, kombiniert mit systemischen Prodrug-Verabreichungen, erzeugt hohe Konzentrationen des Wachstums inhibitorischer Arzneistoffe im Zielgewebe. Die therapeutische Wirkung der Transgen-Expression kann durch Verabreichung des Prodrugs reguliert und kann unabhängig vom Gentransfer initiiert werden.
Die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-tk) wandelt ein inertes Nucleosid-Analogon, nämlich Ganciclovir, in eine phosphorylierte, toxische Form in transduzierten Zellen um. Sein anschließender Einbau in die Wirts-DNA induziert einen Kettenabbruch und Zelltod in sich teilenden Zellen, während sich nicht-teilende Zellen unbeeinträchtigt bleiben. Eine lokale Abgabe von rekombinantem Adenovirus, der für HSV-tk codiert, zum Zeitpunkt der Ballon-Verletzung und einer systemischen Verabreichung von Ganciclovir hemmte die Glatte-Muskelzell-Proliferation in vivo und senkte die intimale Bildung in Ballon-verletzten Schweine- und Rattenarterien und arteriosklerotischen Kaninchen-Arterien. Eine ähnliche Reduktion der neointimalen Hyperplasie wurde in arteriellen Interpositionstransplantaten beobachtet, die HSV-tk im Kaninchen überexprimieren. Die Cytosin-Deaminase (CD) katalysiert die hydrolytische Desaminierung von nicht-toxischem Cytosin und 5-Fluorocytosin (5-FC) zu Uracil und 5-Fluoruracil, das die Thymidilat-Synthase hemmt und daher die DNA- und RNA-Synthese. In menschlichen und Kaninchen primären glatten Muskelzellen induziert CD/5-FC keine signifikante Nekrose oder Apoptose, sondern hat cytostatische Wirkungen auf glatte Gefäßmuskelzellen zur Folge. Der CD-Gentransfer im femoralen Verletzungs-Kaninchen-Modell, gefolgt von einer systemischen 5-FC-Behandlung, hatte die Abnahme des Flächenverhältnisses von Intima zu Media zur Folge, vergleichbar zur Wirksamkeit von HSV-tk-Ganciclovir in einem Ratten- oder Schweinemodell einer Gefäßverletzung.
Der Fas/FasL Tot-Signalgebungsweg vermittelt die zelluläre Immunocytotoxizität in aktivierten Lymphocyten. Die Bindung des Fas-Rezeptors an FasL aktiviert den Caspaseweg, der zur Apoptose führt. FasL wird in intimalen glatten Muskelzellen und immunkompetenten Zellen in arteriosklerotischem Plaque exprimiert. Studien unter Verwendung von Adenovirus vermitteltem Gentransfer von FasL an Ballon-verletzten Ratten-Carotisarterien demonstrierten eine Attenuierung der T-Zell-Extravasation in FasL-exprimierenden Arterien im Gegensatz zu fingierten Virus-behandelten Arterien, begleitet durch eine 60%ige Reduktion der Neointima-Bildung (Intima/Media-Flächenverhältnis). FasL kann dazu dienen, das Gefäß vor einer Leukocyten-Extravasation an den subendothelialen Raum während der Arterienverletzung durch Induzieren einer T-Lymphocyt-Apoptose zu schützen.
Ein Targeting von Zellzyklus-regulatorischen Proteinen fördert die Hemmung der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. Ein Anhalten des Zellzyklus verhindert die vsmc-Proliferation und Migration und eine Endothel-Dysfunktion, gezeigt durch eine verbesserte Vasoreaktivität und NO-Produktion, was das Gefäß gegenüber einer entzündlichen Infiltration und Freien-Radikal-Bildung weniger empfindlich macht.
Ein Fortschreiten durch den Zellzyklus wird durch Assemblierung und Disassemblierung der unterschiedlichen Cyclin-Cyclin-abhängigen Kinasekomplexe kontrolliert. Diese Komplexe phosphorylieren Retinoblastom-Protein, was zur Freisetzung der abgespaltenen Transkriptionsfaktoren, E2F und E1f1 führt. Die Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren (CKIs) modulieren die enzymatische Aktivität von Cyclin/CDK-Komplexen, die für eine G₁-Progression notwendig sind. In vivo reduziert eine Ad-p21-Infektion von porcinen Iliofemoralen- und Ratten-Carotisarterien im Anschluss an eine Ballon-Verletzung eine BrdU-Inkorporation um 35 % und das I/M-Flächenverhältnis um 37 %. Desgleichen hemmte eine Gax-Homöobox-Genüberexpression als ein stromaufwärts gelegener Regulator von p21 in dem Ratten-Carotisarterien-Verletzungsmodell eine neointimale Bildung und eine luminale Verengung um 59 bzw. 56 Prozent. Eine Adenovirus-vermittelte Überexpression von p27 in Ballon-verletzten Ratten- und Schweinearterien attenuierte die intimale Läsionsbildung signifikant.
Die Wirkungen vieler Cyclin-CDK- und -CK1-Interaktionen werden durch ihre Wirkung auf den Phosphorylierungsstatus vermittelt und deswegen die Aktivität von Retinoblastom-Genprodukt (Rb). Rb hemmt die Zellzyklusprogression von G₁ in die S-Phase durch Abtrennen und Inaktivieren einer Reihe von zellulären Transkriptionsfaktoren. Eine lokalisierte Infektion von Schweine-Endothelzellen und vsmc mit Ad-ΔRb und einem unphosphorylierbaren, konstitutiv aktiven Rb hat eine signifikante Reduktion der Zellproliferation und [³H]Thymidin-Inkorporation zur Folge, während die Zellen lebensfähig bleiben. In der Ratten-Carotisarterien-Verletzung ebenso wie im Schweine-Ballonverletzungsmodell hat die ΔRb-Expression eine 42-47%ige Abnahme des Neointima/Media-Flächenverhältnisses bezüglich zu Kontrollarterien zur Folge.
Alternativ reduziert die Hemmung des Zellzyklus in humanen Venentransplantaten mit einer ex vivo Behandlung von E2F Köder-Oligodesoxynucleotid nicht nur die Transplantat-Empfindlichkeit gegenüber einer Arteriosklerose, sondern hemmt auch die mediale Hypertrophie, die das Transplantat gegenüber einem erhöhten hämodynamischen Stress widerstandsfähiger macht und verbessert die Venentransplantat-Verweilzeit.
Metalloproteinasen bauen die extrazelluläre Matrix ab, fördern die Wachstumsfaktorfreisetzung und die Zellaktivierung und sind deswegen für die Zellmigration essentiell. Eine Überexpression von Gewebsinhibitor durch Metalloproteinasen (TIMP) hemmte ebenfalls das invasive und metastatische Verhalten von Tumorzellen. Die Wirkungen von TIMP-Proteinexpressionen wurden in einem Organkulturmodell der Neointima-Bildung evaluiert, das sich für eine Untersuchung der smc-Migration eher als für die Proliferation eignet. Eine Überexpression von TIMPi und 2 reduzierten die Neointima-Bildung und neointimale Zellzahlen um jeweils 54 bis 79 % und 71 %, veränderten jedoch die smc-Proliferation und Lebensfähigkeit nicht. Diese Daten bestätigen die Bedeutung von Metalloproteinasen und der smc-Migration für die Entwicklung der neointimalen Hyperplasie und legen nahe, dass ein kombinierter anti-proliferativer und anti-migratorischer Gentherapieansatz die Läsionsreduktion optimieren kann.
Weitere Verfahren haben eine Rekonstitution von Endothel-abgeleiteten Hemmsignalen zum Ziel, die eine Leukocyten-Adhäsion und eine Blutplättchen-Aggregation verhindern, den lokalen Muskeltonus relaxieren bzw. entspannen und die vsmc-Proliferation durch Gentransfer von iNOS oder eNOS hemmen. Es zeigte sich, dass der NOS-Weg eine signifikante Rolle in mehreren kardiovaskulären Störungen spielt, einschließlich der Arteriosklerose, der systemischen und pulmonaren Hypertension, der Ischämie-Reperfusion, der Hypercholesterinämie und des Vasospasmus. Eine L-Argin-Zuführung, iNOS- und eNOS-Gentransfer und verschiedener NO-Donoren haben eine erfolgreiche Reduktion der Läsionsbildung in hypercholesterinämischen Kaninchen und eine neointimale Hyperplasie im Anschluss an ein arterielles Ballon-Verletzungsmodell in Ratten und Schweinen gezeigt.
Somit demonstrieren Studien bei verschiedenen Tiermodellen, dass genetische Ansätze machbar und in der Beschränkung der Zellproliferation, Migration und extrazellulären Matrixablagerung effektiv sind. Die HO1-codierenden Nucleinsäuren sind insbesondere in Verfahren zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung von Nutzen. Beispielsweise kann ein Nucleinsäure, die HO1 codiert, lokal in eine verletzte Arterie eingebracht werden, um eine Restinose zu verhindern.
Eine Gentherapie unter Verwendung einer Nucleinsäure im Kontext der vorliegenden Erfindung kann mit anderen Gen- oder Nicht-Gentherapien zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung kombiniert werden. Potentielle Molekül-Targets für eine kardiovaskuläre Erkrankung sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5 Potentielle Molekül-Targets für eine kardiovaskuläre Erkrankung
HO1-Expressionskonstrukte in Kombination mit anderen Therapien
Die Mittel der vorliegenden Erfindung können mit anderen Mitteln zur Behandlung einer Zellproliferation kombiniert werden. Beispielsweise können andere Gene als Thymidinkinase, Cytosin-Deaminase, p21, p27 und p53 und Kombinationen hiervon gleichzeitig in Zellen transformiert und exprimiert werden. Beispielsweise hatten das Herpes-simplex-Thymidinkinase-(HS-tk)-Gen, wenn es an Blutgefäßwände durch Adenovirus-Systeme verabreicht wurden, eine erfolgreiche Abnahme der neointimalen Proliferation, die mit einer Restinose assoziiert ist, zur Folge (Chang et al., Mol. Med., 1995, 172-181). Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird ins Auge gefasst, dass die HO1-Genexpression in ähnlicher Weise in Verbindung mit anderen Gentherapieansätzen verwendet werden könnte. Die Gene können auf einer einzigen Nucleinsäure codiert werden, können jedoch separat transkribiert werden. Alternativ können die Gene operativ verbunden werden, so dass sie co-transkribiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Gene operativ verbunden, um ein Fusionsprotein zu codieren. In anderen Ausführungsformen werden die co-transkribierten Gene durch eine interne Ribosomenbindungsstelle abgetrennt, was es den Proteinen ermöglicht, separat translatiert zu werden. Solche Kombinationstherapien sind in WO 99/03508 beschrieben (hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen).
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichungswege
Wo eine klinische Anwendung eines Expressionskonstruktes, das eine HO1-codierende Nucleinsäure umfasst, ins Auge gefasst wird, wird es notwendig sein, den Komplex als pharmazeutische Zubereitung zuzubereiten, die für die ins Auge gefasste Verabreichung geeignet ist. Im Allgemeinen wird dies die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen, die im Wesentlichen frei von Pyrogenen ebenso wie von anderen Verunreinigungen ist, die sich für Menschen oder Tiere als gefährlich herausstellen könnten. Man würde ebenfalls wünschen, geeignete Salze und Puffer zu verwenden, um den Komplex stabil zu halten und die Komplexaufnahme durch Zielzellen zu ermöglichen.
Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine effektive Menge des Expressionskonstruktes und einer Nucleinsäure, gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder wässrigem Medium. Solche Zusammensetzungen können ebenfalls als Inocula bezeichnet werden. Die Sätze „pharmazeutisch oder pharmakologisch verträglich" betreffen molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine allergischen, nachteiligen oder anderen abträglichen Reaktionen erzeugen, wenn sie einem Tier oder einem Mensch wie geeignet verabreicht werden. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antipilzmittel, isotonische und Absorptionsverzögerungs mittel und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt. Insofern ausgenommen, als irgendein konventionelles Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen ins Auge gefasst. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können in die Zusammensetzungen mit eingebracht werden.
Lösungen. der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmazeutisch verträgliche Salze können in Wasser hergestellt werden, die in geeigneter Weise mit einem oberflächenaktiven Stoff vermischt sind, beispielsweise mit Hydroxypropylcellulose. Dispersionen können ebenfalls in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen hiervon und in Ölen hergestellt werden. Unter üblichen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die Expressionskonstrukte und Abgabeträger der vorliegenden Erfindung können klassische pharmazeutische Zubereitungen einschließen. Die Verabreichung therapeutischer Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wird über allgemeine Wege erfolgen, solange das Zielgewebe über diesen Weg verfügbar ist. Vorzugsweise wird die Verabreichung durch intravenöse Injektion oder Katheterabgabe an den Ort der Blutgefäßverletzung erfolgen. Solche Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen verabreicht werden, die physiologisch verträgliche Träger, Puffer oder andere Trägermittel mit einschließen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise in Form injizierbarer Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen verabreicht; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in Flüssigkeiten vor Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Diese Zubereitungen können ebenfalls emulgiert sein. Eine typische Zusammensetzung für einen solchen Zweck umfasst einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Weitere pharmazeutisch verträgliche Träger schließen wässrige Lösungen, nicht-toxische Trägerstoffe, einschließlich Salze, Konservierungsmittel, Puffer und dergleichen ein. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester wie beispielsweise Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Salzlösungen, parenterale Trägerstoffe wie beispielsweise Natriumchlorid, Ringer'sche Dextrose etc. ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoffwiederauffüller ein. Konservierungsmittel schließen antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase ein. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gemäß wohlbekannter Parameter eingestellt.
Kits
Alle die essentiellen Materialien und Reagenzien, die zur Ausübung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, können zusammen in einem Kit zusammengebaut werden. Dies wird im Allgemeinen ausgewählte Expressionskonstrukte umfassen. Ebenfalls eingeschlossen werden können verschiedene Medien zur Replikation der Expressionskonstrukte und Wirtszellen für eine solche Replikation sein. Derartige Kits umfassen getrennte Behälter für jedes individuelle Reagenz.
Wenn die Bestandteile des Kits in ein oder mehreren flüssigen Lösungen bereitgestellt werden, ist die flüssige Lösung vorzugsweise eine wässrige Lösung, wobei eine sterile wässrige Lösung besonders bevorzugt wird. Zur in vivo Verwendung kann das Expressionsprodukt zu einer pharmazeutisch akzeptablen spritzbaren Zusammensetzung formuliert werden.
Die Bestandteile des Kits können ebenfalls in getrockneter oder gefriergetrockneter Form bereitgestellt werden. Wenn Reagenzien oder Bestandteile als getrocknete Form bereitgestellt werden, wird die Rekonstitution im Allgemeinen durch Zusatz eines geeigneten Lösungsmittels erfolgen. Es wird ins Auge gefasst, dass das Lösungsmittel ebenfalls in einem anderen Containerbehältnis bereitgestellt werden kann.
Die Kits der vorliegenden Erfindung schließen ebenfalls typischerweise ein Mittel zur Aufnahme der Vials in einem engen Behältnis zum kommerziellen Verkauf bereit, wie beispielsweise Injektions- oder Spritzgusskunststoffbehälter, in denen die erwünschten Vials enthalten sein können.
Unabhängig von der Anzahl und vom Typ der Behälter können die Kits der Erfindung ebenfalls ein Gerät zur Unterstützung der Injektion/Verabreichung oder zur Anordnung der letztendlichen komplexen Zusammensetzung innerhalb des Körpers eines Tieres umfassen oder mit diesem verpackt sein. Ein solches Gerät kann eine Spritze, ein Katheter oder irgendein medizinisch zugelassenes Abgabemittel oder Vorrichtung sein.
Beispiele
Rekombinante HO1-Expression in Gefäßzellkultur
Replikationsdefiziente Adenoviren, die humanes HO1 (Ad-HO1), Kern-markierte β-Galaktosidase (Ad-ntLacZ) und E1A-defizienten Scheinvirus (ΔE1A-Ad) enthielten, wurden durch homologe Rekombination in 293 Zellen konstruiert. Eine Expression von HO1 im adenoviralen Vektor wurde durch den CMV-Enhancer/Promotor und die bovine Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz reguliert. Rekombinante Virenansätze, die weniger als 1 pfu Wildtyp-Adenovirus pro 1 × 10⁹ pfu rekombinanten Adenovirus enthielten, wurden während der gesamten Verfahren verwendet.
Die rekombinante HO1-Expression wurde in primären Aorta-Schweine-glatten-Gefäßmuskelzellen (vsmc), Schweine-Endothelzellen (ec) und humanen renalen Karzinomzellen (293) unter Verwendung einer Western-Blot-Analyse bestätigt. Signifikante Proteinkonzentrationen konnten in einer Dosis-abhängigen Art und Weise nachgewiesen werden, 48 Stunden nach dem HO1-Gentransfer. Schein-ΔE1A-Viren veränderten die HO1-Expression in Gefäßzellen nicht. Die Transfektionseffizienz in vsmc bei moi 500 und 1000 war jeweils 75 bis 100 %, 48 Stunden nach einer Infektion, wie durch Parallelinfektion mit rekombinanten Adenoviren bestimmt, die für Kern-markiertes LacZ codierten. Steady-state-cGMBP-Konzentrationen wurden um 128 % im Vergleich zu Basis-Konzentrationen erhöht. Die spezifische Hemmung von HO1 durch Zink(II)protoporphyrin IX (ZnPP IX) oder Hemmung von Guanylatcyclase (durch ODQ) normalisierte die cGMP-Erzeugung, wohingegen spezifische Inhibitoren der NOS(L-NAME) oder cAMP (Rp-cAMPS) Signalwege die cGMP-Konzentrationen nicht beeinträchtigten, was darauf hinweist, dass HO1 cGMP durch direktes Aktivieren der Guanylatcyclase durch die CO-Produktion beeinträchtigt.
Die Deletion des HO1-Ortes fördert die Zellproliferation und Progression in G1/S (d. h. entziehen sich dem G1-Zellzyklus-Stopp).
Um die Wirkung von HO1 auf die Zellproliferation unter physiologischeren Bedingungen zu bestimmen, wurde HO1 nullizygote primäre vsmc mit vaskulären Zellen verglichen, die von Wildtyp-Wurfgeschwistern abgeleitet waren. Die Deletion des HO1-Ortes erleichterte/erhöhte/stimulierte das Zellwachstum/Mitogenese und die DNA-Synthese. Die Zellzahl wurde um 80,2 % ± 11,7 72 Stunden nach Restimulation erhöht, wohingegen die [³H]Inkorporation 3,1-fach erhöht wurde. Eine durchflusscytometrische Analyse demonstrierte, dass das Eintreten in die S/G2-Phase in den HO1 null vsmc, verglichen mit den Kontrollen, erleichtert wurde.
Endogenes HO1 spielt eine Rolle im Prozess der arteriellen Umformung nach einer Verletzung
Um die Funktion von HO1 in Reaktion auf einer arterielle Verletzung und Gefäßzellproliferation zu bestimmen, wurde das HO1-Expressionsmuster in der vaskulären Läsionsbildung überprüft. Das Schweinearterienballon-Verletzungsmodell ist ein wohl-etabliertes Modell der humanen vaskulären proliferativen Erkrankung und der Restinose. Iliofemorale Schweine-Arterien wurden unter Verwendung eines Ballonkatheters verletzt und anschließend mit rekombinantem Ad-HO1 oder ΔE1A-Ad (1 × 10¹² Teilchen) unter Verwendung eines Doppel-Ballonkatheters wie kürzlich beschrieben infiziert (Nabel et al., Science. 249: 1285-1288, 1990).
Typischerweise hat eine arterielle Verletzung eine vaskuläre proliferative Läsion innerhalb von zwei bis drei Wochen nach einem chirurgischen Eingriff zur Folge. Mit BrdU-Einbau kann die vsmc-Proliferation in der Gefäßwand bereits zwei Tage nach der Verletzung nachgewiesen werden und ist auf die ersten sieben Tage nach arterieller Reaktion beschränkt. Eine immunhistochemische Analyse ruhender Schweine-Arterien zeigte, dass HO1 anschließend in mittleren vsmc und zu einem geringeren Umfang in Endothelzellen exprimiert wird. Innerhalb von vier Tagen nach einer Ballonverletzung nahm die HO1-Expression ab, wohingegen die Zellproliferation in intimalen und medialen vsmcs zunahm. Zwei Wochen nach einer Verletzung wurde HO1 in hohem Maße in intimalen und mittleren vsmcs exprimiert und korrelierte mit einer Abnahme der Zellproliferation (Tanner et al., Circ. Res., 1997), was nahelegt, dass HO1/CO als ein endogener Inhibitor des vsmc-Wachstums funktioniert. HO1 wurde vorherrschender benachbart den inneren elastischen Lamina exprimiert.
Das temporale und räumliche Expressionsmuster von HO1 nach einer Arterienverletzung in Schweinen stimmt mit dem Expressionsmuster der Zellzyklus-regulatorischen Proteine, p21, p27 und p57 überein (Tanner et al., Circ. Res., 1997), was nahelegt, dass HO1/CO eine Rolle im Stromaufwärts-Transduktionsweg spielen kann, was zur Expression von Cyclinabhängigen Kinaseinhibitoren und daher zum G1/G0-Zellzyklus-Stopp, -Ende und zur Zelldifferenzierung führt. In der Tat wurden untere Regionen der Neointima ebenfalls mit einer geringen vsmc-Mitogenese und Procollagen-Synthese in Verbindung gebracht (Tanner et al., Circ. Res., 1997). Eine Western-Blot-Analyse von Arterien-Homogenaten bestätigte die immunhistologischen Daten. Obwohl Expressionsniveaus zwischen unterschiedlichen Tieren variieren können, ging die HO1-Proteinexpression direkt nach der Arterienverletzung verloren und wurde zwischen 7 und 21 Tagen nach der Verletzung (post injury = pi) wieder nach oben reguliert und korrelierte umgekehrt mit der Zellproliferation.
HO1-Überexpression führt zu einem cGMP-vermittelten G1-Zellzyklusstopp und zu einer Langzeitwachstumshemmung in vaskulären Zellen.
Die Wirkung von HO1 auf die Zellproliferation und Zellzyklusfortschreiten wurde in vsmc und 3T3-Zelllinien bestimmt, die mit Ad-HO1 oder Schein-Virus infiziert wurden. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen in G1/G0 durch Mitogen-Verlust für 24 Stunden angehalten und restimuliert, um erneut zu proliferieren. Keine Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit wurden nach der Virusinfektion und 24-stündigem Serum-Verlust zwischen den Kontroll-(nicht infiziert oder ΔE1A-Ad-infizierten Zellen) und Ad-HO1-infizierten Kulturen beobachtet, wie durch Trypan-Blauausschluss, Anzahl nicht-adhärenter Zellen nach Virusinkubation und Annexin-V-Fluos-unterstützter Durchflusscytometriezellen nach Virusinkubation bestimmt.
In primären vsmc hatte eine HO1-codierende Adenovirusinfektion, jedoch nicht eine ΔE1A-Schein-Adenovirusinfektion, eine Dosis-abhängige Inhibierung der Zellproliferation um jeweils 62,9 %, 86 % und 95,5 % bei moi 250, 500 und 1000 bei 72 Stunden im Anschluss an eine Restimulation zur Folge. Die H³-Thymidin-Inkorporation wurde in HO1-exprimierenden Zellen um 95 % reduziert. Die Wirkung auf die DNA-Synthese konnte durch HO1-Hemmung umgekehrt werden (ZnPP IX), jedoch nicht durch NOS-Hemmung (L-NAME). Die lösliche Guanylatcyclase-(sGC)-Hemmung und die kompetitive Hemmung von cGMP (Rp-8-BrcGMPS) ebenso wie von cAMP (Rp-cAMPS), konnten ebenfalls die H³-Thymidin- Inkorporation unter HO-Überexpression ermöglichen, was nahelegt, dass HO1 die Zellproliferation durch Guanylatcyclase-Aktivierung über eine CO-Produktion attenuiert.
Das erzeugte cGMP kann die Zellproliferation durch Beeinträchtigung der Enzymaktivität von cGMP-abhängigen Kinasen ebenso wie von cAMP-abhängigen Kinasen durch Shedding modulieren. HO1 hemmte die Proliferation aufgrund metabolischer Cytostase nicht, weil die Proteinsynthese durch die adenovirale Infektion nicht beeinträchtigt wurde, wie durch Bradford-Analyse gemessen wurde. Die Wachstumshemmung war mit einer Induktion der p21-Cyclin-abhängigen Kinase assoziiert, regulierte die p27- und p57-Proteinniveaus jedoch nicht nach oben. Eine Propidium-iodid-unterstützte durchflusscytometrische Analyse zeigte, dass die Expression von HO1 eine Dosis-abhängige Akkumulation von Zellen in der G1/G0-Phase des Zellzyklus zur Folge hatte, was einen Stopp in erster Linie im G1/S-Übergang nahelegt. Ähnliche Beobachtungen wurden in der 3T3-Fibroblastenzelllinie vorgenommen.
Transgene Expression in Schweine- und Ratten-iliofemoralen Arterien induziert eine Vasorelaxation
HO wird konstitutiv durch vaskuläre Endothelzellen exprimiert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Basisfreisetzung von CO den lokalen vaskulären Tonus und die Perfusion mehrerer Organsysteme regulieren kann. Daher kann die Dysregulation der CO- und NO-Produktion (Verlust der Produktion oder nicht-ausreichendes Niveau) nach einer Arterien-Ballonverletzung oder einer physikalischen Manipulation während einer Bypass-Operation zu einer ungehinderten arteriellen Vasokonstriktion und zu einem Transplantatversagen führen.
Hier wurden die Effekte auf die transgene HO1-Expression in vivo auf die vaskuläre Konstriktion in isolierten Arterienringen bestimmt. Iliofemorale Schweinearterien wurden mit Ad-HO1 oder ΔE1A-Ad infiziert und nach 4 Tagen sorgfältig gesammelt und für ex vivo Vasoreaktivitätsstudien verwendet. Um eine mögliche Wirkung durch einen NOS-abhängigen Mechanismus auszuschließen, wurden alle Vasoreaktivitätsstudien in Gegenwart von L-NNA durchgeführt, um die NO-Synthase zu hemmen.
Obwohl die Arterien nicht absichtlich während des Gentransfers durch Draht oder Ballon verletzt wurden, konnte keine Endothel-abgeleitete Vasorelaxation durch Acetylcholin-Stimulierung in irgendeiner der Arterien gezeigt werden, was auf eine Endothel-Dysfunktion oder Entblößung hinweist. Die HO1-Expression hatte eine wirkungsvolle Vasorelaxation in Schweine-Gefäßringen zur Folge. Eine maximale isometrische Kraft unter Phenylephrin-Stimulierung wurde 5fach in HO1-infizierten Arterien (80 %) im Vergleich zu scheinbehandelten Arterien reduziert. Der EC₅₀ in HO1-exprimierenden Gefäßen wurde um 0,5 log erhöht im Vergleich zu den Kontrollarterien. Die Hemmung von HO1 durch ZnPP IX stellte den EC₅₀ auf Kontrollniveau wieder her, konnte jedoch die maximale Kontraktionskraft in transfizierten Arterien nur teilweise wiederherstellen (bis 69,5 % des Kontrollwertes).
Die HO1-Transgenexpression in verletzten Arterien reduziert die Neointima-Bildung aufgrund einer Hemmung der vaskulären Zellproliferation signifikant
Um die Wirkung von HO1 auf die Entwicklung einer vaskulären Läsion und vsmc-Proliferation in vivo festzustellen, wurden verletzte Schweinearterien mit Ad-HO1 oder einer ΔE1A-Ad-Kontrolle co-infiziert. Ein gleichzeitiger HO1-Gentransfer hemmte die neointimale Hyperplasiebildung um 75 % bei 1 Woche und 63 % bei 3 Wochen nach der Verletzung. Die durchschnittlichen Umfänge der inneren und der äußeren elastischen Lamina unterschied sich zwischen den experimentellen Gruppen bei Wochen 1 und 3 nicht. Eine histologische Analyse der HE-gefärbten Arterien zeigte keine klaren morphologischen Veränderungen neben der Erhöhung des luminalen Durchmessers aufgrund einer Hemmung der Entwicklung der vaskulären Läsion. Eine DNA-Synthese in vaskulären Zellen wurde signifikant in HO-transgenen Arterien bei 7 Tagen nach dem HO-Gentransfer gehemmt im Vergleich zu ΔE1A-Ad-transfizierten Arterien (t.media; 70 % Abnahme; t.intima: 49 % Abnahme). Diese Beobachtungen bestätigen weiterhin unsere in vitro Daten und stellen eine molekulare Basis für die Hemmung der intimalen Hyperplasie in vivo durch HO1-Überexpression bereit.
Somit kann eine frühe Wiederherstellung der verlorengegangenen HO1/CO-Expression nach einer arteriellen Verletzung und einer endothelialen Dysfunktion das endothelial-abgeleitete Wachstum und migratorische Hemmsignale wiederherstellen und hat eine verbesserte Vasoreaktivität, sogar eine Spasmolyse und eine permanente Reduktion der vaskulären Verletzung durch Hemmung der Glatten-Muskelzell-Proliferation zur Folge.
Verfahren
A. Zellkulturen
primäre-Aorta-Gefäß-glatte Muskelzellen vom Schwein (PAVSMC) wurden aus dem Schweine-Aortabogen durch ein Explantationsverfahren isoliert und in Medium 199 mit 20 % fötalem Rinderserum gezüchtet (Gibco Life Sciences). Die PAVSMC-Kulturen vor Passage 5 wurden während der gesamten Experimente verwendet und wurden in einem subkonfluenten Zustand aufrechterhalten. 3T3-, 293- und A549-Zelllinien wurden vom ATCC (San Diego, CA) bezogen und wie empfohlen kultiviert.
B. Gentargeting
Die humane Häm-Oxygenase 1 wurde durch reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion aus humaner Plazenta-Ganz-RNA (5'-Primer GCGGAGCCAGCACGAACGA (SEQ ID NO:3); 3'-Primer GTGCCCACGGTAAGGAAGC (SEQ ID NO:4)) amplifiziert, was ein 963-bp-Fragment erzeugt, das volle Länge HO1 codiert und durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren sequenziert. Die gesamte zelluläre humane RNA wurde durch Saures-Guanidinium unter Verwendung von Trizol^® (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) extrahiert. Das adenovirale Shuttleplasmid wurde durch Subklonieren von HO1 unter Kontrolle eines Zytomegalievirus-Promotors und des Immediate-early-CMV-Enhancers (pcDNA3, Invitrogen) konstruiert, in einem pAd-Gbl-II-Shuttleplasmid, das die adenovirale 0-1- und die 9-16-Karteneinheit beherbergte. Rekombinante E1A-E3-defiziente Adenoviren, die für humanes HO1 oder eine Kern-markierte β-Galactosidase unter der Kontrolle eines Zytomegalievirus-Promotors codierten wurden durch homologe Rekombination in 293 Zellen (ATCC, Rockville, MD) konstruiert.
Individuelle Plaques wurden isoliert und rekombinante Viren wurden zu zumindest zwei Runden eines Plaque-Assay vermehrt. Viren wurden tatsächlich in Doppelbahn-Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt und die Virustiter wurden durch optische Densitometrie (260 nm) und einem Standardplaque-Assay unter Verwendung von 293 Zellen bestimmt. Die Wildtyp-Kontamination wurde unter Verwendung eines Standardplaque-Assays unter Verwendung von A549-Zellen, quantitativer Polymerasekettenreaktions-Analyse der aufgereinigten Virusansätze und Southern-Blot-Analyse für die genomische E1A-DNA be stimmt. Virenansätze, die weniger als 1 pfu Wildtypadenovirus pro 1 × 10⁹ pfu rekombinanten Adenovirus enthielten, wurden während der gesamten Experimente verwendet.
In den in vitro Experimenten wurden kultivierte 3T3 und PASVSMC mit rekombinantem Adenovirus für 2 Stunden in serumarmen Bedingungen (M199/3 % FCS) inkubiert und anschließend für zumindest 24 Stunden bei normalen Serumkonditionen inkubiert. Um die Zellen in G1/G0 zu synchronisieren, wurden die Zellen dann zu serumfreien Bedingungen (0,2 % BSA) übertragen. Nach 24 Stunden wurde fötales Rinderserum den Kulturen zugesetzt, um das Fortschreiten des Zellzyklus zu starten. In allen Experimenten wurde der moi als Plaquebildende Einheiten pro Zelle berechnet. Die Genstransfereffizienz wurde durch parallele AdntLacZ-Infektion analysiert. Die β-Galactosidase-Expression wurde durch Fixieren der Zellen in 0,5 % Glutaraldehyd und Färben mit X-Gal für 1 Stunde bei 37°C analysiert. Der Prozentsatz infizierter Zellen wurde durch Zählen der gefärbten und gesamten Anzahl von Zellen in 4 zufallsbedingten mikroskopischen Feldern (200 x) bestimmt. Rekombinanter Adenovirus ohne Fremdgen (Ad-ΔE1A) und Puffer wurden als Kontrollen miteingeschlossen.
C. Immunhistochemie
Eine Immunhistochemie wurde auf Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe unter Verwendung einer ABC-Immunoperoxidase (BrdU) und alkalischen Phosphatase-(HO1)-Vorschrift durchgeführt. 5 μm Querschnitte wurden auf Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträgern angeordnet, in Xylol entparaffinisiert und in Ethanol und PBS rehydriert. Primäre Antikörper wurden in PBS mit 1 % BSA und 4 % normalem Ziegenserum verdünnt und auf den Objektträgern für 24 Stunden bei 4°C in einer befeuchteten Kammer angeordnet. Ein polyklonaler Kaninchen-anti-humaner HO1-Antikörper (1:300; Affiniti Research Products, Mamhead Castle, UK) und ein monoklonaler Maus-alkalischer-Phosphatase-konjugierter anti-BrdU-Antikörper (1 U/ml, Boehringer Mannheim, Deutschland) wurden als primäre Antikörper verwendet. Nach mehreren Waschungen mit PBS wurde ein Peroxidase-markiertes Konjugat (Vector Labs) für 30 Minuten bei Raumtemperatur und 3'3-Diaminobenzidin mit Nickelchlorid für 20 min bei Raumtemperatur zugesetzt, um ein dunkelbraunes Reaktionsprodukt zu ergeben.
Für die Peroxidase-Markierung wurde ein biotinylierter Ziegenanti-Kaninchen-sekundärer Antikörper (1:500, Vector Labs) auf den Objektträger für 3 Stunden bei 4°C aufgebracht, gefolgt von einem Avidin-Biotin-Streptavidin-Konjugat (Vector Labs) für 30 min bei Raumtemperatur und ein alkalisches Phosphatase-Substrat (Red KitO, Vector Labs) für 20 min, um ein purpurrotes Reaktionsprodukt zu gewinnen. Methylgrün wurde als Kerngegenfärbung verwendet. Kontrollproben wurden mit aufgereinigtem Kaninchenserum inkubiert und hatten keine unspezifische Färbung zur Folge. Zellpellets von 293-Zellen, transfiziert mit einem HO1-Expressionsvektor oder einem leeren Expressionsvektor, durch Calciumphosphat-Präzipitation, dienten als positive und negative Kontrollen während der Studien. Eine Immunfärbung wurde vollständig durch Präabsorption des Antikörpers mit dem synthetischen HO1-Peptid (1 mg/ml, Affiniti Labs) beseitigt.
D. Immunblot-Analyse der HO1-Expression in PAVSMC
Eine Western-Blot-Analyse wurde an Ganzzelllysaten durch Inkubieren trypsinisierter Zellkulturen oder homogenisierter arterieller Proben in Lyse-Puffer (30 mM Tris pH 7,5, 250 nM NaCl, 2 mM EDTA, 10 % Glycerol, 0,1 % NP40) mit zusätzlichen Protease-Inhibitoren (0,5 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotonin, 10 μ/ml Leupeptin, 1 mM NaF, 0,1 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT) durchgeführt. Zellbruchstücke wurde bei 1600 g_av für 10 min abzentrifugiert und die Proteinkonzentration wurde durch Bradford-Analyse bestimmt. Die Proben wurden für 5 min gekocht und 25 μg Protein pro Bahn wurden auf ein 12%iges denaturierendes SDS-PAGE-Polyacrylamid-Gel aufgebracht. Das Gel wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und mit einem polyklonalen Kaninchenanti-Hämoxygenase-1-Antikörper (Affinity Lab, UK; 1:500), einem sekundären Eselanti-Kaninchen-Meerrettich-markiertem Antikörper (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL; 1:5000) und Supersignal^® (Pierce) als Substrat inkubiert.
E. Zellzyklusfortschritts-Analyse durch Durchflusscytometrie und [³H]Thymidin-Einbau.
Primäre Schweineaorta-SMC wurden zu 2,5 × 10⁵ Zellen pro p100-Platte (10 % Konfluenz) ausgesät. Nach 12 Stunden wurden die VSMC mit rekombinanten Adenoviren für 2 Stunden im M199-Medium infiziert, das 3 % FCS enthielt. Die Medien wurden danach für 24 Stunden mit M199 vertauscht, das 20 % FCS enthielt. Anschließend wurden die Kulturen für 24 Stunden bezüglich Serum abgereichert (M199, 0,2 % BSA), gefolgt von der Wiedereinbringung von FCS zu 20 % VN mit (ohne) den unterschiedlichen Häm-Oxygenaseinhibitoren (ZnPP IX; 10-100 μM), löslichen Guanylylcyclase-Inhibitoren und Monophosphothioat-Inhibitoren ((R)-p-Bromguanosin-3',5'-cyclisches Monophosphorothioat (Tp-8-BrcAMPS, 30 μM), (R)-p-Bromadenosin3',5'-cyclisches Monophosphorothioat (Rp-8-BrcGMPS, 30 μM), Sp-8-(4-Chlorphenylthio)-guanosin3',5'-cyclisches Monophosphorothioat (Sp-8-pCPT-cGMPS, 30 μM), 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3a]chinoxalin-1-on (ODQ, 3 μM), L-N^G-Nitroargininmethylester HCl (L-NAME, NOS-Inhibitor, 1 mM).
Die Zellzahl wurde alle 12 Stunden unter Verwendung eines Hämacytometers bei niedriger Leistungsvergrößerung und Trypanblau 0,4 % (Gibco BRL) bestimmt, um apoptotische und nekrotische Zellen auszuschließen. Keine Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit wurden nach Virusinfektion und 24-stündiger Serumabreicherung zwischen Kontrolle (nicht-infizierte) oder ΔE1A-Ad-infizierte Zellen) und Ad-HO1-infizierten Kulturen beobachtet, wie durch Trypanblau-Ausschluss, die Anzahl nicht-adhärenter Zellen nach Virusinkubation und Annexin-V-Fluos-unterstützte Durchflusscytometrie (Boehringer Mannheim) bestimmt.
Im Anschluss an den G1/G0-Stopp durch Mitogen-Abreicherung wurden die Zellen auf M 199 mit 20 % FCS und [³H]Thymidin (10 mCi/ml, NEN Life Science Products) übertragen. Nach einer Inkubationsperiode von 24 Stunden wurden [³H]Thymidin-behandelte Zellen trypsinisiert und auf Whatmann-Filterpapier übertragen. Die Proben wurden dreimal mit 10 % Trichloressigsäure und zweimal mit 100 % Ethanol gewaschen. Die Filterpapiere wurden auf Szintillationsvials übertragen und durch Szintillationsspektroskopie gemessen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung in Zähler pro Minute von [³H]Thymidin, eingebaut pro Well, dargestellt. Die [³H]Thymidin-Inkorporation wurde bezüglich der Zellanzahl in den unterschiedlichen experimentellen Gruppen standardisiert.
Zur Feststellung der Zellzyklusverteilung wurden die Zellen geerntet, zweimal mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, in eiskaltem 70%igen Ethanol für 20 Minuten fixiert und zweimal in eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden danach mit 1 U DNAsefreier RNase pro 1 × 10⁶ Zellen für 20 min bei 37°C behandelt und in 0,03 mg/ml Propidiumiodid resuspendiert. Der DNA-Gehalt wurde durch Durchflusscytometrie unter Verwendung eines FACScan Modells (Becton Dickinson) untersucht.
F. Zyklische Nucleotid-Immunassays
Die cGMP-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines kommerziellen kompetitiven Immunassays quantifiziert (Biomol, Plymouth Meeting PA, USA) gemäß den Vorschriften des Herstellers. Kurz gesagt, wurden primäre Niedrigpassagen-vsmc-Kulturen in 35-mm-Platten in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen pro Well ausplattiert und mit 20 % FCS für 48 Stunden in M199 gehalten. Die Kulturen wurden mit den rekombinanten Ad-HO1, ΔE1A-Adviren oder PBS infiziert und für 24 Stunden im M199 mit 20 % FCS inkubiert. 30 Minuten für der cGMP-Analyse wurde FePP IX (Hämchlorid, Sigma Chemical, St. Louis, MO) den Kulturen als Substrat zu 5 mM zugesetzt. Zur Analyse des cGMP-Gehaltes wurden die Zellen mit 300 μl 0,1 N HCl nach Entfernung der Medien behandelt. Die Zellsuspension wurde gesammelt, zur Entfernung von Zelldebris bei 600 xg_av abzentrifugiert und auf eine 96-Well-Platte aufgebracht, die mit Ziegenanti-Kaninchen-IgG-Antikörper beschichtet war. Im Assay konkurriert cGMP in den Proben mit alkalischer Phosphatase konjugierten cGMP um die Bindung an einen Kaninchenanti-cGMP-Antikörper während einer zweistündigen Inkubationszeitspanne bei Raumtemperatur. Die Wells werden dann gewaschen, mit Substrat (p-Nitrophenylphosphat) für 1 Stunde inkubiert, was eine gelbe Entfärbung zur Folge hat, und bei 405 nm bei optischer Dichte (Korrektur bei 490 nm) abgelesen. Alle Messungen wurden doppelt durchgeführt.
G. Iliofemorale Ballon-Verletzung am Schwein und in vivo vaskulärer Gentransfer in Schweine und Ratten
Anästhetisierte Yorkshire-Hausschweine (12-15 kg) machten eine sterile chirurgische Exposition der iliofemoralen Arterien durch Laparotomie durch. Ein doppelter Ballonkatheter (CR Bard Inc.) wurde in die iliofemorale Arterie wie kürzlich beschrieben eingefügt (Nabel et al., Science, 249: 1285-1288, 1990). Der proximale Ballon wurde für 5 min auf 500 mm Hg aufgeblasen. Der Zwischenabschnitt zwischen den beiden Ballons ist dann über der verletzten Arterie angeordnet und sowohl der proximale als auch der distale Ballon wird aufgeblasen. 1 cc 1 × 10¹² Teile/ml rekombinante Viren werden in das isolierte arterielle Segment zwischen den Ballons für 20 min bei 150 mm Hg eingeträufelt. Die Tiere werden 4, 7, 14, 21 und 60 Tage später getötet. Die zur Analyse einer vaskulären Zellproliferation bestimmten Schweine (n = 4) empfingen eine intravenöse Injektion von BrdU (25 mg/kg) 1 Stunde vor ihrer Tötung.
Für eine histologische Analyse wurden die Arterien mit 10 % gepuffertem Formalin bei 100 mm Hg perfundiert und in 10 % Formalin für zusätzliche 4 Stunden angeordnet, gefolgt von 70 % Ethanol für 18 Stunden, und wurden in Paraffin eingebettet. Die neointimalen und medialen Querschnittsflächen verletzten Arterien wurden durch computerunterstützte Morphometrie von vier benachbarten Sektionen analysiert, die die vollständige vaskuläre Läsion und den Ort des Gentransfers abdeckten. Eine Analyse wurde durch Forscher durchgeführt, die bezüglich der einzelnen experimentellen Gruppen verblindet waren.
H. Vasoreaktivitätsanalyse
Yorkshire-Schweine wurden einem vaskulären Gentransfer in die iliofemoralen Arterien unter Verwendung von 1 × 10¹² Teilen/ml Ad-HO1 oder ΔE1A-Ad wie beschrieben unterzogen. Bei 4 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff wurden die iliofemoralen Arterien entfernt, unter einem Sezier-Mikroskop in PSS-Puffer gereinigt (NaCl 130; KCl 4,7; KH₂PO₄ 1,18; MgSO₄-7H₂O 1,17; CaCl₂-H₂O 1,6; NaHCO₃ 14,9; Dextrose 5,5; CaNa₂ EDTA 0,03 g/l) in 2 mm lange Ringe geschnitten und in Organkammern, die PSS enthielten, belüftet mit 95 % O₂ und 5 % CO₂, zur Messung der isometrischen Kraft-Entwicklung befestigt. Die endotheliale Integrität wurde durch Exposition der Ringe gegenüber Acetylcholin in Phenylephrinkontrahierten Segmenten getestet. Nach der Equilibration unter einer konstanten passiven Kraft (~6 g) für 60 min wurden die kumulativen Dosis-Reaktionskurven gegenüber Phenylephrin (10^–9–10^–5) in Gegenwart von Indomethacin (10^–5 M) und 1-Nω-Nitroarginin (10^–5 M) aufgezeichnet und unter Verwendung eines MacLab 400 (AD Instruments, Milford, MA) analysiert. Die Organbäder wurden ausgewaschen und man ließ sich die Gewebe entspannen. Ein HO1-spzifizischer Inhibitor (ZnPP IX, 20 μM) wurde danach den Bädern zugefügt und für 1 Stunde inkubiert. De Phenylephrin-Vasokonstriktionskurven wurden erneut unter HO1-Hemmung aufgezeichnet. Die Kontraktionen, die sich zeigten, wurden als Prozentsatz der maximalen Kontraktion oder mNewton der Kraft ausgedrückt.
I. Statistische Analyse
Die experimentellen Daten wurden unter Verwendung einer einseitigen Varianzanalyse (A-NOVA) gefolgt von einem ergänzenden modifizierten Student-T-Test analysiert. Kumulative Phenylephrin Dosis-Wirkungskurven wurden unter Verwendung einer multivariaten Varianzanalyse (MANOVA) analysiert. Unterschiede wurden bei p < 0,05 als signifikant erachtet.

Claims

In vitro-Verfahren zur Hemmung der glatten Gefäßmuskelzell-Proliferation, das das in Berührung Bringen der Zelle mit einer isolierten Nukleinsäure umfasst, die ein Heme-Oxygenase 1-Gen oder eine funktionell äquivalente Mutante hiervon codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein eukaryontischer Expressionsvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor ein viraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der adenovirale Vektor Ad-Heme-Oxygenase 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor, der das Heme-Oxygenase 1-Gen codiert, mit einem nicht-viralen Vektor komplexiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der nicht-virale Vektor ein Liposom ist.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, die ein Heme-Oxygenase 1-Gen oder eine funktionell äquivalente Mutante hiervon codiert, in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung, die durch eine Abnormalität der glatten Gefäßmuskelzell-Proliferation gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament zur Verabreichung durch einen Katheter geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure in einer rekombinanten Zelle enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die rekombinante Zelle eine Endothelzelle ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure ein eukaryontischer Expressionsvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Expressionsvektor ein viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der adenovirale Vektor Ad-Heme-Oxygenase 1 ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Expressionsvektor, der das Heme-Oxygenase 1-Gen codiert, mit einem nicht-viralen Vektor komplexiert wird.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der nicht-virale Vektor ein Liposom ist.
Medizinische Vorrichtung, die eine isolierte Nucleinsäure umfasst, die Heme-Oxygenase 1 codiert, wobei die medizinische Vorrichtung ein Katheter ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Vorrichtung ein Ballonkatheter ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure in einer rekombinanten Zelle enthalten ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei die rekombinante Zelle eine Endothelzelle ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäure ein eukaryontischer Expressionsvektor ist.
Kit, der eine medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22 umfasst.