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Spray-Verabreichung von
Zellen
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verabreichung und Anhaftung
von Zellen an Gewebe.
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Bei
der Behandlung von geschädigter
Haut wie durch Verbrennungs- oder chronische Wunden geschädigte Haut
oder anderen Wunden bestand ein Ansatz darin, das von Biopsien,
typischerweise autologen Biopsien, stammende Keratinocyten zu züchten, bis
eine mehrschichtige hautähnliche
Schicht von der Kulturplatte durch Proteaseverdau abgenommen werden
kann. Die Schwierigkeiten bei diesem Verfahren beinhalten, dass
die zum Wachstum benötigte
Zeit, um derartige super-konfluente Kulturen oder „Epithelschichttransplantate" zu züchten, im
Bereich von drei Wochen liegt, die dünnen Schichten schwierig zu
handhaben sind und die „Annahme", d.h. die stabile
Anhaftung, der Schichttransplantate an das Basalgewebe der Verletzungsstelle
sich als problematisch erwiesen hat. Vgl. beispielsweise Rennekampff
et al., J. Surg Res. 62: 288-295, 1996. Zudem übernehmen in einer derartig
hohen Dichte gezüchtete
Keratinocyten eher das Wesen von nicht proliferierenden, differenzierten
Zellen als von aktiv wachsenden Zellen, die zur Wundheilung beitragen.
Vgl. beispielsweise Rennekampff et al. Man hat zahlreiche Ansätze unternommen,
gezüchtete
Keratinocyten in Wunden einzuführen,
während
derartige Zellen sich in einer aktiveren Wachstumsphase befinden,
wie bei Rennekampff et al. besprochen. Diese beinhalteten die Züchtung der
Zellen bis zur Subkonfluenz auf porösen Polymerträgern und
die Applikation der Träger,
die umgedreht sind, so dass die Zellen nach unten orientiert sind,
auf die Wunden. Zudem haben bestimmte Forscher auf diesem Gebiet
damit experimentiert, Keratinocyten mit Fibrinogen zu mischen und
dann in Thrombin kurz vor der Applikation auf die Wunde zu mischen,
so dass Fibrinogen in Fibrin umgewandelt wird, das eine Polymermatrix
für die
Keratinocyten bildet. Vgl.
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Hundyadi
et al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988; Kaiser et al.,
Burns 20: 23-29, 1994. Die enzymatische Umwandlung von Fibrinogen
liefert reichlich Zeit, während
der die Zusammensetzung eine bearbeitbare Klebrigkeit erhält, so dass
die zellenthaltende Zusammensetzung über die Wunde verteilt werden kann.
Der Fibrin„Kleber" kann auch verwendet
werden, um eine Schutzschicht aus allogener Leichenhaut zu fixieren.
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Eine
frühere
Arbeit der Anmelder zusammen mit anderen, die mit den Anmeldern
zusammenarbeiten, haben ein wirksames Dichtungsmittel identifiziert,
das Fibrin, in einer „Fibrinmonomer"-Form, die gegen
Polymerisierung stabilisiert ist, zu der Stelle liefert, die abgedichtet
werden soll. An der Stelle sind die Stabilisierungsbedingungen umgekehrt,
und es bildet sich ein wirksames Gerinnsel. Vgl. Edwardson et al.,
Europäische Patentanmeldung
Nr.
EP 592242 . Einer
der besonderen Vorteile dieses Fibrinmonomerdichtungsmittel von
EP 592242 besteht darin,
dass das Dichtungsmittel nur Minuten vor dem chirurgischen Eingriff
(oder unter Verwendung manueller Zubereitung innerhalb einer Stunde)
aus einer geringen Menge Patientenblut schnell hergestellt werden
kann, und dies kann unter Verwendung von Standardlaborgeräten erfolgen.
Spezialisierte Werkzeuge zur Herstellung von Fibrinmonomer wurden
ebenfalls beschrieben, und diese Werkzeuge erlauben, dass ein autologes
Dichtungsmittel aus einem Patienten auf eine schnelle, hoch reproduktive,
hoch verlässliche
und extrem sichere Weise hergestellt wird. Vgl. Holm, „Centrifuge
Reagent Delivery System",
WO 96/16713, Holm et al., „Method
and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 und Holm, „Centrifuge
with Annular Filter",
WO 96/16715. Die solubilisierte Fibrinmonomerzusammensetzung kann als
Dichtungsmittel, wie bei Edwardson et al.,
EP 592242 beschrieben, verwendet werden.
Diese Verbesserungen erlauben daher, dass ein autologes Dichtungsmittel
in einem schnellen, automatisierten Verfahren hergestellt wird und
dass das so hergestellte autologe Dichtungsmittel frei von extrinsischen
Proteinaseenzymen wie Rinderthrombin oder Rinderproteinen wie Aprotinin
ist.
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Ein
weiteres Fibrindichtungsmittel, das ohne Verwendung eines proteolytischen
Enzyms zum Polymerisieren induziert werden kann, verwendet (1) eine
erste Komponente eines Fibrinanalogons, wobei der C-terminale Bereich
der γ-Kette
ausreichend verändert
ist, um die Selbstpolymerisierung zu stören, und (2) eine zweite Komponente
eines fibrinähnlichen
Moleküls
wie ein Fibrinogen. Vgl. CederholmWilliams, WO 9529686 A1. Bei Vereinigung
der zwei Komponenten polymerisiert das Fibrinanalogon mit dem Fibrin-verwandten
Molekül.
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Die
Anmelder haben nun gezeigt, dass Keratinocyten, die im selben Zeitrahmen
auf eine Wunde gesprüht
wurden wie fibrinpolymerbildende Zweikomponentensysteme auf die
Wunde gesprüht
und dabei gemischt wurden, wirksam sind, um Keratinocyten (und in
einigen Fällen
Fibroblasten) auf der Wunde in einer dreidimensionalen Fibrinpolymermatrix
zu fixieren, wobei die Menge der fixierten Zellen wirksam ist, sich
auszubreiten, so dass sich eine Epithelschicht bildet. In bevorzugten
erfindungsgemäßen Aspekten
werden die Keratinocyten gleichzeitig mit dem Sprühen und
Mischungen, das während
des Fluges stattfinden, von einem Zweikomponentensystem aufgesprüht, das
die fibrinähnlichen
Moleküle
des Gemisches dynamisch kompetent zum Polymerisieren macht.
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Die
Erfindung gilt auch für
andere Zelltypen, die auf einer Gewebeoberfläche fixiert werden können, beispielsweise,
um neues Gewebewachstum zu erzeugen oder die Gegenwart der Zellen
für einen
ausreichenden Zeitraum zu etablieren, um ein gewünschtes Ergebnis zu erreichen.
Die Erfindung betrifft ferner das Aufsprühen von Zellen auf ein Gewebesubstrat
ohne Fibrin oder mit anderen biokompatiblen, vorzugsweise bioabbaubaren,
adhäsiven
Polymeren. Die Erfindung betrifft ferner Zellen, die mit Kollagen
und oder ohne Fibrin verabreicht werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt die Verwendung eines Fibrinpolymers, gebildet durch
das Beschichten einer Zieloberfläche
mit einer Mischung einer ersten Komponente, umfassend ein nicht
polymeres fibrinähnliches
Protein, und einer zweiten Komponente, die wirksam ist, um das fibrinähnliche
Protein in Fibrinpolymer umzuwandeln, zur Herstellung einer beschichteten
Zieloberfläche,
wobei die Oberfläche
eine Gewebeoberfläche
eines Säugers
oder solch eine Gewebeoberfläche
ist, die mit einer bioabbaubaren Polymerschicht beschichtet ist, wobei
die gemischten zwei Komponenten ein Fibrinpolymer mit einer Klebrigkeit
bilden, die wirksam ist, um Zellen anzuheften, die in einer Suspension
auf eine Zieloberfläche
gesprüht
werden zur Verwendung bei der Wundbehandlung bereit.
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Vorzugsweise
bildet sich das Fibrinpolymer in einer Menge, die wirksam ist, um
eine besiedelungsfördernde
Menge der Zellen auf der Zieloberfläche zu gewährleisten. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner das Mischen einer zellanheftungsfördernden
Menge von Kollagen in das Gemisch. Vorzugsweise wird die Mischung
aufgesprüht,
um die Zieloberfläche
zu beschichten. Die Mischung und die Suspension der Zellen können gleichzeitig
aufgesprüht
werden, um die Zieloberfläche
zu beschichten. Vorzugsweise wird eine besiedelungsfördernde
wirksame Menge der Zellen in einer dreidimensionalen Matrix aus
Fibrinpolymer an der Zieloberfläche
eingeschlossen.
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Die
Verwendung kann das Anhaften der bioabbaubaren Polymerschicht an
die Gewebeoberfläche
umfassen, wobei die Zellsuspension auf die Polymerschicht aufgesprüht wird,
die die Zieloberfläche
definiert. In einer Ausführungsform
ist die Polymerschicht zusammen mit einer entfernbaren, externen
Stützschicht
angeheftet, die geeignet ist, den Dampftransport aus dem Gewebe
weiter einzuschränken,
ohne ihn zu eliminieren, und das Verfahren umfasst ferner: Entfernen
der Stützschicht
nach dem Anhaften der Polymerschicht an das Gewebe und anschließende Applikation
der Zellsuspension. Die Polymerschicht kann ohne Einschränkung eine
Glucosaminglucanpolymerschicht oder eine vernetzte Kollagenpolymerschicht
umfassen.
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Die
Verwendung kann ferner umfassen: Züchtung autologer Zellen aus
einer dem Säuger
entnommenen Biopsie eines Gewebes eines bestimmten Typs und Bildung
der Zellsuspension aus den gezüchteten
Zellen, wobei das Gewebe, auf das die Zellen appliziert werden,
von einem bestimmten Typ ist oder angrenzend an das Gewebe des bestimmten
Typs liegt.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das Gewebe eine Wunde und die Zellsuspension umfasst Keratinocyten.
Vorzugsweise werden die gezüchteten
Keratinocyten einer die Zellen für die
Zellsuspension produzierenden Passage vor dem Erreichen der Konfluenz
geerntet. Die Verwendung kann ferner umfassen: Sprühen einer
Fibroblastensuspension auf die Wunde, die mit den gemischten zwei
Komponenten beschichtet ist. Die Fibroblasten können derselben Mischung zugesetzt
werden, so dass ein Fibrinpolymer erzeugt wird, einer getrennten
Mischung zugesetzt werden, so dass das Polymer erzeugt wird.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die erste Komponente Säuresolubilisiertes
Fibrin und die zweite Komponente kann eine Menge an Base umfassen,
die wirksam ist, um die Mischung ausreichend zu neutralisieren,
um das Fibrin polymerisieren zu lassen. Die Applikation der ersten
und zweiten Komponenten (jeglicher Art) kann das Sprühen der
ersten und zweiten Komponente umfassen, indem sich ein Strahl der
ersten Komponente mit einem Strahl der zweiten Komponente während des
Fluges von einer Sprühvorrichtung
auf die Oberfläche
vereinigt. Das Verfahren kann das Sprühen der Zellsuspension, ersten
Komponente und zweiten Komponente umfassen, wobei sich die Strahlen
der Zellsuspension, ersten Komponente und zweiten Komponente während des
Fluges (von der Sprühvorrichtung
auf die Oberfläche)
vereinen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt [später zu vervollständigen,
unter der Annahme, dass Zeichnungen verwendet werden sollen]
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Definitionen
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Die
folgenden Begriffe sollen für
die Zwecke dieser Anmeldung die jeweilige nachstehend dargelegte Bedeutung
haben.
- – Bioaktives
Mittel. Ein bioaktives Mittel ist eine Substanz wie eine Chemikalie,
die auf eine Zelle, ein Virus, Gewebe, Organ oder einen Organismus
wirken kann, einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf, Arzneistoffe (d.h. pharmazeutisch wirksame
Substanzen) oder Hormone (z.B. Wachstumsfaktoren), um eine Änderung der
Funktion der Zelle, des Virus, Gewebes, Organs oder Organismus hervorzurufen.
Vorzugsweise ist der Organismus ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch.
- – Zellanhaftungsfordernde
wirksame Kollagenmenge. Eine zellanhaftungsfördernde wirksame Kollagenmenge
ist eine Menge, die die Zellmenge reduziert, die für eine besiedelungsfördernde
wirksame Menge der Zellen oder die gewebewachstumsfördernde
wirksame Menge der Zellen benötigt
wird.
- – Besiedelungsfördernde
wirksame Menge der Zellen. Eine besiedelungsfördernde wirksame Menge der anhaftenden
Zellen ist eine Menge, die wirksam ist, um zur Bildung von Kolonien
zu führen
oder um zu einem Niedelassen der Zellen zu führen, die wirksam ist, um eine
physiologische Änderung
bei dem Tier zu verursachen (wenn die anhaftenden Zellen rekombinante
Zellen sind, die ein biologisch aktives rekombinantes Mittel produzieren
und exportieren), oder um zur Bildung von neuem Gewebe zu führen.
- – Dynamische
Fibrinsysteme. Dynamische Fibrinsysteme sind binäre fibrinpolymerbildende Systeme,
die bei Mischung der beiden Komponenten fibrinähnliche Moleküle erzeugen,
die dynamisch kompetent zum Polymerisieren sind.
- – Dynamisch
kompetent zum Polymerisieren. Der Ausdruck, dass fibrinähnliche
Moleküle
einer Mischung dynamisch kompetent zum Polymerisieren sind, gibt
an, dass jede Barriere zur Polymersierungskompetenz rein eine Funktion
der Mischungsdynamik oder der schnellen Kinetik erster Ordnung für jegliche
tertiäre Strukturänderungen
ist, die auf veränderte
Bedingungen des Gemisches wie den pH-Wert zurückzuführen sind.
- – Fibrinähnliches
Protein. Ein fibrinähnliches
Protein basiert auf zwei Paaren von Fibrin-α-Ketten, zwei Paaren von Fibrin-β-Ketten und
zwei Paaren von Fibrin-γ-Ketten,
die man in Fibrinen oder Fibrinogen findet. Ein fibrinähnliches
Protein ist leicht in eine Form umzuwandeln oder kann leicht in
eine Form umgewandelt werden, die dynamisch kompetent zum Polymerisieren
ist. Wie ansonsten in diesem Dokument angemerkt, können zahlreiche
Formen von fibrinabstammenden oder darauf basierenden Molekülen verwendet
werden, um ein Fibrinpolymer herzustellen, und sind daher fibrinähnliche
Proteine.
- – Gewebewachstumsfördernde,
wirksame Menge der Zellen. Eine gewebewachstumsfördernde, wirksame Menge der
anhaftenden Zellen ist eine besiedelungsfördernde wirksame Menge, die
zur Bildung von neuem Gewebe führt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Zellen werden auf ein Gewebesubstrat gesprüht, wobei die Fibringel-bildenden
Komponenten in genügend
kurzer Zeit zuvor aufgesprüht
wurden, so dass das Fibrinpolymer nicht zu sehr ausgereift ist,
um ausreichend Klebrigkeit zu besitzen, um die gesprühten Zellen
anzuheften. Vorzugsweise sind die fibrinähnlichen Komponenten zu einem
hinreichenden Gel gereift, um adhäsiver zu sein als eine der
zwei zur Bildung des Gels gemischten Komponentenzusamensetzungen.
Am meisten bevorzugt werden die beiden Komponenten und die Zellen
gleichzeitig aufgesprüht,
was bedeutet, dass sowohl die Sprühvorrichtung für das Dichtungsmittel
als auch die Sprühvorrichtung
für die
Zellsuspension zu gleichen Zeit in Betrieb sind, wobei die Strahlen
auf dasselbe Gewebe gerichtet sind.
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Vorzugsweise
ist die Bildung von Fibrin, das dynamisch kompetent zum Polymerisieren
ist, unabhängig
von jeglichen proteolytischen Umwandlungen der fibrinähnlichen
Moleküle.
Eine schnelle Rate der Fibrinpolymerisierung ist ein wichtiger Aspekt,
der einen deutlichen Vorteil gegenüber Fibrinogen/Thrombin/Zellgemischen
bereitstellt. Die schnelle Polymerisierung erlaubt die rasche Applikation
einer dünnen
Fibrinschicht und von Zellen auf im Wesentlichen jede Körperoberfläche oder
-höhle.
Bei Ansätzen,
die eine ungenügende Anfangsadhäsivität bereitstellen,
können
Probleme mit dem „Auslauf" aus nicht horizontalen
Oberflächen
auftreten.
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In
den Studien, über
die hier berichtet wird, wird das erfindungsgemäße Verfahren als Vehikel verwendet,
um Wunden mit aktiv wachsenden monodispergierten Keratinocytensuspensionen
unter Verwendung zweier aneinander befestigter Sprühvorrichtungen
zu erzeugen, um Zellen und Fibrindichtungsmittel auf kleine experimentelle
Wunden zu sprühen.
Die Gesamtzahl und Lebensfähigkeit
der auf diese Weise verabreichten Zellen wurden in vitro und in
vivo abgeschätzt,
und man glaubt, dass in gewissem Maße ein Zellverlust auftritt. Die
nachgewiesenen Verluste können
ein Verlust von fragilen Zellen sein, die sich der natürlichen
Alterung nähern
oder die Verluste können
auf das Sprühapplikationssystem
zurückzuführen sein,
das nicht für
die Verabreichung von Zellen optimiert wurde. Beispielsweise wurde
gezeigt, dass Variationen im Luftstrom einen signifikanten Effekt
haben.
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Zelltypen: Gewebetypen
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Die
auf ein Gewebesubstrat erfindungsgemäß einzuführenden Zellen schließen ohne
Einschränkung Keratinocyten,
Fibroblasten, Hepatocyten, Pankreaszellen, Lungenzellen, Muskelzellen
(glatte, Herz-, gestreifte), Chondrocyten, Osteoblasten, Endothelzellen,
befruchtete Eizellen, Nebennierenzellen und Neuronen ein. Die Zellen
können
erfindungsgemäß appliziert
werden, um das Gewebewachstum zu ergänzen oder zu etablieren. Typischerweise
werden die Zellen auf ein Gewebesubstrat appliziert, das geeignet
für das
gewünschte
Gewebewachstum gelegen ist. Die applizierten Zellen können Zellen
einschließen,
die in vitro oder in situ zu einem modifizierten Phänotyp transformiert
wurden, wie Zellen, die transformiert wurden, um ein nützliches
bioaktives Mittel herzustellen, oder Zellen eines bestimmten Gewebes,
die transformiert wurden, um einen genetischen Defekt zu verbessern.
In diesem letzteren Fall kann das gewünschte Ergebnis durch mindestens
eine leichte Besiedelung der transformierten Zellen am Substratgewebe
erreicht werden, an das sie angeheftet sind. Die Zellen können beispielsweise
wie durch eine Endoskopievorrichtung auf Lungengewebe aufgesprüht werden,
um eine therapeutische Produktion eines bioaktiven Mittels für einen
Zeitraum bereitzustellen. Für
Zellen, die durch Einbau eines geeigneten Vektors in situ transformiert
werden, kann das Fibrin als Verstärkungsmittel der Transformation
fungieren, wie bei US-Seriennummer 60/089,543, eingereicht am 17. Juni
1998, und US Seriennummer 09/334,325, eingereicht am16. Juni 1999,
diskutiert.
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Gewebe,
an die die Zellen haften, schließen ohne Einschränkung die
basalen Strukturen einer Wunde (die abhängig von der Wundtiefe das
basale Epidermisgewebe, die Dermis oder Muskelfaszien umfassen können), Lunge,
Leber, Peritoneum oder Myocard ein. Das Vorhandensein einer Wunde
im Gewebeepithel stellt ein bevorzugtes Substrat bereit.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine geeignete Fibroblastensuspension, wobei
die Fibroblasten vorzugsweise autolog sind, mittels Sprühen auf
eine Wunde in Verbindung mit der Sprühverabreichung der Keratinocyten
appliziert. Die Fibroblasten beschleunigen dann die Bildung einer
Hautschicht, um eine bessere Anhaftungshilfe für die sich neu bildende Epidermisschicht
bereitzustellen.
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Zellen
können
direkt von Spendergewebe wie Biopsien oder Blut stammen oder ex
vivo gezüchtet
werden.
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In
einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt
schließen
(oder umfassen) (a) die primär
aufgesprühten
Zellen rekombinant transformierte Zellen ein, um ein bioaktives
Mittel wie einen Wachstumsfaktor zu exprimieren, der bei der Züchtung oder
Aufrechterhaltung der primären
Zellen hilfreich ist, oder (b) so transformierte sekundäre Zellen
werden den primären
aufgesprühten
Zellen zugegeben. Die rekombinanten Zellen können stabile Transformanten
sein, was bedeutet, dass das neue Merkmal entweder mit oder ohne
selektive Bedingungen stabil aufrechterhalten wird. Man kann erwarten,
dass derartige stabile Transformanten den rekombinanten Expressionsphänotyp über einen
verlängerten
Zeitraum aufrechterhalten. Oder die rekombinanten Zellen können transiente
Transformanten sein, von denen man erwarten kann, dass sie den Expressionsphänotyp über einige
Generationen oder weniger verlieren. Derartige transient transformierte
Zellen können durch
gemeinsame Applikation auf das Zielgewebe eines geeigneten transformationsinduzierenden
Vektors mit Primärzellen
erzeugt werden. In bestimmten Ausführungsformen erfolgt die rekombinant
induzierte Expression des bioaktiven Mittels am wünschenswertesten
früh nach
der Applikation der Zellen auf das Gewebeziel, zu der Zeit, während der
die Zellen am geringsten durch Blutversorgung oder andere Hilfsmechanismen
des Wirtstieres unterstützt
werden. Daher können
transient transformierte Zellen oder transformierte Zellen, von denen
man erwarten kann, dass sie eine begrenzte Lebensfähigkeit
an der Stelle des Gewebeziels besitzen, nützlich verwendet werden, um
eine frühe
Expression der geeigneten bioaktiven Mittel bereitzustellen.
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Zweikomponenten-Fibrinsysteme
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Die
Erfindung kann in Verbindung mit jedem Zweikomponentensystem verwendet
werden, das sich kombinieren lässt,
so dass sich ein Fibrinpolymer ergibt. Derartige Zweikomponentensysteme
schließen
herkömmliche
Fibrindichtungsmittel ein, wobei das Fibrinogen mit einem Umwandlungsenzym
(d.h. einem Enzym, das wirksam ist, eine ausreichende Menge an Fibrinpeptiden
zu entfernen, um wirksames Fibrin zu erzeugen) gemischt wird. Derartige
Systeme werden beispielsweise bei Hundyadi et al., J. Dermatol.
Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988 und Kaiser et al., Burns 20: 23-29,
1994, beschrieben. Stärker
bevorzugt werden Systeme, bei denen die einzige Barriere zur Polymerisierung
eine reversible Änderung
der physikalischen Form des Fibrins oder die Trennung von zwei Komponenten
ist, die wirksam sind, ein binäres
Fibrinpolymer zu bilden. Diese Systeme erzeugen beim Mischen Fibrin,
das „dynamisch
kompetent zum Polymerisieren" ist,
wie vorstehend definiert, und können
als „dynamische
Fibrinsysteme" bezeichnet
werden. Bei diesen Systemen können
die zwei Komponenten im Flug während
des Sprühens
gemischt werden, um schnell ein Polymer zu bilden, so dass eine
viskose, zellfixierende Zusammensetzung auf das Empfängergewebe
gesprüht
wird.
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Stärker bevorzugt
ist die Verwendung einer ersten Komponente, die Fibrin ist (vorzugsweise
Fibrin I), das in relativ milder Säure gelöst ist, und einer zweiten Komponente,
die eine ausreichende Menge an Base ist, um die ersten Komponente
zu neutralisieren, so dass das Mischen der beiden Komponenten das
Fibrin dabei in eine polymerisierungskompetente Form (d.h. dynamisch
kompetent zum Polymerisieren) umwandelt. Diese Art des Zweikomponentensystems
kann rasch aus autologem Blut hergestellt werden. Die Fibrinkomponente
trägt genügend Prothrombin
und Faktor XIII, so dass die Bereitstellung von Calciumionen in
der zweiten Komponente wirksam ist, Thrombin zu aktivieren, und
dadurch die Reifung von Fibrin zu Fibrin II und die Aktivierung
von Faktor XIII zu initiieren, um die Fibrinvernetzung bereitzustellen.
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Spezialisierte
Werkzeuge zur Herstellung von derartigem solubilisiertem Fibrin
oder „Fibrinmonomer" wurden beschrieben,
und diese Werkzeuge erlauben, das ein autologes Dichtungsmittel
aus einem Patienten auf eine schnelle, hoch reproduktive, hoch verlässliche
und extrem sichere Weise hergestellt wird. Vgl. Holm, „Centrifuge
Reagent Delivery System",
WO 96/16713, Holm et al., „Method
and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 und
Holm, „Centrifuge
with Annular Filter",
WO 96/16715. Diese Patentanmeldungen beschreiben eine geformte Vorrichtung,
die in einer Zentrifuge betrieben wird. Eine erste Kammer des Gerätes wird
mit Blut gefüllt
und ein Zentrifugationsvorgang trennt das Plasma von einer pelletierten
zellulären
Blutfraktion. Das Plasma wird in eine zweite Kammer übertragen,
in die ein kovalent an Biotin gebundenes Umwandlungsenzym eingebracht
wird. Das Enzym bewirkt, dass das Fibrinogen im Plasma zu Fibrin umgewandelt
wird, wobei die Fibrinmoleküle
aneinander binden, um Polymere zu bilden, die präzipitieren, um einen Feststoff
zu bilden. Das Fibrinpräzipitat
wird durch Zentrifugation pelletiert, und das übrige Plasma wird in die erste
Kammer zurücktransferiert.
Das pelletierte Fibrinpräzipitat
wird mit einer solubilisierenden Flüssigkeit gelöst, die
sehr häufig
eine wässrige,
bei einem sauren pH-Wert gepufferte Lösung ist. Die viskose Fibrinmonomerlösung wird
mit Agarosekügelchen
gemischt, die Avidin gebunden haben, um Spuren des biotiylierten
Umwandlungsenzyms zu entfernen, und dann in eine dritte Kammer (beispielsweise
eine Spritze) über
einen Filter gespült,
der die Agarosekügelchen
entfernt. Die zurückgehaltene
Agarose enthält
jegliches Restenzym, das über
die hochaffine Avindin-Biotin-Interaktion
gebunden ist.
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In
einem bevorzugten Aspekt wird die Fibrinzusammensetzung an geeigneten
Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktoren oder Thrombocyten-Wachstumsfaktoren
angereichert. In einem anderen Aspekt werden die Zellen gemeinsam
mit Thrombocyten oder Makrophagen oder anderen von Blut abstammenden
Zellen verabreicht. Vorzugsweise sind derartige gemeinsam verabreichte
Zellen autolog.
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Es
sollte angemerkt werden, dass während
autologe Fibrin-, Keratinocytenquellen oder Quellen von anderen
Zellen bevorzugt werden, andere Quellen häufig geeignet sind. Derartige
Quellen schließen
frisch gefrorenes Plasma (autolog, Einzelspender etc.) oder Gesamtblut
von der Blutbank ein.
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Die
Zusammensetzungen, die fibrinähnliche
Proteine liefern, schließen
ferner vorzugsweise assoziierte Proteine ein. Fibronektin liegt
beispielsweise vorzugsweise in einer Menge von 3 μg/ml bis
1000 μg/ml
oder mehr, stärker
bevorzugt von 30 μg/ml
bis 60 μg/ml
oder mehr vor.
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Prothrombin
liegt vorzugsweise auf einer Gewichts- oder einer Aktivitäts- zu einer
Volumenbasis in einer Menge von 100% oder mehr, stärker bevorzugt
30-60% oder mehr vor, wobei die prozentuale Menge sich auf die ursprüngliche
Plasmakonzentration von Prothrombin bezieht. Faktor XIII liegt vorzugsweise
in einer Menge von 20-2000%, stärker
bevorzugt 200-1000% oder mehr vor, wobei die prozentuale Menge sich
auf die ursprüngliche
Plasmakonzentration von Faktor XIII bezieht.
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Polymere Träger
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In
einigen Zusammenhängen,
insbesondere bei der Wundversorgung, kann es wünschenswert sein, eine Beschichtung
eines bioabbaubaren Polymers bereitzustellen, das die Anhaftung
und Infiltration der gewünschten
Zellen zulässt.
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Polyurethanmembranverbände, die
als derartige Beschichtungen nützlich
sind, schließen
HydrodermTM (Wilshire Medical, Inc., Dallas,
TX) und SpyrofilmTM (Polymedica Inc., Denver,
CO) ein, die mit einer biokompatiblen Haftbeschichtung geliefert
werden. Auf Hyaluronsäure
basierende Membranen, die als derartige Beschichtungen nützlich sind,
schließen
LaserskinTM (Fidia Advanced Biopolymers,
Abano Terme, Italien) ein.
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Weitere
nützliche
Beschichtungen schließen
ein: EpiGenTM-Polymermembran (T.J. Smith & Nephew; Limited,
HU3 2BN ENGLAND); ApligraftTM-Träger (Vgl.
Eaglstein et al., „Tissue
Engineering and Development of Apligraft in a Human Skin Equivalent," Clinical Therapeutics
19: 894-905,1997; Vertrieb durch Novartis AG), wobei ApligraftTM ein auf Fibrin basierender Träger ist,
der lebende Epidermis- und Dermiszellen enthält und daraus besteht; und
BioSeedTM-Träger (Vgl. Horch et al., „Fibrin
Glue and a Carrier for Cultured Human Keratinocyte Suspensions versus
Epidermal Skin Grafts," Zusammenfassung
1997 Annual Meeting, American Institute of Chemical Engineering.
Wissenschaftliche Veröffentlichung
52H).
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Derartige
nützliche
Polymerbeschichtungen schließen
auch Integra®-Kunsthaut
(Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ) ein. Integra®-Kunsthaut
ist ein Membrandoppelschichtsystem zum Dermisersatz. Eine Hautersatzschicht
wird aus einer porösen
Fasermatrix aus vernetztem Rindersehnenkollagen und Glycosaminglycan
(Chondroitin-6-sulfat) hergestellt. Die poröse Matrix wird mit kontrollierter
Porosität
und definierter Abbaurate hergestellt. Eine vorläufige Epidermisersatzschicht
wird aus synthetischem Polysiloxanpolymer (Silikon) hergestellt
und hat die Funktion, den Feuchtigkeitsverlust aus der Wunde zu
kontrollieren. Die kollagenenthaltende Hautersatzschicht dient als
Matrix für
die Infiltration von Fibroblasten, Makrophagen, Lymphocyten und
Kapillaren, die vom Wundbett stammen. Wenn die Heilung voranschreitet,
wird eine Kollagenmatrix durch Fibroblasten abgelagert; gleichzeitig
wird die Hautschicht der Integra®-Kunsthaut abgebaut.
Vgl. Burke et al., Annals of Surgery 194: 413-427,1981.
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Es
ist zu beachten, dass diese Erfindung mit der Verwendung einer Membranträgerbeschichtung
veranschaulicht wird, aber ein derartiger Träger ist nicht erforderlich.
Im Zusammenhang mit der Wundversorgung kann ein derartiger Träger als
Träger
bei der Bereitstellung einer Barriere z. B. bezüglich des Dampftransportes fungieren.
Jedoch stehen andere Verfahren zur Verfügung, eine Wundversorgung bereitzustellen,
während das
Epidermisgewebe (mit dem erfindungsgemäßen Verfahren) gebildet wird.
Beispielsweise können
allogene Hautransplantate wie ein Spalthauttransplantat über die
aufgesprühten
Zellen appliziert werden, um eine Schutzschicht bereitzustellen.
In diesem Zusammenhang dient der Fibrinkleber ferner dazu, das Hauttransplantat
zu fixieren. Derartige Transplantate weisen typischerweise Glycerin
im Falle der allotransplantierten deepithelialisierten Dermis oder
der Spalthauttransplantate auf.
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Daher
stellt die Erfindung eine Alternative zur Bildung einer Epidermis
auf der Integra-Hautersatzschicht, zur Verwendung von Spalthauttransplantaten,
zu gezüchteten
epithelialen Autotransplantaten und dergleichen bereit.
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Sprühvorrichtungen
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Ein
Zweikomponenten-Fibrinsystem kann durch jede Art von im Fachgebiet
bekannten Vorrichtungen aufgesprüht
werden. Typischerweise sollte das Vermischen kurz vor, während oder
unmittelbar nach dem Sprühen
erfolgen. Das Mischen, das unmittelbar vor dem Sprühen erfolgt,
muss ausreichend zeitnah zum Sprühereignis
erfolgen, so dass die Viskosität
noch nicht hoch genug ist, um die Tröpfchenbildung zu stören. Im
Falle der dynamischen Fibrinsysteme wird ein derartiges vorheriges
Mischen, außer
von kurzer Dauer, aufgrund der Schnelligkeit, mit der die Viskosität sich erhöht, nicht
bevorzugt.
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Eine
bevorzugte Sprühvorrichtung
würde die
zwei Komponenten des Fibrinsystems im Flug während des Sprühvorgangs
mischen. In einem derartigen System stellt die Mischungskinetik
zweier Ströme
eine wesentliche Mischungsdynamik bereit. Weitere Mischungsdynamik
kann durch die Änderungen
der kinetischen Energie bei Kollision der vereinigten Ströme mit dem
Zielgewebe erzeugt werden. Eine Vorrichtung ist bei Holm, US-Patent
5,605,541 beschrieben. Die Holm-Vorrichtung besitzt einen zentralen
Gasauslass und zwei Ringauslässe,
die um den Gasauslass angeordnet sind. Der innere Ringauslass liefert
bevorzugt den Neutralisierungspuffer, während der äußere Ringauslass die Fibrinkomponente
liefert. Der zentrale Gasauslass hilft, die ausgehenden Ströme zu formen
und zu vereinigen. Eine zweite Sprühvorrichtung kann zur ersten
ausgerichtet werden, so dass sowohl Zellen als auch Fibrin zum Zielgewebe
abgegeben werden. Die Holm-Vorrichtung
kann weiter modifiziert werden, so dass ein dritter Auslass wie
ein Ringauslass für
die Zellsuspension bereitgestellt wird.
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Besonders
bevorzugte Sprühvorrichtungen
werden bei WO 97/20585 und WO 98/20931 beschrieben. Die in diesen
Patentanmeldungen beschriebenen Sprühvorrichtungen umfassen Mehrfachlumenkanäle mit Lumendurchmessern
mit typischerweise 300 μm
oder weniger. Die Auslässe
der Lumina münden
zu einer flachen Oberfläche
aus. Bei drei Lumina sind die Lumina am Auslass vorzugsweise entlang
einer geraden Linie ausgerichtet. Beispielsweise kann das eine äußere Lumen
verwendet werden, um Luft oder ein anderes Gas zu liefern, das mittlere
Lumen kann verwendet werden, um das Fibrinmonomer zu liefern und
das andere äußere Lumen
kann verwendet werden, um die Basenlösung mit niedrigem Volumen
zu liefern. Vorzugsweise besitzen die Flüssigkeitsauslässe einen
Durchmesser unter 250 Mikrons wie 25 Mikrons bis 150 Mikrons oder 50
Mikrons bis 125 Mikrons, während
der Gasauslass vorzugsweise 20 bis 50% größer ist. Beispielsweise können die
Auslässe
entlang einer geraden Linie ausgerichtet werden, wobei auf einen
150 Mikron-Gasauslass zwei 100 Mikron-Flüssigkeitsauslässe folgen.
Vorzugsweise betragen kombinierte Flüssigkeitsströme weniger als
3,0 ml/min wie 0,5 bis 0,7 ml/min. Die Flüssigkeitsauslässe sind
vorzugsweise räumlich
angeordnet, so dass die Tröpfchen,
die die Auslässe
verlassen, einander überschneiden
oder berühren.
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Gasströme betragen,
wenn sie verwendet werden, 500 ml/min bis 800 ml/min. Ein benachbarter
Gasstrom tendiert dazu, in den Flüssigkeitsstrom gezogen zu werden
und den Strom in kleineren Tröpfchen
zu dispergieren, wobei ein „Dispersionsspray" erzeugt wird. Wenn
kein Gasstrom verwendet wird, erfolgt die Flüssigkeitsverabreichung in Tropfen
oder einem Strom und nicht so sehr als Tröpfchendispersion wie konische Dispersion.
Die Verabreichung von Flüssigkeiten
durch derartige ausgestoßene
Tropfen oder Ströme
macht eine Sprühform
aus. Derartige ausgestoßene
Tropfen oder Ströme
können
bevorzugt werden, wenn konzentrierte Applikation gewünscht ist.
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Wenn
die Zellsuspensionen alleine aufgesprüht werden, werden vorzugsweise
die vorstehend beschriebenen niedrigen Flüssigkeitsfließraten verwendet.
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Die
Zellsuspension kann von derselben Sprühvorrichtung verabreicht werden,
die das Zweikomponentenfibrinsystem liefert. Beispielsweise kann
die Ausführungsform
von 9 von WO 98/20931, die mindestens drei
Auslässe
zur Verabreichung von Flüssigkeiten
besitzt, verwendet werden.
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Rekombinantes Fibrinogen
und Fibrin
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Mit
Gentechnik können
Fibrinogen und Fibrinmonomere in vergleichsweise hohen Erträgen, in
wesentlich reiner Form und ohne pathogene Viren wie Hepatitis und
HIV hergestellt werden. Die heterologe Expression von Fibrinogen-
und Fibrinketten erlaubt auch die Konstruktion von Mutationen, die
die natürlich
auftretenden Fibrinvarianten nachahmen können, sowie die Isolierung
und das Studium dieser Proteine, ohne dass Patienten mit diesen
seltenen Gendefekten benötigt
werden.
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Jede
der drei verschiedenen Polypeptidketten (Aα, Bβ und γ) von Fibrinogen wird von einem
getrennten Gen codiert. Die cDNAs für jede dieser Ketten wurden
hergestellt (Chung et al., Ann. NY. Acad. Sci. 408:449-450, 1983;
Rixen et al., Biochemistry 22:3237-3244, 1983; Chung et al., Biochemistry
22:3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry 22:3250-3256,1983)
und in prokaryontischen Organismen exprimiert.
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Ferner
wurde jede menschliche Fibrinogenkette getrennt (Huang et al., J.
Biol. Chem. 268:8919-8926, 1993; Roy et al., J. Biol. Chem. 267:23151-23158,
1992; Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991) oder in Kombination
(Hartwig und Danishefsky, J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991; Huang
et al., J. Biol. Chem. 268:8919-8926,1993; Roy et al., 1991, J.
Biol. Chem, 266:4758-4763;
Redman und Samar, US-Patent-Anmeldung 07/663,380, eingereicht März 1991,
erhältlich
vom Natl. Technology Information Service Nr. PAT-APPL07663 380INZ)
in Expressionsplasmide eingeführt
und in eukaryontische Zellen transfiziert.
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Die
meisten bei der Expression von rekombinantem menschlichem Fibrinogen
verwendeten Plasmide stammen von denjenigen, die von Dr. D. Chung,
University of Washington, Seattle, konstruiert wurden und basieren
auf cDNA-Clonen (Rixen et al., Biochemistry 22:3237-3244, 1983;
Chung et al., Biochemistry 22:3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry
22:3250-3256,1983). Die Expression von rekombinanten Fibrinogenketten
wurde zuerst in E. coli erreicht (Bolyard und Lord, Gene 66:183,
1988; Bolyard und Lord, Blood, 73:1202-1206,1989; Lord und Fowlkes,
Blood, 73:166-171, 1989). Die einzeln exprimierten Ketten zeigen
antigene Ähnlichkeiten
mit Fibrinogen und zeigen Thrombin spaltbare Stellen, die denjenigen ähneln, die
man bei nativem Fibrinogen findet (Bolyard und Lord, Blood, 73:1202-1206,1989;
Lord und Fowlkes, Blood, 73:166-171, 1989). Die Fibrinpeptide A
und B können
aus rekombinantem Fibrinogen freigesetzt werden (Bolyard und Lord,
Blood, 73:1202-1206,1989; Lord und Fowlkes, Blood, 73:166-171, 1989).
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Man
hat gezeigt, dass eukaryontische Zellen, die die geeigneten Expressionsplasmide
tragen, die einzelne Fibrinogenketten codieren, die codierten Fibrinogenketten
synthetisieren und intrazellulär
dimere Kettenmoleküle
bilden, z.B. Aα2-, Bβ2- oder γ2-Dimere (Roy et al., J. Biol. Chem. 265:
6389-6393, 1990; Zhang und Redman, J. Biol. Chem. 267: 21727-21732,
1992). Wenn geeignete Plasmide, die Gene enthalten, die alle drei menschlichen
Fibrinogenketten codieren, in dieselbe Zelle übertragen werden, dann werden
ferner nicht nur alle drei Ketten exprimiert, sondern die Polypeptidketten
assoziieren in Paaren und intaktes Fibrinogen wird in das umgebende
Medium sekretiert (Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991;
Hartwig und Danishefsky, J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991). Wie
natürliches
Fibrinogen besteht das sekretierte rekombinante Fibrinogen aus drei
Paaren mit unterschiedlichen Polypeptidketten und ist bei der Bildung
von Fibrinpolymeren funktional.
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Fibrin
wird natürlicherweise
von der Leber synthetisiert und in Kultur gehaltene Megakaryocytenzellen und
transformierte Leberzellen können
die Fibrinogensynthese und -sekretion fortsetzen (Vgl. Otto et al.,
J. Cell. Biol. 105:1067-1072, 1987; Yu et al., Thromb. Res. 46:281-293,
1987; Alving et al., Arch. Biochem. Biophys. 217:19, 1982). Eine
derartige Zelllinie sind die Hep G2-Zellen (Drs. Knowles und Aden, Wister
Institute, Philadelphia). Diese Linie synthetisiert einen Überschuss
an Aα- und γ-Ketten gegenüber den
Bβ-Ketten,
was zu unproduktiven dimeren Komplexen der α- und γ-Ketten (z.B. Aα2γ2) führt. Das
Einführen
eines zusätzlichen Bβ-Ketten codierenden
Expressionsvektors führte
zur Bildung von trimeren Komplexen (AαBβy), die die korrekte Faltung
und Intraketten-Disulfidbrückenbildungmuster übernehmen
(Roy et al., J. Biol. Chem. 265: 6389-6393, 1990). Der Mechanismus
dieser Faltung ist unbekannt, und es können Hilfsproteine und Enzyme beteiligt
sein (Roy et al., J. Biol. Chem. 267:23151-23158, 1992). Diese Studien
zeigten nicht nur die korrekte Transkription von Bβ-cDNA, sondern
auch, dass die überschüssige Bβ-Kette den
Zusammenbau und die Sekretion von intaktem Fibrinogen verstärkt.
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In
Hep G2-Zellen assoziieren die trimeren AαBβy-Komplexe in Paaren, so dass
sich intakte Fibrinogenmoleküle
bilden, die glycosyliert werden und aktiv von der Zelle sekretiert
werden (Huang et al., J. Biol. Chem. 268:8919-8926, 1993). Allerdings
werden nur korrekt zusammengebaute Fibrinogenmoleküle sekretiert.
Daher besitzen Hep G2-Zellen den Synthese- und sekretorischen Apparat
zum Zusammenbau von Fibrinogen.
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Bei
nachfolgenden Experimenten wurden Fibrinogenketten codierende cDNA-Plasmide
in eukaryontische Zellen eingeführt,
die Fibrinogen normalerweise nicht synthetisieren. Diese Experimente
erzeugten erfolgreich funktionales Fibrinogen, was zeigt, dass die
für den
Fibrinogen-Zusammenbau und die Sekretion benötigten Faktoren nicht für die von
der Leber stammenden Zellen wie Hep G2 einzigartig sind. Eukaryontische Zellen,
von denen bekannt ist, dass sie rekombinantes Fibrinogen zusammenbauen
und sekretieren können, schließen Baby-Hamster-Nierenzellen
(BHK), COS-Zellen und Chinesische Hamster-Ovarien-Zellen (CHO) ein
(Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991; Hartwig und Danishefsky,
J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991; Farrell et al., Biochemistry
30:9414-9420, 1991).
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Intaktes
funktionales Fibrinogen, das von stabil transformierten eukaryontischen
Zellen sekretiert wird, führt
zur Akkumulation von Fibrinogenspiegeln von etwa 1-2 μg/ml: Es
sind Verfahren zur Steigerung des Ertrags rekombinanter Proteine
aus transfizierten Zellen wie CHO bekannt, so dass sich der Expressionsspiegel einem
Tausendfachen des basalen sekretorischen Spiegels annähern kann.
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Eine
zusätzliche
Beschreibung der Verfahren zur rekombinanten Herstellung fibrinähnlicher
Moleküle kann
man bei PCT/US95/05527 finden.
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Kollagen
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Die
Erfindung betrifft das Sprühen
von Zellen auf eine Gewebeoberfläche,
die mit zellanhaftungsfördernden
wirksamen Kollagenmengen beschichtet ist. Vorzugsweise wird das
Kollagen auf die Gewebeoberfläche
gesprüht.
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Andere adhäsive Matrices
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Zellen
können
auch in anderen polymeren Haftmitteln oder viskositätsverstärkenden,
auf Polymer basierenden Zusammensetzungen gesprüht werden. Vorzugsweise wird
das adhäsive
oder viskositätsverstärkende Polymer gemeinsam
verabreicht, wie mit einem der vorstehend beschriebenen Mehrfachauslass-Sprühvorrichtungen.
Beispielsweise können
Zellen mit adhäsiven
Zusammensetzungen, umfassend Kollagen, Hyaluronsäure oder andere geeignete Polymere,
verabreicht werden. Zumindest im Falle von bestimmten Polymerzusammensetzungen
mit Mehrfachsäuregruppen
wie Hyaluronsäure
besitzt eine saure Lösung eine
signifikant niedrigere Viskosität,
so dass das Mischen in Verbindung mit der Applikation einer Basenlösung die
Viskosität
erhöht.
Daher können
derartige Polymere bequemer mit einem Mischungsvorgang verabreicht
werden, der demjenigen ähnelt,
der bei säuresolubilisiertem
Fibrin verwendet wird.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter,
sollten aber natürlich
nicht so ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise ihren Umfang
einschränken.
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Beispiel 1 – Herstellung
des Fibrinmonomers
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Das
biochemische Verfahren zur Herstellung von Fibrinmonomer ist vollautomatisch
und wurde früher beschrieben
(Kjaergard et al Cardiovascular Engineering 2:204-206, 1997). 120
ml des Patientenblutes werden in dem Präparationsansatz mit Natriumcitrat
zur Antikoagulation gemischt. Mit rascher zyklischer Zentrifugation
werden 60 ml Plasma isoliert, das man mit biotinyliertem Batroxobin
10 Minuten bei 37°C
reagieren lässt.
Der Biotin-Batroxobin-Komplex katalysiert die Freisetzung von Fibrinpeptid
A aus Fibrinogen, aktiviert jedoch nicht Faktor XIII, was zur Bildung
eines Fibrin I-Polymers führt,
das säurelöslich ist.
Das Fibrin I-Polymer wird durch Zentrifugation isoliert und in 3,5
ml 0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Kovalent an Agarose gebundenes
Avidin wird der Lösung
zugegeben, um das Biotin-Batroxobin an Agarose zu komplexieren.
Der Biotin-Batroxobin:Avidin-Agarose-Komplex wird dann von der Fibrin
I-Lösung
durch Filtration getrennt.
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Die
saure Fibrin I-Lösung
wird in eine Phiole gezogen und an eine Applikatoreinheit übertragen.
Eine Spritze in der Applikatoreinheit enthält 0,75 M Carbonat/Bicarbonatpuffer
(pH 10). Die beiden Lösungen
werden gleichzeitig verabreicht und gründlich während des Verabreichungsvorganges
gemischt. Mischen bei einem Verhältnis
von 7:1 (Fibrin I:Puffer) initiiert die Polymerisierung. Bei einem
neutralen pH-Wert, der auf das Mischen zurückzuführen ist, und in Gegenwart
von Calciumionen, die vom Carbonat/Bicarbonatpuffer geliefert werden, wird
das endogene Prothrombin in Thrombin umgewandelt, was dazu führt, dass
das Fibrinpeptid B aus Fibrin 1 gespalten wird, so dass sich Fibrin
II bildet. Thrombin aktiviert auch Faktor XIII, der auf Fibrin II wirkt,
so dass sich ein stabiles Fibrin II-Polymer bildet. Bei Studien am Menschen
ist der Vorgang nach 30 Minuten beendet und es ergeben sich etwa
4,5 ml konzentriertes Fibrindichtungsmittel, das reich an fibrinassoziierten
Proteinen einschließlich
Fibronektin ist.
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Beispiel 2 – Zeltwachstum
auf Fibrinpolymer
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Eine
in-vitro-Studie wurde durchgeführt,
um zu bewerten, ob subkonfluente Schweine-Keratinocyten polymerisiertes
Fibrindichtungsmittel (hergestellt unter Verwendung des Verfahrens
aus Bespiel 1) als Substrat zur Anhaftung und zum Wachstum nutzen
konnten. Polymerisiertes Fibrindichtungsmittel wurde aus Proben mit
Fibrin I-Lösung,
hergestellt aus einer einzigen Spende von Schweineblut, unter Verwendung
des Verfahrens aus Bespiel 1 hergestellt. Die Fibrin I-Konzentration
in der Lösung
betrug 23,64 mg ml–1 und der pH-Wert betrug
4,43. Es wurde eine einzelne Plastikgewebekulturtestplatte mit 24
Vertiefungen verwendet (innerer Durchmesser der Vertiefung 0,8 cm).
Die Versuchsgruppen werden in der folgenden Tabelle beschrieben:
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Figur
8.1a: Gruppen für
in-vitro-Studie des Schweine-Keratinocyten-Wachstums auf Fibrindichtungsmittel.
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Zu
jeder der 6 Vertiefungen wurden 150 μI Fibrin I-Lösung zugegeben. Zu jeder der
3 Vertiefungen in Gruppe 1 wurden 750 μI DMEM-Kulturmedium (enthaltend
10% FKS) mit 50 ml 50 μg/ml
Typ I-Rattenschwanz-Kollagenlösung
(gelöst
in 0,02 M Essigsäure)
zugegeben. Den 3 Vertiefungen von Gruppe 2 wurde dieselbe Lösung zugegeben,
die Rattenschwanz-Kollagenlösung
wurde jedoch weggelassen und durch 50 μI 0,02 M Essigsäure ersetzt.
Die Fibrin I-Lösung
polymerisierte sofort bei Zugabe der DMEM-Lösung. 50.000 bestrahlte 3T3-Nährzellen
in 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium wurden auf die Oberfläche des
polymerisierten Fibrindichtungsmittels in den 3 Vertiefungen in
Gruppe 1 appliziert und 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium allein
wurden zu den Vertiefungen in Gruppe 2 zugegeben. 100.000 (1 × 105) Passage entstammende subkonfluente Schweine-Keratinocyten wurden
in 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium auf die Oberfläche aller
6 Vertiefungen appliziert. Nach 2-tägiger Züchtung wurde das Medium durch
sanftes Absaugen gewechselt. Nach 4 Tagen war das Gerinnsel aus
Fibrindichtungsmittel noch auf dem Boden jeder Vertiefung vorhanden.
Nach einem weiteren Mediumswechsel wurde das Gerinnsel unter Verwendung
eines Skalpells (Größe 11-Klinge)
und mit einer gezähnten
Zange von der Vertiefung abgehoben.
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Jeder
Gerinnsel wurde dann blockiert und in OCT-Blockierzusammensetzung
eingefroren. Es wurden Gefrierschnitte mit einer Dicke von 15 μm transversal
und tangential zur oberen Oberfläche
des Gerinnsels angefertigt. Man hatte gehofft, dass die letzteren
Schnitte eine Bewertung der Morphologie der anhaftenden Keratinocyten
erlauben würde.
Das Gerinnsel aus dem Fibrindichtungsmittel besitzt eine viel geringere
Stärke
als Gewebebiopsien, und leider fragmentierten alle derartigen Schnitte
während
der Herstellung der Schnitte. Die intakten transversalen Gefrierschnitte
wurden fixiert und auf Keratin 14-Immunreaktivität unter Verwendung von immuncytochemischen
Standardverfahren und Fluoreszenzmikroskopie gefärbt. Die Keratinocyten waren auf
der Oberfläche
des Gerinnsels aus Fibrindichtungsmittel in beiden Versuchsgruppen
sichtbar.
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Beispiel 3 – Wundversorgung
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Anästhetische
und chirurgische Verfahren wurden früher in diesem gut etablierten
Wundmodell beschrieben (Kangesu et al., Brit J. Plastic Surg. 46:3893-4000, 1994). Drei
Vollhautdefekte mit einem zirkulären Durchmesser
von 4 cm wurden der exponierten Muskelfaszie an jeder Seite des
Brustkorbes des Large White Pigs beigebracht. Wenn der IntegraTM-Hautersatz in diesem Modell verwendet
wurde, wurde eine äußerst genaue
Hämostase
des Wundbettes durch sorgfältige
Verwendung einer bipolaren Diathermie (d.h. Erzeugen von Hitze in
Gewebe durch elektrische Ströme
für medizinische
oder chirurgische Zwecke) erreicht. Der IntegraTM-Hautersatz
wurde auf die Art und Weise hergestellt, die bei Burke et al., (Artificial
Skin, Dermal Regeneration Template, Physician Training Manual, Integra
Lifesciences Corporation, 1996) beschrieben wurde, und dann in Scheiben
mit einem Durchmesser von 4,5 cm geschnitten, die an die Wundbasis
unter Verwendung von unterbrochenen 5°-Nähten aus monofilem Nahtmaterial
genäht
wurden, die 2 bis 3 mm innen zur Kante der Scheibe positioniert
waren. Die Wunden wurden aus der umgebenden Haut unter Verwendung
von Polytetrafluorethan (PTFE)-Kammern isoliert, die unter Verwendung
von 2°-Nähten aus
Seidennahtmaterial fixiert wurden. Der IntegraTM-Hautersatz
wurde mit einem nichthaftenden Verband bedeckt und die Kammern mit leicht
komprimierter, mit Salzlösung
getränkter
Gaze gefüllt.
Eine mit Schaumstoff ausgekleidete Schutzhülle wurde um den Rumpf des
Tieres gebunden, um irgendwelche versehentlichen Schäden an den
Wunden zu verhindern. Ein Hautbiopsie zur Initiation der Keratinocytenkulturen
wurde am selben Tag wie das Erzeugen von Vollhautdefekten (isoliert
durch perkutane Kammern) durchgeführt und mit IntegraTM-Hautersatz auf die Rumpffaszie des Brustkorbes
transplantiert.
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Aus
der linken externen Vena jugularis des Schweins wurde Blut entnommen.
Die Vorschrift zur Herstellung von autologem Fibrindichtungsmittel
entsprach Beispiel 1.
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Die
Vorschrift zur Transplantation des IntegraTM-Hautersatzes
(oder der Kunsthaut) wurde verfeinert (wie detailliert bei Clayton
und Bishop, J. Burn Care Rehabil., Bd. 19: (4):358-363, 1998, beschrieben),
um konsistent hohe Annahmeraten zu erreichen.
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In
diesem Experiment wurde ein 10 Wochen altes Tier verwendet. Bei
dieser Vorschrift betrug der Zeitraum nur 10 Tage zwischen der Erstbiopsie
und der Applikation der gezüchteten
Zellen. (Die Erstbiopsie konnte daher während desselben Anästhetikums
entnommen werden, das verwendet wurde, um die isolierten Wunden
zu erzeugen und die IntegraTM-Kunsthaut
zu verwenden.) Die Verbände
wurden unter allgemeiner Anästhesie
am 3. und 8. Tag gewechselt.
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An
Tag 10 wurde das Tier betäubt
und die linke externe Vena jugularis kannüliert. Etwa 4,5 cm3-Schweine-Fibrin
I-Lösung
wurden unter Verwendung eines einzelnen Herstellungslaufes produziert.
Die Wunden wurden exponiert und die temporäre Silikongummimembran des
IntegraTM-Hautersatzes entfernt. Die „Annahme" des IntegraTM-Hautersatzes bei diesem Experiment betrug
in allen 6 Wunden 100%.
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Sechs
große
(T75)-Kolben mit Keratinocyten bei einer 80-90%-igen Konfluenz wurden
unter Verwendung von 5 ml vorgewärmter
0,05%-iger Trypsin/0,02%-iger Ethlendiamintetrasäure (Gibco BRL, Life Technology),
die jedem Kolben zugegeben wurden, dispergiert, wobei die Kolben
bei 37°C
inkubiert wurden. Es dauerte 10 Minuten, um die Zellen von dem Gewebekulturkunststoffmaterial
abzulösen.
Die Wirkung von Trypsin wurde durch Zugabe von serumenthaltenden
Medien neutralisiert. Insgesamt wurden etwa 14 × 106 lebensfähige Zellen
geerntet. Die Keratinocyten wurden in Keratinocytenwachstumsmedium
zum Sprühen
suspendiert. Die Lebensfähigkeit
wurde anhand einer nicht aufgesprühten Probe am Ende des Sprühverfahrens
bewertet.
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Etwa
0,6 cm3 des autologen Schweine-Fibrindichtungsmittels
(etwa 22 mg/ml Fibrinmonomer) und 0,6 cm3 der
Schweine-Zellsuspension wurden auf die Wunden 1-3 appliziert. Etwa
0,6 cm3 des Schweine-Fibrindichtungsmittels
mit Schweine-Keratocyten-Wachstumsmedien
ohne Zellen wurden auf die Wunden 4-6 appliziert. Das Fibrindichtungsmittel
und der Carbonat/Bicarbonatpuffer wurden mit einer Sprühvorrichtung
gesprüht,
und die Zellen wurden mit einer ähnlichen,
auf der ersten Vorrichtung befestigten Vorrichtung gesprüht. Die
Sprühköpfe wurden
in einem Abstand von 2 bis 5 cm von den Wunden gehalten. Die verwendete
Vorrichtung entsprach WO 97/20585, wobei drei linear ausgerichtete
300 μm Auslässe verwendet
wurden, um Luft, säuregelöstes Fibrin
bzw. Carbonat/Bicarbonatpuffer zu verabreichen. Die Wunden auf der
linken Seite des Tieres befanden sich bei einer experimentellen
Gruppe, die Wunden auf der rechten Seite des Tieres befanden sich
bei einer anderen Gruppe. Mit dieser Anordnung wurde jegliche potenzielle
Kontamination von Wunden mit Fibrindichtungsmittel alleine durch
gesprühte
Keratinocyten aus der anderen experimentellen Gruppe vermieden.
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Die
Zelldichte der Zellsuspension wurde auf 2,78 × 106 Zellen
cm– 3 geschätzt.
Die Gesamtanzahl der pro Wunde aufgesprühten Zellen wurde daher auf
1,67 × 106 Zellen geschätzt. Die Lebensfähigkeit
der Zellsuspension vor dem Sprühen
wurde auf 92,8% geschätzt.
Das Fibrindichtungsmittel polymerisierte auf der Wundoberfläche fast
unmittelbar nach der Applikation.
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Frühere Studien,
die unter Verwendung von zweite Passage (P2)-Kerationocyten desselben Tieres erfolgten,
hatten eine 63,2 (SA 5,4) %-ige Lebensfähigkeit für Zellen gezeigt, die auf 5%
Agarose unter Verwendung derselben Vorrichtung (in Abwesenheit von
autologem Fibrindichtungsmittel) gesprüht wurden. Daher erwartet man,
dass die auf jede Wunde applizierte Gesamtanzahl der lebensfähigen Zellen
etwa 1,1 × 106 (oder ∼ 8,8 × 104 lebensfähige
Zellen cm– 2 Wundfläche)
beträgt.
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Eine
Probe der Zellsuspension (Überschuss
derjenigen, die auf die Wunden appliziert wurde) wurde auf einen
mit Kollagen beschichteten 75 cm2-Gewebekulturkolben
gesprüht,
in dem mit 2 × 106 letal bestrahlten Maus-3T3-Zellen gesät waren.
Diese Zellen bildeten innerhalb von 3 Tagen eine fast konfluente
Population. Diese Population wurde anschließend zwei weitere Passagen
ohne offensichtliche Hemmung der Wachstumsrate im Vergleich mit
nicht aufgesprühten
Keratinocyten gezüchtet.
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Die
Wunden wurden photographiert und mit einer Schicht eines nicht adhärenten Verbands
verbunden, und die Kammern wurden mit Salzlösung befeuchteter Gaze gefüllt. Etwa
5 Minuten nach der Applikation der beiden verschiedenen Wundbehandlungen
wurden Stanzbiopsien von den Wunden 3 und 4 entnommen. Weitere Biopsien
wurden am 4. Tag nach der Behandlung unter allgemeiner Anästhesie
vorgenommen und an Tag 14 wurden die Wunden nach Tötung der
Tiere entnommen.
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Tag
0: An beiden Wunden war eine Überzugssschicht
mit Fibrindichtungsmittel mit einer Dicke von etwa 60 μm vorhanden.
Die im Dichtungsmittel suspendierten Keratinocyten waren nur in
Biopsien von Wunden nachweisbar, bei denen die Zellen durch Sprühapplikation
aufgebracht wurden, und besaßen
eine isolierte und sphärische
Morphologie.
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Die
Gesamtanzahl der pro Wunde applizierten Zellen (sowohl lebensfähige als
auch nicht lebensfähige)
wurde auf etwa 1,7 × 106 geschätzt,
so dass die vorhergesagte Dichte der auf die Wunde gesprühten Zellen etwa
1,3 × 105 cm– 2 betrug.
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Tag
4: Vier Tage nach der Behandlung mit einer Sprühmischung aus Fibrindichtungsmittel
und suspendierten Keratinocyten wurden die Keratinocytenkolonien
auf oder genau proximal zur Wundoberfläche nachgewiesen.
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Die
Fibrindichtungsmittelschicht war nicht mehr offensichtlich. Es wurden
keine Keratinocyten in der Biopsie der Kontrollwunde, die nur mit
dem Dichtungsmittel plus Medium behandelt worden war, nachgewiesen.
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Tag
14: Zwei Wochen nach der Sprühapplikation
der Fibrindichtungsmittel/Keratinocyten-Mischung war eine Epithelhülle aus
mehreren Schichten auf der Wundoberfläche vorhanden. Es war kein
Epithel auf der Oberfläche
der Wunden vorhanden, die mit einer Mischung aus gesprühtem Fibrindichtungsmittel
und Medium allein behandelt wurde.
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Epidermale
Bedeckung an Tag 14: Das Epithel auf der Wundoberfläche 14 Tage
nach der Sprühapplikation
der gezüchteten
Keratinocyten wies kein Stratum corneum auf. Makroskopisch ist das
Epithel durch eine Änderung
der Lichtundurchlässigkeit
der Wundoberfläche
gekennzeichnet. Anhand der Biopsien wurde bestätigt, dass Bereiche des Epithels
ein mattes Erscheinungsbild im Vergleich mit der ansonsten glitzernden
Oberfläche
der Wunde aufwiesen.
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Die
mittlere epidermale Bedeckung auf den Wunden 1-3 an Tag 14 nach
der Sprühapplikation
einer Mischung aus Fibrindichtungsmittel und Keratinocyten (berechnet
als Prozentsatz der Gesamtwundfläche)
betrug 66%, wie durch die nachstehende Tabelle veranschaulicht.
Es war kein Epithel auf den Wunden 4-6 vorhanden, die mit Sprühmischung
aus Fibrindichtungsmittel und Medium allein behandelt wurden.
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Tabelle:
Epidermale Bedeckung.
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Eine
allmähliche
Bewegung der IntegraTM-Hautersatz-Scheibe
(und daher des Wundbettes) im Hinblick auf die PTFE-Wundkammer wurde
bemerkt. Man nahm an, dass die Bewegung eine Folge des Phänomens der „Wundverlagerung" aufgrund des Wachstums
des Tieres war. Ein signifikanter Bruch des Wundbettes, das niemals
mit dem Fibrindichtungsmittel/Keratinocyten-Spray behandelt wurde,
an Tag 14 nach der Behandlung war eine Folge der Wundverschiebung.
Die Rekonstitution der Epidermis, berechnet als Prozentsatz der
aufgesprühten
IntegraTM-Kunsthaut, wäre beträchtlich höher als die aufgezeichneten
66%, ohne das Migrationsphänomen
zu berücksichtigen.
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Keratin 6- und Kollagen
VII-Färbung
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Gewebebiopsien
wurden auf Immunreaktivität
gegenüber
Keratin 6 und Kollagen VII gefärbt.
An Tag 4 wurde keine Immunreaktivität gegenüber Keratin 6 oder Kollagen
VII nachgewiesen. An Tag 14 färbten
jedoch die suprabasalen Keratinocyten stark auf K6. Die Kollagen
VII-Immunreaktivität
war unterhalb der Epidermisflächen
und unmittelbar benachbart zu Keratinocytenzysten nachweisbar. Die
Kollagen VII-Immunreaktivität
wurden eher in Form von mehrfachen sich überschneidenden Streifen und
weniger als einzelnes kontinuierliches Band nachgewiesen. Es war
weder eine Keratin 6- noch eine Kollagen VII-Immunreaktivität in Biopsien aus Wunden nachweisbar,
die mit einer Mischung aus Fibrindichtungsmittel und Medium allein
besprüht wurden.