DE69930285T2

DE69930285T2 - Methode zur goldabscheidung

Info

Publication number: DE69930285T2
Application number: DE69930285T
Authority: DE
Inventors: Erez Braun; Yoav Eichen; Uri Sivan
Original assignee: Eichen Yoav Dr; Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 1998-10-27
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2019-10-28
Also published as: EP1125128A1; CA2348415A1; US7851149B2; AU6485999A; CN1145028C; CN1331800A; JP2002528098A; RU2242005C2; JP4453856B2; EP1125128B1; US20040033626A1; IL126776A0; CA2348415C; US7056748B1; ES2263289T3; DE69930285D1; ATE320002T1; AU759205B2; IL126776A; WO2000025136A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die chemische Abscheidung von Goldmetall auf Substraten.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt verschiedene Methoden und Anwendungen, in welchen Metallsubstanzen auf Substraten abgeschieden werden. In vielen dieser Methoden wird das Metall, das abgeschieden werden soll, in Form eines löslichen Komplexes oder Moleküls, zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, bereitgestellt. Unter geeigneten Bedingungen wird der Komplex oder das Molekül reduziert und scheidet das Metall auf dem Substrat ab.
Um die Abscheidung von Metall aus einer Lösung auf ein Substrat sicher zu stellen, ist es manchmal vorteilhaft, zuerst Nukleationszentren auf dem Substrat bereitzustellen. Derartige Nukleationszentren können, beispielsweise, eine Vielzahl von Metallkomplexen, Clustern oder kleine Metallpartikel sein, die auf der Oberfläche abgeschieden oder an dieser befestigt sind.
Beispiele von Verfahren, die eine Metallabscheidung einschließen, sind eine Vielzahl von Verfahren zur Bildherstellung oder zur Kontraststeigerung bei latenten Bildern für die Fotographie, optische Mikroskopie oder Elektronenmikroskopie. Ein weiteres Beispiel von Labortechniken, worin Metallkomplexe auf einem Substrat abgeschieden werden, ist die Abbildung von Auftrennungsprodukten, zum Beispiel Proteinen oder Nukleinsäuren, in einer Vielzahl von chromatographischen oder elektrophoretischen Techniken.
Das Metall, das am üblichsten in solchen Techniken verwendet wird, ist Silber. Ein typischer Nachteil in der Silberabscheidung ist jedoch, dass die Abscheidung nicht vollständig spezifisch ist und bis zu einem gewissen Grad eine spontane Abscheidung von Silber auch ohne eine a priori-Abscheidung von Nukleationszentren erfolgen kann. Wo Silber abscheidung in Methoden zur Bildverstärkung oder Kontrastverstärkung verwendet wird, ergibt sich typischerweise ein limitiertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis.
US 5,202,151 offenbart eine stromlose Vergoldungslösung. US 5,284,748 offenbart ein Verfahren zur Detektion, ob eine Bindungs- oder Komplexbildungsreaktion auftritt.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt als eine ihrer Aufgaben das Bereitstellen eines Verfahrens zur Abscheidung von Gold an spezifischen Positionen auf einem Substrat zu Grunde. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das Bereitstellen einer Zusammensetzung und eines Kits zur Verwendung in einer derartigen Methode. Diese Aufgabe wurde durch das Bereitstellen des Gegenstandes der Ansprüche 1 bis 34 gelöst.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird Gold, welches anfänglich in einem löslichen Gold-bereitstellenden Mittel, welches ein goldenthaltendes Molekül, Cluster oder Komplex sein kann, enthalten ist, auf den Nukleationszentren abgeschieden. Der Begriff „Nukleationszentren", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jedes Salz, Komplex, Cluster oder Partikel mit katalytischen Eigenschaften zum Umformen von Gold aus einem goldenthaltenden Molekül oder Komplex in Goldmetall. Partikel mit einer Metalloberfläche sind beispielsweise Kolloidmetallpartikel, eine Vielzahl von Metallkomplexen, Cluster, die Metallatome enthaften, usw.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Verfahren zum Abscheiden von Gold an einer oder mehreren Position(en) auf einem Substrat bereitgestellt, umfassend:

(a) das Inkontaktbringen der einen oder mehreren Position(en) mit Nukleationszentren-bildenden Mitteln, wobei jedes der Mittel wenigstens ein Element einer Erkennungsgruppe umfasst, die aus zwei oder mehreren Substanzen bestehen, die spezifisch miteinander binden, wobei das andere Element die eine oder mehreren Position(en) umfasst oder bildet, die an wenigstens ein Nukleationszentrum gebunden ist, das eines oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster, der Metallatome enthält, und einem metallhaltigen Komplex besteht;
(b) das Inkontaktbringen der einen oder mehreren Position(en) mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au^I(SCN)₂ ^– als ein lösliches Gold-bereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von weniger als 6 aufweist und kinetisch derart stabil ist, dass das Goldmetall im wesentlichen nicht auf dem Substrat abgeschieden wird, es sei denn, dass ein Nukleationszentrum auf dem Substrat vorhanden ist, und in der Gegenwart eines Nukleationszentrum an der einen oder mehreren Position(en) werden Goldatome aus dem Gold-bereitstellenden Mittel freigesetzt und auf dem Nukleationszentrum zur Bildung von Goldmetallabscheidungen an der einen oder mehreren Position(en) abgeschieden, wie in Anspruch 1 definiert.

Man wird anerkennen, dass sobald Gold auf den Substrat abgeschieden ist, es als Nukleationszentrum für die weitere Goldabscheidung dient. Indem die Inkubationszeit sowie weitere Bedingungen, die die Goldabscheidung beeinflussen (einige von diesen werden unten kurz dargestellt) geeignet kontrolliert werden, kann die Menge an abgeschiedenem Gold an einer Abscheidungsposition kontrolliert werden. Außerdem, obwohl die anfängliche Goldabscheidung an diskreten Positionen auf dem Substrat erfolgen kann, können die diskreten Positionen sich vereinigen, um eine größere Goldabscheidung zu bilden, die die so vereinigten Positionen umfasst, indem man die Goldabscheidungen durch weitere Abscheidungen erlaubt zu wachsen.
Der Begriff „im wesentlichen nicht abgeschieden" bedeutet, dass angedeutet werden soll, dass hier entweder keine Goldabtrennung aus der Lösung stattfindet und die Goldatome somit weiterhin im löslichen Molekül oder Komplex verbleiben, oder dass die Goldmetallabscheidung auf einem Substrat vernachlässigbar und dadurch nicht oder nur schwerlich beobachtbar und messbar ist, woraus sich ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis ergibt.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform werden die Nukleationszentren mittels chemischer oder physikalischer Abscheidung von nukleationszentrenbildenden Mitteln auf der einen oder mehreren Position(en) gebildet. In einer anderen Ausführungsform können derartige Nukleationszentren chemisch auf einer oder mehreren Position(en) mittels einer Redoxreaktion gebildet werden, in welcher Metallionen, insbesondere Silberionen, zu metallischem Silber oxidiert werden. Die chemische Bildung von Nukleationszentren ist per se bekannt (siehe beispielsweise WO 99/04402 und PCT/IL99/00232).
In Übereinstimmung mit einer noch weiteren Ausführungsform werden die Nukleationszentren mittels Bindung von nukleationszentrenbildenden Mitteln an einer oder mehreren Position(en) gebildet. Derartige Mittel umfassen mindestens einen Bindungsbaustein mit einer Bindungsaffinität (welche spezifisch oder nicht-spezifisch sein kann) zu einer oder mehreren Position(en), welcher an mindestens einen Nukleationszentrumsbaustein gebunden ist. Der Nukleationszentrumsbaustein ist eine Spezies, die als katalytisches Mittel zur Goldmetallabscheidung fungieren kann, zum Beispiel ein Salz, ein Metallpartikel, ein Cluster aus Metallatomen oder ein metallenthaltender Komplex. Der Bindungsbaustein kann beispielsweise ein Mitglied einer Erkennungsgruppe sein, wobei ein weiteres Mitglied der Erkennungsgruppe die eine oder mehrere Position(en) bildet oder darin beinhaltet ist. Die Erkennungsgruppe, typischerweise ein Erkennungspaar, besteht aus zwei oder mehreren Substanzen mit einer Bindungsaffinität zueinander. Die Erkennungsgruppe kann, ist aber nicht darauf beschränkt, jede der folgenden Paare sein: Ein Antigen und ein Antikörper oder ein Antikörperderivat mit einer komplementären antigenbindenden Domäne; Zucker und ein Lektin; ein Rezeptor und ein Ligand; eine Nukleotidsequenz und eine komplementäre Nukleotidsequenz; eine Nukleotidsequenz und ihr Bindungsprotein oder synthetisches Bindungsmittel; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Zellulose oder Chitin und eine zellulosebindende Domäne.
Der Nukleationszentrumsbaustein ist bevorzugt ein Goldpartikel oder ein Cluster der Goldatome enthält, zum Beispiel Au₁₁ oder Au₅₅ oder Au₁₄₇ (Goldcluster, die jeweils 11, 55 oder 147 Goldatome enthalten). Die Behandlungszusammensetzung ist typischerweise eine wässrige Lösung.
Das goldbereitstellende Mittel ist Au^I(SCN)₂ ^–, das Reagenz ist Hydrochinon (HQ).
Eine Behandlungszusammensetzung umfassend Au^I(SCN)₂ ^– und HQ in einem sauren Medium ist stabil, was bedeutet, dass das Gold als lösliche Spezies in Lösung verbleibt und weder als festes Metall ausfällt noch sich auf festen Substraten, abgesehen von Nukleationszentren, abscheidet. Wenn der pH einer solchen Behandlungszusammensetzung unter 6 ist, ist die Behandlungszusammensetzung besonders stabil. Bei Kontakt mit einem Nukleationszentrum wird Goldmetall an Positionen auf dem Substrat, die Nukleationszentren umfassen, abgeschieden.
Die Rate der Abscheidung von Goldmetall kann kontrolliert werden, indem beispielsweise der pH der Behandlungszusammensetzung kontrolliert wird: Ein Anstieg im pH wird die Rate der Goldabscheidung erhöhen und eine Abnahme im pH wird die Abscheidungsrate herabsetzen. Weiterhin kann die Abscheidungsrate ebenso mittels einer Vielzahl anderer Mitteln kontrolliert werden, zum Beispiel: Indem die Flussparameter der Behandlungszusammensetzung kontrolliert werden (rasches Fließen verhindert die Vergiftung durch Nebenprodukte, wie CN^–, welche die Goldabscheidungsrate reduzieren können); indem oberflächenaktive Mittel, welche entweder die Abscheidungsrate erhöhen oder erniedrigen können, zugefügt werden (beispielsweise Polyamine, Polysäuren oder Polyalkohole und andere oberflächenaktive Mittel, die die Wirkung haben können, dass sie die Goldabscheidungsrate beeinflussen). Zusätzlich kann durch die Verwendung verschiedener Additive, zum Beispiel die oben genannten, die Rauheit der Oberfläche des abgeschiedenen Goldes geändert werden (eine derartige Änderung kann in einem Wechsel der Farbe und der elektrischen Eigenschaften des abgeschiedenen Goldes resultieren).
Die erfindungsgemäße Methode kann zur Überprüfung der Anwesenheit oder Konzentration einer bestimmten Substanz an Positionen auf einem Substrat verwendet werden.
Ein derartiges Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Bildung von Nukleationszentren an Positionen ermöglichen, die diese Substanz enthalten;
(b) das Inkontaktbringen des Substrats mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au^I(SCN)₂ ^– als ein lösliches goldbereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH von weniger als 6 aufweist und kinetisch derart stabil ist, dass bei einem solchen Aussetzen im wesentlichen kein Goldmetall auf dem Substrat abgeschieden wird, es sei denn, dass ein Nukleationszentrum darauf vorhanden ist, und in der Gegenwart eines Nukleationszentrums an den Positionen werden Goldatome aus dem goldbereitstellenden Mittel freigesetzt und auf den Nukleationszentren zur Bildung von Goldmetallabscheidungen an den Positionen abgeschieden; und
(c) das Nachweisen von Goldabscheidungen auf dem Substrat, wobei eine Goldabscheidung an einer Position auf dem Substrat das Vorhandensein der Substanz an dieser Position anzeigt, wie in Anspruch 6 definiert.

Die Prüfmethode kann in einer Vielzahl von Prüftechniken anwendbar sein, zum Beispiel in Techniken, die die Visualisierung von Probestücken in der Mikroskopie (welches ein optisches oder ein Elektronenmikroskop sein kann) oder jede SPM-Technik beinhalten oder bei der Identifizierung von spezifischen Abtrennungsprodukten auf einem Substrat (zum Beispiel ein Abtrennungsprodukt aus der Elektrophorese oder Chromatographie, das in einem Gel oder auf einem festen Substrat wie einem DNA-Chip enthalten ist). In einer solchen Untersuchung können die Nukleationszentren durch die Verwendung von diesen nukleationszentrenbildenden Mitteln gebildet werden, wobei der Baustein mit der spezifischen Bindungsaffinität ein Mitglied einer Erkennungsgruppe ist, welche jede der oben erwähnten sein kann, und das Mittel, das untersucht werden soll, ist ein anderes Mitglied dieser Gruppe.
In Überstimmung mit einer anderen Ausführungsform wird die Goldabscheidungsmethode der Erfindung in einem Prüfverfahren verwendet, welches zum Detektieren der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe gedacht ist. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung für eine solche Methode anwendbar, in welcher ein Einfangmittel (capturing agent), das auf einem Substrat gehalten wird, verwendet wird, um die Anwesenheit eines Analyten in einer Probe zu detektieren, der spezifisch an das Einfangmittel bindet. Ein derartiges Einfangmittel kann ein Mitglied einer Erkennungsgruppe sein, während der Analyt ein weiteres Mitglied dieser Gruppe ist. Ein spezifisches Beispiel ist der Fall zur Prüfung der Anwesenheit eines Zieloligonukleotids in einer Probe, wobei das Einfangmittel ein Oligonukleotid mit einer dazu komplementären Sequenz ist. Ein nukleationszentrumbildender Baustein kann an die in der Probe vorhandenen Analyten gebunden werden, beispielsweise an die Oligonukleotide in der Probe, und nachdem man die Probe mit dem Substrat hat reagieren lassen und eine Goldabscheidungsreaktion wie oben beschrieben ausgeführt hat, wird die Bildung von Goldabscheidungen die Gegenwart eines Analyten in der Probe anzeigen.
Eine spezifische Anwendung dieses Verfahrens ergibt sich in Oligonukleotidchips. Olegonukleotidchips haben verschiedene Einfangoligonukleotide auf verschiedenen Positionen auf dem Chip abgeschieden. Die Anwendung der oben erwähnten Methode erlaubt es, gleichzeitig eine große Anzahl verschiedener Oligonukleotide in einer Probe zu prüfen.
In einem so hergestellten Prüfkörper enthalten die selektiven Stellen daher Goldabscheidungen, welche ihre Visualisierung erlauben. Die selektiven Positionen können typischerweise Positionen sein, die eine spezifische Substanz enthalten, und die Nukleationszentren werden dadurch an diesen Positionen mittels nukleationszentrenbildenden Mitteln, die einen Baustein mit spezifischer Bindungsaffinität zu dieser spezifischen Substanz haben, gebildet. Auf diese Weise können beispielsweise bestimmte Zellen, Organellen, Gebiete, die reich an einer spezifischen Substanz sind, usw., deutlich visualisiert werden.
In einer Separationstechnik, wo die Probe basierend auf verschiedenen Gängigkeiten der verschiedenen Substanzen durch ein Medium (typischerweise einem Gel oder einem Feststoff) unter den angelegten Bedingungen in verschiedene Fraktionen aufgetrennt wird, beispielsweise in der Elektrophorese, Dünnschichtchromatographie (DSC), usw., können die nukleationszentrenbildenden Mittel der Probe vor der Auftrennung zugemischt werden. Dies ist für gewöhnlich bevorzugt. Zum einem mag die vorhergehende Zugabe des nukleationszentrenbildenden Mittels ökonomischer sein, da weniger Material erforderlich sein kann. Zusätzlich, wo derartige Mittel auf das Substrat nach der Auftrennung aufgebracht werden, müssen diese durch das Medium diffundieren, um die abgetrennte Substanz zu erreichen, die innerhalb des Mediums lokalisiert ist. Eine derartige Diffusion kann ein limitierender Faktor in der ordnungsgemäßen Goldanfärbung von aufgetrennten Fraktionen sein. Wie jedoch leicht erkannt werden kann, ist es möglich manchmal das nukleationszentrumbildende Mittel auch nach der Auftrennung zuzufügen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe zur Verfügung. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) das Bereitstellen eines Substrats, dass einfangende Mittel trägt, die den Analyten binden;
(b) das Inkontaktbringen des Substrats mit der Probe, wobei der Analyt an die Einfangmittel bindet;
(c) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Bildung von Nukleationszentren an den Positionen des Substrats ermöglichen, die den Analyten umfassen;
(d) das Inkontaktbringen des Substrat mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au^I(SCN)₂ ^– als ein goldbereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung kinetisch stabil ist, so dass Gold auf dem Substrat im wesentlichen nur an Positionen davon abgeschieden wird, die die Nukleationszentren enthalten; und
(e) das Nachweisen von metallischen Goldabscheidungen auf dem Substrat, was das Vorhandensein des Analyten in der Probe anzeigt.

Der Nachweis in Schritt (e) des Verfahrens zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe kann durchgeführt werden, indem das Aussehen von abgeschiedenen Gold auf dem Substrat getestet wird (abgeschiedenes Gold kann, abhängig von Größe und Rauheit, eine Farbe aufweisen, die sich zwischen Gelb bis Orange zu Rot bewegt).
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung basiert der Nachweis in Schritt (e) auf der elektrischen Leitfähigkeit des abgeschiedenen Golds. In dieser Ausführungsform können die Einfangmittel auf dem Substrat zwischen den Elektroden getragen werden oder sie können auch von einer oder mehreren Elektroden so getragen werden, dass das abgeschiedene Gold auf dem Nukleationszentrum in Schritt (d) einen elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden aufbaut. Der Nachweis der Goldabscheidungen in Schritt (e) wird daher durchgeführt, indem die Existenz eines elektrischen Kontakts zwischen den Elektroden bestimmt wird, beispielsweise indem das Strom-Potential-Verhältnis zwischen den Elektroden gemessen wird. Die Größe des Strom-Potential-Verhältnisses kann als ein Maß für die Konzentration des Mittels in der Probe verwendet werden. Alternativ kann die Bestimmung der Anzahl von Verbindungen in einer langen Reihe von ähnlichen Elektrodenpaaren, die identische Einfangmittel zwischen sich oder auf sich tragen, ebenso eine quantitative Maßangabe der Analytkonzentration ergeben.
Der untersuchte Analyt kann ein Mitglied jedes der oben erwähnten Erkennungspaare sein, wobei das andere Mitglied des Paares dann als ein Baustein in das Einfangmittel eingebaut wird. Die Bildung der Nukleationszentren in Schritt (c) kann die Bereitstellung von Mitteln mit einem Bindungsbaustein mit spezifischer Bindungsaffinität zum Analyten, der auf dem Substrat mittels des Einfangsmittels eingefangen wird, sein, wobei das Einfangmittel an einen nukleationsbildenden Baustein gebunden ist, welcher ein Metallpartikel, ein Cluster Metallatome enthält oder ein metallenthaltender Komplex sein kann, oder jede andere Spezies mit katalytischen Eigenschaften zur Umwandlung von goldenthal tenden molekularen Spezies in Goldmetall. Zum Beispiel, wo der Analyt ein Mitglied eines Bindungspaares ist, kann der Bindungsbaustein ein anderes Mitglied sein (zum Beispiel, wenn der Analyt ein Antigen ist, kann das nukleationszentrumbildende Mittel einen Antikörper umfassen, welcher gleich oder verschieden wie der Antikörper sein kann, der in dem Einfangmittel verwendet wird). Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Kit zur Verwendung in der oben genannten Methode zur Verfügung. Solch ein Kit umfasst eine Behandlungszusammensetzung wie in Anspruch 30 definiert. Zusätzlich kann ein derartiges Kit auch ein Reagenz zur Bildung von Nukleationszentren an bestimmten Positionen auf einem Substrat umfassen, zum Beispiel solche Reagenzien, die einen spezifischen Bindungsbaustein aufweisen, der ein Mitglied der oben genannten Bindungspaare ist. Zusätzlich kann ein Kit zur Verwendung in der obigen Prüfungsmethode ebenfalls in Übereinstimmung mit einigen Ausführungsformen ein Reagenzsystem zur Identifizierung eines Analyten in einer Probe mit einem nukleationszentrumbildenden Baustein umfassen. Weiterhin, in Übereinstimmung mit einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen, kann der Kit ein Substrat umfassen, welches Elektroden mit Einfangmitteln umfasst, die zwischen und/oder auf den Elektroden gelagert sind.
Um die Erfindung zu verstehen und um zu sehen, wie sie in der Praxis ausgeführt werden kann, wird nun eine bevorzugte Ausführungsform mittels eines nicht-limitierenden Beispiels beschrieben, mit gelegentlicher Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Reaktionsschemata der Darstellungsmethode einer Behandlungszusammensetzungen entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung (Schema (a) und Schema (b)) und der Abscheidung von Gold auf einem Nukleationszentrum (Schema (c)).
2 ist eine schematische Darstellung einer Prüfung eines Analyts in einer Probe entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
3 ist eine schematische Darstellung einer Prüfung entsprechend einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
4 ist eine schematische Darstellung einer Prüfung entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
5 ist eine schematische Darstellung der Methode zur Verstärkung bestimmter Banden auf einem festen oder gelartigen Substrat, welche durch Chromatographie oder Elektrophorese aufgetrennt wurden.
6 ist eine schematische Darstellung einer Methode zur Abbildung bestimmter Teile einer mikroskopischen Probe entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
7 zeigt die Anwendung des Systems in der Detektion von Analyten in einer Probe, in diesem spezifischen Beispiel von Oligonucleotiden mit einer bestimmten Sequenz.
Detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Präparation einer Behandlungszusammensetzung und allgemeines Schema zur Abscheidung von Gold
Eine Behandlungszusammensetzung entsprechend der Erfindung umfasst eine Gold-enthaltende Komplexverbindung – Au^ISCN. Um eine solche Behandlungszusammensetzung herzustellen wird in einer ersten Stufe eine Lösung umfassend KAu^IIICl₄ und KSCN hergestellt, üblicherweise durch Vermischen zweier Maßlösungen, eine umfassend die Gold-enthaltende Komplexverbindung und die andere umfassend KSCN. Eine solche Lösung kann beispielsweise durch Vermischen gleicher Volumina einer ersten Lösung umfassend ungefähr 0,5 M KSCN und einer zweiten Lösung umfassend ungefähr 0,05 M KAu^IIICl₄ hergestellt werden. Durch ein solches Vermischen entsteht die Komplexverbindung KAu^III(SCN)₄ (siehe Schema (a) in 1). Dieser Komplex fällt aus, bildet jedoch spontan den Komplex KAu^I(SCN)₂. Typischerweise, nachdem das KAu^III(SCN)₄ ausgefallen ist, wird dieser gewaschen und in Wasser oder Pufferlösung resuspendiert und man lässt diesen eine spontane Reaktion (SPONT.) wie oben bemerkt (in Schema (b) von 1 dargestellt) eingehen.
Die KAu^I(SCN)₂-Lösung wird dann mit dem Reduktionsmittel vermischt entsprechend der vorliegenden Erfindung, z.B. mit ungefähr 0,055 M Hydrochinon (HQ). Die Reduktion des Gold-enthaltenden Komplexes durch das Hydrochinon ist in dem Fall thermodynamisch günstig, jedoch aufgrund der großen Aktivierungsenergie und des niedrigen Präexponentialfaktors ist die Kinetik sehr langsam. Bei einem pH von weniger als ungefähr 6 ist die spontane Reduktion praktisch Null. Somit ist die Lösung stabil und metallisches Gold wird nicht spontan abgeschieden.
Jedoch, wie in 1, Schema (c) dargestellt, bei der Aussetzung von Nukleationszentren (NC), die als Katalysatoren fungieren, welche z.B. Goldkolloide, andere Metallkolloide, Metallatom, Metall enthaltende Komplexe, Metallionen usw. sein können, wird metallisches Gold (Au⁰) abgeschieden auf der Oberfläche des Nukleationszentrums, das mit der Bildung von Benzochinon (BQ) in Verbindung steht.
Die Abscheidungsrate von Gold wird durch den pH-Wert kontrolliert: Ansäuerung der Lösung, d.h. Erniedrigen des pH-Werts, verlangsamt die Metallabscheidung, während das Hinzugeben einer Base, d.h. Erhöhen des pH-Werts, die Abscheidungsrate des Metalls beschleunigt.
Es sollte bemerkt werden, dass bei basischem pH gelegentliche spontane Abscheidung von Gold auch ohne Nukleationszentren stattfinden kann.
Verschiedene Zusätze, welche entweder anfangs der Behandlungslösung zugegeben werden oder während des Abscheidungsprozesses hinzugefügt werden, können die Rate des Goldabscheidungsprozesses und das Muster der Goldabscheidung (Größe der Abscheidungen, Rauheit der Oberfläche, Farbe, usw.) beeinflussen. Zum Beispiel führt die Zugabe von Halogenidionen zu der Behandlungszusammensetzung zu einer Oberflächenvergiftung der wachsenden Metallzentren. Dies erniedrigt die Rate und stoppt schließlich den Goldabscheidungsprozess. Die Verwendung solcher Zusätze erlaubt somit eine Kontrolle der Kristallinität des abgeschiedenen Goldes, der Korngröße, der Goldabscheidungsrate, der Rauheit der Oberfläche des abgeschiedenen Goldes, der elektrischen Eigenschaften, usw. Der Goldabscheidungsprozess kann offenbar durch die Veränderung von verschiedenen anderen Parametern, wie der Temperatur, des Sauerstoffgehalts, des Lichtflusses, der Rührrate in der Lösung, usw. kontrolliert werden.
Der Goldabscheidungsprozess der Erfindung kann für eine Vielzahl verschiedener Anwendungen eingesetzt werden, von denen einige Beispiele im Folgenden erläutert werden.
NACHWEIS VON ANALYTEN IN EINER PROBE
Eine Prüfmethode gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist in 2 dargestellt. Zur Verfügung gestellt durch diese Ausführungsform wird eine Vorrichtung 20 enthaltend ein nichtleitendes Substrat 22, welches elektrisch leitende Elektroden 23 trägt. In dem Spalt zwischen den Elektroden trägt das Substrat 22 Einfangmittel 24, welche eine spezifische Bindungsaffinität zum Analyten 26 aufweisen, welcher untersucht werden soll.
Probe S, welche den Analyten 26 enthält, wird durch Zugabe von Nukleationszentren 28 vorbehandelt und in einer Art und Weise behandelt, dass die Nukleationszentren an den Analyten gekoppelt werden durch eine kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkung, um den modifizierten Analyten 30 zu ergeben. Im Falle eines Oligonukleotid-Analyten, kann ein solches Koppeln z.B., durch Erhitzen der Probe in Gegenwart eines cis-Platin-Biotins und anschließender Zugabe eines in angemessener Weise derivatisierten Clusters, z.B. eines Au₅₅(Ph₃P)₁₂Cl₆-Streptaridinclusters, durchgeführt werden. Das cis-Platin-Biotin bindet an die Oligonukleotide, worauf das Au₅₅(Ph₃P)₁₂Cl₆-Streptavidin an die Biotingruppen auf diesen Nukleotiden bindet, wodurch Nukleationseinheiten an den Analyten gebunden werden. Im Falle eines Nicht-Nukleotidanalyten, kann die Kopplung dadurch erreicht werden, dass z.B. Amino-derivatisierte Cluster oder Kolloide an Carboxygruppen des Analyten gebunden werden; Carboxy-derivatisierte Cluster oder Kolloide an Aminogruppen des Analyten gebunden werden; Maleimido-derivatisierte Cluster oder Kolloide an Thiolgruppen des Analyten gebunden werden; usw. Wie man erkennen kann, können in diesem Prozess auch andere Substanzen in einer Probe mit einem Nukleationszentrum markiert werden. Diese werden sich jedoch nicht an die Einfangmittel 24 binden und die daran gekoppelten Nukleationszentren werden daher nach der Behandlung nicht auf dem Substrat verbleiben (siehe unten).
Bei Kontakt mit der Vorrichtung 20 bindet der modifizierte Analyt 30 an das Einfangmittel, um Nukleationszentren-bildende Komplexe 32 zu ergeben, welche auf dem Substrat 22 immobilisiert werden. Das Waschen des Substrats entfernt ungebundene Substanzen (NB).
Vorrichtung 20 kann danach mit der Behandlungslösung 34 in Kontakt gebracht werden, welche einen Gold enthaltenden Komplex wie KAu^I(SCN)₂ und als Reduktionsmittel Hydrochinon (HQ) enthält, und folglich wird beim Kontakt mit den Nukleationszentren 28 Gold auf den Nukleationszentren abgeschieden und bildet eine kontinuierliche Goldmasse 36, welche sich zwischen den Elektroden 23 erstreckt. Um zu verhindern, dass die Elektroden 23 als Nukleationszentren fungieren, können diese entweder aus einem leitenden Material hergestellt werden, welches keine katalytischen Eigenschaften aufweist, z.B. Silicium, das mit Siliciumdioxid (Silica), mit langen Alkyl-Ketten oder durch Beschichten mit einem inerten Material passiviert wird, oder, wenn die Elektroden aus einem Metall hergestellt werden, können diese vorbehandelt werden, um sie als Gold-Abscheidungskatalysatoren inert zu machen, z.B. durch Inkubation in einer Lösung, enthaltend ein langkettiges Alkanthiol, wie 1-Octadekyl-thiol.
Durch Messen des Strom-Spannungsverhältnisses unter Verwendung einer Messvorrichtung 40, kann das Vorhandensein eines elektrischen Kontaktes zwischen den Elektroden 23 festgestellt werden, dessen Vorhandensein auf die Anwesenheit des Analyten in der untersuchten Probe hinweist.
Wie der Fachmann erkennen kann, kann das Binden des Einfangmittels an das Substrat über verschiedene Wege erreicht werden. Zum Beispiel können Oxidoberflächen mit einem Siliciumreagenz, wie beispielsweise (CH₃CH₂O)₃Si-R-X, derivatisiert werden, wobei R ein Alkyl, Aryl oder anderer Abstandshalter und X eine aktive Gruppe für anschließendes Binden an eine Gruppe Y in dem Einfangmittel sein können. Die Beschaffenheit von X und Y hängt von der Art des Paares ab, und kann ausgewählt werden aus Paaren bestehend aus Säure und Amin, Hydroxy und Säure, Cycloadditionsreaktionen, Radikalreaktionen, nucleophile Substitutionen, nicht-kovalente Wechselwirkungen, usw., wie dem Fachmann bekannt und klar ist. Wo die Substanz aus einem polymerischen Material besteht, kann das Binden durch eine beliebige der oben aufgeführten Reaktionstypen oder andere auch durch Reaktion zwischen dem Einfangmittel und einer Seitengruppen des polymerischen Materials erreicht werden.
Die Vorrichtung 20 kann zwei oder mehr Elektroden umfassen, typischerweise eine Anordnung einer Vielzahl an Elektroden. Die Anordnung kann verschiedene Geometrien annehmen. Die gleichen Einfangmittel können zwischen verschiedenen Elektrodenpaare transportiert werden, und/oder verschiedene Einfangmittel können zwischen verschiedenen Elektroden abgeschieden werden. Eine Vorrichtung der letzteren Sorte kann in einer Multiplexprüfung (multiplexing assay) für den gleichzeitigen Nachweis einer Anzahl von Analyten verwendet werden. Wo die gleichen Einfangmittel zwischen verschiedenen Elektrodenpaare transportiert werden, kann dies ferner eine quantitative Analyse der Analytenkonzentration ermöglichen: die Konzentration kann beispielsweise aufgrund der Anzahl an elektrischen Kontakten, welche sich zwischen verschiedenen Elektrodenpaaren gebildet haben, festgestellt werden – eine große Anzahl an elektrischen Kontaktne signalisieren eine hohe Konzentration und eine kleine Anzahl entsprechen einer niedrigen Konzentration.
Die Elektrodenanordnung kann auch Bestandteil eines komplexeren elektronischen Aufbaus sein, der verschiedene Komponenten, z.B. Dioden, Transistoren, Leiter, Kondensatoren, usw. enthält.
Eine weitere Ausführungsform einer Untersuchungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 3 dargestellt. Der Hauptunterschied im Fall der Ausführungsform von 3 zu der in 2 beschriebenen besteht darin, dass statt der Behandlung von Probe S, um die Nukleationszentren 28 an die Analyten 26 zu binden, um einen modifizierten Analyten 30 zu erhalten, im Falle der Ausführungsform von 3 ein nukleationszentrenbildendes Mittel 150 zur Verfügung gestellt wird. Andere Bestandteile dieser Untersuchungsmethode sind sehr ähnlich zu der in 2 und entsprechend wurden die gleichen Referenzzahlen, die um 100 verschoben sind (d.h. mit einer "1" als Präfix) zu denen, welche in 2 verwendet wurden, in 3 verwendet, um die gleichen Bestandteile zu bezeichnen.
Nach dem Kontakt einer Vorrichtung 120 mit der Probe bindet der Analyt 126 an ein Einfangmittel 124 und dann, nach dem Waschen von freien (nicht gebundenen (NB)) Analytmolekülen und anderen Substanzen in der Probe, wird die Vorrichtung mit einem Nukleationszentren-bildenden Mittel 150 in Kontakt gebracht, welches einen Baustein 152 mit einer spezifischen Bindungsaffinität zu dem Analyten 126 umfasst, welcher jetzt an das Einfangmittel 124 gebunden ist, gekoppelt an ein Nukleationszentrum 154. Somit bildet sich ein immobilisiertes Nukleationszentrum 132 auf dem Substrat in dem Spalt zwischen den Elektroden 123. Nach dem Entfernen von nicht gebundenen Mitteln (NB) 150 und Zugabe einer Behandlungszusammensetzung 134 bildet sich dann die Gold masse 136, welche den elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden 123 herstellt, welcher dann in einer der 2 ähnlichen Art und Weise bestimmt werden kann.
Eine weitere Ausführungsform einer Untersuchungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung wird in 4 gezeigt. In 4, wurden Bestandteile, welche denen in den 2 und 3 ähnlich sind, mit der gleichen Kennzahl wie in 2 verwendet markiert, welche durch 100 verschoben wurde (d.h. mit einer "2" als Präfix). Probe S enthaltend Analyt 226 wird umgesetzt mit Biotin 227, um eine behandelte Probe S' mit Analyt-Biotinkomplexen 231 zu ergeben. Diese werden dann mit dem Substrat 222 in Kontakt gebracht, welcher die Einfangmittel 224 enthält, zwischen den Elektroden 223 platziert ist, um die modifizierten Einfangkomplexe 232 auf Substrat 222 zu erhalten.
Goldkolloidpartikel 240 werden mit einem Avidin oder einem Streptavidin 242 umgesetzt, um die Nukleationszentren-bildenden Mittel 243 zu ergeben. Das Inkontaktbringen von dem Mittel 243 mit dem modifizierten Substrat 222 ergibt dann immobilisierte Nukleationszentren 235. Danach kann der Gegenstand mit einer Behandlungslösung 234 in Kontakt gebracht werden, ähnlich wie in 2 und 3, um eine Goldabscheidung, zur Bildung einer kontinuierlichen Goldmasse 236 zwischen den Elektroden 223, zu ergeben.
Wie der Fachmann ohne Zweifel erkennen wird, sind verschiedene Modifizierungen der oben aufgeführten Ausführungsformen möglich.
VISUALISIERUNG VON TRENNUNGSPRODUKTEN
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Visualisierung von Trennungsprodukten, welche in einer Vielzahl von Trenntechniken erhalten werden, wie Gelelektrophorese, Gelpermeationstechniken, Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie und anderen verwendet werden. Dies ist schematisch in 5 dargestellt.
Das Substrat 200 kann ein Gel oder ein festes Substrat sein, enthaltend verschiedene Bahnen 202, jede bestehend aus einer Vielzahl an Banden 204, wobei jede einzelne eine spezifische Fraktion einer Probe ist, die in jeder Bahn getrennt ist. Ein solches Substrat 200 kann durch eine beliebige der oben aufgeführten Techniken erhalten werden.
Um das Vorhandensein einer spezifischen Substanz zu visualisieren und ihre Bande zu lokalisieren, wird ein nukleationszentrumbildendes Mittel 206, welches einen Baustein 208 enthält der spezifisch an die Substanz an einem Nukleationszentrum 210 bindet, mit dem Substrat 200 in Kontakt gebracht, die Mittel 206 werden abgewaschen, und nach Eintritt wird das Substrat mit einer Behandlungslösung 212 in Kontakt gebracht und entsprechend werden sich Goldabscheidungen 214 auf Banden bilden, welche diese Substanz enthalten (die anderen Banden sind nicht sichtbar und wurden nur zu Darstellungszwecken hinzugefügt). Nukleationszentrenbildende Mittel 206 können jedoch vorzugsweise vor Beginn der Trennung dem Substrat hinzugefügt werden, da die Diffusion von nachträglich hinzugefügten nukleationszentrenbildende Mitteln ein limitierender Faktor sein kann, um das Binden dieser Mittel an die abgetrennten Substanzen zu erreichen.
Abhängig von den genauen Abscheidungsbedingungen, welche unter anderem die Rauhigkeit der Oberflächen der abgeschiedenen Goldmasse bestimmen werden kann, die Farbe der Banden zwischen Gelb bis Schwarz variieren. Unter Verwendung verschiedener visualisierender Techniken, basierend auf der Messung des Absorptionsvermögens von Licht oder der Transmission von Licht durch die Banden, kann eine quantitative Messung einer aufgetrennten Substanz erhalten werden.
Alternativ hierzu kann die Goldabscheidung auch durch verschiedene elektrische Nachweistechniken anstelle von optischen Techniken detektiert werden. Dies kann beispielsweise durch Anbringen von zwei planaren Anordnungen von Elektroden zwischen denen sich die Trennmatrix befindet, erreicht werden, was eine automatische elektrische Detektion erlaubt.
Kontrastverstärkung in bildgebenden Verfahren
Es gibt viele bildgebende Verfahren, welche Kontrastmittel erfordern, um bestimmte Komponenten zu betrachten. Dies ist in der optischen Mikroskopie, der Elektronenmikroskopie (Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie) sowie in weiteren bildgebenden Techniken der Fall, wie der atomaren Kraftmikroskopie. Bisher bedingten solche bildgebenden Techniken die Abscheidung von Silbermetall oder Kohlenstoff und einigen anderen.
Im Falle von biologischen Proben sind Kontrastverstärker erforderlich, um die Visualisierung von spezifischen Geweben, Zellen, Organellen, usw. zu erlauben.
In Überseinstimmung mit der Erfindung wird, wie in 6 dargestellt, eine biologische Probe 300, welche eine Zelle 302 mit einer nicht sichtbaren Organelle 304 enthält, in Übereinstimmung mit der Erfindung mittels successiver Aussetzung gegenüber einem nukleationszentrumbildenden Mittel 306 behandelt, welches einen Bindungsbaustein 308 hat, der spezifisch für eine Substanz ist, die in der Organelle 304 beinhaltet ist, und ein Nukleationszentrum 310, und nach der Behandlung mit einer Behandlungszusammensetzung 312 ist die Organelle 304 als dunkle oder opake Abscheidung 314 sichtbar.
Abbildung der Oligonukleotidhybridisierung
Die Prüfung auf die Anweseneheit und Konzentration von Oligonukleotiden mit einer spezifischen Sequenz wird heutzutage üblicherweise durchgeführt, indem Oligonukleotidproben mit einer komplementären Sequenz, die an bekannten Stellen auf einem Substrat befestigt sind, verwendet werden. Spezifische und häufig verwendete Beispiele von solchen Systemen sind die so genannten DNA-Chips. Diese Chips sind Oberflächen, die eine Vielzahl von Oligonukleotidprobensequenzen in bekannten und genau beschriebenen Stellen auf einer Oberfläche tragen. Eine Probe, die die Zielsequenzen, die die Probensequenzen auf dem Chip komplementieren, enthalten kann oder nicht enthalten kann, wird behandelt, so dass alle DNA-Fragmente gekennzeichnet werden (üblicherweise mittels fluoreszierenden Markierungen). Durch Kontaktieren der Probe mit der Oberfläche des Chips unter geeigneten Bedingungen haften die Zieloligonukleotide an der Oberfläche an Stellen, die die komplementäre Sequenz tragen. Die Detektion der hybridisierten Produkte wird für gewöhnlich durch Verfolgen der Fluoreszenz der gekennzeichneten Duplexe durchgeführt. Die Stelle des hybridisierten Produkts gibt einen Hinweis auf die Sequenz der Probe und die Fluoreszenzintensität gibt einen Hinweis auf die Oberflächenkonzentration.
Es wird nun auf 7 Bezug genommen, die die Anwendung der Goldabscheidungsmethode gemäß der Erfindung in der Visualisierung von Hybridisierungsprodukten auf einem DNA-Chip, unter Verwendung verschiedener möglicher Visualisierungsverfahren, wie beispielsweise optische Techniken (Absorption, Reflektion) und nicht-optische Visualisierungstechniken (AMF, STM usw.), zeigt. Wie ohne Zweifel gewürdigt werden wird, ist dies nur ein Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen Methode zur Visualisierung der Bindung von Zielobjekten an Proben im allgemeinen, zum Beispiel der Bindung von cDNA-Strängen an komplementäre Stränge, der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen und weitere Arten von Erkennungspaaren.
Ein DNA-Chipsubstrat 400 trägt eine Vielzahl von DNA-Probenstellen, drei davon, 402, 404 und 406 sind beispielhaft dargestellt, jede mit einer unterschiedlichen Nukleotidsequenz. Eine Probe S, die das Zieloligonukleotid 410 enthalten kann, wird in einer Weise behandelt, dass alle DNA-Spezies in der Lösung durch die Markierung 412 gekennzeichnet werden, wodurch eine modifizierte Probe S' erhalten wird, welchen den modifizierten Analyt (falls ein Analyt in S anwesend war) enthalten kann. Das Kontaktieren der modifizierten Probe S' mit dem DNA-Chipsubstrat 400 unter geeigneten Bedingungen erlaubt die selektive Hybridisierung der DNA-Proben auf dem Chip an die Zieloligonukleotide, falls diese in der modifizierten Probe S' gegenwärtig waren. Nach dem Spülen des Chips werden die Nukleationszentren-bildenden Mittel 430 in das System unter Bedingungen eingeführt, die ihre Bindung an die Markierung 412 an die gekennzeichneten Oligonukleotiden, falls anwesend, auf den verschiedenen Stellen auf dem Chip erlauben. Nach dem Spülen sind die Nukleationszentren nur an denjenigen Stellen vorhanden, wo eine Hybridisierung zwischen den Proben auf dem Chip und deren Zielverbindungen aus der Lösungen auftrat. Die Visualisierung der Hybridisierung wird erreicht, indem die Goldabscheidungsmethode der Erfindung angewandt wird, wodurch Goldkörner aus den Nukleationszentren auf dem Chip wachsen und die Goldkörner 440 unter Verwendung verschiedener Techniken, wie optische Techniken und SPM-Techniken (AFM, STM usw.), detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform dienen die Markierungen selbst als Nukleationszentrum. In einem solchen Fall wird der Schritt des Anheftens des Nukleationszentrums an die Markierung ausgelassen.

Claims

Ein Verfahren zur Abscheidung von Gold an einer oder mehreren Position(en) auf einem Substrat, umfassend: (a) das in Kontaktbringen der einen oder mehreren Position(en) mit Nukleationszentren-bildenden Mitteln, wobei jedes der Mittel wenigstens ein Element einer Erkennungsgruppe umfasst, die aus zwei oder mehreren Substanzen besteht, die spezifisch miteinander binden, wobei das andere Element die eine oder mehreren Position(en) umfasst oder bildet, die an wenigstens ein Nukleationszentrum gebunden ist, das eines oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster, der Metallatome enthält und einem metallhaltigen Komplex besteht, (b) das in Kontaktbringen der einen oder mehreren Position(en) mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au¹(SCN)₂ ^– als ein lösliches Goldbereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von weniger als 6 aufweist und kinetisch derart stabil ist, dass das Gold im Wesentlichen nicht auf dem Substrat abgeschieden wird, es sei denn, dass ein Nukleationszentrum auf dem Substrat vorhanden ist, und in der Gegenwart eines Nukleationszentrums an der einen oder den mehreren Position(en) werden Goldatome aus dem Goldbereitstellenden Mittel freigesetzt und auf dem Nukleationszentrum zur Bildung von Goldmetallabscheidungen an der einen oder den mehreren Position(en) abgeschieden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nukleationszentrum eines oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Cluster, der Metallatome enthält, und Komplexen, die Metall enthalten, besteht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nukleationszentrum eines oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Goldpartikel, einem Cluster, der Goldatome enthält, und Komplexen, die Gold enthalten, besteht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Erkennungsgruppe ein Mitglied der Gruppe ist, die aus einem Antigen und einem Antikörper oder einem Antikörperderivat mit einer Antigen-bindenden Domäne; einem Zucker und einem Lektin; einem Rezeptor und einem Liganden; einer Nukleotidsequenz und einer komplementären Nukleotidsequenz; einer Nukleotidsequenz und deren daran bindenden Protein oder anderem spezifisch bindenden Mittel; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Zellulose oder Chitin und Zellulose-bindenden Domäne besteht.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist.
Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer spezifischen Substanz an Positionen auf einem Substrat, umfassend: (a) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Bildung von Nukleationszentren an Positionen ermöglichen, die diese Substanz enthalten, (b) das in Kontaktbringen des Substrats mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au¹(SCN)₂ ^– als ein lösliches Gold-bereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von weniger als 6 aufweist und kinetisch derart stabil ist, dass bei einem solchen Aussetzen im Wesentlichen kein Goldmetall auf dem Substrat abgeschieden wird, es sei denn, dass ein Nukleationszentrum darauf vorhanden ist, und in der Gegenwart eines Nukleationszentrums an den Positionen werden Goldatome aus dem Gold-bereitstellenden Mittel freigesetzt und auf dem Nukleationszentrum zur Bildung von Goldmetallabscheidungen an den Positionen abgeschieden; und (c) den Nachweis von metallischen Goldabscheidungen auf dem Substrat, wobei eine Goldabscheidung an einer Position auf dem Substrat das Vorhandensein der Substanz an dieser Position anzeigt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin Schritt (a) das Folgende umfasst: (a1) das Bereitstellen von Nukleationszentren-bildenden Mitteln, wobei jedes wenigstens eine Gruppe mit einer spezifischen Bindungsaffinität für die Substanz umfasst, die an wenigstens ein Nukleationszentrum gebunden ist, das eine oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster, der Metallatome enthält, und einem metall-haltigen Komplex besteht; und (a2) das in Kontaktbringen des Substrats mit den Mitteln.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Gruppe in einem Element eines Erkennungspaares mitumfasst ist, das aus zwei Molekülen oder Komplexen besteht, die spezifisch miteinander binden, wobei das andere Element in der Substanz mitumfasst ist oder diese ausmacht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das Erkennungspaar ein Mitglied aus der Gruppe ist, die aus einem Antigen und einem Antikörper oder einem Antikörperderivat mit einer Antigen-bindenden Domäne; einem Zucker und einem Lektin; einem Rezeptor und einem Liganden; einer Nukleotidsequenz und einer komplementären Nukleotidsequenz; einer Nukleotidsequenz und deren daran bindenden Protein oder anderem spezifisch bindenden Mittel; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Zellulose oder Chitin und Zellulose-bindenden Domäne besteht, wobei eines ein Teil des Erkennungspaares ist und die Substanz der andere ist oder diesen mit umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6–9 zur Bestimmung des Vorhandenseins einer oder mehrerer Zieloligonukleotide mit einer spezifischen Zielsequenz in einer Probe, umfassend: (a) das Bereitstellen eines Substrats, das eine oder mehrere Oligonukleotidsonden trägt, wobei jede mit einer Sondensequenz ausgestattet ist, die komplementär zu einer der Zielsequenzen ist; (b) das in Kontaktbringen des Substrats mit der Probe und die Bereitstellung von Bedingungen, die die Bildung von Nukleationszentren dort ermöglichen, wo ein Zieloligonukleotid an ein Sondenoligonukleotid hybridisiert; (c) das in Kontaktbringen des Substrats mit einer Behandlungszusammensetzung, die ein Gold-bereitstellendes Mittel, das ein Gold-haltiges Molekül oder Komplex ist, umfasst und ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung derart kinetisch stabil ist, dass bei einem solchen Aussetzen im Wesentlichen kein Goldmetall auf dem Substrat abgeschieden wird, es sei denn, es ist darauf ein Nukleationszentrum vorhanden, und in der Gegenwart eines Nukleationszentrums an den Positionen werden Goldatome aus dem Gold-bereitstellenden Mittel freigesetzt und auf dem Nukleationszentrum zur Bildung von Goldmetallabscheidungen an den Positionen abgeschieden; und (d) das Nachweisen von metallischen Goldabscheidungen auf dem Substrat, wobei eine Goldabscheidung an einer Position auf dem Substrat das Vorhandensein der Substanz an dieser Position anzeigt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin der Schritt (b) das Folgende umfasst: (b1) die Behandlung der Probe zur Bindung eines Markers an Oligonukleotide in der Probe, (b2) das in Kontaktbringen der Probe mit dem Substrat, und (b3) das in Kontaktbringen des Substrats mit einem Nukleationszentrum-haltigen Mittel, das in der Lage ist, spezifisch an den Marker zu binden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin der Schritt (b) das Folgende umfasst: (b1) die Behandlung der Probe, um Nukleationszentren an Oligonukleotide zu binden, die darin vorhanden sind, und (b2) das in Kontaktbringen der Proben mit dem Substrat.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Nukleationszentrum ein Goldpartikel, Cluster, der Goldatome enthält, oder ein Gold-haltiger Komplex ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, worin die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 14, worin das Substrat eine Verbindung zur Beobachtung in einer Bild-gebenden oder visualisierenden Technik ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, worin die Nachweistechnik auf Licht basiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, worin die Nachweistechnik auf Lichtabsorbtion, Lichttransmission, Lichtreflektion oder Lichtstreuung basiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, worin der Nachweis durch Techniken erfolgt, die aus der Transmissionselektronenmikroskopie, der abtastenden Elektronenmikroskopie und der Atomkraftmikroskopie ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15 zur Herstellung der Verbindung zur Beobachtung in einem Mikroskop, worin in Schritt (a) Bedingungen bereit gestellt werden, die die Bildung von Nukleationszentren an ausgewählten Positionen auf der Verbindung ermöglichen.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 14, worin das Substrat getrennte Fraktionen einer Probe enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20 zur Identifizierung von Positionen auf einem spezifischen Trennungsprodukt auf dem Substrat, worin jeweils in Schritt (c) oder (d) das Vorhandensein von Gold auf dem Substrat nachgewiesen wird, wobei solches Gold das Vorhandensein des spezifischen Trennungsproduktes auf dem Substrat an einer Position signalisiert, an der das Gold nachgewiesen wird.
Das Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe, umfassend: (a) das Bereitstellen eines Substrats, das bindende Mittel trägt, die den Analyten binden, (b) das in Kontaktbringen des Substrats mit der Probe, wobei der Analyt an die bindenden Mittel bindet, (c) das Bereitstellen von Bedingungen, die die Bildung von Nukleationszentren an den Positionen des Substrates ermöglichen, die den Analyten umfassen, (d) das in Kontaktbringen des Substrats mit einer Behandlungszusammensetzung, die Au¹(SCN)₂ ^– und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH von weniger als 6 aufweist und derart kinetisch stabil ist, dass Gold auf dem Substrat im Wesentlichen nur an Positionen davon abgeschieden wird, die die Nukleationszentren enthalten; und (e) das Nachweisen von metallischen Goldabscheidungen auf dem Substrat, was das Vorhandensein des Analyten in der Probe anzeigt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, worin Schritt (c) das Folgende umfasst: (c1) das Bereitstellen von Nukleationszentren-bildenden Mitteln, die jeweils wenigstens eine Gruppe mit spezifischer Bindungsaffinität für den Analyten umfassen, die an wenigstens ein Nukleationszentrum gekoppelt ist, das eines oder mehrere der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster aus Metallatomen und einem Metall-haltigen Komplex besteht, und (c2) das in Kontaktbringen des Substrats mit den Mitteln.
Das Verfahren gemäß Anspruch 23, worin der Analyt ein Teil eines Bindungspaares ist, das aus einem Antigen und einem Antikörper oder einem Antikörperderivat mit einer Antigen-bindenden Domäne; einem Zucker und einem Lektin; einem Rezeptor und einem Liganden; einer Nukleotidsequenz und einer komplementären Nukleotidsequenz; einer Nukleotidsequenz und deren daran bindenden Protein oder anderem spezifisch bindenden Mittel; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Zellulose oder Chitin und Zellulose-bindenden Domäne besteht, und wobei wenigstens eine der Verbindungen der andere Teil des Bindungspaares ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, worin Schritt (b) das Folgende umfasst: (b1) das in Kontaktbringen der Probe mit Nukleationszentren, wobei die Nukleationszentren eines oder mehrere der Gruppe sind, die aus Metallpartikeln, Clustern aus Metallatomen und Metall-haltigen Komplexen besteht, und das Bereitstellen von Bedingungen zur Kopplung der Nukleationszentren an den gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Analyten, wodurch eine modifizierte Probe, die modifizierte Analyten enthält, erhalten wird, und (b2) das in Kontaktbringen des Substrats mit den modifizierten Analyten, die an die Nukleationszentren gebunden sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, worin der Analyt ein Teil eines Bindungspaares ist, das aus einem Antigen und einem Antikörper oder einem Antikörperderivat mit einer Antigen-bindenden Domäne; einem Zucker und einem Lektin; einem Rezeptor und einem Liganden; einer Nukleotidsequenz und einer komplementären Nukleotidsequenz; einer Nukleotidsequenz und deren daran bindenden Protein oder anderem spezifisch bindenden Mittel; Biotin und Avidin oder Streptavidin; Zellulose oder Chitin und Zellulose-bindenden Domäne besteht; und wobei das bindende Mittel der andere Teil des Bindungspaares ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, worin die bindenden Mittel auf dem Substrat zwischen Elektroden getragen werden, so dass Gold, das auf den Nukleationszentren in Schritt (d) abgeschieden wird, einen elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden etabliert, und wobei der Nachweis der Goldabscheidungen in Schritt (e) durch die Messung des Strom-Potentialverhältnisses zwischen den Elektroden durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 27, worin der wenigstens eine Metallpartikel, der Cluster aus Metallatomen oder ein Metall-haltiger Komplexe in Goldpartikel oder ein Cluster, der Goldatome enthält, ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 28, worin die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung ist.
Ein Kit zur Verwendung in dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, umfassend eine Behandlungszusammensetzung, die Au¹(SCN)₂ ^– als ein lösliches Gold-bereitstellendes Mittel und Hydrochinon als ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von weniger als 6 aufweist und derart kinetisch stabil ist, dass nach Kontakt mit einem Substrat Gold auf dem Substrat im Wesentlichen nur an Positionen des Substrats abgeschieden wird, die Nukleationszentren enthalten.
Der Kit gemäß Anspruch 30, der zusätzlich Nukleationszentren-bildende Mittel zur Bildung von Nukleationszentren an einer oder mehreren Positionen auf dem Substrat umfasst, wobei die Mittel jeweils wenigstens ein Element einer Erkennungsgruppe mit einer spezifischen Bindungsaffinität zu einer Substanz umfassen, die an der einen oder den mehreren Position(en) vorhanden ist, die an wenigstens eine Nukleationszentrumgruppe gekoppelt ist, die eine oder mehrere der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster aus Metallatomen und einem Metall-haltigen Komplex besteht.
Ein Kit gemäß einem der Ansprüche 30 oder 31 zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend: (i) ein Substrat, das bindende Mittel träg, die den Analyten binden, (ii) Mittel zur Bildung von Nukleationszentren an Teilen des Substrats, auf dem der Analyt immobilisiert wird, (iii) eine Behandlungszusammensetzung, die ein lösliches Gold-haltiges Molekül oder Komplex und ein Reagenz umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von weniger als 6 aufweist und kinetisch derart stabil ist, das Gold auf dem Substrat im Wesentlichen nur an Positionen davon abgeschieden wird, die die Nukleationszentren enthalten.
Der Kit gemäß Anspruch 32, der zusätzlich Nukleationszentren-bildende Mittel umfasst, die jeweils wenigstens eine Gruppe mit einer spezifischen Bindungsaffinität für den Analyten umfassen, der an wenigstens eine Nukleationszentrum-Gruppe gekoppelt ist, die eine oder mehrere aus der Gruppe ist, die aus einem Metallpartikel, einem Cluster aus Metallatomen und einem Metallhaltigen Komplex besteht.
Der Kit gemäß einem der Ansprüche 30 bis 33, worin das Substrat zwei oder mehr Elektroden umfasst und die bindenden Mittel in Spalten zwischen den Elektronen gehalten werden.